CN101249261B - 一种肾综合征出血热粘膜免疫疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肾综合征出血热粘膜免疫疫苗及其制备方法。该疫苗包含来源于一种或多种型别的能够引起肾综合征出血热的汉坦病毒的灭活病毒和壳聚糖，其中壳聚糖以微米颗粒的形式存在，灭活汉坦病毒被包裹于壳聚糖微米颗粒中，进一步的，该疫苗还可以包含具有粘膜佐剂活性的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位。动物实验结果显示，本发明的疫苗经鼻腔和口服接种均能有效激发机体抗汉坦病毒的特异性粘膜免疫应答和体液免疫应答，与对照组相比具有统计学意义(p＜0.01)，相比于传统出血热注射疫苗具有安全、方便、经济等优点。
Description
技术领域
本发明属于疫苗领域，特别是涉及一种针对肾综合征出血热的粘膜免疫疫苗及其制备方法。
背景技术
汉坦病毒(Hantavirus)是一种分节断的负链RNA病毒，属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属，啮齿动物是汉坦病毒的主要宿主。依血清型和基因型可以将汉坦病毒分为近30个病毒种(species)。汉坦病毒可以引起人类两种疾病，即肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HantavirusPulmonary Syndrome，HPS)。肾综合征出血热是以发热、出血倾向及肾脏损害为主要临床特征的急性病毒性传染病。按国际分型习惯，引起肾综合征出血热的是汉坦病毒中的汉滩型(Hantaan)、汉城型(Seoul)、多布拉瓦型(Dobrava)、普马拉型(Puumala)型和Saaremaa型病毒。在我国，将引起肾综合征出血热的汉坦病毒分类为野鼠型和家鼠型等，分别和汉滩型(Hantaan)和汉城型(Seoul)等对应。我国是受汉坦病毒危害最严重的国家，世界上的肾综合征出血热多发生在我国。
目前我国使用的肾综合征出血热疫苗都是通过肌肉注射的灭活疫苗，包括单价及双价疫苗。与传统注射疫苗相比，粘膜疫苗因其简便、经济、低痛及可避免不洁接种而导致疾病传播等诸多优点而引起越来越多研究者的关注，但针对肾综合征出血热的粘膜免疫疫苗尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可经粘膜途径免疫接种的肾综合征出血热粘膜免疫用疫苗。本发明的技术方案如下：
一种肾综合征出血热粘膜免疫用疫苗，至少包含(a)一种或多种型别灭活汉坦病毒，和(b)壳聚糖，其中壳聚糖以微米颗粒的形式存在，灭活汉坦病毒被包裹于壳聚糖微米颗粒中。
进一步的，本发明的肾综合征出血热粘膜免疫用疫苗还可以包含(c)大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)。
上述灭活汉坦病毒可以来源于任何会引起肾综合征出血热的型别，包括汉滩型(Hantaan)、汉城型(Seoul)、多布拉瓦型(Dobrava)、普马拉型(Puumala)型和Saaremaa型等汉坦病毒。通常是用β-丙内酯或其他方法进行灭活处理。优选家鼠型或野鼠型单一型别的灭活汉坦病毒，或者是二者的混合物。目前广泛应用于注射疫苗的灭活汉坦病毒都可以用于本发明。
灭活汉坦病毒典型的制备过程包括Vero E6细胞或其他细胞培养汉坦病毒，收获病毒，β-丙内酯或福尔马林等其他方法灭活，浓缩后过柱纯化，然后添加一定量的人血清白蛋白作为保护剂。可以用双抗体夹心酶连免疫吸附试验检测纯化灭活病毒的抗原活性，紫外比色法(280nm)确定包含病毒的总蛋白含量[宋干等，病毒学报，1985，1(1)：25-29]。所制备的灭活汉坦病毒通常以溶液状态保存，一般在分子筛纯化病毒后，添加终浓度为0.5-1％g/ml的人血清白蛋白作为保护剂，然后再调整溶液体积使总蛋白含量为20-500μg/mL加以储存。
上述壳聚糖形成微米颗粒，以胶体溶液形式存在，所用壳聚糖优选分子量为2100-2210，乙酰化度为80-90％，本发明粘膜免疫用疫苗中壳聚糖的含量为0.1％～0.4％g/mL。在本发明中，事先配制壳聚糖胶体溶液，然后将其与灭活汉坦病毒储存溶液按预定比例混合，二者混合后，灭活汉坦病毒被包裹于壳聚糖微米颗粒当中。
上述壳聚糖胶体溶液可以采用如下方法制备得到：先将医用级别的壳聚糖溶解，滤膜过滤除菌后加入适量多聚磷酸钠(终浓度为0.001-0.05％)得到壳聚糖胶体溶液，该壳聚糖胶体溶液中壳聚糖的浓度为0.2％-0.5％g/ml。溶解壳聚糖最常用的溶剂是低浓度的无机酸或某些有机酸，如0.1％甲酸、0.25％冰乙酸、10％柠檬酸等。
上述方法制备得到的灭活汉坦病毒储存液和壳聚糖胶体溶液通常可以按1∶1-1∶4的体积比配伍，所得疫苗中壳聚糖的含量为0.1％～0.4％g/mL，而包含病毒在内的总蛋白含量为5-250μg/mL。
上述大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位是大肠杆菌不耐热毒素(Heat-labile enterotoxin，LT)中的B亚单位，其具有无毒，但却能有效协助递呈外界抗原到粘膜淋巴相关组织中，具有较强的粘膜免疫佐剂活性。在本发明的疫苗中其用量范围是为0.5-5μg/mL。
大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的获得，可以首先通过基因工程的手段将其基因克隆到表达载体中，然后再转化大肠杆菌进行表达，最后进行分离纯化得到，这些方法均是本领域技术人员所熟知的，于此不再赘述。
本发明肾综合征出血热粘膜免疫用疫苗的制备方法是，分别制备灭活汉坦病毒储存溶液、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位和壳聚糖胶体溶液，然后按比例将各组分混合即可。
本发明的疫苗组合物中还可以包含一种或多种其他佐剂，可以在混合形成上述组合物之前和/或之后加入。所述佐剂例如：CpG ODNs(富含CG的寡核苷酸片断)，比如说CPG#1826：5′-TCCATCACGTTCCTGACGTT-3′(Michael J.McCluskie等，Vaccine2001，19：2657-2660)。
本发明的疫苗组合物通常是以pH 6.5-8.0的胶体溶液或悬浮液形式存在和包装。本发明的疫苗是针对粘膜给药而设计的，可选择的给药途径包括口、鼻、生殖道、直肠等等，其中以鼻内和口服途径最切实可行。因此，本发明的疫苗优选适合于鼻内给药的包装及相应口服包装，如鼻喷雾剂、滴鼻剂、凝胶或口服胶囊。
在本发明所提供的粘膜免疫用肾综合征出血热疫苗中，壳聚糖、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位均为无毒生物制剂，壳聚糖微米颗粒具有缓释、抗消化的作用，而LTB具有粘膜佐剂活性。动物实验结果显示，本发明的疫苗经鼻腔和口服接种均能有效激发机体产生抗汉坦病毒的特异粘膜免疫应答和体液免疫应答，与对照组相比具有统计学意义(p＜0.01)，较传统出血热注射疫苗具有安全、方便、经济等优点，对于肾综合征出血热的预防具有重要意义。
附图说明
图1a是通过SDS-PAGE电泳鉴定实施例1所表达纯化的LTB的电泳结果图；
图1b是通过western blot鉴定实施例1所表达纯化的LTB的结果图。
图2a是200倍光学显微镜下观察到的壳聚糖微米颗粒；
图2b是200倍光学显微镜下观察到的实施例1制备的病毒性肾综合征出血热粘膜免疫疫苗。
图3a是实施例1所制备的配伍一疫苗滴鼻和口服粘膜免疫小鼠后诱导产生sIgA效果的统计结果图；
图3b是实施例1所制备的配伍一疫苗滴鼻和口服粘膜免疫小鼠后血清IgG免疫应答效果的统计结果图。
图4a是实施例1所制备的配伍二疫苗滴鼻和口服粘膜免疫小鼠后诱导产生sIgA效果的统计结果图；
图4b是实施例1所制备的配伍二疫苗滴鼻和口服粘膜免疫小鼠后血清IgG免疫应答效果的统计结果图。
具体实施方式
下面结合附图，通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1、疫苗的制备
一、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的表达纯化
1、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因的扩增
1)PCR扩增引物
上游引物：5’-CAT CCATGGCTC CCC AGT CTA-3’(含Nco I位点)
下游引物：5’-TAA CTC GAG GTT TTC CAT ACT-3’(含Xho I位点)
2)PCR扩增条件
PCR反应体系为100μl，体系组成为：
10×缓冲液：10μl
4×dNTP(各2.5mmol/L)：5μl
上游引物(10pmol/L)：2.5μl
下游引物(10pmol/L)：2.5μl
反应模板：大肠杆菌(E.coli)菌株H10407菌液2μl
高保真DNA聚合酶(5U/μl)：0.5μl
双蒸水：77.5μl
PCR反应条件为：95℃40s，52℃45s，72℃45s，共30个循环，PCR结束后1.5％琼脂糖凝胶纯化回收
3)pET22b-LTB表达载体构建
上述PCR产物和pET22b质粒(德国Novagen公司)用限制性内切酶Nco I和Xho I酶切后，1.5％琼脂糖凝胶纯化回收，用T4 DNA连接酶连接转化DH5α菌株，挑取阳性克隆，DNA测序验证，得到含有LTB基因的重组质粒pET22b-LTB。
2、LTB基因的诱导表达，纯化与鉴定
取pET22b质粒和上述获得的pET22b-LTB质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，接种于2×YT培养基37℃振荡培养至OD600达到0.8左右，加入终浓度为10g/L的乳糖进行室温诱导培养6h。之后6500g离心15分钟收获菌体，常规方法提取目的蛋白，Ni2+亲和层析纯化，1×PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4)缓冲液透析得到带His-Tag的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)。Bradford法测定LTB含量，储存液浓度调整为10-25μg/mL。
通过SDS-PAGE电泳(图1a)和western blot(图1b)鉴定，结果显示LTB获得成功表达和纯化，图中箭头所示为目的蛋白。图1a中：M1为分子量标记物；1为含pET22b质粒的BL21菌体表达的总蛋白(对照)；2为含pET22b-LTB质粒的BL21菌经10g/L乳糖诱导后表达的总蛋白；3为表达并纯化出的目的蛋白LTB。图1b中：M2为分子量标记物，1为含pET22b质粒的BL21菌体表达的总蛋白(对照)；2为表达并纯化出的目的蛋白LTB。
二、壳聚糖胶体溶液的制备
量取0.25ml冰醋酸溶解于100ml双蒸水中获得0.25％醋酸溶液。称取药用级乙酰化壳聚糖(85％乙酰化)0.2-0.5g，溶解于0.25％醋酸溶液100ml中，即获得0.2-0.5％g/ml壳聚糖溶液。之后加入终浓度为0.001-0.05％的多聚磷酸钠，室温混匀得到含壳聚糖微米颗粒的胶体溶液，光学显微镜下可见均匀分散的微米粒子，此即壳聚糖微米颗粒(如图2a示)。
三、灭活汉坦病毒的制备
1、采用2.5升转瓶加含500毫升10％胎牛血清的eagle’s培养基(生长液)，接种VeroE6细胞传代培养，培养条件为37℃，5％CO2，转速10rpm；
2、待细胞贴壁并长满后，弃掉培养基，按1∶200接种汉坦病毒，吸附2小时后补加含2％胎牛血清的eagle’s培养基(维持液)继续培养7-9天；
3、收集上清，4℃下β-丙内酯灭活24小时，37℃水解2小时；
4、将上述灭活病毒原液采用滤板(300k pellicon，美国Millipore公司)浓缩大约50倍；
5、分子筛(Sepharose 4FF column)过柱纯化，其中平衡和洗脱液均为1×PBS，最终纯化的灭活汉坦病毒为液体形式存在，溶剂为1×PBS。双抗体夹心酶连免疫吸附试验检测纯化灭活病毒的抗原活性；
6、加入终浓度为0.5-1％g/ml人血清白蛋白作为稳定灭活病毒的保护剂，然后用紫外比色法(280nm)确定总蛋白含量，之后调整灭活汉坦病毒储存液的体积，使总蛋白浓度为20-500μg/mL。
四、肾综合征出血热粘膜免疫疫苗的配伍
配伍一：量取汉坦病毒储存液(含灭活的家鼠型或野鼠型单一型别的汉坦病毒，或是家鼠型和野鼠型等量混合物)2.5μL，量取LTB储存液0.5μL，量取2-7μL上述壳聚糖微米颗粒胶体溶液中，室温均匀混合后得5-10μL配伍肾综合征出血热粘膜免疫疫苗。取一滴疫苗在光学显微镜下(放大200倍)可见为均匀分散的微米小颗粒(如图2b所示)，根据标尺可见比单纯的壳聚糖微米颗粒(图2a)大1倍左右。
酶联免疫实验证实，在壳聚糖胶体溶液中加入灭活汉坦病毒后，灭活病毒被包裹到壳聚糖微米颗粒中。采用双体夹心法检测，取96孔板，每孔100ng抗汉坦病毒核蛋白单抗包被，4℃过夜，之后加入配伍一疫苗，阳性对照为灭活病毒原液，阴性对照为PBS缓冲液，各设4个复孔，37℃温育2小时。然后洗板，加入辣根过氧化物酶标记的抗汉坦病毒核蛋白单抗，37℃温育1小时。PBS-T洗板6次显色，记录450nm下吸光度值，结果见表1。
表1：检测壳聚糖包裹灭活病毒情况
| 分组 | 本发明 | 阳性对照 | 阴性对照 |
| 吸光度 | 0.134 0.109 0.147 0.127 | 0.771 0.701 0.716 0.694 | 0.112 0.099 0.089 0.11 |
| 均值 | 0.130 | 0.720 | 0.102 |
从表中可以看出本发明与阳性对照相比吸光度值明显下降(0.720/0.130比值＞2)，由此可间接推断灭活病毒已经包裹于壳聚糖胶体溶液中并仍以微米颗粒形式存在(图2b)
配伍二：量取汉坦病毒储存液2.5μL与2.5-7.5μL壳聚糖胶体溶液室温均匀混合后得5-10μL配伍肾综合征出血热粘膜免疫疫苗。
阴性对照组配伍：即仅用灭活病毒进行免疫接种，量取汉坦病毒储存液2.5μL与2.5-7.5μL1×PBS室温均匀混合。
实施例2、疫苗的检验
一、肾综合征出血热粘膜免疫疫苗安全性实验
因本发明疫苗中存在大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位，而大肠杆菌不耐热肠毒素是导致腹泻的主要毒素之一，虽然理论上B亚单位为无毒的，但基于以后本发明要应用于人群接种的安全性考虑，首先在细胞和实验动物水平进行了毒性评估。
细胞水平
采用哺乳动物细胞系Vero E6进行，阳性对照组为商业霍乱毒素0.1μg/mL，样本组分别加10μg/mL，20μg/mL，50μg/mL，100μg/mL LTB，细胞培养3天后阳性对照组开始出现细胞脱落、缩小等症状，5天细胞明显脱落死亡。而样本组均生长良好。
动物水平
6～8周龄雌C57BL/6小鼠随机分两组，每组6只。将上述肾综合征出血热粘膜免疫疫苗口服10倍剂量，同时设立口服PBS对照组。观察各组小鼠的是否有腹泻症状。结果实验组和对照组小鼠大便正常，均无腹泻症状。
二、肾综合征出血热粘膜免疫疫苗免疫效果实验结果
1、实验动物分组：6～8周龄，雌C57BL/6小鼠随机分8组，每组6只，其中配伍一4组：分别为滴鼻接种及对照组，口服接种及对照组；配伍二4组：分别为滴鼻接种及对照组，口服接种及对照组。；
2、肾综合征出血热粘膜免疫疫苗接种：滴鼻免疫组和口服免疫组，取肾综合征出血热粘膜免疫疫苗(配伍一和配伍二)进行滴鼻和口服免疫接种，每次接种5-10微升，其相应的对照组为单独用灭活汉坦病毒。免疫方式为0，14d，28d接种三次。
3、粘膜免疫抗体应答：粘膜免疫结束后，通过1×PBS冲洗小鼠阴道后收集冲洗液约50μl/只，通过断尾采血，分离血清。ELISA方法检测粘膜免疫后粘膜免疫分泌型IgA抗体(sIgA)和体液免疫IgG应答。具体操作程序为：
(1)取表达并纯化的汉坦病毒核蛋白(梁米芳等，中华实验和临床病毒学杂志，1993；7(3)：225)包被96孔酶标板，4℃过夜，5％脱脂奶封闭后备用。
(2)粘膜免疫反应sIgA的检测：阴道冲洗液约按(1∶2)稀释加入上述96孔板，37℃2小时，之后PBS-T(含0.1％吐温-100的磷酸盐缓冲液)洗板三次，加入辣根过氧化物酶标羊抗鼠sIgA，37℃1.5小时；粘膜免疫血清IgG检测：取相应免疫血清按1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200倍比稀释后加入96孔板，37℃2小时，之后PBS-T洗板三次，加入辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG，37℃1.5小时。
(3)反应完毕后PBS-T洗板6次，DAB(邻苯二胺)显色，4N H2SO4终止，记录OD.450值。
(4)数据处理：血清IgG抗体免疫应答结果采用抗体稀释倍数取对数后平均值±SD表示，粘膜免疫sIgA结果直接450nm吸光度均值±SD表示，免疫组与对照组间数据分析采用Student’s t检验(p＜0.05)。
实验结果显示，本发明经滴鼻、口服与对照组相比均能有效(p＜0.01)刺激机体产生特异粘膜免疫sIgA抗体(图3a，4a)和体液免疫IgG抗体应答(图3b，4b)。滴鼻、口服组特异粘膜免疫sIgA抗体反应结果分别为0.340±0.041和0.308±0.057，特异血清IgG抗体反应结果分别为2.803±0.155和2.502±0.246。
4、微量中和试验测定中和抗体滴度：Vero E6细胞消化后接种96孔板，培养过夜待贴壁即可用于实验。取100TCID50汉坦病毒与2倍稀释C57BL/6小鼠免疫血清等体积混合，4℃中和过夜。将中和完毕的混合液接种于上述96孔板中，每个稀释度4孔重复，37℃继续培养7天后检测细胞染毒情况。中和抗体滴度用50％或绝大部分(80％以上)细胞孔被中和抑制的血清最高稀释度的倒数表示。
微量中和实验结果显示肾综合征出血热粘膜免疫疫苗配伍一和二经滴鼻和口服可产生较强保护性中和抗体，抗体滴度分别为1∶16和1∶8左右(表2)。
表2：滴鼻和口服免疫组鼠血清中抗汉坦病毒中和活性结果
*灭活汉坦病毒与铝剂混合皮下注射，即用传统疫苗进行免疫；
**在不加佐剂的情况下，单用灭活汉坦病毒滴鼻；
***在不加佐剂的情况下，单用灭活汉坦病毒口服。
由上述实验可以证明：
1、本发明的肾综合征出血热粘膜免疫用疫苗制备方便、经济，免疫简便易行，低疼痛，易于接受。
2、本发明的肾综合征出血热粘膜免疫用疫苗可以经鼻腔和口服两种途径免疫接种，这两种途径接种均可产生较强保护性中和抗体。
3、动物实验表明，本发明具有良好的生物安全性，能有效激发机体对汉坦病毒产生特异的局部和系统免疫应答，可以用于新型肾综合征出血热疫苗的生产。
Claims (10)
1.一种粘膜免疫用肾综合征出血热疫苗，其包含灭活汉坦病毒和壳聚糖，所述灭活汉坦病毒来源于一种或多种型别的会引起肾综合征出血热的汉坦病毒，壳聚糖以微米颗粒的形式存在，灭活汉坦病毒被包裹于壳聚糖微米颗粒中。
2.如权利要求1所述的肾综合征出血热粘膜免疫用疫苗，其特征在于：所述灭活汉坦病毒是家鼠型和/或野鼠型灭活汉坦病毒。
3.如权利要求1所述的粘膜免疫用肾综合征出血热疫苗，其特征在于：所述壳聚糖分子量为2100-2210，乙酰化度为80-90％。
4.如权利要求1所述的粘膜免疫用肾综合征出血热疫苗，其特征在于：该疫苗中壳聚糖的含量为0.1％～0.4％g/mL。
5.如权利要求1所述的肾综合征出血热粘膜免疫用疫苗，其特征在于：该疫苗还包含大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位，其含量为0.5-5μg/mL。
6.如权利要求1～5中任一权利要求所述的肾综合征出血热粘膜免疫用疫苗，其特征在于：所述疫苗以pH 6.5-8.0的胶体溶液或悬浮液形式存在。
7.权利要求1所述肾综合征出血热粘膜免疫用疫苗的制备方法，先分别制备灭活汉坦病毒储存液和壳聚糖胶体溶液，然后将二者混合。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖胶体溶液的制备包括：先将医用级别的壳聚糖溶解，滤膜过滤除菌后加入多聚磷酸钠得到壳聚糖胶体溶液，其中壳聚糖浓度为0.2％-0.5％g/mL，多聚磷酸钠浓度为0.001-0.05％g/mL。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖分子量为2100-2210，乙酰化度为80-90％。
10.如权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于：首先，按照下列步骤1)～4)制备灭活汉坦病毒储存液：1)细胞培养汉坦病毒后收获病毒；2)用β-丙内酯或福尔马林灭活病毒；3)浓缩后过柱纯化病毒，之后添加终浓度为0.5-1％g/ml的人血清白蛋白作为保护剂；4)调整溶液体积，使总蛋白浓度为20-500μg/mL；然后将该灭活汉坦病毒储存液与壳聚糖胶体溶液按体积比1∶1-1∶4混合。
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