JP2007517057A - 改善された耐容性を有する免疫原性組成物中の疎水性タンパク質の処方物 - Google Patents

Abstract

本発明によって、ヒトにおける注射に適した、疎水性タンパク質の無痛性組成物であって、該組成物は、（ａ）疎水性タンパク質、（ｂ）該タンパク質を可溶化するのに必要な量より少ない量の両性イオン界面活性剤、および（ｃ）薬学的に受容可能なキャリア内に該タンパク質の溶解性を維持するのに有効な量の薬学的に受容可能な非イオン性界面活性剤を含む、疎水性タンパク質の無痛性組成物が提供される。本発明の実施形態では、感染体がヒトの病原体である場合の、非経口的に投与することを含むヒトの免疫化方法もまた提供される。

Description

（技術分野）
本発明は、ポーリン類のような疎水性膜タンパク質に対する免疫反応を誘導するのに用いられる無痛または疼痛の少ない免疫原性組成物または医薬組成物に関する。これらの組成物は、髄膜炎または淋病のような哺乳動物の疾病の予防または治療に用いられる。

（背景技術）
タンパク質を主成分とするほとんどの医薬品は、界面活性剤を含まないかまたはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリソルベート８０）またはＴＷＥＥＮ（登録商標）２０のような比較的低刺激性の界面活性剤を含有する。しかしながら、これらの低刺激性界面活性剤は、しばしばある種の疎水性膜タンパク質を可溶化できない。疎水性膜タンパク質が膜から分離される際に、その露出した疎水性領域が相互作用してそのタンパク質分子を凝集させ、水溶液から沈殿させる。このようなタンパク質は、疎水性基と水との両方に親和性を持つ界面活性剤によって可溶化される。イオン性界面活性剤は、膜タンパク質の露出した疎水性領域のほか、水溶性タンパク質の疎水性コア部も結合する。それらの界面活性剤は、その荷電のためにイオン結合および水素結合を壊してしばしばタンパク質を変性させる。高濃度域では、たとえばドデシル硫酸ナトリウムはタンパク質を完全に変性させる。これに対して高濃度域での非イオン性界面活性剤は、界面活性剤、リン脂質および疎水性膜タンパク質の混合ミセルの形成によって生物の膜を可溶化する。しかしながら、変性したタンパク質および混合ミセル中のタンパク質は、一般的には免疫原性組成物として用いるのには適さない。低濃度域ではそれらの界面活性剤は、疎水性膜タンパク質を可溶化できない。両性イオン界面活性剤は、天然の膜から抽出された疎水性膜の可溶化、および遺伝子組み換えによって産生されたようなタンパク質のリフォールディングを促進するのに有効であることがすでに示されている。非特許文献１を参照のこと。以下に開示するように、たとえばＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのような病原体から抽出された膜タンパク質を含有する有効な免疫原性組成物が現在必要とされている。

（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）
グラム陰性の被包性双球菌であるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、ヒトに特異的な病原体であって、髄膜炎の最も破壊的な形態のひとつであるＭｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ属菌による髄膜炎を引き起こす。これらの細菌は世界的に知られており、突発的で流行性の疾患を引き起こし得る。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓのヒトからヒトへの伝染は、主として空気経路で起こり、特に囚人、軍キャンプ、寄宿舎、学校の教室およびデイケアセンターのような閉鎖空間で問題となる。ある場合では、全体の２‐１０％の人たちがこの微生物の無症候性キャリヤーとなっている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。このような高い保菌率からして大発生または流行に対する脅威または可能性はいつも存在する。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓでは血清型が特定されているが、その血清学的分類は、特定の菌株の莢膜の多糖の組成に基づいている。髄膜炎球菌類の中には少なくとも１３種の異なる血清型、すなわちＡ，Ｂ，Ｃ，２９‐Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｘ，Ｌ，Ｗ１３５，Ｘ，ＹおよびＺがある。これらの血清型のうち、Ａ，Ｂ，ＣおよびＷ１３５が最も頻繁に疾病を引き起こす。血清型Ａ，ＣおよびＷ１３５での莢膜の性質を基にして、それらの血清型に対抗する有用な免疫原性組成物の開発が進められてきた。しかしながら、血清型Ｂの莢膜の多糖は、ヒトに使用するには不適であると考えられている。血清型Ｂに対する免疫原性組成物が求められることから、ポーリン類のような種々の膜タンパク質の抗原性および免疫原性の特性解析に集中して努力がなされてきた。主要タンパク質抗原のいくつかには、クラス１（Ｐｏｒ Ａ、カチオン性特異的ポーリン）、クラス２またはクラス３（Ｐｏｒ Ｂ、アニオン性特異的タンパク質）、それより少ないがクラス４、クラス５（Ｒｍｐ、並びにＯｐｃおよびＯｐａ不透明化関連タンパク質類）のＯＭＰのような外膜タンパク質（ＯＭＰ：ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）および表面脂質化タンパク質類が含まれる。

（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）
現在、淋病は世界中に最も広まった性病の一つであり、米国だけでも一年間に数百症例確認される。この疾病の原因菌がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅであって、これまでの従来の抗生物質による療法に対する耐性およびある程度であるが健常なヒト血清の抗菌活性に対する耐性をその進化の過程でつけてきた細菌である。従来の方法による感染防除が効かないことから、その感染を効果的に防ぐことができる免疫原性組成物に対する必要性が生じている。

淋病に対する免疫原性組成物の開発の領域において最も集中して行なわれた研究の対象は、その外膜タンパク質類である。淋菌の膜を部分的に用いたいくつかの免疫原性組成物については、たとえば特許文献１、特許文献２および特許文献３にすでに記載されている。しかしながら、これらの組成物のほとんどはタンパク質と外来細胞物質との混合物を含有し、所望の免疫反応と同時に頻繁に炎症性および生理学的な副作用の誘発が見られる。したがってさらに純粋な形の細菌抗原を有する免疫原性組成物の必要性が存在する。

淋病用の免疫原性組成物の一つの候補としては、プロテインＩとして知られる特異的外膜タンパク質、すなわちＰｏｒが挙げられる。Ｐｏｒは、疎水性膜タンパク質であり、ポーリンとして機能するＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの主要外膜タンパク質である。ポーリン類は、細胞において疎水性脂質外膜を通して低分子量の物質を通過（チャネリング）させるものと考えられている。Ｐｏｒには免疫原性組成物に使用される候補物質として注目される特徴がいくつか存在する。第一の特徴はそれがＮｅｉｓｅｒｉａ属菌において血清型特異性に少なくとも部分的に関与することである。第二の特徴はそれが露出表面にあるのが本来の状態であり、感染微生物の表面に結合して食細胞によって食されやすくするオプソニン類の産生を引き起こすと考えられることである。

Ｐｏｒ分子の二つの異なる主要なタイプは、ペプチドマッピングおよびタンパク質易分解特性に基づき淋菌類においてＰｏｒＡ（ＰＩＡとしても知られる）およびＰｏｒＢ（ＰＩＢとしても知られる）と表わされてきた。非特許文献５；非特許文献６を参照のこと。淋菌類が発現するＰｒｏＡは、全身的な感染に関連すると考えられ、一方のＰｏｒＢは一般には局所的感染に関連する。非特許文献７；非特許文献８を参照のこと。実質的に精製された核酸分子がコードするＰＩＡについては、特許文献４に記載されている。実質的に精製された核酸分子がコードするＰＩＢについては、特許文献５に記載されている。

疎水性膜タンパク質、特にＰｏｒタンパク質の有益な免疫原効果に可能性があると思われるので、有効性および認容性を有するサブユニットの免疫原性組成物およびそれらの製法の達成が求められている。さらに特定すると、髄膜炎球菌類または淋菌類の疎水性膜タンパク質から成り、容易に製造が可能であって、安全で無痛または疼痛が少なく、感染の治療および／または予防に有効である免疫原性組成物が必要とされている。
米国特許第４，２０３，９７１号明細書 米国特許第４，２８８，５５７号明細書 米国特許第４，６８１，７６１号明細書 米国特許第５，７３６，３６１号明細書 米国特許第６，０６８，９９２号明細書 Ｍａｔｓｕｋａ，Ｙ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８）１７（７）：ｐ．７１９‐７２８ Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．，１９７１，１２３：ｐ．６７‐７３ Ｍｏｏｒｅら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９９４，ｐ．３８‐４５ ＲｏｍｅｒｏらＣｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ，１９９４，７：ｐ．５５９‐５７５ Ｂａｒｒｅｒａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８４，４４：ｐ．５６５‐５６８ Ｂｌａｋｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８１，３３：ｐ．２１２‐２２２ Ｂｕｃｈａｎａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８１，３２：ｐ．９８５‐９９４ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９７８，２０：ｐ．２６７‐２７３

（発明の要旨）
本発明の一つの実施形態では、（ａ）疎水性タンパク質、（ｂ）そのタンパク質を可溶化するのに必要な量より少ない量の両性イオン界面活性剤および（ｃ）薬学的に受容可能なキャリア中でのそのタンパク質の溶解を維持するのに有効な量の薬学的に受容可能な非イオン性界面活性剤を含有し、ヒトに注射するのに適した無痛性の疎水性タンパク質組成物が提供される。本発明の実施形態では、感染体がヒトの病原体である場合の、非経口的に投与することを含むヒトの免疫化方法もまた提供される。

本発明の別な実施形態では、哺乳動物に投与するのに適し、薬学的に受容可能なキャリア中の疎水性タンパク質の無痛性免疫原性組成物の製法が提供される。その方法は、（ａ）その疎水性タンパク質を両性イオン界面活性剤で可溶化して第一の組成物を形成し、（ｂ）その第一の組成物をそれよりも疼痛が小さくなるように改変する、段階を含む。本発明のそのほかの実施形態では、両性イオン界面活性剤とともに疎水性タンパク質を含む組成物の改変方法が提供され、その方法には（ｉ）両性イオン界面活性剤を希釈する、（ｉｉ）両性イオン界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤と変える、および（ｉｉｉ）疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤を加えるが両性イオン界面活性剤の濃度を一定に保つこと、が含まれる。別の実施形態では、改変段階が両性イオン界面活性剤の希釈であって、その疎水性タンパク質は沈殿状態で存在するものである。

本発明のさらに別の実施形態では、疎水性タンパク質と両性イオン界面活性剤とを含む免疫原性組成物を哺乳動物に投与する際に伴う疼痛の低減方法が提供される。その方法とは、改変前の組成物と比較して疼痛が低減するように組成物を改変し、その改変免疫原性組成物を投与することを含むものである。本発明のほかの実施形態では、両性イオン界面活性剤とともに疎水性タンパク質を含む組成物の改変方法が提供され、（ｉ）両性イオン界面活性剤を希釈する、（ｉｉ）両性イオン界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤と変える、および（ｉｉｉ）疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤を加えるが両性イオン界面活性剤の濃度を一定に保つこと、が含まれる。別の実施形態では、改変段階が両性イオン界面活性剤の希釈であって、その疎水性タンパク質は沈殿状態で存在するものである。

特定の実施形態では、両性イオン界面活性剤はその最終濃度がＣＭＣ（限界ミセル濃度）未満のｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネートであって、非イオン性界面活性剤はその最終濃度がＣＭＣ超のα‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である。

本発明の別の実施形態では、疎水性タンパク質の溶解性は非イオン性界面活性剤中で維持される。本発明の代替の実施形態では、改変の段階が両性イオン界面活性剤の希釈であって、疎水性タンパク質は沈殿した状態にある。

本発明のある実施形態では、疼痛はラットでの足蹠試験モデルで計測される。ほかの実施形態では、改変組成物が改変前の組成物と比較してラットでの足蹠試験モデルで計測される疼痛が少なくとも約５０％低下する。

本発明のさらに別の実施形態では、疎水性タンパク質と両性イオン界面活性剤とを含む免疫原性組成物を哺乳動物に投与することに伴う疼痛の低減方法が提供される。その方法には、改変前の組成物と比較してラットでの足蹠試験モデルで計測されるものとしての傷みが低減するように組成物を改変し、その改変免疫原性組成物を投与する工程が含まれ、その改変組成物は改変前の組成物と比較してラットでの足蹠試験モデルで計測されるものとしての疼痛が少なくとも５０％低減するものとする。

本発明のほかの実施形態では、免疫原性組成物中の疎水性タンパク質の溶解性を維持する方法が提供され、その方法には疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤中で疎水性タンパク質を可溶化する工程が含まれ、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤がα‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である。

本発明の特別な実施形態では、疎水性膜タンパク質を含み、疼痛を伴わない組成物でヒトを免疫化する方法が提供され、その方法には最終の処方物において疎水性タンパク質の溶解性を維持するための薬学的に受容可能な界面活性剤としてのＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を選択する工程が含まれ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００の濃度はＣＭＣ超である。

本発明のある実施形態では、両性イオン界面活性剤はｎ‐オクチル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート、ｎ‐デシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート、ｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート、ｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート、３‐（Ｎ，Ｎ‐ｎ‐ヘキサデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート、３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐１‐プロパンスルホネート、３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐２‐ヒドロキシ‐１‐プロパンスルホネートおよびｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルグリシンから成る群から選択される。本発明の特別な実施形態では、両性イオン界面活性剤はｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネートである。

本発明のさらに別の実施形態では、非イオン性界面活性剤はα‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキソ‐１，２‐エタンジイル）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートおよびポリオキシエチレン（３５）ラウリルエーテルから成る群から選択される。本発明の特別な実施形態では、非イオン性界面活性剤はα‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である。

本発明のある実施形態では、両性イオン界面活性剤は最終濃度がそのＣＭＣ未満のｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネートであり、非イオン性界面活性剤は最終濃度がそのＣＭＣ超のα‐〔４‐〔１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である。

本発明の特別な実施形態では、疎水性タンパク質は内在性膜タンパク質である。本発明のほかの実施形態では、内在性膜タンパク質は細菌、ウイルス、寄生生物およびプリオンから成る群から選択される感染体に由来するものである。ある実施形態では、感染体は細菌であって、内在性膜タンパク質はポーリンである。特定の実施形態では、内在性膜タンパク質は淋菌のポーリンまたは髄膜炎球菌のポーリンである。

本発明の一つの実施形態では、疼痛を引き起こす組成物の界面活性成分を、傷みを引き起こさない界面活性剤による希釈、交換または添加で改変して、疼痛を引き起こさない組成物を製造する。本発明の特別な実施形態では、改変組成物は改変前の組成物と比較してラットでの足蹠試験モデルで計測されるものとしての疼痛が少なくとも５０％低減する。本発明の特定の実施形態では、改変組成物は改変前の組成物と比較してラットでの足蹠試験モデルで計測されるものとしての疼痛が少なくとも約７５％低減する。本発明の別の実施形態では、希釈または交換された組成物は改変前の組成物と比較してラットでの足蹠試験モデルで計測されるものとしての疼痛が少なくとも約９０％低減する。

（発明の詳細な説明）
本発明の実施形態では、疎水性膜タンパク質のような疎水性タンパク質の組成物、特に好ましい認容性の免疫原性組成物、が提供される。本発明の実施形態では、その組成物の製法もまた提供される。

疎水性タンパク質を抗原とする免疫原性組成物の製法はこれまで開示されてきたが、これらの組成物には、哺乳動物に注射する際に疼痛を引き起こすことが既にわかっている精製用の界面活性剤、あるいはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリソルベート８０）またはＴＷＥＥＮ（登録商標）２０のようにある種の疎水性タンパク質を可溶化できないマイルドな界面活性剤が含まれている。たとえば、内在性膜タンパク質のような可溶化が難しい疎水性タンパク質では、双性イオン性界面活性剤を用いて細胞膜から単離し精製を行なってきた。しかしながら、本発明の発見の一つは、これらの免疫原性組成物中に両性イオン界面活性剤が存在することによって、注射時にヒトおよびラットで疼痛が起こり、許容されないレベルまで忍容性が著しく低下するということである。

予想外であったが、限界ミセル濃度未満の非イオン性界面活性剤または両性イオン界面活性剤を含有する溶液中に加えられる疎水性タンパク質を含む免疫原性組成物が、投与対象に対する認容性が優れていることがわかった。本発明はこの発見に関わる。本発明の別の実施形態では、疼痛が少ないか疼痛を引き起こさない界面活性剤がその限界ミセル濃度超のレベルで添加される一方、疼痛を引き起こす界面活性剤の濃度は一定に保っておく。その結果得られる組成物は対象に投与される際の認容性が改善される。本明細書で用いられる場合の、「改善された忍容性」を有する免疫原性組成物とは、疎水性膜タンパク質と、対象に注射する際に界面活性剤成分として０．０５％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３‐１４のみを含む疎水性タンパク質の投与用の免疫原性組成物と比較して、実質的に疼痛が少ない界面活性剤とを含む免疫原性組成物のことを指す。

ヒトでの臨床試験では、予防免疫原性組成物候補として組換え淋菌ＰｏｒＢ（“ｒＰｒｏＢ”）が試験された。その免疫原性組成物は、１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）および０．０３％（ｗ／ｖ）Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）（“Ｚｗ”）３‐１４含有の０．５ｍｌ中に、５０μｇの組換え淋菌ポーリン（“ＧＣｒＰｏｒＢ”）を含むもので、Ｚｗ３‐１４はポーリンを可溶化する双性イオン性界面活性剤である。しかしながら、この組成物を注射すると、注射した部分の疼痛が許容できないレベルであるため認容性に乏しかった。ＧＣｒＰｏｒＢの投与を受けた８名の被験者の各々では、アジュバントに関わらずに即時に疼痛を経験した（３名は激痛、５名は中程度の疼痛）。尚、アジュバントとしては３‐Ｏ‐脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（Ｃｏｒｉｘａ社製、米国、モンタナ州、ハミルトン市）、リン酸アルブミンまたはＭＰＬ＋リン酸アルブミンとし、さらにアジュバントなしでもそれぞれ２回行なった。その疼痛は注射後２０分以内で寛解した。

本発明の実施形態によると、組換えサブユニット免疫原性組成物における疼痛の源泉が部分的に解明されることになった。注射時の疼痛は、非経口免疫原性組成物の認容性に影響する一連の臨床上の問題となるものである。前述の疼痛は、アジュバントに関わらずすべてのＧＣｒＰｏｒＢ免疫原性組成物分において起こったため、特別なアジュバント、またはアジュバントの免疫原性組成物との相互作用によるものではないと思われた。その疼痛がポーリン自体、界面活性剤またはそれら二つの組合わせによるかどうかを判断する必要があった。ニュージーランド白色ウサギでのＧＣｒＰｏｒＢ免疫原性組成物の試験では、毒性の明白な徴候は見られず、血液学的、化学的または病理学的データにおいても臨床上のはっきりしたいかなる異常も認められなかった。接種部位の組織病理学的スコアは、ＧＣｒＰｏｒＢタンパク質によるいかなる明確な副作用も示唆しなかった。注射部位でのまれな中程度の反応（浮腫および紅斑）は、短時間見られたが、どのような特異的抗原またはアジュバントに関連するものでもなかった。認容性のあるＧＣｒＰｏｒＢを製造するためには、疼痛の原因を判断する動物試験モデルを用いる必要があった。本発明の実施形態では、この試験の結果が部分的にベースになっている。

動物試験モデルであるラットの足舐め（足蹠）試験モデルは、抗生物質の注射に付随する疼痛の検出に以前から用いられてきたが（Ｃｅｌｏｚｚｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８０，４：２５８‐１８９；Ｃｏｍｅｒｓｋｉら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１９８６，６：３３５‐３３８）、今回このモデルを用いた。このモデルでは、注射された側の脚をラットが上げ、舐め、噛む時間をモニタリングするものである。このモデルでは、ＧＣｒＰｏｒＢの可溶化に用いた界面活性剤、すなわちＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３‐１２またはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３‐１４が、注射時の疼痛の原因であることが示された。同様のいくつかの試験では、界面活性剤であるオクチル‐グルコシドおよびＣＨＡＰＳ（登録商標）（３‐（（コールアミドプロピル）‐ジメチルアンモニオ）‐１‐プロパンスルホネートも、注射時に無視できない疼痛を引き起こすことがすでに示されていた。

当業者であれば、疼痛についてのほかのインビボ試験モデルまたはインビトロでの疼痛の相関性試験を用いて、疼痛を引き起こす免疫原性組成物が無痛性の免疫原性組成物に改変された時点を決定することができることがわかるであろう。

一方、この問題の原因をはっきりさせるだけで、問題解決につながるとは予感してなかった。本発明の方法および組成物では、両性イオン界面活性剤を強力な非イオン性界面活性剤で希釈するか交換することで、注射時に許容範囲外の疼痛の反応を起こさない認容性のある処方物が得られるというさらなる発見が得られる。

本発明の実施形態では、両性イオン界面活性剤で疎水性タンパク質を精製し、さらに得られる免疫原性組成物の認容性を改善するために両性イオン界面活性剤の濃度を下げる方法が提供される。特に、本発明の実施形態では、疎水性膜タンパク質を含有し、被験者への注射時の疼痛のレベルが小さいかまたは疼痛がないサブユニット免疫原性組成物の製造を目的とするものである。

本発明の特定の実施形態では、疎水性タンパク質はｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネ−ト（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３‐１４）のような両性イオン界面活性剤中に可溶化されている。「両性イオン界面活性剤」という用語は、全体は電気的に中性であるが、正に荷電した部分と負に荷電した部分とを持ち、疎水性タンパク質を溶解するのに通常用いられる界面活性剤のことを指す。当業者であれば、本発明の一つの実施形態を、ほかの両性イオン界面活性剤または尿素中に最初に可溶化された疎水性タンパク質の免疫原性組成物にも適用可能であることがわかるであろう。両性イオン界面活性剤の非限定的な例には、ｎ‐オクチル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート：Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３‐８、ｎ‐デシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート：Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３‐１０、ｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート：Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３‐１２、ｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート：Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３‐１４、３‐（Ｎ，Ｎ‐ｎ‐ヘキサデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート：Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３‐１６、３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐１‐プロパンスルホネート：ＣＨＡＰＳ（登録商標）、３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐２‐ヒドロキシ‐１‐プロパンスルホネート：ＣＨＡＰＳＯ（登録商標）、ｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルグリシン：ＥＭＰＩＧＥＮ ＢＢ（登録商標）、およびラットでの足蹠試験モデルで疼痛を生じさせるそのほかの両性イオン界面活性剤が含まれる。

当業者であれば、細胞膜からまたは組換え発現後の封入体から本発明の疎水性タンパク質を可溶化またはリフォールディングするのに、両性イオン界面活性剤の組合わせを用いることもできることがわかるであろう。

本発明の特定の実施形態では、組成物中の両性イオン界面活性剤は非イオン性界面活性剤で希釈または交換される。「表面活性剤」という用語は、極めて低濃度で用いられると、水の表面張力を大きく低下させることができる界面活性化薬剤を指す。「界面活性剤」という用語は、非極性の疎水性部分と極性の親水性部分とを有する両性分子である、ある種の表面活性剤を指す。「界面活性剤」および「表面活性剤」という用語は、互換可能なように用いられる。界面活性剤はリン脂質二重膜中に入り込み、脂質とタンパク質とを可溶化して膜を破壊する。界面活性剤分子の疎水性部分は、炭化水素にひきつけられる一方、親水性部分は水に強くひきつけられる。いくつかの界面活性剤は天然物であるが、ほとんどのものは洗浄用および油と水との混合物の分散用に開発された合成分子である。界面活性剤の極性（親水性）末端は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の場合のような電荷を帯びた（イオン性）もの、またはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）の場合のような電荷を帯びていない（非イオン性）ものがあり、あるいは双性イオン性界面活性剤の場合のように正に荷電した部分と負に荷電した部分とを有するものがあり得る。

「非イオン性界面活性剤」という用語は、荷電していない界面活性剤として作用する分子を指す。その親水性基は帯電種ではなく、別の水溶性の高いある部分、たとえば短い水溶性のポリマー鎖から形成されている。伝統的に、非イオン性界面活性剤には、親水性基としてポリ（エチレンオキシド）鎖が用いられてきた。ポリ（エチレンオキシド）は水溶性ポリマーであり、非イオン性界面活性剤において用いられるものは、モノマーユニットの長さが典型的には１０‐１００である。親水性基としてポリ（エチレンオキシド）鎖を用いる界面活性剤には、一般には二種類のもの、すなわちアルコールエトキシレートおよびアルキルフェノールエトキシレートがある。当業者であれば、本発明の実施形態によって、ほかの非イオン性界面活性剤で希釈または交換された組成物も得られることがわかるであろう。非イオン性界面活性剤の非限定的な例には、Ｎ，Ｎ‐ビス（３‐Ｄ‐グルコン‐アミドプロピル）コールアミド：ＢｉｇＣＨＡＰ（登録商標）、α‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）：Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート：ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（商標）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート：ＴＷＥＥＮ８０、ポリオキシエチレン（３５）ラウリルエーテル：ＢＲＩＪ（登録商標）３５、エチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）_１１：ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０，ＮＰ４０、ｎ‐オクチル‐ｂ‐Ｄ‐グルコピラノシド：ＯＧ、および疎水性タンパク質を可溶化するほかの非イオン性界面活性剤が含まれる。当業者であれば、非イオン性界面活性剤の組合わせを、疎水性タンパク質の可溶化および免疫原性組成物中のそのようなタンパク質の投与に付随する疼痛の低減にも用いることができることがわかるであろう。

本明細書で用いられる「疎水性」という用語は、ある物質が水をはじく傾向、あるいは水と混合しないかまたは水中に溶解しない傾向を指す。本明細書で用いられる「親水性」という用語は、ある物質が水に引き付けられる傾向、あるいは水中に溶解する傾向を指す。「疎水性タンパク質」という用語は、水に不溶かまたはごくわずか溶解するタンパク質を指す。疎水性タンパク質は、一般には水および水溶性イオン性化合物と最小限にしか会合を示さず，そのかわりに互いに会合するかまたは水相の外側の別の脂質と会合する。

「組成物」という用語は、保存用または投与用、あるいはその両方のための、被験者に直接投与されるのに好ましい水性媒体または水溶液を指す。本発明の一つの実施形態における組成物は、タンパク質、両性イオン界面活性剤および非イオン性界面活性剤を含有することができる。組成物については、免疫原性組成物、治療用組成物または診断用組成物のようなそれらの機能によって特徴づけることができる。

「免疫原性組成物」という用語は、広い意味で、その組成物中に存在する抗原に対する免疫反応を誘導させるために投与され得るいずれの組成物も指す。本発明の一つの実施形態の免疫原性組成物には、抗原性タンパク質またはペプチド、両性イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤が含有し得る。免疫原性組成物は、感染予防または感染者の治療に用いることができる。一般に免疫原性組成物には、免疫学的有効量の免疫原（たとえば抗原または感染体）および薬学的に受容可能なキャリアが含有され、所望によりアジュバントも含有される。

本明細書で定義される「単離された」という用語は、タンパク質またはペプチドが特定なソースから得られるかまたは分離されるという意味である。たとえば「Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから単離された」ということは、タンパク質またはポリペプチドがＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細菌細胞から得られたかまたは分離されたという意味である。単離された物質は、必ずしも必須要件ではないが、精製されているとよい。

本明細書で定義される「精製された」という用語は、対象のタンパク質またはポリペプチドが、該ポリペプチドと自然の状態で共存していた種々の別のタンパク質、脂質、核酸および炭水化物成分から実質的に分離され終わったことを指す。ほかの成分の残存量は、その量に関わらず免疫原性組成物中の精製物または抗原としての使用に干渉しないものとする。「精製された」という用語は、合成の際のアーチファクトを含んだままの合成ペプチド調製物を排除しようとするものではなく、またいくつかの不純物を含有する調製物を排除する意味の用語でもないが、その場合の調製物では、再現性のあるタンパク質またはポリペプチドの特性データ、たとえば分子量、糖残存量、クロマトグラフィーによる反応性および免疫原としての挙動、が示されていることが条件である。そのような特性は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、質量分析またはバイオアッセイ、さらに本分野で既知のそのほかの方法で評価することができる。

精製方法については当該分野ですでに知られている。たとえば、ポリペプチドおよびタンパク質は、調製用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、沈降クロマトグラフィー、塩析クロマトグラフィー、抽出および向流分配を含む種々の方法で精製することができるが、それらの方法に限定されるものではない。いくつかの目的に対しては、たとえば精製しやすいようにｔａｇ配列を付け加えたタンパク質またはポリペプチドを組換え発現系で製造することが好ましく、たとえば限定される例ではないが、ポリヒスチジン配列、あるいは抗体に特異的に結合するＦＬＡＧおよびＧＳＴのような配列が挙げられる。次にそのタンパク質およびポリペプチドは、適当な固相マトリックスでのクロマトグラフィーによって、宿主細胞粗製溶解物から精製することができる。あるいは、得られるタンパク質またはペプチドに対して生成された抗体を、精製用試薬として用いることができる。細胞は、遠心分離、マトリックス分離（たとえばナイロンウール分離）、パニングおよびそのほかの免疫学的分離法、除去（たとえば汚染細胞の補体除去）およびセルソーティング（たとえば蛍光活性化セルソーター〔ＦＡＣＳ〕）を含む種々の技法で精製することができる。それら以外の精製方法も可能である。精製した物質とは、もとから付随する細胞成分が約５０％未満、好ましくは約７５％未満、さらに最も好ましくは約９０％未満を含むものとすればよい。「ほぼ純粋な」ということは、当該分野で既知の通常の精製技術を用いて行なうことが可能な最高純度を示す。

本明細書で用いられる「約」または「およそ」という用語は、対象の値の５０％以内、好ましくは２０％以内、より好ましくは１０％以内、さらに好ましくは５％以内に入ることを意味する。あるいは「約」または「およそ」という用語は、使用できるツールがいかなる質的レベルの測定値であってもそれに依存するであろう種類の値に対して、その値が科学的に許容される誤差範囲内に収まり得ることを意味する。「約」または「およそ」という用語は、平均値の分散を規定するものでもある。ほかに言及がない場合は、すべての値はおよそのものであり、暗黙のうちに誤差範囲内に収まるものとする。

（界面活性剤組成物の改変）
本発明の実施形態では、疎水性タンパク質含有の免疫原性組成物の製法および投与法が提供される。その方法には、両性イオン界面活性剤を用いる疎水性タンパク質の可溶化またはリフォールディングが含まれる。本発明のある実施形態では、疎水性タンパク質溶液から成る界面活性剤組成物を非イオン性界面活性剤で改変して、改変前の組成物と比較してラットでの足蹠で計測されるような疼痛を低減することが提供される。本明細書で用いられる「改変」という用語は、（ｉ）両性イオン界面活性剤を希釈する、（ｉｉ）両性イオン性界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤と交換する、または（ｉｉｉ）疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤を加えるが、両性イオン界面活性剤の濃度を一定に保つ方法のうちの一つによって免疫原性組成物の認容性を改善する工程を指すものである。

本発明の一つの実施形態では、疎水性タンパク質から成る免疫原性組成物の製法が提供される。本発明の一つの実施形態では製法は、タンパク質を両性イオン界面活性剤で可溶化し、次にその両性イオン界面活性剤を非イオン性界面活性剤で希釈して両性イオン界面活性剤の濃度を下げる工程を含む。本発明の一つの実施形態では、両性イオン界面活性剤は少なくとも約２倍に希釈され、たとえば約０．０５％から約０．０２５％の濃度に希釈される。本発明の別の実施形態では、両性イオン界面活性剤は少なくとも約４倍に希釈され、たとえば約０．０５％から約０．０２％の濃度に希釈される。本発明の別の実施形態では、両性イオン界面活性剤は少なくとも約５倍に希釈され、たとえば約０．０５％から約０．０１％の濃度に希釈される。本発明の特別な実施形態では、両性イオン界面活性剤は少なくとも約７．５倍に希釈され、たとえば約０．０５％から約０．００６７％の濃度に希釈される。本発明の一つの実施形態では、両性イオン界面活性剤は少なくとも約１０倍に希釈され、たとえば０．０５％から約０．００５％の濃度に希釈される。本発明の別の実施形態では、両性イオン界面活性剤は少なくとも約１５倍に希釈され、たとえば０．０５％から約０．００３％の濃度に希釈される。本発明の一つの実施形態では、両性イオン界面活性剤は少なくとも約２０倍に希釈され、たとえば０．０５％から約０．００２５％の濃度に希釈される。当業者であれば、希釈率が上がると希釈工程は交換工程にとってかわられるようになることがわかるであろう。両性イオン界面活性剤は注射時に疼痛を引き起こし得るので、濃度を特にその臨界ミセル濃度未満にまで下げることで、投与時に無痛の組成物が得られる。当業者であれば、疎水性タンパク質、特にポーリン類のような疎水性膜タンパク質から成り、疼痛がないかまたは疼痛が少ない免疫原性組成物の利点がわかるであろう。

本発明の一つの実施形態では、疼痛が少ないか疼痛を起こさない界面活性剤が、疎水性タンパク質の溶解性を維持するのに充分なレベルまで添加される一方、疼痛を引き起こす界面活性剤の濃度は一定に保たれる。本発明の別の実施形態では、疼痛が少ないか疼痛を引き起こさない界面活性剤が、その臨界ミセル濃度超のレベルまで添加される一方、疼痛を引き起こす界面活性剤の濃度は一定に保たれる。特定の理論に結びつけようとするわけではないが、疼痛を引き起こす界面活性剤に疼痛を引き起こさない界面活性剤を加えると、両方の界面活性剤で混合ミセルが生成し、注射の際に起こる疼痛の低減または除去が達成される（認容性が改善されると考えられる）。実施例８を参照のこと。

本発明の一つの実施形態の免疫原性組成物の別の製法には、双性イオン性界面活性剤でタンパク質を可溶化し、次にその両性イオン界面活性剤を非イオン性界面活性剤と交換する工程が含まれる。界面活性剤の交換方法は、本領域で既知のものである。そのような技術の一つとして、イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。イオン交換クロマトグラフィー法では、最初に両性イオン界面活性剤含有溶液中にタンパク質を可溶化させる。その可溶化タンパク質を、予め同じ緩衝液で平衡化してあるＱ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、米国、ニュージャージー州、ピスキャタウエイ市）のようなイオン交換カラム上に装填する。結合したタンパク質を、適当な非イオン性界面活性剤含有溶液で洗浄する。非イオン性界面活性剤含有の生理食塩水のリニアグラジエントを用いてタンパク質を溶離させる。次に溶離した物質を透析し、孔径０．２２μｍの膜フィルターを通過させ、そのタンパク質濃度を測定する。当業者は、本分野で既知のそのほかの交換技法でも、疼痛を起こす界面活性剤を疼痛を起こさない界面活性剤に交換するのに使用できることを認識するであろう。そのような技法には、たとえば膜透析およびゲルろ過クロマトグラフィーが含まれる。

本発明の実施形態では、両性イオン界面活性剤はＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３‐８、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３‐１０、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３‐１２、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３‐１４またはＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３‐１６界面活性剤のようなＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）界面活性剤である。

本発明の特定の実施形態では、両性イオン界面活性剤中に可溶化したタンパク質は、非イオン性界面活性剤であるポリエチレングリコールｔ‐オクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ‐１００）で希釈されるかあるいは交換される。当業者であれば、本発明の実施形態では、ほかの非イオン性界面活性剤で希釈または交換されている両性イオン界面活性剤中に可溶化した疎水性タンパク質の免疫原性組成物も得ることができることがわかるであろう。特定の実施形態では、ポリエチレングリコールｔ‐オクチルフェニルエーテルの最終濃度は、約０．０１％‐約０．２％である。別の実施形態では、ポリエチレングリコールｔ‐オクチルフェニルエーテルの最終濃度は、約０．０５％である。

本発明の実施形態では、希釈または交換されて最終濃度が下がり、結果として組成物による疼痛が少なくなるような両性イオン界面活性剤を含有する組成物が提供される。疼痛の低減は、ラットでの足蹠疼痛試験によって測定できる。本発明の特定の実施形態では、ラットでの足蹠疼痛試験で計測した場合、疼痛は少なくとも５０％低減する。本発明の別の特定の実施形態では、両性イオン界面活性剤は臨界ミセル濃度未満にまで低下させる。

本明細書で用いられる「疼痛」という用語は、苦痛感を指す。疼痛は、炎症、虚血、機械的またはそのほかの刺激による実際のあるいは潜在的な傷または組織障害に伴うものである。神経系は、多数の感覚受容器からの入力を受ける。感覚器および運動ニューロンの回路は、末梢神経系内に含まれている。これらの回路は脳および脊髄を含み、主として介在ニューロンから構成されている中枢神経系（ＣＮＳ）へ情報を送り、さらにそれから情報を受ける。極めて特殊化した感覚受容細胞類は、特定の環境刺激に反応し、脳（たとえば味および匂いの受容体の場合）または末梢感覚ニューロン（たとえば疼痛および伸展の受容体の場合）に直接それらの出力を送る。本明細書で用いられる「侵害性」という用語は、有害刺激を検出する神経機序のことを指す。侵害性には、末梢神経末端による有害刺激の伝達、およびそれらの信号を中枢神経系の疼痛感受性（侵害性）ニューロンに伝送することの二つの段階が含まれる。

本明細書で用いられる「ラットでの足蹠の疼痛」または「ラットでの足舐め行動」の試験またはモデルとは、注射の際に特定の処方物によって引き起こされる疼痛を測定するのに用いられる試験またはモデルを指す。その試験は、注射部位に疼痛を引き起こすことが知られている組成物群、並びに注射部位に疼痛を引き起こさないことが知られている組成物群によって、疼痛を誘発するのか評価するために組成物を、同一種で体重がほぼ同じラットの足蹠内に一様に注射することから成る。各試験および対照試験には、統計的に有意な数の動物を用いなければならない。注射後に動物を鏡付きケージ内に置き、注射された側の脚のちぢこまり、上げ、舐めまたは噛みの行動を、技術者（好ましくは免疫原性組成物の区別を知らされていない技術者）が２０‐３０分間観察する。ストップウオッチを用いて疼痛反応行動に費やされた時間を記録し、１０分間の合計を取る。

本明細書で用いられる「疼痛が少ない」という成句とは、組成物に関して、ラットでの足蹠疼痛試験によって計測される際の疼痛反応の時間または強さあるいはその両方が、改変前の組成物に比べて低下するように改変されることを指す。本明細書で用いられる「疼痛の５０％低下」という成句は、改変後および改変前の免疫原性組成物を同じ容量および同じ方法で投与した場合に、ラットでの足蹠疼痛試験で計測される際の疼痛反応に費やされる時間が、同じ観察時間で５０％低下することを指す。各群の動物数は、統計的に有意な数とする。異なる注射群の観察は、組成物の区別を知らされていない同じ技術者によって行なわれるのが好ましい。

本明細書で用いられる「臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）」という用語は、特定の界面活性剤の分子の単量体が密集してミセルを形成する最低限の界面活性剤の濃度を指す。濃度の単位としては、ｍＭまたは容量％（Ｖ／Ｖ）がしばしば用いられる。それについては、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｔａｎｆｏｒｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（第２版、１９８０）による“Ｔｈｅ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｉｃｅｌｌｅｓ Ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”を参照にこと。非常に低い濃度域では界面活性剤は、単離分子として純水に溶解する。濃度が上がると、その疎水性効果によってその分子はミセルを形成し始める。これらは、分子の外側に親水性部分が面し、中央に疎水性部分が密集している微小球状の凝集体である。ミセルを形成するときのＣＭＣは界面活性剤ごとの特性を持ち、その疎水性部分および親水性部分の構成体に左右される。当業者であれば、ＣＭＣ値が温度、圧力などに依存するため、しばしばその値が範囲で示されることがわかるであろう。既知の限界ミセル濃度のいくつかを以下のリストに示す。

界面活性剤分子の混合物を含む混合ミセルは容易に形成する。その理由は分子内に両親媒性分子の会合力が非特異的に働き、生成するミセルが液体様コアを持つためである。本明細書で用いられる「混合ミセル」とは、Ｚｗ３‐１２とＴＸ‐１００との混合ミセルのような異なる界面活性剤分子の混合物を含むミセルを指す。

（タンパク質および抗原）
「抗原」という用語は、免疫系によって認識され得るいずれの物質も指し、そのような認識の際に特異的な免疫反応が生じ、一般には特異的な抗体の産生または細胞性免疫が生じることとなる。「抗原」という用語には、細菌またはウイルスの全体を含めることができるが、免疫原性組成物は病原体由来のタンパク質またはペプチドのようなサブユニット抗原をしばしば含む。サブユニット抗原は、細菌、ウイルス、寄生生物、真菌または腫瘍細胞のような、各種の感染体由来とすることができる。

大腸菌を含めた多くの細菌は、細胞膜のまわりに外膜を持つ。外膜には、種々の細孔形成性のポーリンタンパク質が貫通しており、それらは外側の脂質二重膜を通して６００ダルトンまでの選択された親水性溶質を拡散可能にするものである。ポーリン類は、脂質二重膜と交差する細孔形成性膜貫通型タンパク質であって、β‐バレル型タンパク質構造を有する。いくつかの多重回膜貫通型タンパク質は、α‐ヘリックス類よりもむしろ閉鎖型のβ‐シート（β‐バレル）状に配置された膜貫通型セグメントを有する。そのバレルは、円筒構造内に巻いて入るように曲がった１６回らせん化逆平行β‐シートから形成されている。極性側鎖は内側表面の水性チャンネルに沿って並ぶ一方、非極性側鎖は、バレルの外側から突き出て脂質二重膜の疎水性コアと相互作用する。そのようなタンパク質で最も研究された例は、多くの細菌の外膜中に見られるポーリン類である。それらは、完全な原子構造がＸ線結晶学によってすでに解明されている数少ない膜貫通型タンパク質である。

本発明の例示の実施形態では、抗原がポーリンである免疫原性組成物が提供される。当業者であれば、ある種のポーリンが優れた免疫原性組成物の候補と考えられることだわかる。たとえば、ポーリン（Ｐｏｒ）Ａは、自然感染すると抗体を誘導させるＢ型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの莢下膜タンパク質抗原であって（Ｌｅｈｍａｎｎ，Ａ．Ｋ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９９，６７：２５５２）、髄膜炎球菌の優れた免疫原性組成物候補である（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｔ，Ｅ．Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２０００，１８：１３３４）。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａｌ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの細菌細胞表面にＰｏｒタンパク質が存在するために、それらは比較的保存され、外膜中に豊富に存在する。Ｐｏｒタンパク質は、有効な免疫原性組成物の候補抗原として注目されてきた。ＨｅｃｋｅｌｓＪ．Ｅ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ，８：２２５‐２３０（１９９０）を参照のこと。複数の分子疫学的研究では、自然感染の間に産生されるＰｏｒ特異的抗体類が、同一のＰｏｒ血清型の淋菌による再感染を部分的に保護し得ることが示唆されている（Ｐｌｕｍｍｅｒ，Ｆ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８９，８３：１４７２‐１４７６）。構造的特性および免疫化学的特性に基づき、ＰｏｒＡおよびＰｏｒＢと称されるＰｏｒタンパク質類の二つの主要な血清型がこれまで認識され、両者は相互排他的対立遺伝子によってコードされている。当業者であれば、哺乳動物に投与するための淋菌および髄膜炎球菌のポーリン類を含めた疎水性膜タンパク質含有の疼痛がないかまたは疼痛の少ない組成物を製造することが重要であることがわかるであろう。

ＰＩＡ遺伝子含有のｐＵＮＣ７プラスミドを包含する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、米国北部地域研究所（ＮＲＲＬ）において、１９８７年１１月１３日にアクセッションナンバーＮＲＲＬ＃Ｂ‐１８２６３ですでに寄託されている。ＰＩＢ遺伝子含有のｐＵＮＣＨ２５プラスミドを包含する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、米国培養保存収集機関（ＡＴＣＣ）において、アクセッションナンバー６７７７５ですでに寄託されている。

「膜タンパク質」とは膜に会合するタンパク質のことである。異なる膜タンパク質類は、異なる方式で膜に会合している。多くの膜タンパク質は脂質二重膜を通って延在し、その一部分は膜のいずれかの側にある。これらの膜貫通型タンパク質類は、その隣接部位と同様に両親媒性であって、疎水性の領域と親水性の領域とを有する。それらの疎水性領域は膜を通過し、二重膜内部の脂質分子の疎水性尾部と相互作用する。それらの疎水性領域は、膜の一方の側または他方の側で水にさらされる。これらの膜タンパク質のいくつかの疎水性は、脂質二重膜の膜小葉部内に挿入された脂肪酸鎖の共有結合によって増大する。ほかの膜タンパク質は、細胞質ゾル内またはペリプラズム内に全体が配置されており、脂肪酸鎖またはそれ以外のタイプの脂質鎖との一個または複数の共有結合でのみ二重膜に会合するものである。さらにそれ以外の膜タンパク質は、真核細胞の細胞外面またはグラム陰性細菌細胞の外膜に完全に表出し、一個の共有結合でのみ二重膜に結合している。

脂質二重膜の疎水性内部に全く延在していないいくつかのタンパク質は、ほかの膜タンパク質との非共有結合によって膜の一方の面または別の面に結合している。それらのタンパク質の多くは、タンパク質間の相互作用に干渉するが脂質二重膜を損傷しない、イオン強度が極めて高いかまたは低い溶液、あるいは極端なｐＨの溶液にさらすことによるような、比較的穏やかな抽出手順によって膜から遊離させることができ、それらのタンパク質は便宜上、「膜周辺タンパク質」と呼ばれる。これに対して膜貫通型タンパク質では、多くのタンパク質が脂質基によって二重層内に収容されており、いくつかのほかの強く結合したタンパク質は前述の方法によっては遊離させることができず、それらはそのため「膜一体化タンパク質」と呼ばれる。一般に膜貫通型タンパク質（およびいくつかのほかの強く結合した膜タンパク質）は、両性イオン界面活性剤のような疎水性会合を崩し脂質二重層を破壊する薬剤によってのみ、可溶化することができる。

当業者であれば、本発明の疎水性タンパク質が組換えＤＮＡ法によって製造でき、既知の方法を用いて細菌または真核細胞中で発現させることができることがわかるであろう。さらにその疎水性タンパク質は、尿素またはグアニジンを用いてまず封入体から回収してその各々のタンパク質分子を可溶化できることも、当業者であればわかるであろう。次にその可溶化（変性）タンパク質は、両性イオン界面活性剤、その配合物、または両性イオン界面活性剤とそれ以外の界面活性剤との配合物を含有する溶液で交換または希釈してリフォールディングされる。

（組成物および処理方法）
本発明の実施形態では、免疫療法または免疫予防用の動物に投与するための、あるいはそれ以外の治療または診断の目的のための免疫原性組成物が提供される。それらの組成物は、注射または許容できない疼痛反応を誘発させないそれ以外の投与経路で投与することができる。それらの免疫原性組成物は、アジュバントおよび／またはキャリアを含むこともできる。本発明の実施形態では、特定疾患の予防または治療のために投与される免疫学的に有効な投与量の組成物も提供される。たとえば淋病、髄膜炎、またはその他グラム陰性細菌疾患の予防または治療のためにそれらの組成物は投与することができる。

本発明の一つの実施形態では、免疫原性組成物は哺乳動物に投与される。本明細者で用いられる「哺乳動物」という用語は、哺乳動物網内の種群と定義される。哺乳動物の非限定的な例には、ヒツジ、ブタ、ウシ、並びにラットおよびマウスのようなげっ歯類、さらにサル、類人猿およびヒトのような霊長類が挙げられる。

「免疫学的に有効な投与量」という用語は、所望の免疫反応を誘発させるのに充分な量の化合物または組成物のことを指す。一般に、本発明の実施形態の免疫原性組成物に対して適する免疫学的に有効な量または投与量の選択は、使用される特定の免疫原性組成物、並びに免疫化される対象の特に全般的健康状態および体重を含めた体調に基づいても選択されるであろう。そのような選択および有効投与量の上げ下げの調節は、当業者に知られている。明確な副作用が伴わない免疫反応を誘発させるのに求められる活性成分の量は、用いる組成物に依存して変わる。

ある実施形態では、免疫原性組成物は一種または複数のアジュバントを含有するであろう。本明細書で用いられる「アジュバント」という用語は、本発明の特定の実施形態の免疫原性組成物の免疫原性を上昇させる物質のことである。

多くのサトカインまたはリンホカインは免疫調節活性を有することが明らかにされており、したがってアジュバントとして用いることができ、その中には以下に挙げるものが含まれるが、それらに特に限定されない；インターロイキン、１‐α，１‐β，２，４，５，６，７，８，１０，１２（米国特許第５０７８９９６号参照），１３，１４，１５，１６，１７および１８（およびそれらの変異体類）、インターフェロン‐α，βおよびγ、顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子（米国特許第５０７８９９６号およびＡＴＣＣアクセッションナンバー３９９００）、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＳＦ、ならびに腫瘍壊死因子αおよびβ。さらに本発明の特定の実施形態で有用なそのほかのアジュバントにはケモカインが挙げられ、それにはＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１α、ＭＩＰ‐１βおよびＲＡＮＴＥＳが含まれるが、それらに限定されない。セレクチン、たとえばＬ‐セレクチン、Ｐ‐セレクチンおよびＥ‐セレクチン、のような接着分子類も、アジュバントとして有用である。さらに別のアジュバントには、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ‐１およびＭａｄＣＡＭ‐１のようなムチン様分子、ＬＦＡ‐１、ＶＬＡ‐１、Ｍａｃ‐１およびｐ１５０．９５のようなインテグリン・ファミリーのメンバー、ＰＥＣＡＭあるいはＩＣＡＭ‐１、ＩＣＡＭ‐２およびＩＣＡＭ‐３のようなＩＣＡＭ類、ＣＤ２並びにＬＦＡ‐３のような免疫グロブリン・スーパーファミリー、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌのような補助刺激分子類、血管成長因子、神経成長因子、線維芽増殖因子、上皮増殖因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ‐１および血管内皮増殖因子を含む増殖因子類、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、並びにＦｉｔ，Ａｐｏ‐１、ｐ５５、ＷＳＬ‐１、ＤＲ３，ＴＲＡＭＰ，Ａｐｏ‐３、ＡＩＲ，ＬＡＲＤ，ＮＧＲＦ，ＤＲ４、ＤＲ５，ＫＩＬＬＥＲ，ＴＲＡＩＬ‐Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２およびＤＲ６を含む受容体分子類が含まれるが、それらに限定されない。さらに別のアジュバント分子類にはカスパーゼ（ＩＣＥ）が含まれる。それらについては、開示内容が参照によって本明細書に組込まれている国際公開第９８／１７７９９号および国際公開第９９／４３８３９号を参照のこと。

免疫反応を増大させるのに用いられる適したアジュバントにはさらに、米国特許第４９１２０９４号で開示され、参照によって本明細書に組込まれているＭＰＬ（登録商標）（３‐Ｏ‐脱アセチル化モノホスホリルリピドＡ；Ｃｏｒｉｘａ社製、米国、モンタナ州、ハミルトン市）が含まれるが、それに限定されない。またアジュバントとして用いるのに適したものには、合成リピドＡ類縁体類、またはアミノアルキルグルコサミンリン酸化合物類（ＡＧＰ）、あるいはそれらの誘導体類または類縁体類があり、それらはＣｏｒｉｘａ社（モンタナ州、ハミルトン市）から購入でき、参照によって本明細書に組込まれている米国特許第６１１３９１８号に記載されているものである。ＡＧＰの一つとしては、２‐〔（Ｒ）‐３‐テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ〕エチル‐２‐デオキシ‐４‐Ｏ‐ホスホノ‐３‐Ｏ‐〔（Ｒ）‐３‐テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ〕‐２‐〔（Ｒ）‐３‐テトラデカノイルオキシテトラデカノイル‐アミノ〕‐ｂ‐Ｄ‐グルコピラノシドが挙げられ、５２９としても知られている（正式にはＲＣ５２９として知られる）。この５２９アジュバントは、水性液または安定エマルションとして製剤化されている。

さらに別のアジュバントには、ミネラルオイルと水とのエマルション、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等のようなアルミニウム塩類（ａｌｕｍ）、アムルゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ），Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ‐ラクチド‐ポリラクチド／グリコシド、プルロニックポリオール類、ムラミルジペプチド類、死滅化Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、米国特許第５０５７５４０号に記載され、参照として本明細書に組込まれているＳｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）ＱＳ‐２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ社製、米国、マサチューセッツ州、フラミンガム市）のようなサポニン類、それから生成されるＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激性複合体）のような粒子類、結核菌、細菌性リポ多糖類、ＣｐＧ部位含有のオリゴヌクレオチド類（米国特許第６２０７６４６号、本明細書で参照刊行物として取り上げられている）のような合成ポリヌクレオチド類、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ‐Ｋ６３、ＬＴ‐Ｒ７２、ＰＴ‐Ｋ９／Ｇ１２９、が含まれ、それらについては、たとえば本明細書に参照刊行物として取り上げられている国際公開第９３／１３３０２号および国際公開第９２／１９２６５号を参照のこと。

アジュバントとして有用なものには、国際公開第００／１８４３４号中に記載されているものも含むコレラ毒素類およびその変異体類（２９位のアミノ酸であるグルタミン酸が別のアミノ酸（アスパラギン酸を除く）、好ましくはヒスチジンに置換したもの）も挙げられる。同様のコレラ毒素類またはその変異体類が、国際公開第０２／０９８３６８号に記載されている（１６位のアミノ酸であるイソロイシンが別のアミノ酸に置き換わり、場合によりさらに６８位のアミノ酸であるセリンが別のアミノ酸に置き換わり、および／または７２位のアミノ酸であるバリンが別のアミノ酸に置き換わっている）。ほかのコレラ毒素類には、国際公開第０２／０９８３６９号に記載のもの（２５位のアミノ酸であるアルギニンが別のアミノ酸に置き換わり、および／または４９位に１個のアミノ酸が挿入され、および／または３５位と３６位とに２個の網の酸が挿入されている）が挙げられる。

種々の投与経路が利用可能である。言うまでもないが、選択される特定の投与形態は、種々の投与経路を利用することができる選択される特別な免疫原性組成物、治療される特別の条件および治療上の効力に求められる投与量に依存するものである。本発明のある実施形態の方法は、一般的に、医療上許容される投与法、すなわち臨床上許容されない副作用が発生せず、有効な免疫反応レベルが生じる、いかなる投与法でも行なうことができる。投与経路の例としては、非経口（たとえば静脈内、動脈内、皮内、経皮、筋肉内、皮下、腹腔内）、経粘膜（たとえば経口、直腸内、経鼻、経膣、経気道）および経皮（局所）が挙げられるが、それらに限定されない。

免疫原性組成物の好ましい投与方法には、非経口投与法がある。非経口投与に用いられる溶液類または懸濁物類には、注射用水、生理食塩水、不揮発性油類、ポリエチレングリコール類、グリセリン、ポリエチレングリコールまたはそのほかの合成溶媒類のような滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類のような抗菌剤類、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤類、エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤類、酢酸塩類、クエン酸塩類またはリン酸塩類のような緩衝剤類、および塩化ナトリウムまたはＤ‐グルコースのような張度調節剤類の成分が含まれる。ｐＨについては、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整することができる。非経口用処方物については、アンプル類、使い捨てシリンジ類、あるいはガラス製またはプラスチック製の多回投与用バイアル内に封入することができる。

「薬学的に受容可能な」という用句は、生理学的に認容であって、投与時にアレルギー反応または同様の厄介な反応（たとえば胃の不調、眩暈など）を一般には発生させない分子体または組成物のことを指す。特に免疫原性組成物をヒトに用いる場合では、「薬学的に受容可能な」という用語は、監視機関（たとえば米国食品医薬品局）に承認されたか、あるいはヒトまたは動物での使用に一般的に認められた薬局方（たとえば米国薬局方）に収載されているという意味であることが好ましい。

「キャリア」という用語は、化合物が投与される際に伴う希釈剤、アジュバント、賦形剤または媒体を指す。滅菌水または滅菌生理食塩水、グルコース水溶液、およびグリセリン溶液類は、キャリアとして、特に注射用溶液として用いるのが好ましい。適した医薬用キャリアの例については、Ｅ，Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。適合するキャリアは当業者に明らかであって、投与経路に大部分依存するであろう。

化合物の毒性および効力は、たとえば細胞培養アッセイ類、またはＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するための実験動物の使用におけるような、標準的な医薬的手順で測定することができる。ＬＤ５０およびＥＤ５０のパラメータは当業者によく知られており、各々、集団の５０％の致死、および集団の５０％での治療有効性が現れる化合物の用量を指す。毒性と治療有効性との用量比は、治療指数としての意味を持ち、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現することができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。有害な副作用が出現する化合物を用いる場合には、たとえばその化合物を罹患組織部位を特異的に標的とする送達系を用いるのが特に好ましく、それによって別の細胞、組織または器官での損傷の可能性が最小になり、副作用が低減する。

本発明の実施形態は、以下の実施例として記載される。しかしながら、本明細書のこれら実施例またはそのほかの実施例のいずれも説明にすぎず、本発明の範囲および意味、あるいは例示した用語を何ら限定するものではない。また本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態のいずれも制限するものでもない。さらに、当業者であれば、本明細書を読めば本発明に多くの変形および変更があることもわかり、本発明の精神および範囲を逸脱することはない。

（略語）
実施例中、以下の略語が用いられる。
Ｚｗ：Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３‐１４；０．１Ｘ Ｚｗ＝０．００５％ Ｚｗ３‐１４；１Ｘ Ｚｗ＝０．０５％Ｚｗ３‐１４
ＴＸ：ＴＲＩＴＯＮ Ｘ‐１００；還元型ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（“ｒｅｄＴＸ”）
ＧＣＰｏｒＢ：組換え淋菌ＰｏｒＢ（ＦＡ１０９０株由来）
ＭｎＰｏｒＡ：組換え髄膜炎球菌ＰｏｒＡ（クラスＩポーリン）
０．１Ｘ ＰｏｒＢ＝１０μｇ／ｍｌＧＣｒＰｏｒＢ；１Ｘ ＰｏｒＢ＝１００μｇ／ｍｌＧＣｒＰｏｒＢ
（実施例１：種々の免疫原性組成物の注射に対する疼痛反応）
（材料および方法）
免疫原性組成物の調製。組換え淋菌ＰｏｒＢ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＦＡ１０９０株由来の“ＧＣｒＰｏｒＢ”）は、ｐＥＴ‐１７ｂ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、米国、ウイスコンシン州、マジソン市）を用いて大腸菌内で製造した。封入体内に発現したその組換えタンパク質を、尿素中に可溶化させ、最新版の医薬品の製造および品質管理に関する基準（ｃＧＭＰ）のもとでＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）（“Ｚｗ”）３‐１４含有カラムクロマトグラフィーで精製した。バッチでの濃縮物を、１０ｍＭ ＮａＰＯ_４（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｚｗ３‐１４（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、米国、カリフォルニア州、サンジエゴ市；カタログ番号６９３０１７）溶液中、‐２０℃で保存した。この素材のポーリン濃度は１．３ｍｇ／ｍｌであった。

ラットでの足蹠疼痛モデルにおいて試験した免疫原性組成物で用いたすべての緩衝液は、注射用水（“ＷＦＩ”）を用いて調製し、０．２２μｍのメンブランフィルターを通過させた。還元型ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ‐１００（“ｒｅｄＴＸ”）は、Ｓｉｇｍａ社（米国、ミズーリ州、セントルイス市；カタログ番号Ｘ‐１００Ｒ‐ＰＣ）から購入し、ホリマリンはＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国、ニュージャージー州、ギブスタウン市；カタログ番号ＦＸ０４１５‐５）から購入し、そのほかのすべての試薬類は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ‐１００（“ＴＸ”）（カタログ番号Ｘ１９８−０５）を含めてＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社（米国、ニュージャージー州、フィリップスバーグ市）から購入した。実施例１に示した実験に関しては、ＰＢＳは発熱性物質不含のものではなく、Ｓｉｇｍａ社（カタログ番号Ｐ０２６１）から入手したものである。これ以降の実施例では、発熱性物質不含のＰＢＳを調製した。

以下の臨床グレードの免疫原性組成物を本研究に用いた。

１）０．０５％（ｗ／ｖ）Ｚｗ３‐１４含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に、１００μｇ／ｍｌの組換え淋菌ポーリンタンパク質を含むＧＣｒＰｏｒＢ
２）０．０４％（ｖ／ｖ）ＴＸ（ＡｌＰＯ_４としてアルミニウム２５０μｇ／ｍｌ含有または不含）、および０．０３％（ｗ／ｖ）Ｚｗ３‐１２含有のＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来の組換えＰ４タンパク質５０μｇおよび組換えＰ６タンパク質５０μｇ、並びに天然型ＵｓｐＡ２（Ｍｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来）５０μｇを含む非定型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ／Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（“ＮＴＨｉ／Ｍｃａｔ”）免疫原性組成物〔この免疫原性組成物は、ヒトでのボランティアに注射したところ、疼痛が伴わなかったもので、それはおそらく０．０３％のＺｗ３‐１２がその臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満であるためと思われる。これに対して０．０４％のＴＸ濃度は、そのＣＭＣ超である。〕および、
３）ＳＴＩＭＵＬＯＮ（登録商標）ＱＳ‐２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ社製、フラミンガム市）１００μｇ／ｍｌ含有のＰＢＳ（ｐｈ６．５）中に、呼吸器多核性ウイルス（ＲＳウイルス）由来の精製Ｆタンパク質（“ＰＦＰ‐２”）１００μｇ／ｍｌを含む免疫原性組成物。尚、この組成物はヒトでのボランティアに注射したところ、直ちに疼痛が伴った。

疼痛の対照：ホルマリン（ホルムアルデヒド１００μｌ）をその５％溶液として注射時の疼痛の陽性対照とし、その疼痛は即時的なものと遅延的なものとの二相性の疼痛の反応を生じる。

ラットでの足蹠疼痛試験のための実験用免疫原性組成物は、前記のＺｗ３‐１４、ＴＸまたは還元型ＴＸを含有する、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）・１５０ｍＭ ＮａＣｌ（“ＴＢＳ”）のいずれか適当な緩衝液で無菌的にタンパク質を層流フードで希釈して調製するのが好ましい。これらの試験用の陽性対照は、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解した５％（ｖ／ｖ）ホルマリン溶液とした。免疫原性組成物を２ｍｌ容の１型ガラスバイアルに分注し、Ｗｅｓｔラテックス不含ストッパーおよびアルミニウムシールで密封した。すべての免疫原性組成物は２‐８℃で貯蔵した。

（ラットでの足蹠疼痛試験。）免疫原性組成物試料を投与前に予め室温にした。疼痛反応のモニターに関与しない技術者が、動物に注射する。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国、ニューヨーク州、キングストン市）から購入したオスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｒｌ：ＣＤ（登録商標）（ＳＤ）ＩＧＳ ＢＲ，到着時の体重５０‐１００ｇ）を、すべての試験に用いた。ラットは試験開始前約１週間、研究施設に順化させ、その時点で体重は１００‐１５０ｇとなった。注射前に、注射する側の脚に傷がないことを予め確認検査した。次に技術者の腕の中に動物を拘束して後脚を前方に伸ばした。右の後肢をフックジョイントの真上に捕らえ、脚がまっすぐになるように足の底面（足底）を上方に加圧した。動物ごとに新しい２３ゲージ針を用い、作業者は脚中央に、脚面と平行に針の斜め側を上にして、針が足の裏の中央に位置するまで挿入した。上記の物質を注入し、針をそのまま３‐５秒間保留してから引抜き、注入部位からの漏れを最小限にする。注入容量は０．１ｍｌとした。

次に動物を３面鏡（両側および底部にあわせる）付きのケージに配置し、異なる技術者（免疫組成物の同定ができないような状況で）が注射した側の脚の縮まり、上げ、舐めまたは叩きの行動を３０分間観察した。これらの疼痛反応行動に費やされた時間の長さを、ストップウオッチを用いて記録し、１０分間の合計を出した。各群６匹の動物を用いた。

（統計解析。）結果は、各処理群を緩衝液単独（ＰＢＳまたはＴＢＳ）注射の対照群との比較を行なう多重比較用として調整したＡＮＯＶＡ法を用いて解析した。この方法は、それらの試験での測定値の分散が群間で大きく異なったため、控えめなアプローチといえる。さらに正規性の想定も満たしていないものであった。これらのことから、ＡＮＯＶＡ法を用いる前のデータに、ランク変換を適用させた。

各々の免疫原性組成物を比較する２次解析は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎランク試験を用いて行なった。所望によりＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較調整も実施した。これらの２次解析には、（ａ）緩衝液含有のＴＸまたは還元型ＴＸ中に希釈されたＧＣｒＰｏｒＢ／Ｚｗ３‐１４、（ｂ）０．０５％Ｚｗ３‐１４中の１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌＧＣｒＰｏｒＢ、（ｃ）ＮＴＨｉ／Ｍｃａｔ免疫原性組成物含有の０．０５％Ｚｗ３‐１４中の１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌのＧＣｒＰｏｒＢ、および（ｄ）０．０５％または０．００５％のＺｗ３‐１４を伴うＰＢＳに比較を含めた。

陰性対照の免疫原性組成物との比較に関する１次解析における各試験に対しては、有意水準α０．０５を用い、２次解析で考慮される各々の試験に対しては別に有意水準α０．０５を用いた。また多重比較のためにＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ調整を用いた。

（結果）
表１は、連続１０分間隔における、種々の免疫原性組成物０．１ｍｌ注射に対する疼痛反応に費やされた時間をまとめたものである。ＰＢＳおよび非定型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（ＮＴＨｉ／Ｍｃａｔ）は、陰性対照として用いた。ＰＢＳ＋Ｚｗ３‐１４、ＲＳウイルス由来ＰＦＰ＋ＱＳ‐２１アジュバント（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ社製、米国、ニューヨーク州、ニューヨーク市）、およびＰＢＳ中のＧＣｒＰｏｒＢ＋０．０５％Ｚｗ３‐１４を試験群とした。５％ホルマリンは、注射時の疼痛の陽性対照として用いた。中央値、平均値および値域は、各々の処理後の観察時間に対して、各免疫原性組成物について得られる。各群の動物数は６匹とした。表２は、表１で得られた結果の統計解析をまとめたものである。報告されたｐ‐値は、ランク変換ＡＮＯＶＡアプローチから得られた結果である。統計的検定は、ＳｔｅｅｌおよびＤｗａａｓ法で確認した。

表１および２に示されるように、試験組成物の中でホルマリンがはっきりと最も強い疼痛反応を誘発させた。この試験において緩衝液対照として用いられたＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社から購入）が発熱物質不含のものではなく、したがって予想される疼痛反応よりもおそらく大きくなったと思われるため、この試験からのデータの解釈は複雑である。それにもかかわらず、データから免疫処置後の最初の１０分間では、１００μｇ／ｍｌのＧＣｒＰｏｒＢ、ＰＢＳ中の０．０５％Ｚｗ３‐１４、またはＰＦＰ‐２＋ＱＳ‐２１によって誘発した疼痛反応が、ＮＴＨｉ／Ｍｃａｔ免疫原性組成物の場合よりも強いことが示唆されるが、それらの差は統計的に有意ではなかった。

次の実施例では、方法の全体的な感度を上げるために、免疫原性組成物注射容量を２００μｌとして２回注射した。

（実施例２：疼痛反応に対する注射の効果）
（材料および方法）
免疫原性組成物の調製。免疫原性組成物は、実施例１に記載したように調製した。この実験モデルの感度を上げるために、このモデルでの最大注射容量（０．２ｍｌ）を評価した。この実施例では、ＰＢＳは発熱物質不含のものとした。

ラットでの足蹠疼痛試験。ラットでの足蹠疼痛試験は、実施例１に記載したように行なった。この実施例では動物数を各群４‐６とし、注射容量は０．１ｍｌおよび０．２ｍｌとした。

統計解析。統計解析は実施例１に記載したように行なった。

（結果）
表３は、疼痛反応に対する注射容量の効果（０．１ｍｌの場合の０．２ｍｌの場合との比較）をまとめたものである。疼痛反応時に費やされた時間長の中央値、平均値および値域は、各免疫原性組成物について、各々処理後の観察期間で求めた。尚、０．１ＸＧＣｒＰｏｒＢ＝１０μｇ／ｍｌＧＣｒＰｏｒＢおよび１ＸＧＣｒＰｏｒＢ＝１００μｇ／ｍｌＧＣｒＰｏｒＢである。表４は、表３で得られた結果の統計解析を要約したものである。報告したｐ‐値は、ランク変換ＡＮＯＶＡアプローチから得られた結果である。統計的検定は、ＳｔｅｅｌおよびＤｗａａｓ法で確認した。＊印は、ＳｔｅｅｌおよびＤｗａａｓ法によって１ランク単位の限界値（有意差境界）以内で統計的には有意ではないとされたことを示すものである。

表３および４に示すように、Ｚｗ３‐１４単独およびＧＣｒＰｏｒＢ（１００μｇ／ｍｌ）＋Ｚｗ３‐１４の免疫原性組成物での疼痛反応は、実施例１で検出されたもの（０．１ｍｌの注射容量のみ）よりも強かった。ＰＢＳ陰性対照は認容性が充分であり（表３）、予想されるような疼痛行動は最小であった（中央値は０‐１０分後の観察で０秒、１０‐２０分後の観察で３秒であった）。０‐１０分の時間枠内の疼痛反応の解析によって、０．０５％のＺｗ３‐１４含有試料が、ＰＢＳ緩衝液対照とは統計的に異なることが証明された（ランク変換ＡＮＯＶＡによるｐ≦０．０００９、α水準０．０１での比較による）。表４参照のこと。さらに１０−２０分の時間枠内では、ＧＣｒＰｏｒＢ免疫原性組成物の臨床用処方物０．２ｍｌの注射を受けた動物は、ＰＢＳの場合と比較してなお有意な疼痛反応を示した（ｐ＝０．０００２、α水準０．０１での比較）。０．００５％Ｚｗ３‐１４含有の免疫原性組成物を注射された動物では、疼痛反応が最小であり、陰性対照であるＰＢＳで誘発される疼痛反応と全く同じであることは注目されることであった。０．０５％Ｚｘ３‐１４がそのＣＭＣ（０．００４‐０．０１５％）よりも充分に高濃度であるため、これらの結果によって、ＣＭＣ超のＺｗ３‐１４の存在が注射時の疼痛の原因であり得ることが示唆された。

上記免疫原性組成物では、２００μｌ注射すると感度が上昇したことを考慮して、残りの実施例では、免疫原性組成物の注射容量はすべて２００μｌとし、ホルマリンの注射容量だけは１００μｌのままで行なう。次の試験では、陽性対照としてのＰＦＰ‐２＋ＱＳ‐２１と比較しての免疫原性組成物の評価を行う。

（実施例３：免疫原性組成物の注射に対する疼痛反応）
（材料および方法）
免疫原性組成物の調製。免疫原性組成物は実施例２に記載したように調製した。ヒトでのボランティアにおいて注射時に疼痛が伴うことが認められているＰＦＰ‐２＋ＱＳ‐２１免疫原性組成物を、陽性対照として用いた。

ラットでの足蹠疼痛試験。ラットでの足蹠疼痛試験は、実施例１に記載したように実施した。この実施例では、動物数を各群８とし、注射容量は０．２ｍｌとした。

統計解析。統計解析は実施例１に記載したように行なった。さらに、多重比較用のＴｕｒｋｅｙ‐Ｋｒａｍｅｒ調整を伴うランク変換ＡＮＯＶＡアプローチを用いて、全３群の互いの比較も行なった。

（結果）
この研究では、ＰＦＰ‐２＋ＱＳ‐２１免疫原性組成物が、ヒトでのボランティアで注射時に疼痛が伴うことが判明しているために陽性対照として役立つかどうかの試験を行った。ホルマリン含有物以外の免疫組成物は、注射容量０．２ｍｌで投与した。表５は、ＰＦＰ‐２＋ＱＳ‐２１の０．２ｍｌ注射に伴う疼痛反応に対する時間長を要約したものである。中央値、平均値および値域は、処置後の観察期間ごとに各免疫原性組成物群に関して得る。尚、一匹の動物で５２秒の反応が見られたが、データから除いた。表６は、表５で得られた結果の統計解析をまとめたものである。報告したｐ‐値は、ランク変換ＡＮＯＶＡアプローチから得られた結果である。統計的検定は、ＳｔｅｅｌおよびＤｗａａｓ法によって確認した。

表５で示されるように、ＰＦＰ‐２＋ＱＳ‐２１およびＧＣｒＰｏｒＢのいずれの免疫原性組成物とも、最初の１０分間で疼痛反応が生じた。これらの反応は、充分な認容性を持つ０．２ｍｌのＰＢＳ（陰性対照）の場合におこる反応とは有意に異なった（ｐ≦０．０００２、α水準０．０５での比較）（表６参照）。

これまでの３つの実施例の結果によって、ヒトでのボランティアにおいて注射時に疼痛が伴うことが判明していた２種の免疫原性組成物（ＧＣｒＰｏｒＢ＋０．０５％Ｚｗ３‐１４およびＰＦＰ‐２＋ＱＳ‐２１）では、ラットでの足蹠（足舐め）試験モデルにおいて、０．２ｍｌ注射時に疼痛を引き起こすことも明らかになった。ＮＴＨｉ／Ｍｃａｔ免疫原性組成物は、ヒトでのボランティアに注射しても疼痛が伴わず、ラットでの足蹠試験モデル（０．１ｍｌ注射）でも疼痛を引き起こさなかった。これらの結果によってさらに、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３‐１４が、ＧＣｒＰｏｒＢ免疫原性組成物に付随する疼痛の主な源であることが示唆された。これに対して、０．００５％（ＣＭＣ未満）までにＺｗ３‐１４の濃度を下げると、疼痛反応は有意に減少するように思えた。これらの結果に基づき、Ｚｗ３‐１４を除くかまたは低減した代替処方物を製造し、このラットモデルで試験した。

次の試験は、２種の異なるタンパク質濃度で実施し、ラットでの足蹠試験モデルで疼痛を引き起こす免疫原性組成物のタンパク質成分を一定とし、界面活性剤希釈の効果を評価するものである。

（実施例４：疼痛反応に対する異なるＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３‐１４またはＧＣｒＰｏｒＢの効果。）
（材料および方法）
免疫原性組成物の調製。免疫原性組成物は実施例３に記載したように調製した。

ラットでの足蹠疼痛試験。ラットでの足蹠疼痛試験は、実施例１に記載したように行なった。初期の実験で注射後２０‐３０分後に観察される疼痛反応がごく小さかったことも一部考慮して、この実施例では疼痛反応を注射後の最初の２０分間モニターした。すべての免疫原性組成物の注射容量は、０．２ｍｌとした（ホルマリン陽性対照のみは、０．１ｍｌの注射容量とした）。各群の動物数は１０に増やした。

統計解析。統計解析は実施例１に記載したように実施した。

（結果）
表７は、０．２ｍｌ注射による疼痛反応に費やされた時間長に対するＺｗ３‐１４またはＧＣｒＰｏｒＢの異なる濃度の効果をまとめたものである。各群とも１０匹の動物を用いた（表７）。中央値、平均値および値域は、処置後の観察期間ごとに、各免疫原性組成物群に対して得る。表８は、表７で得られた結果の統計解析を要約したものである。報告したｐ‐値は、ランク変換ＡＮＯＶＡアプローチから得られた結果である。統計的検定は、ＳｔｅｅｌおよびＤｗａａｓ法で確認した。

本発明の一つの実施形態では、疼痛誘発性界面活性剤を希釈し、タンパク質成分を一定に保つことで免疫原性組成物の認容性が上がる。これら条件下では、タンパク質は沈殿を形成して不溶化するであろう。表７に、０．００５％Ｚｗ３‐１４中のＧＣｒＰｏｒＢによって誘発した疼痛反応の測定結果を、０．０５％Ｚｗ３‐１４中の同一タンパク質用量の場合と比較して示す。０．００５％はＺｗ３‐１４にとってはＣＭＣ未満であり、その組換え型ポーリンタンパク質は微細な沈殿物を形成する。これまでのいくつかの研究によって、タンパク質は沈殿を形成してもなお免疫原性を有することが明らかにされており（データは省略）、したがってこのことによって、疼痛を克服することが可能な方法と考えられる処方物オプションが示された。その結果は表７中にあり、０．００５％Ｚｗ３‐１４中の１００μｇ／ｍｌ濃度のＧＣｒＰｏｒＢでは、ラット試験モデルにおいて疼痛が生じなかったが、０．０５％Ｚｗ３‐１４中の同じ濃度のＧＣｒＰｏｒＢではやはり有意な疼痛が生じた。これに対してＮＴＨｉ／Ｍｃａｔ臨床用免疫原性組成物ではやはり疼痛は生じなかった。統計解析の結果、ＰＢＳ注射群と比較した場合に、０．００５％Ｚｗ３‐１４で誘発する疼痛反応とＮＴＨｉ／Ｍｃａｔ免疫原性組成物での場合との間に有意差がないことが明らかになった（表８）。０．０５％Ｚｗ３‐１４含有の免疫原性組成物によって誘発される疼痛反応は、ＰＢＳ注射群と比較して注射後０‐１０分の時間枠において有意に大きかった（ｐ＜０．０００１、α水準０．００６２５；表８）。

この実施例によって、疼痛誘発性界面活性剤を希釈し、タンパク質成分を一定に保つことによって、免疫原性組成物の認容性がいかに改善され得るかが示された。次の実施例では、初めに疼痛を引き起こさない界面活性剤を同定し、次に疼痛を引き起こす界面活性剤を、疼痛を引き起こさない界面活性剤と交換することによる免疫原性組成物の忍容性改善法を示す。このアプローチでは、タンパク質成分の溶解性をどのようにして維持するかということも示される。

（実施例５：ＧＣｒＰｏｒＢによって誘発した疼痛反応に対するＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ‐１００の効果。）
（材料および方法）
免疫原性組成物の調製。免疫原性組成物は実施例３に記載したように調製した。

界面活性剤の交換。ＧＣｒＰｏｒＢと会合した界面活性剤の置換または交換（たとえばＺｗ３‐１４をＴＸに置換える）は、イオン交換クロマトグラフィーによって達成した。要約すると、１０ｍＭ ＮａＰＯ_４（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｚｗ３‐１４中のＧＣｒＰｏｒＢを、予め同一緩衝液で平衡化したＱ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ‐Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、米国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ市）カラム上に装填した。２５ｎＭ ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）および０．０３％（ｖ／ｖ）ＴＸ 約９００ｍｌで、結合したタンパク質を洗浄した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．０３％（ｖ／ｖ）ＴＸ中のＮａＣｌのリニアグラジュエントを用いてタンパク質を溶離させた。ＧＣＰｏｒＢ含有画分を集め、ＴＸを直接加えてＴＸ濃度を０．０６％（ｖ／ｖ）に調整した。次にその集めた素材を、０．０６％（ｖ／ｖ）ＴＸ含有の１０ｍＭ ＮａＰＯ_４（ｐＨ７．４）および１５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。透析した素材を０．２２μｍのメンブレンフィルターに通過させ、ろ液分のタンパク質濃度を測定した。

ラットでの足蹠疼痛試験。ラットでの足蹠疼痛試験は、実施例４に記載したように実施した。この実施例では動物数は各群８とした。

統計解析。統計解析は実施例１に記載したように実施した。

（結果）
ＮＴＨｉ／Ｍｃａｔ免疫原性組成物は、ＣＭＣ未満の濃度のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３‐１２およびＣＭＣ超の濃度の０．０４％（ｖ／ｖ）のＴＸも含むため、また特にＴＸとＺｗ３‐１２との混合物では、ヒトでのボランティア試験において注射時に疼痛を伴わなかったため、ＴＸがＧＣｒＰｏｒＢ用の代替界面活性剤と考えられることは興味深いものであった。

表９は、０．２ｍｌの注射容量を用いた際にＧＣｒＰｏｒＢによって生じた疼痛反応に費やされた時間長に対するＴＸの効果についてまとめたものである。各群の動物数は８とした。中央値、平均値および値域は、処置後の観察期間ごとに、免疫原性組成物の各群に対して得られる。尚、Ａｌ ｇｅｌとはＡｌＰＯ_４としてのアルミニウム２５０μ／ｍｌのことである。表１０は、表９で得られた結果の統計解析をまとめたものである。報告したｐ‐値は、ランク変換ＡＮＯＶＡアプローチから得られた結果である。統計的検定は、ＳｔｅｅｌおよびＤｗａａｓ法によって確認した。＊印は、ＳｔｅｅｌおよびＤｗａａｓ法において１ランク単位の限界値（有意境界）以内で統計的に有意ではないことを示す。

０．０６％ＴＸ中のＧＣｒＰｏｒＢ（１００μｇ／ｍｌ）を注射した動物では、０‐１０分および１０‐２０分の両方の時間枠とも、事実上疼痛反応が見られなかった（ｐ値は各々、０．９８および０．５５、α水準０．０１での比較）。これらの疼痛反応は、ＰＢＳ単独によって生じた反応と同様のものであった（表９および１０）。これらのデータによって、Ｚｗ３‐１４をＴＸと交換すると疼痛反応が有意に減少することが明らかになった。

実際的観点からは、界面活性剤の交換を行なうと、タンパク質の損失の可能性、さもなければコスト上昇の可能性がある少なくとも一段階の追加工程が必要となる。したがって次の実施例では、疼痛を引き起こす界面活性剤を希釈することで、疼痛を引き起こさない界面活性剤での無痛レベルを達成する疼痛問題解決の設計方法が教唆される。

（実施例６：ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ‐１００緩衝液へのＧＣｒＰｏｒＢ／ＺＷ３‐１４の希釈の効果。）
（材料および方法）
希釈による免疫原性組成物の調製。界面活性剤交換工程の代わりに、０．０５％Ｚｗ３‐１４含有ＰＢＳ中に存在する濃縮素材を、０．０５％ＴＸ含有緩衝液中に直接希釈する方法についての使用性を試験した。この希釈によって、免疫原性組成物の認容性が改善され、その際のＺｗ３‐１４残存量はそのＣＭＣ未満の濃度（０．００４％程度）で含有する。

ラットでの足蹠疼痛試験。ラットでの足蹠疼痛試験は、実施例４に記載したように行なった。動物数は各群１０とした。

統計解析。統計解析は、実施例１に記載したように行なった。

（結果）
表１１は、０．２ｍｌの注射容量を用いた際の、ＴＸ緩衝液中へのＧＣｒＰｏｒＢ／Ｚｗ３‐１４の希釈効果をまとめたものである。疼痛反応に費やされた時間長の中央値、平均値および値域は、処置後の観察期間ごとに、各々の免疫原性組成物群に対して得られる。表１２は、表１１で得られた結果の統計解析をまとめたものである。報告されたｐ‐値はランク変換ＡＮＯＶＡアプローチから得られた結果である。統計的検定は、ＳｔｅｅｌおよびＤｗａａｓ法によって確認した。＊＊印は、ＡＮＯＶＡとＳｔｅｅｌ・Ｄｗａａｓ法との間に明らかな不一致があることを示す。

０．０５％ＴＸ含有緩衝液中に直接希釈された免疫原性組成物については、ラットでの足蹠試験モデルにおいて疼痛を引き起こさない処方物としても成り立った。この組成物はＰＢＳ単独、ＴＸとＰＢＳとを配合したＰＢＳ，およびＴＸ中に希釈されたＺｗ３‐１４の場合の疼痛反応と同様であった（表１１および１２参照）。この実施例では、タンパク質の溶解性はＴＲＩＴＯＮ中に維持されている。

次に、ほかの緩衝液系およびほかの非イオン性界面活性剤が、忍容性の改善された免疫原性組成物の製造に有用かどうかを評価した。

（実施例７：ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ‐１００または還元型ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ‐１００含有のＴＲＩＳ緩衝化生理食塩水中に調合されたＧＣｒＰｏｒＢに対する疼痛反応）
（材料および方法）
免疫原性組成物の調製。免疫原性組成物は、実施例６に記載したように調製した。ＧＣｒＰｏｒＢのバッチ濃縮物は、還元型ＴＸで希釈した。

ラットでの足蹠疼痛試験。ラットでの足蹠疼痛試験は、実施例４に記載したように行なった。動物数は各群１０とした。尚、ＰＢＳの代わりにＴＢＳを用いた。

統計解析。統計解析は、実施例１に記載したように行なった。

（結果）
表１３は、ＴＸまたは還元型ＴＸ含有のＴＢＳ中に調合されたＧＣｒＰｏｒＢの０．２ｍｌ注射に対する疼痛反応に費やされた時間長を要約したものである。還元型ＴＸは、２８０ｎｍにおける吸光性が減少したＴＸ−１００の類縁体であり、そのために、使いやすく、より許容されるものである。中央値、平均値および値域は、処置後の観察期間ごとに、各々の免疫原性組成物群に対して得られる。動物数は各群１０とした。表１４は、表１３で得られた結果の統計解析を要約したものである。報告されたｐ‐値は、ランク変換ＡＮＯＶＡアプローチから得られた結果である。統計的検定は、ＳｔｅｅｌおよびＤｗａａｓ法で確認した。尚、ＴＢＳとは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌのことである。

０．０５％のＴＸまたは還元型ＴＸをＴＢＳ希釈液中に用い、ＧＣｒＰｏｒＢが水酸化アルミニウムアジュバントに結合できるように変えても同様な結果が得られた（表１３参照）。ＴＸまたは還元型ＴＸの組成物についてのいずれの結果も、緩衝液対照の場合と統計的に区別不能であった（表１４参照）。

疼痛を誘発する界面活性剤のミセルをそのＣＭＣ未満にまで希釈し、疼痛を誘発しない界面活性剤をそのＣＭＣ超の水準にまで添加すると、認容性の高い免疫原性組成物が得られる。次の実施例では、疼痛を引き起こす界面活性剤をそのＣＭＣ超に維持しつつ、疼痛を誘発しない界面活性剤を混合ミセル形成まで加えて疼痛を緩和することによる疼痛の問題解決が設計可能かどうかを評価した。

（実施例８：ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ‐１００を添加し、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３‐１２を一定に保つことによる、疼痛誘発性組成物の無痛性組成物への変換）
（材料および方法）
注射液の調製。以下の界面活性剤およびそれらの配合物は、ラットでの足蹠疼痛試験モデルで評価した：ＰＢＳ中の０．２％Ｚｗ３‐１２；０．００２％ＴＸを伴う０．２％Ｚｗ３‐１２；０．０１％ＴＸを伴う０．２％Ｚｗ３‐１２；０．０５％ＴＸ中に希釈された０．２％Ｚｗ３‐１２；０．２％ＴＸ中に希釈された０．２％Ｚｗ３‐１２。

ラットでの足蹠疼痛試験。ラットでの足蹠疼痛試験は、実施例４に記載したように行なった。動物数は各群１０とした。

統計解析。統計解析は、実施例１に記載したように行なった（データは省略）。

（結果）
図１は、異なる濃度のＴＸが添加されたＺｗ３‐１２と比較した、Ｚｗ３‐１２注射によって誘発した疼痛を示すものである。たとえば、非希釈化０．２％Ｚｗ３‐１２、および０．００２％含有０．２％Ｚｗ３‐１２の場合では、ラットでの足蹠試験モデルによって明らかになったように比較的強い疼痛が生じた。これらの処方物では、疼痛誘発性の両性イオン界面活性剤の濃度をＺｗ３‐１２として０．２％で一定にし、第二の無痛性の非イオン性界面活性剤（ＴＸ）の量を上げて混合ミセル形成まで添加した。図１に示したように、０．２％Ｚｗ３‐１２の溶液に０．０１％ＴＸ、０．０５％ＴＸまたは０．２％ＴＸを加えると、ラットでの足蹠試験モデルにおいてラットに注射した際の疼痛反応が劇的に減少する。

そのプロットから分かるように、０．２％（最終濃度）Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３‐１２の溶液にＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を加えると、疼痛反応が低減した。この効果は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００の濃度が０．０１％に達すると起こり、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００が０．２％まで添加されても効果は続くと考えられる。これらの結果は予期されないものである。免疫原性組成物に界面活性剤を加えるほど、その溶液は細胞をさらに可溶化する可能性があり、疼痛もさらに誘発されることが通常、予想されるものである。

データの統計解析によって、０‐１０分の時間枠では、陰性対照（たとえば０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００単独）と比較して、最低濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００注射群でも有意検定は存在しないことが明らかとなる。同様に１０‐２０分の時間枠でも、同じ比較で有意ではなく、さらに０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００混合物でも陰性対照との有意差はないことが明らかである。

０．２％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３‐１２の溶液に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を０．０１％添加することで、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３‐１２およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００の両方の混合ミセルが生成したと結論づけることができ、さらにこれらのミセルが、注射時の疼痛を低減させるような溶液物性を有すると結論づけることができる。

次の実施例では、ラットでの足蹠モデル試験において誘発する疼痛を計測することによって、種々の界面活性剤の認容性を評価した。

（実施例９：種々の界面活性剤の認容性）
（材料および方法）
注射液の調製。表１５，１６および１７に挙げた界面活性剤については各々、そのＣＭＣ超の指示濃度で調製した。ホルマリンを除くすべての注射容量は２００μｌとし、ホルマリンの場合は１００μｌとした。

ラットでの足蹠疼痛試験。ラットでの足蹠疼痛試験は、実施例４に記載したように行なった。動物数は各群８とした。

（結果）
界面活性剤の精査は、ＣＭＣ超の濃度で注射した際に、両性イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤のどれが疼痛を引き起こし、どれが疼痛を引き起こさないかを決定するために行なった。その結果から、非イオン性界面活性剤であるＴＲＩＴＯＮ Ｘ‐１００、還元型ＴＲＩＴＯＮ Ｘ‐１００、ＴＷＥＥＮ ８０およびＢＲＩＪは注射時に高い認容性を有し、ラットでの足蹠疼痛試験で有意な疼痛を引き起こさないことが明らかである。表１５，１６および１７参照のこと。これに対して、両性イオン界面活性剤であるＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３‐１０、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３‐１２、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３‐１４、ＣＨＡＰＳおよびＥＭＩＰＧＥＮ ＢＢは、ラットでの足蹠試験モデルで、いずれも有意な疼痛を引き起こし、免疫原性組成物中に用いるには不適と思われた。同じく、非イオン性界面活性剤であるドデシルマルトシドおよびオクチルグルコシドでも、ラットでの足蹠試験モデルにおいて疼痛が誘発された。

次の実施例では、ほかの疎水性タンパク質でも淋菌ＰｏｒＢと同じパターンの認容性を示すことを証明しようとするものである。

（実施例１０：組換え髄膜炎球菌ＰｏｒＡ（クラスＩポーリン）含有の免疫原性組成物の注射に対する疼痛反応）
（材料および方法）
免疫原性組成物の調製。免疫原性組成物は、実施例２に記載したように調製した。

ラットでの足蹠疼痛試験。ラットでの足蹠疼痛試験は、実施例１に記載したように行なった。この実施例では、動物数を各群１０とし、注射容量を０．２ｍｌとした。

（結果）
この研究は、組換え型ポーリンタンパク質の髄膜炎球菌ＰｏｒＡ（クラスＩポーリン）が、これまでの実施例で見られたような淋菌ＰｏｒＢでの場合と同じパターンの認容性を示すかどうかを試験するために行なった。

その結果から、免疫原性組成物にＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３‐１４とＴＲＩＴＯＮ Ｘ‐１００とを組合わせ、ラットでの足蹠試験モデルで評価した際に、髄膜炎球菌ＰｏｒＡでは淋菌ＰｏｒＢと同じパターンの認容性を示すことが指摘された。表１８を参照のこと。髄膜炎球菌ＰｏｒＡとＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３‐１４とを含む免疫原性組成物は、ラットでの足蹠試験モデルで疼痛を誘発させたが、一方、髄膜炎球菌ＰｏｒＡとＴＲＩＴＯＮ Ｘ‐１００とを含む免疫原性組成物は、ラットでの足蹠試験モデルにおいて、髄膜炎球菌ＰｏｒＡとＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３‐１４とを含むものよりも疼痛の誘発がかなり低く、認容性が高かった。

表１８のデータから、アジュバントであるＡｌＯＨの添加が、疼痛誘発レベルに対してプラスまたはマイナスのいずれの効果も及ぼさず、したがって免疫原性組成物の認容性にも影響を及ぼさないことも示される。表１８を参照のもと。

本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によってその領域が限定されるものではない。さらに、本明細書に記載された内容に加えて本発明の種々の変形は、前述の記載および添付図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変形は、添付の請求項の範囲内にあるものとする。

また当然ながら、すべての値はおよそのものであって、説明のために示されているもの。

特許、特許出願、公開、製品記載およびプロトコル類は、本明細書中に挙げられているが、その開示は、その全体がすべての目的に対して本明細書に参照として組入れられている。

この図は、ラットでの足蹠内に疼痛を起こす両性イオン界面活性剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３‐１２）および無痛性の非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００）の種々の免疫原性組成物を注射した後の、それに伴う疼痛を図示するものである。疼痛を起こす両性イオン界面活性剤の濃度は一定とし、第二の無痛性の非イオン性界面活性剤の添加量を上昇させている。

Claims (65)

1. ヒトにおける注射に適した、疎水性タンパク質の無痛性組成物であって、該組成物は、以下：
   （ａ）疎水性タンパク質、
   （ｂ）該タンパク質を可溶化するのに必要な量より少ない量の両性イオン界面活性剤、および
   （ｃ）薬学的に受容可能なキャリア内に該タンパク質の溶解性を維持するのに有効な量の薬学的に受容可能な非イオン性界面活性剤を含む、
   疎水性タンパク質の無痛性組成物。
2. 前記両性イオン界面活性剤が、ｎ‐オクチル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐デシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；３‐（Ｎ，Ｎ‐ｎ‐ヘキサデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐１‐プロパンスルホネート；３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐２‐ヒドロキシ‐１‐プロパンスルホネートおよびｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルグリシンから成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記両性イオン界面活性剤が、ｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネートである、請求項２に記載の組成物。
4. 前記非イオン性界面活性剤が、α‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレ−ト、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートおよびポリオキシエチレン（３５）ラウリルエーテルから成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
5. 前記非イオン性界面活性剤が、α‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である、請求項４に記載の組成物。
6. 前記両性イオン界面活性剤が、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満の最終濃度のｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネートであって、かつ前記非イオン性界面活性剤が、そのＣＭＣを超える最終濃度のα‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である、請求項１に記載の組成物。
7. 前記疎水性タンパク質が内在性膜タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
8. 前記内在性膜タンパク質が、細菌、ウイルス、寄生生物およびプリオンから成る群から選択される感染体由来のものである、請求項７に記載の組成物。
9. 前記感染体が細菌である、請求項８に記載の組成物。
10. 前記内在性膜タンパク質がポーリンである、請求項９に記載の組成物。
11. 前記内在性膜タンパク質が淋菌のポーリンである、請求項９に記載の組成物。
12. 前記内在性膜タンパク質が髄膜炎球菌のポーリンである、請求項９に記載の組成物。
13. ヒトを免疫化する方法であって、該方法は、請求項８に記載の組成物を非経口的に投与する工程を包含し、ここで、前記感染体がヒト病原体である、方法。
14. 哺乳動物への投与に適した、薬学的に受容可能なキャリア中の疎水性タンパク質のより疼痛の少ない免疫原性組成物を作製する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）該疎水性タンパク質を両性イオン界面活性剤で可溶化して、第一の組成物を作製する工程、および
    （ｂ）改変された組成物が該第一組成物と比較して注射時の疼痛が少なくなるように、該第一組成物を改変する工程、
    を包含する、方法。
15. 前記改変工程（ｂ）が、（ｉ）前記両性イオン界面活性剤を希釈する工程、（ｉｉ）該両性イオン界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤と交換する工程、および（ｉｉｉ）疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤を添加するが、前記両性イオン界面活性剤の濃度を一定に保つ工程、から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記改変工程（ｂ）が、前記両性イオン界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤で希釈する工程である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記改変工程（ｂ）が、前記両性イオン界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤と交換する工程である、請求項１５に記載の方法。
18. 前記改変工程（ｂ）が、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤を添加するが、前記両性イオン界面活性剤の濃度を一定に保つ工程である、請求項１５に記載の方法。
19. 前記両性イオン界面活性剤が、ｎ‐オクチル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐デシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；３‐（Ｎ，Ｎ‐ｎ‐ヘキサデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐１‐プロパンスルホネート；３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐２‐ヒドロキシ‐１‐プロパンスルホネートおよびｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルグリシンから成る群から選択される、請求項１６、１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記両性イオン界面活性剤が、ｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネートである、請求項１６、１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記非イオン性界面活性剤が、α‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレ−ト、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートおよびポリオキシエチレン（３５）ラウリルエーテルから成る群から選択される、請求項１６、１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記非イオン性界面活性剤が、α‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である、請求項１６，１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記両性イオン界面活性剤が、そのＣＭＣ未満の最終濃度のｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネートであって、かつ前記非イオン性界面活性剤が、そのＣＭＣを超える最終濃度のα‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である、請求項１６、１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記改変工程（ｂ）が、前記両性イオン界面活性剤を希釈する工程であり、ここで前記疎水性タンパク質が沈殿を形成する、請求項１４に記載の方法。
25. 前記疎水性タンパク質が、細菌、ウイルス、寄生生物およびプリオンから成る群から選択される感染体由来の内在性膜タンパク質である、請求項１６、１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記感染体が細菌である、請求項１６、１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記内在性膜タンパク質がポーリンである、請求項１６、１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記両性イオン界面活性剤が、前記臨界ミセル濃度未満まで希釈される、請求項１６、１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記内在性膜タンパク質が淋菌のポーリンである、請求項１６、１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記内在性膜タンパク質が髄膜炎球菌のポーリンである、請求項１６，１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記疼痛が、ラットでの足蹠試験モデルで計測した場合、少なくとも約５０％低減する、請求項１６、１７または１８のいずれか１項に記載の方法。
32. 疎水性タンパク質と両性イオン界面活性剤とを含有する免疫原性組成物を哺乳動物に投与する際に伴う疼痛を低減する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）改変後の組成物が改変前の組成物と比較してより疼痛が少なくなるように、該組成物を改変する工程、および
    （ｂ）該免疫原性組成物を投与する工程、
    を包含する、方法。
33. 前記改変工程（ａ）が、（ｉ）前記両性イオン界面活性剤を希釈する工程、（ｉｉ）前記両性イオン界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤と交換する工程、および（ｉｉｉ）疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤を添加するが、前記両性イオン界面活性剤の濃度を一定に保つ工程から成る群から選択される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記改変工程（ａ）が、前記両性イオン界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤で希釈する工程である、請求項３３に記載の方法。
35. 前記改変工程（ａ）が、前記両性イオン界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤と交換する工程である、請求項３３に記載の方法。
36. 前記改変工程（ａ）が、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤を添加するが、前記両性イオン界面活性剤の濃度を一定に保つ工程である、請求項３３に記載の方法。
37. 前記両性イオン界面活性剤が、ｎ‐オクチル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐デシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；３‐（Ｎ，Ｎ‐ｎ‐ヘキサデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐１‐プロパンスルホネート；３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐２‐ヒドロキシ‐１‐プロパンスルホネートおよびｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルグリシンから成る群から選択される、請求項３４、３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記両性イオン界面活性剤が、ｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネートである、請求項３４、３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
39. 前記非イオン性界面活性剤が、α‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレ−ト、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートおよびポリオキシエチレン（３５）ラウリルエーテルから成る群から選択される、請求項３４、３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記非イオン性界面活性剤が、α‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である、請求項３４、３５および３６のいずれか1項に記載の方法。
41. 前記両性イオン界面活性剤が、そのＣＭＣ未満の最終濃度のｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネートであって、かつ前記非イオン性界面活性剤が、そのＣＭＣを超える最終濃度のα‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である、請求項３４、３５または３６のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記疎水性タンパク質が内在性膜タンパク質である、請求項３４、３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記内在性膜タンパク質が、細菌、ウイルス、寄生生物およびプリオンから成る群から選択される感染体由来のものである、請求項３４、３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記感染体が細菌である、請求項３４、３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記内在性膜タンパク質がポーリンである、請求項３４、３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記内在性膜タンパク質が淋菌のポーリンである、請求項３４、３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
47. 記内在性膜タンパク質が髄膜炎球菌のポーリンである、請求項３４、３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
48. 前記疎水性タンパク質の溶解性が前記非イオン性界面活性剤中で維持される、請求項３４、３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
49. 前記改変工程（ａ）が、前記両性イオン性界面活性剤を希釈する工程であり、ここで前記疎水性タンパク質が沈殿を形成する、請求項３３に記載の方法。
50. 前記疼痛が、前記ラットでの足蹠試験モデルで計測される、請求項３４、３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
51. 前記改変された組成物が、前記ラットでの足蹠試験モデルで計測した場合、前記改変前の組成物と比較して少なくとも約５０％の疼痛の低減をもたらす、請求項５０に記載の方法。
52. 疎水性タンパク質と両性イオン界面活性剤とを含有する免疫原性組成物を哺乳動物に投与する際に伴う疼痛を低減する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）改変前の組成物と比較して改変後の組成物が、ラットでの足蹠試験モデルで計測される場合の疼痛の低減をもたらすように、該組成物を改変する工程、および
    （ｂ）該免疫原性組成物を投与する工程、
    を包含し、
    ここで、該改変前の組成物と比較して該改変後の組成物が、ラットでの足蹠試験モデルで計測される場合の疼痛の少なくとも５０％の低減をもたらす、方法。
53. 前記改変工程（ａ）が、（ｉ）前記両性イオン界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤で希釈する工程、（ｉｉ）前記両性イオン界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤と交換する工程、および（ｉｉｉ）疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤を添加するが、前記両性イオン界面活性剤の濃度を一定に保つ工程から成る群から選択される、請求項５２に記載の方法。
54. 前記改変工程（ａ）が、前記両性イオン界面活性剤を疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤で希釈する工程である、請求項５３に記載の方法。
55. 前記改変工程（ａ）が、前記両性イオン界面活性剤を、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤と交換する工程である、請求項５３に記載の方法。
56. 前記改変工程（ａ）が、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤を添加するが、前記両性イオン界面活性剤の濃度を一定に保つ工程である、請求項５３に記載の方法。
57. 前記両性イオン界面活性剤が、ｎ‐オクチル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐デシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；ｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；３‐（Ｎ，Ｎ‐ｎ‐ヘキサデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネート；３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐１‐プロパンスルホネート；３‐〔（３‐コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕‐２‐ヒドロキシ‐１‐プロパンスルホネートおよびｎ‐ドデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルグリシンから成る群から選択される、請求項５４、５５および５６のいずれか１項に記載の方法。
58. 前記両性イオン界面活性剤が、ｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネートである、請求項５４、５５および５６のいずれか１項に記載の方法。
59. 前記非イオン性界面活性剤が、α‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレ−ト、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートおよびポリオキシエチレン（３５）ラウリルエーテルから成る群から選択される、請求項５４、５５および５６のいずれか１項に記載の方法。
60. 前記非イオン性界面活性剤が、α‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である、請求項５４、５５および５６のいずれか１項に記載の方法。
61. 前記両性イオン界面活性剤が、そのＣＭＣ未満の最終濃度のｎ‐テトラデシル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アンモニオ‐１‐プロパンスルホネートであって、かつ前記非イオン性界面活性剤が、そのＣＭＣを超える最終濃度のα‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である、請求項５４、５５または５６のいずれか１項に記載の方法。
62. 前記疎水性タンパク質が内在性膜タンパク質である、請求項５４、５５または５６のいずれか１項に記載の方法。
63. 前記内在性膜タンパク質が、細菌、ウイルス、寄生生物およびプリオンから成る群から選択される感染体由来のものである、請求項５４、５５または５６のいずれか１項に記載の方法。
64. 免疫原性組成物において疎水性タンパク質の溶解性を維持する方法であって、該方法は、疼痛を起こさない非イオン性界面活性剤中に疎水性タンパク質を可溶化する工程を包含し、ここで、非イオン性界面活性剤がα‐〔４‐（１，１，３，３‐テトラメチルブチル）フェニル〕‐ω‐ヒドロキシポリ（オキシ‐１，２‐エタンジイル）である、方法。
65. 疼痛を生じさせることなく、疎水性膜タンパク質含有組成物でヒトを免疫化する方法であって、該方法は、最終処方物において疎水性タンパク質の溶解性を維持するための薬学的に受容可能な界面活性剤として、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を選択する工程を包含し、ここで、該Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００の濃度はＣＭＣを超える、方法。

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