PT1248647E - Vacina de vesícula da membrana externa (omv) compreendendo proteínas de membrana externa de n. meningitidis do serogrupo b - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE "VACINA DE VESÍCULA DA MEMBRANA EXTERNA (OMV) COMPREENDENDO PROTEÍNAS DE MEMBRANA EXTERNA DE N. MENINGITIDIS DO SEROGRUPO B"

ÁREA DE APLICAÇÃO TÉCNICA A presente invenção refere-se a vacinas contra Neisseria meningitidis do serogrupo B (NmB).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Neisseria meningitidis é um diplococo Gram-negativo não móvel patogénico para os humanos. É uma espécie colonizadora da faringe, causando meningite e, ocasionalmente, septicemia na ausência de meningite. Nos Estados Unidos da América, a taxa de incidência é de 0,6-1 por 100 000 pessoas por ano, podendo ser muito superior durante um surto epidémico (ver Lieberman et al. (1996) JAMA 275(19):1499-1503,- Schuchat et al (1997) N Engl J Med 337(14):970-976). Nos paises em vias de desenvolvimento, as taxas endémicas da doença são muito mais elevadas e, durante as epidemias, as taxas de incidência podem atingir os 500 casos por 100 000 pessoas por ano. A mortalidade é extremamente elevada, situando-se nos 10-20% nos Estados Unidos e em valores muito superiores nos países em desenvolvimento. Depois da introdução da vacina conjugada contra Haemophilus influenzae, a N. meningitidis é a principal causa de meningite bacteriana em todas as faixas etárias nos Estados Unidos (Schuchat et al (1997) supra). 1

Foram identificados 12 serogrupos de N.meningitidis com base nos polissacáridos capsulares do organismo. A vacina meningocócica utilizada actualmente é uma vacina polissacaridica tetravalente composta pelos serogrupos A, C, Y e W135. Contudo, na sequência do sucesso observado com a vacinação contra H.influenzae, desenvolveram-se vacinas conjugadas contra os serogrupos A e C. 0 serogrupo B permanece, contudo, um problema e é actualmente responsável por aproximadamente 50% de todos os casos de meningite nos EUA, Europa e América do Sul. A abordagem polissacaridica não pode ser utilizada, uma vez que o polissacárido capsular menB é um polímero do ácido N-acetil neuramínico com ligações a(2-8) que também está presente nos tecidos dos mamíferos. Isso resulta na tolerância ao antigénio; na realidade, caso fosse elicitada uma resposta, esta seria anti-hospedeiro e, portanto, indesejável. Para evitar a indução de autoimunidade e a induzir uma resposta imune protectora, o polissacárido capsular foi, por exemplo, quimicamente modificado pela substituição dos grupos N-acetilo por grupos N-propionilo, mantendo a antigenicidade específica inalterada (Romero & Outschoorn (1994) Clin Microbiol Rev 7 (4) :559-575) .

Uma vacina de vesícula de membrana externa (outer- membrane vesicle - OMV) eficaz contra o serogrupo B foi produzida pelo Instituto Norueguês de Saúde Pública [e.g. Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-96. Apesar de esta vacina ser segura e prevenir a doença por NmB, a sua eficácia está limitada à estirpe utilizada para fabricar a vacina.

Também existem relatos de outras vacinas baseadas em preparações de membrana externa. É objecto da presente invenção alargar a eficácia destas vacinas a outras estirpes. 2

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Surpreendentemente, descobriu-se que a adição de determinados outros componentes às vacinas OMV alarga significativamente o espectro da sua eficácia.

Assim, a presente invenção apresenta uma composição que contém (a) uma preparação de membrana externa de NmB e (b) um componente imunogénico seleccionado entre um ou mais dos seguintes: • uma proteina descrita em WO99/57280 ou um seu fragmento imunogénico; • uma proteina descrita em W099/36544 ou um seu fragmento imunogénico; • uma proteina descrita em W099/24578 ou um seu fragmento imunogénico; • uma proteina descrita em WOOO/66791 ou um seu fragmento imunogénico; • uma proteina descrita em Tettelin et al. [Science (2000) 287:1809-1815] ou um seu fragmento imunogénico; • uma proteina descrita em Parkhill et al. [Nature (2000) 404:502-506] ou um seu fragmento imunogénico; • uma proteina descrita em W097/28273 ou um seu fragmento imunogénico; • uma proteina descrita em W096/29412 ou um seu fragmento imunogénico; • uma proteina descrita em WO95/03413 ou um seu fragmento imunogénico; • uma proteina descrita em W099/31132 ou um seu fragmento imunogénico; 3 • uma proteína descrita em W099/58683 ou um seu fragmento imunogénico; • uma proteína descrita em W099/55873 ou um seu fragmento imunogénico; e/ou • a proteína PorA, TbpA, TbpB, PilC, OpA ou Omp85 de Neisseria meningitidis.

Se a composição incluir uma proteína descrita em W099/24578, es: sa proteí .na compreende preferivelmente uma sequência de aminoácidos seleccionada i do grupo constituído pelas sequências com as identidades (SEQ ID) 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 , 18, 20, 22, 24, 26 , 28, 30, 32, 34, 36 , 38, 40, 42, 44, 46 , 48, 50, 52, 54, 56 , 58, 60, 62, 64, 66 , 68, 70, 72, 74, 76 , 78, 80, 82, 84, 86, . 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, . 136, 138, 140 , 142 ,144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540. 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 4 596 598 600 602 604 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 63 6, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 6 6 6, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890 e 892, conforme apresentadas em W099/24578 (ou uma proteína que inclui um fragmento imunogénico de uma ou mais destas sequências, ou uma proteína que inclui uma sequência com uma identidade que apresente uma semelhança preferivelmente superior a 50%, por ex. de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais, com uma destas SEQ ID).

Se a composição incluir uma proteína descrita em W099/36544, essa proteína deve, de preferência, incluir uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído pelas SEQ ID 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 , 32, 34, 36, . 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 , 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 , 80 , 82 , 84, r 86, 88 e 90, conforme apresentadas em W099/36544 (ou uma proteína que inclui um fragmento imunogénico de uma ou mais destas SEQ ID, ou uma proteína que inclui uma sequência com uma identidade que apresente uma semelhança preferivelmente superior a 50%, por ex. de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais, com uma

destas SEQ ID) . As SEQ ID 2, 4, 4 conforme apresentadas em WO 99/36544 correspondem às SEQ ID 15-17 da presente aplicação. Se a composição compreender uma proteína descrita em Tettelin et al. (ou seja, uma proteína codificada por um dos genes aí 5 descritos), essa proteína compreende, de preferência, uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído por NMB0001 a NMB2160 (ou uma proteína que compreenda um fragmento imunogénico de um ou mais destes 2160 genes, ou uma proteína que compreenda uma sequência com a mesma identidade (de preferência semelhança superior a 50%, por exemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) que um destes 2160 genes).

Se a composição incluir uma proteína descrita em Parkhill et al., essa proteína compreende, de preferência, uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído pelas 2121 sequências codificadoras aí apresentadas (ou uma proteína que compreenda um fragmento imunogénico de uma ou mais destas 2121 sequências, ou uma proteína que compreenda uma sequência com a mesma identidade (de preferência semelhança superior a 50%, por exemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) que uma destas 2121 sequências).

Se a composição incluir uma proteína descrita em WO99/57280, essa proteína compreende de preferência uma sequência de aminoácidos s elecc: ionada e ntre o grupo cons tituído pelas SEQ ID 2, 4, 6, 8 , io, 12, 14, 16 , 18 , 20, 22, 24, 26 , 28, 30, 32, 34, 36 , 38, 40, 42, 44, 46 , 48 , 50, 52, 54, 56 , 58, 60, 62, 64, 66 , 68, 70, 72, 74, 76 , 78 , 80, 82, 84, 86 , 88, 90, 92, 94, 96, r 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 6 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368 , 310, 372 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392 , 394, 396 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416 , 418, 420 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 , 442, 444 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464 , 466, 468 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488 , 490, 492 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512 , 514, 516 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536 , 538, 540 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560 , 562, 564 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584 , 586, 588 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608 , 610, 612 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632 , 634, 636 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656 , 658, 660 662, 664, 6 6 6, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680 , 682, 684 686, 688, 690, 692, 694, 6 9 6, 698, 700, 702, 704 , 706, 708 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728 , 730, 732 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752 , 754, 756 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776 , 778, 780 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800 , 802, 804 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824 , 826, 828 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848 , 850, 852 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872 , 874, 876 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896 , 898, 900 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920 , 922, 924 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944 , 946, 948 950, 952, 954, 956, 958, 960, 962, 964, 9 6 6, 968 , 970, 972 974, 976, 978, 980, 982, 984, 986, 988, 990, 992 , 994, 9 9 6 998, 1000, 1002 !, 1004, 1006, 1008, 1010, r 1012, 1014, 1016 1018, 1020 , 1022, 1024, 1026, 1028, 1030 , 1032, 1034, 1036 1038, 1040 , 1042, 1044, 1046, 1048, 1050 , 1052, 1054, 1056 1058, 1060 , 1062, 1064, 1066, 1068, 1070 , 1072, 1074, 1076 1078, 1080 , 1082, 1084, 1086, 1088, 1090 , 1092, 1094, 1096 1098, 1100 , 1102, 1104, 1106, 1108, 1110 , 1112, 1114, 1116 1118, 1120, 1122 , 1124, 1126, 1128, 1130, 1132, 1134, 1136 7 1138, 1140, 1142, 1144, 1146, 1148, 1150, 1152, 1154, 1156 1158, 1160, 1162, 1164, 1166, 1168, 1170, 1172, 1174, 1176 1178, 1180, 1182, 1184, 1186, 1188, 1190, 1192, 1194, 1196 1198, 1200, 1202, 1204, 1206, 1208, 1210, 1212, 1214, 1216 1218, 1220, 1222, 1224, 1226, 1228, 1230, 1232, 1234, 1236 1238, 1240, 1242, 1244, 1246, 1248, 1250, 1252, 1254, 1256 1258, 1260, 1262, 1264, 1266, 1268, 1270, 1272, 1274, 1276 1278, 1280, 1282, 1284, 1286, 1288, 1290, 1292, 1294, 1296 1298, 1300, 1302, 1304, 1306, 1308, 1310, 1312, 1314, 1316 1318, 1320, 1322, 1324, 1326, 1328, 1330, 1332, 1334, 1336 1338, 1340, 1342, 1344, 1346, 1348, 1350, 1352, 1354, 1356 1358, 1360, 1362, 1364, 1366, 1368, 1370, 1372, 1374, 1376 1378, 1380, 1382, 1384, 1386, 1388, 1390, 1392, 1394, 1396 1398, 1400, 1402, 1404, 1406, 1408, 1410, 1412, 1414, 1416 1418, 1420, 1422, 1424, 1426, 1428, 1430, 1432, 1434, 1436 1438, 1440, 1442, 1444, 1446, 1448, 1450, 1452, 1454, 1456 1458, 1460, 1462, 1464, 1466, 1468, 1470, 1472, 1474, 1476 1478, 1480, 1482, 1484, 1486, 1488, 1490, 1492, 1494, 1496 1498, 1500, 1502, 1504, 1506, 1508, 1510, 1512, 1514, 1516 1518, 1520, 1522, 1524, 1526, 1528, 1530, 1532, 1534, 1536 1538, 1540, 1542, 1544, 1546, 1548, 1550, 1552, 1554, 1556 1558, 1560, 1562, 1564, 1566, 1568, 1570, 1572, 1574, 1576 1578, 1580, 1582, 1584, 1586, 1588, 1590, 1592, 1594, 1596 1598, 1600, 1602, 1604, 1606, 1608, 1610, 1612, 1614, 1616 1618, 1620, 1622, 1624, 1626, 1628, 1630, 1632, 1634, 1636 1638, 1640, 1642, 1644, 1646, 1648, 1650, 1652, 1654, 1656 1658, 1660, 1662, 1664, 1666, 1668, 1670, 1672, 1674, 1676 1678, 1680, 1682, 1684, 1686, 1688, 1690, 1692, 1694, 1696 1698, 1700, 1702, 1704, 1706, 1708, 1710, 1712, 1714, 1716 1718, 1720, 1722, 1724, 1726, 1728, 1730, 1732, 1734, 1736 1738, 1740, 1742, 1744, 1746, 1748, 1750, 1752, 1754, 1756 1758, 1760, 1762, 1764, 1766, 1768, 1770, 1772, 1774, 1776 1778, 1780, 1782, 1784, 1786, 1788, 1790, 1792, 1794, 1796 1798, 1800, 1802, 1804, 1806, 1808, 1810, 1812, 1814, 1816 8 1818, 1820, 1838, 1840, 1858, 1860, 1878, 1880, 1898, 1900, 1918, 1920, 1938, 1940, 1958, 1960, 1978, 1980, 1998, 2000, 2018, 2020, 2038, 2040, 2058, 2060, 2078, 2080, 2098, 2100, 2118, 2120, 2138, 2140, 2158, 2160, 2178, 2180, 2198, 2200, 2218, 2220, 2238, 2240, 2258, 2260, 2278, 2280, 2298, 2300, 2318, 2320, 2338, 2340, 2358, 2360, 2378, 2380, 2398, 2400, 2418, 2420, 2438, 2440, 2458, 2460, 2478, 2480, 1822, 1824, 1842, 1844, 1862, 1864, 1882, 1884, 1902, 1904, 1922, 1924, 1942, 1944, 1962, 1964, 1982, 1984 2002, 2004, 2022, 2024, 2042, 2044, 2062, 2064, 2082, 2084, 2102, 2104, 2122, 2124, 2142, 2144, 2162, 2164, 2182, 2184, 2202, 2204, 2222, 2224, 2242, 2244, 2262, 2264, 2282, 2284, 2302, 2304, 2322, 2324, 2342, 2344, 2362, 2364, 2382, 2384, 2402, 2404, 2422, 2424, 2442, 2444, 2462, 2464, 2482, 2484, 1826, 1828, 1846, 1848, 1866, 1868, 1886, 1888, 1906, 1908, 1926, 1928, 1946, 1948, 1966, 1968, 1986, 1988, 2006, 2008, 2026, 2028, 2046, 2048, 2066, 2068, 2086, 2088, 2106, 2108, 2126, 2128, 2146, 2148, 2166, 2168, 2186, 2188, 2206, 2208, 2226, 2228, 2246, 2248, 2266, 2268, 2286, 2288, 2306, 2308, 2326, 2328, 2346, 2348, 2366, 2368, 2386, 2388, 2406, 2408, 2426, 2428, 2446, 2448, 2466, 2468, 2486, 2488, 1830, 1832 1850, 1852 1870, 1872 1890, 1892 1910, 1912 1930, 1932 1950, 1952 1970, 1972 1990, 1992, 2010, 2012 2030, 2032 2050, 2052 2070, 2072 2090, 2092 2110, 2112 2130, 2132 2150, 2152 2170, 2172 2190, 2192 2210, 2212 2230, 2232 2250, 2252 2270, 2272 2290, 2292 2310, 2312 2330, 2332 2350, 2352 2370, 2372 2390, 2392 2410, 2412 2430, 2432 2450, 2452 2470, 2472 2490, 2492 1834, 1836, 1854, 1856, 1874, 1876, 1894, 1896, 1914, 1916, 1934, 1936, 1954, 1956, 1974, 1976, 1994, 1996, 2014, 2016, 2034, 2036, 2054, 2056, 2074, 2076, 2094, 2096, 2114, 2116, 2134, 2136, 2154, 2156, 2174, 2176, 2194, 2196, 2214, 2216, 2234, 2236, 2254, 2256, 2274, 2276, 2294, 2296, 2314, 2316, 2334, 2336, 2354, 2356, 2314, 2376, 2394, 2396, 2414, 2416, 2434, 2436, 2454, 2456, 2474, 2476, 2494, 2496, 9 2498, 2500, 2502, 2504, 2506, 2508, 2510, 2512, 2514, 2516, 2518, 2520, 2522, 2524, 2526, 2528, 2530, 2532, 2534, 2536, 2538, 2540, 2542, 2544, 2546, 2548, 2550, 2552, 2554, 2556, 2558, 2560, 2562, 2564, 2566, 2568, 2570, 2572, 2574, 2576, 2578, 2580, 2582, 2584, 2586, 2588, 2590, 2592, 2594, 2596, 2598, 2600, 2602, 2604, 2606, 2608, 2610, 2612, 2614, 2616, 2618, 2620, 2622, 2624, 2626, 2628, 2630, 2632, 2634, 2636, 2638, 2640, 2642, 2644, 2646, 2648, 2650, 2652, 2654, 2656, 2658, 2660, 2662, 2664, 2666, 2668, 2670, 2672, 2674, 2676, 2678, 2680, 2682, 2684, 2686, 2688, 2690, 2692, 2694, 2696, 2698, 2700, 2702, 2704, 2706, 2708, 2710, 2712, 2714, 2716, 2718, 2720, 2722, 2724, 2726, 2728, 2730, 2732, 2734, 2736, 2738, 2740, 2742, 2744, 2746, 2748, 2750, 2752, 2754, 275b, 2758, 2760, 2762, 2764, 2766, 2768, 2770, 2772, 2774, 2776, 2778, 2780, 2782, 2784, 2786, 2788, 2790, 2792, 2794, 2796, 2798, 2800, 2802, 2804, 2806, 2808, 2810, 2812, 2814, 2816, 2818, 2820, 2822, 2824, 2826, 2828, 2830, 2832, 2834, 2836, 2838, 2840, 2842, 2844, 2846, 2848, 2850, 2852, 2854, 2856, 2858, 2860, 2862, 2864, 2866, 2868, 2870, 2872, 2874, 2876, 2878, 2880, 2882, 2884, 2886, 2888, 2890, 2892, 2894, 2896, 2898, 2900, 2902, 2904, 2906, 2908, 2910, 2912, 2914, 2916, 2918, 2920, 2922, 2924, 2926, 2928, 2930, 2932, 2934, 2936, 2938, 2940, 2942, 2944, 2946, 2948, 2950, 2952, 2954, 2956, 2958, 2960, 2962, 2964, 2966, 2968, 2970, 2972, 2974, 2976, 2978, 2980, 2982, 2984, 2986, 2988, 2990, 2992, 2994, 2996, 2998, 3000, 3002, 3004, 3006, 3008, 3010, 3012, 3014, 3016, 3018 e 3020 , tal como apresentadas em W09 9/572 80 (< ou uma proteína que compreenda um fragmento imunogénico de uma ou mais destas SEQ ID, ou uma proteína que compreenda uma sequência com a mesma identidade (de preferência semelhança superior a 50%, por exemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) que uma destas SEQ ID). 10

Se a composição incluir uma proteína descrita em W099/28273, essa proteína é, de preferência, a proteína descrita na Figura 4 ou na Figura 13 de W097/28273.

Se a composição incluir uma proteína descrita em W096/29412, essa proteína compreende, de preferência, uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído pelas SEQ ID 1-8 apresentadas em W096/29412 (ou uma proteína que compreenda um fragmento imunogénico de uma ou mais destas SEQ ID, ou uma proteína que compreenda uma sequência com a mesma identidade (de preferência semelhança superior a 50%, por exemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) que uma destas SEQ ID).

Se a composição incluir uma proteína descrita em WO95/03413, essa proteína compreende, de preferência, uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído pelas SEQ ID 1-23 apresentadas em WO95/03413 (ou uma proteína que compreenda um fragmento imunogénico de uma ou mais destas SEQ ID, ou uma proteína que compreenda uma sequência com a mesma identidade (de preferência semelhança superior a 50%, por exemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) que uma destas SEQ ID).

Se a composição incluir uma proteína descrita em W099/31132, essa proteína compreende, de preferência, uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído pela SEQ ID 2 apresentada em W099/31132 (ou uma proteína que compreenda um fragmento imunogénico da SEQ ID 2, ou uma proteína que compreenda uma sequência com a mesma identidade (de preferência semelhança superior a 50%, por exemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) que a SEQ ID 2) . A SEQ ID 2 conforme descrita em W099/31132 corresponde à SEQ ID n.° 39 da presente aplicação. 11

Se a composição incluir uma proteína descrita em W099/58683, essa proteína compreende, de preferência, uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído pela SEQ ID 2 ou pela SEQ ID 4 apresentadas em W099/58683 (ou uma proteína que compreenda um fragmento imunogénico da SEQ ID 2 ou da SEQ ID 4, ou uma proteína que compreenda uma sequência com a mesma identidade (de preferência semelhança superior a 50%, por exemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) que a SEQ ID 2 ou a SEQ ID 4). As SEQ ID 2 e 4 conforme apresentadas em WO 99 /58683 correspondem às SEQ ID 40 e 41 da presente aplicação.

Se a composição incluir uma proteína descrita em W099/55873, essa proteína compreende, de preferência, uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído pela SEQ ID 2 ou pela SEQ ID 4 apresentadas em W099/55873 (ou uma proteína que compreenda um fragmento imunogénico da SEQ ID 2 ou da SEQ ID 4, ou uma proteína que compreenda uma sequência com a mesma identidade (de preferência semelhança superior a 50%, por exemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) que a SEQ ID 2 ou a SEQ ID 4).

Pormenores das proteínas Opa e PorA encontram-se em Wiertz et al. [Infect. Immun. (1996) 61:298-304]. PilC é descrita em Nassif et al. [PNAS USA (1994) 91:3769-73]. Omp85 é descrita em Manning et al. [Microb. Pathog. (1998) 25:11-21]. TbpA e TbpB são descritas em Ala'Aldeen & Borriello [Vaccine (1996) 14:49-53] bem como em Legrain et al. [Prorein Expr Purif (1995) 6:570-578].

Proteínas preferidas para o componente (b) são: • a proteína '919', tipificada pelas SEQ ID 3069-3074 e 3207-3241 de WO99/57280 (ver também a Figura 23 e o Exemplo 15 do mesmo documento). 12 • a proteína '235', tipificada pelas SEQ ID 869-874 e 3149- 3178 de WO99/57280 (ver também a Figura 20 e o Exemplo 12 do mesmo documento). • a proteína '519', tipificada pelas SEQ ID 3045-3056 e 3185-3206 de WO99/57280 (ver também a Figura 22 e o Exemplo 14 do mesmo documento). • a proteína '225', tipificada pelas SEQ ID 793-804 e 3115- 3148 de WO99/57280 (ver também a Figura 19 e o Exemplo 11 do mesmo documento). • a proteína 'ORF40', tipificada pelo exemplo 1 (SEQ ID 2,4,6) de W099/36544 (ver também a Figura 1 de WOOO/66741; ver também W099/31132 e W099/58683). As proteínas apresentadas na Figura 1 de WOOO/66741 correspondem às SEQ ID 18-38 da presente aplicação. • a proteína '287', tipificada pelo exemplo 9 de WO99/57280 (ver as SEQ ID 1199-1204, 3103-3108 e 3179-3184 no mesmo documento) . • a proteína 'ORF1', tipificada pelo exemplo 77 (SEQ ID 647- 654) de W099/24578 (ver também W099/55873 e n.° de catalogação AJ242535). • a proteína 'ORF4', tipificada pelo exemplo 26 (SEQ ID 215- 226) de W099/24578 (ver também a Figura 2 de WOOO/66741). • a proteína 'ORF46', tipificada pelo exemplo 55 (SEQ ID 457-466) de W099/24578 (ver também a Figura 12 de WOOO/66741). O componente (b) da composição é, de preferência, uma proteína NmB. É preferível que o componente (b) inclua uma proteína de uma estirpe de NmB diferente da estirpe a partir da qual deriva a OMV do componente (a), ou seja, a OMV no componente (a) é, de preferência, suplementado pelo componente imunogénico (b) de uma estirpe diferente de NmB. 13

Um ou mais dos componentes (ou todos os componentes) podem ser adsorvidos sobre A1(0H)3. O componente da preparação de membrana externa

As composições da invenção incluem uma preparação de membrana externa de NmB como componente (a). Esta encontra-se, de preferência, sob a forma de vesículas de membrana externa (OMV). A preparação de OMV a partir de NmB é bem conhecida na área. Os métodos para obter preparações adequadas são descritos, por exemplo, em: Claassen et al. [Vaccine (1996) 14:1001-1008]; Cartwright et al. [Vaccine (1999) 17:2612-2619]; Peeters et al. [Vaccine (1996) 14:1009-1015]; Fu et al.

[Biotechnology NY (1995) 12:170-74]; Davies et al. [J.Immunol.

Meth. (1990) 134:215-225]; Saunders et al. [Infect. Immun. (1999) 67:113-119]; Draabick et al. [Vaccine (2000) 18: 160-172]; Moreno et al. [Infect. Immun. (1985) 47:527-533];

Milagres et al. [Infect. Immun. (1994) 62:4419-4424]; Naess et al. [Infect. Immun. (1998) 66:959-965]; Rosenqvist et al.

[Dev.Biol.Stand. (1998) 92:323-333]; Haneberg et al. [Infect.

Immunn. (1998) 66:1334-41]; Andersen et al. [Vaccine (1997) 15:1225-34]; Bjune et al. [Lancet (1991) 338:1093-96] etc.

As OMV são, de preferência, obtidas como um extracto desoxicolato de NmB (i.e. obtidas a partir de NmB por extracção com desoxicolato) . O protocolo de extracção preferido é o descrito por Fredriksen et al. [Production, characterization and control of MenB vaccine "Folkehelsa": an outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease (1991) NIPH Ann. 14(2):67-80].

Uma estirpe preferida para extrair as OMV é a estirpe 44/76 (B:15:PI.7,16:P5.5:L3,7,9) de N.meningitidis. 14

Outros detalhes sobre o componente OMV podem ser encontrados, por exemplo, Bjune et al. [Lancet (1991) 338(8775): 1093-96], ou Fredriksen et al. [Characterization of high molecular weight component in MenB-vaccine 'Folkehelsa', an outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease. Páginas 818-824 de Pathobiology and immunobiology of Neisseriaceae (eds. Conde-Glez et al.) ISBN 968-6502-13-0]. O componente OMV pode ser adsorvido sobre adjuvante de hidróxido de aluminio. Uma proporção proteina:adjuvante preferida é 1:67 (p/p).

Uma dose tipica de vacina para um ser humano contém 25 yg de proteina, 2 yg LPS e 1,67 mg Al(OH)3, e pode ser injectada no músculo deltoide em volumes de 0,5 ml. O componente OMV (e.g. conforme obtido por extracção com desoxicolato) pode ser tratado de modo a remover-se determinados componentes. Por exemplo, é possivel remover agentes pirogénicos ou componentes tóxicos (por ex. LPS).

De preferência, o componente OMV deve conservar o componente antigénico de 80 kDa descrito por Fredriksen et al. [páginas 818-824 de Pathobiology and immunobiology of Neisseriaceae].

Mais preferivelmente, o componente OMV deve conservar uma proteina que inclua uma ou mais das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID 3, SEQ ID 5, SEQ ID 7, SEQ ID 9, SEQ ID 11, SEQ ID 13 [ou (i) uma proteina com a identidade de sequência de SEQ ID 3, SEQ ID 5, SEQ ID 7, SEQ ID 9, SEQ ID 11 ou SEQ ID 13 - dependendo da SEQ ID em particular, em que a semelhança entre as identidades de sequência é, de preferência, superior a 50% (por ex. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais), o que inclui mutações e variantes alélicas, ou (ii) uma proteina que compreende um fragmento imunogénico da 15 SEQ ID 1, SEQ ID 3, SEQ ID 5, SEQ ID 7, SEQ ID 9, SEQ ID 11 ou SEQ ID 13 - o fragmento deve compreender pelo menos n aminoácidos consecutivos da sequência e, dependendo da sequência em particular, n é 7 ou mais (por ex. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou mais).]

Combinação dos componentes (a) e (b)

Os componentes (a) e (b) podem ser combinados misturando simplesmente o componente (b) com uma preparação de membrana externa (por ex. misturando ORF4 com OMV norueguesa).

Como alternativa, estes podem ser combinados por manipulação de uma bactéria, de modo a que esta produza (de preferência hiperproduza) o componente (b) na respectiva membrana externa - uma preparação de membrana externa de uma bactéria recombinante deste tipo incluirá simultaneamente o componente (a) e o componente (b).

Bactérias adequadas para este tipo de manipulação incluem Neisseria meningitidis (qualquer serótipo ou estirpe), Neisseria lactamica, Neisseria cinerea ou qualquer outra Neisseria não tipificável. Também se pode utilizar outras bactérias Gram-negativas, como E.coli, Salmonella, Shigella, Bordetella, Yersinia, Helicobacter, etc. Os métodos de transformação são bem conhecidos na área.

Vacinas multivalentes

Opcionalmente, a composição da invenção pode também compreender um ou mais dos seguintes componentes: • um antigénio protector contra Neisseria meningitidis do serogrupo A; 16 • um antigénio protector contra Neisseria meningitidis do serogrupo C; • um antigénio protector contra Neisseria meningitidis do serogrupo Y; • um antigénio protector contra Neisseria meningitidis do serogrupo W; • um antigénio protector contra Haemophilus influenzae; • um antigénio protector contra pneumococos; • um antigénio protector contra a difteria; • um antigénio protector contra o tétano; • um antigénio protector contra a tosse convulsa; • um antigénio protector contra Helicobacter pylori; • um antigénio protector contra a poliomielite; e/ou • um antigénio protector contra o virus da hepatite B.

Exemplos preferidos destes componentes opcionais são: • um antigénio polissacarídico contra Neisseria meningitidis do serogrupo A; • um antigénio polissacarídico contra Neisseria meningitidis do serogrupo C, tal como descrito em Costantino et al. (1992)

Vaccine 10:691-698. • um antigénio polissacarídico contra Neisseria meningitidis do serogrupo Y; • um antigénio polissacarídico contra Neisseria meningitidis do serogrupo W; • um antigénio polissacarídico contra Haemophilus influenzae; • um antigénio polissacarídico contra pneumococos; 17 • um antigénio protector contra a difteria, constituído por um toxóide da difteria, como seja o mutante CRM197 [e.g. Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70]. • um antigénio protector contra o tétano, constituído por um toxóide do tétano [e.g. Wassilak & Orenstein, Capítulo 4 de Vaccines (eds. Plotkin & Mortimer), 1988] • um antigénio protector contra a tosse convulsa, compreendendo holotoxina de pertussis (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA); contendo também opcionalmente pertactina e/ou aglutinogénios 2 e 3 [e.g. Gustafsson et al. (1996) N.

Engl. J. Med. 334:349-355; Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238] . • um antigénio protector contra H.pylori, compreendendo uma ou mais proteínas CagA (e.g. WO93/18150), VacA (e.g. WO93/18150), NAP (e.g. WO99/53310), HopX (e.g. W098/04702), HopY (e.g. W098/04702), urease. • um antigénio protector contra o vírus da hepatite B, constituído por um antigénio de superfície HBV e/ou um antigénio nuclear HBV.

Quando a composição inclui um antigénio contra a difteria, inclui de preferência também antigénios contra o tétano e a poliomielite. Quando a composição inclui um antigénio contra o tétano, inclui de preferência também antigénios contra a difteria e a poliomielite. Quando a composição inclui um antigénio contra a poliomielite, inclui de preferência também antigénios contra a difteria e o tétano. A toxina de pertussis é uma proteína tóxica e, quando está presente na composição, é de preferência destoxifiçada. A destoxificação pode ser realizada por meios químicos e/ou genéticos. Um mutante destoxifiçado preferido é o mutante com dupla mutação 9K/129G [e.g. Rappuoli (1997) Nature Medicine 3:374-376] . 18

Quando a composição inclui uma proteína que existe sob diferentes formas, nascente e madura, utiliza-se de preferência a forma madura da proteína. Por exemplo, quando se inclui NspA, (W096/29412; ver também Martin et al. (1997) J. Exp. Med 185 1173-1183), utiliza-se de preferência a forma madura da proteína sem o peptídeo sinalizador.

Quando a composição inclui um antigénio polissacarídico, o polissacárido é, de preferência, conjugado à proteína transportadora.

Terapia, profilaxia e diagnóstico A composição da invenção é, de preferência, uma vacina. As vacinas de acordo com a invenção podem ser profilácticas (ou seja, para prevenir a infecção) ou terapêuticas (ou seja, para tratar a doença após infecção). A invenção também disponibiliza as composições da invenção para serem utilizadas como medicamentos (de preferência como vacinas) ou como reagentes para diagnóstico. Também providencia o uso de uma composição de acordo com a invenção no fabrico de: (i) um medicamento para o tratamento ou prevenção da infecção por bactérias da família da Neisseria; (ii) um reagente de diagnóstico para a detecção da presença de bactérias da família da Neisseria ou de anticorpos contra bactérias da família da Neisseria; e/ou (iii) um reagente que tem a capacidade de originar anticorpos contra bactérias da família da Neisseria. As referidas bactérias da família da Neisseria podem pertencer a qualquer espécie ou estirpe (como N.gonorrhoeae), mas são de preferência N.meningitidis, especialmente do serogrupo B (NmB). A invenção também providencia um método para tratar um doente, que compreende a administração ao doente de uma 19 quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de acordo com a invenção. 0 método é, de preferência, a imunização.

Processos

De acordo com outros aspectos, a invenção providencia diversos processos. É providenciado um processo para produzir uma composição da invenção, que inclui o passo de extrair (por ex. extracção com desoxicolato) de OMV de N.meningitidis.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

As sequências na listagem de sequências são: SEQ ID DESCRIÇÃO 1 Sequência da proteína N-terminal de N.meningitidis do serogrupo B, 80-85kDa 2 Gene completo de N.meningitidis do serogrupo B 3 Proteína codificada pela SEQ ID 2 4 Proteína e peptídeo de sinalização da SEQ ID 3 5 Proteína madura da SEQ ID 3 6 Gene completo de N.gonorrhoeae, homólogo da SEQ ID 2 7 Proteína codificada pela SEQ ID 6 8 Proteína e peptídeo de sinalização da SEQ ID 7 9 Proteína madura da SEQ ID 7 20 10 Gene completo de N. meningitidis do serogrupo A, homólogo da SEQ ID 2 11 Proteína codificada pela SEQ ID 10 12 Proteína e peptideo de sinalização da SEQ ID 11 13 Proteína madura da SEQ ID 11 14 Proteina '919' de nmb estirpe 2996

MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

Segue-se um resumo de técnicas e procedimentos padronizados que podem ser utilizados para realizar a invenção (ou seja, utilizar as sequências descritas para fins de vacinação ou diagnóstico). Este resumo não constitui uma limitação à invenção, apresentando exemplos que podem ser utilizados, mas que não são requisitos.

Geral

Na prática, a presente invenção utiliza, excepto quando indicado em contrário, técnicas convencionais da biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que se encontram ao alcance de alguém familiarizado com a área. Estas técnicas são explicadas em detalhe na literatura e.g. Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edição (1989) ; DNA Cloning, Volumes I e II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984);

Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986);

Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); a colecção 21

Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller e M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor

Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principies and Practice, Segunda Edição (Springer-Verlag, N.Y.) e Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir e C. C. Blackwell eds 1986).

Nesta especificação utilizam-se as abreviações padrão para os nucleótidos e aminoácidos.

As proteínas utilizadas com a invenção podem ser preparadas por diversos meios (por ex. expressão recombinante, purificação a partir de culturas celulares, síntese química, etc.) e sob diversas formas (por ex. nativas, fusões etc.). De preferência, são preparadas numa forma substancialmente pura (ou seja, substancialmente isentas de outras proteínas de Neisseria ou da célula hospedeira).

Os ácidos nucleicos utilizados com a invenção podem ser preparados de diversas maneiras (por ex. por síntese química, genómica ou bibliotecas de cDNA, a partir do próprio organismo, etc.) e podem assumir diversas formas (por ex. cadeia simples, cadeia dupla, vectores, sondas etc.). 0 termo "ácido nucleico" inclui DNA e RNA, bem como os seus análogos, tal como os que contêm esqueletos modificados, e ácidos nucleicos peptídicos (PNA) etc.

Definições

Uma composição contendo X está "substancialmente isenta de" Y quando pelo menos 85% do peso total de X+Y na composição é X. De preferência, X constitui pelo menos cerca de 90% do peso do total de X+Y na composição, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95% ou mesmo 99% do peso. 22 0 termo "compreendendo" significa "incluindo" bem como "consistindo", e.g. uma composição que "compreende" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional a X, como seja X + Y. 0 termo "heterólogo" refere-se a dois componentes biológicos que não se encontram juntos na natureza. Os componentes podem ser células hospedeiras, genes ou regiões reguladoras, como por exemplo promotores. Apesar de os componentes heterólogos não se encontrarem juntos na natureza, podem funcionar em conjunto, como quando um promotor heterólogo de um gene está operacionalmente ligado ao gene. Outro exemplo é quando uma sequência de Neisseria é heteróloga de uma célula hospedeira de ratinho. Outro exemplo seriam dois epitopos da mesma proteina ou de proteinas diferentes, que foram montadas numa única proteina, numa conformação que não se encontra na natureza.

Uma "origem de replicação" é uma sequência de polinucleótidos que inicia e regula a replicação de polinucleótidos, como um vector de expressão. A origem de replicação comporta-se como uma unidade autónoma da replicação de polinucleótidos na célula, capaz de controlar a sua própria replicação. Uma origem de replicação pode ser necessária para que um vector se replique numa célula hospedeira particular. Com algumas origens de replicação, é possível reproduzir um vector de expressão com um elevado número de cópias na presença das proteínas apropriadas na célula. Exemplos de origens são as sequências que se replicam autonomamente, activas nas leveduras; e o antigénio T virai activo nas células COS-7.

A identidade entre proteínas é determinada, de preferência, pelo algoritmo de Smith-Waterman para determinação de homologia, conforme implementado pelo programa MPSRCH (Oxford Molecular), utilizando um alinhamento de GAP 23 por afinidade com os parâmetros "gap open penalty" = 12 e "gap extension penalty" = 1. Tipicamente, uma identidade de 50% ou mais entre duas proteínas é tomada como indicação de equivalência funcional.

Conforme utilizado no presente documento, uma "variante alélica" de uma molécula de ácido nucleico ou de uma região para a qual a sequência de ácidos nucleicos é aqui fornecida é uma molécula de ácido nucleico ou uma região que ocorre na mesma posição (locus) do genoma de outro ou segundo isolado e que, devido a variações naturais causadas, por exemplo, por mutação ou recombinação, apresenta uma sequência de ácidos nucleicos semelhante, mas não idêntica. Uma variante alélica de uma região codificadora codifica tipicamente uma proteína com uma actividade semelhante à da proteína codificada pelo gene com a qual é comparada. Uma variante alélica também pode compreender uma alteração nas regiões 5' ou 3' não traduzidas do gene, tal como as regiões reguladoras (e.g. ver a patente dos EUA 5,753,235).

Sistemas de expressão

As sequências de nucleótidos de Neisseria podem ser expressas através de uma diversidade de sistemas de expressão; por exemplo, os sistemas usados com células de mamíferos, baculovírus, vegetais, bactérias e leveduras. i. Sistemas e expressão com células de mamíferos

Os sistemas de expressão com células de mamífero são conhecidos na área. Um promotor mamífero é qualquer sequência de DNA capaz de se ligar à RNA polimerase de mamífero e iniciar a transcrição a jusante (downstream) (3') de uma sequência codificadora (por ex. gene estrutural) em mRNA. Um 24 promotor terá uma região iniciadora de transcrição, que se localiza geralmente próxima da extremidade 5' da sequência codificadora, e um motivo TATA (TATA box), geralmente localizado 25-30 pares de bases (bp) a montante (upstream) do ponto de iniciação da transcrição. Pensa-se que a TATA box comanda a RNA polimerase II a iniciar a sintese de RNA no ponto correcto. Um promotor de mamifero também conterá um elemento promotor a montante, geralmente localizado entre 100 a 200 pares de bases a montante da TATA box. Um elemento promotor a montante determina a velocidade a que a transcrição é iniciada e pode actuar em qualquer uma das orientações [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in

Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed.].

Os genes virais de mamifero são frequentemente altamente expressados e apresentam uma gama de hospedeiros alargada; por isso, as sequências que codificam genes virais de mamifero apresentam-se como sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem o promotor precoce SV40, o promotor LTR do virus do tumor mamário murino (MMTV), o promotor principal tardio do adenovírus (Ad MLP) e o promotor do virus de herpes simplex. Além disso, as sequências derivadas de genes não virais, tal como o gene da metalotioneina de murino, também mostram ser sequências promotoras úteis. A expressão pode ser constitutiva ou regulada (induzivel). Dependendo do promotor, pode ser induzida com glucocorticóides em células que respondem a hormonas. A presença de um elemento estimulador (enhancer), combinada com os elementos promotores acima descritos, aumentará geralmente os niveis de expressão. Um estimulador é uma sequência de DNA reguladora que pode estimular a transcrição até 1000 vezes quando ligado a promotores homólogos ou heterólogos, com a sintese a começar no ponto 25 iniciador do RNA normal. Os estimuladores também apresentam actividade quando estão localizados a montante (upstream) ou a jusante (downstream) no ponto de iniciação da transcrição, com uma orientação normal ou invertida, ou a uma distância superior a 1000 nucleótidos do promotor [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular

Biology of the Cell, 2a ed.]. Os elementos estimuladores derivados de virus podem ser particularmente úteis, pois têm geralmente uma gama de hospedeiros mais alargada. Exemplos incluem o estimulador do gene precoce SV40 [Dijkema et al (1985) EMBO J. 4:761] e o intensificador/promotores derivados da sequência de repetição terminal longa (LTR) do virus de sarcoma de Rous [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sei. 79:6777] e do citomegalovirus humano [Boshart et al. (1985)

Cell 41:521]. Adicionalmente, alguns estimuladores podem ser regulados e ficam activos apenas na presença de um indutor, como uma hormona ou um ião metálico [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237] .

Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente em células de mamifero. Uma sequência promotora pode ser ligada directamente à molécula de DNA, em cujo caso o primeiro aminoácido na parte N-terminal da proteína recombinante será sempre metionina, que é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a porção N-terminal pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio. Em alternativa, as proteínas exógenas podem ser secretadas da célula para o meio de crescimento através da criação de moléculas de DNA quiméricas que codifiquem uma proteína de fusão constituída por um fragmento de sequência líder que assegura a secreção da proteína exógena em células de mamíferos. De preferência, existem sítios de processamento codificados entre o fragmento líder e o gene exógeno que pode ser clivado in vivo ou in vitro. O fragmento da sequência 26 lider codifica geralmente um peptídeo sinalizador constituido por aminoácidos hidrofóbicos que controlam a secreção da proteína da célula. 0 líder tripartido do adenovírus é um exemplo de uma sequência líder que assegura a secreção de uma proteína exógena em células de mamíferos.

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição e de poliadenilação reconhecidas por células de mamíferos são regiões reguladoras localizadas na posição 3' em relação ao codão stop da tradução e, por isso, flanqueiam a sequência codificadora em conjunto com os elementos promotores. A extremidade 3' do mRNA maduro é formada por clivagem pós-transcrição específica ao sítio e poliadenilação [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. In Transcription and splicing (ed. B.D. Hames e D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sei. 14:105]. Estas sequências orientam a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido no polipeptídeo codificado pelo DNA. Exemplos de sinais de terminação da transcrição/poliadenilação incluem os derivados do SV40 [Sambrook et al (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Geralmente, os componentes acima descritos, incluindo um promotor, um sinal de poliadenilação e uma sequência terminadora da transcrição são agrupados na construção de expressão. Se desejado, também se pode incluir estimuladores, intrões com sítios dadores e aceitadores de splicing funcional e sequências líder numa construção de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicão, tal como um elemento extra-cromossómico (por ex. plasmídeos) capaz de se manter estável um anfitrião como as células de mamífero ou bactérias. Os sistemas de replicação dos mamíferos incluem os derivados de vírus animais, que 27 precisam de factores que actuam em trans para a replicação. Por exemplo, os plasmídeos que contêm os sistemas de replicação dos papovavírus, como o SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] ou o poliomavirus, replicam-se com um elevado número de cópias na presença do antigénio T virai apropriado. Exemplos adicionais de replicões mamíferos incluem os derivados de papilomavírus bovino e de vírus de Epstein-Barr. Adicionalmente, o replicão pode ter dois sistemas de replicação, o que permite manter-se, por exemplo, nas células de mamíferos para expressão e num anfitrião procariótico para clonagem e amplificação. Exemplos de vectores vaivém mamífero-bactéria incluem o pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] e pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074] . O processo de transformação utilizado depende do hospedeiro a ser transformado. Os métodos de introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamíferos são conhecidos da arte e incluem a transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulação dos polinucleótidos em lipossomas e microinjecção directa de DNA nos núcleos.

As linhagens de células disponíveis como anfitriões são conhecidas da arte e incluem muitas linhas de células imortalizadas disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, sem se limitar a, células de ovários de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular (por ex. Hep G2) e uma série de outras linhas de células. 28 ii. Sistemas de Baculovírus 0 polinucleótido que codifica a proteína também pode ser inserido num vector de expressão de insecto adequado e ser funcionalmente ligado aos elementos de controlo nesse vector. A construção do vector utiliza técnicas que são conhecidas da arte. De um modo geral, os componentes do sistema de expressão incluem um vector de transferência, geralmente um plasmideo bacteriano, que contém um fragmento do genoma do baculovirus e também um sitio de restrição conveniente para inserção do gene ou genes heterólogos a expressar; um baculovirus do tipo selvagem com uma sequência homóloga à do fragmento especifico do baculovirus no vector de transferência (isto permite a recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma do baculovirus); e células hospedeiras de insecto apropriadas e meio de crescimento.

Depois de inserir a sequência de DNA que codifica a proteína no vector de transferência, o vector e o genoma virai de tipo selvagem são transfectados para uma célula hospedeira de insecto, onde o vector e o genoma virai são recombinados. 0 vírus recombinante empacotado é expresso e as placas recombinantes são identificadas e purificadas. Os materiais e métodos para os sistemas de expressão de baculovírus/células de insecto estão disponíveis comercialmente sob a forma de kit, inter alia, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac") . Estas técnicas são geralmente conhecidas para os especialistas da arte e estão extensamente descritas em Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (a partir de agora referido como "Summers and Smith").

Antes de introduzir a sequência de DNA que codifica a proteína no genoma do baculovírus, os componentes acima descritos, incluindo um promotor, um líder (se desejado), a sequência codificadora em questão e a sequência de terminação da transcrição, são geralmente reunidos numa construção 29 intermédia de translocação (vector de transferência). Esta construção pode conter um único gene e elementos reguladores funcionalmente ligados; múltiplos genes, cada um com o respectivo conjunto de elementos reguladores funcionalmente ligados; ou múltiplos genes regulados pelo mesmo conjunto de elementos reguladores. As construções intermédias de translocação são frequentemente mantidas num replicão, tal como um elemento extra-cromossómico (por ex. plasmídeos) capaz de se manter estável um anfitrião como uma bactéria. 0 replicão terá um sistema de replicação, o que lhe permite manter-se num hospedeiro adequado para clonagem e amplificação.

Actualmente, o vector de transferência mais comum utilizado para introduzir genes estranhos no AcNPV é o pAc373. Foram concebidos muitos outros vectores conhecidos dos peritos na arte. Estes incluem, por exemplo, o pVL985 (que altera o codão inicial da poliedrina de ATG para ATT e que introduz um sitio de clonagem BamHI 32 pares de bases a jusante do ATT) ver Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31.

Geralmente, o plasmídeo também contém o sinal de poliadenilação da poliedrina (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) e um gene procariótico de resistência à ampicilina (amp) e origem de replicação para selecção e propagação em E. coli.

Os vectores de transferência de Baculovírus contêm geralmente um promotor de baculovirus. Um promotor de baculovirus é qualquer sequência de DNA capaz de ligar uma RNA polimerase de baculovirus e iniciar a transcrição a jusante (5' a 3') de uma sequência codificadora (por ex. um gene estrutural) em mRNA. Um promotor conterá uma região iniciadora da transcrição que se encontra geralmente numa posição próxima da extremidade 5' da sequência codificadora. Esta região iniciadora da transcrição inclui geralmente um sitio de 30 ligação da RNA polimerase e um sítio de iniciação da transcrição. Um vector de transferência de baculovírus também pode conter um segundo domínio chamado estimulador (enhancer), que, quando está presente, se encontra geralmente numa posição distai em relação ao gene estrutural. A expressão pode ser regulada ou constitutiva.

Os genes estruturais, abundantemente transcritos tardiamente num ciclo de infecção virai, fornecem sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem sequências derivadas do gene que codifica a proteína do poliedro virai, Friesen et al., (1986) "The Regulation of Baculovírus Gene

Expression," in: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler) ; EPO Publ. N.°s 127 839 e 155 476; e o gene que codifica a proteína plO, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69:765. 0 DNA que codifica sequências sinalizadoras adequadas pode ser derivado de genes de proteínas secretadas de insecto ou baculovírus, tal como o gene da poliedrina do baculovírus (Carbonell et al. (1988) Gene, 73:409). Em alternativa, como os sinais das modificações pós-tradução das células de mamíferos (como a clivagem do peptídeo sinalizador, clivagem proteolítica e fosforilação) parecem ser reconhecidos pelas células de insectos, e os sinais necessários para a secreção e acumulação nuclear também parecem ser conservados entre as células de invertebrados e de vertebrados, os líderes de origens que não sejam insectos, tal como os derivados de genes codificadores do interferão a humano, Maeda et al., (1985), Nature 315:592; peptídeo libertador de gastrina humano, Lebacq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 humano, Smith et al., (1985) Proc. Nat'l Acad. Sei. USA, 82:8404; IL-3 de ratinho, (Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; e glucocerebrosidase humana, Martin et al. (1988) DNA, 31 7:99, também podem ser usados para conseguir secreção em insectos.

Um polipeptideo ou poliproteína recombinante pode ser expressado intracelularmente ou, se for expressado com as sequências reguladoras adequadas, pode ser secretado. Uma boa expressão intracelular de proteínas exógenas não fundidas requer geralmente genes heterólogos que têm idealmente uma sequência lider curta contendo os sinais iniciadores da tradução adequados precedendo um sinal inicial ATG. Se desejado, a metionina na porção N-terminal pode ser clivada da proteína madura por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Como alternativa, as poliproteínas ou proteínas recombinantes que não sejam secretadas naturalmente podem ser secretadas da célula de insecto através da criação de moléculas de DNA quimérico que codificam uma proteína de fusão composta de um fragmento com uma sequência líder que assegura a secreção da proteína exógena em insectos. 0 fragmento da sequência líder codifica geralmente um peptídeo sinalizador constituído por aminoácidos hidrofóbicos que controlam a translocação da proteína para dentro do retículo endoplasmático.

Depois da inserção da sequência de DNA e/ou do gene que codifica o produto de expressão precursor da proteína, uma célula de insecto anfitriã é co-transformada com o DNA heterólogo do vector de transferência e o DNA genómico do baculovírus de tipo selvagem - geralmente por co-transfecção. A sequência promotora e de terminação da transcrição da construção conterá, geralmente, uma secção com 2-5kb do genoma do baculovírus. Os métodos de introdução de DNA heterólogo no sítio desejado no baculovírus são conhecidos da arte. (Ver Summers and Smith supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol.

Cell. Biol. (1983) 3:2156; e Luckow and Summers (1989)). Por 32 exemplo, a inserção pode dar-se num gene como o gene da poliedrina, por recombinação homóloga de duplo crossover; a inserção também pode dar-se num sítio da enzima de restrição modificado para fazer parte do gene de baculovírus desejado. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. Quando é clonada em vez do gene da poliedrina no vector de expressão, a sequência de DNA é flanqueada de ambos os lados, 5' e 3', por sequências específicas da poliedrina e fica localizada a jusante do promotor da poliedrina. 0 vector de expressão de baculovírus recém-formado é depois empacotado num baculovírus recombinante infeccioso. A recombinação homóloga ocorre a frequências baixas (entre cerca de 1% e cerca de 5%); assim, a maioria do vírus produzido após a co-transfecção continua a ser um vírus do tipo selvagem. Por isso, é necessário um método para identificar os vírus recombinantes. Uma vantagem do sistema de expressão é um rastreio visual que permite distinguir os vírus recombinantes. A proteína da poliedrina, que é produzida pelos vírus nativos, é produzida a níveis muito elevados nos núcleos das células infectadas nas fases tardias após infecção virai. A proteína da poliedrina acumulada forma corpos oclusivos que também contêm partículas incrustadas. Estes corpos oclusivos, com dimensões que podem atingir os 15 ym, são altamente refractários, o que lhes dá um aspecto brilhante e luminoso que é fácil de visualizar à luz do microscópio. As células infectadas com vírus recombinantes não têm estes corpos oclusivos. Para distinguir vírus recombinantes de vírus do tipo selvagem, o sobrenadante da transfecção é cultivado para obtenção de placas sobre uma monocamada de células de insecto através de técnicas conhecidas dos peritos na arte.

Nomeadamente, as placas são analisadas à luz do microscópio para detecção da presença (indicativa de vírus do tipo selvagem) ou ausência (indicativa do vírus recombinante) de corpos oclusivos. "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 33 (Ausubel et al. eds) em 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith, supra; Miller et al. (1989). Os vectores de expressão de baculovírus recombinante foram desenvolvidos para infectar diversos tipos de células de insecto. Por exemplo, foram desenvolvidos baculovirus para, entre outros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni (WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986)

Nature 321:718; Smith et al. , (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; e de um modo geral, Fraser, et al. (1989) In Vitro Cell. Dev.

Biol. 25:225).

As células e meios de cultura de células estão disponíveis comercialmente quer para expressão directa quer para expressão por fusão de polipeptídeos heterólogos num sistema de expressão/baculovírus; a tecnologia de cultura celular é conhecida para a generalidade dos especialistas na arte. Ver, por ex. Summers and Smith supra.

As células de insecto modificadas podem ser cultivadas num meio nutriente apropriado, que permita uma manutenção estável dos plasmídeos presentes no insecto hospedeiro modificado. Quando o gene do produto de expressão é de controlo induzivel, o hospedeiro pode ser cultivado a elevada densidade e a expressão induzida. Em alternativa, quando a expressão é constitutiva, o produto será expresso continuamente no meio e o meio nutriente terá de ser circulado continuamente, para remover o produto desejado e acrescentar os nutrientes consumidos. 0 produto pode ser purificado por técnicas como a cromatografia, por ex. HPLC, cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta iónica, etc.; electroforese; centrifugação de gradiente de densidade; extracção por solventes, ou similares. 0 produto pode ser ainda mais purificado, conforme apropriado e necessário, de modo a remover substancialmente qualquer proteína de insecto 34 que também seja secretada para o meio ou que resulte da lise das células de insecto, de modo a obter-se um produto que está pelo menos substancialmente isento de resíduos do hospedeiro, e.g. proteínas, lípidos e polissacarídeos. A fim de se obter a expressão da proteína, as células hospedeiras recombinantes derivadas dos transformantes são incubadas sob condições que permitam a expressão da sequência codificadora da proteína recombinante. Estas condições variam, dependendo da célula hospedeira seleccionada. Contudo, as condições são facilmente verificáveis para alguém com conhecimentos gerais na arte, com base nos conhecimentos actuais na arte. iii. Sistemas vegetais São conhecidos muitos sistemas de expressão genética em cultura celular e em plantas inteiras. Os exemplos de sistemas de expressão genética celular em plantas incluem os descritos em patentes como: US 5,693,506; US 5,659,122; e US 5,608,143. Outros exemplos de expressão genética em culturas celulares vegetais foram descritos por Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991) . É possível encontrar descrições de peptídeos sinalizadores de proteínas vegetais além das referências acima descritas em Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler et al., Plant Molecular Biology 3: 407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al., Gene 55:353-356 (1987); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992) . Uma descrição da regulação da expressão dos genes das plantas pela fito-hormona, ácido giberélico e enzimas secretadas induzidas pelo ácido giberélico pode encontrar-se em R.L. Jones and J. MacMillin, Gibberellins: in: Advanced 35

Plant Physiology, . Malcolm B. Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, Londres, pp. 21-52. Referências gue descrevem outros genes regulados por via metabólica: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038(1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel and Hickey, Proc. Natl. Acad. Sei. 84:1337-1339 (1987)

Tipicamente, utilizando técnicas conhecidas da arte, uma sequência de polinucleótidos desejada é inserida numa cassete de expressão contendo elementos de regulação genética concebida para operar em plantas. A cassete de expressão é inserida num vector de expressão desejado com sequências companheiras a montante e a jusante da cassete de expressão adequada à expressão num hospedeiro vegetal. As sequências companheiras serão de origem plasmidica ou virai e providenciarão as caracteristicas necessárias ao vector para permitir que os vectores movam o DNA de um hospedeiro de clonagem original, como uma bactéria, para a planta hospedeira desejada. A construção vector bactéria/planta básica providenciará, de preferência, uma origem de replicação procariótica para um leque alargado de hospedeiros; um marcador seleccionável procariótico; e, para transformações por Agrobacterium, sequências de DNA T para a transferência mediada por Agrobacterium para cromossomas de planta. Quando o gene heterólogo não for de fácil detecção, a construção incluirá de preferência também um gene marcador seleccionável adequado para determinar se uma célula vegetal foi transformada. Uma revisão geral de marcadores adequados, por exemplo para os membros da familia das gramineas, pode ser encontrada em Wilmink e Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11(2):165-185.

As sequências adequadas que permitem a integração da sequência heteróloga no genoma da planta também são recomendadas. Estas podem incluir sequências de transposão e 36 similares para recombinação homóloga, bem como sequências Ti que permitem a inserção aleatória de uma cassete de expressão heteróloga num genoma de planta. Marcadores procarióticos seleccionáveis adequados incluem a resistência a antibióticos, como a ampicilina ou a tetraciclina. Podem estar presentes no vector outras sequências de DNA que codificam funções adicionais, como é bem conhecido na arte.

As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem ser incluídos numa cassete de expressão para a expressão da(s) proteína(s) de interesse. Geralmente, existirá apenas uma cassete de expressão, apesar de ser possível utilizar duas ou mais. A cassete de expressão recombinante conterá, em adição à sequência codificadora da proteína heteróloga, os seguintes elementos: uma região promotora, sequências 5' da planta não traduzidas, codão de iniciação dependendo de o gene estrutural vir equipado com um codão deste tipo ou não, e uma sequência de terminação da transcrição e tradução. Sítios únicos da enzima de restrição nas extremidades 5' e 3' da cassete permitem uma fácil inserção num vector pré-existente.

Uma sequência codificadora heteróloga pode referir-se a qualquer proteina relacionada com a presente invenção. A sequência codificadora da proteína de interesse codificará um peptídeo sinalizador que permite o processamento e a translocação da proteína, conforme apropriado, e geralmente não terá qualquer sequência que possa resultar na ligação da proteína desejada da invenção a uma membrana. Uma vez que, na sua maioria, a região iniciadora da transcrição será de um gene que é expressado e translocado durante a germinação, também se poderá providenciar a translocação da proteína de interesse utilizando o peptídeo sinalizador que assegura a translocação. Desse modo, a(s) proteína (s) de interesse serão translocadas das células onde foram expressadas e podem ser colhidas de forma eficiente. Tipicamente, a secreção nas 37 sementes dá-se através da camada celular da aleurona ou do escutelo para dentro do endosperma da semente. Apesar de não ser necessário que a proteína seja secretada das células nas quais foi produzida, isso facilita o isolamento e purificação da proteína recombinante.

Uma vez que a expressão final do produto do gene desejado será numa célula eucariótica, é desejável determinar se alguma porção do gene clonado contém sequências que serão processadas como intrões pelo mecanismo do spliciossoma do anfitrião. Caso isso aconteça, a mutagénese sítio-dirigida da região do "intrão" pode ser conduzida de modo a prevenir a perda de uma porção da mensagem genética como falso código de intrão, Reed e Maniatis, Cell 41:95-105, 1985. O vector pode ser micro-injectado directamente nas células da planta utilizando micropipetas para transferir mecanicamente o DNA recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genet, 202:179-185, 1985. O material genético também pode ser transferido para a célula da planta utilizando polietileno glicol, Krens, et al., Nature, 296, 72-74, 1982. Outro método de introdução de segmentos de ácidos nucleicos é por penetração balística de alta velocidade de pequenas partículas com o ácido nucleico integrado na matriz de pequenas contas ou partículas ou à sua superfície, Klein, et al., Nature, 327, 70-73, 1987 e Knudsen e Muller, 1991, Planta, 185:330-336 Teaching particle bombardment of barley endosperm to create transgenic barley. Outro método ainda de introdução seria por fusão de protoplastos com outras entidades, sejam estas minicélulas, células, lisossomas ou outros corpos com superfícies lipídicas que possam ser fundidos, Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 1859-1863, 1982. O vector também pode ser introduzido nas células da planta por electroporação. (Fromm et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 82:5824, 1985). Nesta técnica, os protoplastos da 38 planta são electroporados na presença de plasmídeos contendo a construção genética. Os impulsos eléctricos de alta intensidade permeabilizam de forma reversível as biomembranas, permitindo a introdução dos plasmídeos. Os protoplastos vegetais electroporados voltam a formar a parede celular, dividem-se e formam o callus (tecido indiferenciado) da planta.

Todas as plantas a partir das quais se pode isolar e cultivar protoplastos para obter plantas inteiras regeneradas podem ser transformadas pela presente invenção de modo a recuperar plantas inteiras que contenham o gene transferido. Sabe-se que praticamente todas as plantas podem ser regeneradas a partir da cultura de células ou de tecidos, incluindo, sem se limitar a, todas as principais espécies de cana-de-açúcar, beterraba sacarina, algodão, fruta e outras árvores, legumes e vegetais. Algumas plantas adequadas incluem, por exemplo, espécies dos géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum e Datura.

Os meios de regeneração variam entre as espécies de plantas, mas de um modo geral providencia-se primeiro uma suspensão de protoplastos transformados que contêm cópias do gene heterólogo. 0 tecido indiferenciado (callus) é formado e é possível induzir rebentos a partir do callus, que são subsequentemente enraizados. Alternativamente, a formação de embriões pode ser induzida a partir da suspensão de protoplastas. Estes embriões germinam como embriões normais 39 para formar plantas. Os meios de cultura conterão geralmente diversos aminoácidos e hormonas, tal como a auxina e citocininas. Também é vantajoso adicionar ácido glutâmico e prolina ao meio, especialmente no caso de espécies como o milho e a alfafa. Os caules e as raizes desenvolvem-se normalmente de forma simultânea. Uma regeneração eficiente dependerá do meio, do genótipo e do historial da cultura. Se estas três variáveis forem controladas, a regeneração será totalmente reproduzível e repetivel.

Nalguns sistemas de cultura celular vegetal, a proteina desejada da invenção pode ser excretada ou, em alternativa, a proteina pode ser extraida da planta completa. Quando a proteina desejada da invenção é secretada para o meio, pode ser recolhida. Em alternativa, os embriões e as meias-sementes sem embrião ou outros tecidos da planta podem ser destruídos mecanicamente de modo a libertar a proteina secretada entre as células e tecidos. A mistura pode ser suspendida numa solução tampão para se recuperar as proteínas solúveis. São então utilizados métodos convencionais de isolamento e purificação de proteínas para purificar a proteina recombinante. Os parâmetros tempo, temperatura, pH, oxigénio e volumes são ajustados por métodos de rotina para optimizar a expressão e recuperação da proteina heteróloga. iv. Sistemas Bacterianos

As técnicas de expressão bacteriana são conhecidas na área. Um promotor bacteriano é qualquer sequência de DNA capaz de se ligar à RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição a jusante (downstream) (3') de uma sequência codificadora (por ex. gene estrutural) em mRNA. Um promotor conterá uma região iniciadora da transcrição que se encontra geralmente numa posição próxima da extremidade 5' da sequência 40 codificadora. Esta região iniciadora da transcrição inclui geralmente um sitio de ligação da RNA polimerase e um sitio de iniciação da transcrição. Um promotor bacteriano também pode ter um segundo domínio chamado operador, no qual pode haver sobreposição com um sítio de ligação da RNA polimerase adjacente no qual a síntese do RNA começa. 0 operador permite a transcrição (induzível) regulada negativa, uma vez que uma proteína repressora do gene pode ligar-se ao operador e, assim, inibir a transcrição de um gene específico. A expressão constitutiva pode ocorrer na ausência de elementos reguladores negativos, como o operador. Adicionalmente, a regulação positiva pode ser conseguida por uma sequência que liga uma proteína activadora do gene, que, quando está presente, se encontra geralmente em posição proximal (5' ) relativamente à sequência que liga a RNA polimerase. Um exemplo de uma proteína activadora de um gene é a proteína activadora do catabolito (CAP), que ajuda a iniciar a transcrição do operão lac em Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al. (1984) Annu.

Rev. Genet. 18:173]. A expressão regulada pode, por isso, ser positiva ou negativa, aumentando ou diminuindo a transcrição.

As sequências que codificam as enzimas de vias metabólicas mostram ser sequências promotoras particularmente úteis. Os exemplos incluem sequências promotoras derivadas de enzimas da metabolização do açúcar, como a galactose, lactose (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056] e maltose. Outros exemplos incluem as sequências promotoras derivadas das enzimas biossintéticas, como o triptofano (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981)

Nucl. Acids Res. 9:731; patente dos EUA 4,738,921; EP-A-0036776 e EP-A-0121775] . Os sistemas promotores g-laotamase (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (ed. I. Gresser)], bacteriófago lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] e T5 41 [patente dos EUA 4,689,406] também oferecem sequências promotoras úteis.

Adicionalmente, os promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores bacterianos. Por exemplo, pode-se juntar as sequências activadoras da transcrição de um promotor bacteriano ou bacteriófago às sequências do operão de outro promotor bacteriano ou bacteriófago, criando um promotor híbrido sintético [patente dos EUA 4,551,433]. Por exemplo, o promotor tac é um promotor híbrido trp-lac composto pelas sequências promotora trp e operão lac que é regulado pelo repressor lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. 80:21]. Além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores que ocorrem na natureza de origem não bacteriana, que têm a capacidade de ligar a RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Também é possível acoplar um promotor de origem não bacteriana que ocorre naturalmente com uma RNA polimerase para produzir níveis elevados de expressão de alguns genes em procariotas. 0 sistema bacteriófago T7 RNA polimerase/promotor é um exemplo de um sistema promotor acoplado [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82:1074]. Adicionalmente, um promotor híbrido também pode ser composto por um promotor bacteriófago e uma região operador de E. coli (EPO-A-O 267 851) .

Em adição a uma sequência promotora funcional, um sítio de ligação do ribossoma eficiente também é útil na expressão de genes estranhos em procariotas. Na E. coli, o sítio de ligação do ribossoma é denominado sequência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um codão iniciador (ATG) e uma sequência com 3-9 nucleótidos de comprimento localizada 3-11 nucleótidos a montante do codão iniciador [Shine et al. (1975) Nature

254:34]. Pensa-se que a sequência SD promove a ligação do mRNA 42 ao ribossoma através do emparelhamento de bases entre a sequência SD e a extremidade 3' do 16S rRNA da E. coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)]. Para expressar genes eucarióticos e genes procarióticos com sitios de ligação ao ribossoma fracos [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Uma molécula de DNA pode ser expressada intracelularmente. Uma sequência promotora pode ser ligada directamente à molécula de DNA, em cujo caso o primeiro aminoácido na parte N-terminal será sempre uma metionina, que é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina N-terminal pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio ou por incubação in vivo ou in vitro com uma peptidase da metionina N-terminal bacteriana (EPO-A-O 219 237).

As proteínas de fusão oferecem uma alternativa à expressão directa. Geralmente, uma sequência de DNA que codifica a porção N-terminal de uma proteína bacteriana endógena ou de outra proteína estável é fundida com a extremidade 5' das sequências codificadoras heterólogas. Ao ser expressada, esta construção fornecerá uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene da célula lambda do bacteriófago pode ser ligada na extremidade 5' de um gene exógeno e expressada na bactéria. A proteína de fusão resultante retém, de preferência, um sítio para uma enzima de processamento (factor Xa) clive a proteína do bacteriófago do gene exógeno [Nagai et al. (1984) Nature 309:810]. As proteínas de fusão também podem ser produzidas a partir de sequências dos genes lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60:197], trpE [Allen et al. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al. 43

(1989) J. Gen. Microbiol. 135:11] e Chey [EP-A-0 324 647]. A sequência de DNA na junção das duas sequências de aminoácidos podem ou não codificar um sitio de clivagem. Outro exemplo é uma proteína de fusão de ubiquitina. Uma proteína de fusão deste género é feita com a região da ubiquitina que, de preferência, retém um sítio para uma enzima de processamento (por ex. a protease processadora específica da ubiquitina) clivar a ubiquitina da proteína exógena. Este método permite isolar uma proteína nativa exógena [Miller et al. (1989) Bio/

Technology 7:698].

Em alternativa, as proteínas exógenas podem ser secretadas da célula através da criação de moléculas de DNA quiméricas que codifiquem uma proteína de fusão constituída por um fragmento de sequência de um peptídeo sinalizador que assegura a secreção da proteína exógena em bactérias [patente dos EUA 4,336,336]. 0 fragmento da sequência sinalizadora codifica geralmente um peptídeo sinalizador constituído por aminoácidos hidrofóbicos que controlam a secreção da proteína da célula. A proteína é secretada para o meio de crescimento (bactérias gram-positivas) ou para o espaço periplasmático, localizado entre a membrana interna e externa da célula (bactérias gram-negativas). De preferência, existem locais de processamento que podem ser clivado in vivo ou in vitro codificados entre o fragmento do peptídeo sinalizador e o gene exógeno. É possível derivar DNA que codifica sequências sinalizadoras adequadas a partir de genes para proteínas bacterianas secretadas, como é o caso do gene da proteína da membrana externa de E. coli (ompA) [Masui et al. (1983), in:

Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437] e a sequência sinalizadora da fosfatase alcalina de E. coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl.

Acad. Sei. 82:7212]. Como exemplo adicional, refere-se que a 44 sequência sinalizadora do gene da alfa-amilase de diversas estirpes de bacilos pode ser utilizada para secretar proteínas heterólogas de B. subtilis [Paiva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582; EP-A-0 244 042]. Geralmente, as sequências de terminação da transcrição reconhecidas pelas bactérias são regiões reguladoras localizadas em posição 3' em relação ao codão stop e, por isso, flanqueiam a sequência codificadora em conjunto com o promotor. Estas sequências orientam a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido no polipeptídeo codificado pelo DNA. As sequências de terminação da transcrição incluem frequentemente sequências de DNA com cerca de 50 nucleótidos capazes de formar estruturas em haste e ansa que ajudam a terminar a transcrição. Os exemplos incluem sequências de terminação da transcrição derivadas de genes com fortes promotores, tal como o gene trp em E. coli bem como outros genes biossintéticos.

Geralmente, os componentes acima descritos, incluindo um promotor, uma sequência sinalizadora (se desej ado), a sequência codificadora de interesse e uma sequência de terminação da transcrição são agrupados em construções de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicão, tal como um elemento extra-cromossómico (por ex. plasmídeos) capaz de se manter estável um anfitrião como uma bactéria. O replicão terá um sistema de replicação, o que lhe permite manter-se num hospedeiro procariótico para expressão ou para clonagem e amplificação. Adicionalmente, um replicão pode ser um plasmídeo com alto ou baixo número de cópias. Um plasmídeo de alto número de cópias terá geralmente um número de cópias entre cerca de 5 e cerca de 200, e geralmente entre cerca de 10 e cerca de 150. Um hospedeiro que contém um plasmídeo com alto número de cópias conterá de preferência pelo menos cerca de 10, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 20 plasmídeos. Pode-se seleccionar um 45 vector com um alto ou baixo número de cópias, dependendo do efeito do vector e da proteina exógena no hospedeiro.

Alternativamente, as construções de expressão podem ser integradas no genoma bacteriano com um vector de integração. Os vectores de integração contêm geralmente pelo menos uma sequência homóloga ao cromossoma bacteriano que permite ao vector integrar. As integrações parecem resultar de recombinações entre o DNA homólogo no vector e o cromossoma bacteriano. Por exemplo, os vectores de integração construídos com DNA de diversas estirpes de bacilos integram-se no cromossoma do bacilo (EP-A- 0 127 328). Os vectores de integração também podem ser constituídos por sequências de bacteriófago ou transposão.

Geralmente, as construções de expressão extra-cromossómicas e de integração podem conter marcadores seleccionáveis que permitem a selecção as estirpes de bactérias que foram transformadas. Os marcadores seleccionáveis podem ser expressados no hospedeiro bacteriano e podem incluir genes que tornam as bactérias resistentes a medicamentos como a ampicilina, cloramfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) e tetraciclina [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Os marcadores seleccionáveis também podem incluir genes biossintéticos, tal como os das vias biossintéticas da histidina, triptofano e leucina.

Em alternativa, alguns dos componentes acima descritos podem ser agrupados em vectores de transformação. Os vectores de transformação são geralmente constituídos por um marcador seleccionável que é mantido num replicão ou é desenvolvido até um vector de integração, conforme acima descrito.

Os vectores de expressão e de transformação, sejam eles replicões extra-cromossómicos ou vectores de integração, foram desenvolvidos para a transformação em várias bactérias. Por 46 exemplo, os vectores de expressão foram desenvolvidos para, inter alia, as seguintes bactérias: Bacillus subtilis [Paiva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582; EP-A-0 036 259 e EPA- 0 063 953; WO 84104541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985)

Gene 40: 183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EP- A-0 036 776,EP-A-0 136 829 e EP-A-0 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [patente dos EUA 4,745,056].

Os métodos de introdução de DNA exógeno em bactérias anfitriãs são bem conhecidos da arte e incluem geralmente a transformação de bactérias tratadas com CaCl2 ou com outros agentes, como catiões divalentes e DMSO. O DNA também pode ser introduzido em células bacterianas por electroporação. Os processos de transformação variam geralmente com a espécie de bactéria a ser transformada. Ver, por ex. [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Paiva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582; EP-A-0 036 259 e EP-A-0 063 953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl.

Acad. Sei. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:949,

Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sei. 69: 2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127;

Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. In Genetic

Engineering: Actas do International Symposium on Genetic

Engineering (eds. H.W. Boyer e S. Nicosia); Mandei et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS

Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988)

Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation 47 of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti e R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th

Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus]. v. Expressão em Leveduras

Os sistemas de expressão em leveduras também são conhecidos daqueles com conhecimentos gerais na área. Um promotor de levedura é qualquer sequência de DNA capaz de ligar a RNA polimerase de levedura e iniciar a transcrição a jusante (downstream) (3') de uma sequência codificadora (por ex. gene estrutural) em mRNA. Um promotor conterá uma região iniciadora da transcrição que se encontra geralmente numa posição próxima da extremidade 5' da sequência codificadora. Esta região iniciadora da transcrição inclui geralmente um sitio de ligação da RNA polimerase (a "TATA Box") e um sitio de iniciação da transcrição. Um promotor de levedura também pode conter um segundo dominio chamado uma sequência activadora upstream (UAS), que, quando está presente, se encontra geralmente numa posição distai em relação ao gene estrutural. A UAS permite a expressão regulada (induzivel). A expressão constitutiva ocorre na ausência de uma UAS. A expressão regulada pode ser positiva ou negativa, desse modo aumentando ou diminuindo a transcrição.

Uma levedura é um organismo fermentador com uma via metabólica activa, pelo que as sequências codificadoras de enzimas na via metabólica oferecem sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem a álcool desidrogenase (ADH) (EP-A-0 284 044), enolase, glucocinase, glucose-6- fosfato isomerase, gliceraldeido-3-fosfate-desidrogenase (GAP ou GAPDH), hexocinase, fosfofructocinase, 3-fosfoglicerato 48 mutase e piruvato cinase (PyK) (EPO-A- 0 329 203) . O gene PH05 de levedura, que codifica a fosfatase ácida, também oferece sequências promotoras úteis [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:1] .

Adicionalmente, os promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores de leveduras. Por exemplo, é possível juntar as sequências UAS de um promotor de levedura com a região activadora da transcrição de outro promotor de levedura, criando um promotor sintético híbrido. Exemplos de promotores híbridos deste género incluem a sequência reguladora ADH ligada à região de activação da transcrição GAP (patentes dos EUA n.°s 4,876,197 e 4,880,734). Outros exemplos de promotores híbridos incluem os promotores que consistem das sequências reguladoras dos genes ADH2, GAL4, GAL10 ou PH05 combinadas com a região de activação transcricional de um gene da enzima glicolítica como a GAP ou PyK (EP-A-0 164 556). Além disso, um promotor de levedura pode incluir promotores que ocorrem na natureza de origem não levedura, que têm a capacidade de ligar a RNA polimerase de levedura e iniciar a transcrição. Exemplos de promotores deste tipo incluem, inter alia, [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," in: Plasmids of Medicai, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis e A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109;].

Uma molécula de DNA pode ser expressada intracelularmente na levedura. Uma sequência promotora pode ser ligada directamente à molécula de DNA, em cujo caso o primeiro aminoácido na parte N-terminal da proteína recombinante será 49 sempre metionina, que é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na porção N-terminal pode ser clivada da proteina por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Proteínas de fusão oferecem uma alternativa aos sistemas de expressão em leveduras, bem como a sistemas de expressão em mamíferos, baculovirus e bactérias. Geralmente, uma sequência de DNA que codifica a porção N-terminal de uma proteina endógena de levedura ou de outra proteina estável é fundida com a extremidade 5' das sequências codificadoras heterólogas. Ao ser expressada, esta construção fornecerá uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene da superóxido dismutase (SOD) de levedura ou humana pode ser ligado na extremidade 5' de um gene exógeno e expressado na levedura. A sequência de DNA na junção das duas sequências de aminoácidos podem ou não codificar um sitio de clivagem. Ver, por ex. EP-A-0 196 056. Outro exemplo é uma proteina de fusão ubiquitina. Uma proteina de fusão deste género é feita com a região da ubiquitina que, de preferência, retém um sítio para uma enzima de processamento (por ex. a protease processadora específica da ubiquitina) clivar a ubiquitina da proteína exógena. Assim, através deste método é possível isolar uma proteína exógena nativa (e.g. WO88/024066). Em alternativa, as proteínas exógenas podem ser secretadas da célula para o meio de crescimento através da criação de moléculas de DNA quiméricas que codifiquem uma proteína de fusão constituída por um fragmento de sequência líder que assegura a secreção da proteína exógena em leveduras. De preferência, existem locais de processamento codificados entre o fragmento líder e o gene exógeno que pode ser clivado in vivo ou in vitro. O fragmento da sequência líder codifica geralmente um peptídeo sinalizador constituído por aminoácidos hidrofóbicos que controlam a secreção da proteína da célula. 50 0 DNA que codifica as sequências sinalizadoras adequadas pode ser derivado dos qenes de proteinas de levedura secretadas, tal como o qene da invertase de levedura (EP-A-0 012 873; JPO. 62,096, 086) e o gene do factor A (patente dos EUA 4,588,684). Em alternativa, existem lideres de origem não levedura, como um lider interferão, que também asseguram a secreção nas leveduras (EP-A-0 060 057).

Uma classe preferida de líderes de secreção são os que utilizam um fragmento do gene do factor alfa da levedura, que contém ambas, uma sequência sinalizadora "pre" e uma região "pro". Os tipos de fragmento de factor alfa que podem ser utilizados incluem o líder do factor alfa pre-pro completo (cerca de 83 resíduos aminoácido) bem como líderes truncados do factor alfa (geralmente cerca de 25 a cerca de 50 resíduos aminoácido) (patentes dos EUA 4,546,083 e 4,870,008; EP-A-0 324 274) . Outros líderes que utilizam um fragmento líder do factor alfa que assegura a secreção incluem os líderes híbridos do factor alfa construídos com uma sequência pre de uma primeira levedura e uma região pro de um factor alfa de uma segunda levedura, (por ex. ver WO 89/02463.)

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição reconhecidas por leveduras são regiões reguladoras localizadas em posição 3' em relação ao codão stop e, por isso, flanqueiam a sequência codificadora em conjunto com o promotor. Estas sequências orientam a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido no polipeptídeo codificado pelo DNA. Exemplos da sequência de terminação da transcrição e outras sequências de terminação reconhecidas por leveduras, como as que codificam enzimas glicolíticas.

Geralmente, os componentes acima descritos, incluindo um promotor, um líder (se desejado), a sequência codificadora de interesse e uma sequência de terminação da transcrição são agrupados em construções de expressão. As construções de 51 expressão são frequentemente mantidas num replicão, tal como um elemento extra-cromossómico (por ex. plasmídeos) capaz de se manter estável um anfitrião como uma levedura ou bactéria. 0 replicão pode ter dois sistemas de replicação, o que permite manter-se, por exemplo, em leveduras para expressão e num anfitrião procariótico para clonagem e amplificação. Exemplos de vectores vaivém levedura-bactéria incluem o YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8:17-24], pCI/I [Brake et al. (1984) Proc.

Natl. Acad. Sei USA 81:4642-4646] e YRpl7 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Adicionalmente, um replicão pode ser um plasmideo com elevado ou reduzido número de cópias. Um plasmideo com elevado número de cópias terá geralmente um número de cópias que varia entre cerca de 5 e cerca de 200, geralmente entre cerca de 10 e cerca de 150. Um hospedeiro com um plasmideo com elevado número de cópias terá, de preferência, pelo menos cerca de 10, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 20. Pode ser seleccionado um vector com elevado ou reduzido número de cópias, dependendo do efeito do vector e da proteina exógena no hospedeiro. Per, por ex. Brake et al., supra.

Alternativamente, as construções de expressão podem ser integradas no genoma da levedura com um vector de integração. Os vectores de integração contêm geralmente pelo menos uma sequência homóloga a um cromossoma da levedura que permite ao vector integrar e, de preferência, contêm duas sequências homólogas a flanquear a construção de expressão. As integrações parecem resultar de recombinações entre o DNA homólogo no vector e o cromossoma da levedura [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Um vector de integração pode ser direccionado para um locus especifico na levedura através de uma selecção da sequência homóloga apropriada para inclusão no vector. Ver Orr-Weaver et al., supra. Uma ou mais construções de expressão podem integrar, possivelmente afectando os niveis de proteina recombinante 52 produzidos [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:6750]. As sequências cromossómicas incluídas no vector podem ocorrer como o único segmento no vector, o que resulta na integração do vector completo, ou como dois segmentos homólogos a segmentos adjacentes no cromossoma e que flanqueiam a construção de expressão no vector, o que pode resultar na integração estável de apenas a construção de expressão.

Geralmente, as construções de expressão extra-cromossómicas e de integração podem conter marcadores seleccionáveis que permitem a selecção as estirpes de leveduras que foram transformadas. Marcadores seleccionáveis podem incluir genes biossintéticos que podem ser expressados no hospedeiro levedura, como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 e ALG7, e o gene de resistência G418, que confere às leveduras resistência à tunicamicina e G418, respectivamente. Adicionalmente, um marcador seleccionável adequado também pode dar à levedura a capacidade de crescer na presença de compostos tóxicos, como metais. Por exemplo, a presença de CUP1 permite à levedura crescer na presença de iões de cobre [Butt et al. (1987) Microbiol, Rev. 51:351].

Em alternativa, alguns dos componentes acima descritos podem ser agrupados em vectores de transformação. Os vectores de transformação são geralmente constituídos por um marcador seleccionável que é mantido num replicão ou é desenvolvido até um vector de integração, conforme acima descrito.

Os vectores de expressão e de transformação, sejam eles replicões extra-cromossómicos ou vectores de integração, foram desenvolvidos para a transformação em várias leveduras. Por exemplo, os vectores de expressão foram desenvolvidos para, inter alia, as seguintes leveduras: Candida albicans [Kurtz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze, et al. (1985)J. Basic Microbiol. 25:141]. Hansenula polymorpha 53 (1986) J. Gen.

Microbiol.

[Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459;

Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302],

Kluyveromyces fragilis [Das, et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg et al. (1990)

Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985)J. Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Patentes dos EUA Nos. 4,837,148 and 4,929,555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163], Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse (1981) Nature 300:706] e Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10:380471 Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10:49].

Os métodos de introdução de DNA exógeno em anfitriões levedura são bem conhecidos da arte e geralmente incluem a transformação de esferoplastos ou de células de levedura intactas tratadas com catiões alcalinos. Os processos de transformação variam geralmente com a espécie de levedura a ser transformada. Ver, por ex. [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell.

Biol. 6:142; Kunze et al. (1985)J. Basic Microbiol. 25:141;

Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459;

Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg et al. (1990)

Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze et al. (1985)J. Basic

Microbiol. 25:141; Patentes dos EUA Nos. 4,837,148 e 4,929,555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Nail. Acad.

Sei. USA 75; 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163

Saccharomyces]; [Beach and Nurse (1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces]; [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia]. 54

Anticorpos

Conforme utilizado no presente documento, o termo "anticorpo" refere-se a um polipeptídeo ou a um grupo de polipeptideos composto por pelo menos um sitio de combinação do anticorpo. Um "sitio de combinação de um anticorpo" é o espaço tridimensional de ligação com uma forma da superfície interna e distribuição de carga complementar às características de um epítopo de um antigénio, que permite a ligação do anticorpo ao antigénio. "Anticorpo" inclui, por exemplo, anticorpos de vertebrados, anticorpos híbridos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos alterados, anticorpos univalentes, proteínas Fab e anticorpos de domínio único.

Os anticorpos anti-proteínas da invenção são úteis para cromatografia de afinidade, imunoensaios e distinguir/identificar proteínas de Neisseria.

Os anticorpos anti-proteínas da invenção, sejam elas policlonais ou monoclonais, podem ser preparados por métodos convencionais. De um modo geral, aproteína é utilizada primeiro para imunizar um animal adequado, de preferência um ratinho, rato, coelho ou cabra. Os coelhos e as cabras são referidos para a preparação de soros policlonais devido ao volume de soro que pode ser obtido e à disponibilidade de anticorpos anti-coelho e anti-cabra marcados. A imunização é geralmente realizada misturando ou emulsifiçando a proteína em soro fisiológico, de preferência com um adjuvante como o adjuvante de Freund completo, e injectando a mistura ou emulsão por via parentérica (geralmente subcutânea ou intramuscular). Uma dose de 50-200 pg/injecção é tipicamente suficiente. A imunização é geralmente reforçada 2-6 semanas mais tarde com uma ou mais injecções da proteína em soro fisiológico, de preferência usando adjuvante de Freund incompleto. Em alternativa, é possível gerar anticorpos por 55 imunização in vitro utilizando métodos conhecidos na arte, que para os propósitos da presente invenção é considerada equivalente à imunização in vivo. Anti-soros policlonais são obtidos por sangramento do animal imunizado para um recipiente de vidro ou de plástico, incubação do sangue a 25°C durante uma hora, seguida de incubação a 4°C durante 2-18 horas. 0 soro é recuperado por centrifugação (por ex. lOOOg durante 10 minutos). É possivel obter cerca de 20-50 ml por sangramento de coelho.

Os anticorpos monoclonais são preparados pelo método padronizado de Kohler & Milstein [Nature (1975) 256:495-96] ou uma variante do mesmo. Tipicamente, um ratinho ou um rato é imunizado conforme descrito acima. Contudo, em vez de sangrar o animal para extrair o soro, remove-se o baço (e, opcionalmente, diversos gânglios linfáticos grandes), que é dissociado em células individuais. Se desejado, as células do baço podem ser escolhidas (depois da remoção de células aderentes não especificas) aplicando uma suspensão de células a uma placa ou poço revestido com o antigénio anti-proteina. As células B que expressam a imunoglobulina ligada à membrana especifica para o antigénio ligam-se à placa e não são lavadas com o resto da suspensão. As células B resultantes, ou todas as células do baço dissociadas, são induzidas para se fundirem com células de mieloma para formar hibridomas e são colocadas em cultura num meio selectivo (por ex. meios de hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Os hibridomas resultantes são distribuídos em placas por diluição limite e analisados para detecção de produção de anticorpos que se ligam especificamente ao antigénio imunizador (e que não se ligam a antigénios não relacionados). Os hibridomas que secretam MAb seleccionados são então colocados em cultura in vitro (por ex. em frascos de cultura de tecidos ou reactores de fibra ocos) ou in vivo (como ascites em ratinhos). 56

Caso seja desejado, os anticorpos (policlonais ou monoclonais) podem ser marcados através de técnicas convencionais. Marcadores adequados incluem fluoróforos, cromóforos, isótopos radioactivos (em particular 32P e 125I) , reagentes "electrão-denso", enzimas e ligandos com parceiros de ligação específicos. As enzimas são tipicamente detectadas pela sua actividade. Por exemplo, a peroxidase de rábano é geralmente detectada pela sua capacidade de converter 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) num pigmento azul, quantificável por espectrofotometria. Um "parceiro de ligação especifico" refere-se a uma proteína capaz de se ligar a um ligando com elevada especificidade, como por exemplo no caso de um antigénio e o respectivo anticorpo monoclima. Outros parceiros de ligação específicos incluem a botina e a avizinha ou atrevidinha, IH e proteína A, e os numerosos pares receptor/ligando conhecidos da arte. Deve entender-se que a descrição acima não se destina a categorizar os diversos marcadores em classes distintas, uma vez que o mesmo marcador pode servir para vários modos diferentes. Por exemplo, I pode servir de marcador radioactivo ou como reagente electrão-denso. A peroxidase de rábano (HRP) pode servir como enzima ou como antigénio de um MAb. Além disso, é possível combinar diversos marcadores para os efeitos desejados. Por exemplo, MAbs e avidina também necessitam de marcadores na prática da presente invenção: assim, poder-se-ia marcar um MAb com biotina e detectar a sua presença com avidina marcada com 125I ou com um MAb antibiotina marcado com HRP. Outras permutações e possibilidades serão óbvias para quem tenha conhecimentos gerais na arte e são consideradas equivalentes no âmbito na presente invenção. 57

Composições Farmacêuticas

As composições farmacêuticas podem compreender polipeptideos, anticorpos ou o ácido nucleico da invenção. As composições farmacêuticas compreenderão uma quantidade terapeuticamente eficaz dos polipeptideos, anticorpos ou polinucleótidos da invenção reclamada. 0 termo "quantidade terapeuticamente efectiva", conforme utilizado no presente documento refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição indesejável, ou para exibir um efeito preventivo ou terapêutico detectável. 0 efeito pode ser detectado por exemplo, por marcadores quimicos ou pelos niveis de antigénios. Os efeitos terapêuticos também incluem a redução dos sintomas físicos, tal como a redução da temperatura corporal. A quantidade efectiva precisa para um sujeito depende do tamanho e saúde do sujeito, da natureza e extensão da condição, e das terapêuticas ou combinação de terapêuticas seleccionadas para serem administradas. Assim, não é útil especificar uma quantidade eficaz exacta a priori. Contudo, a quantidade eficaz para uma determinada situação pode ser determinada por experiências de rotina e são da responsabilidade do médico.

Para fins da presente invenção, uma dose efectiva será de entre cerca de 0,01 mg/kg e 50 mg/kg ou 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg das construções de DNA no indivíduo ao qual será administrada.

Uma composição farmacêutica também pode conter um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veículo para a administração de um agente terapêutico, tal como anticorpos ou um polipeptídeo, genes e outros agentes terapêuticos. O termo refere-se a qualquer veículo farmacêutico que não induza ele 58 mesmo a produção de anticorpos nocivos para o indivíduo que recebe a composição, e que pode ser administrado sem qualquer toxicidade indesejável. Veículos adequados podem ser macromoléculas grandes que são metabolizadas lentamente, como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, co-polímeros de aminoácidos e partículas de vírus inactivados. Veículos deste tipo são bem conhecidos na arte.

Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados aqui, por exemplo, sais de ácidos minerais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e similares; e os sais de ácidos orgânicos como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e similares. Uma discussão abrangente dos excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível na obra Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991). Veículos farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem conter líquidos como água, soro fisiológico, glicerol e etanol. Adicionalmente, podem estar presentes nos veículos substâncias auxiliares, como agentes molhantes e emulsificantes, substâncias tampão do pH e similares. Tipicamente, as composições terapêuticas são preparadas como injectáveis, quer como soluções quer como suspensões líquidas; também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução e, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injecção. Os lipossomas estão incluídos na definição de veiculo farmaceuticamente aceitável. Métodos de Administração

Depois de formuladas, as composições da invenção podem ser administradas directamente ao sujeito. Os sujeitos a ser tratados podem ser animais; em particular, é possível tratar sujeitos humanos. 59 levada A administração directa das composições será geralmente a cabo por injecção, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou directamente no espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas a uma lesão. Outros modos de administração incluem a administração oral e pulmonar, supositórios e aplicações transdérmicas ou transcutâneas (por ex. ver WO98/20734), agulhas e pistolas ou hiposprays de genes. 0 tratamento pode seguir um esquema de programa de dose individual ou programa de múltiplas doses.

Vacinas

As vacinas incluem antigénio(s) imunizante (s), imunogénio (s), polipeptideo(s), proteína(s) ou ácido(s) nucleico(s), geralmente em combinação com "veículos farmaceuticamente aceitáveis", que incluem qualquer veículo que não induza ele próprio a produção de anticorpos nocivos para o indivíduo que recebe a composição. Veículos adequados são, tipicamente, macromoléculas grandes que são metabolizadas lentamente, como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, co-polímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (como gotículas de óleo ou lipossomas) e partículas de vírus inactivados. Estes tipos de veículos são bem conhecidos na arte. Adicionalmente, estes veículos podem funcionar como agentes imunoestimulantes ("adjuvantes"). Além disso, o antigénio ou imunogénio pode ser conjugado com um toxóide bacteriano, tal como um toxóide de difteria, tétano, cólera, H. pylori e outros patogénios.

Adjuvantes preferidos para melhorar a eficácia da composição incluem, sem se limitar a: (1) sais de alumínio (alúmen), como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, 60 sulfato de alumínio, etc; (2) formulações de emulsão óleo-em-água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, como muramilpeptídeos (ver em baixo) ou componentes das paredes celulares bacterianas), como por exemplo (a) MF59™ (WO 90/14837; Capítulo 10 in Vaccine design: The Subunit and Adjuvant Approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), contendo 5% esqualeno, 0,5% Tween 80 e 0,5% Span 85 (opcionalmente contendo quantidades variadas de MTP-PE (ver abaixo), apesar de não ser necessário) formulado em partículas de dimensões sub-mícron utilizando um microfluidizador como o microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA) , (b) SAF, contendo 10% esqualeno, 0,4% Tween 80, 5% polímero L121 plurónico-bloqueado e thr-MDP (ver abaixo) microfluidifiçado numa emulsão submícron ou centrifugado para gerar uma emulsão com partículas de dimensões maiores, e (c) sistema adjuvante de Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo 2% esqualeno, 0,2% Tween 80 e um ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo constituído por monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), de preferência MPL + CWS (Detox™); (3) adjuvantes saponina, como Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) , podem ser utilizados ou podem gerar-se partículas dos mesmos como ISCOM (complexos imunoestimulantes); (4) Adjuvante de Freund Completo (CFA) e Adjuvante de Freund Incompleto (IFA); (5) citocinas, como interleucinas (por ex. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 12, etc.), interferões (por ex. interferão gama), factor estimulante de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose tumoral (TNF), etc; e (6) outras substâncias que actuam como agentes imunoestimulantes para melhorar a eficácia da composição. Alúmen e MF59™ são preferidos.

Tal como mencionado acima, os muramilpeptídeos incluem, sem se limitarem a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor- 61 MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1'-2'-dipaimitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

As composições imunogénicas (ou seja o antigénio imunizante/imunogénio/polipeptideo/proteína/ácido nucleico, veículo farmaceuticamente aceitável e adjuvante) contêm tipicamente diluentes, como água, soro fisiológico, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, podem estar presentes nos veículos substâncias auxiliares, tal como agentes molhantes ou emulsificantes, substâncias tampão do pH e similares.

Tipicamente, as composições imunogénicas são preparadas como injectáveis, quer como soluções quer como suspensões líquidas; também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução e, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injecção. A preparação também pode ser emulsificada ou encapsulada em lipossomas para um efeito adjuvante melhorado, conforme foi discutido acima para os veículos farmaceuticamente aceitáveis.

As composições imunogénicas utilizadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz dos polipeptídeos antigénicos ou imunogénicos, bem como qualquer outro dos componentes acima mencionados, conforme necessário. Por "quantidade imunologicamente eficaz" designa-se que a administração dessa quantidade a um indivíduo, quer como dose individual quer como parte de uma série, é eficaz no tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia conforme a saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, o grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado (por ex. primata não humano, etc.), a capacidade do sistema imunitário do indivíduo para sintetizar anticorpos, o grau de protecção desejado, a formulação da vacina, a avaliação do médico assistente da condição clínica e outros factores relevantes. É expectável 62 que a quantidade caia num intervalo relativamente alargado, que pode ser determinado por ensaios de rotina.

As composições imunogénicas são convencionalmente administradas por via parentérica, por ex. por injecção, por via subcutânea, intramuscular ou transdérmica/transcutânea (e.g. WO98/20734). Formulações adicionais adequadas para outros modos de administração incluem formulações orais e pulmonares, supositórios e aplicações transdérmicas. 0 tratamento pode seguir um esquema de programa de dose individual ou programa de múltiplas doses. A vacina pode ser administrada em conjunto com outros agentes imuno-reguladores.

Como alternativa às vacinas à base de proteínas, pode aplicar-se a vacinação com DNA [e.g. Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283; Donnelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648; ver mais à frente].

Veículos de Entrega de Genes

Os veículos de entrega da terapia genética, de construções que incluem uma sequência codificadora de uma terapêutica da invenção, a administrar no mamífero para expressão no mamífero, podem ser administrados localmente ou sistemicamente. Estas construções podem utilizar abordagens vectoriais virais ou não virais, nas modalidades in vivo ou ex vivo. A expressão de uma tal sequência codificadora pode ser induzida por meio de promotores endógenos de mamífero ou promotores heterólogos. A expressão da sequência codificadora in vivo pode ser constitutiva ou regulada. A invenção inclui veículos de entrega de terapia genética capazes de expressar as sequências de ácidos nucleicos contempladas. 0 veículo de entrega de terapia genética é, de preferência, um vector virai e, mais preferivelmente, um 63 vector de retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associado (AAV) , vírus de herpes ou alfavírus. 0 vector virai pode também ser um vector virai derivado de astrovírus, coronavírus, ortomixovírus, papovavírus, paramixovírus, parvovírus, picornavírus, poxvírus ou togavírus. Ver, em geral, Jolly (1994) Câncer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapyô:185-193; e Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153.

Os vectores de retrovírus são bem conhecidos da arte e contemplamos que qualquer vector de terapia genética retroviral seja possível de utilizar na invenção, incluindo de retrovírus de tipo B, C e D, retrovírus xenotrópicos (por exemplo, NZB-Xl, NZBX2 e NZB9-1 (ver 0'Neill (1985) J. Virol. 53:160) retrovírus politrópicos p.ex. MCF e MCF-MLV (ver Kelly (1983) J. Virol. 45:291), espumavírus e lentivírus. Ver RNA Tumor Viruses, 2.a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

Partes do vector de terapia genética retroviral podem ser derivadas de diferentes retrovírus. Por exemplo, os LTR do retrovector podem ser derivados de um vírus do sarcoma murino, um sítio de ligação de tRNA de um vírus do sarcoma de Rous, um sinal de empacotamento de um vírus de leucemia murino e uma origem de síntese da segunda cadeia de um vírus de leucose aviária.

Estes vectores retrovirais recombinantes podem ser utilizados para gerar a transdução de partículas do vector retroviral competentes, ao introduzi-las em linhagens de células de empacotamento apropriadas (ver patente dos EUA 5,591,624). Os vectores retrovirais podem ser construídos para se integrarem de forma específica ao local no DNA da célula hospedeira, através da incorporação de uma enzima integrase quimérica na partícula retroviral (ver W096/37626). É 64 preferível que o vector virai recombinante seja uma replicação defeituosa do vírus recombinante.

Linhagens de células de empacotamento adequadas para utilização com os vectores retrovirais acima descritos são bem conhecidas da arte, fáceis de preparar (ver WO95/30763 e WO92/05266), e podem ser utilizadas para criar linhas de células produtoras (também denominadas linhas de células do vector ou "VCL") para a produção de partículas do vector recombinante. De preferência, as linhas de células de empacotamento são compostas por células parentais humanas (p.ex. células HT1080) ou linhas de células parentais de marta, o que elimina a inactivação no soro humano.

Os retrovírus preferidos para a construção de vectores de terapia genética retroviral incluem os vírus da leucose aviária, vírus da leucemia bovina, vírus da leucemia murina, vírus indutor de focus em células do vison, vírus do sarcoma murino, vírus da reticuloendoteliose e vírus do sarcoma de Rous. Vírus da leucemia murina particularmente preferidos incluem ο 4070A e ο 1504A (Hartley e Rowe (1976) J Virol 19:19-25), Abelson (ATCC No. VR-999), Friend (ATCC No. VR-245), Graffi, Gross (ATCC Nol VR-590), Kirsten, vírus do sarcoma de Harvey e Rauscher (ATCC No. VR-998) e vírus da leucemia murina de Moloney (ATCC No. VR-190). Estes retrovírus podem ser obtidos a partir de depósitos ou colecções tais como a American Type Culture Collection ("ATCC") de Rockville, Maryland, ou podem ser isolados a partir de fontes conhecidas por meio de técnicas disponíveis.

Exemplos de vectores para terapia genética retroviral conhecidos possíveis de utilizar na presente invenção incluem os descritos nos pedidos de patente GB2200651, EP0415731, EP0345242, EP0334301, WO89102468; WO89/05349, WO89/09271, W090/02806, WO90/07936, WO94/03622, W093/25698, W093/25234, WO93/11230, WO93/10218, W091/02805, WO91/02825, WO95/07994, US 65 5,219,740, US 4,405,712, US 4,861, 719, US 4, 980,289, US 4,777,127, US 5,591,624. Ver também Vile (1993) Câncer Res 53:3860-3864; Vile (1993) Câncer Res 53: 962-967; Ram (1993) Câncer Res 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:493-503; Baba (1993) J Neurosurg 79:729-735; Mann (1983) Cell 33:153; Cane (1984) Proc Natl Acad Sei 81:6349; e Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

Os vectores de terapia genética derivados de adenovirus humanos são também conhecidos da arte e podem ser utilizados nesta invenção. Veja-se, por exemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 e Rosenfeld (1991) Science 252:431, e WO93/07283, WO93/06223, e WO93/07282. Exemplos de vectores de terapia genética adenovirais possíveis de utilizar nesta invenção incluem os descritos nos documentos referidos acima e em W094/12649, WO93/03769, W093/19191, W094/28938, W095/11984, W095/00655, WO95/27071, W095/29993, W095/34671, W096/05320, W094/08026, WO94/11506, WO93/06223, W094/24299, WO95/14102, W095/242 97, WO95/02697, W094/28152, W094/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, W094/18922 e WO95/09654. Alternativamente, poderá empregar-se a administração de ADN ligado a adenovirus inactivados tal como se descreve em Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-154. Os veículos de entrega de genes da invenção incluem também vectores de vírus adeno-associados (AAV). Exemplos importantes e preferidos de vectores deste tipo para utilização na presente invenção são os vectores de base AAV-2 descritos em Srivastava, WO93/09239. Os vectores AAV mais preferidos compreendem as duas sequências de repetição terminal repetidas AAV invertidas em que as sequências D nativas se encontram modificadas por substituição de nucleótidos, de modo que pelo menos 5 nucleótidos nativos e até 18 nucleótidos nativos, de preferência pelo menos 10 nucleótidos nativos sejam retidos e os restantes nucleótidos da sequência D sejam eliminados ou substituídos por nucleótidos não nativos. As sequências D nativas das 66 sequências de repetição terminal invertidas do AAV são sequências de 20 nucleótidos consecutivos em cada sequência de repetição terminal invertida AAV (i.e. existe uma sequência em cada extremidade), as quais não estão envolvidas na formação de HP. 0 nucleótido de substituição não nativo pode ser qualquer nucleótido diferente do nucleótido encontrado na mesma posição na sequência D nativa. Outros exemplos de vectores AAV possíveis de utilizar são pWP-19, pWN-1, ambos publicados em Nahreini (1993) Gene 124:257-262. Um outro exemplo de um tal vector AAV é o psub201 (ver Samulski (1987) J. Virol. 61:3096). Outro vector AAV exemplificativo é o vector ITR de duplo D. A construção do vector ITR de duplo D é revelada na patente dos EUA 5,478,745. Outros vectores são revelados na patente dos EUA 4,797,368 de Cárter e na patente dos EUA 5,139,941 de Muzyczka, na patente dos EUA 5,474,935 de Chartejee, e na patente W094/288157 de Kotin. Um outro exemplo de vector AAV possível de utilizar nesta invenção é o SSV9AFABTKneo, que contém o estimulador AFP e o promotor de albumina, e dirige a expressão predominantemente no figado. A sua estrutura e construção são reveladas em Su (1996) Human Gene Therapy 7:463-470. Vectores AAV para terapia genética encontram-se descritos nos documentos de patente US 5,354,678, US 5,173,414, US 5,139,941 e US 5,252,479.

Os vectores de terapia genética da invenção incluem ainda vectores de herpes. Exemplos importantes e preferidos são os vectores de virus de herpes simplex contendo uma sequência que codifica um polipeptídeo timidina cinase tais como os revelados em US 5,288,641 e EP0176170 (Roizman). Outros vectores exemplares do virus de herpes simplex incluem HFEM/ICP6- LacZ revelado em WO95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac descrito em Geller (1988) Science 241:1667-1669 e em W090/09441 e WO92/07945, HSV Us3::pgC-lacZ descrito em Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 e HSV 7134, 2RH 105 e GAL4 67 descritos em EP 0453242 (Breakefield), e os depositados na ATCC com os números de acesso ATCC VR-977 e ATCC VR-260.

Também são contemplados os vectores de terapia genética com alfavirus que possam ser utilizados na presente invenção. Vectores alfavirus preferidos são os vectores de virus Sindbis. Togavírus, virus da floresta de Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus de Middleberg (ATCC VR-370), virus do rio Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), virus de encefalite equina venezuelana (ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532), e os descritos nas patentes dos EUA 5,091,309, 5,217,879 e WO92/10578. Mais particularmente, podem ser utilizados os vectores de alfavirus descritos no pedido de patente americana 08/405,627, registado em 15 de Março de 1995, W094/21792, WO92/10578, WO95/07994, US 5,091,309 e US 5,217,879. Estes alfavirus podem ser obtidos a partir de depósitos ou colecções tais como a ATCC de Rockville, Maryland, ou podem ser isolados a partir de fontes conhecidas por meio de técnicas disponíveis. De preferência, são utilizados vectores alfavirus com reduzida citotoxicidade (ver USSN 081679640).

Sistemas vectoriais de DNA tais como os sistemas eucarióticos de expressão por camadas também são úteis para expressar os ácidos nucleicos da invenção. Ver WO95/07994 para uma descrição detalhada de sistemas eucarióticos de expressão por camadas. De preferência, os sistemas eucarióticos de expressão por camadas da invenção são derivados de vectores alfavirus e, mais preferencialmente, de vectores virais Sindbis.

Outros vectores virais adequados para a utilização na presente invenção incluem os derivados do poliovírus, por exemplo ATCC VR-58 e os descritos em Evans, Nature 339 (1989) 385 e Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115; rinovírus, por exemplo ATCC VR-1110 e os descritos em Arnold (1990) J Cell Biochem L401; poxvírus como o poxvírus de canário ou o 68 vírus vaccinia, por exemplo ATCC VR-111 e ATCC VR-2010 e os descritos em Fisher- Hoch (1989) Proc Natl Acad Sei 86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sei 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; em US 4, 603, 112 e US 4,769, 330 e WO89/01973; o vírus SV4 0, por exemplo ATCC VR-305 e os descritos em Mulligan (1979) Nature 277:108 e Madzak (1992) J Gen Virol 73:1533; o vírus influenza, por exemplo ATCC VR-797 e vírus recombinantes de influenza produzidos por técnicas de genética reversa conforme descrito em US 5,166,057 e em Enami (1990) Proc Natl Acad Sei 87:3802-3805; Enami & Palese (1991) J Virol 65:2711-2713 e Luytjes (1989) Cell 59:110, (ver também McMichael (1983) NEJ Med 309:13, e Yap (1978) Nature 273:238 and Nature (1979) 277:108); vírus da imunodeficiência humana como descrito em EP-0386882 e em Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; vírus do sarampo, por exemplo ATCC VR-67 e VR-1247 e os descritos em EP-0440219; vírus Aura, por exemplo ATCC VR-368; vírus Bebaru, por exemplo ATCC VR-600 e ATCC VR-1240; vírus Cabassou, por exemplo ATCC VR-922; vírus Chikungunya, por exemplo ATCC VR-64 e ATCC VR-1241; vírus Fort Morgan, por exemplo ATCC VR-924; vírus Getah, por exemplo ATCC VR-369 e ATCC VR-1243; vírus Kyzylagach, por exemplo ATCC VR-927; vírus Mayaro, por exemplo ATCC VR-66; vírus Mucambo, por exemplo ATCC VR-580 e ATCC VR-1244; vírus Ndumu, por exemplo ATCC VR-371; vírus Pixuna, por exemplo ATCC VR-372 e ATCC VR-1245; vírus Tonate, por exemplo ATCC VR-925; vírus Triniti, por exemplo ATCC VR-469; vírus Una, por exemplo ATCC VR-374; vírus Whataroa, por exemplo ATCC VR-926; vírus Y-62-33, por exemplo ATCC VR-375; vírus 0'Nyong, vírus de encefalite oriental, por exemplo ATCC VR-65 e ATCC VR- 1242; vírus de encefalite ocidental, por exemplo ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 e ATCC VR-1252; e coronavírus, por exemplo ATCC VR-740 e os descritos em Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121:190. A entrega das composições da presente invenção nas células não está limitada aos vectores virais acima 69 mencionados. Podem ser utilizados outros métodos e meios de entrega, como por exemplo vectores de expressão de ácidos nucleicos, DNA policatiónico condensado ligado ou não ligado a adenovírus isolado, por exemplo do pedido de patente americana 08/366, 787, registado em 30 de Dezembro de 1994 e Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154, DNA ligado a ligando, por exemplo de Wu (1989) J Biol Chem 264: 16985-16987, células veículos de entrega de células eucarióticas, por exemplo do pedido de patente americana 081240,030, registado em 9 de Maio de 1994, e o pedido de patente americana 08/404,796, deposição de materiais de hidrogel fotopolimerizado, pistola manual de partículas de transferência de genes, conforme descrita na patente dos EUA 5,149,655, radiação ionizante conforme descrita em US5,206,152 e em WO92/11033, neutralização da carga nucleica ou fusão com membranas celulares. Outras abordagens são descritas em Philip (1994) Mol Cell Biol 14: 2411-2418 e em Woffendin (1994) Proc Natl Acad Sei 91:1581-1585.

Pode ser utilizada a transferência de genes mediada por partículas, por exemplo do pedido de patente americana 60/023,867. Resumidamente, a sequência pode ser inserida em vectores convencionais que contenham sequências de controlo convencionais para expressão de alto nível, e em seguida incubadas com moléculas sintéticas de transferência de genes, como é o caso de catiões poliméricos que ligam o DNA, como a polilisina, protamina e albumina, ligadas a ligandos específicos a células, como o asialoorosomucoid, conforme descrito em Wu & Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432, insulina, conforme descrito em Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40:253-263, galactose, conforme descrito em Plank (1992)

Bioconjugate Chem 3:533-539, lactose ou transferina.

Também pode ser utilizado DNA nu. Exemplos de métodos de introdução de DNA nu são descritos em WO 90/11092 e US 70 5,580,859. A eficiência da absorção pode ser melhorada através de utilização de goticulas de látex biodegradáveis. As goticulas de látex revestidas com DNA são transportadas de forma eficiente para dentro das células após o inicio da endocitose pelas goticulas. 0 método pode ser ainda melhorado através do tratamento das goticulas para aumentar a hidrofobia e, assim, facilitar a disrupção do endossoma e a libertação do DNA no citoplasma.

Os lipossomas que podem funcionar como veiculos d entrega dos genes são descritos em US 5,422,120, W095/13796, W094/23697 , W091/14445 e EP-524,968. Tal como descrito no pedido de patente americana 601023,867, sobre entrega não virai, as sequências de ácidos nucleicos codificadoras de um polipeptideo podem ser inseridas em vectores convencionais que contenham sequências de controlo convencionais para expressão de alto nivel, e depois incubadas com moléculas sintéticas de transferência de genes, como catiões poliméricos que ligam o DNA como a polilisina, protamina e albumina, ligados a ligandos específicos a células como asialoorosomucoid, insulina, galactose, lactose ou transferina. Outros sistemas de entrega incluem o uso de lipossomas para encapsular o DNA que contém o gene controlado por uma variedade de promotores específicos ao tecido ou ubiquos. Outros sistemas de entrega não-viral adequados incluem sistemas de entrega mecânica, tal como a abordagem descrita em Woffendin et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91(24):11581-11585. Além disso, a sequência codificadora e o produto da expressão da mesma podem ser entregues por deposição de materiais de hidrogel fotopolimerizado. Outros métodos convencionais de entrega de genes que podem ser usados para introduzir a sequência codificadora incluem, por exemplo, o uso de uma pistola manual de partículas de transferência de genes, conforme descrito em US 5, 149, 655; o uso de radiação ionizante para activar o gene transferido, conforme descrito em US 5,206,152 e WO92/11033 71

Exemplos de veículos de entrega de genes policatiónicos e lipossomas são descritos em US 5,422,120 e 4,762,915; em WO95/13796; W094/23697; e W091/14445; em EP-0524968; e em Stryer, Biochemistry, pp. 236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acia 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) Proc Natl Acad Sei 84:7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.

Uma composição polinucleotídica pode compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um veículo de terapia genética, de acordo com a definição do termo supra. Para fins da presente invenção, uma dose efectiva será de entre cerca de 0,01 mg/kg e 50 mg/kg ou 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg das construções de DNA no indivíduo ao qual será administrada. Métodos de Administração

Depois de formuladas, as composições polinucleotídicas da invenção podem ser administradas (1) directamente no sujeito; (2) administradas ex vivo, em células derivadas do sujeito; ou (3) in vitro para expressão das proteínas recombinantes. Os sujeitos a tratar podem ser mamíferos ou aves. Também é possível tratar sujeitos humanos. A administração directa das composições será geralmente levada a cabo por injecção, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou directamente no espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas a uma lesão. Outros modos de administração incluem a administração oral e pulmonar, supositórios e aplicações transdérmicas ou transcutâneas (por ex. ver WO98/20734), agulhas e pistolas ou hiposprays de genes. O tratamento pode seguir um esquema de programa de dose individual ou programa de múltiplas doses. 72

Os métodos de administração ex vivo e reimplantação das células transformadas no sujeito são conhecidos da arte e estão descritos em p.ex. W093/14778. Exemplos de células úteis em aplicações ex vivo incluem, por exemplo, células estaminais (indiferenciadas), particularmente hematopoiéticas, células linfáticas, macrófagos, células dendriticas ou células tumorais. De um modo geral, a entrega de ácidos nucleicos em aplicações ex vivo e in vitro pode ser realizada pelos seguintes processos, por exemplo, transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulação do(s) polinucleótido (s) em lipossomas e microinjecção directa do DNA nos núcleos, todos eles bem conhecidos na arte.

Composições farmacêuticas polinucleotídicas e polipeptidicas

Em adição aos veículos e sais farmaceuticamente aceitáveis acima descritos, podem ser utilizados os seguintes agentes adicionais com composições polinucleotídicas e/ou polipeptidicas. A. Polipeptídeos

Um exemplo são polipeptídeos que incluem, sem se limitar a: asioloorosomucoid (ASOR); transferina; asialoglicoproteínas; anticorpos; fragmentos de anticorpos; ferritina; interleucinas; interferões, granulócitos, factor de estimulação de colónias de macrófagos (GM-CSF), factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), factor de estimulação de colónias de macrófagos (MCSF), factor de células estaminais e eritropoietina. Antigénios virais, tais como proteínas de envelope, também podem ser usadas. E também, 73 proteínas de outros organismos invasores, como o peptídeo com 17 aminoácidos da proteína circunsporozoíta do plasmodium falciparum conhecida como RII. B.Hormonas. Vitaminas, etc.

Outros grupos que podem ser incluídos são, por exemplo: hormonas, esteróides, androgénios, estrogénios, hormona da tiróide ou vitaminas como o ácido fólico. C. Polialquilenos, Polissacáridos, etc.

Também é possível incluir polialquileno glicol com os polinucleótidos/polipeptídeos desejados. Numa versão preferida, o polialquileno glicol é o polietilenoglicol. Além disso é possível incluir mono-, di- ou polissacáridos. Numa versão preferida deste aspecto, o polissacárido é o dextrano ou o DEAE-dextrano. E também, quitosano e poli(lactideco-glicólido) D. Lípidos e Lipossomas 0 polinucleótido/polipeptídeo também pode ser encapsulado em lípidos e empacotado em lipossomas antes de ser administrado ao sujeito ou entregue nas células do sujeito. A encapsulação em lípidos é geralmente realizada com recurso a lipossomas que têm a capacidade de se ligar de forma estável ou de capturar e reter ácidos nucleicos. A razão de polinucleótidos condensados para a preparação lipídica pode variar, mas geralmente rondará 1:1 (mg DNA:micromoles lípido) ou mais de lípido. Para uma revisão do uso de lipossomas como veículos para a entrega de ácidos nucleicos, ver Hug e Sleight 74 (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-521.

As preparações lipossómicas para utilização na presente invenção incluem preparações catiónicas (com carga positiva), aniónicas (com carga negativa) e neutras. Os lipossomas catiónicos têm demonstrado mediar a entrega intracelular de DNA plasmidico (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7416); mRNA (Malone (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 6077-6081); e factores de transcrição purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192), sob forma funcional.

Os lipossomas catiónicos estão facilmente disponíveis. Por exemplo, lipossomas de N[1-2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamónio (DOTMA) estão disponíveis comercialmente com o nome Lipofectin, da GIBCO BRL, Grand Island, NY. (Ver, também, Feigner supra). Outros lipossomas comercialmente disponíveis incluem transfectase (DDAB/DOPE) e DOTAP/DOPE (Boerhinger). Outros lipossomas catiónicos podem ser preparados a partir de materiais disponíveis utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Ver, p.ex. Szoka (1978) Proc. Nail. Acad. Sei. USA 75:4194-4198; W090/11092 para uma descrição da síntese de lipossomas DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamónio)propano).

Do mesmo modo, também está disponíveis lipossomas aniónicos e neutros, como dos laboratórios Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), ou podem ser facilmente preparados a partir de materiais muito acessíveis. Estes materiais incluem fosfatidil colina, colesterol, fosfatidil etanolamina, dioleoilfosfatidil colina (DOPC), dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG), dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE), entre outros. Estes materiais também podem ser misturados com os materiais de partida DOTMA e DOTAP em proporções apropriadas. Os métodos de produção de lipossomas utilizando estes materiais são bem conhecidos na arte. 75

Os lipossomas podem compreender vesículas multilamelares (MLV), vesículas unilamelares pequenas (SUV) ou vesículas unilamelares grandes (LUV). Os diversos complexos lipossoma-ácido nucleico são preparados utilizando métodos conhecidos na arte. Ver p.ex. Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101:512-527; Szoka (1978) Proc. Nail. Acad. Sei. USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer & Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraley (1979) Proc. Nail. Acad. Sei. USA 76:3348); Enoch & Strittmatter (1979) Proc. Nail. Acad. Sei. USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka &

Papahadjopoulos (1978) Proc. Nail. Acad. Sei. USA 75:145; e Schaefer-Ridder (1982) Science 215:166. E. Lipoproteínas

Adicionalmente, pode incluir-se lipoproteínas com o polinucleótido/polipeptídeo a ser administrado. Exemplos de lipoproteínas a utilizar incluem: quilomíerons, HDL, IDL, LDL e VLDL. Também se pode utilizar mutantes, fragmentos ou fusões destas proteínas. Além disso, pode utilizar-se modificações de lipoproteínas que ocorrem na natureza, como LDL acetiladas. Estas lipoproteínas podem visar a entrega de polinucleótidos em células que expressam receptores de lipoproteínas. De preferência, se forem incluídas lipoproteínas com os polinucleótidos a ser entregues, não é incluído mais nenhum ligando alvo na composição.

As lipoproteínas que ocorrem na natureza contêm uma porção lípido e uma porção proteína. A porção proteína é conhecida como apoproteína. No presente, estão isoladas e identificadas as apoproteínas A, B, C, D e E. Pelo menos duas 76 destas contêm diversas proteínas designadas por números romanos AI, AII, AIV; Cl, CII, CIII.

Uma lipoproteína pode incluir mais de uma apoproteína. Por exemplo, nos quilomícrons que ocorrem na natureza que compreendem A, B, C e E, ao longo do tempo estas lipoproteínas perdem as apoproteínas A e adquirem as C e E. VLDL inclui apoproteínas A, B, C e E, LDL inclui a apoproteína B; e HDL inclui as apoproteínas A, C e E.

Os aminoácidos destas apoproteínas são conhecidos e são descritos em, por exemplo, Breslow (1985) Annu Rev. Biochem 54:699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J Biol Chem 261:12918; Kane (1980) Proc Natl Acad Sei USA 77:2465; e Utermann (1984) Hum Genet 65:232.

As lipoproteínas contêm uma diversidade de lípidos, incluindo triglicéridos, colesterol (livre e sob a forma de ésteres) e fosfolípidos. A composição dos lípidos varia nas lipoproteínas que ocorrem na natureza. Por exemplo, os quilomícrons compreendem essencialmente triglicéridos. Uma descrição mais detalhada do conteúdo lipídico de lipoproteínas que ocorrem na natureza pode ser encontrada, por exemplo, em Meth. Enzymol. 128 (1986). A composição dos lípidos é escolhida de forma a ajudar na conformação da apoproteína para a actividade de ligação do receptor. A composição dos lípidos também pode ser escolhida de modo a facilitar a interaeção hidrofóbica e associação com a molécula ligante do polinucleótido.

Lipoproteínas que ocorrem na natureza podem ser isoladas a partir de soro por ultracentrifugação, por exemplo. Métodos destes estão descritos em Meth. Enzymol. (supra); Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454-5460 e Mahey (1979) J Clin. Invest 64: 743-750. As lipoproteínas também podem ser produzidas in vitro ou por métodos recombinantes, por expressão dos genes da 77 apoproteína numa célula hospedeira desejada. Ver, por exemplo, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15:403 e Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30: 443. As lipoproteínas também podem ser adquiridas a fornecedores comerciais, tal como a Biomedical Techniologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, EUA. Outra descrição de lipoproteínas pode ser encontrada em Zuckermann et al. W 098/06437 F. Agentes Policatiónicos É possível incluir agentes policatiónicos, com ou sem lipoproteína, numa composição com o polinucleótido/polipeptídeo a ser administrado.

Os agentes policatiónicos exibem, tipicamente, uma carga global positiva ao pH fisiológico relevante e são capazes de neutralizar a carga eléctrica dos ácidos nucleicos de modo a facilitar a administração no local desejado. Estes agentes apresentam aplicações in vitro, ex vivo e in vivo. Os agentes policatiónicos podem ser utilizados para administrar ácidos nucleicos a um sujeito vivo por via intramuscular, subcutânea, etc.

De seguida apresentam-se exemplos de polipeptídeos úteis como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina, poliornitina e protamina. Outros exemplos incluem histonas, protaminas, albumina de soro humano, proteínas que ligam o DNA, proteínas cromossómicas não-histonas, proteínas de revestimento de vírus de DNA, tal como (X174, factores de transcrição também contêm domínios que ligam o DNA e, por isso, podem ser úteis como agentes de condensação dos ácidos nucleicos. Resumidamente, os factores de transcrição como C/CEBP, c-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1,

Oct-1, Oct-2, CREP e TFIID contêm domínios básicos que ligam sequências de DNA. 78

Agentes orgânicos policatiónicos incluem: espermina, espermidina e purtrescina.

As dimensões e as propriedades físicas de um agente policatiónico podem ser extrapoladas a partir da lista acima para construir outros agentes polipeptídicos policatiónicos ou para produzir agentes policatiónicos sintéticos. Os agentes policatiónicos sintéticos úteis incluem, por exemplo, DEAE-dextrano, polibreno. Lipofectin™ e lipofectAMINE™ são monómeros que formam complexos policatiónicos quando combinados com polinucleótidos/polipeptideos.

Ensaios de Imunodiagnóstico

Os antigénios de Neisseria da invenção podem ser usados em imunoensaios para detectar niveis de anticorpos (ou, pelo contrário, anticorpos anti-Neisseria podem ser utilizados para detectar níveis de antigénio). Podem ser desenvolvidos imunoensaios à base de antigénios recombinantes bem definidos para substituir métodos de diagnóstico invasivos. É possível detectar anticorpos de proteínas de Neisseria em amostras biológicas, incluindo, por exemplo, amostras de sangue ou de soro. 0 design dos imunoensaios está sujeito a grandes variações, e várias destas são conhecidas na arte. Os protocolos dos imunoensaios podem basear-se, por exemplo, na competição ou na reacção directa ou ser ensaios do tipo sandwich. Os protocolos também podem, por exemplo, usar suportes sólidos ou ser de imunoprecipitação. A maioria dos ensaios envolve o uso de um anticorpo ou polipeptídeo marcados; os marcadores podem ser, por exemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas ou de fingimento. Também são conhecidos ensaios que amplificam os sinais da sonda; exemplos destes são ensaios que utilizam a 79 biotina e a avidina, e imunoensaios com marcadores enzimáticos e mediados por enzimas, tal como os ensaios ELISA.

Kits adequados ao imunodiagnóstico e que contêm os reagentes marcados adequados são construídos embalando os materiais apropriados, incluindo as composições da invenção, em recipientes adequados, juntamente com os restantes reagentes e materiais (por exemplo, soluções tampão adequadas, soluções salinas, etc.) necessários para realizar o ensaio, bem como um conjunto adequado de instruções para o ensaio.

Hibridização dos Ácidos Nucleicos "Hibridização" refere-se à associação de duas sequências de ácidos nucleicos entre si por uma ponte de hidrogénio. Tipicamente, uma sequência será fixada num suporte sólido e a outra estará livre em solução. Em seguida, as duas sequências serão colocadas em contacto uma com a outra sob condições que favorecem as pontes de hidrogénio. Factores que afectam estas ligações incluem: 0 tipo e volume do solvente; a temperatura de reacção; o tempo de hibridização; agitação; agentes que bloqueiam a ligação não especifica da sequência na fase liquida ao suporte sólido (reagente de Denhardt ou BLOTTO); a concentração das sequências; o uso de compostos que aumentam a taxa de associação de sequências (sulfato de dextrano ou polietilenoglicol); e a adstringência das condições de lavagem após hibridização. Ver Sambrook et al. [supra] Volume 2, capitulo 9, pp. 9.47 a 9.57. "Adstringência" refere-se às condições numa reacção de hibridização que favorecem a associação de sequências muito semelhantes em detrimento de sequências que diferem entre si. Por exemplo, a combinação de temperatura e concentração de sal devem ser escolhidas de modo a serem cerca de 120 a 200 °C abaixo da Tm calculada para o hibrido a ser estudado. As 80 condições de temperatura e sal podem frequentemente ser determinadas empiricamente em experiências preliminares nas quais amostras de DNA qenomico imobilizadas sobre filtros são hibridizadas com a sequência de interesse e depois lavadas sob diferentes condições de adstringência. Ver Sambrook et al. na página 9.50.

As variáveis a considerar ao realizar, por exemplo, um Southern blot são (1) a complexidade do DNA a incubar e (2) a homologia entre a sonda e a sequência a ser detectada. A quantidade total do(s) fragmento(s) a ser estudado pode variar numa magnitude de 10, entre 0,1 e 1 yg para um plasmideo ou fago a 10-9 a 10-8 g para um gene de cópia única num genoma eucariótico altamente complexo. Para polinucleótidos menos complexos podem ser usados tempos substancialmente mais curtos de incubação, hibridização e exposição, uma quantidade menor de polinucleótidos de partida e sondas com menor actividade especifica. Por exemplo, um gene de cópia única de levedura pode ser detectado com um tempo de exposição de apenas 1 hora, começando com 1 yg de DNA de levedura, incubação durante duas horas e hibridização de 4-8 horas com uma sonda de 108 cpm/yg. Para um gene de mamifero de cópia única uma abordagem conservativa seria começar com 10 yg de DNA, incubar durante a noite e hibridizar durante a noite n presença de 10% de sulfato de dextrano utilizando uma sonda com mais de 108cpm/yg, resultando num tempo de exposição de ~24 horas.

Diversos factores podem afectar a temperatura de fusão (Tm) de um híbrido DNA-DNA entre a sonda e o fragmento de interesse e, consequentemente, as condições apropriadas para a hibridização e lavagem. Em muitos casos, a sonda não é 100% homóloga com o fragmento. Outras variáveis comuns incluem o comprimento e conteúdo total de G+C das sequências de hibridização e a força iónica e o teor em formaldeído do 81 tampão de hibridização. Os efeitos de todos estes factores pode ser aproximado por uma única equação:

Tm= Si + i6.6(ÍogioCi) + 0.4(%{G + C)]-0,6(%fofjnamide) - 600/a-i J{%mismatch). em que Ci é a concentração do sal (iões monovalentes) e n é o comprimento do híbrido em pares de bases (ligeiramente modificada de Meinkoth & Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284) .

Ao desenhar uma experiência de hibridização, alguns factores que afectam a hibridização dos ácidos nucleicos podem ser convenientemente alterados. A temperatura de hibridização e das lavagens e a concentração do sal durante as lavagens são os factores mais simples de ajustar. À medida que a temperatura de hibridização aumenta (ou seja, a adstringência), torna-se menos provável que ocorra hibridização entre cadeias não homólogas e, em resultado disso, o background reduz-se. Se a sonda marcada radioactivamente não for completamente homóloga com o fragmento imobilizado (como é frequentemente o caso em experiências de hibridização de genes familiares e inter-espécies), a temperatura de hibridização tem de ser diminuída e o background aumentará. A temperatura das lavagens afecta a intensidade da banda de hibridização e o grau de background da mesma forma. A adstringência das lavagens também aumenta com a redução das concentrações de sal.

Em geral, temperaturas de hibridização convenientes na presença de 50% de formamida são 42°C para uma sonda com 95% a 100% de homologia com o fragmento alvo, 37°C para 90% a 95% de homologia, e 32°C para 85% a 90% de homologia. Para homologias mais baixas, o teor em formamida deve ser baixado e a temperatura deve ser ajustada em conformidade, utilizando a equação acima. Se a homologia entre a sonda e o fragmento alvo não for conhecida, a abordagem mais simples é começar com 82 condições de hibridização e de lavagem não adstringentes. Se forem observadas bandas não especificas ou de background elevado após auto-radiografia, o filtro pode ser lavado com elevada adstringência e re-exposto. Se o tempo necessário para a exposição tornar esta abordagem impraticável, deve-se testar diversas adstringências de hibridização e/ou lavagem em paralelo.

Identificação da proteína meningocócica de 80-85 kDa

Observou-se que diversas preparações de vesículas de membrana externa de N.meningitidis serogrupo B continham um componente com aproximadamente 80-85 kDa. Esta proteína foi purificada com géis SDS-PAGE e o N-terminal foi sequenciado (SEQ ID 1).

Procedeu-se à reacção cruzada de anticorpos originados contra a proteína purificada por SDS-PAGE com proteínas equivalentes em mais de 50 estirpes de N.meningitidis de diversos serogrupos e serótipos. Também foi observada reacção cruzada com N.gonorrhoeae, N.polysaccharia e N.lactamica. Também se fez reagir soros pór-imunização de pacientes vacinados com a proteína. O gene completo foi clonado a partir do serogrupo B de N.meningitidis (SEQ ID 2) e a proteína codificada foi inferida (SEQ ID 3). Um peptídeo sinalizador (SEQ ID 4) e uma sequência madura foram inferidos por comparação com a sequenciação N-terminal acima descrita. 83

Identificação de genes correspondentes em N.meningitidis serogrupo A e em N. gonorrhoeae

Com base na sequência do serogrupo B de N.meningitidis, os genes correspondentes de N.meningitidis serogrupo A e N.gonorrhoeae foram clonados e sequenciados. 0 gene completo do serogrupo A de N.meningitidis é apresentado na SEQ ID 6, com a proteína codificada na SEQ ID 7. 0 peptídeo sinalizador e a sequência madura correspondem às SEQ IDs 8 e 9. 0 gene completo de N.gonorrhoeae é apresentado na SEQ ID 10, com a proteína codificada na SEQ ID 11. O peptídeo sinalizador e a sequência madura correspondem às SEQ IDs 12 e 13.

Comparações de sequências

As sequências das proteínas foram comparadas e apresentam elevada homologia. A sequência de N.meningitidis serogrupo B e a sequência de N.gonorrhoeae apresentam uma identidade de 95,4% com sobreposição de 797 aa: 84 or£21.pep orf2ing.pep orf21.pep or£21ng.pep or£21.pep or£21ng.pep er£21.pep orf21ng.pep o? £21.pep orf2Ing,pep or£23. .pep or£21ng.p«p orf 21-pep orÊSing.pep or£23. ,pep or£21ng.pep or£2i.pep or£21rsg.pep or£21.pep or£2Í»g.pep orf 21.pep 10 20 30 40 50 60

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orf 21. pep GYESGTLGPKVYDEYGBKISYGGNK.vWv'SAELtfPMÍ>GAK.DARTVRLSlFAI!AGSVWOG or£21ng.pep orf 21.pep orfílng.pep

GYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGARDARTVRLSLFACAGSVWDG 670 680 630 700 710 720 730 740 750 760 770 780

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orf21.pep KPEDEXQRFQFQLGTTF ΠηίΜΙΜΜΠΙΙΙ or£21ng.pep XPEDEIQRFQFQU5TTFX 780 790 A e B 797 aa:

As sequências de N.meningitidis serogrupos apresentam uma identidade de 99, 9% com sobreposição de 10 20 30 40 50 60

orf 21 .pep MKLRQIASALMMLG1S PLALADFTI QDX RVBGLQRTEPSTWiíYLPVRVGDTYWDTHGSA orf 21 a. pep MXLKQX ASALSÍVXG X S PLALADFTIQDXRVBGLQRTEPSTVFNYI. PVKVGOTYNDTHG SA 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

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XIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNIXGAKMLQNIlAIKKÍtLESFGLAQ 70 ÔÔ 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 SQYPNQATLNQAVAGLKESnfLGRGKXltflQXÇPKVTKUtí^VBIDIFXDEGKSAKITDIE i s g i m i í i ;n; i i! i; e i m m i i! i i i i í i i m m m m m! i i i {m; SOYFUOATLNGAVAGLKEEYX.GRGKIíÍÍIGITPKVTKIAXÍÍÍRVDIDXTXDEGKSAKITOIE 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 FEGNQVYSDRKIáflRQMSLTEGGXWTWliTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRXL or£21a.pep or£21.pep orf2la.pep orf21.pep orf21a.pep orf21.pep orf21a.pep FEGNQVY S13RKLMRQMS LTBGG XWBíLTRSNQFNEQKFAQDííEKVFDPYQKNGY FDFRIL 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 DTGIQYNEDKYKQTXKITVHEGGRFFWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ 11S f I i Π i I i! 11SI Π ! Π f I! 11 Μ11! 11111! E Π H í Mi Hí Π111111!!! DTDXQTNEDRTKQTX RI TVHEGGRFRWGKV S lEGDTlíEVPKAELEKtLYKRPGKWYERQQ 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 MTAVLGSIQNRKGSAGYAYSEISVQFLPNAETKYVDFVLHIEPGRKXYVNEIHIYGNNKT m μ ; η π m m 11 π m : η m i η u i m μ π m 11 i i m m m I m MTAVLGEIQNRNGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTCDFVtHXEPGRKIYVNEIHITGNNXY 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 RDEVYmREtRQNESAPYDTSRLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE niirÍiiiiiiHiiHiHiíiiiiiiiijiiíiímmiimmiiiiimi RDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPEKVDLNMSLTE 370 380 390 400 410 420 86 or£21 -psp or£21a.pep

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610 620 630 640 650 660 570 680 630 700 710 720 GYSSGTlí3PKl'YBEYG£Ki'SYGGPKKAS'7SAELLt’FFPGAK©ARTVRI.SIJFADAGSVKiX; Μ i 111 Π ! I Μ I! Μ Μ Π Π Μ Μ 1!! Π f i 1! 111Π Π Π ΜI ΠI ί ΠI Π Η M GYgSGTIiGPÍtVYOEYGEK I SYeSNXKAÍWS AEIT F PKtPGAKDftSTVRLSJjFADAGSWSlG or121.pep or£21a,pep 670 680 690 700 710 720 730 740 7S0 760 770 780 SÍTYDONS Ξ SATGGRVQNIYGAGNTHKST PÍ74ELKYSAGGAVTfcmSPLGPMKFSYAYEbKK li ΠS11H 11 iπH1 ί Π 11 Uí I íf 11H IH11IΠ11111 i1111N11111IIi KTYDD«£SSATGGRVQNIYGAGKTHKSTFTNELRYSAGGAVT6«,SPU3PMKFSYAYPLKK 730 740 750 760 770 ?S0 ar £21.pep or£2la,pep ©r£21 - pep or£2la.pep 750 KPBDKIQRFQFCLGrr-F1111111 m s m m KPEDSIORFQFQIaSTTFX 790 0 elevado grau de conservação sugere que uma única proteína pode ser capaz de induzir respostas imunes contra uma diversidade de espécies de Neisseriae.

Vacinas

As três proteínas acima identificadas foram expressadas e utilizadas para imunização. Foram observadas boas respostas imunes contra as proteínas.

Vacinas combinadas proteínas organismos

Adicionalmente, as antigénios contra outros foram combinadas com patogénicos (p.ex. a 87 vacina polissacarídica Chiron contra a meningite C) e usadas para imunização. Foram observadas boas respostas imunes.

Outros componentes NmB

Apesar de ser eficaz, a protecção elicitada pela vacina OMV norueguesa está limitada à estirpe usada para fabricar a vacina. Os ensaios clínicos da vacina revelaram uma eficácia de apenas 57,2% ao fim de 29 meses em adolescentes, apesar de se terem observado respostas de IgG em quase 100% dos pacientes [e.g. Rosenqvist et al. (1995) Infect. Immun. 63 :4642-4652] .

Surpreendentemente, descobriu-se que a adição de outros componentes definidos às vacinas OMV norueguesas alargam significativamente a sua eficácia. A vacina norueguesa não elicita a protecção contra NmB da estirpe 2996. Adicionaram-se determinadas proteínas da estirpe 2996 à vacina norueguesa, e demonstrou-se que a eficácia da vacina aumentou surpreendentemente. Além disso, a adição de um antigénio conjugado polissacarídico de NmC [e.g. Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698] deu resultados excelentes.

As actividades bactericidas das combinações são apresentadas no quadro seguinte:

Grupo OMV Norueguês Antigénio NmB* Antigénio NmC Actividade bactericida contra NmB estirpe 2996 1 + ' <4 2 + #1 512 88 3 + #2 ' >2048 4 + #3 1024 5 + #3 + 256 6 #3 2048 7 #3 + 2048 * Foram utilizados três antigénios NmB diferentes: #1: 0RF1- e.g. exemplo 77 de W099/24578 (ver também W099/55873) #2: proteína '287' - e.g. Figura 21 de WO99/57280 (também SEQ IDs 3103-3108) #3: Uma mistura em Al(OH)3 de #1, #2 e proteína '919' (SEQ ID 14 aqui; ver também WO99/57280 Figura 23 e SEQ IDs 3069-3074 aqui). É evidente que a ineficácia da vacina OMV norueguesa contra a estirpe 2996 (grupo 1) pode ser contornada pela adição de determinados antigénios da estirpe 2996. Os resultados com a proteína '287' de NmB são particularmente bons. A vacina norueguesa pode, assim, ser melhorada sem ser necessário preparar OMV de um conjunto de estirpes diferentes.

Esta vacina também oferece protecção contra estirpes de MenB heterólogas. A mesma vacina, preparada utilizando proteínas da estirpe 2996, foi testada contra cinco outras estirpes. Obteve-se os seguintes títulos:

Grupo 2996 BZ133 BZ232 1000 MC58 NGH38 1 <4 1024 <4 >2048 >2048 32 2 512 512 <4 >2048 >2048 256 3 4096 4096 256 1024 >2048 1024 4 1024 2048 <4 2048 >2048 64 5 256 >32000 <4 >2048 >2048 128 89 6 2048 2048 4 <4 64 4 7 2048 >32000 4 128 1024 128 Controlo * 32768 4096 8192 16384 16384 8192 * Controlos: estirpes 2996, BZ133 & 1000 = OMVs preparadas a partir de estirpe homóloga; estirpe BZ232 = OMVs preparadas a partir de 2996; MC58 & NGH38 = SEAM3

Um segundo estudo suplementou OMVs "norueguesas" com proteínas da estirpe 2996 de NmB: - proteína 919, expressada em E.coli sem qualquer parceiro de fusão - 0RF1, expressado em E.coli como uma fusão marcada por His

- Proteína 287, expressada em E.coli como uma fusão GST

- Uma mistura destas três proteínas, opcionalmente com o conjugado NmC

As preparações foram adjuvadas com AI(OH)3 e testadas contra a estirpe homóloga utilizando o ensaio bactericida. Obteve-se os seguintes resultados:

NmB NmC Antigénio 2996 N6H38 394/98 Cll BZ133 OMVs <4 32 1024 * <4 1024 + 919 <4 <4 4 <4 512 +ORF1 512 256 2048 4096 512 +287 4096 1024 1024 512 4096 +mistura 1024 64 4 64 2048 90

+mistura 256 128 2048 64000 >32000 +NmC * os anticorpos foram bacteriostáticos, não bactericidas

Outros trabalhos com o antigénio 287

Foi feita uma investigação mais profunda de combinações de OMVs norueguesas com o antigénio 287. 20yg de antigénio 287 foi combinado com a vacina OMV norueguesa (15yg OMV + AI(OH) 3) e a mistura foi utilizada para imunizar ratinhos. Os anticorpos foram testados no ensaio bactericida e demonstraram ser eficazes contra todas as estirpes testadas. Obteve-se os seguintes resultados:

NmB NmA NmC Antigénio 2996 BZ133 BZ232 1000 MC58 NGH38 NZ F6124 Cll OMVs <4 1024 <4 >2048. 32768 32 <4 287 8000 4096 256 <4 512 2048 1024 1024 2048 OMV+287 4096 4096 256 1024 4096 1024 1024

Em quase todos os casos, a combinação de OMVs + proteína 287 apresenta, surpreendentemente, resultados melhores que as OMVs isoladas. OMVs recombinantes E.coli foram transformadas para expressar 0RF1, ORF40 e ORF46. As OMVs preparadas a partir de E.coli recombinantes conseguiram induzir anticorpos bactericidas contra N. meningitidis. 91 0RF1, ORF40 e ORF46 (estirpe 2996) foram expressadas como fusões marcadas com His em E.coli e foram preparadas como proteínas puras ou sob a forma de OMVs. Os títulos bactericidas contra ambas as preparações foram testados usando a estirpe como 2996 estímulo:

Antigénio: ORFl ORF40 ORF46 Purificado 64 2048 16000 OMV 1024 256 128000

Os títulos bactericidas utilizando estirpes heterólogas como estímulo também foram medidos. ORF46 dá um título contra a estirpe MC58 de 4096 na forma pura, mas este sobe para 32000 para a forma de OMVs. ORF1 dá um título contra a estirpe F6124 de NmA de 128 na forma pura, mas este sobe para 512 para a forma de OMVs. ORF40 dá um título contra a estirpe MC58 de 512 na forma pura, mas este duplica para a forma de OMVs.

Estes dados mostram que os antigénios NmB conservam a imunogenicidade quando preparados em E.coli sob a forma de OMVs e, adicionalmente, que a imunogenicidade pode efectivamente ser melhorada.

Entender-se-á que esta aplicação descreve a invenção por via de exemplos, e que podem ser introduzidas modificações.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> CHIRON SpA

<120> VACINA OMV SUPLEMENTADA CONTRA MENINGOCOCCUS

<130> P023785WO <140> <141> 2001-01-17 <150> GB-0001067.8 <151> 2000-01-17 92 <15Ο> GB-0005699.4 <151> 2000-03-09 <160> 14

<170> SeqWin99, versão 1.02 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4 0 0> 1

Asp Phe Thr Ile Gin Asp XJ 1 5

<210> 2 <211> 2394 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 2 atgaaactga aacagattgc ttçcgcactg gccgacttca ecatecaaga catccgcgcc gtattcaact acctgcccgc eaaagtcgge atcatcaaaa gectgfcacgc caccggtttc gggcagctcc tgctgaccgt tatcgaacgc gcaaaaatgc tgeaaaacga cgccattaag tcgcaatact ttaatcaggc gacactcaat cecgggcgcg gcaaactcaa tatccaaatc cgcgtcgaca tcgacatcae gattgacgag tttgaaggca accaagtcta ttccgaccgc ggcggcattt ggecatggct gacacgaagc gatatggaaa aagtaaccga cfctctaccaa gataccgaca tccaaaeeaa cgaagacaaa gasggeggac gtttccgttg gggcaaagtc aaagccgaac tggaaaaact gctgaccatg atgaccgccg ttttgggfcga gattcagaac gaaatcagcg tacagccgct gccgaacgct atcgaaccgg gccggaaaat ctacgtcaac cgcgacgaag tcgtccgccg tgaafctacgc aagctgeaac gttecaaaga gcgcgtegag gatgccgtcc cgcttgccgg cacgcccgac cgttccaccg gttccctgga tttgagcgcg tccgcaggcg ttteccaaga caacctgttc fcccaggagca aaaccacgct taacggctcg

Arg Vai Glu Qly Leu Gin Arg Thr 10 15 acgatgttgg gcatatcgcc tttggcaefct gaaggcttgc agegtaecga gccgagtacc gaeacefcaca aegaeaeaca cggcagtgcc tttgacgacg tacgcgtcga aactgcggac cccaccatcg gctcgctcaa catcaccggc aaaaacctcg aatcgttcgg gctggcgcag caggcagtcg ccggcctgaa agaagaatac acgcccaaag taaccaaact cgcccgcaac ggcaaatccg ccaaaatcac çgacatçgaa aaactgatgc ggcaaatgtc cctgaccgaa aaccaattca acgagcagaa atttgcccaa aataacgget acctcgattt ccgtatccfcc accaagcaga ccatcaaaat caccgtccac tccatcgaag gcgacaccaa cgaagtcccc aagcccggca aatggtacga aegccagcag cgcatgggct cggeaggeta cgcatacagc gaaaccaaaa ccgtegattt cgtcctgcac gaaatacaca tcaceggcaa caacaaaacc caaatggaat ccgcacccta egacacctcc etttfcgggct acttegacaa tgtccagttt aaagtcgatt tgaacatgag tctgaccgaa ggttgggttc aagataccgg gttggtcatg ggtacgggea agtcggccgc actgcgcgcc ctgtcgttta ctgaccegta efcfccacggca 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 ?20 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 93 gacggggfcca gectgggcta cgatgtttac accageatca aacaatataa aaeeaccacg gttaecgaat acgaccgcgt gaatttcggt fcacaacaaag cgcccaaaca ctatgccgac acagacggca gcttcaaagg ctggctgtac accgacagcg cgttatggcc gacgcgcggc etgcctggea gcaaactgca atactactcc ctgagcaaaa ccttcacgct gatgctcggc agaaccaaãg aaatceeett ctttgaaaac ggatacgaaa gcggcacgct cggtccgaaa tacggcggea acaaaaaagc caacgtctçç aaagacgcgc gcaccgtccg cctgagcetg aaaacctacg acgacaacag cagttccgcg gccggcaata cceataaatc cacctttacc gttacctggc tctcgccttt aggcccgafcg aaaccggaag acgaaateca acgctfcccaa

<210> 3 <211> 797 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 3 ggaaaagcct tcgacccgog caaagcatcg gcaggcgcag gcatccgcat gagcgtgcct ttggtggcag aacacctgac cgtcaacacc tttatcaaga aatacggcaa aaeegacggc ãaaggtaccg teggctgggg gcgcaacaaa tacctgacgg gcgtgaacgc cgaaatcgcc gccacccaca accaaacctg gttcttcccc ggcgaagtcg geattgcggg cggctacggc ttctacggcg gcggcctggg ttcggtgcgc gtctatgacg aatacggcga aaaaatcagc gccgagctgc tcttcccgat gcccggcgcg tttgccgacg caggcagogt gtgggacggc accgçfcggca gggttcaaaa catttacggc aaegaattgc gctatfcecgc eggeggegcg aaattcagct acgccfcaccc gctgaagaaa ttccaactcg gcacgacgtt cfcaa 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2394

Met Lys Leu Lys Gin He Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Gly He Ser 1 5 10 15

Pro Leu Ala Leu Aia Asp Phe Thr Ile Gin Asp Ile Arg Vai Glu Gly 20 25 30

Leu Gin Arg Thr Glu Pro Ser Thr Vai Phe Aan Tyr Leu Pro Vai Lys 35 40 45

Vai Gly Asp Thr Tyr Asn Asp Thr ais Gly Ser Ala He Ile Lys Ser 50 55 60

Leu Tyr Ala Thr Gly Phe Phe Asp Asp Vai Arg Vai Glu Thr Ala Asp 65 70 75 80

Gly Gin Leu Leu Leu Thr Vai He Glu Arg Pro Thr Ile Gly Ser Leu 85 90 95

Asn Ile Thr Gly Ala Lys Met Leu Gin Asn Asp Ala Ile Lys Lys Asn 100 105 110

Leu Glu Ser Phe Gly Leu Ala Gin Ser Gin Tyr Phe Asn Gin Ala Thr 115 120 125

Leu Asn Gin Ala Vai Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gly 130 135 140

Lys Leu Asn He Gin Ile Thr Pro Lys Vai Thr Lys Leu Ala Arg Asn 145 150 155 160

Arg Vai Asp Ile Asp Ile Thr He Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys lie 165 170 175

Thr Asp Ha Glu Phe Glu Gly Asn Gin Vai Tyr Ser Asp Argr Lys Leu 180 185 190

Met Arg Gin Met Ser Leu Thr Glu Gly Gly Ile Trp Thr Trp Leu Thr 94 195 200 205

Arg Ser Asn Gin Phe Asn Glu Gin Lys Phe Ala Gin Asp Mefc Glu Lys 210 215 220

Vai Thr Asp Phe Tyr Gin Asn Asn Gly Tyr Phe Asp Phe Arg Ile Leu 225 230 235 240

Asp Thr Asp Ile Gin Thr Asn Glu Asp Lys Thr Lys Gin Thr Ile Lys 245 250 255

Ile Thr Vai Hís Glu Gly Gly Arg Phe Arg Trp Gly Lys Vai Ser Ile 260 265 270

Glu Gly Asp Thr Asn Glu Vai Pro Lys Ala Glu Leu Glu Lys Leu Leu 275 280 285

Thr Mefc Lys Pro Gly Lys Trp Tyr Glu Arg Gin Gin Mefc Thr Ala Vai 290 295 300

Leu Gly Glu ile Gin Asn Arg Mefc Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Tyr Ser 305 310 315 320

Glu Ile Ser Vai Gin pro Leu Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr Vsl Asp 325 330 335

Phe Vai Leu Hxs Ile Glu Pro Gly Arg Lys Ile Tyr Vai Asn Glu Ile 340 345 350 Hís Ile Thr Gly Asn Asn Lys Thr Arg Asp Glu Vai Vai Arg Arg Glu 355 360 365

Leu Arg Gin Mefc Glu Ser Ala Pro Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Gin Arg 370 375 380

Ser Lys Glu Arg Vai Glu Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Vai Gin Phe 385 390 395 400

Asp Ala Vai Pro Leu Ala Gly Thr Pro Asp Lys Vai Asp Leu Asn Mat 405 410 . 415

Ser Leu Thr Glu Arg Ser Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ala Gly Trp 420 425 430

Vai Gin Asp Thr Gly Leu Vai Met Ser Ala Gly Vai Ser Gin Asp Asn 435 440 445

Leu Phe Gly Thr Gly Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys 450 455 460

Thr Thr Leu Asn Gly Ser Leu Ser Phe Thr Asp Pro Tyr Phe Thr Ala 465 470 475 480

Asp Gly Vai Ser Leu Gly Tyr Asp Vai Tyr Gly Lys Ala Phe Asp Pro 485 490 495

Arg Lys Ala Ser Thr Ser Ile Lys Gin Tyr Lys Thr Thr Thr Ala Gly 500 505 510

Ala Gly Ile Arg Met Ser Vai Pro Vai Thr Glu Tyr Asp Arg Vai Asn 95 515 520 525

Phe Gly Leu vai Ala 61« His Leu Thr Vai Asn Thr Tyr Asn Lys Ala 530 535 540

Pro Lys His Tyr Ala Asp Phe Ile Lys Lys Tyr Gly Lys Thr Asp Gly 545 550 555 560

Thr Asp Gly Ser Phe Lys Gly Trp Leu Tyr Lys Gly Thr Vai Gly Trp 565 570 575

Gly Arg Asn Lys Thr Asp Ser Ala Leu Trp Pro Thr Arg Gly Tyr Leu 580 585 590

Thr Gly Vai Asn Ala 01« Ile Ala Leu Pro Gly Ser Lys Leu Gin Tyr 595 600 605

Tyr Ser Ala Thr His Asn Gin Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lys Thr 610 615 620

Phe Thr Leu Met Leu Gly Gly Glu Vai Gly Ile Ala Gly Gly Tyr Gly 625 630 635 640

Arg Thr Lys Glu lie Pro Phe Phe Glu Asn Phe Tyr Gly Gly Gly Leu 645 650 655

Gly Ser Vai Arg Gly Tyr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lys Vai Tyr 660 665 670

Asp Glu Tyr Gly Glu Lys Ile Ser Tyr Gly Gly Asn Lys Lys Ala Asn 675 680 685

Vai Ser Ala Glu Leu Leu Phe Pro Met Pro Gly Ala Lys Asp Ala Arg 690 695 700

Thr Vai Arg Leu Ser Leu Phe Ala Asp Ala Gly Ser Vai Trp Asp Gly 705 710 715 720

Lys Thr Tyr Asp Asp Asn Ser Ser Ser Ala Thr Gly Gly Arg Vai Gin 725 730 735

Asn Ile Tyr Gly Ala Gly Asn Thr His Lys Ser Thr Phe Thr Asn Glu 740 745 750

Leu Arg Tyr Ser Ala Gly Gly Ala Vai Thr Trp Leu Ser Pro Leu Gly 755 760 765

Pro Met Lys Phe Ser Tyr Ala Tyr Pro Leu Lys Lys Lys Pro Glu Asp 770 775 780

Glu Ile Gin Arg Phe Gin Phe Gin Leu Gly Thr Thr Phe 785 790 795

<210> 4 <211> 21 <212> PRT 96 <213> Neisseria meningitidis <4Ο0> 4

Met Lys Leu Lys Gin lie Ala Ser Ala Leu Mac Met Leu Gly lie Ser 15 10 15

Pro Leu Ala Leu Ala 20

<210> 5 <211> 776 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 5 97

Asp Phe Thr Ile Gin Asp Xle Arg Vai Glu Gly Leu Gin Arg Thr Glu 1 5 10 15

Pro Ser Thr Vai Phe Asn Tyr Leu Pro Vai Lys Vai Gly Asp Thr Tyr 20 25 30

Asn Asp Thr His Gly Ser Ala lie Xle Lys Ser Leu Tyr Ala Thr Gly 35 40 45

Phe Phe Asp Asp Vai Arg Vai Glu Thr Ala Asp Gly Gin Leu Leu Leu 50 55 60

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Lys Met Leu Gin Asn Asp Ala Ile Lys Lys Asn Leu Glu Ser Phe Gly 85 90 95

Leu Ala Gin ser Gin Tyr Phe Asn Gin Ala Thr Leu Asn Gin Ala Vai 100 105 110

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Xle Thr Pro Lys vai Thr Lys Leu Ala Arg Asn Arg Vai Asp He Asp 130 135 140

Xle Thr Ile Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys Ile Thr Asp Ile Glu Phe 145 150 155 160

Glu Gly Asn Gin Vai Tyr Ser Asp Arg Lys Leu Met Arg Gin Met Ser 165 170 175

Leu Thr Glu Gly Gly Xle Trp Thr Trp Leu Thr Arg Ser Asn Gin Phe 180 185 180

Asn Glu Gin Lys Phe Ala Gin Asp Met Glu Lys Vai Thr Asp Phe Tyr 195 200 205

Gin Asn Asn Gly Tyr Phe Asp Phe Arg Ile Leu Asp Thr Asp Ile Gin 210 215 220

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Gly Gly Arg Phe Arg Trp Gly Lys Vai Ser Ile Glu Gly Asp Thr Asn 245 250 255

Glu Vai Pro Lys Ala Glu Leu Glu Lys Leu Leu Thr Met Lys Pro Gly 98 260 265 270

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Asn Arg Met Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Tyr Ser Glu Xle Ser Vai Gin 230 255 3ÕÔ

Pro Leu Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr Vai Asp Phe Vai Leu His xle 305 310 315 320

Glu Pro Gly Arg Lys lie Tyr Vai Asn Glu Ile His Ile Thr Gly Asn 325 330 335

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Glu Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Vai Gin Phe Asp Ala Vai Pro Leu 370 375 380

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Asp Ser Ala Leu Trp Pro Thr Arg Gly Tyr Leu Thr Gly Val Asn Ala 565 570 575

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Lys lie Ser Tyr Gly Gly àsn Lys Lys Ala Asm Vai Ser Ala Glu Leu 660 665 670

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Leu Phe Ala Asp Ala Gly Ser Vai Trp Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Asp 6§0 695 700

Asn Ser Ser Ser Ala Thr Gly Gly Arg Vai Gin Asn Ile Tyr Gly Ala 705 710 715 720

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Gly Gly Ala Vai Thr Trp Leu Ser Pro Leu Gly Pro Met Lys Phe Ser 740 745 750

Tyr Ala Tyr Pro Leu Lys Lys Lys Pro Glu Asp Glu Xle Gin Arg Phe 755 760 765

Gin Phe Gin Leu Gly Thr Thr Phe 770 775

<210> 6 <211> 2379 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 6 «tgaaactga aacagattgc ccccgcactg atgatgttgg gcatatcgcc ttfcggcattt 60 gccgacttca ccatccaaga catccgtgtc gaaggcttge agcgtaccga gccgagcacc 120 gtattcaact acctgcccgt caaagtcggc gaoacctaca acgacacaca cggcagtgcc 180 atcateaaaa gcctgtacgc caccggtttc ttfcgaegacg tacgagtcga aactgcggac 240 gggcagctfcc fcgctgaccgt tatcgaacgc cecaccatcg getcgctcaa catcaccggc 300 gccaaaafcgc tgcaaaacga cgecatcaag aaaaacctcg aatcgctegg gctggcgcag 360 tcgcaatact ttaatcagge gacactcaac caggcagtcg ccggcctgaa agaagaatae 420 ctcgggcgtg gcaaacteaa catccaaatc aegeccaaag taaccaaact cgcccgcaac 480 cgcgtcgaca tcgacatcac gattgacgag ggcaaatccg ccaaaatcac cgacatogaa 540 tttgaaggca aceaagteta ttcogaccge aaaetgatgc ggcagatgtc gctgaccgaa 600 ggcggcattt ggacatggct gacacgaagc gaccggtfccg accgccagaa attcgcccaa 660 gacatggaaa aagtaaccga cttetaccag aacaaeggct: acttcgattt ccgtatcctc 720 gataccgaca tccaaaceaa cgaagacaaa acçaggcaga ccatcaaaat caccgtccac 7S0 gaaggcggac gtttccgctg gggcaaagfcg tegattgaag gcgacaccaa cgaagfccccc 840 aaggccgaac tggaaaaact gctgaccatg aagcccggca aatggtacga acgccagcag 900 atgaccgccg cctcgggcga gactcagaac cgcatgggct cggcaggcta cgcatacagc 950 100 gaaatcagcg tacagccgct gccgaacgcc ggaaccaaaa ccgtcgattt cgtcctgcae 1020 atcgaaccgg gccggaaaafc ctacgtcaac gaaatccaca tcaccggcaa caacaaaacc 1080 cgcgacgaag tcgtgcgccg cgaattgcgc caaatggaat ccgcgcctta egacaccfcce 1140 aagctgcaac gctccaaaga gcgcgtcgag cttttgggct acttcgacaa cgfcacagfctt 1200 gatgccgtcc cgcttgccgg tacgcccgac aaagtcgatt fcgaacafcgag cctgaccgaa 1260 cgctccaccg gctcgctcga ctfcgagcgcg ggctgggttc aggataccgg cttggtcatg 1320 tccgccggcg tategcagga caacctgttc ggtaegggcâ agtcggccgc cçtgcgcgcc 1380 tcgcgaagca aaaccacgct caacggctcg ctgtcgttta ccgacccgta cttcacggca 1440 gacggggtca gcefcgggcta cgafcatttac ggaaaagcct tegacccgcg caaagcatcg 1500 accagcgtca aacaatataa aaccaccacc gccggcggcg gegtaaggat gggtatcecc 1550 gttaccgaat acgaccgcgt caattfccggg ctggcggcgg aacacctgac cgtcaacacc 1620 tacaacaaag cacccaaacg ctatgccgac tttatcagga aatacggcaa aaccgacggc 1680 gçagacggca gcttcaaagg cctgctgtac aaaggcaccg tcggctgggg gcgcaacaag 1740 accgacagcg cgtcatggcc gacgcgcggc tacctgaccg gcgtaaatgc cgaaatcgcc 1800 ctgcccggca gcaaactgca atactactoc gecacccaca accaaacctg gttcttcccc 1860 ttaagcaaaa ccttcacgct gatgctcggc ggegaagteg gcattgcggg cggcfcacggc 1320 agaaccaaag aaatcccctt ctttgaaaac ttctacggcg gcggcctggg tfceggfcgcgc 1380 ggctacgaaa gcggcacgct cggcccgaaa gtgtatgacg aatacggcga aaaaatcagc 2040 tacggeggca acaaaaaagc caacgtctcc geegagctgc tettcccgat gcccggtgcg 2100 aaagacgcac gcaccgtccg cctgagectg tttgccgacg caggcagcgt gfcgggacggc 2160 agaaccfcata ccgccgccga aaaçggtaac aacaaatcgg tttactcgga aaaegcgcafc 2220 aaatccacct ttaccaacga attgcgctat tecgecggcg gcgcogttac ctggctctcg 2280 cctttgggtc cgatgaaatt cagctacgcc tacccgetga agaaaaaace ggaagacgaa 2340 atccaacgct cccaattcca gcteggcacg acgtfccfcaa 2373

<210> 7 <211> 792 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 7

Hat Lys Leu Lys Gin Ile Ala Ser Ala Leu Het Met Leu Gly Ile Ser 15 10 15

Pr© teu Ala Phe Ala Asp Phe Thr Ile Gin Asp Ile Arg Vai Glu Gly 20 25 30

Leu Gin Arg Thr Glu Pro Ser Thx Vai Phe Asn Tyr Leu Pr© Vai Lys 35 40 45

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Leu Glu Ser Phe Gly Leu Ala Gin Ser Gin Tyr Phe Asn Gin Ala Thr 115 120 125

Leu Asn Gin Ala Vai Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gly 130 13S 140

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Arg Ser Asp Arg Phe Asp Arg Glu Lys Fhe Ala Gin Asp Met Glu Lys 210 215 220

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Leu Phe Gly Thr Gly Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys 450 455 460

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Gly Ser Vai Arg Gly Tyr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lys Val Tyr 660 665 670

Asp Glu Tyr Gly Glu Lys Ile Ser Tyr Gly Gly Asn Lys Lys Ala Asn 675 680 685

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Arg Thr Tyr Thr Ala Ala Glu Asn Gly Asn Asn Lys Ser Val Tyr Ser 725 730 735

Glu Asn Ala His Lys Ser Thr Phe Thr Asn Glu Leu Arg Tyr Ser Ala 740 745 750

Gly Gly Ala Val Thr Trp Leu Ser Pro Leu Gly Pro Met Lys Phe Ser 755 760 765

Tyr Ala Tyr Pro Leu Lys Lys Lys Pr© Glu Asp Glu He Gin Arg Phe 770 775 780

Gin Phe Gin Leu Gly Thr Thr Phe 785 ?30 103 gonorrhoeae <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Neisseria <4Ο0> 8

Met Lys Leu Lys Gin Ile Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Gly Ile Ser 1 5 10 15

Pro Leu Ala Phe Ala 20

<210> 9 <211> 771 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 9

Asp Phe Thr Ile Gin Asp Ile Arg Vai Glu Gly Leu Gin Arg Thr Glu 15 10 15

Pro Ser Thr Vai Phe Asn Tyr Leu Pro Vai Lys Vai Gly Asp Thr Tyr 20 25 30

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Leu Thr Glu Gly Gly He Trp Thr Trp Leu Thr Arg Ser Asp Arg phe 180 IBS 190

Asp Arg Gin Lys Phe Ala Gin Asp Met Glu Lys Vai Thr Asp Phe Tyr 195 200 205

Gin Asn Asn Gly Tyr Phe Asp Phe Arg Ile Leu Asp Thr Asp He Gin 210 215 220 104

Thr Asn Glu Asp Lys Thr Arg Gin Thr Ile Lys Ile Thr Vai His Glu 225 230 235 240

Gly Gly Arg Phe Arg Trp Gly Lys Vai Ser Ile Glu Gly Asp Thr Asn 245 250 255

Glu Vai Pro lys Ala Glu Leu Glu lys Leu Leu Thr Met Lys Pro Gly 260 265 270

Lys Trp Tyr Glu Arg Gin Gin Hat Thr Ala Vai Leu Gly Glu Ile Gin 275 280 285

Asn Arg Het Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Tyr Ser Glu Ile Ser Vai Gin 290 295 300

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Glu Pro Gly Arg Lys Ile Tyr Vai Asn Glu Ile His Ile Thr Gly Asn 325 330 335

Asn Lys Thr Arg Asp Glu Vai Vai Arg Arg Glu Leu Arg Gin Met Glu 340 345 350

Ser Ala Pro Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Gin Arg Ser Lys Glu Arg Vai 355 360 365

Glu Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Vai Gin Phe Asp Ala Vai Pro Leu 370 375 380

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Ser Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ala Gly Trp Vai Gin Asp Thr Gly 405 410 415

Leu Vai Met Ser Ala Gly Vai Ser Gin Asp Asn Leu Phe Gly Thr Gly 420 425 430

Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys Thr Thr Leu Asn Gly 43S 440 445

Ser Leu Ser Phe Thr Asp Pro Tyr Phe Thr Ala Asp Gly Vai Ser Leu 450 455 460

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Ser Vai Lys Gin Tyr Lys Thr Thr Thr Ala Gly Gly Gly Vai Arg Met 485 490 495

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Lys Gly Leu Leu Tyx Lys Gly Thr Vai Gly Trp Gly Arg Asa Lys Thr 54$ 550 555 560

Asp Ser Ala Ser Trp Pro Thr Arg Gly Tyr Leu Thr Gly Vai Asn Ala 565 570 575

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Asn Gin Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lys Thr Phe Thr Leu Met Leu 595 600 60$

Gly Gly Glu Vai Gly Ile Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Ile 610 615 620

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Tyr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lys Vai Tyr Asp Glu Tyr Gly Glu 645 650 655

Lys Ile Ser Tyr Gly Gly Asn Lys Lys Ala Asn Vai Ser Ala Glu Leu 660 665 670

Leu Phe Pro Met Pro Gly Ala Lys Asp Ala Arg Thr Vai Arg Leu Ser 675 680 685

Leu Phe Ala Asp Ala Gly Ser Vai Trp Asp Gly Arg Thr Tyr Thr Ala 690 695 700

Ala Glu Asn Gly Asn Asn Lys Ser Vai Tyr Ser Glu Asn Ala Hís Lys 705 710 715 720

Ser Thr Phe Thr Asn Glu Leu Arg Tyr Ser Ala Gly Gly Ala Vai Thr 725 730 735

Trp Leu Ser Pro Leu Gly Pro Met Lys Phe Ser Tyr Ala Tyr Pro Leu 740 745 750

Lys Lys Lys Pro Glu Asp Glu Ile Gin Arg Phe Gin Phe Gin Leu Gly 755 760 765

Thr Thr Phe 770

<210> 10 <211> 2394 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <4 0 0> 10 60 120 180 240 300 360 420 480 atgaaaetga aaeagattgc ttccgcactg atggtcttgg gcatategec tttggcaçtt gccgaettca ccatccaaga catccgcgtc gaaggcttgc agcgtaeega gccgagtacc gtattcaact acctgcccgt caaagtcggc gacacctaca acgacacaca cggcagfcgcc afccafccaaaa gcctgtacgc caccggtttc tttgacgacg tacgcgtega aactgcggac gggcagctcc tgetgaccgt tatcgaacgc cecaccatcg gcfecgctcaa catcaccggc gcaaaaatgc tgcaaaacga cgccattaag aaaaacctcg aafccgttcgg gctggcgcag tcgcaatact ttaatcaggc gacaeteaafc caggcagtcg ccggcctgaa agaagaatac etcgggcgcg gcaaaetcaa tatccaaate acgcccaaag fcaaccaaact cgcccgcaac 106 cgcgtcgaca tcgacatcac gattgaegag ggcaaatccg ççaaaatcac cgacatcgaa 540 tttgaaggca aecaagtcta fcfcccgaccgc aaactgatgc ggcagatgtc gctgaccgaa 600 ggcggeattt ggaeatggct gacacgaagc aaccaatcca acgagcagaa atttgcccaa 660 gacatggaaa aagcaaccga cttctaccag aacaacggct acttcgattt ccgcatcctc 720 gataccgaca tccaaaccaa cgaagacaaa accaagcaga ccatcaaaat caccgtccac 780 gaaggeggac gtttccgttg gggcaaagte tceatcgaag gcgacaccaa cgaagtcccc 640 aaagccgaac tggaaaaacfc gctgaccatg aagcccggca aatggtacga acgçcagcag 900 atgaccgccg ttttgggtga gattcagaac cgcatgggct cggcaggcta cgcatacagc 960 gaaatcagcg taoagccgct gccaaacgcc gaaaccaaaa ccgtcgattt cgtcctgcac 1020 atcgaacegg gccggaaaat ctaegtcaac gaaafcccaca tcaccggcaa caacaaaace 1080 tgcgaegaag tcgtgcgccg cgaattgcgc caaatggaat ccgcgcctta cgacacctcc 1140 aagctgcaac gctccaaaga gcgcgtcgag cttttgggcfc acttcgacaa cgtacagfcfct 1200 gatgccgtcc cgcttgcegg cacacccgac aaagfccgatc tgaacatgag cctgaccgaa 1260 cgttccaccg gctegctcga cttgagcgcg ggctgggtac aggataccgg cctggtcatg 1320 tccgcaggcg tttcccaaga caacctgttc ggtacgggca agfccggccgc cctgcgcgcc 1380 tcacgaagca aaaccacgct caacggctcg ctgtcgttta cegacccgta cttcacggca 1440 gacggggtea gcctgggeta cgatgtttac ggaaaagcct tcgacccgcg çaaagcatcg 1500 accagcatca aacaatataa aaccaccacg gcaggcgcag gcafcccgcat gagcgtgcct 1560 gttaccgaat aegaccgcgt gaatfctcggt ttggtggcag aacaccfcgac cgtcaacacc 1620 tacaaeaaag egeccaaaea ctatgccgac fcttafccaaga aatacggcaa aaccgacggc 1680 acagacggca gcttcaaagg ctggctgtac aaaggtaccg tcggctgggg gcgcaacaaa 1740 accgacagcg cgttatggcc gacgcgcgge taccfcgacgg gcgtgaacgc cgaaatcgcc 1800 ctgcccggca gcaaactgca atactactcc gccacccaca accaaacctg gttcttcccc 1860 ttaagcaaaa ccttcacgct gatgctcggc ggcgaagtcg gcattgcggg cggctacggc 1920 agaaccaaag aaatcccctt ctttgaaaac ttctacggog gcggcctggg ttcggtgcgc 1980 ggatacgaaa gcggcacgct cggtccgaaa gtgtatgacg aatacggcga aaaaatcagc 2040 tacggeggca aeaaaaaage caacgtcçee gccgagctgc tctfccccgat geccggcgcg 2100 aaagacgcgc gcaccgtccg cctgagcctg tttgccgacg caggcagcgt gtgggscgge 2160 aaaacctacg acgacaacag eagttccgcg accggcggca gggttcaaaa catttacggc 2220 gccggcaata eccataaatc cacctttacc aaegaattgc gctattccgc cggcggcgcg 2280 gtcacctggc tctcgccttt aggcecgatg aaattcagct acgcctaccc gctgaagaaa 2340 aaaccggaag acgaaatcca acgcttccaa ttccaactcg gcacgacgtt cfcaa 2394

<210> 11 <211> 797 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4 0 0> 11

Met Lys Leu Lys Gin Ile Ala Ser Ala Leu Met Vai Leu Gly Ile Ser 15 10 15

Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Thr Ile Gin Asp Ile Arg Vai Glu Gly 20 25 30

Leu Gin Arg Thr Glu Pro Ser Thr Vai Phe Asn Tyr Leu Pro vai Lys 35 40 · 45

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Leu Tyr Ala Thr Gly Phe Phe Asp Asp Vai Arg Vai Glu Thr Ala Asp 65 70 ?5 80

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Asn Ile Thr Gly Ala Lys Met Leu Gin Asn Asp Ala Ile Lys Lys Asn 100 105 110 107

Leu fila Ser Phe Gly Leu Ala Gin Ser Gin Tyr Phe Asn Gin Ala Thr 115 120 125 leii Asn Gin Ala Vai Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gly 130 135 140

Lys Leu Asn Ile Gin Ile Thr Pro Lys Vai Thr Lys Leu Ala Arg Asn 145 150 155 160

Arg Vai Asp Ile Asp He Thr Ile Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys Ile 165 170 175

Thr Asp Ile Glu Phe Glu Gly Asn Gin Vai Tyr Ser Asp Arg Lys Leu 180 185 190

Ket Arg Gin Mefc Ser Leu Thr Glu Gly Gly Ile Trp Thr Trp Leu Thr 195 200 205

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Leu Arg Gin Met Glu Ser Ala Pro Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Gin Arg 370 375 380

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Vai Gin Asp Thr Gly Leu Vai Met Ser Ala Gly vai Ser Gin Asp Asn 435 440 445

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<210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 12

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<210> 13 <211> 776 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4 0 0> 13

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<210> 15 <211> 245 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <22 0> <221> variação <222> 70 <223> Xaa = Qualquer aminoácido <400> 15

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<210> 19 <211> 591 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4 0 0> 19 120

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<210> 27 <211> 594 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 27

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Lys 145 Leu ser Phe Gly Ala 150 Asn Gly Asn Lys val 155 Asn Ile Thr Ser Asp 160 rhr Lys Gly teu asp 165 phe Ala Lys Glu Thr 170 Ala Gly Thr Asn Gly Asp 175 ΡΓΟ Thr vai HÍS 180 Leu Asn Gly He Gly 185 Ser Thr Leu Thr Asp 190 Thr Leu Leu Asn Thr 195 Gly Ala Thr Thr Asn 200 val Thr Asn Asp Asn 205 val Thr Asp Asp Glu 210 Lys Lys Arg Ala Ala 215 Ser val Lys ASp val 220 teu Asn Ala Gly Tro Asn 22 S He Lys Gly val 230 Lys Pro Gly Thr Thr 235 Ala ser ASp Asn val 240 ASp Phe val Arg Thr 245 ryr ASp Thr val Glu 250 Phe Leu ser Ala Asp 255 Thr tys Thr Thr Thr 260 val Asn val Glu Ser 265 Lys Asp Asn Gly Lys 270 Lys Thr Glu Vai Lys 275 lie Gly Ala Lys Thr 280 Ser val ile Lys Glu 285 Lys Asp Gly tys Leu 290 val Thr Gly Lys Gly 295 Lys Asp Glu Asn Gly 300 Ser Ser rhr ASp Glu 305 Gly Glu Gly Leu val 310 Thr Ala Lys Gl u val 315 Ile ASp Ala val Asn 320 Lys Ala Gly Trp Arg 325 Met Lys Thr Thr rhr 330 Ala Asn Gly Gin rhr Gly 335 Gin Ala Asp tys 340 phe Glu Thr val Thr 345 ser Gly Thr Asn Val 350 Thr Phe Al a Ser Gly 355 Lys Gly Thr Thr Ala 360 Thr val ser Lys Asp 365 ASP Gin Gly Asn lie 370 Thr val Lys Tyr Asp 375 val Asn val Gly ASp 380 Ala Leu Asn val Asn 385 Gin Leu Gin Asn Ser 390 Gly Trp Asn Leu Asp 395 Ser Lys Ala val Ala 400 Gly ser Ser Gly tys 405 val lie Ser Gly Asn 410 val Ser Pro Ser Lys Gly 415 tys Met Asp Glu 420 Thr val Asn Ile Asn 425 Ala Gly Asn Asn Ile 430 Glu Ile Thr arg Asn 435 Gly Lys Asn Ile ASp 440 ile Ala Thr Ser Met 445 Ala Pro Gin phe Ser 450 ser val Ser Leu Gly 455 Ala Gly Ala ASp Ala 460 pro Thr Leu Ser vai 465 ASp ASp Glu Gly Ala 470 Leu Asn val Gly Ser 475 Lys Asp Thr Asn Lys 480 PfO vai Arg Ile rhr 485 Asn Val Ala Pro Gly 490 val Lys Glu Gly ASp 495 Val Thr Asn val Ala 500 Gin Leu Lys Gly val SOS Ala Gin Asn Leu Asn 510 Asn Arg 135 Πβ ASP Α$η vai Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly He Ala Gin Ala He $15 S2Õ $2$

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<210> 28 <211> 598 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 28 «et 1 Asn Lys Ile Tyr 5 Arg He lie Trp Asn 10 ser Aía Leu Asn Ala 1$ Trp Vai vai val Ser 20 Glu teu Thr Arg A$n 2$ HiS Thr Lys Arg Ala 30 Ser Ala Thr vai Ala 35 Thr Ala val Leu Ala 40 Thr Leu Leu Phe Ala 45 Thr val Gin Ala Asn 50 Ala Thr Asp Asp Asp 5$ ASp Leu Tyr Leu Glu 60 Pro Val Gin Arg Thr 65 Ala val val Leu Ser 70 Phe Arg Ser ASP Lys ?5 Glu Gly Thr Gly Glu 80 Lys Glu Gly Thr Glu 85 Asp ser ASO Trp Ala 90 val Tyr Phe Asp Glu 95 Lys Arg val teu Lys 100 Ala Gly Ala ile Thr 105 Leu Lys Ala Gly Asp 110 Asn Leu Lys He Lys 115 Gin Asn Thr Asn Glu 120 Asn Thr Asn Glu as n 12$ Thr Asn Asp Ser Ser 130 Phe Thr Tyr ser teu 135 tys tys Asp Leu Thr 140 ASp Leu Thr ser vai 145 Glu Thr Glu Lys Leu ISO Ser Phe Gly Ala Asn 155 Gly Asn Lys val Asn 160 He Thr Ser Asp Thr 165 Lys Gly Leu Asn phe 170 Ala Lys Glu Thr Ala 175 Gly Thr Asn Gly ASp 180 Pro Thr Val HIS teu 185 Asn Gly He Gly Ser 190 Thr Leu Thr Asp Thr 195 teu Leu Asn Thr Gly 200 Ala Thr Thr Asn val 205 Thr Asn ASp Asn vai 210 Thr ASp ASp Glu Lys 215 Lys Arg Ala Ala Ser 220 val Lys Asp val teu 225 Asn Ala Gly Trp Asn 230 He Lys Gly val Lys 235 Pro Gly Thr Thr Ala 240 136

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Trp

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<210> 29 <211> 599 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4Ο0> 29

Met ι Asn tys ile Tyr 5 Arg Xle xle Trp Asn 10 Ser Ala Leu Asn Ala 15 Trp val Ala val Ser 20 Glu Leu Thr Arg Asn 25 His Thr Lys Arg Ala 30 Ser Ala Thr val tys 35 Thr Ala val teu Ala 40 Thr Leu Leu Phe Ala 45 Thr val Gin Ala Asn 50 Ala Thr ASp Glu Asp 55 Gl u Glu Glu Glu Leu 60 Glu Pro val val Arg 65 Ser Ala Leu Val Leu Gin 70 phe Met xle ASp 75 Lys Glu Gly Asn Gly 80 Glu Asn Glu ser Thr 85 Gly Asn xle Gly Trp 90 Ser Ile Tyr Tyr Asp 95 Asn HÍS Asn Thr Leu 100 HiS Gly Ala Thr Val 105 Thr Leu Lys Ala Gly 110 ASp Asn Leu tys Xle 115 tys Gin Asn Thr Asn 120 Lys Asn Thr Asn Glu 125 Asn Thr Asn ASp ser 130 Ser Phe Thr Tyr ser 135 Leu Lys Lys Asp Leu 140 Thr Asp Leu Thr Ser 145 val Glu Thr Glu tys ISO Leu. ser phe Gly Ala 155 Asn Gly Asn Lys val 160 A$n He Thr ser ASp 16S thr Lys Gly Leu Asn 170 Phe Ala Lys Glu Thr 175 Ala Gly Thr Asn Gly 180 ASp Thr Thr val His 185 Leu A$n Gly Ile Gly 190 Ser Thr Leu Thr ASp 195 Thr Leu Leu Asn Thr 200 Gly Ala Thr Thr Asn 205 val Thr A$n ASp Asn 210 val Thr ASp Asp Lys 215 Lys Lys Arg Ala Ala 220 ser val Lys ASP Vai 225 Leu Asn Ala Gly Trp 230 Asn Xle Lys Gly val 235 Lys ΡΓΟ Gly Thr Thr 240 Ala Ser ASp Asn val 245 Asp Phe val HIS Thr 250 Tyr ASp Thr val Glu 255 phe teu Ser Ala ASp 260 Thr Lys Thr Thr Thr 265 val Asn val Glu Ser 270 Lys ASP Asn Gly tys 275 Arg Thr Glu val tys 280 xle Gly Ala tys Thr 285 Ser val xle Lys Glu 290 Lys Asp Gly Lys Leu 295 val Thr Gly Lys Gly 300 Lys Gly Glu Asn Gly 305 ser ser Thr Asp Glu 310 Gly Glu Gly Leu Val 315 Thr Ala Lys Glu val 320 ile ASp Ala val Asn 325 Lys Ala Gly Trp Arg 330 Met Lys Thr Thr Thr 335 Ala 138

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<210> 30 <211> 592 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 30

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Met Asn Lys He Tyr Arg Ile ile Trp Asn Ser Ala teu Asn Ala Trp

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Asn Ser Arg Gly His Phe G^y A^a ff£ A^a s«r <^y Tyr Gin Trp 5gè 585 590

<210> 32 <211> 592 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 32

Met 1 Asn tys lie Tyr S Arg lie x 1 e rrp Asn 10 Ser Afa Leu Asn Ata 15 Trp vai Ala vai ser 20 Glu teu Thr Arg Asn 25 HÍS Thr tys Arg Ala 30 Ser Ala Thr vai Lys 35 Thr Ala vai teu Ala 40 Thr teu Leu Phe Ala 4$ Thr val Gin Ala Asn 50 Ala Thr ASp Gl u Asp 55 Glu Glu Glu Glu Leu 60 Glu Ser val Gin Arg 65 Ser vai vai Gly ser 70 lie Gin Ala ser Met 75 Glu Gly Ser Gly Glu 80 teu Glu Thr ile ser 85 Leu Ser Met Thr Asn 90 ASp Ser tys Glu phe 95 val ASp Pro Tyr xle 200 vai vai Thr Leu tys 105 Ala Gly ASp Asn Leu 110 tys xle tys Gin Asn 115 Thr Asn Glu Asn Thr 120 Asn Ala ser Ser Phe 125 Thr Tyr ser leu tys 130 tys ASP t eu Thr Gly 135 Leu xle Asn val Glu 140 Thr Glu tys teu Ser 145 Phe Gly Ala Asn Gly 150 tys tys val aso Xle 155 ile ser ASp Thr tys 160 61 y teu Asn Phe Ala 165 tys Glu Thr Ala Gly 170 Thr Asn Gly Asp Thr 175 Thr vai His teu Asn 180 Gly ile Gly Ser rhr 185 Leu Thr ASp Thr teu 190 Ala Gly ser Ser Ala 195 Ser HÍS val ASp Ala 200 Gly Asn Gin Ser Thr 205 His Tyr Thr Arg Ala 210 Ala Ser 11« tys ASp 21$ Val teu Asn Ala Gly 220 Trp Asn Ile tys Gly 225 vai tys Thr Gly ser 230 Thr Thr Gly Gin Ser 235 Glu Asn val ASp Phe 240 vai Arg Thr Tyr ASp 245 Thr val Glu Phe Leu 250 ser Ala Asp Thr tys 255 Thr Thr Thr vai aso 260 val Glu Ser tys Asp 265 Asn Gly Lys Arg Thr 270 Glu val tys ile Gly Ala Lys Thr Ser val xle tys Glu Lys Asp Gly tys teu 143 275 280 285 vai Thr cly Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly ser ser Thr Asp Glu Gly 295 290 300

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Gly Ala Asp Ala

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<210> 40 <211> 594 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 40

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Val Ala val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30 Th r vai Ala Thr Ala val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr val Gin 35 40 45 Ala Ser Thr Thr ASp ASp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu pro val Gin Arg 50 55 60 Thr Ala val val Leu Ser Phe Arg ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80 Lys Glu val Thr Glu ASp ser Asn Trp Gly val Tyr Phe Asp Lys Lys 85 90 95 Giy val Leu Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu 100 105 110 Lys ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Ala Ser Ser Phe Thr 115 120 125 tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser val Gly Thr Glu 130 135 140 Lys Leu Ser Phe Ser Ala Asn Ser Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp u7 _ 145 150 155 160 Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Lys Thr Ala Glu Thr Asn Gly Asp 165 170 175 Thr Thr val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu 180 185 190 Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn val Thr Asn Asp Asn val Thr Asp 195 200 205 ASp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly 210 215 220 Trp Asn ile Lys Gly val Lys Pro Gly Thr Thr Ala ser Asp Asn val 225 230 235 240 ASp Phe val Arg Thr Tyr ASp Thr val Glu Phe Leu ser Ala Asp Thr 245 250 255 Lys Thr Thr Thr val Asn val Glu ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr 260 265 270 Glu val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly 275 280 285 Lys Leu val Thr Gly Lys ASp Lys Gly Glu Asn Asp Ser ser Thr Asp 290 295 300 Lys Gly Glu Gly Leu val Thr Ala LVS — j — Glu val Ile Asp Ala val Asn 305 310 315 320 Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly 325 330 335 Gin Ala Asp Lys phe Glu Thr val Thr Ser Gly Thr Asn val Thr Phe 340 345 350 Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr val ser Lys Asp Asp Gl n Gly 355 360 365 Asn Ile Thr val Met Tyr Asp val Asn val Gly ASP Ala Leu Asn val 370 375 380 157 ASH Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu ASp Ser Lys Ala val Ala 385 390 395 400 Gly Ser Ser Gly Lys 405 val Ile Ser Gly Asn 410 val ser Pro ser Lys 415 Gl y tys Met ASP Glu 420 Thr val Asn Ile ASíl 425 Ala Gly Asn Asn ile 430 Glu ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn IU Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr pro Gin 435 440 445 Phe $er ser val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser 450 455 460 vai ASp Asp Gf u oly Ala teu Asn val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys 465 470 475 480 pro Vai Arg lie thr Asn val Ala Pro Gly val Lys Gl u Gly ASp Val 485 490 495 Thr Asn vai a! a Gin Leu Lys Gly val Ala Gin Asn Leu Asn Asn His 500 505 510 ile ASp Asn val ASp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala ile 515 520 525 Ala Thr Ala Gly teu val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met «et 530 535 540 Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala il e ílt 545 550 555 560 Tyr ser Ser ile Ser ASP Gly Gly Asn Trp ile ile tys Gly Thr Ala 565 570 575 Ser Gly Asn ser Arg Gly His phe Gly Ala Ser Ala ser Val Gly Tyr 580 585 590

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Lisboa, 11 de Novembro de 2010 160

Claims (15)

1. Reivindicações 1. Um composição compreendendo (a) uma preparação de membrana externa N.meningitidis do serogrupo B e (b) proteína ORF40 de Neisseria meningitidis; caracterizado por o componente (b) ser seleccionado de entre um ou mais dos seguintes: • uma proteína incluindo uma sequência de aminoácidos seleccionada das SEQ IDs 15-17, ou uma proteína incluindo um fragmento imunogénico de uma ou mais das SEQ IDs 15-17, ou uma proteína contendo uma sequência com uma homologia de 80% ou mais com uma ou mais das SEQ IDs 15-17; • uma proteína incluindo uma sequência de aminoácidos seleccionada das SEQ IDs 18-38; • uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído pela SEQ ID 39 ou uma proteína compreendendo um fragmento imunogénico da SEQ ID 39, ou uma proteína compreendendo uma sequência com uma homologia de 80% ou mais com a SEQ ID 39; e/ou • uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído pela SEQ ID 40 ou SEQ ID 41 ou uma proteína compreendendo um fragmento imunogénico da SEQ ID 40 ou SEQ ID 41, ou uma proteína compreendendo uma sequência com uma homologia de 80% ou mais com a SEQ ID 40 ou SEQ ID 41, em que as SEQ IDs: 15-41 são conforme definidas nas figuras.
2. 2. A composição, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizada por o componente (b) ser uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada das SEQ IDs 15-17, ou uma proteína compreendendo um fragmento imunogénico de uma ou mais SEQ IDs 15-17, ou uma proteína compreendendo uma sequência, quando as SEQ IDs: 15-41 são 1 conforme definidas nas figuras, com homologia superior a 80% com uma ou mais das SEQ IDs 15-17.
3. 3. A composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o componente (b) incluir uma proteina de uma estirpe de N.meningitidis serogrupo B ('NmB').
4. 4. A composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o componente (b) incluir uma proteina de uma estirpe de NmB diferente da estirpe a partir da qual o componente (a) é derivado.
5. 5. A composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por um ou mais dos seus componentes ser adsorvido sobre um adjuvante de hidróxido de aluminio.
6. 6. A composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o componente (a) compreender vesículas de membrana externa (OMV).
7. 7. A composição, de acordo com a reivindicação N°.6, caracterizada por as OMVs serem um extracto desoxicolato de Neisseria meningitidis, serogrupo B.
8. 8. A composição, de acordo com a reivindicação N°.6 ou da reivindicação N°.7, caracterizada por as OMVs serem da estirpe 44/76 de Neisseria meningitidis.
9. 9. A composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.6 a N°.8, caracterizada por o componente OMV ser adsorvido sobre um adjuvante de hidróxido de alumínio.
10. 10. A composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender ainda um componente imunogénico seleccionado entre as proteínas 2 NspA, PorA, TbpA, TbpB, PilC, OpA ou Omp85 de Neisseria meningitidis.
11. 11. A composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender ainda um ou mais dos seguintes componentes: • um antigénio protector contra Neisseria meningitidis do serogrupo A; • um antigénio protector contra Neisseria meningitidis do serogrupo C; • um antigénio protector contra Neisseria meningitidis do serogrupo Y; • um antigénio protector contra Neisseria meningitidis do serogrupo W; • um antigénio protector contra Haemophilus influenzae; • um antigénio protector contra pneumococos; • um antigénio protector contra difteria; • um antigénio protector contra o tétano; • um antigénio protector • um antigénio protector • um antigénio protector • um antigénio protector contra a tosse convulsa; contra Helicobacter pylori; contra a poliomielite; e/ou contra o virus da hepatite B.
12. 12. A composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a composição ser uma vacina.
13. 13. A composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para uso como medicamento. 3 14. 0 uso de uma preparação de (a) membrana externa de N. meningitidis do serogrupo B e (b) proteína ORF40 de Neisseria meningitidis, de acordo com a reivindicação N°.l ou a reivindicação N°.2, caracterizado por ser utilizado no fabrico de: (i) um medicamento para o tratamento ou prevenção da infecção por bactérias da família da Neisseria; (ii) um reagente de diagnóstico para a detecção da presença de bactérias da família da Neisseria ou de anticorpos contra bactérias da família da Neisseria; e/ou (iii) um reagente que tem a capacidade de originar anticorpos contra bactérias da família da Neisseria.
14. 15. Uma composição compreendendo uma preparação de membrana externa e de proteína ORF40 de Neisseria meningilidis, preparada a partir de uma bactéria que foi manipulada para a hiperprodução de ORF40 na sua membrana externa, caracterizada por a ORF40 ser de acordo com o definido na reivindicação N°.l ou na reivindicação N°.2.
15. 16. Um método para preparar uma bactéria recombinante de Neisseria meningitidis para a preparação da composição, de acordo com a reivindicação N°.15, caracterizado por compreender a manipulação de uma bactéria N.meningitidis para que hiperproduza a proteína ORF40 na sua membrana externa. Lisboa, 11 de Novembro de 2010 4