CN107056901B - 脑膜炎双球菌组合物及其方法 - Google Patents

脑膜炎双球菌组合物及其方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107056901B
CN107056901B CN201710129205.3A CN201710129205A CN107056901B CN 107056901 B CN107056901 B CN 107056901B CN 201710129205 A CN201710129205 A CN 201710129205A CN 107056901 B CN107056901 B CN 107056901B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
polypeptide
lipidated
amino acid
neisseria meningitidis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710129205.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107056901A (zh
Inventor
A·S·安德森
S·K·霍伊塞思
K·U·扬森
J·K·莫兰
M·E·鲁彭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Inc
Original Assignee
Pfizer Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Inc filed Critical Pfizer Inc
Publication of CN107056901A publication Critical patent/CN107056901A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107056901B publication Critical patent/CN107056901B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/36—Neisseria

Abstract

一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其包含与SEQ ID NO:71具有至少95％相同性的氨基酸序列。另一方面，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽，以及至少一种来自脑膜炎双球菌血清群之缀合的荚膜糖。

Description

脑膜炎双球菌组合物及其方法
本发明是申请日为2013年3月6日，申请号为201380021485.6，标题为“脑膜炎双球菌组合物及其方法”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)组合物及其方法。
背景技术
脑膜炎双球菌为一种可以引起败血症、脑膜炎及死亡之革兰氏阴性荚膜细菌。脑膜炎双球菌基于化学上及抗原性上独特之多糖荚膜而可分为约13个血清群(包括血清群A、B、C、E29、H、I、K、L、W-135、X、Y及Z)。其中五个血清群(A、B、C、Y及W135)为大部分疾病之成因。
脑膜炎双球菌性脑膜炎为一种毁灭性疾病，尽管可使用抗生素，但其可以在数小时内致使儿童及年轻成人死亡。需要针对脑膜炎双球菌血清群A、B、C、Y及W135及/或X之经改良之免疫原性组合物。
发明内容
为了满足这些及其它需要，本发明涉及脑膜炎双球菌组合物及其方法。
一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其包括与SEQ ID NO:71具有至少95％相同性之氨基酸序列，其中该序列的前二十个氨基酸残基不含半胱氨酸。
在一个实施方式中，所述分离的多肽包括SEQ ID NO:71之位置1至184之氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述分离的多肽包括SEQ ID NO:71之位置158至185之氨基酸序列。在另一实施方式中，所述分离的多肽包括SEQ ID NO:71之位置159至186之氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述分离的多肽包括SEQ ID NO:71之位置185至254之氨基酸序列中至少6个连续氨基酸。
在一个实施方式中，所述分离的多肽系非丙酮酸化。
在一个实施方式中，所述分离的多肽系非脂化。
在一个实施方式中，所述分离的多肽具有免疫原性。
在一个实施方式中，所述分离的多肽包括由SEQ ID NO:71中所示之序列组成的氨基酸序列。
一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其包括与SEQ ID NO:76具有至少95％相同性之氨基酸序列，其中该序列的前二十个氨基酸残基不含半胱氨酸。
在一个实施方式中，所述分离的多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:76。
在一个实施方式中，所述分离的多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:76，其中位置1之半胱氨酸系经删除。在另一实施方式中，所述分离的多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:76，其中位置1之半胱氨酸由非Cys残基之氨基酸取代。在一个实施方式中，所述分离的多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:77。
在一个实施方式中，所述分离的多肽系非丙酮酸化。在一个实施方式中，所述分离的多肽系非脂化。在一个实施方式中，所述分离的多肽具有免疫原性。
另一方面，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括如上述任何实施方式中之多肽。另一方面，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括如本文所述之任何实施方式中之多肽。
一方面，本发明涉及一种分离的核酸序列，其编码由SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列组成的分离的多肽。
在一个实施方式中，所述分离的核酸序列包括SEQ ID NO:72。
一方面，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽，及至少一种选自以下之缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物；b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物；c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物；及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包括至少两种选自以下之缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物；b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物；c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物；及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包括至少三种选自以下之缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物；b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物；c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物；及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包括脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物；脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物；脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物；及脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
在一个实施方式中，所述多肽为亚家族A多肽。
在一个实施方式中，所述多肽为亚家族B多肽。
在一个实施方式中，所述多肽为非丙酮酸化且非脂化之A05。
在一个实施方式中，所述多肽为非丙酮酸化且非脂化之A12。
在一个实施方式中，所述多肽为非丙酮酸化且非脂化之A22。
在一个实施方式中，所述多肽为非丙酮酸化且非脂化之B01。
在一个实施方式中，所述多肽为非丙酮酸化且非脂化之B09。
在一个实施方式中，所述多肽为非丙酮酸化且非脂化之B44。
在一个实施方式中，所述多肽为非丙酮酸化且非脂化之B22。
在一个实施方式中，所述多肽为非丙酮酸化且非脂化之B24。
在一个实施方式中，所述多肽为非丙酮酸化且非脂化之A62。
在一个实施方式中，所述多肽包括选自SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:75的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:77。
一方面，本发明涉及一种诱导哺乳动物针对脑膜炎双球菌之免疫应答的方法。该方法包括给该哺乳动物施用有效量之免疫原性组合物，该免疫原性组合物包括来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽，及选自以下之至少一种缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物；b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物；c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物；及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物针对脑膜炎双球菌血清群C之杀细菌性抗体的方法。该方法包括给该哺乳动物施用有效量之免疫原性组合物，该免疫原性组合物包括来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽。
在一个实施方式中，该多肽由SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列或选自以下序列的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21，其中位置1之半胱氨酸系经删除。在另一实施方式中，该多肽包括SEQ ID NO:76中所示之氨基酸序列。在另一实施方式中，该多肽之位置1之半胱氨酸系经删除。在另一实施方式中，该多肽包括SEQ ID NO:77中所示之氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物进一步包括至少一种选自以下之缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物；b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物；c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物；及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物针对脑膜炎双球菌血清群Y之杀细菌性抗体的方法。该方法包括给该哺乳动物施用有效量之免疫原性组合物，该免疫原性组合物包括来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽。
在一个实施方式中，该多肽由SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列或选自以下序列的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21，其中位置1之半胱氨酸系经删除。在另一实施方式中，该多肽包括SEQ ID NO:76中所示之氨基酸序列。在另一实施方式中，该多肽之位置1之半胱氨酸系经删除。在另一实施方式中，该多肽包括SEQ ID NO:77中所示之氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物进一步包括至少一种选自以下之缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物；b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物；c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物；及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
另一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物针对脑膜炎双球菌之杀细菌性抗体的方法，其包括给该哺乳动物施用有效量之免疫原性组合物，该免疫原性组合物包括来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽，及至少一种选自以下之缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物；b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物；c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物；及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
附图说明
图1：P2086变体核酸序列。
图2：P2086变体氨基酸序列。各变体之N端尾中之Gly/Ser茎部(stalk)加下划线。
图3：ORF2086蛋白质之结构。
图4：N端Cys之移除导致在大肠杆菌(E.coli)中之表达丧失。
图5：Gly/Ser茎部长度对非脂化之ORF2086变体表达之影响。与标记为B01之蛋白质变体有关之序列示于SEQ ID NO:35中。与标记为B44之蛋白质变体有关之序列示于SEQID NO:36中。与标记为A05之蛋白质变体有关之序列示于SEQ ID NO:37中。与标记为A22之蛋白质变体有关之序列示于SEQ ID NO:38中。与标记为B22之蛋白质变体有关之序列示于SEQ ID NO:39中。与标记为A19之蛋白质变体有关之序列示于SEQ ID NO:40中。
图6：Gly/Ser茎部虽短，但非脂化之B09之表达水平高。左边两个泳道表明在诱导之前及之后N端Cys删除型B09变体的表达。第三及第四泳道表明在诱导之前及之后N端Cys阳性B09变体的表达。最右边之泳道为分子量标准。图像下方所示之氨基酸序列示于SEQ IDNO:41。在图中称为“A22_001”之表示N端Cys删除型A22变体之核苷酸序列示于SEQ ID NO:42中，其在图中展示于SEQ ID NO:41下方。在图中称为“B22_001”之表示N端Cys删除型B22变体之核苷酸序列示于SEQ ID NO:52中。在图中称为“B09_004”之表示N端Cys删除型B09变体之核苷酸序列示于SEQ ID NO:53中。
图7：密码子优化增加非脂化之B22及A22变体之表达。左侧画面表示在IPTG诱导之前(泳道1及3)及之后(泳道2及4)N端Cys删除型B22变体之表达。右侧画面表示在IPTG诱导之前(泳道7)及之后(泳道8)N端Cys删除型A22变体之表达。泳道5及6为分子量标准。
图8：P2086变体核酸及氨基酸序列。
图9A至9B：实施例15至19中所论述之所选的野生型亚家族A与B fHBP变体之序列比对。应注意，A62之N端与B09 100％相同且其C端与A22100％相同。所示序列为A05(SEQ IDNO:13)；A12(SEQ ID NO:14)；A22(SEQ ID NO:15)；A62(SEQ ID NO:70)；B09(SEQ ID NO:18)；B24(SEQ ID NO:20)；及共有序列(SEQ ID NO:78)。
序列标示符
SEQ ID NO:1给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A04基因之DNA序列，其包括编码N端Cys之密码子。
SEQ ID NO:2给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A05基因之DNA序列，其包括编码N端Cys之密码子。
SEQ ID NO:3给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A12基因之DNA序列，其包括编码N端Cys之密码子。
SEQ ID NO:4给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A12-2基因之DNA序列，其包括编码N端Cys之密码子。
SEQ ID NO:5给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A22基因之DNA序列，其包括编码N端Cys之密码子。
SEQ ID NO:6给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B02基因之DNA序列，其包括编码N端Cys之密码子。
SEQ ID NO:7给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B03基因之DNA序列，其包括编码N端Cys之密码子。
SEQ ID NO:8给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B09基因之DNA序列，其包括编码N端Cys之密码子。
SEQ ID NO:9给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B22基因之DNA序列，其包括编码N端Cys之密码子。
SEQ ID NO:10给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B24基因之DNA序列，其包括编码N端Cys之密码子。
SEQ ID NO:11给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B44基因之DNA序列，其包括编码N端Cys之密码子。
SEQ ID NO:12给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A04之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:13给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A05之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:14给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A12之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:15给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A22之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:16给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B02之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:17给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B03之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:18给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B09之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:19给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B22之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:20给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B24之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:21给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B44之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:22给出了实施例2中所示之正向引物之DNA序列。
SEQ ID NO:23给出了实施例2中所示之反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:24给出了实施例2表1中所示之正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:25给出了实施例2表1中所示之反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:26给出了实施例2表1中所示之正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:27给出了实施例2表1中所示之反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:28给出了实施例4中所示之Gly/Ser茎部之DNA序列。
SEQ ID NO:29给出了由例如SEQ ID NO:28编码之实施例4中所示之Gly/Ser茎部之氨基酸序列。
SEQ ID NO:30给出了实施例4中所示之Gly/Ser茎部之DNA序列。
SEQ ID NO:31给出了由例如SEQ ID NO:30编码之实施例4中所示之Gly/Ser茎部之氨基酸序列。
SEQ ID NO:32给出了实施例4中所示之Gly/Ser茎部之DNA序列。
SEQ ID NO:33给出了由例如SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:34编码之Gly/Ser茎部之氨基酸序列。
SEQ ID NO:34给出了实施例4中所示之Gly/Ser茎部之DNA序列。
SEQ ID NO:35给出了图5中所示之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B01之N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36给出了图5中所示之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B44之N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37给出了图5中所示之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A05之N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38给出了图5中所示之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A22之N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39给出了图5中所示之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B22之N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40给出了图5中所示之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A19之N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41给出了图6中所示之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体之N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42给出了图6中所示之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A22之N端的DNA序列。
SEQ ID NO:43给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B44基因之经密码子优化之DNA序列，其中相较于SEQ ID NO:11，删除了编码N端半胱氨酸之密码子。质粒pDK087包括SEQ ID NO:43。
SEQ ID NO:44给出了非脂化之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B44之氨基酸序列。SEQ ID NO:44与SEQ ID NO:21相同，其中删除了SEQ ID NO:21之位置1之N端半胱氨酸。SEQ ID NO:44由例如SEQ ID NO:43编码。
SEQ ID NO:45给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B09基因之经密码子优化之DNA序列，其中相较于SEQ ID NO:8，删除了编码N端半胱氨酸之密码子，且其中该序列包括编码另外之Gly/Ser区域之密码子。质粒pEB063包括SEQ ID NO:45。
SEQ ID NO:46给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B09基因之经密码子优化之DNA序列，其中相较于SEQ ID NO:8，删除了编码N端半胱氨酸之密码子。质粒pEB064包括SEQ ID NO:46。
SEQ ID NO:47给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B09基因之经密码子优化之DNA序列，其中相较于SEQ ID NO:8，删除了编码N端半胱氨酸之密码子。质粒pEB065包括SEQ ID NO:47。
SEQ ID NO:48给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B09基因之DNA序列，其中相较于SEQ ID NO:8，删除了编码N端半胱氨酸之密码子。质粒pLA134包括SEQ ID NO:48。
SEQ ID NO:49给出了非脂化之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B09的氨基酸序列。SEQ ID NO:49与SEQ ID NO:18相同，其中删除了SEQ ID NO:18之位置1之N端半胱氨酸。SEQ ID NO:49由例如选自SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:48的DNA序列编码。
SEQ ID NO:50给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B09之氨基酸序列，其中删除了相较于SEQ ID NO:18编码N端半胱氨酸之密码子，且其中该序列包括编码另外之Gly/Ser区域之密码子。SEQ ID NO:50由例如SEQ ID NO:45编码。
SEQ ID NO:51给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B44基因之DNA序列，其中相较于SEQ ID NO:11，删除了编码N端半胱氨酸之密码子。质粒pLN056包括SEQ ID NO:51。
SEQ ID NO:52给出了图6中所示之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B22之N端的DNA序列。
SEQ ID NO:53给出了图6中所示之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B09之N端的DNA序列。
SEQ ID NO:54给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A05基因之DNA序列，其中相较于SEQ ID NO:2，删除了编码N端半胱氨酸之密码子。
SEQ ID NO:55给出了非脂化之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A05的氨基酸序列。SEQ ID NO:55与SEQ ID NO:13相同，其中删除了SEQ ID NO:13之位置1之N端半胱氨酸。SEQ ID NO:55由例如SEQ ID NO:54编码。
SEQ ID NO:56给出了实施例7中所示之丝氨酸-甘氨酸重复序列之氨基酸序列。
SEQ ID NO:57给出了非脂化之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B01的氨基酸序列。SEQ ID NO:57与SEQ ID NO:58相同，其中删除了SEQ ID NO:58之位置1之N端半胱氨酸。
SEQ ID NO:58给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B01之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:59给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B15之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:60给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B16之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:61给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B22之DNA序列，其中SEQID NO:19之氨基酸位置1之N端Cys之密码子由甘氨酸之密码子置换。
SEQ ID NO:62给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B22之氨基酸序列，其中SEQ ID NO:19之氨基酸位置1之N端Cys由甘氨酸置换。
SEQ ID NO:63给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A22之DNA序列，其中SEQID NO:15之氨基酸位置1之N端Cys的密码子由甘氨酸之密码子置换。
SEQ ID NO:64给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A22之氨基酸序列，其中SEQ ID NO:15之氨基酸位置1之N端Cys由甘氨酸置换。
SEQ ID NO:65给出了编码非脂化且非丙酮酸化之A05多肽的经密码子优化之DNA序列(pEB042)。
SEQ ID NO:66给出了非脂化之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A12的氨基酸序列。SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:14相同，其中SEQ ID NO:14之位置1之N端半胱氨酸系经删除。SEQ ID NO:66由例如SEQ ID NO:67编码。
SEQ ID NO:67给出了非脂化且非丙酮酸化之A12多肽的经密码子优化之DNA序列。
SEQ ID NO:68给出了非脂化之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A22的氨基酸序列。SEQ ID NO:68与SEQ ID NO:15相同，其中删除了SEQ ID NO:15之位置1之N端半胱氨酸。SEQ ID NO:68由例如SEQ ID NO:69编码。
SEQ ID NO:69给出了非脂化且非丙酮酸化之A22多肽的经密码子优化之DNA序列。
SEQ ID NO:70给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A62之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:71给出了非脂化之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A62的氨基酸序列。SEQ ID NO:71与SEQ ID NO:70相同，其中删除了SEQ ID NO:70之位置1之N端半胱氨酸。
SEQ ID NO:72给出了SEQ ID NO:71之经密码子优化之DNA序列。
SEQ ID NO:73给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A05基因之经密码子优化之DNA序列(pDK086)，其中相较于SEQ ID NO:2，删除了编码N端半胱氨酸之密码子。
SEQ ID NO:74给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A29之氨基酸序列，其在氨基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:75给出了非脂化之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B22的氨基酸序列。SEQ ID NO:75与SEQ ID NO:19相同，其中删除了SEQ ID NO:19之位置1之N端半胱氨酸。
SEQ ID NO:76给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A05的氨基酸序列。
SEQ ID NO:77给出了非脂化之脑膜炎双球菌血清群B之2086变体A05的氨基酸序列。SEQ ID NO:77与SEQ ID NO:19相同，其中SEQ ID NO:76之位置1之N端半胱氨酸不存在。
SEQ ID NO:78给出了图9A至9B中所示之共同序列之氨基酸序列。
SEQ ID NO:79除不存在SEQ ID NO:78之位置1之Cys外与SEQ ID NO:78相同。
SEQ ID NO:80给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B24的氨基酸序列。SEQ IDNO:80与SEQ ID NO:20相同，其中删除了SEQ ID NO:20之位置1之N端半胱氨酸。
SEQ ID NO:81给出了脑膜炎双球菌血清群B之2086变体B24的氨基酸序列。SEQ IDNO:81与SEQ ID NO:20相同，其中删除了SEQ ID NO:20之位置1至3之残基。
发明详述
除非另外定义，否则本文所用之所有技术及科学术语的意义与一般本发明所属领域的普通技术人员通常所了解之意义相同。尽管在实践或测试本发明时可使用类似于或等效于本文所述方法及材料的方法及材料，但在下文中描述适合之方法及物质。这些物质、方法及实施例仅具说明性，而不是要具有限制性。本文提及之所有出版物、专利及其它文献以引用方式全文并入本文中。
定义
术语“抗原”一般系指含有同源抗体可选择性结合之至少一个表位的生物分子，通常为蛋白质、肽、多糖、脂质或缀合物；或在有些情况下系指可刺激动物产生抗体或T细胞应答或两者皆具之免疫原性物质，包括注射或吸收至动物体内之组合物。免疫应答可针对整个分子或该分子各个部分之一或多个(例如表位或半抗原)产生。该术语可用以指个别分子或抗原性分子之同源或异源群体。抗原由抗体、T细胞受体或特异性体液及/或细胞免疫之其它元件识别。术语“抗原”包括所有相关之抗原表位。给定抗原之表位可使用此项技术中熟知之许多表位定位技术鉴定。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology,Vol.66(Glenn E.MorrisEd.,1996)Humana Press,Totowa,N.J。举例而言，线性表位可藉由下述方法确定，例如，在固体支撑物上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白质分子之部分，以及当所述肽仍与所述支撑物连接时使所述肽与抗体反应。这些技术为本领域已知的且描述于例如美国专利第4,708,871号；Geysen等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；Geysen等人,(1986)Molec.Immunol.23:709-715中，上述文献皆以引用方式全文并入本文中。相似地，构象表位可藉由通过诸如X射线结晶学及二维核磁共振确定的氨基酸空间构象来鉴定。参见例如Epitope Mapping Protocols(同上)。此外，出于本发明之目的，“抗原”亦可用以指包括对天然序列的修饰(诸如删除、添加及取代(一般为性质上保守的，但可为非保守的))的蛋白质，只要该蛋白质维持引起免疫应答之能力即可。这些修饰可为有意的，如经由定点突变诱发或经由特定合成程序或经由基因工程方法达成，或可为偶然的，诸如经由产生抗原之宿主突变所致。此外，所述抗原可自微生物(例如细菌)产生、获得或分离或可为整个生物体。相似地，在此定义中亦包括诸如在核酸免疫接种应用中表达抗原之寡核苷酸或多核苷酸。亦包括合成抗原，例如多表位(polyepitope)、侧翼表位及其它重组或合成衍生之抗原(Bergmann等人,(1993)Eur.J.Immunol.23:2777 2781；Bergmann等人,(1996)J.Immunol.157:3242 3249；Suhrbier,A.(1997)Immunol.and Cell Biol.75:402 408；Gardner等人,(1998)12thWorld AIDS Conference,Geneva,Switzerland,1998年6月28日-7月3日)。
术语“保守性”氨基酸取代可基于所涉及残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性及/或酸碱兼性性质方面之相似性来进行。举例而言，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸及甲硫氨酸；极性/中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸及组氨酸；以及带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸及谷氨酸。在一些实施方式中，所述保守性氨基酸变化会改变ORF2086多肽之一级序列，但不改变分子之功能。当产生这些突变体时，可考虑氨基酸之亲水指数。氨基酸亲水指数在赋予多肽以相互作用的生物学功能方面的重要性是本领域普遍理解的(Kyte&Doolittle,1982,J.Mol.Biol.,157(1):105-32)。已知某些氨基酸可经其它具有相似亲水指数或得分之氨基酸取代且仍产生具有相似生物学活性之多肽。各氨基酸已基于其疏水性及电荷特征指定亲水指数。那些指数为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；及精氨酸(-4.5)。
相信氨基酸残基之相对亲水特征确定所得多肽之二级及三级结构，继而限定所述多肽与其它分子(诸如酶、基质、受体、抗体、抗原及其类似分子)之相互作用。本领域已知氨基酸可经具有相似亲水指数之另一氨基酸取代且仍获得功能等效之多肽。在该等变化中，优选亲水指数相差+/-2以内之氨基酸的取代优选，特别优选亲水指数相差+/-1以内之氨基酸的取代优选，更优选亲水指数相差+/-0.5以内之氨基酸的取代优选。
亦可基于亲水性进行保守性氨基酸取代或插入。如美国专利第4,554,101号(其以引用方式并入本文中)中所述，取决于相邻氨基酸之亲水性的多肽最大局部平均亲水性与其免疫原性及抗原性有关，亦即与多肽之生物学特性有关。美国专利第4,554,101号叙述已对氨基酸残基指定下列亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应了解，氨基酸可经具有相似亲水性值之另一氨基酸取代且仍获得生物学上等效且尤其免疫学上等效之多肽。在这些变化中，优选亲水性值相差±2以内之氨基酸的取代优选；特别优选亲水性值相差±1以内之氨基酸的取代优选；更优选亲水性值相差±0.5以内之氨基酸的取代优选。考虑到上述各种特征之例示性取代为本领域技术人员所熟知且包括(不限于)：精氨酸与赖氨酸；谷氨酸与天冬氨酸；丝氨酸与苏氨酸；谷氨酰胺与天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸。
如本文所用之术语“免疫原性有效量”系指多肽或包含多肽之组合物在脊椎动物宿主体内引起免疫应答之有效量。举例而言，本发明rLP2086蛋白之免疫原性有效量为在脊椎动物宿主体内引起免疫应答之有效量。特定之“免疫原性有效剂量或量”将视宿主之年龄、体重及医学病状以及施用方法而定。本领域技术人员可以容易地确定适合之剂量。
如本文所用之术语”Gly/Ser茎部”系指与由ORF2086编码之蛋白质之N端Cys残基紧邻之下游处的一系列Gly及Ser残基。在Gly/Ser茎部中可存在5至12个Gly及Ser残基。因此，Gly/Ser茎部由ORF2086所编码之蛋白质之2位氨基酸至7-13位氨基酸组成。优选地，Gly/Ser茎部由ORF2086所编码之蛋白质之2位氨基酸至最多7-13位氨基酸组成。本发明之P2086变体之Gly/Ser茎部在图2中(SEQ ID NO:12-21)由加下划线之序列表示。如本文所示，Gly/Ser茎部之长度可以影响非脂化之P2086变体之稳定性或表达量。在一例示性实施方式中，将由影响Gly/Ser茎部之长度所产生之效应与相应之野生型变体进行比较。
术语“免疫原性”系指抗原或疫苗引起体液或细胞或两者介导之免疫应答的能力。
“免疫原性量”或“免疫有效量”或“剂量”在本文中可互换使用，一般系指由本领域技术人员已知之标准分析所测量量的抗原或免疫原性组合物的足以引其免疫应答之量，所述免疫应答是细胞(T细胞)应答或体液(B细胞或抗体)应答或两者。
术语“免疫原性组合物”涉及任何含有抗原(例如微生物或其组分)之药物组合物，该组合物可用于引起个体之免疫应答。本发明之免疫原性组合物可用于治疗易受脑膜炎双球菌感染之人类，所述治疗用经由全身性经皮或黏膜途径施用所述免疫原性组合物的方法进行。这些施用可包括经由肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、皮内(i.d.)或皮下途径注射；藉由贴剂或其它经皮传递装置敷用；或经由黏膜施用至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一个实施方式中，所述免疫原性组合物可用于生产疫苗或激发可用于被动地保护或治疗个体之多克隆或单克隆抗体。
特定免疫原性组合物之组分之最佳量可藉由涉及观测个体之适当免疫应答之标准研究来确定。在最初的疫苗接种后，个体可接受一次或多次时间间隔足够长之追加免疫接种。
术语“分离”意谓将物质自其原始环境移出(例如，若其为天然存在的，则自自然环境移出，或若其为重组实体，则自其宿主生物体移出，或自一个环境放入不同之环境)。举例而言，“分离”之蛋白质或肽基本上不含来自产生该蛋白质之细胞或组织来源之细胞物质或其它污染蛋白，或基本上不含在化学合成时或以其它方式存在于作为化学反应之一部分之混合物中的化学前体或其它化学物质。在本发明中，可自细菌细胞或细胞碎片分离蛋白质，以使其以适用于生产免疫原性组合物之形式提供。术语“分离(isolated)”或“分离(isolating)”可包括纯化(purifying)或纯化(purification)，包括例如如本文所述之纯化蛋白质之方法。措辞“基本上不含细胞物质”涉及多肽或蛋白质制剂，其中所述多肽或蛋白质与细胞的细胞组分分开，所述多肽或蛋白质自所述细胞分离或重组产生。因此，基本上不含细胞物质之蛋白质或肽包括荚膜多糖、蛋白质或肽制剂，所述制剂具有少于约30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(以干重计)之污染蛋白或多糖或其它细胞物质。当重组产生多肽/蛋白质时，亦优选基本上不含培养基，亦即培养基占蛋白质制剂之体积的少于约20％、10％或5％。当藉由化学合成产生多肽或蛋白质时，优选优选基本上不含化学前体或其它化学物质，亦即将其与合成蛋白质或多糖所涉及之化学前体或其它化学物质分开。因此，这些多肽或蛋白质制剂具有少于约30％、20％、10％、5％(以干重计)之除感兴趣的多肽/蛋白质或多糖片段以外的化学前体或化合物。
如本文所用之术语“N端尾”系指由ORF2086编码之蛋白质之N端部分，其使蛋白质附于细胞膜。N端尾展示于图3中侧视图结构之底部。N端尾通常包含由ORF2086编码之蛋白质之N端16个氨基酸。在一些实施方式中，N端尾为SEQ ID NO:12-21中任一者之氨基酸1至16。如本文所用之术语“ORF2086”系指奈瑟氏菌属(Neisseria)细菌之开放阅读框2086。奈瑟氏菌属ORF2086、由其编码之蛋白质、那些蛋白质之片段以及包含那些蛋白质之免疫原性组合物为本领域已知且描述于例如WO2003/063766及美国专利申请公开案第US20060257413号及第US 20090202593号中，上述各文献以引用之方式全文并入本文中。
术语“P2086”一般系指由ORF2086编码之蛋白质。“2086”之前的“P”为“蛋白质”的缩写。本发明之P2086蛋白可经脂化或非脂化。“LP2086”及“P2086”通常分别指2086蛋白质之脂化及非脂化形式。本发明之P2086蛋白可为重组蛋白。“rLP2086”及“rP2086”通常分别指重组2086蛋白之脂化及非脂化形式。“2086”因其能够与因子H结合而亦称为因子H结合蛋白(fHBP)。
如本文所用之术语“药学可接受之稀释剂、赋形剂及/或载剂”意欲包括与给人类或其它脊椎动物宿主施用兼容之任何溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂等。通常，药学可接受之稀释剂、赋形剂及/或载剂为经联邦、州政府或其它管理机构批准或列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其它公认之药典中之用于动物(包括人类以及非人类哺乳动物)的稀释剂、赋形剂及/或载剂。术语稀释剂、赋形剂及/或“载剂”系指与药物组合物一起施用之稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体(vehicle)。这些药物稀释剂、赋形剂及/或载剂可为无菌液体，诸如水及油，包括石油、动物、植物或合成来源之油。水、盐水溶液及右旋糖及甘油水溶液可作为液体稀释剂、赋形剂及/或载剂，尤其是用于可注射溶液。适合之药物稀释剂及/或赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要，所述组合物亦可含有少量湿润剂、膨胀剂、乳化剂或pH值缓冲剂。这些组合物可呈溶液、悬浊液、乳液、持续释放配制品等形式。适合之药物稀释剂、赋形剂及/或载剂之实例描述于E.W.Martin之“雷明登氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”中。所述配制品应适于施用方式。适当之稀释剂、赋形剂及/或载剂对于本领域技术人员而言是明显的且在很大程度上将视给药途径而定。
“保护性”免疫应答系指免疫原性组合物引起体液或细胞介导之免疫应答用以保护个体免遭感染之能力。所提供之保护作用不需要为绝对保护作用，亦即不需要完全防止或根除感染，只要相较于对照个体群体(例如未施用疫苗或免疫原性组合物之受感染动物)，存在统计显著性改良作用即可。保护作用可限于减轻感染症状发病之严重度或快速性。一般而言，“保护性免疫应答”将包括诱导至少50％之个体体内针对特定抗原具特异性之抗体水平提高，包括针对各抗原某种程度之可测测量的功能性抗体应答。在特定情况下，“保护性免疫应答”可包括诱导至少50％个体体内对特定抗原具特异性之抗体水平提高至两倍或抗体水平提高至四倍，包括针对各抗原某种程度之可测测量的功能性抗体反应。在某些实施方式中，调理抗体(opsonising antibody)与保护性免疫应答有关。因此，可藉由在血清杀细菌活性(SBA)分析或调理吞噬作用分析(例如下文所述者)中测量的细菌计数降低百分比来分析保护性免疫应答。这些分析亦为本领域已知的。例如，对于脑膜炎双球菌疫苗而言，SBA分析是为保护作用而设立之替代分析。在一些实施方式中，相较于在不存在免疫原性组合物情况下之细菌计数，细菌计数降低至少10％、25％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。
术语“蛋白质”、“多肽”及“肽”指氨基酸残基之聚合物且不限于产物之最小长度。因此，在该定义内包括肽、寡肽、二聚体、多聚体等。该定义涵盖全长蛋白及其片段由。所述术语亦包括相对于天然序列的修饰，诸如删除、添加及取代(一般在性质上为保守的，但其可为非保守的)，优选地，该蛋白质维持在施用该蛋白质之动物体内之引起免疫应答的能力。所述术语亦包括表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、脂化、磷酸化等。
在本文中亦描述所揭示之多核苷酸及多肽之活性变体及片段。“变体”系指基本上相似之序列。如本文所用之变体多肽“变体多肽”系指源自天然蛋白质之藉由对天然蛋白质之N端及/或C端处之一或多个氨基酸进行修饰而产生的多肽。所述修饰可包括删除天然蛋白质之N端及/或C端处之一或多个氨基酸(所谓之截短)；在蛋白质之一或多个内部位点处删除及/或添加一或多个氨基酸；或天然蛋白质中之一或多个位点处一或多个氨基酸之取代。变体多肽继续具有天然多肽之想要的生物学活性，即其具免疫原性。本文公开之多肽或多核苷酸序列之变体(亦即SEQ ID NO:1-25或39)通常将与参照序列具有至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％之序列相同性。
术语“片段”系指包含指定数目之连续氨基酸或核苷酸残基之一部分氨基酸或核苷酸序列。在特定实施方式中，本文公开之多肽之片段可保留全长多肽之生物学活性，因此具免疫原性。多核苷酸之片段可编码保留蛋白质之生物学活性，因此具免疫原性之蛋白质片段。或者，适用作PCR引物之多核苷酸片段一般不保留生物学活性。因此，本文公开之核苷酸序列之片段可在至少约15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、175个、200个、225个、250个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个或1500个连续核苷酸或直至全长多核苷酸的范围内。本文公开之多肽序列之片段可包含至少10个、15个、20个、25个、30个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、225个、250个、275个、300个、400个、425个、450个、475个或500个连续氨基酸，或直至全长多肽中存在之氨基酸总数。
如本文所用之术语“重组”系指藉由基因工程方法产生的任何蛋白质、多肽或表达感兴趣的基因之细胞。如对于蛋白质或多肽使用之术语“重组”意谓藉由使重组多核苷酸表达所产生的多肽。本发明之蛋白质可自天然来源分离或藉由基因工程方法产生。如本文所用之“重组”进一步描述核酸分子，其因其来源或操作而不与其在自然界中所关联之全部或一部分多核苷酸关联。如对于宿主细胞所使用之术语“重组”意谓宿主细胞包括重组多核苷酸。
术语“个体”系指哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或任何其它动物。术语“个体”亦包括人类。术语“个体”亦包括家庭宠物。家庭宠物之非限制性实例包括：狗、猫、猪、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、天竺鼠、雪貂、鸟、蛇、蜥蜴、鱼、龟及蛙。术语“个体”亦包括家畜动物。家畜动物之非限制性实例包括：羊驼、野牛、骆驼、牛、鹿、猪、马、美洲驼、骡、驴、绵羊、山羊、兔、驯鹿、牦牛、鸡、鹅及火鸡。
如本文所用之术语“哺乳动物”系指任何哺乳动物，诸如人类、小鼠、兔、非人类灵长类动物。在一优选实施方式中，所述哺乳动物为人类。
术语“疫苗”或“疫苗组合物”可互换使用，指包含至少一种可诱导个体之免疫应答的免疫原性组合物的药物组合物。
一般描述
本发明亦鉴定出先前未鉴定出之在表达非脂化之P2086变体方面之困难且提供克服这些困难之方法以及由其产生之新颖组合物。虽然编码非脂化之P2086变体的质粒构建体会使得非脂化之变体强烈表达，但这些变体在N端Cys上经丙酮酸化。丙酮酸化会防碍多肽之生产相同性或均一性或降低其可能性。发明人进一步发现自非脂化之P2086变体序列中删除N端Cys可避免非脂化之P2086变体丙酮酸化。试图藉由删除N端Cys之密码子来克服丙酮酸化会消除表达或导致表达不可溶变体。或者，自非脂化之P2086变体移除N端Cys会减少一些变体之表达。然而，令人惊奇的是，发明人发现尽管N端Cys残基经删除，但至少非丙酮酸化且非脂化之A05、A12、A22、A62、B01、B09、B22及B44变体可表达。一般而言，与相应的野生型非脂化之序列相比，这些多肽可在不存在除Cys删除以外之其它修饰的情况下表达。参见例如实施例2及4。此外，发明人发现非丙酮酸化且非脂化之变体惊人地具免疫原性且其出人意料地激发杀细菌性抗体。
因此，本发明提供两种克服在表达非脂化之变体方面的这些困难或降低这些困难之可能性的方法。然而，本发明考虑其它方法。第一种方法为改变N端尾中与N端Cys紧邻之下游处的Gly/Ser茎部之长度。第二种方法为在N端尾内进行密码子优化。然而，本发明考虑对额外的密码子进行优化。这些方法使得可溶性非脂化之P2086变体之表达增强。举例而言，在一个实施方式中，与相应的野生型非脂化之变体之表达相比，可溶性非脂化之P2086变体之表达增强。
分离的多肽
意外地，发明人发现了分离的非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽。发明人进一步发现所述多肽出人意料地具免疫原性且能够引起杀细菌性免疫应答。
如本文所用之术语“非丙酮酸化”系指多肽不具有丙酮酸成分。具有丙酮酸成分之非脂化之ORF2086多肽相较于相应之野生型多肽通常展现+70之质量位移。在一个实施方式中，在藉由质谱测量时，本发明多肽相较于相应之野生型非脂化之多肽未展现+70之质量位移。参见，例如，实施例10。
在另一实施方式中，相较于相应之野生型非脂化之ORF2086多肽，分离的非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽包括N端半胱氨酸残基之删除。术语“N端半胱氨酸”系指多肽之N端或N端尾处之半胱氨酸(Cys)。更具体而言，如本领域已知，如本文所用之“N端半胱氨酸”系指如下N端半胱氨酸，在该N端半胱氨酸上LP2086脂蛋白以三棕榈酰基脂质尾进行脂化。举例而言，在以SEQ ID NO:12-21中之任一者作为参照序列时，N端半胱氨酸位于位置1。作为另一实例，在以SEQ ID NO:70作为参照序列时，N端半胱氨酸位于位置1。
如本文所用之术语“野生型非脂化之ORF2086多肽”或“野生型非脂化之2086多肽”或“野生型非脂化之多肽”系指氨基酸序列与在自然界中发现之相应脂化之成熟ORF2086多肽之氨基酸序列相同的ORF2086多肽。非脂化之分子与脂化之分子之间的唯一差异在于野生型非脂化之ORF2086多肽在N端半胱氨酸处未经三棕榈酰基脂质尾脂化。
如本领域已知，非脂化之2086形式系藉由没有原始前导序列之蛋白质或藉由用一部分未指定用于在宿主细胞中进行脂肪酸酰化之位点的序列置换前导序列而产生。参见，例如，WO2003/063766，其以全文引用的方式并入本文。
非脂化之ORF2086之实例不仅包括刚才所描述之野生型非脂化之ORF2086多肽，且亦包括具有根据SEQ ID NO:12-21中之任一者之氨基酸序列的多肽，其中N端Cys系经删除，以及具有根据SEQ ID NO:12-21中之任一者之氨基酸序列的多肽，其中N端Cys经不为Cys残基之氨基酸取代。非脂化之ORF2086多肽之另一实例包括具有根据SEQ ID NO:70之氨基酸序列的多肽，其中N端Cys系经删除，以及具有根据SEQ ID NO:70之氨基酸序列的多肽，其中N端Cys经不为Cys残基之氨基酸取代。非脂化之ORF2086多肽之其它实施例包括选自以下之氨基酸序列：SEQ ID NO:44(B44)、SEQ ID NO:49(B09)、SEQ ID NO:55(A05)、SEQ ID NO:57(B01)、SEQ ID NO:58(B01)、SEQ ID NO:62(B22)、SEQ ID NO:64(A22)及SEQ ID NO:75(B22)。非脂化之ORF2086多肽之其它实例包括选自SEQ ID NO:66(A12)、SEQ ID NO:68(A22)及SEQ ID NO:71(A62)之氨基酸序列。更多实例包括SEQ ID NO:80(B24)及SEQ IDNO:81(B24)。非脂化之ORF2086多肽之额外的实例包括示于SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77中之氨基酸序列。在一个实施方式中，非脂化之多肽包括与编码相应非脂化之多肽的序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列。举例而言，在一例示性实施方式中，非脂化之A62多肽包括与SEQ ID NO:71具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列。
野生型非脂化之ORF2086多肽之实例包括具有根据SEQ ID NO:12-21(展示于图2中)、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59及SEQ ID NO:60中之任一者之氨基酸序列的多肽。野生型非脂化之ORF2086多肽之另一实例包括具有根据SEQ ID NO:70之氨基酸序列的多肽。这些例示性野生型非脂化之ORF2086多肽包括N端Cys。
如本文所用之例如“非脂化”之B44多肽包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:21、位置1之N端Cys经删除的SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:44。“野生型非脂化”之B44多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:21之多肽。“非丙酮酸化且非脂化”之B44多肽包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：位置1之N端Cys经删除的SEQ ID NO:21以及SEQ IDNO:44。
作为另一实例，如本文所用之“非脂化”之B09多肽包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:18、位置1之N端Cys经删除的SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:49以及SEQID NO:50。“野生型非脂化”之B09多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:18之多肽。“非丙酮酸化且非脂化”之B09包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：位置1之N端Cys经删除的SEQID NO:18、SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:50。
作为另一实例，如本文所用之“非脂化”之A05多肽包括具有选自以下之氨基酸序列之多肽：SEQ ID NO:13、位置1之N端Cys经删除的SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:55。“非脂化”之A05多肽之另一实施例包括具有选自以下之氨基酸序列之多肽：SEQ ID NO:13，其中位置1之N端Cys经不为Cys残基之氨基酸取代。“非脂化”之A05多肽之其它实例包括具有SEQID NO:76中所示之氨基酸序列的多肽。“非脂化”之A05多肽之另一实例包括具有SEQ IDNO:77中所示之氨基酸序列的多肽。“野生型非脂化”之A05包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:13之多肽。“非丙酮酸化且非脂化”之A05包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：位置1之N端Cys经删除的SEQ ID NO:13以及SEQ ID NO:55。“非丙酮酸化且非脂化”之A05之其它实施例包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:13，其中位置1之N端Cys经不为Cys残基之氨基酸取代；SEQ ID NO:76，其中位置1之Cys系经删除；SEQ ID NO:76，其中位置1之Cys经不为Cys残基之氨基酸取代；以及SEQ ID NO:77。
如本文所用之“非脂化”之A62多肽包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：SEQID NO:70、位置1之N端Cys经删除的SEQ ID NO:70，以及SEQ ID NO:71。非脂化之A62多肽之另一实例包括具有SEQ ID NO:70之多肽，其中位置1之N端Cys经不为Cys残基之氨基酸取代。“野生型非脂化”之A62多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:70之多肽。“非丙酮酸化且非脂化”之A62包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：位置1之N端Cys经删除的SEQ IDNO:70，以及SEQ ID NO:71。非丙酮酸化且非脂化之A62多肽之另一实例包括具有SEQ IDNO:70之多肽，其中位置1之N端Cys经不为Cys残基之氨基酸取代。优选地，“非丙酮酸化且非脂化”之A62包括具有SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列的多肽。
如本文所用之“非脂化”之A12多肽包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：SEQID NO:14、位置1之N端Cys经删除的SEQ ID NO:14，以及SEQ ID NO:66。“野生型非脂化”之A12多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:14之多肽。“非丙酮酸化且非脂化”之A12包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：位置1之N端Cys经删除的SEQ ID NO:14，以及SEQ ID NO:66。
如本文所用之“非脂化”之A22多肽包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：SEQID NO:15、位置1之N端Cys经删除的SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:64以及SEQ ID NO:68。“野生型非脂化”之A22多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:15之多肽。“非丙酮酸化且非脂化”之A22包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：位置1之N端Cys经删除的SEQ ID NO:15、SEQID NO:64及SEQ ID NO:68。优选地，“非丙酮酸化且非脂化”之A22包括具有SEQ ID NO:68中所示之氨基酸序列的多肽。
如本文所用之术语“删除”N端Cys包括相较于野生型非脂化之多肽序列使N端Cys经删除的突变。举例而言，“删除”N端Cys系指自参照序列，例如自相应之野生型序列，移除氨基酸Cys，从而使得氨基酸残基相较于参照序列有所减少。除非另外描述，否则术语“N端Cys”、“位置1之N端Cys”、“位置1之Cys”可互换。
在另一实施方式中，N端Cys经不为Cys残基之氨基酸取代。举例而言，在一例示性实施方式中，SEQ ID NO:12-21之位置1之N端Cys包括位置1之C→G取代。参见例如SEQ IDNO:62相较于SEQ ID NO:19(B22野生型)，以及SEQ ID NO:64相较于SEQ ID NO:15(A22野生型)。置换N端Cys之例示性氨基酸包括任何非Cys氨基酸，优选为极性不带电荷之氨基酸，诸如甘氨酸。在一优选实施方式中，用非保守性残基对Cys进行取代。
意外地，发明人发现表达N端Cys残基经删除之非脂化之ORF2086多肽会使得在藉由质谱测量时，相较于相应之野生型非脂化之ORF2086多肽，丙酮酸化不可检测。非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽之实例包括具有选自以下序列的氨基酸序列之多肽：SEQ IDNO:12(A04)、SEQ ID NO:13(A05)、SEQ ID NO:14(A12)、SEQ ID NO:15(A22)、SEQ ID NO:16(B02)、SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ ID NO:20(B24)、SEQ ID NO:21(B44)及SEQ ID NO:70(A62)，其中位置1之半胱氨酸系经删除。非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽之另一实例包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:58(B01)之多肽，其中位置1之半胱氨酸系经删除。分离的非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽之其它实例包括具有选自以下序列的氨基酸序列之多肽：SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:75。非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽之另一实例包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:57(B01)之多肽。分离的非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽之另一实例包括具有SEQ ID NO:77(A05)之多肽；具有SEQ ID NO:76(A05)之多肽，其中位置1之Cys系经删除；以及具有SEQ ID NO:76(A05)之多肽，其中位置1之Cys经不为Cys残基之氨基酸取代。非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽之其它实例包括具有选自以下序列的氨基酸序列之多肽：SEQ ID NO:12(A04)、SEQ ID NO:13(A05)、SEQ ID NO:14(A12)、SEQ ID NO:15(A22)、SEQ ID NO:58(B01)、SEQ ID NO:16(B02)、SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ ID NO:20(B24)、SEQ ID NO:21(B44)及SEQ ID NO:70(A62)，其中位置1之半胱氨酸经不为Cys残基之氨基酸取代。优选地，非丙酮酸化且非脂化之2086多肽包括至少约250个、255个或260个连续氨基酸，及至多约270个、269个、268个、267个、266个、265个、264个、263个、260个、259个、258个、257个、256个或255个连续氨基酸。任何最小值可与任何最大值组合以确定范围。更优选地，所述多肽具有至少254个或262个连续氨基酸。在一些实施方式中，所述多肽具有至多262个连续氨基酸。在其它实施方式中，所述多肽具有至多254个连续氨基酸。在一个实施方式中，非丙酮酸化且非脂化之多肽包括与编码相应之非丙酮酸化且非脂化之多肽的序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列。举例而言，在一例示性实施方式中，非丙酮酸化且非脂化之A62多肽包括与SEQ ID NO:71具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，分离的非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽系由可操作地连接至表达系统之核苷酸序列编码，其中该表达系统能够于细菌细胞中表达。在一例示性实施方式中，所述核苷酸序列连接至控制核苷酸序列表达之调节序列。
适合之表达系统、调节序列及细菌细胞是本领域已知的。举例而言，可使用任何质粒表达载体，例如PETTM(Novogen,Madison Wis.)或PMALTM(New England Biolabs,Beverly,Mass.)，只要该多肽能够在细菌细胞中表达即可。优选地，使用PETTM载体克隆并在大肠杆菌(E.coli)中表达重组蛋白。在PETTM系统中，所克隆之基因可在噬菌体T7启动子控制下表达。例示性细菌细胞包括荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，以及，优选地，大肠杆菌。
一方面，本发明涉及一种可藉由该方法获得之非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽。优选地，该多肽是分离的。本发明进一步涉及包括可藉由一种方法获得之非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽的组合物。该组合物优选为免疫原性组合物。该方法包括表达编码具有选自以下序列的氨基酸序列之多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:70，其中位置1之半胱氨酸系经删除。在另一实施方式中，该方法包括表达编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:76之多肽的核苷酸序列，其中位置1之半胱氨酸系经删除。在另一实施方式中，该方法包括表达编码具有选自以下序列的氨基酸序列之多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:70，其中位置1之半胱氨酸经不为Cys残基之氨基酸取代。所述核苷酸序列可操作地连接至表达系统，该表达系统能够在细菌细胞中表达。
在一个实施方式中，该方法包括表达编码具有选自以下序列的氨基酸序列之多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:75。在另一实施方式中，该方法包括表达编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:77之多肽的核苷酸序列。在另一实施方式中，核苷酸序列选自：SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69及SEQ IDNO:72。优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌。
B09、B44、A05：一方面，本发明涉及一种组合物，其包括第一分离多肽和第二分离多肽，所述第一分离多肽包括SEQ ID NO:49(B09)中所示之氨基酸序列，所述第二分离多肽包括SEQ ID NO:44(B44)中所示之氨基酸序列的。在一优选实施方式中，所述多肽具免疫原性。在另一优选实施方式中，该组合物进一步包括来自血清群B脑膜炎双球菌之ORF2086亚家族A多肽。优选地，ORF2086亚家族A多肽为非丙酮酸化且非脂化之ORF2086亚家族A多肽。在一例示性实施方式中，ORF2086亚家族A多肽为A05，其实例包括例如位置1之N端半胱氨酸经删除的SEQ ID NO:13，以及SEQ ID NO:55。在另一例示性实施方式中，该组合物包括具有以下氨基酸序列之非丙酮酸化且非脂化之A05多肽：位置1之Cys经删除的SEQ ID NO:76；位置1之Cys经不为Cys残基之氨基酸取代的SEQ ID NO:76；以及SEQ ID NO:77。
多肽结构域
另一方面，本发明涉及一种用于产生分离的多肽的方法。该方法包括在细菌细胞中表达多肽，该多肽包括与SEQ ID NO:21具有大于90％相同性的序列，所述序列包括至少一个选自以下的结构域：SEQ ID NO:21之氨基酸13至18、SEQ ID NO:21之氨基酸21至34，以及SEQ ID NO:21之氨基酸70至80，或其组合，其中该多肽没有N端半胱氨酸。该方法进一步包括纯化该多肽。其中产生之多肽包括非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽。优选地，该多肽具免疫原性。在一优选实施方式中，所述细菌细胞为大肠杆菌。
包括至少一个选自SEQ ID NO:21之氨基酸13-18、SEQ ID NO:21之氨基酸21-34及SEQ ID NO:21之氨基酸70-80或其组合的结构域之多肽的实例包括SEQ ID NO:12(A04)、SEQ ID NO:13(A05)、SEQ ID NO:14(A12)、SEQ ID NO:15(A22)、SEQ ID NO:16(B02)、SEQID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ ID NO:20(B24)及SEQ IDNO:21(B44)。优选地，这些多肽之位置1之半胱氨酸系经删除。在另一实施方式中，位置1之半胱氨酸经不为Cys残基之氨基酸取代。其它例示性多肽包括SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:62及SEQ ID NO:64。另一例示性多肽包括SEQID NO:70及SEQ ID NO:71。另一例示性多肽包括SEQ ID NO:76。另一例示性多肽包括SEQID NO:77。其它实例包括SEQ ID NO:80(B24)及SEQ ID NO:81(B24)。
在一个例示性实施方式中，分离的多肽序列进一步包括至少一个选自以下的结构域：SEQ ID NO:21之氨基酸96-116、SEQ ID NO:21之氨基酸158-170、SEQ ID NO:21之氨基酸172-185、SEQ ID NO:21之氨基酸187-199、SEQ ID NO:21之氨基酸213-224、SEQ ID NO:21之氨基酸226-237、SEQ ID NO:21之氨基酸239-248，或其组合。包括至少一个选自SEQ IDNO:21之氨基酸13-18、SEQ ID NO:21之氨基酸21-34及SEQ ID NO:21之氨基酸70-80，或其组合的结构域，且进一步包括至少一个选自以下的结构域：SEQ ID NO:21之氨基酸96-116、SEQ ID NO:21之氨基酸158-170、SEQ ID NO:21之氨基酸172-185、SEQ ID NO:21之氨基酸187-199、SEQ ID NO:21之氨基酸213-224、SEQ ID NO:21之氨基酸226-237、SEQ ID NO:21之氨基酸239-248或其组合之多肽的实例包括SEQ ID NO:16(B02)、SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ ID NO:20(B24)及SEQ ID NO:21(B44)。优选地，这些多肽之位置1之半胱氨酸系经删除。其它例示性多肽包括具有选自SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:55以及SEQ ID NO:62之氨基酸序列的多肽。
一方面，本发明涉及一种藉由本文所述之方法产生的分离的多肽。在一个实施方式中，所述分离的多肽为非丙酮酸化且非脂化之多肽。另一方面，本发明涉及一种藉由本文所述之方法产生的免疫原性组合物。
编码多肽之核苷酸序列
B09：一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其包括位置1之N端Cys经删除之SEQ IDNO:18，或SEQ ID NO:49中所示之氨基酸序列。编码SEQ ID NO:49之例示性核苷酸序列包括选自以下之序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:48。优选地，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:46。一方面，本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:46。一方面，本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:47。一方面，本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:48。
一方面，本发明涉及一种质粒，其包括选自以下之核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48及SEQ ID NO:45，其中该质粒能够在细菌细胞中表达。如上文所述，适合之表达系统、调节序列及细菌细胞是本领域已知的。优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌。
另一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其包括SEQ ID NO:50中所示之氨基酸序列。在一例示性实施方式中，SEQ ID NO:50由SEQ ID NO:45编码。
B44：另一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其包括N端Cys经删除之SEQ ID NO:21，或SEQ ID NO:44中所示之氨基酸序列。编码SEQ ID NO:44之例示性核苷酸序列包括选自以下之序列：SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:51。优选地，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:43。一方面，本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:43。
A05：一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其包括位置1之N端Cys经删除之SEQ IDNO:13(A05)，或SEQ ID NO:55中所示之氨基酸序列。编码SEQ ID NO:55之例示性核苷酸序列包括选自以下之序列：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:73。优选地，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:65。一方面，本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:54。一方面，本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:65。一方面，本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:73。
A12：另一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其包括N端Cys经删除之SEQ ID NO:14(A12)，或SEQ ID NO:66中所示之氨基酸序列。编码SEQ ID NO:66之例示性核苷酸序列包括SEQ ID NO:67。一方面，本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:67。
A22：另一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其包括N端Cys经删除之SEQ ID NO:15(A22)或SEQ ID NO:68中所示之氨基酸序列。编码SEQ ID NO:68之例示性核苷酸序列包括SEQ ID NO:69。一方面，本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:69。
A62：一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其具有与SEQ ID NO:71具有至少95％相同性之氨基酸序列，其中该序列之前20个氨基酸残基不含半胱氨酸。优选地，该多肽包括如SEQ ID NO:71之位置1至184处所示之氨基酸序列。优选地，该多肽是非脂化且非丙酮酸化的。在另一实施方式中，所述多肽具免疫原性。
在另一实施方式中，所述分离的多肽包括A62之片段。A62之例示性片段包括来自SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71之任何数目之连续残基。在一个实施方式中，所述分离的多肽包括SEQ ID NO:71之位置158至185之氨基酸序列。在另一实施方式中，所述分离的多肽包括SEQ ID NO:71之位置159至186之氨基酸序列。在一个实施方式中，所述多肽包括SEQID NO:71之位置185至254之氨基酸序列中之至少6个连续氨基酸。
另一方面，本发明涉及一种分离的核酸序列，其编码分离的多肽，该分离的多肽具有与SEQ ID NO:71具有至少95％相同性之氨基酸序列，其中该氨基酸序列之前20个氨基酸残基不含半胱氨酸。优选地，所述多肽由SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列组成。在一个实施方式中，所述分离的核酸序列包括SEQ ID NO:72。
另一方面，本发明涉及一种分离的多肽，其包括N端Cys经删除之SEQ ID NO:70(A62)，或SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列。编码SEQ ID NO:71之例示性核苷酸序列包括SEQ ID NO:72。一方面，本发明涉及一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:72。
免疫原性组合物
在一优选实施方式中，包括分离的非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽之本文所述之组合物具免疫原性。本领域已知包括由来自脑膜炎双球菌ORF2086之核苷酸序列编码之蛋白质的免疫原性组合物。例示性免疫原性组合物包括WO2003/063766及美国专利申请公开案第US 20060257413号及第US 20090202593号中所述者，其以全文引用方式并入本文中。其中所述之这样的免疫原性组合物包括鉴定为ORF2086蛋白质之展现杀细菌活性之蛋白质、其免疫原性部分和/或其生物学等效物。ORF2086蛋白质系指由奈瑟菌属之开放阅读框架2086编码之蛋白质。
所述蛋白质可为重组蛋白或自天然的奈瑟菌属之分离的蛋白质。举例而言，奈瑟菌属ORF2086蛋白可自诸如以下之细菌菌株分离：奈瑟菌属之细菌菌株，包括脑膜炎双球菌(血清群A、B、C、D、W-135、X、Y、Z及29E)、淋病双球菌(Neisseria gonorrhoeae)及乳糖奈瑟菌(Neisseria lactamica)之菌株，以及所述蛋白质之免疫原性部分和/或生物等效物。
ORF2086蛋白质包括2086亚家族A蛋白及亚家族B蛋白、其免疫原性部分和/或其生物等效物。2086亚家族A蛋白及2086亚家族B蛋白是本领域已知的，参见例如上文所引用之Fletcher等人,2004及Murphy等人,J Infect Dis.2009年8月1日；200(3):379-89。亦参见WO2003/063766，其公开代表与2086亚家族A之蛋白质有关之氨基酸序列的SEQ ID NO:260至278。另外，WO2003/063766中公开代表与2086亚家族B之蛋白质有关之氨基酸序列的SEQID NO:279至299。WO2003/063766系以全文引用之方式并入本文中。ORF2086蛋白质或其等效物等可以是脂化或非脂化的。优选地，奈瑟菌属ORF2086蛋白质是非脂化的。或者，所述免疫原性组合物可为脂化ORF2086蛋白质与非脂化之ORF2086蛋白质的组合。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包括一种分离的蛋白质，该蛋白质与由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码之蛋白质具有至少95％氨基酸序列相同性。在另一实施方式中，所述免疫原性组合物包括一种分离的蛋白质，该蛋白质与由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码之蛋白质具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列相同性。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包括一种分离的蛋白质，该蛋白质与由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码之亚家族A蛋白质具有至少95％氨基酸序列相同性。优选地，所述免疫原性组合物包括由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码的分离的亚家族A蛋白质。在一些实施方式中，ORF2086亚家族A多肽为A05、A04、A12、A62或A22变体。在一些实施方式中，ORF2086亚家族A多肽为A05、A12或A22变体。
亚家族A多肽之组合：在一个实施方式中，所述组合物包括ORF2086亚家族A多肽之任何组合。ORF2086亚家族A多肽之例示性组合包括，例如，A05与A12；A05与A22；A05与A62；A12与A62；A12与A22；A22与A62；A05、A12与A22；A05、A12与A62；A12、A22与A62；及A05、A22与A62。优选地，ORF2086亚家族A多肽是非经脂化且非丙酮酸化的。
在另一实施方式中，免疫原性组合物包括一种分离的蛋白质，该蛋白质与由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码之亚家族B蛋白质具有至少95％氨基酸序列相同性。优选地，所述免疫原性组合物包括由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码的分离的亚家族B蛋白质。在一些实施方式中，所述ORF2086亚家族B蛋白质为B44、B02、B03、B22、B24或B09变体。在一些实施方式中，所述ORF2086亚家族B蛋白质为B44、B22或B09变体。
亚家族B多肽之组合：在一个实施方式中，所述组合物包括ORF2086亚家族B多肽之任何组合。ORF2086亚家族B多肽之例示性组合包括，例如，B09与B22；B22与B44；B44与B09；B01与B09；B01与B22；B01与B44；及B09、B22与B44；B09与B24；B22与B24；B24与B44；B01与B24；B02与B24；B02与B01；B02与B09；B02与B44；B01、B09与B24；B01、B24与B44。
在一优选实施方式中，所述免疫原性组合物包括一种分离的非丙酮酸化且非脂化之多肽，该多肽与由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码的亚家族B蛋白质具有至少95％氨基酸序列相同性。举例而言，在一些实施方式中，ORF2086亚家族B蛋白质为选自以下之序列：具有如SEQ ID NO:21中所示之氨基酸序列的B44；具有如SEQ ID NO:16中所示之氨基酸序列的B02；具有如SEQ ID NO:17中所示之氨基酸序列的B03；具有如SEQ ID NO:19中所示之氨基酸序列的B22；具有如SEQ ID NO:20中所示之氨基酸序列的B24；具有如SEQ IDNO:58中所示之氨基酸序列的B01；或具有如SEQ ID NO:18中所示之氨基酸序列的B09变体，其中N端Cys系经删除，或其组合。
更优选地，所述免疫原性组合物包括非丙酮酸化且非脂化之B09多肽、非丙酮酸化且非脂化之B44多肽或其组合。在一个实施方式中，所述组合物包括具有如SEQ ID NO:18中所示之氨基酸序列的非丙酮酸化且非脂化之B09变体(其中N端Cys经删除)、具有如SEQ IDNO:21中所示之氨基酸序列的非丙酮酸化且非脂化之B44(其中N端Cys经删除)或其组合。在另一实施方式中，所述免疫原性组合物包括具有SEQ ID NO:49之非丙酮酸化且非脂化之B09、具有SEQ ID NO:44之非丙酮酸化且非脂化之B44，或其组合。
一方面，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括来自血清群B脑膜炎双球菌之ORF2086亚家族B多肽，其中该多肽为非丙酮酸化且非脂化之B44。B44可包括如N端Cys经删除之SEQ ID NO:21，或SEQ ID NO:44中所示之氨基酸序列。在一个实施方式中，该组合物进一步包括来自血清群B脑膜炎双球菌之第二ORF2086亚家族B多肽，其中该第二多肽为非丙酮酸化且非脂化之B09。B09可包括如N端Cys经删除之SEQ ID NO:18，或SEQ ID NO:49中所示之氨基酸序列。在一个实施方式中，所述免疫原性组合物为疫苗。
在另一实施方式中，所述组合物包括至多3种ORF2086亚家族B多肽。在另一实施方式中，所述组合物包括至多2种ORF2086亚家族B多肽。
在另一实施方式中，所述组合物包括至多1、2或3种ORF2086亚家族B变体。在另一实施方式中，所述组合物包括至多1、2或3种ORF2086亚家族A变体。
包括亚家族B多肽及亚家族A多肽之组合物：在一个实施方式中，所述组合物进一步包括一或多种ORF2086亚家族A多肽。在一优选实施方式中，所述组合物包括A05亚家族A多肽。更优选地，A05亚家族A多肽是非脂化且非丙酮酸化的。在另一优选实施方式中，所述组合物包括A62亚家族A多肽。更优选地，A62亚家族A多肽是非脂化且非丙酮酸化的。
在另一实施方式中，所述免疫原性组合物包括与由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码之亚家族A蛋白质具有至少95％氨基酸序列相同性的分离的蛋白质以及与由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码之亚家族B蛋白质具有至少95％氨基酸序列相同性的分离的蛋白质。
优选地，所述免疫原性组合物包括由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码的分离的亚家族A蛋白质以及由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码的分离的亚家族B蛋白质。更优选地，所述免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之亚家族A ORF2086多肽以及分离的非丙酮酸化且非脂化之亚家族B ORF2086多肽。
组合：涵盖ORF2086多肽之任何组合。在一个实施方式中，所述组合物在不存在亚家族B多肽的条件下包括至少一种亚家族A多肽。举例而言，所述组合物仅包括亚家族A多肽。在另一实施方式中，所述组合物在不存在亚家族A多肽的条件下包括至少一种亚家族B多肽。举例而言，组合物仅包括亚家族A多肽。
所述免疫原性组合物可包括任何亚家族A多肽或其组合。在一些实施方式中，所述ORF2086亚家族A多肽为A05、A04、A12或A22变体。在另一实施方式中，所述ORF2086亚家族A多肽包括A62。在一优选实施方式中，所述ORF2086亚家族A多肽为具有如SEQ ID NO:13中所示之氨基酸序列的A05；具有如SEQ ID NO:12中所示之氨基酸序列的A04；具有如SEQ IDNO:14中所示之氨基酸序列的A12；或具有如SEQ ID NO:15中所示之氨基酸序列的A22变体，其中N端Cys系经删除，或其任何组合。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A05与A62亚家族A ORF2086多肽之组合。举例而言，免疫原性组合物可包括具有SEQ ID NO:55之多肽及具有SEQ ID NO:71之多肽。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A05与A12亚家族A ORF2086多肽之组合。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A12与A62亚家族A ORF2086多肽之组合。
所述免疫原性组合物可包括任何亚家族B多肽或其组合。在一些实施方式中，所述ORF2086亚家族B蛋白质为B44、B02、B03、B22、B24或B09变体。在一优选实施方式中，所述ORF2086亚家族B蛋白质为具有如SEQ ID NO:21中所示之氨基酸序列的B44；具有如SEQ IDNO:16中所示之氨基酸序列的B02；具有如SEQ ID NO:17中所示之氨基酸序列的B03；具有如SEQ ID NO:19中所示之氨基酸序列的B22；具有如SEQ ID NO:20中所示之氨基酸序列的B24；或具有如SEQ ID NO:18中所示之氨基酸序列的B09变体，其中N端Cys系经删除，或其组合。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之B09与B44亚家族BORF2086多肽之组合。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之B09与B22亚家族B ORF2086多肽之组合。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之B22与B44亚家族B ORF2086多肽之组合。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之B09、B22与B44亚家族B ORF2086多肽之组合。
在一个实施方式中，所述组合物在不存在脂化之ORF2086多肽的条件下包括非脂化之ORF2086多肽。在另一实施方式中，所述组合物包括非脂化之ORF2086多肽及至少一种脂化之ORF2086多肽。
在一个实施方式中，所述组合物在不存在脂化之ORF2086多肽的条件下包括非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽。在另一实施方式中，所述组合物包括脂化之ORF2086多肽以及非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽。举例而言，所述组合物可包括具有SEQ ID NO:76之脂化之A05多肽以及具有SEQ ID NO:77之非丙酮酸化且非脂化之A05。另一例示性组合物包括具有SEQ ID NO:76之脂化之A05多肽以及具有SEQ ID NO:71之非丙酮酸化且非脂化之A62。另一例示性组合物包括具有SEQ ID NO:58之脂化之B01多肽以及具有SEQ ID NO:71之非丙酮酸化且非脂化之A62。
例示性组合：一种例示性免疫原性组合物包括分离的非脂化之A05、B09、B22及B44ORF2086多肽之组合。举例而言，免疫原性组合物可包括非丙酮酸化且非脂化之A05(SEQID NO:55)亚家族A ORF2086多肽以及分离的非丙酮酸化且非脂化之B09(SEQ ID NO:49)、B22(SEQ ID NO:75)及B44(SEQ ID NO:44)亚家族B ORF2086多肽。
另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A05及A12亚家族AORF2086多肽以及分离的非丙酮酸化且非脂化之B22及B44亚家族B ORF2086多肽之组合。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A05、A12、B09及B44多肽。另一实例包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A12、A62、B09及B44多肽。另一实施例包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A05、A12、A62、B09及B44多肽。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A62及B09多肽。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A62及B44多肽。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A62、B09及B44多肽。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A05、A62及B44多肽。另一例示性免疫原性组合物包括分离的非丙酮酸化且非脂化之A05、A62、B09及B44多肽。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包括1:1比率之亚家族A蛋白质与亚家族B蛋白质。在另一实施方式中，所述免疫原性组合物包括以下任一比率之亚家族A多肽与亚家族B多肽：1:1；1:2；1:3；1:4；1:5；1:6；1:7；1:8；1:9；或1:10。在另一实施方式中，所述免疫原性组合物包括以下任一比率之亚家族B多肽与亚家族A多肽：1:1；1:2；1:3；1:4；1:5；1:6；1:7；1:8；1:9；或1:10。
杀细菌性免疫应答
一方面，本文所述之分离的多肽及组合物引起哺乳动物针对由脑膜炎双球菌之任何血清群，诸如选自血清群A、B、C、E29、H、I、K、L、W-135、X、Y及Z之血清群，所致之感染的杀细菌性免疫应答。在一优选实施方式中，本文所述之分离的多肽及组合物引起哺乳动物针对由血清群A、B、C、W-135、Y和/或X所致之感染的杀细菌性免疫应答。
另一方面，本文所述之分离的多肽及组合物引起哺乳动物针对来自血清群B脑膜炎双球菌之ORF2086多肽的杀细菌性免疫应答。所述组合物能够在给哺乳动物施用之后诱导杀细菌性抗脑膜炎双球菌抗体，且在优选实施方式中，可诱导针对各个亚家族之菌株具杀细菌性的抗体。关于杀细菌性反应之其它信息在下文中给出。参见，例如，实施例6、11、12及13。
在一个实施方式中，所述组合物引起针对脑膜炎双球菌血清群B之异源亚家族的杀细菌性免疫应答。举例而言，包括非脂化之亚家族A多肽之组合物可引起针对脑膜炎双球菌血清群B之亚家族A变体和/或针对脑膜炎双球菌血清群B之亚家族B变体的杀细菌性免疫应答。参见，例如，实施例18至19。
另一方面，本文所述之分离的多肽及组合物引起针对以下至少一者的杀细菌性免疫应答：脑膜炎双球菌之血清群A、血清群B、血清群C、血清群W135和/或血清群Y菌株。在一优选实施方式中，组合物引起至少针对脑膜炎双球菌之血清群B、血清群C及血清群Y的杀细菌性免疫应答。参见，例如，实施例21。
在人体内及用作代替品之临床前研究中，杀细菌性抗体是保护作用的指示物，且本文所述之任何新免疫原性组合物候选者应激发这些功能性抗体。
B09：一方面，分离的非脂化之B09多肽及其免疫原性组合物激发针对(例如可结合于)来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族B之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。在一例示性实施方式中，具有SEQ ID NO:18(其中位置1之N端Cys经删除)或SEQ ID NO:49之分离的非丙酮酸化且非脂化之B09多肽及其免疫原性组合物激发针对(例如可结合于)来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族A或优选亚家族B之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。优选地，非丙酮酸化且非脂化之B09多肽及其免疫原性组合物激发针对以下之杀细菌性抗体：A05变体(SEQ ID NO:13)；B44变体(SEQ ID NO:21)；B16变体(SEQ ID NO:60)；B24变体(SEQ ID NO:20)；B09变体(SEQ ID NO:18)或其组合。在一例示性实施方式中，非丙酮酸化且非脂化之B09多肽及其免疫原性组合物激发针对以下之杀细菌性抗体：B44变体(SEQ ID NO:21)；B16变体(SEQ IDNO:60)；B24变体(SEQ ID NO:20)；B09变体(SEQ ID NO:18)或其组合。参见例如实施例11、实施例12及实施例13。
B44：一方面，分离的非脂化之B44多肽及其免疫原性组合物引起针对(例如可结合于)来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族B之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。在另一例示性实施方式中，具有SEQ ID NO:21(其中位置1之N端Cys经删除)或SEQ ID NO:44之分离的非丙酮酸化且非脂化之B44多肽及其免疫原性组合物激发针对(例如可结合于)来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族B之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。优选地，非丙酮酸化且非脂化之B44多肽及其免疫原性组合物引起针对以下之杀细菌性抗体：B44变体(SEQ ID NO:21)；B16变体(SEQ ID NO:60)；B24变体(SEQ ID NO:20)；B09变体(SEQ ID NO:18)或其组合。参见例如实施例11。另外，非丙酮酸化且非脂化之B44多肽及其免疫原性组合物亦可激发结合于B02变体(SEQ ID NO:16)之杀细菌性抗体。参见，例如，实施例12及实施例13。此外，非丙酮酸化且非脂化之B44多肽及其免疫原性组合物亦可激发结合于B03变体(SEQ ID NO:17)及B15变体(SEQ ID NO:59)之杀细菌性抗体。参见，例如，实施例6。
B22：一方面，分离的非脂化之B22多肽及其免疫原性组合物激发针对(例如可结合于)来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族B之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。在另一例示性实施方式中，具有SEQ ID NO:19(其中位置1之N端Cys经删除)之分离的非丙酮酸化且非脂化之B22多肽及其免疫原性组合物激发针对(例如可结合于)来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族B之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。优选地，非丙酮酸化且非脂化之B22多肽激发针对以下之杀细菌性抗体：B44变体(SEQ ID NO:21)；B16变体(SEQ ID NO:60)；B24变体(SEQ ID NO:20)；B09变体(SEQ ID NO:18)或其组合。参见，例如，实施例13。
A05：一方面，分离的非脂化之A05多肽及其免疫原性组合物激发针对(例如可结合于)来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族A之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。在一个实施方式中，具有SEQ ID NO:13(其中N端Cys经删除)或SEQ ID NO:55之分离的非丙酮酸化且非脂化之A05多肽及其免疫原性组合物激发针对(例如可结合于)来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族A之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。在一个实施方式中，分离的A05多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:76，其中位置1之半胱氨酸系经删除。在另一实施方式中，分离的A05多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:76，其中位置1之半胱氨酸经不为Cys残基之氨基酸取代。在一个实施方式中，分离的A05多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:77。优选地，非丙酮酸化且非脂化之A05及其免疫原性组合物激发针对以下之杀细菌性抗体：A05变体(SEQ ID NO:13)、A22变体(SEQ ID NO:15)、A12变体(SEQ ID NO:14)或其组合。参见，例如，实施例6及13。
A62：一方面，分离的非脂化之A62多肽及其免疫原性组合物激发针对(例如可结合于)来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族A之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。在一个实施方式中，分离的A62多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:70，其中位置1之半胱氨酸经不为Cys残基之氨基酸取代。在另一实施方式中，具有SEQ ID NO:70(其中N端Cys系经删除)或SEQ ID NO:71之分离的非丙酮酸化且非脂化之A62多肽及其免疫原性组合物激发针对(例如可结合于)来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族A和/或亚家族B之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。举例而言，非丙酮酸化且非脂化之A62及其免疫原性组合物激发针对以下之杀细菌性抗体：A05变体(SEQ ID NO:13)、A12变体(SEQ ID NO:14)、A22变体(SEQ ID NO:15)及A62变体(SEQ IDNO:70)。作为另一实施例，非丙酮酸化且非脂化之A62及其免疫原性组合物激发针对A29变体、B09变体及B24变体之杀细菌性抗体。参见例如实施例18至19。在另一实施方式中，非丙酮酸化且非脂化之A62及其免疫原性组合物激发针对B16变体之杀细菌性抗体。
A12：在一个实施方式中，具有SEQ ID NO:14(其中N端Cys系经删除)或SEQ ID NO:66之分离的非丙酮酸化且非脂化之A12多肽及其免疫原性组合物激发针对来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族A和/或亚家族B之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。优选地，非丙酮酸化且非脂化之A12及其免疫原性组合物激发针对以下之杀细菌性抗体：A05变体(SEQ ID NO:13)、A22变体(SEQ ID NO:15)、A12变体(SEQ ID NO:14)、A62变体(SEQ ID NO:70)、A29变体、B09变体。参见，例如，实施例18至19。
在一个实施方式中，具有SEQ ID NO:15(其中N端Cys系经删除)或SEQ ID NO:68之分离的非丙酮酸化且非脂化之A22多肽及其免疫原性组合物激发针对(例如可结合于)来自血清群B脑膜炎双球菌亚家族A和/或亚家族B之ORF2086多肽的杀细菌性抗体。优选地，非丙酮酸化且非脂化之A22及其免疫原性组合物激发针对以下之杀细菌性抗体：A05变体(SEQID NO:13)、A22变体(SEQ ID NO:15)、A62变体(SEQ ID NO:70)、A29变体。参见，例如，实施例18至19。
激发杀细菌性抗体之方法
一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物之对血清群A脑膜炎双球菌具特异性之杀细菌性抗体的方法。一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物之对血清群C脑膜炎双球菌具特异性之杀细菌性抗体的方法。一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物之对血清群W135脑膜炎双球菌具特异性之杀细菌性抗体的方法。一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物之对血清群X脑膜炎双球菌具特异性之杀细菌性抗体的方法。一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物之对血清群Y脑膜炎双球菌具特异性之杀细菌性抗体的方法。一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物之对血清群A、B、C、W-135、X和/或Y脑膜炎双球菌具特异性之杀细菌性抗体的方法。一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物之对血清群B脑膜炎双球菌具特异性之杀细菌性抗体的方法。在一例示性实施方式中，该方法包括激发对ORF2086亚家族B血清群B脑膜炎双球菌、ORF2086亚家族A血清群B脑膜炎双球菌或其组合具特异性之杀细菌性抗体。
该方法包括给该哺乳动物施用有效量的如上文所述之分离的非丙酮酸化且非脂化之2086多肽或其免疫原性组合物。参见，例如，实施例18至19及22。
在一优选实施方式中，该方法包括激发对ORF2086亚家族B血清群B脑膜炎双球菌具特异性之杀细菌性抗体。所述分离的多肽或免疫原性组合物包括非丙酮酸化且非脂化之B44多肽。在另一优选实施方式中，所述组合物进一步包括非丙酮酸化且非脂化之B09多肽。在一例示性实施方式中，分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:44或其组合。在另一例示性实施方式中，所述分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:18，其中位置1之N端Cys系经删除；SEQ ID NO:21，其中位置1之N端Cys系经删除；或其组合。在另一例示性实施方式中，所述分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:19，其中位置1之N端Cys系经删除。在一个实施方式中，用于激发对ORF2086亚家族B血清群B脑膜炎双球菌具特异性之杀细菌性抗体的免疫原性组合物包括非丙酮酸化且非脂化之A05、A12及A62多肽中之至少一者。参见，例如，实施例19。
在一优选实施方式中，该方法包括激发对ORF2086亚家族A血清群B脑膜炎双球菌具特异性之杀细菌性抗体。分离的多肽或免疫原性组合物包括非丙酮酸化且非脂化之A05多肽。在一优选实施方式中，所述分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:13，其中位置1之N端Cys系经删除。在另一优选实施方式中，苏搜组合物进一步包括非丙酮酸化且非脂化之B44多肽。参见，例如，实施例6及13。在一例示性实施方式中，所述分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:44或其组合。在一优选实施方式中，分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:13，其中位置1之N端Cys系经删除；SEQ ID NO:21，其中位置1之N端Cys系经删除；或其组合。在另一例示性实施方式中，所述分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:77(A05)、SEQ ID NO:44(B44)或其组合。在一个实施方式中，用于激发对ORF2086亚家族A血清群B脑膜炎双球菌具特异性之杀细菌性抗体的免疫原性组合物包括非丙酮酸化且非脂化之A05、A12及A62多肽中之至少一者。参见例如实施例18至19。
当给哺乳动物施用包括至少两种如上文所述之非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽的例示性免疫原性组合物时，发明人意外地发现相较于包括一种各别非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽的免疫原性组合物，可引起针对脑膜炎双球菌之血清群B的协同杀细菌性免疫应答。参见，例如，实施例19。因此，在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包括至少一种第一非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽，其与至少一种第二非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽协同作用以引起针对脑膜炎双球菌之血清群B的免疫应答。
另一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物之对脑膜炎双球菌之血清群C具特异性之杀细菌性抗体的方法。该方法包括给该哺乳动物施用有效量的如上文所述之来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非丙酮酸化且非脂化之2086多肽或其免疫原性组合物。参见，例如，实施例22。在一个实施方式中，该多肽包括SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列或选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21，其中位置1之半胱氨酸系经删除。在一个实施方式中，该多肽包括SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列或选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQID NO:21，其中位置1之半胱氨酸经不为Cys残基之氨基酸取代。在另一实施方式中，所述免疫原性组合物进一步包括至少一种选自以下之缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物，b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物，c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物，及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。例示性免疫原性组合物包括至少一种分离的非丙酮酸化且非脂化之A62多肽及a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物，b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物，c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物，及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
另一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物之对脑膜炎双球菌之血清群Y具特异性之杀细菌性抗体的方法。该方法包括给该哺乳动物施用有效量的如上文所述之来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非丙酮酸化且非脂化之2086多肽或其免疫原性组合物。参见，例如，实施例22。在一个实施方式中，该多肽包括SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列或选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21，其中位置1之半胱氨酸系经删除。在一个实施方式中，该多肽包括SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列或选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQID NO:21，其中位置1之半胱氨酸经不为Cys残基之氨基酸取代。在另一实施方式中，所述免疫原性组合物进一步包括至少一种选自以下之缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物，b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物，c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物，及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
另一方面，本发明涉及一种激发哺乳动物之对脑膜炎双球菌之血清群X具特异性之杀细菌性抗体的方法。该方法包括给该哺乳动物施用有效量的如上文所述之来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非丙酮酸化且非脂化之2086多肽或其免疫原性组合物。参见例如实施例22。在一个实施方式中，该多肽包括SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列或选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21，其中位置1之半胱氨酸系经删除。在一个实施方式中，该多肽包括SEQ ID NO:71中所示之氨基酸序列或选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQID NO:21，其中位置1之半胱氨酸经不为Cys残基之氨基酸取代。在另一实施方式中，免疫原性组合物进一步包括至少一种选自以下之缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物，b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物，c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物，及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
当给哺乳动物施用如上文所述包括四种非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽及脑膜炎双球菌血清群A、C、W135及Y中之每一者之荚膜糖之缀合物的例示性免疫原性组合物时，发明人意外地发现，相较于不存在荚膜糖之缀合物且包括ORF2086多肽之免疫原性组合物，以及相较于不存在ORF2086多肽且包括脑膜炎双球菌血清群A、C、W135及Y中之每一者之荚膜糖之缀合物的免疫原性组合物，可引起至少针对脑膜炎双球菌之血清群B、C及Y之协同杀细菌性免疫应答。参见，例如，实施例22。因此，在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包括至少一种非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽，其与脑膜炎双球菌血清群A、C、W135及Y之荚膜糖之至少一种缀合物协同作用以引起针对脑膜炎双球菌之免疫应答。所引起之免疫应答可针对脑膜炎双球菌之血清群B、C及Y中之至少一者。所述免疫原性组合物可包括由来自奈瑟菌属ORF2086之核苷酸序列编码的蛋白质、其多核苷酸或等效物作为该免疫原性组合物中之唯一活性免疫原。或者，免疫原性组合物可进一步包括活性免疫原，包括其它奈瑟菌属免疫原性多肽，或一或多种其它微生物病原体(例如但不限于病毒、朊病毒、细菌或真菌)之免疫活性蛋白或荚膜多糖。所述组合物可包含所选适应症所需之一或多种所需蛋白质、片段或药物化合物。
本发明涵盖任何多抗原或多价免疫原性组合物。举例而言，免疫原性组合物可包括两种或两种以上ORF2086蛋白之组合、ORF2086蛋白与一或多种Por A蛋白之组合、ORF2086蛋白与脑膜炎双球菌血清群A、C、Y及W135多糖和/或多糖缀合物之组合、ORF2086蛋白与脑膜炎双球菌及肺炎球菌(pneumococcus)的组合之组合，或上述任一者之组合，呈适于所需施用，例如适于黏膜传递之形式。本领域技术人员将容易地调配此类多抗原或多价免疫组合物。
一方面，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包括来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽，及选自以下之至少一种缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物，b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物，c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物，及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包括来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽及该等缀合物中之至少两者。在另一实施方式中，该组合物包括该等缀合物中之至少三者。举例而言，所述组合物可包括来自以下之糖：血清群A及C；血清群A及W135；血清群A及Y；血清群C及W135；血清群W135及Y；血清群A、C及W135；血清群A、C及Y；血清群A、W135及Y；血清群C及W135及Y。优选包括至少一种血清群C糖之组合物(例如C及Y)。
在另一实施方式中，所述免疫原性组合物包括来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽及四种缀合物，例如脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物；脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物；脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物；及脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物。
在一优选实施方式中，所述缀合物为荚膜糖与载体蛋白之缀合物。适合之载体蛋白在此项技术中为已知的。优选地，所述载体蛋白为细菌毒素，诸如白喉或破伤风毒素，或其类毒素或突变体。最优选地，所述载体蛋白为CRM197。举例而言，在一个实施方式中，所述组合物包括至少一种选自以下之缀合物：(a)(i)血清群A脑膜炎双球菌之荚膜糖与(ii)CRM197之缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎双球菌之荚膜糖与(ii)CRM197之缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎双球菌之荚膜糖与(ii)CRM197之缀合物；及(d)(i)血清群Y脑膜炎双球菌之荚膜糖与(ii)CRM197之缀合物。
血清群A、C、W135及Y之荚膜糖是本领域已加以表征且为已知的。举例而言，血清群A脑膜炎双球菌之荚膜糖为(α1→6)连接型N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸盐之均聚物，其中在C3及C4位置经部分O-乙酰化。C3位置之乙酰化可占70％至95％。用于纯化糖之条件可导致去O-乙酰化(例如在碱性条件下)，但保留此C3位置之OAc为有用的。在一些实施方式中，血清群A糖中至少50％(例如至少60％、70％、80％、90％、95％或大于95％)之甘露糖胺残基在C3位置经O-乙酰化。可用封闭基团置换乙酰基以防止水解，且这些经修饰之糖仍为本发明之含义内的血清群A糖。
血清群C荚膜糖为(α2→9)连接型唾液酸(N-乙酰基神经胺糖酸)之均聚物。大部分血清群C菌株在唾液酸残基之C7和/或C8处具有O-乙酰基，但一些临床分离物没有这些O-乙酰基。
血清群W135糖为唾液酸-半乳糖二糖单元之聚合物。如同血清群C糖，其具有可变之O-乙酰化，但在唾液酸7位及9位上经O-乙酰化。结构系写为：→4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。
血清群Y糖类似于血清群W135糖，除了二糖重复单元包括葡萄糖而非半乳糖。血清群Y结构系写为：→4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。如同血清群W135，其在唾液酸7位及9位上具有可变之O-乙酰化。
根据本发明使用之糖可如上文所述经O-乙酰化，例如，具有与在天然荚膜糖中所见之O-乙酰化模式相同的O-乙酰化模式，或其可在糖环之一或多个位置部分或完全地去O-乙酰化，或其相对于天然荚膜糖可经高度O-乙酰化。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物包括来自脑膜炎双球菌血清群B之分离的非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽，及选自以下之至少一种缀合物：a)脑膜炎双球菌血清群A之荚膜糖之缀合物，b)脑膜炎双球菌血清群C之荚膜糖之缀合物，c)脑膜炎双球菌血清群W135之荚膜糖之缀合物，及d)脑膜炎双球菌血清群Y之荚膜糖之缀合物，其中该非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽包括以下至少一者：B44、B09、A05、B22、A12、A22、A62、B24、B16、B15及B03。在一个实施方式中，所述多肽包括选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71及SEQ IDNO:75。在另一实施方式中，所述多肽包括选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:17、SEQID NO:59、SEQ ID NO:60及SEQ ID NO:20，其中位置1之半胱氨酸系经删除。在另一实施方式中，所述多肽包括选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60及SEQ ID NO:20，其中位置1之半胱氨酸经不为Cys残基之氨基酸取代。
本发明亦涵盖多免疫接种方案，其中可将任何适用于针对病原体之组合物组合于本发明之组合物中或与本发明之组合物组合。举例而言(不限于)，可给患者施用本发明之免疫原性组合物及另一用于针对人类乳头状瘤病毒(HPV)进行免疫接种之免疫组合物(诸如HPV疫苗
Figure BDA0001239455110000441
)作为多免疫接种方案之一部分。本领域技术人员将能够容易地选择连同本发明之免疫原性组合物一起使用之免疫原性组合物以达成开发及执行多免疫接种方案之目的。
可使用ORF2086多肽、片段及等效物作为缀合物免疫原性组合物之一部分；其中一或多种蛋白质或多肽缀合于载体以产生针对多种血清型或脑膜炎双球菌之血清型，尤其针对脑膜炎双球菌血清群(尤其为血清群B)和/或针对多种疾病具有免疫原性特性的组合物。或者，可使用一种ORF2086多肽作为其它免疫原性多肽之载体蛋白。该等免疫原性组合物之调配为本领域技术人员所熟知。
本发明之免疫原性组合物优选包括药学可接受之赋形剂、稀释剂和/或载剂。适合之药学可接受之赋形剂、载剂和/或稀释剂包括任何及所有常规之溶剂、分散介质、填充剂、固体载剂、水溶液、包覆剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂等。适合之药学可接受之赋形剂、稀释剂和/或载剂包括，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲液、右旋糖、甘油、乙醇等之一或多者以及其组合。
药学可接受之赋形剂、稀释剂和/或载剂可进一步包括少量辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强抗体之存放期或有效性。药学可接受之赋形剂、稀释剂和/或载剂之制备及使用是本领域所熟知的。除非与活性成分不兼容，计划将任何常规介质或试剂用于本发明之免疫原性组合物中。
免疫原性组合物可非经肠施用，例如藉由皮下注射或肌肉内注射，以及经口或鼻内施用。肌肉内免疫接种之方法由Wolff等人,Biotechniques；11(4):474-85,(1991)及Sedegah等人,PNAS第91卷,第9866-9870页,(1994)描述。其它施用方式使用例如(不限于)口服配制品、肺部配制品、栓剂及经皮施用。口服配制品包括，例如，常用之赋形剂，诸如(不限于)医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。优选地，肌肉内施用免疫原性组合物。
本发明之免疫原性组合物可进一步包含一或多种其它“免疫调节剂”，其为干扰或改变免疫系统的药剂，从而可观察到体液和/或细胞介导免疫上调或下调。在一个特定实施方式中，优选体液和/或细胞介导免疫上调。某些免疫调节剂之实例尤其包括例如佐剂或细胞激素，或美国专利第5,254,339号中所述之ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)。
可用于本发明之疫苗中之佐剂之非限制性实例包括RIBI佐剂系统(Ribi Inc.,Hamilton,Mont.)、明矾、矿物凝胶(诸如氢氧化铝凝胶)、水包油乳液、油包水乳液(诸如弗氏(Freund's)完全佐剂及不完全佐剂)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta Ga.)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge Mass.)、SAF-M(Chiron,Emeryville Calif.)、
Figure BDA0001239455110000451
佐剂、皂素、Quil A或其它皂素流分、单磷酰基脂质A及阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂。适用于本发明疫苗中之水包油乳液之非限制性实例包括经改质SEAM62及SEAM 1/2配制品。经改质SEAM62为含有5％(v/v)角鲨烯(Sigma)、1％(v/v)
Figure BDA0001239455110000452
85清洁剂(ICI Surfactants)、0.7％(v/v)
Figure BDA0001239455110000453
80清洁剂(ICISurfactants)、2.5％(v/v)乙醇、200μg/ml Quil A、100μg/ml胆固醇及0.5％(v/v)卵磷脂之水包油乳液。经改质SEAM 1/2为包含以下之水包油乳液：5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)
Figure BDA0001239455110000461
85清洁剂、0.7％(v/v)聚山梨醇酯80清洁剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A及50μg/ml胆固醇。
可包括在疫苗中之其它“免疫调节剂”包括，例如，一或多种白介素、干扰素或其它已知细胞激素或趋化因子。在一个实施方式中，所述佐剂可为环糊精衍生物或聚阴离子性聚合物，诸如美国专利第6,165,995号及第6,610,310号中所分别描述者。应了解，欲使用之免疫调节剂和/或佐剂将视将接受疫苗或免疫原性组合物施用之个体、注射途径及欲给与之注射次数而定。
在一些实施方式中，所述佐剂为皂素。在一些实施方式中，皂素浓度为1μg/ml至250μg/ml；5μg/ml至150μg/ml；或10μg/ml至100μg/ml。在一些实施方式中，皂素浓度为约1μg/ml；约5μg/ml；约10μg/ml；约20μg/ml；约30μg/ml；约40μg/ml；约50μg/ml；约60μg/ml；约70μg/ml；约80μg/ml；约90μg/ml；约100μg/ml；约110μg/ml；约120μg/ml；约130μg/ml；约140μg/ml；约150μg/ml；约160μg/ml；约170μg/ml；约180μg/ml；约190μg/ml；约200μg/ml；约210μg/ml；约220μg/ml；约230μg/ml；约240μg/ml；或约250μg/ml。
在某些优选实施方式中，将本发明之蛋白质用于口服施用之免疫原性组合物中，该组合物包括黏膜佐剂且用于治疗或预防人类宿主之脑膜炎双球菌感染。该黏膜佐剂可为霍乱毒素；然而，优选地，除霍乱毒素以外的可根据本发明使用之黏膜佐剂包括霍乱全毒素之无毒衍生物(其中A亚基是经诱变的)、经化学修饰之霍乱毒素或藉由修饰霍乱毒素氨基酸序列所产生之相关蛋白质。对于可尤其适用于制备本发明之免疫原性组合物的特定霍乱毒素，参见如国际公开申请案WO 00/18434中所公开的突变体霍乱全毒素E29H，该申请案以全文引用的方式并入本文。可将这些佐剂添加至本发明多肽中或与本发明多肽缀合。相同技术可应用于其它具有黏膜佐剂或传递特性之分子，诸如大肠杆菌热不稳定性毒素(LT)。
可使用具有黏膜佐剂或传递活性之其它化合物，诸如胆汁；聚阳离子，诸如DEAE-葡聚糖及聚鸟氨酸；清洁剂，诸如十二烷基苯硫酸钠；脂质缀合材料；抗生素，诸如链霉素；维生素A；及其它可改变黏膜表面之结构或功能完整性的化合物。其它黏膜活性化合物包括微生物结构之衍生物，诸如MDP；吖啶及西咪替丁。亦可使用如上文所述之STIMULONTMQS-21、MPL及IL-12。
本发明之免疫原性组合物可以ISCOMS(免疫刺激复合物)、含有CTB之ISCOMS、脂质体或密封于诸如丙烯酸酯或聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)之化合物中形成具有适于吸附之尺寸的微球体形式传递。本发明之蛋白质亦可并入油性乳液中。
给患者施用之免疫原性组合物之量(亦即剂量)可根据为本领域技术人员所知之标准技术，在考虑诸如特定抗原、佐剂(若存在)、特定患者之年龄、性别、体重、物种、病状及投药途径之因素下来确定。
举例而言，用于青年人类患者之剂量可包括至少0.1μg、1μg、10μg或50μg奈瑟菌属ORF2086蛋白质，及至多80μg、100μg、150μg或200μg奈瑟菌属ORF2086蛋白质。任何最小值与任何最大值可组合以确定适合范围。
佐剂
如本文所述之免疫原性组合物在某些实施方式中亦包含一或多种佐剂。佐剂为在连同免疫原或抗原一起施用时增强免疫应答之物质。已经显示，多种细胞激素或淋巴因子具有免疫调节活性，且因此适用作佐剂，所述细胞激素或淋巴因子包括(但不限于)白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参见例如美国专利第5,723,127号)、13、14、15、16、17及18(及其突变形式)；干扰素-α、干扰素-β及干扰素-γ；粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)(参见，例如，美国专利第5,078,996号及ATCC保藏号39900)；巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)；粒细胞群落刺激因子(G-CSF)；及肿瘤坏死因子α及β。
适于与本文所述之免疫原性组合物一起使用之其它佐剂包括趋化因子，包括(不限于)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β及RANTES；黏附分子，诸如选择素，例如L-选择素、P-选择素及E-选择素；黏蛋白样分子，例如CD34、GlyCAM-1及MadCAM-1；整合素家族之成员，诸如LFA-1、VLA-1、Mac-1及p150.95；免疫球蛋白超家族之成员，诸如PECAM、ICAM，例如ICAM-1、ICAM-2及ICAM-3，CD2及LFA-3；共刺激分子，诸如B7-1、B7-2、CD40及CD40L；生长因子，包括血管生长因子、神经生长因子、纤维母细胞生长因子、表皮生长因子、PDGF、BL-1及血管内皮生长因子；受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2及DR6；及半胱天冬酶(Caspase)(ICE)。
其它例示性佐剂包括(但不限于)氢氧化铝；磷酸铝；STIMULONTM QS-21(AquilaBiopharmaceuticals,Inc.,Framingham,Mass.)；MPLTM(3-O-去酰化单磷酰基脂质A；Corixa,Hamilton,Mont.)、529(氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物，Corixa,Hamilton,Mont.)、IL-12(Genetics Institute,Cambridge,Mass.)；GM-CSF(Immunex Corp.,Seattle,Wash.)；N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰基-去甲基-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为nor-MDP)；N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基-乙胺)(CGP 19835A，称为MTP-PE)；及霍乱毒素。在某些优选实施方式中，所述佐剂为QS-21。
其它例示性佐剂包括霍乱毒素之无毒衍生物，包括其A亚基，和/或脑膜炎双球菌多肽与霍乱毒素或其B亚基(“CTB”)之缀合物或遗传工程改造融合物、前类霍乱原(procholeragenoid)、真菌多糖，包括裂裥菌素、胞壁酰二肽、胞壁酰二肽(“MDP”)衍生物、佛波醇酯、大肠杆菌之热不稳定毒素、嵌段聚合物或皂素。
磷酸铝已作为佐剂用于1期临床试验中，其浓度为每剂0.125mg，比由美国联邦法规[610.15(a)]规定之极限每剂0.85mg低得多。含铝佐剂广泛用于人类以在肌肉内或皮下施用时加强抗原之免疫应答。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物中铝之浓度为0.125μg/ml至0.5μg/ml；0.20μg/ml至0.40μg/ml；或0.20μg/ml至0.30μg/ml。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物中铝之浓度为约0.125μg/ml；约0.15μg/ml；约0.175μg/ml；约0.20μg/ml；约0.225μg/ml；约0.25μg/ml；约0.275μg/ml；约0.30μg/ml；约0.325μg/ml；约0.35μg/ml；约0.375μg/ml；约0.40μg/ml；约0.425μg/ml；约0.45μg/ml；约0.475μg/ml；或约0.50μg/ml。
在一优选实施方式中，所述免疫原性组合物中铝之浓度为0.125mg/ml至0.5mg/ml；0.20mg/ml至0.40mg/ml；或0.20mg/ml至0.30mg/ml。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物中铝之浓度为约0.125mg/ml；约0.15mg/ml；约0.175mg/ml；约0.20mg/ml；约0.225mg/ml；约0.25mg/ml；约0.275mg/ml；约0.30mg/ml；约0.325mg/ml；约0.35mg/ml；约0.375mg/ml；约0.40mg/ml；约0.425mg/ml；约0.45mg/ml；约0.475mg/ml；或约0.50mg/ml。
适用于增强免疫应答之佐剂进一步包括(不限于)MPLTM(3-O-去酰化单磷酰基脂质A，Corixa,Hamilton,MT)，其描述于美国专利第4,912,094号中。合成脂质A类似物或氨基烷基葡萄糖胺磷酸盐化合物(AGP)或其衍生物或类似物亦适用作佐剂，其可自Corixa(Hamilton,MT)获得且描述于美国专利第6,113,918号中。一种这样的AGP为2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其亦称为529(原先称作RC529)。此529佐剂系调配成水性形式(AF)或稳定乳液(SE)。
其它佐剂包括胞壁酰肽，诸如N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲基胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳液，诸如MF59(美国专利第6,299,884号)(含有5％角鲨烯、0.5％聚山梨醇酯80及0.5％SPAN 85(任选地，含有各种量之MTP-PE)，使用微流化床(诸如型号110Y之微流化床(Microfluidics,Newton,MA))调配成次微米颗粒)，及SAF(含有10％角鲨烯、0.4％聚山梨醇酯80、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121及thr-MDP，微流体化成次微米乳液或涡旋产生较大粒度之乳液)；不完全弗氏佐剂(IFA)；铝盐(明矾)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝；爱菲金；阿夫立定；L121/角鲨烯；D-丙交酯-聚乳酸交酯/糖苷；普朗尼克多元醇；杀死之博德氏杆菌(Bordetella)；皂素，诸如StimulonTM QS-21(Antigenics,Framingham,MA.)(描述于美国专利第5,057,540号中)、ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)(描述于美国专利第5,254,339号中)及免疫刺激复合物(ISCOMATRIX)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；细菌脂多糖；合成的多核苷酸，诸如含有CpG基序之寡核苷酸(例如美国专利第6,207,646号)；IC-31(Intercell AG,Vienna,Austria)，描述于欧洲专利第1,296,713号及第1,326,634号中；百日咳毒素(PT)或其突变体、霍乱毒素或其突变体(例如美国专利第7,285,281号、第7,332,174号、第7,361,355号及第7,384,640号)；或大肠杆菌热不稳定性毒素(LT)或其突变体，特别是LT-K63、LT-R72(例如美国专利第6,149,919号、第7,115,730号及第7,291,588号)。
产生非脂化之P2086抗原的方法
一方面，本发明涉及一种产生非丙酮酸化且非脂化之ORF2086多肽的方法。该方法包括使编码ORF2086多肽之核苷酸序列表达，在该ORF2086多肽中，相较于相应之野生型序列，N端半胱氨酸系经删除，且其中该核苷酸序列可操作地连接至能够在细菌细胞中表达之表达系统。藉由该方法产生之例示性多肽包括本文所述之任何多肽。举例而言，优选地，所述多肽具有以下所示之氨基酸序列：SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ IDNO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ IDNO:21；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:70，其中相较于相应之野生型序列，位置1之半胱氨酸系经删除。在另一优选实施方式中，所述多肽具有SEQ ID NO:76中所示之氨基酸序列，其中位置1之半胱氨酸系经删除。其它例示性多肽包括具有选自以下之氨基酸序列的多肽：SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:75。另一例示性多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:77之多肽。其它实例包括SEQ ID NO:80(B24)及SEQ ID NO:81(B24)。该方法进一步包括纯化该多肽。
在一些实施方式中，本发明提供一种产生可溶性非脂化之P2086抗原的方法，其包含以下步骤：将ORF2086变体核酸序列克隆至无脂化控制序列之大肠杆菌表达载体中，用ORF2086表达载体转化大肠杆菌细菌，诱导表达及分离所表达之P2086蛋白。在一些实施方式中，用IPTG诱导表达。
在一些实施方式中，ORF2086变体之N端Cys之密码子系经删除。这样的密码子之实例包括TGC。在一些实施方式中，藉由点诱变使ORF2086变体之N端Cys之密码子突变以产生Ala、Gly或Val密码子。在一些实施方式中，将Ser及Gly密码子添加至ORF2086变体之N端尾中以延伸与N端Cys紧邻之下游处的Gly/Ser茎部。在一些实施方式中，Gly/Ser茎部内Gly及Ser残基之总数为至少7、8、9、10、11或12。在一些实施方式中，N端Cys之密码子系经删除。在一些实施方式中，N端7个、8个、9个、10个、11个或12个残基为Gly或Ser。
在一些实施方式中，藉由点诱变将非脂化之ORF2086变体之N端尾之密码子优化。在一些实施方式中，将非脂化之ORF2086变体之N端尾优化以匹配B09变体之N端尾。在一些实施方式中，藉由点诱变将ORF2086变体之N端尾之密码子优化，从而使得编码ORF2086变体之第五个氨基酸之密码子与SEQ ID NO:8之核苷酸13至15 100％相同，且编码ORF2086变体之第十三个氨基酸之密码子与SEQ ID NO:8之核苷酸37至39 100％相同。在一些实施方式中，将非脂化之ORF2086变体之N端尾优化，以使得5'端45个核酸与SEQ ID NO:8之核酸1至45 100％相同。在一些实施方式中，将非脂化之ORF2086变体之N端尾优化，以使得5'端42个核酸与SEQ ID NO:8之核酸4至45 100％相同。在一些实施方式中，将非脂化之ORF2086变体之N端尾优化，以使得5'端39个核酸与SEQ ID NO:8之核酸4至42 100％相同。在一些实施方式中，非脂化之P2086变体之N端尾相较于SEQ ID NO:18之氨基酸1至15包含至少一处氨基酸取代。在一些实施方式中，非脂化之P2086变体之N端尾相较于SEQ ID NO:18之氨基酸1至15包含两处氨基酸取代。在一些实施方式中，非脂化之P2086变体之N端尾相较于SEQ IDNO:18之氨基酸2至15包含至少一处氨基酸取代。在一些实施方式中，非脂化之P2086变体之N端尾相较于SEQ ID NO:18之氨基酸2至15包含两处氨基酸取代。在一些实施方式中，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。
在一些实施方式中，非脂化之变体之密码子已经优化以使表达增加。密码子优化是本领域已知的。参见例如Sastalla等人,Applied and Environmental Microbiology,第75(7)卷:2099-2110(2009)及Coleman等人,Science,第320卷:1784(2008)。在一些实施方式中，密码子优化包括将氨基酸序列之密码子利用率与所选择而包括和/或不包括特定DNA序列之宿主生物体之密码子频率相匹配。在一些实施方式中，密码子优化进一步包括最小化相应二级mRNA结构以减少翻译障碍。在一些实施方式中，N端尾已经密码子优化而包含SEQ ID NO:28、30、32及34中之任一者。在一些实施方式中，Gly/Ser茎部已经密码子优化而包含SEQ ID NO:28、30、32及34中之任一者。
为了可更好地理解本发明，阐述以下实施例。这些实施例仅出于说明之目的而不视作限制本发明范畴。
免疫原性组合物配制品
在某些实施方式中，本发明之免疫原性组合物进一步包含以下至少一者：佐剂、缓冲剂、低温保护剂、盐、二价阳离子、非离子型清洁剂、自由基氧化抑制剂、稀释剂或载剂。
本发明之免疫原性组合物除复数种脑膜炎双球菌蛋白质抗原及荚膜多糖-蛋白质缀合物之外亦可进一步包含一或多种防腐剂。FDA要求多剂量(多剂量)小瓶中之生物学产品含有防腐剂，仅有少数例外。含有防腐剂之疫苗产品包括含有以下之疫苗：苄索氯铵(benzethonium chloride)(炭疽)、2-苯氧乙醇(DTaP、HepA、莱姆病(Lyme)、脊髓灰质炎(Polio)(非经肠))、苯酚(肺炎球菌(Pneumo)、伤寒(非经肠)、牛痘)及硫柳汞(DTaP、DT、Td、HepB、Hib、流感、JE、Mening、Pneumo、狂犬病)。批准用于可注射药物之防腐剂包括，例如，氯丁醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、苄索氯铵、氯化苯甲烃铵、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞及硝酸苯汞。
本发明的配制品可进一步包含以下一或多者：缓冲剂、盐、二价阳离子、非离子型清洁剂、低温保护剂(诸如糖)及抗氧化剂(诸如自由基清除剂或螯合剂)，或其任何多重组合。对任一种组分(例如螯合剂)之选择可决定是否需要另一组分(例如清除剂)。所调配的用于施用之最终组合物应为无菌和/或无热原的。本领域技术人员可，根据多种因素，诸如所需之特定储存及投药条件，凭经验确定这些及其它组分的那些组合用于纳入含有防腐剂之本发明免疫原性组合物中是最佳的。
在某些实施方式中，与非经肠施用相容之本发明配制品包含一或多种选自(但不限于)以下之生理学上可接受之缓冲剂：Tris(三甲胺)、磷酸盐、乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸及丁二酸盐。在某些实施方式中，将配制品缓冲至约6.0至约9.0，优选约6.4至约7.4之pH值范围内。
在某些实施方式中，可能需要调节本发明之免疫原性组合物或配制品之pH值。可使用本领域标准技术调节本发明之配制品之pH值。可将配制品之pH值调节至3.0至8.0。在某些实施方式中，配制品之pH值可为，或可调节至3.0至6.0、4.0至6.0或5.0至8.0。在其它实施方式中，配制品之pH值可为，或可调节至约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约5.8、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5或约8.0。在某些实施方式中，pH值可为，或可调节至以下范围内：4.5至7.5，或4.5至6.5、5.0至5.4、5.4至5.5、5.5至5.6、5.6至5.7、5.7至5.8、5.8至5.9、5.9至6.0、6.0至6.1、6.1至6.2、6.2至6.3、6.3至6.5、6.5至7.0、7.0至7.5或7.5至8.0。在一特定实施方式中，配制品之pH值为约5.8。
在某些实施方式中，与非经肠施用相容之本发明配制品包含一或多种二价阳离子，包括(但不限于)MgCl2、CaCl2及MnCl2，浓度在约0.1mM至约10mM范围内，优选至多约5mM。
在某些实施方式中，与非经肠施用相容之本发明配制品包含一或多种盐，包括(但不限于)氯化钠、氯化钾、硫酸钠及硫酸钾，所述盐以在非经肠施用时对于个体而言在生理学上可接受之离子强度存在，且以在最终配制品中产生所选离子强度或同渗容摩的最终浓度纳入。配制品之最终离子强度或同渗重摩将由多种组分(例如，来自缓冲化合物及其它非缓冲盐之离子)决定。优选之盐，即NaCl在至多约250mM之范围内存在，其中选择盐浓度以补充其它组分(例如糖)，因此配制品之最终总同渗容摩与非经肠施用(例如肌肉内或皮下注射)兼容且将促进免疫原性组合物配制品之免疫原性组分在各种温度范围内之长期稳定性。无盐配制品将耐受一或多种所选低温保护剂之范围增加以维持所需之最终同渗容摩水平。
在某些实施方式中，与非经肠施用相容之本发明配制品包含一或多种选自(但不限于)以下之低温保护剂：二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖或海藻糖)及多羟基烃(例如半乳糖醇、甘油、甘露糖醇及山梨糖醇)。
在某些实施方式中，配制品之同渗容摩在约200mOs/L至约800mOs/L范围内，其中优选范围为约250mOs/L至约500mOs/L或约300mOs/L至约400mOs/L。无盐配制品可含有，例如，约5％至约25％蔗糖，且优选含有约7％至约15％或约10％至约12％蔗糖。或者，无盐配制品可含有例如约3％至约12％山梨糖醇，且优选含有约4％至7％或约5％至约6％山梨糖醇。若添加诸如氯化钠之盐，则相对减少蔗糖或山梨糖醇之有效范围。考虑这些及其它这样的同渗重摩及同渗容摩完全处于本领域技术范围内。
在某些实施方式中，与非经肠施用相容之本发明配制品包含一或多种自由基氧化抑制剂和/或螯合剂。多种自由基清除剂及螯合剂在此项技术中为已知的且适用于本文所述之配制品及使用方法。实例包括(但不限于)乙醇、EDTA、EDTA/乙醇组合、三乙醇胺、甘露糖醇、组氨酸、甘油、柠檬酸钠、肌醇六磷酸、三聚磷酸盐、抗坏血酸/抗坏血酸盐、丁二酸/丁二酸盐、苹果酸/苹果酸盐、甲磺酸去铁铵、EDDHA及DTPA，以及上述中的两者或两者以上之各种组合。在某些实施方式中，可以添加有效增强配制品之长期稳定性的浓度的至少一种非还原性自由基清除剂。亦可以各种组合(诸如清除剂与二价阳离子)形式添加一或多种自由基氧化抑制剂/螯合剂。螯合剂之选择将决定是否需要添加清除剂。
在某些实施方式中，与非经肠施用相容之本发明配制品包含一或多种非离子型界面活性剂，包括(但不限于)聚氧化乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚山梨醇酯-80(吐温80)、聚山梨醇酯-60(吐温60)、聚山梨醇酯-40(吐温40)及聚山梨醇酯-20(吐温20)；聚氧乙烯烷基醚，包括(但不限于)BRIJ 58、BRIJ 35以及其它者，诸如TRITON X-100；TRITON X-114、NP40、SPAN 85及普朗尼克系列之非离子型表面活性剂(例如普朗尼克121)，其中优选组分为约0.001％至约2％(优选至多约0.25％)之浓度的聚山梨醇酯-80或约0.001％至1％(优选至多约0.5％)之浓度的聚山梨醇酯-40。
在某些实施方式中，本发明之配制品包含一或多种适用于非经肠施用之其它稳定剂，例如包含至少一个硫醇(-SH)基团之还原剂(例如半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、硫代乙醇酸钠、硫代硫酸盐、单硫代甘油或其混合物)。二者选一或任选地，可进一步藉由自储存容器中移除氧气、将配制品遮光保护(例如藉由使用琥珀玻璃容器)来使本发明之含防腐剂之免疫原性组合物配制品稳定。
本发明之含防腐剂之免疫原性组合物配制品可包含一或多种药学可接受之稀释剂、载剂或赋形剂，所述赋形剂包括本身不诱导免疫应答之任何赋形剂。适合之赋形剂包括(但不限于)大分子(诸如蛋白质、糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物)、蔗糖(Paoletti等人,2001,Vaccine,19:2118)、海藻糖、乳糖及脂质聚集物(诸如油滴或脂质体)。这些该等稀释剂、赋形剂和/或载剂为本领域技术人员所熟知。药学可接受之赋形剂论述于例如Gennaro,2000,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,ISBN:0683306472中。
本发明之组合物可经冻干或呈水性形式，即溶液或悬浊液。有利地，液体配制品可自其包装形式直接施用且因此对于注射而言为理想的，不需要如本发明之冻干组合物所需之另外在水性介质中进行复水。
可藉由非经肠施用(肌肉内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内施用或施用至组织之间质间隙)；或藉由经直肠、经口、经阴道、局部、经皮、鼻内、眼部、经耳、肺部或其它黏膜施用来向个体直接传递本发明之免疫原性组合物。在一优选实施方式中，非经肠施用系藉由肌肉内注射例如于个体之大腿或上臂来达成。注射可经由针(例如皮下注射针)来达成，但或者可使用无针注射。典型肌肉内剂量为0.5mL。本发明之组合物可以制备成各种形式，例如，用于注射之液体溶液或悬浊液。在某些实施方式中，组合物可制备成用于肺部施用(例如于吸入器中)之粉末或喷雾剂。在其它实施方式中，所述组合物可制备成栓剂或子宫托，或用于经鼻、经耳或眼部施用，例如制备成喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末。
特定免疫原性组合物之组分之最佳量可藉由涉及观测个体之适当免疫应答之标准研究来确定。在最初疫苗接种后，个体可接受一次或多次时间间隔足够长之追加免疫接种。
包装及剂型
本发明之免疫原性组合物可包装成单位剂量或多剂量形式(例如2剂、4剂或4剂以上)。对于多剂量形式，相较于预装药品之注射器，通常优选，但不必须是小瓶。适合之多剂量形式包括(但不限于)：每个容器2至10次剂量，每剂0.1至2mL。在某些实施方式中，所述剂量为0.5mL剂量。参见，例如，国际专利申请案WO2007/127668，其以引用方式并入本文中。
组合物可存在于小瓶或其它适合之储存容器中，或可存在于预装药品之传递装置中，例如单组分或多组分注射器，所述注射器可提供有针或未提供针。注射器通常但不必须含有单一剂量之本发明之含防腐剂免疫原性组合物，亦设想多剂量预装药品之注射器。同样，小瓶可包括单一剂量，或者可包括多个剂量。
可常规地确立有效之剂量体积，但用于注射之典型剂量之组合物的体积为0.5mL。在某些实施方式中，所述剂量经调配以给人类个体进行施用。在某些实施方式中，剂量经调配以给成人、青少年、青年、幼童或婴儿(亦即至多一岁大)人类个体施用且在优选实施方式中可藉由注射施用。
本发明之液体免疫原性组合物亦适用于复水以冻干形式存在之其它免疫原性组合物。在免疫原性组合物用于该临时复水时，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒具有两个或两个以上小瓶、两个或两个以上已填充注射器或小瓶及已填充注射器各一或多个，其中在注射前使用注射器之内容物复水小瓶之内容物，或反之亦然。
或者，可例如使用本领域熟知之多种用于冷冻干燥之方法中之一者将本发明之免疫原性组合物冻干并复水，所述方法形成干燥之形状规则(例如球形)之颗粒，诸如微丸或微球体，可藉由改变用于制备所述颗粒之精确方法来选择及控制之其颗粒特征，诸如平均直径。所述免疫原性组合物可进一步包含佐剂，任选地，该佐剂用单独的、干燥的且形状规则(例如球形)之颗粒(诸如微丸或微球体)制备或含于所述颗粒。在这样的实施方式中，本发明进一步提供一种免疫原性组合物试剂盒，其包含第一组分，该第一组分包括稳定化之干燥免疫原性组合物，以及任选地，进一步包含本发明之一或多种防腐剂；及第二组分，该第二组分包含用于复水第一组分之无菌水性溶液。在某些实施方式中，所述水性溶液包含一或多种防腐剂，且任选地，可包含至少一种佐剂(参见例如WO2009/109550(以引用方式并入本文中))。
在另一实施方式中，多剂量形式之容器系选自(但不限于)由以下容器的一或多者：一般实验室玻璃器皿、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管、管道、袋、罐、小瓶、小瓶扣合物(例如橡胶塞、螺旋盖)、安瓿、注射器、双腔室或多腔室注射器、注射器塞、注射器活塞、橡胶扣合物、塑料扣合物、玻璃扣合物、药筒(cartridge)及抛弃式笔等。本发明之容器不受生产材料限制，且包括诸如玻璃、金属(例如钢、不锈钢、铝等)及聚合物(例如热塑性塑料、弹性体、热塑性弹性体)之材料。在一特定实施方式中，该形式之容器为具有丁基橡胶塞之5mL Schott 1型玻璃小瓶。本领域技术人员将了解，上述形式绝非详尽清单，而仅用作在可用于本发明之形式种类方面对本领域技术人员的指导。预期用于本发明中之其它形式可见于来自实验室设备供货商及生产商(诸如United States Plastic Corp.(Lima,OH)、VWR)之公开目录中。
实施例
实施例1：实验程序
血清杀细菌分析
用吸附于AlPO4之rLP2086或rP2086(A+B)蛋白质对食蟹猕猴(Cynomolgusmacaques)(n＝5只/组)进行经肌肉内免疫接种。食蟹猕猴为非人类灵长类动物之一个实例。在第0周、第4周及第24周对动物进行疫苗接种，且在第0周、第4周、第6周及第26周测定ORF2086特异性IgG及功能性抗体效价。测定针对rLP2086A及rLP2086B之血清ORF2086特异性IgG效价。
藉由针对脑膜炎双球菌菌株之血清杀细菌分析(SBA)研究功能性抗体效价，所述脑膜炎双球菌菌株表达具有与疫苗中所含之序列同源或异源之序列的LP2086。
使用SBA用人类补体测定用ORF2086疫苗进行免疫接种之猕猴或兔中之血清杀细菌性抗体。将兔免疫血清或猕猴免疫血清热失活以移除固有补体活性，并随后在96孔微量滴定盘中于含Ca2+及Mg2+之Dulbecco’sDulbecco's PBS(D-PBS)中1:2连续稀释以测试针对脑膜炎双球菌菌株之血清杀细菌活性。使分析中使用之细菌在补充有Kellogg's补充剂之GC培养基(GCK)中生长，并藉由在650nm下之光密度进行监测。在0.50-0.55之最终OD650下收获细菌用于分析，在D-PBS中稀释且将1000-3000CFU添加至具有20％人类补体之分析混合物中。
使用不具有可检测杀细菌活性之人类血清作为外源补体来源。测试补体来源对于各单个测试菌株之适合性。只有当在未添加免疫血清下对照组中存活之细菌数>75％时才使用补体来源。需要十种独特之补体来源来进行此研究中所述之SBA。
在37℃、5％CO2下温育30分钟之后，将D-PBS添加至反应混合物中且将等分试样转移至填充有50％GCK培养基之微量过滤盘中。过滤微量过滤盘，在37℃、5％CO2下温育隔夜且对微菌落进行染色且定量。血清杀细菌效价系定义为相较于在无免疫血清下对照孔中之CFU，使CFU减少50％之血清稀释度之内插倒数。SBA效价系定义为在37℃下温育30分钟之后使细菌计数减少50％之测试血清稀释度之内插倒数。若ORF2086免疫血清之SBA效价为相应免疫前血清之4倍或大于4倍，则确定对利用ORF2086免疫血清之杀伤作用具敏感性。在起始稀释度下针对分析菌株呈阴性之血清的效价系指定为分析之检测极限的一半(亦即4)。
实施例2：克隆及表达非脂化之ORF2086变体
最初藉由自基因组DNA进行PCR扩增来获得对应于来自脑膜炎双球菌菌株M98250771(A05)之残基27至286的成熟P2086氨基酸序列。具有序列TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG(SEQ ID NO:22)之正向引物与5'端序列退火且含有用于克隆之NdeI位点。具有序列CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC(SEQ ID NO:23)之反向引物与基因之3'端退火且含有终止密码子TAG，后面是限制性位点BamHI。首先将799bp扩增片段克隆至中间载体PCR2.1(Invitrogen,Carlesbac,CA)中。用NdeI及BamHI裂解此质粒，且将其连接至表达载体pET9a(Novagen,Madison,WI)中，该表达载体已经NdeI及BamHI裂解。所得载体pLA100(其包括SEQ ID NO:54)表达无N端半胱氨酸之来自菌株M98250771之成熟的亚家族A05P2086(参见SEQ ID NO:13，其中位置1之N端Cys系经删除；或SEQ ID NO:55)，该N端半胱氨酸应存在于脂化之蛋白质中。使用BLR(DE3)大肠杆菌宿主菌株[F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcmΔ(srl-recA)306::Tn10(TetR)(DE3)](Novagen)使fHBP表达。
使用相同克隆步骤来制备B02、B03、B09、B22、B24、B44、A04、A12及A22之N端Cys删除型变体。亦藉由此相同方法，使用亦包括Cys密码子(例如SEQ ID NO:1-11之第一个密码子)之正向引物来制备含有N端Cys之变体。基于本文提供之序列，技术人员将能够设计用于这些变体中之每一者的正向引物及反向引物。举例而言，使用以下引物扩增B44非脂化之变体，继而使用NdeI及BlpI将其克隆至pET9a中。
表1
Figure BDA0001239455110000581
结果
非脂化之质粒构建体强烈表达，但非脂化之蛋白质变体在N端Cys残基处经丙酮酸化。参见实施例8及9，其描述，例如，用于表达构建体之方法。为克服此丙酮酸化，使N端Cys密码子经删除。参见例如实施例10。然而，删除N端Cys经会使A22及B22变体之不表达。参见例如，图4。然而，虽然N端Cys残基经删除，但A05、B01及B44变体仍表达。参见，例如，位置1之N端Cys经删除之SEQ ID NO:13(A05)、SEQ ID NO:35(B01N端)，及位置1之N端Cys经删除之SEQ ID NO:21(B44)。参见例如，图5。另外，非脂化之B09变体之表达不受N端Cys残基删除影响。参见，例如，实施例4。
实施例3：Gly/Ser茎部对非脂化之变体表达的影响
为了确定A05、B01及B44变体在N端Cys不存在下表达而A22及B22变体则不表达的原因，比对这些变体之序列。A05、B01及B44变体皆具有紧邻N端Cys之后的一系列延伸之10或11个Gly及Ser残基(亦即Gly/Ser茎部)。然而，A22及B22变体仅具有由6个Gly及Ser残基组成之Gly/Ser茎部。因此，藉由插入另外之Gly及Ser残基使A22及B22变体之Gly/Ser茎部延伸。
藉由实施例2中所述之方法，使用编码具有10个或11个Gly及Ser残基之Gly/Ser茎部之正向引物制备长Gly/Ser茎部变体。
相较于N端Cys删除型A22及B22短Gly/Ser茎部(6个Gly/Ser残基)变体，N端Cys删除型长Gly/Ser茎部(10至11个Gly/Ser残基)A22及B22变体展示出表达增加。然而，相较于A05、B01及B44变体表达量，这些表达量仍有所降低。
实施例4：密码子优化
非脂化之B09变体之表达不受N端Cys残基删除影响(参见位置1之半胱氨酸经删除的SEQ ID NO:18，或SEQ ID NO:49)。参见例如图6。对B09变体进行序列评估表明，B09变体具有由6个Gly及Ser残基组成之Gly/Ser茎部，该Gly/Ser茎部类似于A22及B22变体之Gly/Ser茎部。实际上，B09与A22变体之N端尾在氨基酸层面上是相同的。然而，B09与A22变体(分别为SEQ ID NO:53与42)之N端尾在核酸层面上有2个核酸不同：SEQ ID NO:8之核酸15及39。参见例如图6。B22变体之N端尾之前14个氨基酸与B09及A22变体相同，且B22变体之N端尾仅在第15个氨基酸处不同。B22变体之核酸1至42与A22变体之核酸1至42相同。B22变体(参见SEQ ID NO:52)之核酸1至42与B09(参见SEQ ID NO:53)之核酸1至42相同，但在最佳比对时，于核酸15及39处存在差异。因此，B22变体与B09变体之不同之处在于SEQ ID NO:8之氨基酸15及39。此最后一句含有打字错误且应表述为B22变体与B09变体的不同之处在于SEQ ID NO:8之核酸15及39。
为了确定核酸差异是否影响B09变体相较于A22及B22变体之表达量，藉由点突变使A22及B22变体突变以将核酸15及39并入Gly5及Gly13之相应密码子中。并入这些沉默核酸突变会使得A22及B22N端Cys删除型变体之表达显著增加至类似于N端Cys删除型B09变体之表达量。参见例如，图7。因此，进行密码子优化以匹配B09变体可使N端Cys删除型非脂化之P2086变体之表达增加。
对非脂化之变体序列的进一步分析表明在Gly/Ser茎部中进行另外之密码子优化会提高表达。因此，藉由实施例2之方法，使用包含这些经密码子优化之序列的正向引物建构另外之非脂化之变体。用于产生经优化之Gly/Ser茎部的正向引物包括以下任何序列：
Figure BDA0001239455110000601
实施例5：免疫原性组合物配制品优化
ISCOMATRIX调配疫苗产生快速之免疫应答，使得达成大于4倍应答率所需之剂量数减少，所述应答率如在血清杀细菌分析中所测量的。用二价非脂化之rP2086疫苗之不同配制品对各组五只恒河猴进行免疫接种。所述疫苗包括非丙酮酸化且非脂化之A05变体(SEQ ID NO:13(其中位置1之N端Cys系经删除)或由SEQ ID NO:54编码之SEQ ID NO:55)及非丙酮酸化且非脂化之B44变体(SEQ ID NO:21(其中位置1之N端Cys系经删除)或由SEQ IDNO:51编码之SEQ ID NO:44)。佐剂单位如下：AlPO4为250mcg，ISCOMATRIX为10mcg至100mcg。表2至5中所示之AlPO4之佐剂单位系展示为毫克单位，且因此与250mcg相对而展示为0.25(毫克)。
免疫接种时程为第0周、第4周及第24周，其中在第0周、第4周、第6周及第26周取血。在第一次给药后，任一组之SBA效价均未增加。在第二次给药后，对于含有ISCOMATRIX佐剂之配制品观测到SBA效价增加及应答者数目增加，应答者系如由SBA效价高于基线增加至4倍所定义。表2及3分别提供对于fHBP亚家族A及B菌株所观测到的SBA GMT。ISCOMATRIX配制品之SBA GMT分别为对于A及B亚家族菌株之AIPO4配制品所观测到之SBA GMT的3至19倍及4至24倍。在第三次给药后，对于ISCOMATRIX配制品亦观测到效价增强，fHBP亚家族A及B菌株之ISCOMATRIX配制品分别为AIPO4配制品的13至95倍及2至10倍。对如由SBA效价较基线增加至四倍或大于四倍所定义的应答者比例之分析揭露相似之趋势(表4及5)。
Figure BDA0001239455110000611
Figure BDA0001239455110000612
Figure BDA0001239455110000621
Figure BDA0001239455110000622
Figure BDA0001239455110000623
实施例6：由脂化及非脂化之变体所赋予的免疫保护作用
重组表达之非脂化之P2086变体(B44)针对呈现不同之fHBP变体(约85％至约<92％ID)LP2086序列之菌株诱导如由SBA所测量之广泛之保护作用。对于用AlPO4调配之非脂化之疫苗获得这些应答率。参见表6，其展示由二价fHBP疫苗产生之对亚家族B fHBP MnB菌株的SBA应答率。非脂化之疫苗(在“脂化”行下由“-”表示)包括每种蛋白质1mcg之非丙酮酸化且非脂化之A05变体(SEQ ID NO:13，其中位置1之N端Cys系经删除)及非丙酮酸化且非脂化之B44变体(SEQ ID NO:21，其中位置1之N端Cys系经删除)。
或者，如由SBA效价所测量重组表达之非脂化之P2086变体(B44)针对带有相似(>92％ID)及不同(<92％ID)LP2086序列之菌株所诱导之免疫应答大于脂化之变体(B01)。相较于脂化之rLP2086B01疫苗，对于含有非脂化之rP2086B44之疫苗观测到较高应答率(如由SBA效价较基线增加至四倍或大于四倍所定义)(表6)。
根据表6，非脂化之B44为针对多种LP2086变异菌株(例如激发针对多种LP2086变异菌株之杀细菌性抗体)提供广泛覆盖的组合物中优选之fHBP亚家族B组分。
令人惊奇的是，发明人注意到LP2086B09变异菌株尤其不可能对于异源(非B09)ORF2086多肽具有阳性SBA应答率。特定而言，发明人发现就分析菌株而言，LP2086B09为一例外，表6中所述之A05/B44免疫原性组合物针对该分析菌株可激发杀细菌性抗体。因此，在一优选实施方式中，本发明之免疫原性组合物包括B09多肽，尤其在组合物包括超过一种ORF2086亚家族B多肽的情况下。在一优选实施方式中，包括非脂化之B44之免疫原性组合物亦可包括非脂化之B09多肽。
Figure BDA0001239455110000631
实施例7：B44及B09变体之密码子优化
虽然在前述实施例中所达到之表达量足以用于许多应用，但需要进一步优化，因此制备在蛋白质之全长范围内含有额外密码子优化的大肠杆菌表达构建体并加以测试。发现用于表达无Cys B44蛋白质之一个经改良序列为SEQ ID NO:43中所示之核酸序列。如实施例9中所示，含有SEQ ID NO:43之表达构建体相较于未经优化之野生型序列会呈现出增强之表达。
藉由将上述经优化之B44(SEQ ID NO:43)构建体中之密码子变化应用于B09(SEQID NO:48)来改良N端Cys删除型B09蛋白质之表达。为了产生经优化之B09序列，首先将B44经优化之DNA序列(SEQ ID NO:43)与B09等位基因之DNA序列(SEQ ID NO:48)比对。无论B44(SEQ ID NO:44)与B09(SEQ ID NO:49)之间的氨基酸是否相同，将B09等位基因之整个非脂化之编码序列(SEQ ID NO:48)优化，以反映出在B44经优化之等位基因(SEQ ID NO:43)所观察到之密码子变化。改变B09等位基因中对应于B09等位基因与B44等位基因之间的相同氨基酸之密码子序列，以反映出B44经优化序列(SEQ ID NO:43)中所用之密码子。不改变B09DNA序列中B09(SEQ ID NO:49)与B44(SEQ ID NO:44)之间不同的氨基酸之密码子序列。
另外，非脂化之B44氨基酸序列(SEQ ID NO:44)在其N端处含有两个连续之丝氨酸-甘氨酸重复序列(S-G-G-G-G)(SEQ ID NO:56)(亦参见SEQ ID NO:44之氨基酸2至6)，而B09等位基因在N端仅含有一个丝氨酸-甘氨酸重复序列(参见SEQ ID NO:49之氨基酸2至6及氨基酸7至11)。B44之N端上之两个丝氨酸-甘氨酸重复序列(SEQ ID NO:44之氨基酸2至6及氨基酸7至11)亦具有不同之密码子使用(参见SEQ ID NO:43之核苷酸4至18及核苷酸19至33)，且将经优化之B44丝氨酸-甘氨酸重复序列之不同组合(例如SEQ ID NO:43之核苷酸4至18或SEQ ID NO:43之核苷酸19至33，或其组合)应用于B09DNA序列(SEQ ID NO:48，例如应用于SEQ ID NO:48之核苷酸4至18)以研究对重组蛋白表达之影响。
建构经优化之B09之三种不同型式：SEQ ID NO:45含有经优化之B44中之两个丝氨酸-甘氨酸重复序列(GS1及GS2)(SEQ ID NO:43之核酸4至33)，SEQ ID NO:46含有GS1(SEQID NO:43之核酸4至18)，且SEQ ID NO:47含有GS2(SEQ ID NO:43之核酸19至33)。使用本领域标准化学方法以化学方式合成上述所有经密码子优化之序列的DNA。如实施例8及9中所述，将所得DNA克隆至适当质粒表达载体中且测试在大肠杆菌宿主细胞中之表达。
实施例8：表达ORF2086B09变体之方法
用以下质粒转化大肠杆菌K-12菌株细胞(野生型W3110之衍生物(CGSC4474)，recA、fhuA及araA删除)：质粒pEB063，其包括SEQ ID NO:45；质粒pEB064，其包括SEQ IDNO:46；质粒pEB065，其包括SEQ ID NO:47；或质粒pLA134，其包括SEQ ID NO:48。对K-12菌株之优选的修饰有助于达成发酵目的，但并非为蛋白质表达所需。
将细胞接种于葡萄糖-盐合成培养基中。在37℃下温育8小时之后，施加线性葡萄糖进料且再继续温育3小时。将异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)添加至培养物中达0.1mM之最终浓度，继而在37℃下温育12小时。16,000×g离心10分钟收集细胞，并添加来自Lienco Technologies(St.Louis,MO)之Easy-LyseTM细胞溶解试剂盒及上样缓冲液来使其溶解。藉由对SDS-PAGE凝胶进行库马斯染色(Coomassie staining)和/或蛋白质印迹分析(藉由扫描密度计进行定量)来分析澄清之细胞裂解液中B09之表达。扫描密度测定术之结果于下表7中：
Figure BDA0001239455110000651
实施例9：表达ORF2086B44变体之方法
用包括SEQ ID NO:51之质粒pLN056转化大肠杆菌B菌株细胞(BLR(DE3)，Novagen)。用包括SEQ ID NO:43之质粒pDK087转化大肠杆菌K-12菌株细胞(野生型W3110之衍生物)。将细胞接种于葡萄糖-盐合成培养基中。在37℃下温育8小时之后，应用线性葡萄糖进料且再继续温育3小时。将异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)添加至培养物中达0.1mM之最终浓度，继而在37℃下温育12小时。16,000×g离心10分钟收集细胞，并添加来自Lienco Technologies(St.Louis,MO)之Easy-LyseTM细胞溶解试剂盒及上样缓冲液来使其溶解。对SDS-PAGE凝胶进行库马斯染色和/或蛋白质印迹分析(藉由扫描密度计进行定量)来分析上清液中B09之表达。扫描密度测定术之结果于下表8中：
Figure BDA0001239455110000661
实施例10：丙酮酸化
本实施例表明在表达于例如大肠杆菌中时，非脂化之ORF2086蛋白质之N端Cys残基可经丙酮酸化。
使用反相高效液相层析(RP-HPLC)监测在产生变体A05(SEQ ID NO:13)及B44(SEQID NO:21)期间的异源蛋白质积聚。此分离与四极渡越时间质谱仪(QTOF-MS)互相作用以提供监测产物相关变体形成的手段。
在大肠杆菌B和/或K-12宿主细胞中表达之后，对由这些发酵获得之产物进行纯化程序，期间观测到产物修饰。对质谱进行去卷积(deconvolution)将变体表征为相较于分别具有27640Da及27572Da之A05及B44天然产物，展现+70Da之质量位移。
公开之文献表明先前已在蛋白质中观测到+70Da质量位移且已归因于氨基端残基之丙酮酸化。
使用质谱片段化数据(MS/MS)确定丙酮酸酯基之存在及位置。所述数据表明修饰处于氨基端半胱氨酸残基处，亦即根据A05及B44之位置1之氨基酸处。对于A05，相较于A05多肽之总数(SEQ ID NO:13)，丙酮酸化之多肽的百分比为约30％。对于B44，相较于B44多肽之总数(SEQ ID NO:21)，丙酮酸化之多肽的百分比为约25％。
在纯化不含氨基端半胱氨酸之A05(SEQ ID NO:13，其中位置1之N端Cys系经删除；或SEQ ID NO:55)及B44变体(SEQ ID NO:21，其中位置1之N端Cys系经删除；或SEQ ID NO:44)时，没有可检测之丙酮酸化(+70Da)。
实施例11：B09及B44单独及组合之免疫原性
用每剂以250mcg AlPO4调配之B09变体(由SEQ ID NO:48编码之SEQ ID NO:49)或B44变体(由SEQ ID NO:43编码之SEQ ID NO:44)或A05、B09及B44(分别为SEQ ID NO:55、由SEQ ID NO:48编码之SEQ ID NO:49，及由SEQ ID NO:43编码之SEQ ID NO:44)对5至10组恒河猴进行免疫接种。在第0周、第4周及第8周经由肌肉内途径用如表9及10中所列之10mcg各非脂化之fHBP单独或以组合形式对猴进行疫苗接种。在针对具有亚家族A或亚家族B fHBP变体之MnB菌株的SBA中分析第0周及第12周血清样品。将效价4×升高之动物记录为应答者。所测试之B44变体为经优化之构建体(SEQ ID NO:43)且经优化之构建体(表9)B44疫苗单独或与B09组合维持在先前研究(上表)中所观测到之广泛应答率。B09疫苗单独(表10)亦可产生广泛交叉反应性免疫应答(表10)。
表9：在恒河猴中对于非脂化之fHBP疫苗所获得的应答率
Figure BDA0001239455110000671
在第0周、第4周及第8周以含250mcg AlPO4之配制品形式用如疫苗行中所列之10mcg各非脂化之fHBP单独或以组合形式对恒河猴(n＝10)进行肌肉内免疫接种。在针对表中所列之MnB菌株的SBA中分析第0周及第10周血清样品。将效价4×升高之动物记录为应答者。
表9表明，例如，相较于单独包括B44之组合物的交叉覆盖(coverage)，包括非丙酮酸化且非脂化之B44、B09及A05之组合的组合物针对测试变体展示出较高交叉覆盖。鉴于本申请中所展示之结果(尤其包括表6及表9)，包括单独或呈组合形式之B44、B09及A05的组合物为本发明之优选实施方式。特别地，公开了包括B44及B09之组合物。优选地，该组合物进一步包括亚家族A多肽，尤其诸如A05。
表10：在恒河猴中对于非脂化之fHBP B09疫苗所获得的应答率
Figure BDA0001239455110000681
在第0周、第4周及第8周以含250mcg AlPO4之配制品形式用如疫苗行中所列之10mcg各非脂化之fHBP单独或以组合形式对恒河猴(n＝5)进行肌肉内免疫接种。在针对表中所列之MnB菌株的SBA中分析第0周及第10周血清样品。将效价4×升高之动物记录为应答者。
实施例12：由脂化及非脂化之变体构建体赋予的免疫保护
藉由全细胞ELISA对获自Charles River Canada之20只雌性新西兰白兔(2.5kg至3.5kg)进行预筛选，并基于针对呈现fHBP变体B02(SEQ ID NO:16)及B44(SEQ ID NO:21)之测试菌株的背景效价较低而选择10只动物用于此研究(表11)。在第0周、第4周及第9周用以50μg ISCOMATRIX调配之100μg各蛋白质以每次0.5ml剂量对各组三只动物进行肌肉内免疫接种(表12)。用非脂化之B44(SEQ ID NO:44)对组1进行疫苗接种。包括对照组，用以AlPO4(250mcg)调配之脂化之B01对对照组进行疫苗接种。在第0周、第4周、第9周及第10周对兔进行取血。自第10周起制备个体血清且藉由血清杀细菌分析针对来自fHBP B亚家族之多种血清群B脑膜炎双球菌菌株进行分析。
表11：研究中使用之兔
Figure BDA0001239455110000682
Figure BDA0001239455110000691
表12
Figure BDA0001239455110000692
免疫接种时程：第0周、第4周、第9周；取血时程：第0周、第4周、第9周、第10周
血清杀细菌分析(SBA)：对单独血清样品进行针对多种血清群B脑膜炎双球菌菌株之基于微群落之血清杀细菌分析(SBA)(表13)。来自捐献者之人类血清经验证后作为用于分析中所测试之菌株的补体来源。对补体介导之抗体依赖性杀细菌效价进行内插并将其表示为在分析中杀死50％之脑膜炎双球菌细胞之测试血清之稀释度的倒数。所述分析之检测极限为4之SBA效价。SBA效价<4系指定为2之数值。计算并比较第10周血清相较于免疫接种前取血样品之效价有≥4倍的升高之SBA效价。
如在SBA中所测量之血清杀细菌性抗体活性为针对脑膜炎双球菌疾病之保护作用的免疫替代物。用非脂化之rfHBP进行免疫接种以引起兔之杀细菌性抗体的能力系藉由SBA来测定。藉由模拟天然存在之补体介导之细菌溶解的SBA来测量血清样品中抗体之含量。藉由针对具有B44fHBP或B02fHBP之菌株的SBA分析自第10周收集之兔血清样品。如表13中所示，在第三次免疫接种之后一周(第10周)，所有血清样品针对两种测试菌株皆显示出杀细菌性活性。(表13)。在新西兰兔中非脂化之B44(SEQ ID NO:44)针对这些菌株之免疫原性大于非脂化之B01。用iscomatrix佐剂调配之非脂化之B44(SEQ ID NO:44)针对这些菌株所提供之效价类似于以磷酸铝调配之脂化之B01。兔免疫接种前取血样品血清一般未展示先前存在针对所测试菌株之杀细菌性活性。
表13：用重组非脂化之fHBP进行疫苗接种之新西兰白兔中针对fHBP亚家族B菌株之血清杀细菌性活性
Figure BDA0001239455110000701
实施例13：六种非脂化之因子H结合蛋白在新西兰白兔中之免疫原性
用如表14中所述之非脂化之fHBP变体对各组5只兔进行免疫接种。在第0周、第4周及第9周施用疫苗。藉由针对具有同源及异源fHBP序列之菌株的SBA分析自第0周及第10周收集之兔血清样品。表14展示第三次免疫接种后应答者之百分比。在第三次免疫接种之后一周(第10周)，所有血清样品针对同源菌株以及来自相同fHBP亚家族之其它测试菌株均显示出杀细菌性活性。兔免疫接种前取血样品血清一般未展示先前存在针对所测试菌株之杀细菌性活性。
表14：用重组非脂化之fHBP进行疫苗接种之新西兰白兔中第三次给药后应答者之百分比
Figure BDA0001239455110000702
所用之MnB fHBP蛋白
Figure BDA0001239455110000703
Figure BDA0001239455110000711
表14中之测试变体：
Figure BDA0001239455110000712
实施例14：
＞非脂化之A05(SEQ ID NO：55)
SSGSGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTFKVGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
＞pEB042(SEQ ID NO：65)
ATGAGCTCTGGAAGCGGAAGCGGGGGCGGTGGAGTTGCAGCAGACATTGGAACAGGATTAGCAGATGCACTGACGGCACCGTTGGATCATAAAGACAAAGGCTTGAAATCGCTTACCTTAGAAGATTCTATTTCACAAAATGGCACCCTTACCTTGTCCGCGCAAGGCGCTGAAAAAACTTTTAAAGTCGGTGACAAAGATAATAGCTTAAATACAGGTAAACTCAAAAATGATAAAATCTCGCGTTTTGATTTCGTGCAAAAAATCGAAGTAGATGGCCAAACCATTACATTAGCAAGCGGTGAATTCCAAATATATAAACAAGACCATTCAGCAGTCGTTGCATTGCAAATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGTTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGTGAACATACAGCCTTCAACCAATTACCAAGCGGCAAAGCGGAGTATCACGGTAAAGCATTTAGCTCAGATGATGCAGGCGGTAAATTAACTTATACAATTGACTTTGCAGCAAAACAAGGACATGGCAAAATTGAACATTTAAAAACACCCGAACAGAACGTAGAGCTCGCATCCGCAGAACTCAAAGCAGATGAAAAATCACACGCAGTCATTTTGGGTGACACGCGCTACGGCAGCGAAGAAAAAGGTACTTACCACTTAGCTCTTTTTGGCGACCGAGCTCAAGAAATCGCAGGTAGCGCAACCGTAAAGATAAGGGAAAAGGTTCACGAAATTGGGATCGCGGGCAAACAATAA
＞非脂化之A12(SEQ ID NO：66)
SSGGGGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
＞pEB043(SEQ ID NO：67)
ATGAGCTCTGGAGGTGGAGGAAGCGGGGGCGGTGGAGTTGCAGCAGACATTGGAGCAGGATTAGCAGATGCACTGACGGCACCGTTGGATCATAAAGACAAAAGTTTGCAGTCGCTTACCTTAGATCAGTCTGTCAGGAAAAATGAGAAACTTAAGTTGGCGGCGCAAGGCGCTGAAAAAACTTATGGAAACGGTGACAGCTTAAATACAGGTAAACTCAAAAATGATAAAGTCTCGCGTTTTGATTTCATTCGTCAAATCGAAGTAGATGGCCAAACCATTACATTAGCAAGCGGTGAATTCCAAATATATAAACAAAACCATTCAGCAGTCGTTGCATTGCAAATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGTTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGTGAACATACAGCCTTCAACCAATTACCAGACGGCAAAGCGGAGTATCACGGTAAAGCATTTAGCTCAGATGATCCGAACGGTAGGTTACACTATTCCATTGACTTTACCAAAAAACAAGGATACGGCAGAATTGAACATTTAAAAACGCCCGAACAGAACGTAGAGCTCGCATCCGCAGAACTCAAAGCAGATGAAAAATCACACGCAGTCATTTTGGGTGACACGCGCTACGGCGGCGAAGAAAAAGGTACTTACCACTTAGCCCTTTTTGGCGACCGCGCTCAAGAAATCGCAGGTAGCGCAACCGTAAAGATAAGGGAAAAGGTTCACGAAATTGGGATCGCGGGCAAACAATAA
＞非脂化之A22(SEQ ID NO：68)
SSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
＞pEB058(SEQ ID NO：69)
ATGAGCTCTGGAGGTGGAGGAGTTGCAGCAGACATTGGAGCAGGATTAGCAGATGCACTGACGGCACCGTTGGATCATAAAGACAAAAGTTTGCAGTCGCTTACCTTAGATCAGTCTGTCAGGAAAAATGAGAAACTTAAGTTGGCGGCGCAAGGCGCTGAAAAAACTTATGGAAACGGTGACAGCTTAAATACAGGTAAACTCAAAAATGATAAAGTCTCGCGTTTTGATTTCATTCGTCAAATCGAAGTAGATGGCCAACTTATTACATTAGAAAGCGGTGAATTCCAAATATATAAACAAGACCATTCAGCAGTCGTTGCATTGCAAATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGTTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGTGAACATACAGCCTTCAACCAATTACCAAGCGGCAAAGCGGAGTATCACGGTAAAGCATTTAGCTCAGATGATGCAGGCGGTAAATTAACTTATACAATTGACTTTGCAGCAAAACAAGGACATGGCAAAATTGAACATTTAAAAACACCCGAACAGAACGTAGAGCTCGCATCCGCAGAACTCAAAGCAGATGAAAAATCACACGCAGTCATTTTGGGTGACACGCGCTACGGCGGCGAAGAAAAAGGTACTTACCACTTAGCTCTTTTTGGCGACCGAGCTCAAGAAATCGCAGGTAGCGCAACCGTAAAGATAAGGGAAAAGGTTCACGAAATTGGGATCGCGGGCAAACAATAA
＞A62(SEQ ID NO：70)。GenBank：ACI46789.1
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
＞非脂化之A62(SEQ ID NO：71)
SSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
＞pLA164(SEQ ID NO：72)
ATGAGCAGCGGAGGGGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGTGCGGGGCTTGCCGATGCACTAACCGCACCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGCAGTCTTTAACGCTGGATCAGTCCGTCAGGAAAAACGAGAAACTGAAGCTGGCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTATGGAAACGGCGACAGCCTTAATACGGGCAAATTGAAGAACGACAAGGTCAGCCGCTTCGACTTTATCCGTCAAATCGAAGTGGACGGGAAGCTCATTACCTTGGAGAGCGGAGAGTTCCAAGTGTACAAACAAAGCCATTCCGCCTTAACCGCCCTTCAGACCGAGCAAGTACAAGACTCGGAGGATTCCGGGAAGATGGTTGCGAAACGCCAGTTCAGAATCGGCGACATAGCGGGCGAACATACATCTTTTGACAAGCTTCCCAAAGGCGGCAGTGCGACATATCGCGGGACGGCGTTCGGTTCAGACGATGCTGGCGGAAAACTGACCTATACTATAGATTTCGCCGCCAAACAGGGACACGGCAAAATCGAACACTTGAAAACACCCGAGCAAAATGTCGAGCTTGCCTCCGCCGAACTCAAAGCAGATGAAAAATCACACGCCGTCATTTTGGGCGACACGCGCTACGGCGGCGAAGAAAAAGGCACTTACCACCTCGCCCTTTTCGGCGACCGCGCCCAAGAAATCGCCGGCTCGGCAACCGTGAAGATAAGGGAAAAGGTTCACGAAATCGGCATCGCCGGCAAACAGTAA
＞pDK086(SEQ ID NO：73)
ATGTCCAGCGGTTCAGGCAGCGGCGGTGGAGGCGTGGCAGCAGATATCGGAACAGGTTTAGCAGATGCTCTGACAGCACCCTTAGATCACAAAGACAAAGGACTTAAATCACTGACATTGGAAGATTCTATCTCGCAAAATGGTACTCTCACTCTTTCAGCCCAAGGCGCAGAAAAAACATTTAAAGTAGGCGATAAAGATAACTCCTTAAATACAGGTAAATTAAAAAATGACAAAATCTCACGGTTTGATTTCGTTCAGAAAATTGAAGTAGATGGACAAACGATTACATTAGCAAGCGGCGAATTCCAAATTTATAAACAAGACCATTCAGCAGTAGTAGCATTACAAATCGAAAAAATTAACAACCCGGACAAAATTGATTCTCTTATTAACCAACGCTCTTTTCTCGTATCAGGACTTGGTGGTGAACATACAGCGTTTAATCAACTGCCGTCAGGAAAAGCAGAATATCATGGTAAAGCATTTTCATCAGACGACGCAGGTGGCAAACTGACCTATACTATTGACTTTGCAGCAAAACAGGGACATGGAAAAATTGAACATTTAAAAACACCCGAACAGAACGTAGAACTGGCCTCAGCAGAATTGAAAGCTGATGAAAAATCCCATGCAGTAATTTTAGGCGATACACGTTACGGTAGCGAAGAAAAAGGTACATATCACTTAGCTCTTTTTGGCGATCGTGCTCAAGAAATTGCTGGTTCCGCAACAGTTAAAATCCGTGAAAAAGTACATGAAATCGGCATTGCAGGTAAACAATAA
＞A29(SEQ ID NO：74)
CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGDKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYTIDFTNKQGYGRIEHLKTPELNVDLASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
＞非脂化之B22(SEQ ID NO：75)
SSGGGGVAADIGAVLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDASGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAASDIKPDKKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ
＞非脂化之A05(SEQ ID NO：76)(pPW102)
CGSSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTFKVGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
＞非脂化之A05(SEQ ID NO：77)
GSSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTFKVGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
＞共同序列(SEQ ID NO：78)
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQSHSALVALQTEQINNSDKSGSLINQRSFRISGIAGEHTAFNQLPKGGKATYRGTAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
＞共同序列(SEQ ID NO：79)
SSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQSHSALVALQTEQINNSDKSGSLINQRSFRISGIAGEHTAFNQLPKGGKATYRGTAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
实施例15：产生亚家族ArP2086之非脂化之变体-克隆非脂化之fHBP基因
将非脂化之A05fHBP蛋白之编码序列(SEQ ID NO：55)与表达优化之B44序列(SEQID NO：43)进行比对。在两者之间的氨基酸相同处，使用B44(SEQ ID NO：43)中之密码子在A05基因中进行取代。在Celtek Genes处重新合成经优化之序列，在N端及C端分别添加限制性核酸内切酶位点NdeI及BamHI。将所得基因(SEQ ID NO：65)在那些位点处亚克隆至pET30a中。
由pEB043(SEQ ID NO：67)表达重组非脂化之A12fHBP(SEQ ID NO：66)。藉由BlueHeron Technologies对A12等位基因进行表达优化。藉由与用于A05(pEB042)之方法相同的方法将此基因优化。另外，用经Blue Heron优化之B44 SGGGGSGGGG(SEQ ID NO：44之氨基酸残基2至11)氨基端密码子置换天然A12 SSGGGG(SEQ ID NO：66之氨基酸残基1至6)密码子。在Celtek Genes处重新合成经优化之序列，在N端及C端分别添加限制性核酸内切酶位点NdeI及BamHI。将所得基因(SEQ ID NO：67)在那些位点处亚克隆至pET30a中。
由pEB058(SEQ ID NO：69)表达重组非脂化之A22 fHBP(SEQ ID NO：68)。藉由与用于pEB042之方法相同的方法将此基因优化。另外，用经Blue Heron优化之B44 SGGGG(SEQID NO：44之氨基酸残基2至6)氨基端密码子置换天然A22 SSGGGG(SEQ ID NO：68之氨基酸残基1至6)密码子。在Celtek Genes处重新合成经优化之序列，在N端及C端分别添加限制性核酸内切酶位点NdeI及BamHI。将所得基因(SEQ ID NO：69)在那些位点处亚克隆至pET30a中。
由pLA164(SEQ ID NO：72)表达重组A62 fHBP(SEQ ID NO：71)。用在N端及C端分别含有限制性核酸内切酶位点NdeI及BamHI之引物对来自菌株0167/03之A62_002等位基因进行PCR扩增。将所得基因(SEQ ID NO:72)在那些位点处亚克隆至pET30a中。
实施例16：亚家族A rP2086蛋白大肠杆菌表达菌株之表达、发酵及纯化
使用经pLA164(SEQ ID NO:72)转化之BLR(DE3)大肠杆菌B recA表达A62(SEQ IDNO:71)。将质粒pEB042(SEQ ID NO:65)转化至大肠杆菌宿主BD643(W3110:DE3ΔrecA ΔfhuA ΔaraA)中，得到用于表达A05(SEQ ID NO:55)之菌株BD660。由菌株BD592表达A22(SEQ ID NO:68)，该菌株BD592含有位于宿主BD559(其亦为W3110:DE3ΔrecA ΔfhuA ΔaraA)中之质粒pEB058(SEQ ID NO:69)。最后，将质粒pEB043(SEQ ID NO:67)转化至宿主BD483(W3110:DE3ΔrecA)中，得到用于表达A12(SEQ ID NO:66)之菌株BD540。
发酵
在基于葡萄糖之基本培养基中使表达菌株发酵。将隔夜菌元培养物接种于10公升发酵器中，该发酵器在37℃、1vvm通气下操作，其中级联dO控制在20％。当分批葡萄糖自培养基耗尽(在约OD600＝15下)时，开始以3.8g/L/hr进行限制性线性葡萄糖进料。继续进料直至用0.1mM IPTG进行诱导且贯穿整个后继蛋白质表达时段。为了使A05(SEQ ID NO:55)表达，在OD600＝25下诱导菌株BD660，并在诱导后7小时(HPI)期间继续发酵。藉由在OD600＝40下诱导且发酵24HPI使得菌株BD592及BD540分别表达A22(SEQ ID NO:68)及A12(SEQ IDNO:66)。在发酵结束时，藉由离心收集细胞糊状物。
A62(SEQ ID NO:71)
rP2086蛋白在大肠杆菌菌株之细胞质中以可溶性蛋白质形式产生。通常藉由在低渗缓冲液(10mM Hepes-NaOH，pH 7.4，含有蛋白酶抑制剂)中使表达rP2086之亚家族A之特定变体之冷冻细胞融化且在微流化床中在约20,000psi下破坏细胞来获得可溶性细胞质提取物。添加RNase及DNAse以消化核酸，并在低速离心以移除任何未破裂之细胞且接着高速离心(≥100,000×g)以移除膜、细胞壁及其它较大之亚细胞组分后收集呈上清液形式之细胞质提取物。藉由以25％饱和硫酸铵，接着以50％饱和硫酸铵进行连续调节，并在各次调节后藉由低速离心移除沉淀物质来进一步澄清细胞质提取物。接着藉由使含10mM Hepes-NaOH(pH 7.4)、1mM Na2EDTA之缓冲液中之50％饱和硫酸铵中之rP2086吸附于疏水性相互作用管柱(购自GE Healthcare之苯基琼脂糖)，接着藉由用含10mM Hepes-NaOH(pH 7.4)、1mM Na2EDTA之缓冲液使硫酸铵浓度线性降低至0％来洗脱rP2086以移除低分子量离子性细胞组分。接着藉由用含10mM Tris-HCl(pH 8.6)、1mM Na2EDTA之缓冲液调节含有rP2086之流份，并使汇集之流份通过用相同缓冲液平衡之阴离子交换管柱(购自EMD之TMAE)来移除大部分带负电荷之蛋白质。接着藉由在陶瓷羟基磷灰石(获自BioRad)上进行层析来进一步纯化rP2086，所述层析藉由使含有rP2086之缓冲液交换成含有1mM磷酸钠之10mM Hepes-NaOH(pH 7.4)以使蛋白质吸附于陶瓷羟基磷灰石，接着在pH 7.4下用线性梯度之磷酸钠洗脱至250mM来进行。上列之单元操作通常足以产生纯化之rP2086亚家族A成员。然而，由于表达量可能变化超过10倍，所以当所表达之rP2086处于范围下限时或当需要超纯rP2086(以高浓度用于NMR结构测定)时，添加以下另外之单元操作：层析聚焦，继而进行陶瓷羟基磷灰石层析。使来自早先羟基磷灰石步骤之含有rP2086蛋白之缓冲液交换成25mM Tris-乙酸盐(pH 8.3)且使蛋白质吸附于用相同缓冲液平衡之层析聚焦PBE94管柱(获自GEHealthcare)，接着用特种多缓冲液(polybuffer)94-乙酸盐(pH 6)之缓冲液洗脱。将rP2086蛋白质在其约pI下洗脱并汇集含有蛋白质之流份。接着使含有rP2086之流份的缓冲液交换成含有1mM磷酸钠之10mM Hepes-NaOH(pH 7.4)且如上吸附并洗脱。藉由SDS-PAGE分析测定藉由此方法制备之rP2086亚家族A成员通常>95％均质且最常>99％均质。
A05、A12及A22(分别为SEQ ID NO:55、66及68)
在发酵结束时，藉由连续离心回收细胞浆料(slurry)且将其以约1/4之原始发酵体积重悬于20mM Tris、5mM EDTA(pH 6.0)中。藉由高压均质化(2次通过，4000-9000psi)使细胞悬浊液溶解。向匀浆中添加DADMAC达0.5％之最终浓度。在15℃至25℃下搅拌溶液60分钟，期间形成重沉淀物。藉由连续离心使溶液澄清。使用两个层析步骤，继而进行最终缓冲液交换来纯化蛋白质(A05、A12及A22)。将离心滤液之pH值调节至5.5并加载于GigaCap-S管柱(CEX)上。使蛋白质结合于树脂并随后使用氯化钠梯度洗脱。向来自CEX管柱之汇集物中添加柠檬酸钠达1.5M之最终浓度，并将溶液加载于苯基-650M管柱(HIC)上。使蛋白质结合于树脂且随后使用柠檬酸钠阶段梯度洗脱。藉由透滤使含有纯化之蛋白质的HIC汇集物交换成最终药物物质缓冲液。使用5kD再生乙酸纤维素超滤卡匣。蛋白质浓度之目标为1.5至2.0mg/mL。经0.2微米过滤器过滤经透滤之保留物，之后填充于储存瓶中。将药物物质储存于-70℃。
实施例17：血清杀细菌分析
藉由针对表达具有与疫苗中所含之序列同源或异源之序列的fHBP之野生型或经工程改造脑膜炎双球菌血清群B菌株的血清杀细菌分析(SBA)研究功能性抗体效价。使用SBA用人类补体测定用rP2086疫苗进行免疫接种之兔之血清杀细菌性抗体。将兔免疫血清热失活以移除固有补体活性，并随后在96孔微量滴定盘中于含Ca2+及Mg2+之Dulbecco’sPBS(D-PBS)中两倍连续稀释以测试针对脑膜炎双球菌菌株之血清杀细菌性活性。对于用经工程改造之菌株进行的组合研究，在上文所述之连续稀释之前将相关血清以1:1比率混合，因此各组分之有效浓度为在单独地测试各血清时的一半。使分析中使用之细菌生长在补充有凯洛格氏补充剂(GCK)之GC培养基中且藉由650nm下之光密度来监测。在0.50-0.55之最终OD650下收集细菌以用于分析中，在D-PBS中稀释且将1000-3000CFU添加至分析混合物中。使用不具有可检测杀细菌性活性之人类血清作为外源性补体来源。测试补体来源针对各单个测试菌株之适合性。对于同基因菌株，鉴定单一人类血清并使其适于针对所有同基因菌株的SBA。只有当在未添加免疫血清下对照组中存活之细菌数>75％时才使用补体来源。在37℃、5％CO2下且在摇床上以700rpm搅动下温育30分钟后，将D-PBS添加至反应混合物中且将等分试样转移至预先填充有50％GCK培养基(用于野生型菌株)及100％GCK培养基(用于经工程改造之菌株)的微量过滤盘中。过滤微量过滤盘，在37℃、5％CO2下温育过夜且对微群落进行染色且定量。血清杀细菌效价系定义为相较于在无免疫血清下对照孔中之CFU，使得CFU减少50％的血清稀释度之内插倒数。若相较于相应免疫前血清，抗rP2086免疫血清使SBA效价升高4倍或大于4倍，则确定对由抗rP2086免疫血清所产生之杀死作用具敏感性。在起始稀释度下针对分析菌株呈阴性之血清的效价系指定为分析之检测极限的一半。
实施例18：rP2086亚家族A蛋白质之非脂化变体之免疫原性
在两个研究中使用获自Charles River(Canada)之白色新西兰雌性兔(2.5kg至3.5kg)。对于第一个研究，用30mcg或3mcg经脂化之A05或非脂化之A05fHBP配制品中之每一者对每组3只兔进行免疫接种。对于第二个研究，在右后腿处用含500μg/mL AlPO4佐剂之20μg/mL rP2086A变体经肌肉内对每组5只兔进行免疫接种(0.5毫升/剂/两个部位)。在第0周、第4周及第9周对动物进行疫苗接种，在第0周及第6周取血，且在第10周放血。在第0周、第6周及第10周测定LP2086特异性杀细菌抗体效价。
这些研究之目的在于模拟对于未经免疫学处理之群体(诸如婴儿)所观测到的应答降低。首先，我们比较了含有脂化之A05(SEQ ID NO:13)或非脂化之A05(SEQ ID NO:55)之低剂量及高剂量(每剂每种抗原30mcg相对于3mcg)疫苗(表15A及15B)。使用低剂量以便能辨别各疫苗之间在应答率方面的差异。使用两个菌株组进行SBA分析。第一组由引起侵袭性疾病之野生型菌株组成。第二组为如下经遗传工程改造之菌株组，该菌株组具有相同之菌株背景且不同之处仅在于所表达之fHBP序列：表达fHBP之B24变体之脑膜炎双球菌菌株PMB3556经工程改造以使其内源性fhbp基因经编码其它fHBP变体之基因置换。构建体设计为仅“变换”编码ORF之区域而周围遗传背景保持完整。因此，使用此菌株组进行之SBA分析允许使用一种人类补体来源评估针对以相同量且在相同遗传背景下表达之不同亚家族AfHBP蛋白质之反应性。所有菌株之fHBP表达量均高于由Jiang等人(2010)所鉴定之阈值。如表15A及15B中所示，高剂量及低剂量之含有脂化之A05的疫苗引起针对全部遗传学上不同之亚家族A变体之广泛保护作用，而在两种剂量下对于含有非脂化之A05变体之疫苗观测到降低之反应。因此，此并行比较显示，虽然非脂化之A05变体针对全部亚家族A表达菌株具交叉保护作用，但其免疫原性不如脂化之变体，后者很可能形成天然构型(表15A及15B)。
对于后续研究，将剂量升高每种非脂化之亚家族A变体10mcg以评定其各自针对亚家族A菌株提供广泛覆盖的潜能。SBA分析显示，在此升高之剂量下，来自用非脂化之A05(SEQ ID NO:55)、A62(SEQ ID NO:71)、A12(SEQ ID NO:66)及A22(SEQ ID NO:68)fHBP变体进行免疫接种之兔的血清针对表达同源及异源亚家族A变体之野生型菌株均诱导效价，表面在此低剂量下于亚家族A内全部具交叉保护性。因此，我们观测到，N2C1疫苗(A05)可产生可杀死N1C2(A22)及N2C2(A12)变异菌株之抗体，同样，来自这些其它群之疫苗可杀死具有相对变体之菌株。在这些条件下，观测到A05及A62变体针对各菌株诱导最高之SBA应答者比率(表16)。因此，此展示针对这些变体具保护作用。
Figure BDA0001239455110000791
Figure BDA0001239455110000792
表15A及15B.在用含有脂化或非脂化之A05之30mcg或3mcg疫苗对兔(n＝3)进行免疫接种之前及之后(PD3＝第10周)获得之血清针对脑膜炎双球菌群B菌株之几何平均SBA效价。表15A及15B之上部表格(标记为“野生型菌株”)概述针对临床分离株之活性。表15A及15B之下部表格(标记为“同基因菌株”)概述针对一组同基因菌株之活性，这些同基因菌株系自亲本脑膜炎双球菌菌株(PMB3556)工程改造，以使得其内源性fHBP之整个ORF经A05(SEQ ID NO:13)、A22(SEQ ID NO:15)、A29(SEQ ID NO:74)或A12(SEQ ID NO:14)变体置换。
Figure BDA0001239455110000801
表16.获自用10mcg非脂化之A亚家族fHBP变体进行免疫接种之兔的第10周血清针对表达A05、A62、A12或A22fHBP变体之菌株的SBA GMT水平较背景升高至少4倍的应答者之百分比
使用上文所述之同基因菌株组在10mcg之增加之剂量下对于所有变体亦皆观测到交叉保护作用，其中用A62变体(SEQ ID NO:71)进行免疫接种之兔的血清展示出最大之交叉反应性，其次是A05抗血清(表17)。另外，用A62变体(SEQ ID NO:71)进行免疫接种之兔的血清对亲本PMB3556菌株及B09变换菌株展示出反应性(表18)，指示交叉反应性活性扩大至亚家族B蛋白质。A62看似由亚家族A(A22)结构域及亚家族B(B09)结构域构成(图9)。
Figure BDA0001239455110000802
Figure BDA0001239455110000803
Figure BDA0001239455110000811
表17.同基因“变换”菌株系自亲本脑膜炎双球菌菌株(PMB3556)工程改造，以使得其内源性fHBP(B24变体)之整个ORF经A05(SEQ ID NO:13)、A22(SEQ ID NO:15)、A29(SEQID NO:74)或A12(SEQ ID NO:14)变体置换。KA3011为阴性对照菌株(亦即fhbp基因经删除之亲本PMB3556)。血清(在用10mcg非脂化之A亚家族fHBP变体之三次给药对兔进行免疫接种之前或之后第10周获得)针对这些菌株之几何平均SBA效价(n＝5)展示于上部表格中。应答较背景升高至少4倍之应答者的百分比展示于下部表格中。
Figure BDA0001239455110000812
表18.血清(在用10mcg非脂化之亚家族A蛋白质(A62(SEQ ID NO:71)；A05(SEQ IDNO:55)；A12(SEQ ID NO:66)；A22(SEQ ID NO:68))对兔(n＝5)进行免疫接种之前或之后第10周获得)针对两种亚家族B同基因菌株之几何平均SBA效价。
实施例19：评估将针对非脂化之亚家族A蛋白质产生之血清组合对SBA之影响
评定血清之组合以评估对覆盖宽度的影响。测试配对之疫苗接种前血清与疫苗接种后血清以确定不存在因组合血清而诱导之非特异性杀伤作用。针对呈现亚家族A内之多样性的4种同基因菌株计算单独的血清及血清组合之GM升高之倍数。对于所测试之一些组合检测到升高之倍数增加，提供证据表明覆盖之宽度可能因纳入较多亚家族A变体而增加(表19)。最佳组合看似为A05(SEQ ID NO:55)与A62(SEQ ID NO:71)或A62(SEQ ID NO:71)与A12(SEQ ID NO:66)(表20)。
Figure BDA0001239455110000813
Figure BDA0001239455110000821
Figure BDA0001239455110000822
表19.针对如表17中所示之同基因菌株组再测试来自各疫苗组之最高应答者之血清的SBA效价。在1:1混合物中测试血清以确定协同活性之程度。
Figure BDA0001239455110000823
表20.以组合形式测试之血清的升高之倍数相较于单独测试之各者的增加(根据表19计算)。
在上述实施例18至19中所呈现之结果展示非脂化之亚家族A蛋白质具免疫原性且可针对带有同源或异源变体之脑膜炎双球菌菌株所致之感染提供保护作用。此处所呈现之资料说明所选之非脂化之亚家族A变体保留免疫原性且针对异源菌株提供交叉保护作用，但这些应答低于脂化之变体。我们亦证明与亚家族B具有序列相似性(参见例如图9)之A62(SEQ ID NO:71)rP2086抗原可针对各亚家族进行保护，这是因为A62(SEQ ID NO:71)疫苗可杀伤表达亚家族B变体B09或B24之菌株。
上文所呈现之数据展示非脂化之亚家族A变体不仅能够提供在脂化fHBP之组合中所观测到之类型的协同作用，其亦可提供针对B亚家族变体之覆盖。
实施例20：评估因子H结合蛋白与四价脑膜炎双球菌缀合物疫苗之组合在新西兰白兔中之免疫原性
在获自Charles River,Canada之2.5kg至3.5kg范围内之新西兰白兔中进行研究(表21)。在进入研究前，使用针对菌株A05及B02的全细胞ELISA针对存在抗体对55只兔进行预筛选。在筛选后，在第0周、第4周及第9周，在后腿处对抗体效价相对低之兔(特异性IgG效价<350)进行肌肉内疫苗接种(每个部位0.5mL)(每剂1.0mL，参见表22)。每组有三只兔。在第0周、第4周、第6周、第9周对兔进行取血且在第10周放血(exsanguinate)。制备血清样品，并藉由SBA分析第0周及第10周血清样品。根据表23-26制备脑膜炎双球菌缀合物疫苗(
Figure BDA0001239455110000832
脑膜炎双球菌(群A、C、Y及W-135)寡糖白喉CRM197缀合物疫苗，Novartis)、二价rLP2086及四价非脂化之变体以及其组合。
表21：此研究中使用之兔
Figure BDA0001239455110000831
Figure BDA0001239455110000841
a根据已制定之实验动物照护及使用委员会(Institutional Animal Care andUse Committee)准则饲养兔。
研究之设计展示于表22中。
Figure BDA0001239455110000842
Figure BDA0001239455110000851
配制品之概述
Figure BDA0001239455110000852
Figure BDA0001239455110000861
Figure BDA0001239455110000862
Figure BDA0001239455110000871
表25.数据分析
Figure BDA0001239455110000872
Figure BDA0001239455110000873
在与
Figure BDA0001239455110000874
组合后在2℃至8℃下监测非脂化之四价蛋白质(B22、B09、A05及B44)之稳定性6小时。
实施例21：血清杀细菌分析(SBA)
对个别血清样品进行针对多种血清群B、C及Y脑膜炎双球菌菌株(表27)之基于微群落之血清杀细菌分析(SBA)。来自捐献者之人类血清经验证后作为用于分析中所测试之菌株的补体来源。对补体介导之抗体依赖性杀细菌效价进行内插，并将其表示为在分析中杀死50％之脑膜炎双球菌细胞之测试血清之稀释度的倒数。分析之检测极限为4之SBA效价。SBA效价<4系指定为2之数值。计算并比较第10周血清相较于免疫接种前取血样品之效价有≥4倍的升高之SBA效价。
表27 SBA菌株
血清群 fHBP变体 菌株名称
B A05 PMB1745
B B02 PMB17
B B09 PMB1489
B B16 PMB2882
B B44 PMB147
C A68 PMB2432
C B24 PMB2240
Y A121 PMB3386
Y B09 PMB3210
实施例22：脂化或非脂化之因子H结合蛋白与结合之疫苗的组合在新西兰白兔中之免疫原性
血清杀细菌性抗体为针对脑膜炎双球菌疾病之保护作用的免疫替代物。藉由SBA测定用脂化、非脂化之rfHBP、四价结合之疫苗单独或以组合形式进行免疫接种是否会激发兔之杀细菌性抗体。SBA藉由模拟天然存在之补体介导之细菌溶解来测量血清样品中抗体之含量。在人类中，免疫接种前之SBA效价:免疫接种后之SBA效价为1:4则视作具保护性；效价升高四倍亦视为免疫学相关免疫应答。藉由针对多种脑膜炎双球菌血清群之菌株的SBA分析自第0周及第10周收集之兔血清样品。如表28(较高剂量)及29(较低剂量)中所示，在第三次免疫接种后一周(第10周)，四价缀合物疫苗仅引起针对所测试之MnC及MnY菌株的SBA反应。所有其它血清样品均显示出针对同源菌株以及来自与疫苗配制品相同之fHBP亚家族的其它测试菌株的杀细菌性活性。应注意，单独用各自30mcg剂量之脂化之A05/B01(分别为SEQ ID NO:13及58)进行免疫接种针对同源菌株以及针对来自两个fHBP亚家族之其它测试菌株激发最高杀细菌性抗体(表28)。同样，单独用非脂化之A05/B09/B22/B44(分别为SEQID NO:55、49、75及44)进行免疫接种亦针对多种脑膜炎双球菌血清群之菌株引起杀细菌性抗体，虽然SBA效价为脂化之二价疫苗的1/3至1/15(表30)。脂化之fHBP、高剂量之非脂化之fHBP及所有组合针对各种血清群之所有菌株皆达成100％应答者比率(SBA效价升高≥4倍)。
表28：使用来自以较高剂量之fHBP与缀合物疫苗之组合进行免疫接种之兔的血清针对脑膜炎双球菌血清群B、C及Y菌株之SBA效价升高之倍数的增加
Figure BDA0001239455110000891
兔免疫接种前取血样品血清未展示先前存在针对测试菌株之杀细菌性活性。在第0周、第4周及第8周用0.5mL疫苗对NZW兔(n＝3)进行肌肉内疫苗接种；数据第10周
表29：使用来自以较低剂量之fHBP与缀合物疫苗之组合进行免疫接种之兔的血清针对脑膜炎双球菌血清群B、C及Y菌株之SBA效价升高之倍数的增加
Figure BDA0001239455110000892
Figure BDA0001239455110000901
兔免疫接种前取血样品血清未展示先前存在针对测试菌株之杀细菌性活性。在第0周、第4周及第8周用0.5mL疫苗对NZW兔(n＝3)进行肌肉内疫苗接种；数据第10周
表30：使用来自以fHBP与缀合物疫苗之组合进行免疫接种之兔的血清针对脑膜炎双球菌血清群B、C及Y菌株之SBA应答者比率
Figure BDA0001239455110000902
在第0周、第4周及第8周用0.5mL疫苗对NZQ兔(n＝3)进行肌肉内疫苗接种；数据第10周脂化之fHBP所引起之SBA效价高于非脂化之fHBP。
每剂各30mcg之脂化之fHBP引起升高3至15倍的针对所测试之所有脑膜炎双球菌B、C及Y菌株之SBA效价。每剂各30mcg之非脂化之fHBP引起升高4至23倍的针对所测试之所有脑膜炎双球菌B、C及Y菌株之SBA效价(表28至29)。
用fHBP、缀合物疫苗或组合达成剂量滴定
相较于较低剂量，较高剂量之缀合物疫苗、fHBP或其组合使得SBA反应增加(表28至30)。1倍人类剂量之缀合物疫苗针对脑膜炎双球菌C及Y菌株引起之SBA效价为十分之一剂量之缀合物疫苗的2至8倍。每剂各30mcg之脂化之fHBP针对所测试之所有菌株引起之SBA效价为每剂各3mcg之脂化之fHBP的2至4倍。每剂各30mcg之非脂化之fHBP针对所有脑膜炎双球菌血清群B、C及Y菌株引起之SBA效价为每剂各3mcg非脂化之fHBP的4至15倍。
藉由fHBP与缀合物疫苗之组合所产生的协同SBA反应
存在以下趋势：相较于单独使用任一组分，当使用缀合物疫苗与fHBP之组合时，针对脑膜炎双球菌血清群C及Y菌株之SBA应答较高，尤其在添加较低剂量之脂化或非脂化之fHBP的情况下(表29)。在本研究中，使用来自用呈含AlPO4之配制品形式的重组脂化或非脂化之fHBP及缀合物疫苗单独或以组合形式进行免疫接种之新西兰白兔的血清针对多种脑膜炎双球菌血清群之菌株评估功能性活性。接受缀合物疫苗之兔仅引起针对脑膜炎双球菌血清群C及Y菌株的SBA应答，但不引起针对血清群B菌株SBA反应。呈含AlPO4之配制品形式的脂化或非脂化之fHBP激发针对所测试之所有脑膜炎双球菌血清群之菌株具杀细菌性的血清抗体。
接受三种剂量之呈含AlPO4之配制品形式的脂化或非脂化之fHBP的新西兰白兔激发针对所测试之脑膜炎双球菌血清群B、C及Y菌株具杀细菌性的血清抗体。除较低剂量之非脂化疫苗组之外，针对所测试之所有菌株皆达到100％之应答者比率(SBA效价升高≥4倍)。
脂化之fHBP激发之杀细菌性抗体效价大于非脂化之形式。在单独或呈组合形式之脂化或非脂化之fHBP及缀合物疫苗下观测到明显之剂量应答。
存在以下趋势：缀合物疫苗与fHBP之间尤其在添加较低剂量之蛋白质时针对脑膜炎双球菌血清群C及Y菌株有协同性SBA反应。
实施例23：评估非脂化之因子H结合蛋白之组合在新西兰白兔中之免疫原性
在获自Charles River,Canada之2.5kg至3.5kg范围内之新西兰白兔中进行研究(表31)。在第0周、第4周及第9周在后腿处以每个部位0.5mL对兔进行肌肉内疫苗接种(每剂1.0mL，参见表32)。所测试之各抗原的序列号(Sequence ID Number)列于表33中。每组有10只兔。在第0周、第6周对兔进行取血且在第10周放血。制备血清样品，并在针对一组脑膜炎双球菌分离株的SBA中分析第0周及第10周血清样品。
表31：这些研究中使用之兔a
物种 兔
品系 新西兰白兔
来源 Charles River Laboratory
每组动物数 10
性别 雌性
体重 2.5-3.5kg
a根据确立之实验动物照护及使用委员会准则饲养兔
表32：研究设计a
Figure BDA0001239455110000921
a对兔进行肌肉内疫苗接种(第0周、第4周及第9周)并取血(第0周、第6周及第10周)以制备用于SBA分析之血清样品。
表33：所用之脑膜炎双球菌血清群B fHBP蛋白质变体
Figure BDA0001239455110000931
表34概述相较于对脂化抗原之rLP2086-A05与rLP2086-B01对的免疫应答兔对非脂化之fHBP蛋白质之混合物的免疫应答。兔免疫接种前取血样品血清一般未展示先前存在针对所测试菌株之杀细菌性活性。免疫应答呈现为各处理组中在第三次免疫接种后对各自fHBP抗原组合有应答且SBA效价增加≥4倍的动物之百分比。使用表达与疫苗免疫原相同之fHBP变体(A05、A12)的目标脑膜炎双球菌菌株或表达异源fHBP变体(A22、B16、B24)的菌株进行SBA分析。在所测试之亚家族A变体中A22fHBP变体之比较氨基酸序列相同性偏差至多15％。相似地，在包括作为抗原之亚家族B变体中B16及B24fHBP变体之比较氨基酸序列相同性偏差至多12％。
表34：用重组非脂化之fHBP进行疫苗接种，在第三次给药后产生SBA效价升高≥4倍的应答的新西兰白兔之百分比
Figure BDA0001239455110000932
Figure BDA0001239455110000941
a每个处理组10只动物；所有处理剂皆用AlPO4佐剂(250mcg/剂)调配
在彼等用10mcg之各测试rP2086变体进行免疫接种之兔组中，来自用组合A05+A62+B09+B44处理之动物的血清样品具有最高之杀细菌性应答率。仅用各自5mcg之四种非脂化之fHBP变体之相同混合物处理之动物的SBA应答略微降低。以5mcg进行给药之其它4价fHBP抗原组与非脂化之A05+A62+B09+B44之组合的表现一样好。在所测试之4价组合中，来自包括各自5mcg非脂化之fHBP变体A12+A62+B09+B44的处理组之血清样品针对所选分析菌株的SBA应答率最佳。对五价非脂化组合A05+A12+A62+B09+B44之应答率略优于对所测试之任何4价组合的反应。
序列表
<110> 辉瑞公司
A·S·安德森
S·K·霍伊塞思
K·U·扬森
M·E·鲁彭
J·K·莫兰
<120> 脑膜炎双球菌组合物及其方法
<130> PC071917
<160> 81
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 780
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 1
tgcagcagcg gaggcggagg cggcggtgtc gccgccgaca tcggcacggg gcttgccgat 60
gcactaactg cgccgctcga ccataaagac aaaggtttga aatccctgac attggaagac 120
tccattcccc aaaacggaac actgaccctg tcggcacaag gtgcggaaaa aactttcaaa 180
gccggcgaca aagacaacag cctcaacacg ggcaaactga agaacgacaa aatcagccgc 240
ttcgacttcg tgcaaaaaat cgaagtggac ggacaaacca tcacactggc aagcggcgaa 300
tttcaaatat acaaacagga ccactccgcc gtcgttgccc tacagattga aaaaatcaac 360
aaccccgaca aaatcgacag cctgataaac caacgctcct tccttgtcag cggtttgggc 420
ggagaacata ccgccttcaa ccaactgccc ggcgacaaag ccgagtatca cggcaaagca 480
ttcagctccg acgatgccgg cggaaaactg acctatacca tagattttgc cgccaaacag 540
ggacacggca aaatcgaaca cctgaaaaca cccgagcaaa atgtcgagct tgccgccgcc 600
gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgcc gtcattttgg gcgacacgcg ctacggcagc 660
gaagaaaaag gcacttacca cctcgccctt ttcggcgacc gcgcccaaga aatcgccggc 720
tcggcaaccg tgaagatagg ggaaaaggtt cacgaaatcg gcatcgccgg caaacagtag 780
<210> 2
<211> 786
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 2
tgcagcagcg gaagcggaag cggaggcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacagggctt 60
gccgatgcac taactgcgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc cctgacattg 120
gaagactcca tttcccaaaa cggaacactg accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact 180
ttcaaagtcg gcgacaaaga caacagtctc aatacaggca aattgaagaa cgacaaaatc 240
agccgcttcg actttgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc 300
ggcgaatttc aaatatacaa acaggaccac tccgccgtcg ttgccctaca gattgaaaaa 360
atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt 420
ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccagcg gcaaagccga gtatcacggc 480
aaagcattca gctccgacga tgccggcgga aaactgacct ataccataga ttttgccgcc 540
aaacagggac acggcaaaat cgaacacctg aaaacacccg agcagaatgt cgagcttgcc 600
tccgccgaac tcaaagcaga tgaaaaatca cacgccgtca ttttgggcga cacgcgctac 660
ggcagcgaag aaaaaggcac ttaccacctc gctcttttcg gcgaccgagc ccaagaaatc 720
gccggctcgg caaccgtgaa gataagggaa aaggttcacg aaatcggcat cgccggcaaa 780
cagtag 786
<210> 3
<211> 765
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 3
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacggaca aaccatcacg ctggcaagcg gcgaatttca aatatacaaa 300
cagaaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc 420
ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgac 480
ccgaacggca ggctgcacta ctccattgat tttaccaaaa aacagggtta cggcagaatc 540
gaacacctga aaacgcccga gcagaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765
<210> 4
<211> 765
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 4
tgcagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacattggtg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacggaca aaccatcacg ctggcaagcg gcgaatttca aatatacaaa 300
cagaaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc 420
ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgac 480
ccgaacggca ggctgcacta ctccattgat tttaccaaaa aacagggtta cggcagaatc 540
gaacacctga aaacgcccga gcagaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765
<210> 5
<211> 765
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 5
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa 300
caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggtggaga acataccgcc 420
ttcaaccaac tgcccagcgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat 480
gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc 540
gaacacttga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765
<210> 6
<211> 792
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 6
tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg 60
cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120
ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga 180
actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa 240
atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag 300
agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag 360
caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc 420
gacatagtgg gcgaacatac atcttttgac aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat 480
cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc 540
gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgcctgaact caatgttgac 600
ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc 660
ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag 720
gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc 780
gccaagcaat aa 792
<210> 7
<211> 768
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 7
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag aacaagatcc agagcattcc 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccggttcaaa atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccaaaga cgtcatggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480
gatgccggcg gaaaactgac ctatactata gattttgctg ccaaacaggg acacggcaaa 540
atcgaacatt tgaaatcgcc cgaactcaat gtcgagcttg ccaccgccta tatcaagccg 600
gatgaaaaac accatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaatcaaga cgagaaaggc 660
agttactccc tcggtatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720
gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcaataa 768
<210> 8
<211> 768
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 8
tgcagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt taacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggaa gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagactc ggaggattcc 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccaaagg cggcagtgcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480
gatgctggcg gaaaactgac ctatactata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540
atcgaacatt tgaaatcgcc cgaactcaat gtcgagcttg ccaccgccta tatcaagccg 600
gatgaaaaac gccatgccgt tatcagcggt tccgtccttt acaaccaaga cgagaaaggc 660
agttactccc tcggtatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720
gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768
<210> 9
<211> 768
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 9
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtgcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagattc ggagcattca 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgata tagcgggtga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcatt cggttcagac 480
gatgccagtg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540
atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gttgacctgg ccgcctccga tatcaagccg 600
gataaaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660
agttactctc taggcatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcagaagtg 720
gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768
<210> 10
<211> 768
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 10
tgcagcagcg gagggggtgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggt 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgc 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagtg gagagttcca agtatacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcctttcag accgagcaaa tacaagattc ggagcattcc 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480
gatgccggcg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg aaacggcaaa 540
atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gtcgacctgg ccgccgccga tatcaagccg 600
gatggaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660
agttactccc tcggtatctt tggcggaaaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720
aaaaccgtaa acggcatacg ccatatcggc cttgccgcca agcaataa 768
<210> 11
<211> 792
<212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 11
tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg 60
cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120
ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga 180
actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa 240
atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag 300
agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag 360
caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc 420
gacatagtgg gcgaacatac atcttttggc aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat 480
cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc 540
gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgccagaact caatgttgac 600
ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc 660
ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag 720
gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc 780
gccaagcaat aa 792
<210> 12
<211> 259
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 12
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr
1 5 10 15
Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly
20 25 30
Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu
35 40 45
Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys
50 55 60
Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg
65 70 75 80
Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu
85 90 95
Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val
100 105 110
Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu
115 120 125
Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr
130 135 140
Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala
145 150 155 160
Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
165 170 175
Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu
180 185 190
Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser
195 200 205
His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly
210 215 220
Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly
225 230 235 240
Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala
245 250 255
Gly Lys Gln
<210> 13
<211> 261
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 13
Cys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15
Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20 25 30
Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly
35 40 45
Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly
50 55 60
Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile
85 90 95
Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala
100 105 110
Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp
115 120 125
Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu
130 135 140
His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly
145 150 155 160
Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile
165 170 175
Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr
180 185 190
Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu
195 200 205
Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu
210 215 220
Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile
225 230 235 240
Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly
245 250 255
Ile Ala Gly Lys Gln
260
<210> 14
<211> 254
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 14
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100 105 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125
Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140
Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160
Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly
165 170 175
Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250
<210> 15
<211> 254
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 15
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100 105 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125
Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140
Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250
<210> 16
<211> 263
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 16
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1 5 10 15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn
35 40 45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala
50 55 60
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu
85 90 95
Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser
100 105 110
Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser
115 120 125
Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly
130 135 140
Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
165 170 175
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
180 185 190
Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro
195 200 205
Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln
210 215 220
Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln
225 230 235 240
Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His
245 250 255
Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
260
<210> 17
<211> 255
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 17
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110
Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Arg
115 120 125
Phe Lys Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu
180 185 190
Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile
195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255
<210> 18
<211> 255
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 18
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu
180 185 190
Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile
195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255
<210> 19
<211> 255
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 19
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180 185 190
Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile
195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255
<210> 20
<211> 255
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 20
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu
100 105 110
Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180 185 190
Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile
195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240
Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255
<210> 21
<211> 263
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 21
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1 5 10 15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn
35 40 45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala
50 55 60
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu
85 90 95
Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser
100 105 110
Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser
115 120 125
Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly
130 135 140
Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
165 170 175
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
180 185 190
Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro
195 200 205
Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln
210 215 220
Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln
225 230 235 240
Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His
245 250 255
Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
260
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence: Forward primer
<400> 22
tgccatatga gcagcggaag cggaag 26
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence: Reverse primer
<400> 23
cggatcccta ctgtttgccg gcgatgc 27
<210> 24
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence: Forward primer
<400> 24
tttcttcccg ggaaggagat atacatatgt gcagcagcgg aggcggcgg 49
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence: Reverse primer
<400> 25
tttcttgctc agcattattg cttggcggca agaccgat 38
<210> 26
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence: Forward primer
<400> 26
tttcttcccg ggaaggagat atacatatga gcagcggagg cggcgg 46
<210> 27
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence: Reverse primer
<400> 27
tttcttgctc agcattattg cttggcggca agaccgat 38
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 28
atgagctctg gaggtggagg aagcgggggc ggtgga 36
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 29
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 30
atgagctctg gaagcggaag cgggggcggt gga 33
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 31
Met Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 32
atgagctctg gaggtggagg a 21
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 33
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 34
atgagcagcg ggggcggtgg a 21
<210> 35
<211> 28
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 35
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp
1 5 10 15
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20 25
<210> 36
<211> 28
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 36
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1 5 10 15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20 25
<210> 37
<211> 27
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 37
Cys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15
Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20 25
<210> 38
<211> 23
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 38
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20
<210> 39
<211> 23
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 39
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20
<210> 40
<211> 23
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 40
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X is G or V
<400> 41
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Xaa
1 5 10 15
<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 42
atgagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cgggg 45
<210> 43
<211> 789
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 43
agctctggag gtggaggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg agcaggatta 60
gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgaaatc gcttacctta 120
gaagattcta tttcacaaaa tggcaccctt accttgtccg cgcaaggcgc tgaacgtact 180
tttaaagccg gtgacaaaga taatagctta aatacaggta aactcaaaaa tgataaaatc 240
tcgcgttttg atttcattcg tcaaatcgaa gtagatggcc aacttattac attagaaagc 300
ggtgaattcc aagtatataa acaatcccat tcagcactta cagcattgca aaccgaacag 360
gtccaagact cagaacattc cggcaaaatg gtagctaaac gtcaattccg catcggtgac 420
attgtcggtg aacatacaag cttcggaaaa ttaccaaaag atgtgatggc gacctatcgc 480
ggtacggcat ttggatcaga tgatgcaggc ggtaaattaa cttatacaat tgactttgca 540
gcaaaacaag gacatggcaa aattgaacat ttaaaatctc ccgaacttaa cgtagatctc 600
gcagcagcag atattaaacc agatgaaaaa caccacgcag tcatttcagg ttcagtttta 660
tacaatcagg cagaaaaagg ttcgtactct ttaggtattt ttggcgggca agctcaagaa 720
gttgcaggta gcgcagaagt agaaacggca aatggcattc gtcacattgg gttagcggcg 780
aaacaataa 789
<210> 44
<211> 262
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 44
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20 25 30
Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly
35 40 45
Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala Gly
50 55 60
Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile
85 90 95
Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala
100 105 110
Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly
115 120 125
Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly Glu
130 135 140
His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg
145 150 155 160
Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr
165 170 175
Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys
180 185 190
Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp
195 200 205
Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala
210 215 220
Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu
225 230 235 240
Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile
245 250 255
Gly Leu Ala Ala Lys Gln
260
<210> 45
<211> 780
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 45
agctctggag gtggaggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg agcaggatta 60
gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgcagtc gcttacctta 120
gatcagtctg tcaggaaaaa tgagaaactt aagttggcgg cgcaaggcgc tgaaaaaact 180
tatggaaacg gtgacagctt aaatacaggt aaactcaaaa atgataaagt ctcgcgtttt 240
gatttcattc gtcaaatcga agtagatggc aagcttatta cattagaaag cggtgaattc 300
caagtatata aacaatccca ttcagcactt acagcattgc aaaccgaaca ggtccaagac 360
tcagaagatt ccggcaaaat ggtagctaaa cgtcaattcc gcatcggtga cattgcgggt 420
gaacatacaa gcttcgacaa attaccaaaa ggcggcagtg cgacctatcg cggtacggca 480
tttggatcag atgatgcagg cggtaaatta acttatacaa ttgactttgc agcaaaacaa 540
ggacatggca aaattgaaca tttaaaatct cccgaactta acgtagagct cgcaaccgca 600
tatattaaac cagatgaaaa acgccacgca gtcatttcag gttcagtttt atacaatcag 660
gacgaaaaag gttcgtactc tttaggtatt tttggcgggc aagctcaaga agttgcaggt 720
agcgcagaag tagaaacggc aaatggcatt caccacattg ggttagcggc gaaacaataa 780
<210> 46
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 46
agctctggag gtggaggagt tgcagcagac attggagcag gattagcaga tgcactgacg 60
gcaccgttgg atcataaaga caaaggcttg cagtcgctta ccttagatca gtctgtcagg 120
aaaaatgaga aacttaagtt ggcggcgcaa ggcgctgaaa aaacttatgg aaacggtgac 180
agcttaaata caggtaaact caaaaatgat aaagtctcgc gttttgattt cattcgtcaa 240
atcgaagtag atggcaagct tattacatta gaaagcggtg aattccaagt atataaacaa 300
tcccattcag cacttacagc attgcaaacc gaacaggtcc aagactcaga agattccggc 360
aaaatggtag ctaaacgtca attccgcatc ggtgacattg cgggtgaaca tacaagcttc 420
gacaaattac caaaaggcgg cagtgcgacc tatcgcggta cggcatttgg atcagatgat 480
gcaggcggta aattaactta tacaattgac tttgcagcaa aacaaggaca tggcaaaatt 540
gaacatttaa aatctcccga acttaacgta gagctcgcaa ccgcatatat taaaccagat 600
gaaaaacgcc acgcagtcat ttcaggttca gttttataca atcaggacga aaaaggttcg 660
tactctttag gtatttttgg cgggcaagct caagaagttg caggtagcgc agaagtagaa 720
acggcaaatg gcattcacca cattgggtta gcggcgaaac aataa 765
<210> 47
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 47
agcagcgggg gcggtggagt tgcagcagac attggagcag gattagcaga tgcactgacg 60
gcaccgttgg atcataaaga caaaggcttg cagtcgctta ccttagatca gtctgtcagg 120
aaaaatgaga aacttaagtt ggcggcgcaa ggcgctgaaa aaacttatgg aaacggtgac 180
agcttaaata caggtaaact caaaaatgat aaagtctcgc gttttgattt cattcgtcaa 240
atcgaagtag atggcaagct tattacatta gaaagcggtg aattccaagt atataaacaa 300
tcccattcag cacttacagc attgcaaacc gaacaggtcc aagactcaga agattccggc 360
aaaatggtag ctaaacgtca attccgcatc ggtgacattg cgggtgaaca tacaagcttc 420
gacaaattac caaaaggcgg cagtgcgacc tatcgcggta cggcatttgg atcagatgat 480
gcaggcggta aattaactta tacaattgac tttgcagcaa aacaaggaca tggcaaaatt 540
gaacatttaa aatctcccga acttaacgta gagctcgcaa ccgcatatat taaaccagat 600
gaaaaacgcc acgcagtcat ttcaggttca gttttataca atcaggacga aaaaggttcg 660
tactctttag gtatttttgg cgggcaagct caagaagttg caggtagcgc agaagtagaa 720
acggcaaatg gcattcacca cattgggtta gcggcgaaac aataa 765
<210> 48
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 48
agcagcggag ggggcggtgt cgccgccgac atcggtgcgg ggcttgccga tgcactaacc 60
gcaccgctcg accataaaga caaaggtttg cagtctttaa cactggatca gtccgtcagg 120
aaaaacgaga aactgaagct ggcggcacaa ggtgcggaaa aaacttatgg aaacggcgac 180
agccttaata cgggcaaatt gaagaacgac aaggtcagcc gcttcgactt tatccgtcaa 240
atcgaagtgg acgggaagct cattaccttg gagagcggag agttccaagt gtacaaacaa 300
agccattccg ccttaaccgc ccttcagacc gagcaagtac aagactcgga ggattccggg 360
aagatggttg cgaaacgcca gttcagaatc ggcgacatag cgggcgaaca tacatctttt 420
gacaagcttc ccaaaggcgg cagtgcgaca tatcgcggga cggcgttcgg ttcagacgat 480
gctggcggaa aactgaccta tactatagat ttcgccgcca agcagggaca cggcaaaatc 540
gaacatttga aatcgcccga actcaatgtc gagcttgcca ccgcctatat caagccggat 600
gaaaaacgcc atgccgttat cagcggttcc gtcctttaca accaagacga gaaaggcagt 660
tactccctcg gtatctttgg cgggcaagcc caggaagttg ccggcagcgc ggaagtggaa 720
accgcaaacg gcatacacca tatcggtctt gccgccaagc agtaa 765
<210> 49
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 49
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100 105 110
Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115 120 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130 135 140
Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Leu
180 185 190
Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile Ser
195 200 205
Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly
210 215 220
Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu
225 230 235 240
Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250
<210> 50
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 50
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20 25 30
Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu
35 40 45
Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly
50 55 60
Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe
65 70 75 80
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu
85 90 95
Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala
100 105 110
Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val
115 120 125
Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser
130 135 140
Phe Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala
145 150 155 160
Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
165 170 175
Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu
180 185 190
Leu Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg
195 200 205
His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly
210 215 220
Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly
225 230 235 240
Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala
245 250 255
Ala Lys Gln
<210> 51
<211> 789
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 51
agcagcggag gcggcggaag cggaggcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cgcggggctt 60
gccgatgcac taaccgcacc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc cctgacattg 120
gaagactcca tttcccaaaa cggaacactg accctgtcgg cacaaggtgc ggaaagaact 180
ttcaaagccg gcgacaaaga caacagtctc aacacaggca aactgaagaa cgacaaaatc 240
agccgcttcg actttatccg tcaaatcgaa gtggacgggc agctcattac cttggagagc 300
ggagagttcc aagtgtacaa acaaagccat tccgccttaa ccgcccttca gaccgagcaa 360
gtacaagact cggagcattc cgggaagatg gttgcgaaac gccagttcag aatcggcgac 420
atagtgggcg aacatacatc ttttggcaag cttcccaaag acgtcatggc gacatatcgc 480
gggacggcgt tcggttcaga cgatgccggc ggaaaactga cctacaccat agatttcgcc 540
gccaagcagg gacacggcaa aatcgaacat ttgaaatcgc cagaactcaa tgttgacctg 600
gccgccgccg atatcaagcc ggatgaaaaa caccatgccg tcatcagcgg ttccgtcctt 660
tacaaccaag ccgagaaagg cagttactct ctaggcatct ttggcgggca agcccaggaa 720
gttgccggca gcgcggaagt ggaaaccgca aacggcatac gccatatcgg tcttgccgcc 780
aagcaataa 789
<210> 52
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 52
atgagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtg 45
<210> 53
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 53
atgagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cgggg 45
<210> 54
<211> 783
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 54
agcagcggaa gcggaagcgg aggcggcggt gtcgccgccg acatcggcac agggcttgcc 60
gatgcactaa ctgcgccgct cgaccataaa gacaaaggtt tgaaatccct gacattggaa 120
gactccattt cccaaaacgg aacactgacc ctgtcggcac aaggtgcgga aaaaactttc 180
aaagtcggcg acaaagacaa cagtctcaat acaggcaaat tgaagaacga caaaatcagc 240
cgcttcgact ttgtgcaaaa aatcgaagtg gacggacaaa ccatcacgct ggcaagcggc 300
gaatttcaaa tatacaaaca ggaccactcc gccgtcgttg ccctacagat tgaaaaaatc 360
aacaaccccg acaaaatcga cagcctgata aaccaacgct ccttccttgt cagcggtttg 420
ggcggagaac ataccgcctt caaccaactg cccagcggca aagccgagta tcacggcaaa 480
gcattcagct ccgacgatgc cggcggaaaa ctgacctata ccatagattt tgccgccaaa 540
cagggacacg gcaaaatcga acacctgaaa acacccgagc agaatgtcga gcttgcctcc 600
gccgaactca aagcagatga aaaatcacac gccgtcattt tgggcgacac gcgctacggc 660
agcgaagaaa aaggcactta ccacctcgct cttttcggcg accgagccca agaaatcgcc 720
ggctcggcaa ccgtgaagat aagggaaaag gttcacgaaa tcggcatcgc cggcaaacag 780
tag 783
<210> 55
<211> 260
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 55
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
1 5 10 15
Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
20 25 30
Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp
50 55 60
Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr
85 90 95
Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val
100 105 110
Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser
115 120 125
Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His
130 135 140
Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys
145 150 155 160
Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp
165 170 175
Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro
180 185 190
Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys
195 200 205
Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys
210 215 220
Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala
225 230 235 240
Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile
245 250 255
Ala Gly Lys Gln
260
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 56
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 57
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 57
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp Ile
1 5 10 15
Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20 25 30
Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly
35 40 45
Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly
50 55 60
Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe
65 70 75 80
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu
85 90 95
Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala
100 105 110
Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met Val
115 120 125
Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser
130 135 140
Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala
145 150 155 160
Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
165 170 175
Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu
180 185 190
Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His
195 200 205
His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly
210 215 220
Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly
225 230 235 240
Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala
245 250 255
Ala Lys Gln
<210> 58
<211> 260
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 58
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp
1 5 10 15
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn
35 40 45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn
50 55 60
Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg
65 70 75 80
Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu
85 90 95
Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr
100 105 110
Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met
115 120 125
Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr
130 135 140
Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr
145 150 155 160
Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp
165 170 175
Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro
180 185 190
Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys
195 200 205
His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys
210 215 220
Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala
225 230 235 240
Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu
245 250 255
Ala Ala Lys Gln
260
<210> 59
<211> 255
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 59
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Ile Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Ile Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180 185 190
Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile
195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240
Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255
<210> 60
<211> 255
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 60
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180 185 190
Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile
195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255
<210> 61
<211> 768
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 61
ggcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtgcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagattc ggagcattca 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgata tagcgggtga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcatt cggttcagac 480
gatgccagtg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540
atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gttgacctgg ccgcctccga tatcaagccg 600
gataaaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660
agttactctc taggcatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcagaagtg 720
gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768
<210> 62
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 62
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180 185 190
Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile
195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255
<210> 63
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 63
ggcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa 300
caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggtggaga acataccgcc 420
ttcaaccaac tgcccagcgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat 480
gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc 540
gaacacttga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtaa 765
<210> 64
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 64
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100 105 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125
Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140
Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250
<210> 65
<211> 786
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 65
atgagctctg gaagcggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg aacaggatta 60
gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgaaatc gcttacctta 120
gaagattcta tttcacaaaa tggcaccctt accttgtccg cgcaaggcgc tgaaaaaact 180
tttaaagtcg gtgacaaaga taatagctta aatacaggta aactcaaaaa tgataaaatc 240
tcgcgttttg atttcgtgca aaaaatcgaa gtagatggcc aaaccattac attagcaagc 300
ggtgaattcc aaatatataa acaagaccat tcagcagtcg ttgcattgca aattgaaaaa 360
atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gttccttcct tgtcagcggt 420
ttgggcggtg aacatacagc cttcaaccaa ttaccaagcg gcaaagcgga gtatcacggt 480
aaagcattta gctcagatga tgcaggcggt aaattaactt atacaattga ctttgcagca 540
aaacaaggac atggcaaaat tgaacattta aaaacacccg aacagaacgt agagctcgca 600
tccgcagaac tcaaagcaga tgaaaaatca cacgcagtca ttttgggtga cacgcgctac 660
ggcagcgaag aaaaaggtac ttaccactta gctctttttg gcgaccgagc tcaagaaatc 720
gcaggtagcg caaccgtaaa gataagggaa aaggttcacg aaattgggat cgcgggcaaa 780
caataa 786
<210> 66
<211> 258
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 66
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20 25 30
Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu
35 40 45
Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly
50 55 60
Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe
65 70 75 80
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala
85 90 95
Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala
100 105 110
Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile
115 120 125
Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala
130 135 140
Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe
145 150 155 160
Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr
165 170 175
Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln
180 185 190
Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His
195 200 205
Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr
210 215 220
Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser
225 230 235 240
Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly
245 250 255
Lys Gln
<210> 67
<211> 780
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 67
atgagctctg gaggtggagg aagcgggggc ggtggagttg cagcagacat tggagcagga 60
ttagcagatg cactgacggc accgttggat cataaagaca aaagtttgca gtcgcttacc 120
ttagatcagt ctgtcaggaa aaatgagaaa cttaagttgg cggcgcaagg cgctgaaaaa 180
acttatggaa acggtgacag cttaaataca ggtaaactca aaaatgataa agtctcgcgt 240
tttgatttca ttcgtcaaat cgaagtagat ggccaaacca ttacattagc aagcggtgaa 300
ttccaaatat ataaacaaaa ccattcagca gtcgttgcat tgcaaattga aaaaatcaac 360
aaccccgaca aaatcgacag cctgataaac caacgttcct tccttgtcag cggtttgggc 420
ggtgaacata cagccttcaa ccaattacca gacggcaaag cggagtatca cggtaaagca 480
tttagctcag atgatccgaa cggtaggtta cactattcca ttgactttac caaaaaacaa 540
ggatacggca gaattgaaca tttaaaaacg cccgaacaga acgtagagct cgcatccgca 600
gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgca gtcattttgg gtgacacgcg ctacggcggc 660
gaagaaaaag gtacttacca cttagccctt tttggcgacc gcgctcaaga aatcgcaggt 720
agcgcaaccg taaagataag ggaaaaggtt cacgaaattg ggatcgcggg caaacaataa 780
<210> 68
<211> 253
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 68
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser
20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95
Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys
100 105 110
Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe
115 120 125
Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro
130 135 140
Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala
145 150 155 160
Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His
165 170 175
Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala
180 185 190
Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly
195 200 205
Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu
210 215 220
Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile
225 230 235 240
Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250
<210> 69
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 69
atgagctctg gaggtggagg agttgcagca gacattggag caggattagc agatgcactg 60
acggcaccgt tggatcataa agacaaaagt ttgcagtcgc ttaccttaga tcagtctgtc 120
aggaaaaatg agaaacttaa gttggcggcg caaggcgctg aaaaaactta tggaaacggt 180
gacagcttaa atacaggtaa actcaaaaat gataaagtct cgcgttttga tttcattcgt 240
caaatcgaag tagatggcca acttattaca ttagaaagcg gtgaattcca aatatataaa 300
caagaccatt cagcagtcgt tgcattgcaa attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360
gacagcctga taaaccaacg ttccttcctt gtcagcggtt tgggcggtga acatacagcc 420
ttcaaccaat taccaagcgg caaagcggag tatcacggta aagcatttag ctcagatgat 480
gcaggcggta aattaactta tacaattgac tttgcagcaa aacaaggaca tggcaaaatt 540
gaacatttaa aaacacccga acagaacgta gagctcgcat ccgcagaact caaagcagat 600
gaaaaatcac acgcagtcat tttgggtgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggtact 660
taccacttag ctctttttgg cgaccgagct caagaaatcg caggtagcgc aaccgtaaag 720
ataagggaaa aggttcacga aattgggatc gcgggcaaac aataa 765
<210> 70
<211> 255
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 70
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu
180 185 190
Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile
195 200 205
Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu
210 215 220
Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val
225 230 235 240
Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250 255
<210> 71
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 71
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100 105 110
Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115 120 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130 135 140
Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250
<210> 72
<211> 768
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 72
atgagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt taacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggaa gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagactc ggaggattcc 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccaaagg cggcagtgcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480
gatgctggcg gaaaactgac ctatactata gatttcgccg ccaaacaggg acacggcaaa 540
atcgaacact tgaaaacacc cgagcaaaat gtcgagcttg cctccgccga actcaaagca 600
gatgaaaaat cacacgccgt cattttgggc gacacgcgct acggcggcga agaaaaaggc 660
acttaccacc tcgccctttt cggcgaccgc gcccaagaaa tcgccggctc ggcaaccgtg 720
aagataaggg aaaaggttca cgaaatcggc atcgccggca aacagtaa 768
<210> 73
<211> 786
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 73
atgtccagcg gttcaggcag cggcggtgga ggcgtggcag cagatatcgg aacaggttta 60
gcagatgctc tgacagcacc cttagatcac aaagacaaag gacttaaatc actgacattg 120
gaagattcta tctcgcaaaa tggtactctc actctttcag cccaaggcgc agaaaaaaca 180
tttaaagtag gcgataaaga taactcctta aatacaggta aattaaaaaa tgacaaaatc 240
tcacggtttg atttcgttca gaaaattgaa gtagatggac aaacgattac attagcaagc 300
ggcgaattcc aaatttataa acaagaccat tcagcagtag tagcattaca aatcgaaaaa 360
attaacaacc cggacaaaat tgattctctt attaaccaac gctcttttct cgtatcagga 420
cttggtggtg aacatacagc gtttaatcaa ctgccgtcag gaaaagcaga atatcatggt 480
aaagcatttt catcagacga cgcaggtggc aaactgacct atactattga ctttgcagca 540
aaacagggac atggaaaaat tgaacattta aaaacacccg aacagaacgt agaactggcc 600
tcagcagaat tgaaagctga tgaaaaatcc catgcagtaa ttttaggcga tacacgttac 660
ggtagcgaag aaaaaggtac atatcactta gctctttttg gcgatcgtgc tcaagaaatt 720
gctggttccg caacagttaa aatccgtgaa aaagtacatg aaatcggcat tgcaggtaaa 780
caataa 786
<210> 74
<211> 262
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (group B)
<400> 74
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1 5 10 15
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn
35 40 45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala
50 55 60
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr
85 90 95
Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser
100 105 110
Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile
115 120 125
Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly
130 135 140
Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His
145 150 155 160
Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Thr
165 170 175
Ile Asp Phe Thr Asn Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys
180 185 190
Thr Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp
195 200 205
Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu
210 215 220
Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile
245 250 255
Gly Ile Ala Gly Lys Gln
260
<210> 75
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 75
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu Ala
1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser
20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100 105 110
Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115 120 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130 135 140
Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu
180 185 190
Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Ser
195 200 205
Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly
210 215 220
Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu
225 230 235 240
Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250
<210> 76
<211> 258
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 76
Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly
1 5 10 15
Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu
20 25 30
Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr
35 40 45
Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp
50 55 60
Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe
65 70 75 80
Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala
85 90 95
Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala
100 105 110
Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile
115 120 125
Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala
130 135 140
Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe
145 150 155 160
Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala
165 170 175
Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln
180 185 190
Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His
195 200 205
Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr
210 215 220
Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser
225 230 235 240
Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly
245 250 255
Lys Gln
<210> 77
<211> 257
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 77
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu
35 40 45
Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn
50 55 60
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp
65 70 75 80
Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser
85 90 95
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
100 105 110
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
115 120 125
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
130 135 140
Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
145 150 155 160
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
165 170 175
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
180 185 190
Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
195 200 205
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
210 215 220
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
225 230 235 240
Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
245 250 255
Gln
<210> 78
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 78
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Val Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110
Gln Ile Asn Asn Ser Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125
Phe Arg Ile Ser Gly Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140
Pro Lys Gly Gly Lys Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu
180 185 190
Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile
195 200 205
Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu
210 215 220
Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val
225 230 235 240
Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250 255
<210> 79
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 79
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95
Ile Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Val Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100 105 110
Ile Asn Asn Ser Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe
115 120 125
Arg Ile Ser Gly Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro
130 135 140
Lys Gly Gly Lys Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250
<210> 80
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 80
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln
100 105 110
Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115 120 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130 135 140
Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu
180 185 190
Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser
195 200 205
Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly
210 215 220
Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys
225 230 235 240
Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250
<210> 81
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic amino acid sequence
<400> 81
Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala
1 5 10 15
Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr
20 25 30
Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln
35 40 45
Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys
50 55 60
Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu
65 70 75 80
Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr
85 90 95
Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln
100 105 110
Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile
115 120 125
Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly
130 135 140
Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly
145 150 155 160
Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly
165 170 175
Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala
180 185 190
Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser
195 200 205
Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe
210 215 220
Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val
225 230 235 240
Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250

Claims (30)

1.分离的多肽，由SEQ ID NO: 68所示的氨基酸序列组成。
2.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽是脂化的。
3.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽是非脂化的。
4.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽是非丙酮酸化的。
5.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽是非脂化的且非丙酮酸化的。
6.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽具有免疫原性。
7.免疫原性组合物，包含权利要求1至5中任一项的多肽。
8.分离的核酸，编码由SEQ ID NO: 68所示的氨基酸序列组成的分离的多肽。
9.权利要求8的分离的核酸，其中所述核酸的序列由SEQ ID NO: 69组成。
10.免疫原性组合物在制备用于在除人之外的哺乳动物中诱导针对脑膜炎双球菌(Neisseria Meningitidis)的免疫应答的药物中的用途，所述免疫原性组合物包含由SEQID NO: 68所示的氨基酸序列组成的分离的多肽。
11.免疫原性组合物在制备用于在除人之外的哺乳动物中激发针对脑膜炎双球菌的杀细菌性抗体的药物中的用途，所述免疫原性组合物包含由SEQ ID NO: 68所示的氨基酸序列组成的分离的多肽。
12.免疫原性组合物，包含来自脑膜炎双球菌血清群B的分离的非脂化且非丙酮酸化的ORF2086多肽，及至少一种选自以下的缀合物：
a) 脑膜炎双球菌血清群A的荚膜糖的缀合物，
b) 脑膜炎双球菌血清群C的荚膜糖的缀合物，
c) 脑膜炎双球菌血清群W135的荚膜糖的缀合物；及
d) 脑膜炎双球菌血清群Y的荚膜糖的缀合物，
其中所述多肽由SEQ ID NO: 68所示的氨基酸序列组成。
13.权利要求12的免疫原性组合物，其中所述组合物包含至少两种选自以下的缀合物：
a) 脑膜炎双球菌血清群A的荚膜糖的缀合物，
b) 脑膜炎双球菌血清群C的荚膜糖的缀合物，
c) 脑膜炎双球菌血清群W135的荚膜糖的缀合物；及
d) 脑膜炎双球菌血清群Y的荚膜糖的缀合物。
14.权利要求12的免疫原性组合物，其中所述组合物包含至少三种选自以下的缀合物：
a) 脑膜炎双球菌血清群A的荚膜糖的缀合物，
b) 脑膜炎双球菌血清群C的荚膜糖的缀合物，
c) 脑膜炎双球菌血清群W135的荚膜糖的缀合物；及
d) 脑膜炎双球菌血清群Y的荚膜糖的缀合物。
15.权利要求12的免疫原性组合物，其中所述组合物包含脑膜炎双球菌血清群A的荚膜糖的缀合物；脑膜炎双球菌血清群C的荚膜糖的缀合物；脑膜炎双球菌血清群W135的荚膜糖的缀合物；及脑膜炎双球菌血清群Y的荚膜糖的缀合物。
16.分离的多肽，由SEQ ID NO: 64所示的氨基酸序列组成。
17.权利要求16的分离的多肽，其中所述多肽是脂化的。
18.权利要求16的分离的多肽，其中所述多肽是非脂化的。
19.权利要求16的分离的多肽，其中所述多肽是非丙酮酸化的。
20.权利要求16的分离的多肽，其中所述多肽是非脂化的且非丙酮酸化的。
21.权利要求16的分离的多肽，其中所述多肽具有免疫原性。
22.免疫原性组合物，包含权利要求16至21中任一项的多肽。
23.分离的核酸，编码由SEQ ID NO: 64所示的氨基酸序列组成的分离的多肽。
24.权利要求23的分离的核酸，其中所述核酸的序列由SEQ ID NO: 63组成。
25.免疫原性组合物在制备用于在除人之外的哺乳动物中诱导针对脑膜炎双球菌的免疫应答的药物中的用途，所述免疫原性组合物包含由SEQ ID NO: 64所示的氨基酸序列组成的分离的多肽。
26.免疫原性组合物在制备用于在除人之外的哺乳动物中激发针对脑膜炎双球菌的杀细菌性抗体的药物中的用途，所述免疫原性组合物包含由SEQ ID NO: 64所示的氨基酸序列组成的分离的多肽。
27.免疫原性组合物，包含来自脑膜炎双球菌血清群B的分离的非脂化且非丙酮酸化的ORF2086多肽，及至少一种选自以下的缀合物：
a) 脑膜炎双球菌血清群A的荚膜糖的缀合物，
b) 脑膜炎双球菌血清群C的荚膜糖的缀合物，
c) 脑膜炎双球菌血清群W135的荚膜糖的缀合物；及
d) 脑膜炎双球菌血清群Y的荚膜糖的缀合物，
其中所述多肽由SEQ ID NO: 64所示的氨基酸序列组成。
28.权利要求27的免疫原性组合物，其中所述组合物包含至少两种选自以下的缀合物：
a) 脑膜炎双球菌血清群A的荚膜糖的缀合物，
b) 脑膜炎双球菌血清群C的荚膜糖的缀合物，
c) 脑膜炎双球菌血清群W135的荚膜糖的缀合物；及
d) 脑膜炎双球菌血清群Y的荚膜糖的缀合物。
29.权利要求27的免疫原性组合物，其中所述组合物包含至少三种选自以下的缀合物：
a) 脑膜炎双球菌血清群A的荚膜糖的缀合物，
b) 脑膜炎双球菌血清群C的荚膜糖的缀合物，
c) 脑膜炎双球菌血清群W135的荚膜糖的缀合物；及
d) 脑膜炎双球菌血清群Y的荚膜糖的缀合物。
30.权利要求27的免疫原性组合物，其中所述组合物包含脑膜炎双球菌血清群A的荚膜糖的缀合物；脑膜炎双球菌血清群C的荚膜糖的缀合物；脑膜炎双球菌血清群W135的荚膜糖的缀合物；及脑膜炎双球菌血清群Y的荚膜糖的缀合物。
CN201710129205.3A 2012-03-09 2013-03-06 脑膜炎双球菌组合物及其方法 Active CN107056901B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261609257P 2012-03-09 2012-03-09
US61/609,257 2012-03-09
CN201380021485.6A CN104334187B (zh) 2012-03-09 2013-03-06 脑膜炎双球菌组合物及其方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380021485.6A Division CN104334187B (zh) 2012-03-09 2013-03-06 脑膜炎双球菌组合物及其方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107056901A CN107056901A (zh) 2017-08-18
CN107056901B true CN107056901B (zh) 2021-05-07

Family

ID=48182966

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380021485.6A Active CN104334187B (zh) 2012-03-09 2013-03-06 脑膜炎双球菌组合物及其方法
CN201710129205.3A Active CN107056901B (zh) 2012-03-09 2013-03-06 脑膜炎双球菌组合物及其方法
CN201610087738.5A Active CN105693830B (zh) 2012-03-09 2013-03-06 脑膜炎双球菌组合物及其方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380021485.6A Active CN104334187B (zh) 2012-03-09 2013-03-06 脑膜炎双球菌组合物及其方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610087738.5A Active CN105693830B (zh) 2012-03-09 2013-03-06 脑膜炎双球菌组合物及其方法

Country Status (21)

Country Link
US (3) US8986710B2 (zh)
EP (3) EP3485906A1 (zh)
JP (2) JP5925342B2 (zh)
KR (5) KR101784644B1 (zh)
CN (3) CN104334187B (zh)
AR (3) AR090294A1 (zh)
AU (5) AU2013229063B2 (zh)
BR (2) BR112014021658A2 (zh)
CA (4) CA3066792C (zh)
CO (1) CO7061042A2 (zh)
HK (1) HK1206625A1 (zh)
IL (4) IL234555B (zh)
MX (3) MX359256B (zh)
MY (2) MY167723A (zh)
NZ (2) NZ628449A (zh)
PE (2) PE20190458A1 (zh)
PH (2) PH12014501887A1 (zh)
RU (2) RU2665841C2 (zh)
SG (3) SG10201602558UA (zh)
TW (5) TWI600662B (zh)
WO (1) WO2013132452A2 (zh)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
WO2012025873A2 (en) 2010-08-23 2012-03-01 Wyeth Llc STABLE FORMULATIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS rLP2086 ANTIGENS
JP5976652B2 (ja) 2010-09-10 2016-08-24 ワイス・エルエルシー 髄膜炎菌ｏｒｆ２０８６抗原の非脂質化変異体
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
EP3485906A1 (en) 2012-03-09 2019-05-22 Pfizer Inc Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
CA2903716C (en) 2013-03-08 2019-04-09 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
KR20180099912A (ko) 2013-09-08 2018-09-05 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
WO2015128480A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Novartis Ag Modified meningococcal fhbp polypeptides
NZ766003A (en) * 2014-07-23 2024-01-26 Children’S Hospital & Res Center At Oakland Factor h binding protein variants and methods of use thereof
US10888611B2 (en) 2015-02-19 2021-01-12 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP3334455A4 (en) * 2015-08-11 2019-08-21 Orbis Health Solutions LLC STRATEGY FOR BACTERIAL AND VIRAL VACCINATION
US20180228885A1 (en) * 2016-03-04 2018-08-16 Orbis Health Solutions Llc Bacterial and viral vaccine strategy
AU2017321863A1 (en) 2016-09-02 2019-04-11 Sanofi Pasteur, Inc. Neisseria meningitidis vaccine
SG10202111092UA (en) * 2017-01-31 2021-11-29 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP3923982A1 (en) 2019-02-11 2021-12-22 Pfizer Inc. Neisseria meningitidiscompositions and methods thereof
BR112022004921A2 (pt) 2019-09-27 2022-07-19 Pfizer Composições para neisseria meningitidis e métodos das mesmas
US20220265805A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Sanofi Pasteur Inc. Meningococcal b recombinant vaccine
WO2024030931A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Sanofi Pasteur Inc. Adjuvanted immunogenic composition against neisseria meningitidis b

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1578785A (zh) * 2001-10-11 2005-02-09 惠氏控股有限公司 预防和治疗脑膜炎球菌性疾病的新型免疫原性组合物
CN102356089A (zh) * 2008-02-21 2012-02-15 诺华有限公司 脑膜炎球菌fHBP多肽

Family Cites Families (228)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
CH660375A5 (it) 1983-02-08 1987-04-15 Sclavo Spa Procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica.
EP0138854B1 (en) 1983-03-08 1992-11-04 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Antigenically active amino acid sequences
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4650764A (en) 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
GB8424757D0 (en) 1984-10-01 1984-11-07 Pasteur Institut Retroviral vector
SE8405493D0 (sv) 1984-11-01 1984-11-01 Bror Morein Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel
FR2573436B1 (fr) 1984-11-20 1989-02-17 Pasteur Institut Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
EP0232262A4 (en) 1985-08-15 1989-09-19 Stauffer Chemical Co MICROORGANISM PRODUCING TRYPTOPHANE.
US5078996A (en) 1985-08-16 1992-01-07 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US5514581A (en) 1986-11-04 1996-05-07 Protein Polymer Technologies, Inc. Functional recombinantly prepared synthetic protein polymer
US4980289A (en) 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
RU2023448C1 (ru) 1987-07-30 1994-11-30 Сентро Насьональ Де Биопрепарадос Способ получения вакцины против различных патогенных серотипов менингита нейссера группы в
AU3069189A (en) 1988-02-05 1989-08-25 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Retroviral packaging cell lines and processes of using same
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
WO1990002806A1 (en) 1988-09-01 1990-03-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges
US7118757B1 (en) 1988-12-19 2006-10-10 Wyeth Holdings Corporation Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
US5124263A (en) 1989-01-12 1992-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombination resistant retroviral helper cell and products produced thereby
US5601831A (en) 1989-03-09 1997-02-11 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for nontypable Haemophilus influenzae
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
WO1990014837A1 (en) 1989-05-25 1990-12-13 Chiron Corporation Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
CA2039921A1 (en) 1990-04-16 1991-10-17 Xandra O. Breakefield Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991018088A1 (en) 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
EP0467714A1 (en) 1990-07-19 1992-01-22 Merck & Co. Inc. The class II protein of the outer membrane of neisseria meningitidis
EP0550553B1 (en) 1990-09-25 2000-07-12 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral defective vaccine produced by transcomplementing cell line
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
IL101715A (en) 1991-05-02 2005-06-19 Amgen Inc Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs
WO1993007897A1 (en) 1991-10-21 1993-04-29 Medimmune, Inc. Bacterial expression vectors containing dna encoding secretion signals of lipoproteins
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
IT1253009B (it) 1991-12-31 1995-07-10 Sclavo Ricerca S R L Mutanti immunogenici detossificati della tossina colerica e della tossina lt, loro preparazione ed uso per la preparazione di vaccini
WO1993015115A1 (en) 1992-01-24 1993-08-05 Cornell Research Foundation, Inc. E. coli dna polymerase iii holoenzyme and subunits
JPH08503855A (ja) 1992-12-03 1996-04-30 ジェンザイム・コーポレイション 嚢胞性線維症に対する遺伝子治療
ES2231770T3 (es) 1993-03-05 2005-05-16 Wyeth Holdings Corporation Nuevos plasmidos para la produccion de proteina crm y toxina difterica.
AU696336B2 (en) 1993-03-19 1998-09-10 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Defective mutant non-retroviral virus (e.g. HSV) as vaccine
EP0624376B1 (en) 1993-05-13 2000-03-15 American Cyanamid Company Preparation and uses of LOS-depleted outer membrane proteins of gram-negative cocci
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
WO1995002697A1 (fr) 1993-07-13 1995-01-26 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique
US5906928A (en) 1993-07-30 1999-05-25 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Efficient gene transfer into primary murine lymphocytes obviating the need for drug selection
FR2708622B1 (fr) 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
US5550213A (en) 1993-12-27 1996-08-27 Rutgers, The State University Of New Jersey Inhibitors of urokinase plasminogen activator
FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
FR2715847B1 (fr) 1994-02-08 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
FR2716459B1 (fr) 1994-02-22 1996-05-10 Univ Paris Curie Système hôte-vecteur utilisable en thérapie génique.
WO1995026411A2 (en) 1994-03-25 1995-10-05 The Uab Research Foundation Composition and methods for creating syngeneic recombinant virus-producing cells
US5739118A (en) 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
EP0753069A1 (en) 1994-04-15 1997-01-15 Targeted Genetics Corporation Gene delivery fusion proteins
US5571515A (en) 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5837533A (en) 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
GB9422096D0 (en) 1994-11-02 1994-12-21 Biocine Spa Combined meningitis vaccine
FR2727679B1 (fr) 1994-12-05 1997-01-03 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
BE1008978A5 (fr) 1994-12-27 1996-10-01 Solvay Adjuvants pour vaccins.
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
IL117483A (en) 1995-03-17 2008-03-20 Bernard Brodeur MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K.
AU6043396A (en) 1995-06-05 1996-12-24 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation, The Composition and methods for creating syngeneic recombinant v irus-producing cells
AU721954B2 (en) 1995-06-07 2000-07-20 Connaught Laboratories Inc. Expression of lipoproteins
FR2741358B1 (fr) 1995-11-17 1998-01-02 Centre Nat Rech Scient Production de vecteurs retroviraux par l'intermediaire de vecteurs viraux a base de virus a adn
US6355255B1 (en) 1998-12-07 2002-03-12 Regents Of The University Of Minnesota Streptococcal C5a peptidase vaccine
US5846547A (en) 1996-01-22 1998-12-08 Regents Of The University Of Minnesota Streptococcal C5a peptidase vaccine
JP4150082B2 (ja) 1996-08-27 2008-09-17 カイロン コーポレイション 独特の髄膜炎菌性ｂエピトープを規定するモノクローナル抗体およびワクチン組成物の調製におけるそれらの使用
DE69708318T3 (de) 1996-08-27 2006-11-16 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville Neisseria meningitidis serogruppe b glykokonjugate und verfahren zu deren verwendung
GB9622159D0 (en) 1996-10-24 1996-12-18 Solvay Sociutu Anonyme Polyanionic polymers as adjuvants for mucosal immunization
US6472518B1 (en) 1996-10-24 2002-10-29 Centers For Disease Control And Prevention, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Invasion associated genes from Neisseria meningitidis serogroup B
GB9622660D0 (en) 1996-10-31 1997-01-08 Biocine Spa Immunogenic detoxified mutant toxin
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
HUP0004589A3 (en) 1997-06-30 2003-08-28 Centre Nat Rech Scient Improved method for transferring nucleic acid into the striped muscle and combination therefor
BR9810372A (pt) 1997-06-30 2000-09-05 Rhone Poulenc Rorer Sa Processo de transferência de ácido nucléico para o interior de células de organismos eucarióticos pluricelulares in vivo, composição, ácido nucléico e campo elétrico, e, produto de combinação
BR9810500A (pt) 1997-06-30 2000-09-05 Rhone Poulenc Rorer Sa Sistema e aparelho para a transferência de ácido nucléico in vivo para o interior de células de organismos eucarióticos pluricelulares
JPH1144977A (ja) 1997-07-25 1999-02-16 Copyer Co Ltd 画像形成装置
EP1007546B1 (en) 1997-08-27 2009-01-21 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Molecular mimetics of meningococcal b epitopes
BR9813930A (pt) 1997-11-06 2006-12-19 Chiron Spa antìgeno neisserial
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
AU1979599A (en) 1998-01-14 1999-08-02 Chiron S.P.A. (neisseria meningitidis) antigens
PT1053329E (pt) 1998-02-03 2010-01-04 Ct Disease Contr & Prevention Proteína psaa lipidada recombinante, métodos de preparação e utilização
GB9806456D0 (en) 1998-03-25 1998-05-27 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB9808734D0 (en) 1998-04-23 1998-06-24 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9808932D0 (en) 1998-04-27 1998-06-24 Chiron Spa Polyepitope carrier protein
EP2261347A3 (en) 1998-05-01 2012-01-11 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Neisseria meningitidis antigens and compositions
JP5074644B2 (ja) 1998-05-29 2012-11-14 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 組合わせの髄膜炎菌ｂ／ｃワクチン
CA2344740C (en) 1998-09-30 2011-11-22 American Cyanamid Company Mutant cholera holotoxin as an adjuvant
EP1198245B1 (en) 1998-09-30 2004-08-25 Walter Reed Army Institute of Research Use of purified invaplex from gram negative bacteria as a vaccine
RU2223492C2 (ru) * 1998-10-09 2004-02-10 Чирон Корпорейшн БЕЛОК, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ neisseria meningitidis (ВАРИАНТЫ), ЕГО ФРАГМЕНТ, КОДИРУЮЩАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА (ВАРИАНТЫ), ЗОНД, ПРАЙМЕР, КОМПОЗИЦИЯ
MXPA01003557A (es) 1998-10-09 2004-04-05 Chiron Corp Secuencias genomicas de neisseria y metodos para su uso.
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6281337B1 (en) 1998-11-12 2001-08-28 Schering Corporation Methods for conversion of protein isoforms
JP2004537954A (ja) 1999-01-15 2004-12-24 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ナイセリア・メニンギティディス・ポリペプチドｂａｓｂ０５２
AU2292800A (en) 1999-01-22 2000-08-07 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Neisseria meningitidis antigenic polypeptides, corresponding polynucleotides andprotective antibodies
GB9902084D0 (en) 1999-01-29 1999-03-24 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
EP1150712B1 (en) 1999-02-05 2008-11-05 Merck & Co., Inc. Human papilloma virus vaccine formulations
EP1154790B1 (en) 1999-02-26 2004-10-20 Chiron S.r.l. Enhancement of bactericidal activity of neisseria antigens with oligonucleotides containing cg motifs
US6245568B1 (en) 1999-03-26 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Human papilloma virus vaccine with disassembled and reassembled virus-like particles
US7115730B1 (en) 1999-04-27 2006-10-03 Chiron Srl Immunogenic detoxified mutant E. coli LT-A-toxin
ES2323845T3 (es) 1999-04-30 2009-07-27 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Secuencias genomicas de neisseria y procedimientos de uso.
CN100392082C (zh) 1999-04-30 2008-06-04 启龙股份公司 保守的奈瑟球菌抗原
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
DK2270172T3 (en) 1999-05-19 2016-02-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Combination Compositions of Neisseria.
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
US7384640B1 (en) 1999-09-30 2008-06-10 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant
ES2541830T3 (es) 1999-10-29 2015-07-27 Novartis Vaccines And Diagnositics S.R.L. Péptidos antigénicos de Neisseria
ATE460484T1 (de) 1999-11-29 2010-03-15 Novartis Vaccines & Diagnostic 85 kda antigen von neisseria
GB9928196D0 (en) 1999-11-29 2000-01-26 Chiron Spa Combinations of B, C and other antigens
DE60039450D1 (de) 1999-12-02 2008-08-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Zusammensetzungen und methoden zur stabilisierung von biologischen molekülen nach lyophilisierung
PT1248647E (pt) 2000-01-17 2010-11-18 Novartis Vaccines & Diagnostics Srl Vacina de vesícula da membrana externa (omv) compreendendo proteínas de membrana externa de n. meningitidis do serogrupo b
CA2744921C (en) 2000-02-28 2014-05-13 Chiron S.R.L. Hybrid expression of neisserial proteins
RU2293573C2 (ru) 2000-06-08 2007-02-20 Интерселл Аг Иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды
AT410635B (de) 2000-10-18 2003-06-25 Cistem Biotechnologies Gmbh Vakzin-zusammensetzung
DK2332581T3 (en) 2001-01-23 2015-10-05 Sanofi Pasteur Inc Tri- or tetravalent meningococcal polysaccharide-crm197 conjugate vaccine
GB0103424D0 (en) 2001-02-12 2001-03-28 Chiron Spa Gonococcus proteins
EP1373314A2 (en) 2001-03-30 2004-01-02 Geneprot, Inc. Human arginine-rich protein-related compositions
AU2002258734A1 (en) 2001-04-13 2002-10-28 Wyeth Holdings Corporation Removal of bacterial endotoxin in a protein solution by immobilized metal affinity chromatography
RU2322451C2 (ru) 2001-04-17 2008-04-20 Новартис Вэксинс Энд Диагностикс, Инк. Молекулярные миметики эпитопов менингококка в, которые вызывают выработку функционально активных антител
ATE451386T1 (de) 2001-06-07 2009-12-15 Wyeth Corp Mutantenformen von cholera holotoxin als adjuvans
WO2002098369A2 (en) 2001-06-07 2002-12-12 Wyeth Holdings Corporation Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
AU2002330681C1 (en) 2001-07-26 2015-04-02 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccines comprising aluminium adjuvants and histidine
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
EP1436385A4 (en) 2001-09-14 2005-12-14 Invitrogen Corp DNA POLYMERASES AND MUTANTS CORRESPONDING
GB0129007D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Chiron Spa Adjuvanted antigenic meningococcal compositions
JP2005526153A (ja) 2002-03-26 2005-09-02 カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ 水中において改善された安定性を持つ修飾糖
GB0302218D0 (en) 2003-01-30 2003-03-05 Chiron Sri Vaccine formulation & Mucosal delivery
DE60328481D1 (de) 2002-05-14 2009-09-03 Novartis Vaccines & Diagnostic Schleimhautapplizierter impfstoff, der das adjuvanz chitosan und menigokokkenantigene enthält
ATE513560T1 (de) 2002-05-14 2011-07-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Kombinationsimpfstoff gegen bakterielle meningitis, der über die schleimhaut appliziert wird
US6954446B2 (en) 2002-06-25 2005-10-11 Motorola, Inc. Multiple mode RF communication device
US7785608B2 (en) * 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
GB0220198D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Modified saccharides,conjugates thereof and their manufacture
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
DE60335477D1 (de) 2002-10-11 2011-02-03 Novartis Vaccines & Diagnostic Polypeptidimpstoffe zum breiten schutz gegen hypervirulente meningokokken-linien
ATE466875T1 (de) 2002-11-15 2010-05-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Unerwartete oberflächenproteine in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) * 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
EP1590459A2 (en) 2003-01-15 2005-11-02 Wyeth Holdings Corporation Methods for increasing neisseria protein expression and compositions thereof
CN101926988B (zh) 2003-01-30 2014-06-04 诺华疫苗和诊断有限公司 抗多种脑膜炎球菌血清组的可注射性疫苗
EP1603950A2 (en) 2003-03-17 2005-12-14 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
MXPA05011110A (es) 2003-04-16 2006-01-24 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de un padecimiento originado por meningococos.
CA2528007C (en) 2003-06-02 2012-03-27 Chiron Corporation Immunogenic compositions based on microparticles comprising adsorbed toxoid and a polysaccharide-containing antigen
CA2530434A1 (en) 2003-06-23 2005-01-06 Aventis Pasteur, Inc. Immunization method against neisseria meningitidis serogroups a and c
GB0316560D0 (en) 2003-07-15 2003-08-20 Chiron Srl Vesicle filtration
CA2885040C (en) 2003-10-02 2018-10-30 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Liquid vaccines for multiple meningococcal serogroups
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
JP2007517057A (ja) 2003-12-30 2007-06-28 ワイス 改善された耐容性を有する免疫原性組成物中の疎水性タンパク質の処方物
GB0406013D0 (en) 2004-03-17 2004-04-21 Chiron Srl Analysis of saccharide vaccines without interference
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
GB0408978D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Meningococcal fermentation for preparing conjugate vaccines
PL1740217T3 (pl) 2004-04-30 2012-03-30 Novartis Ag Szczepienie koniugatem meningokokowym
GB0409745D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Compositions including unconjugated carrier proteins
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
GB0410220D0 (en) 2004-05-07 2004-06-09 Kirkham Lea Ann Mutant pneumolysin proteins
GB0411387D0 (en) 2004-05-21 2004-06-23 Chiron Srl Analysis of saccharide length
GB0413868D0 (en) 2004-06-21 2004-07-21 Chiron Srl Dimensional anlaysis of saccharide conjugates
DE602005025647D1 (de) 2004-07-23 2011-02-10 Novartis Vaccines & Diagnostic Polypeptide für die oligomerisierung von antigenen
GB0419408D0 (en) 2004-09-01 2004-10-06 Chiron Srl 741 chimeric polypeptides
GB0419846D0 (en) 2004-09-07 2004-10-13 Chiron Srl Vaccine adjuvants for saccharides
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
GB0428394D0 (en) 2004-12-24 2005-02-02 Chiron Srl Saccharide conjugate vaccines
CA2590974C (en) 2005-01-27 2017-10-03 Children's Hospital & Research Center At Oakland Gna1870-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by neisseria meningitidis
WO2006096701A2 (en) 2005-03-07 2006-09-14 Id Biomedical Corporation Of Quebec C.O.B. As Glaxosmithkline Biologicals North America Pharmaceutical liposomal compositions
RU2412944C2 (ru) 2005-05-06 2011-02-27 Новартис Вэксинз Энд Дайагностикс Срл Иммуногены для вакцин против менингита а
PE20110072A1 (es) 2005-06-27 2011-02-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica
US8007807B2 (en) 2005-09-01 2011-08-30 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Multiple vaccination including serogroup C meningococcus
DE602005024320D1 (de) 2005-09-05 2010-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Bakterizidie-serumtest für n. meningitidis spezifische antiseren
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
AU2006327023A1 (en) 2005-12-23 2007-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Conjugate vaccines
EP2004225B1 (en) 2006-03-22 2012-04-25 Novartis AG Regimens for immunisation with meningococcal conjugates
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
US20070253985A1 (en) 2006-04-26 2007-11-01 Wyeth Novel processes for coating container means which inhibit precipitation of polysaccharide-protein conjugate formulations
CA2654709A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Nathalie Devos Neisseria meningitidis lipooligosaccharide vaccine
GB0612854D0 (en) 2006-06-28 2006-08-09 Novartis Ag Saccharide analysis
RU2450019C2 (ru) 2006-06-29 2012-05-10 Новартис Аг Полипептиды из neisseria meningitidis
JP2009544321A (ja) 2006-07-27 2009-12-17 ワイス 組換えタンパク質を製造するための高細胞密度流加発酵法
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
BRPI0811979A2 (pt) 2007-06-04 2014-10-21 Novartis Ag Formulação para vacinas de meningite
GB0713880D0 (en) 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
WO2009038889A1 (en) 2007-08-02 2009-03-26 Children's Hospital And Research Center At Oakland Fhbp- and lpxl1-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by neisseria meningitidis
PL2200642T3 (pl) 2007-10-19 2012-09-28 Novartis Ag Preparaty szczepionek meningokokowych
CA2716399C (en) 2008-03-05 2020-07-21 Pierre Chouvenc Process for stabilizing an adjuvant containing vaccine composition
AU2009223613B2 (en) 2008-03-10 2014-09-25 Children's Hospital & Research Center At Oakland Chimeric factor H binding proteins (fHBP) containing a heterologous B domain and methods of use
US20100035234A1 (en) 2008-05-19 2010-02-11 Novartis Ag Vaccine assays
MX2010012999A (es) 2008-05-30 2012-03-07 U S A As Represented By The Secretary Of The Army On Behalf Of Walter Reed Army Vacuna de vesícula de membrana externa nativa multivalente del meningococo, método para su fabricación y uso.
BRPI0917306A2 (pt) 2008-08-27 2016-04-19 Childrens Hosp & Res Ct Oak ensaios com base fator de complemento h para a atividade sérica bacterecida contra neisseria meningitidis
WO2010028096A2 (en) 2008-09-03 2010-03-11 Children's Hospital & Research Center At Oakland Peptides presenting an epitope of an a domain of factor h binding protein and methods of use
IT1394288B1 (it) 2008-09-12 2012-06-06 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogeni di proteine che legano il fattore h.
CN102271707B (zh) 2008-10-29 2015-04-08 阿布林克斯公司 单域抗原结合性分子的制剂
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
CA2747340A1 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
NZ595234A (en) 2009-03-24 2013-12-20 Novartis Ag Adjuvanting meningococcal factor h binding protein
WO2010109324A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
US9266942B2 (en) 2009-04-30 2016-02-23 Children's Hospital & Research Center Oakland Chimeric factor H binding proteins (fHbp) and methods of use
US9365885B2 (en) 2009-06-16 2016-06-14 Puiying Annie Mak High-throughput complement-mediated antibody-dependent and opsonic bactericidal assays
CN104650241A (zh) * 2009-08-27 2015-05-27 诺华股份有限公司 包括脑膜炎球菌fHBP序列的杂交多肽
US20130022639A1 (en) 2009-09-30 2013-01-24 Novartis Ag Expression of meningococcal fhbp polypeptides
GB0917647D0 (en) 2009-10-08 2009-11-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Expression system
US20130022633A1 (en) 2009-10-27 2013-01-24 University Of Florence MENINGOCOCCAL fHBP POLYPEPTIDES
JP5781542B2 (ja) 2009-12-30 2015-09-24 ノバルティス アーゲー Ｅ．ｃｏｌｉキャリアタンパク質に結合体化した多糖免疫原
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
JP2013521770A (ja) 2010-03-10 2013-06-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン組成物
CN102802662A (zh) 2010-03-18 2012-11-28 诺华有限公司 用于脑膜炎球菌血清组b的含佐剂疫苗
US9827300B2 (en) 2010-03-30 2017-11-28 Children's Hospital & Research Center Oakland Factor H binding proteins (FHBP) with altered properties and methods of use thereof
EP2585106A1 (en) 2010-06-25 2013-05-01 Novartis AG Combinations of meningococcal factor h binding proteins
WO2012025873A2 (en) 2010-08-23 2012-03-01 Wyeth Llc STABLE FORMULATIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS rLP2086 ANTIGENS
ES2744471T3 (es) 2010-09-04 2020-02-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Ensayos de anticuerpos bactericidas para evaluar la inmunogenia y la potencia de vacunas de sacárido capsular meningocócico
GB201015132D0 (en) 2010-09-10 2010-10-27 Univ Bristol Vaccine composition
US20120070457A1 (en) 2010-09-10 2012-03-22 J. Craig Venter Institute, Inc. Polypeptides from neisseria meningitidis
US9259462B2 (en) 2010-09-10 2016-02-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Developments in meningococcal outer membrane vesicles
JP5976652B2 (ja) 2010-09-10 2016-08-24 ワイス・エルエルシー 髄膜炎菌ｏｒｆ２０８６抗原の非脂質化変異体
GB201101665D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Novartis Ag Immunogenic compositions
EP3485906A1 (en) * 2012-03-09 2019-05-22 Pfizer Inc Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
CA2903716C (en) 2013-03-08 2019-04-09 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
EP2999460A1 (en) * 2013-05-22 2016-03-30 Pearl Therapeutics, Inc. Compositions, methods&systems for respiratory delivery of three or more active agents
KR20180099912A (ko) * 2013-09-08 2018-09-05 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1578785A (zh) * 2001-10-11 2005-02-09 惠氏控股有限公司 预防和治疗脑膜炎球菌性疾病的新型免疫原性组合物
CN102356089A (zh) * 2008-02-21 2012-02-15 诺华有限公司 脑膜炎球菌fHBP多肽

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of Neisseria meningitidis Isolates That Do Not Express the Virulence Factor and Vaccine Antigen Factor H Binding Protein;Jay Lucidarme 等;《CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY》;20110630;第18卷(第4期);第1002-1014页 *
factor H-binding protein [Neisseria meningitidis];Lucidarme,J 等;《GenBank》;20090202;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6250008B2 (ja) 2017-12-20
KR20140135811A (ko) 2014-11-26
CA2865745A1 (en) 2013-09-12
KR20160022402A (ko) 2016-02-29
TWI616455B (zh) 2018-03-01
NZ731330A (en) 2020-11-27
MX351993B (es) 2017-11-03
IL245852B (en) 2020-06-30
AU2016228316B2 (en) 2017-06-15
AU2016228316A1 (en) 2016-10-06
EP3485906A1 (en) 2019-05-22
AU2019204425A1 (en) 2019-07-11
EP4043029A1 (en) 2022-08-17
AR090294A1 (es) 2014-11-05
KR20170089981A (ko) 2017-08-04
MX2018011291A (es) 2023-01-31
JP2015514395A (ja) 2015-05-21
US20130243807A1 (en) 2013-09-19
TW201600109A (zh) 2016-01-01
RU2739504C2 (ru) 2020-12-25
US9724402B2 (en) 2017-08-08
US20160347797A1 (en) 2016-12-01
MY198910A (en) 2023-10-02
AU2021201721A1 (en) 2021-04-15
WO2013132452A2 (en) 2013-09-12
TWI627181B (zh) 2018-06-21
AU2021201721B2 (en) 2023-03-30
TW201602130A (zh) 2016-01-16
WO2013132452A3 (en) 2014-01-09
KR101716557B1 (ko) 2017-03-14
NZ718108A (en) 2017-10-27
SG11201404730XA (en) 2014-10-30
CN105693830A (zh) 2016-06-22
IL275081A (en) 2020-07-30
KR20160092051A (ko) 2016-08-03
HK1206625A1 (zh) 2016-01-15
TW201704256A (zh) 2017-02-01
RU2018129163A (ru) 2018-11-09
KR20160092052A (ko) 2016-08-03
TW201806966A (zh) 2018-03-01
US9561269B2 (en) 2017-02-07
NZ628449A (en) 2016-04-29
CO7061042A2 (es) 2014-09-19
SG10201602558UA (en) 2016-05-30
SG10201911003QA (en) 2020-01-30
PH12014501887B1 (en) 2014-11-17
TWI600662B (zh) 2017-10-01
TWI605827B (zh) 2017-11-21
CA2960030A1 (en) 2013-09-12
CA3195971A1 (en) 2013-09-12
KR101784644B1 (ko) 2017-10-11
AR125326A2 (es) 2023-07-05
RU2014136401A (ru) 2016-05-10
PE20142115A1 (es) 2014-12-17
RU2017104529A3 (zh) 2020-07-02
TW201341397A (zh) 2013-10-16
CA3066792A1 (en) 2013-09-12
MY167723A (en) 2018-09-21
US20160030543A1 (en) 2016-02-04
US8986710B2 (en) 2015-03-24
AU2017210600A1 (en) 2017-08-24
IL245852A0 (en) 2016-07-31
PH12014501887A1 (en) 2014-11-17
JP2016040284A (ja) 2016-03-24
PH12018501517A1 (en) 2019-07-29
IL275081B (en) 2021-10-31
JP5925342B2 (ja) 2016-05-25
IL260135B (en) 2019-07-31
CA2865745C (en) 2018-01-09
CN107056901A (zh) 2017-08-18
PH12018501517B1 (en) 2019-07-29
IL260135A (en) 2018-07-31
BR122016004924A2 (pt) 2019-07-30
CN105693830B (zh) 2021-07-06
CN104334187A (zh) 2015-02-04
RU2665841C2 (ru) 2018-09-04
TWI570133B (zh) 2017-02-11
PE20190458A1 (es) 2019-04-01
RU2018129163A3 (zh) 2021-12-29
CA2960030C (en) 2020-02-25
CA3066792C (en) 2023-06-20
EP2822583A2 (en) 2015-01-14
KR101763625B1 (ko) 2017-08-01
MX2014010156A (es) 2014-09-16
NZ747917A (en) 2022-02-25
IL234555B (en) 2018-07-31
KR101784142B1 (ko) 2017-10-10
CN104334187B (zh) 2017-04-05
BR112014021658A2 (pt) 2017-07-11
AU2013229063B2 (en) 2016-10-06
AU2013229063A1 (en) 2014-09-25
MX359256B (es) 2018-09-19
RU2017104529A (ru) 2018-08-16
AU2017210600B2 (en) 2019-07-11
AR125327A2 (es) 2023-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107056901B (zh) 脑膜炎双球菌组合物及其方法
KR101584871B1 (ko) 네이세리아 메닝기티디스 orf2086 항원의 비-지질화된 변이체
US10829521B2 (en) Neisseria meningitidis composition and methods thereof
RU2776310C2 (ru) Композиции neisseria meningitidis и способы их применения
NZ731330B2 (en) Neisseria meningitidis compositions and methods thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1241890

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant