ES2323845T3 - Secuencias genomicas de neisseria y procedimientos de uso. - Google Patents
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Abstract
Una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1.
Description
Secuencias genómicas de Neisseria y
procedimientos de uso.
Esta invención se refiere a los procedimientos
para obtener antígenos e inmunógenos, a los antígenos e inmunógenos
obtenidos de esta manera, y a los ácidos nucleicos de la especie
bacteriana: Neisseria meningitidis. En concreto, se refiere
a las secuencias genómicas de las bacteria; más concretamente, su
serogrupo "B".
Neisseria meningitidis es un patógeno
humano diplococo no motil gram negativo. Coloniza la faringe
produciendo meningitis y, ocasionalmente, septicemia en ausencia de
meningitis. Está estrechamente relacionado con N.
gonorrhoea, aunque una característica que diferencia claramente
meningococo de gonococo es la presencia de una cápsula polisacárida
que está presente en todos los meningococos patógenos.
N. meningitidis produce enfermedades
endémicas y epidémicas. En los Estados unidos la tasa de ataques es
de 0,6-1 por 100.000 personas por año, y puede ser
mucho mayor durante los brotes. (Véase Lieberman y col. (1996)
Safety and Immunogenicity of a Serogroups A/C Neisseria meningitidis
Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccine in Young
Children. JAMA 275(19): 1499-1503; Schuchat y
col (1997) Bacterial Meningitis in the United States in 1995. N
Engl J Med 337(14): 970-976). En los países
en vías de desarrollo, los índices de enfermedades endémicas son
mucho mayores y durante las incidencias epidémicas los índices
pueden aumentar en 500 casos por 100.000 personas por año. La
mortalidad es extremadamente elevada, un 10-20% en
los Estados Unidos, y mucho mayor en los países en vías de
desarrollo. Tras la introducción de la vacuna conjugada contra
Haemophilus influenzae, N. meningitidis es la causa
principal de la meningitis bacteriana a todas las edades en los
Estados Unidos (Schuchat y col (1997) más arriba).
En función del polisacárido capsular del
organismo, se han identificado 12 serogrupos de N.
meningitidis. El grupo A es el patógeno más frecuentemente
implicado en la enfermedad epidémica en el África subsahariana. Los
serogrupos B y C son responsables de la gran mayoría de los casos en
los Estados Unidos y en los países más desarrollados. Los
serogrupos W135 e Y son responsables del resto de los casos en los
Estados Unidos y los países desarrollados. La vacuna meningocóccica
actualmente en uso es una vacuna polisacárida tetravalente
compuesta de los serogrupos A, C, Y y W135. Aunque eficaz en
adolescentes y adultos, induce una mala respuesta inmune y corta
duración de la protección, y no se puede usar en niños (por ejemplo,
Morbidity and Mortality weekly report, Vol. 46, Nº
RR-5 (1997)). Esto es debido a que los polisacáridos
son antígenos independientes de las células T que inducen una
respuesta inmune débil que no se puede estimular mediante
inmunización repetida. Tras el éxito de la vacunación contra H.
influenzae, se han desarrollado vacunas conjugadas contra los
serogrupos A y C y están en la etapa final de ensayo clínico
(Zollinger WD "New and Improved Vaccines Against Meningococcal
Disease". En: New Generation Vaccines, más arriba, pp.
469-488; Lieberman y col (1996) más arriba;
Costantino y col (1992) Development and phase I clinical testing of
a conjugate vaccine against meningococcus A (menA) y C (menC)
(Vaccine 10: 691-698)).
Sin embargo, el meningococo B (MenB) sigue
siendo un problema. Este serotipo es responsable actualmente del
50% de meningitis total en los Estados Unidos, Europa, y Sudamérica.
El enfoque del polisacárido no se puede usar debido a que el
polisacárido capsular de MenB es un polímero del ácido
N-acetil neuramínico
\alpha(2,8)-unido que está también
presente en el tejido de los mamíferos. Esto da como resultado la
tolerancia al antígeno; de hecho, si se estimula una respuesta
inmune, sería anti-auto, y por tanto indeseable. Con
el fin de evitar la inducción de la autoinmunidad y para inducir
una respuesta inmune protectora, el polisacárido capsular ha de
ser, por ejemplo, modificado químicamente sustituyendo los grupos
N-acetilo con grupos N-propionilo,
quedando la antigenia específica inalterada (Romero y Outschoorn
(1994) Current status of Meningococcal group B vaccine candidates:
capsular or non-capsular? Clin Microbiol Rev
7(4): 559-575).
Las soluciones alternativas de las vacunas MenB
han usado mezclas complejas de proteínas de membrana externa (OMP)
que contienen tanto las OMP solas, como las OMP enriquecidas en
porinas, o suprimidas las OMP de clase 4 que se cree que inducen
los anticuerpos que bloquean la actividad bactericida. Esta solución
produce vacunas que no están bien caracterizadas. Son capaces de
proteger contra la cepa homóloga, pero no son eficazs a largo plazo
cuando tienen muchas variantes antigénicas de las proteínas de
membrana externa. Para superar la variabilidad antigénica, se han
construido vacunas multivalentes que contienen hasta nueve porinas
diferentes (por ejemplo, Poolman JT (1992) Development of a
meningococcal vaccine. Infect. Agentes Dis. 4:13-28.
Las proteínas adicionales a usar en las vacunas de membrana externa
han sido las proteínas opa y opc, pero ninguna de estas soluciones
ha sido capaz de superar la variabilidad antigénica (por ejemplo,
Ala'Aldeen y Boriello (1996). Las proteínas 1 y 2 de unión a la
transferrina meningocócica se exponen ambas a la superficie y
generan anticuerpos bactericidas capaces de matar cepas homólogas y
heterólogas. Vaccine 14(1): 49-53).
Está disponible una cierta cantidad de datos de
la secuencia para los genes y las proteínas meningocócicas y
gonocócicas (por ejemplo, documentos
EP-A-0467714, WO96/29412), pero esto
no significa que estén completos. Se describe una proteína de N.
meningitidis con el número de acceso X77920 del EMBL. La
disposición de secuencias adicionales proporcionaría una
oportunidad de identificar las proteínas segregadas o expuestas a la
superficie que son presuntas dianas para el sistema inmune y que no
son antigénicamente variables o al menos más antigénicamente
conservadas que otras regiones más variables. De esta manera,
aquellas secuencias antigénicas que están mucho más conservadas son
secuencias preferidas. Aquellas secuencias específicas de
Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoeae que
están mucho más conservadas son secuencias preferidas adicionales.
Por ejemplo, algunas de las proteínas identificadas serían
componentes de vacunas eficaces contra el meningococo B, algunas
serían componentes de vacunas contra todos los serotipos
meningocócicos, y otras serían componentes de vacunas contra todas
las Neisseriae patógenas. La identificación de las secuencias
de las bacterias facilitará también la producción de sondas
biológicas, concretamente, sondas específicas de organismos.
Es por tanto un objeto de la invención
proporcionar secuencias de ADN Neisserial que (1) codifiquen
proteínas predichas y/o demostradas como antigénicas o
inmunogénicas, (2) se puedan usar como sondas o cebadores de
amplificación, y (3) se puedan analizar mediante sistemas
bioinformáticos.
Las Figuras que no se refieren específicamente a
la invención reivindicada son únicamente para ilustración. La Fig.
1 ilustra los productos de expresión de la proteína y la
purificación del ORF 919 predicho según se clonó y expresó en E.
coli.
La Fig. 2 ilustra los productos de expresión de
la proteína y la purificación del ORF 279 predicho según se clonó y
expresó en E. coli.
La Fig. 3 ilustra los productos de expresión de
la proteína y la purificación del ORF 576-1 según
se clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 4 ilustra los productos de expresión de
la proteína y la purificación del ORF 519-1 predicho
según se clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 5 ilustra los productos de expresión de
la proteína y la purificación del ORF 121-1 predicho
según se clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 6 ilustra los productos de expresión de
la proteína y la purificación del ORF 128-1
predicho según se clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 7 ilustra los productos de expresión de
la proteína y la purificación del ORF 206 predicho según se clonó y
expresó en E. coli.
La Fig. 8 ilustra los productos de expresión de
la proteína y la purificación del ORF 287 predicho según se clonó
y expresó en E. coli.
La Fig. 9 ilustra los productos de expresión de
la proteína y la purificación del ORF 406 predicho según se clonó y
expresó en E. coli.
La Fig. 10 ilustra la representación gráfica de
la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los
productos de expresión de la proteína del ORF 919 predicho según se
clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 11 ilustra la representación gráfica de
la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los
productos de expresión de la proteína del ORF 279 predicho según se
clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 12 ilustra la representación gráfica de
la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los
productos de expresión de la proteína del ORF 576-1
predicho según se clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 13 ilustra la representación gráfica de
la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los
productos de expresión de la proteína del ORF 519-1
predicho según se clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 14 ilustra la representación gráfica de
la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los
productos de expresión de la proteína del ORF 121-1
predicho según se clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 15 ilustra la representación gráfica de
la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los
productos de expresión de la proteína del ORF 128-1
predicho según se clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 16 ilustra la representación gráfica de
la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los
productos de expresión de la proteína del ORF 206 predicho según se
clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 17 ilustra la representación gráfica de
la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los
productos de expresión de la proteína del ORF 287 predicho según se
clonó y expresó en E. coli.
La Fig. 18 ilustra la representación gráfica de
la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los
productos de expresión de la proteína del ORF 406 predicho según se
clonó y expresó en E. coli.
La invención proporciona una proteína
constituida por la secuencia de aminoácidos codificada por los
nucleótidos 1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1.
La invención proporciona también una proteína
constituida por una secuencia de aminoácidos que difiere de la
secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1366680 a
1364114 de la SEC DE ID Nº: 1, cuya secuencia tiene un 95% o más de
identidad con una secuencia de aminoácidos codificada por los
nucleótidos 1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1.
La invención proporciona también un anticuerpo,
un ácido nucleico y una composición tal como se define en las
reivindicaciones.
Los aspectos de la siguiente descripción que no
se refieren específicamente a la invención reivindicada se incluyen
para comparación e ilustración y comparación.
La primera secuencia completa del genoma de
N. meningitidis se describió como 961 secuencias parciales de
nucleótidos contiguos, que se muestran como las SEC DE ID N^{os}:
1-961 del documento PCT/US99/23573 de propiedad
compartida (la solicitud '573), presentado el 8 de Octubre de 1999
(que se va a publicar en Abril de 2000). Se describió también una
única secuencia del genoma de longitud completa de N.
meningitidis como la SEC DE ID Nº 1068 de la solicitud '573. La
descripción se basa en un genoma de longitud completa de N.
meningitidis que aparece como la SEC DE ID Nº: 1 en la presente
solicitud como Apéndice A de la misma. Las 961 secuencias de la
solicitud '573 representan sustancialmente el genoma completo del
serotipo B de N. meningitidis (> 99,98%). Existe un
solapamiento parcial entre algunas de las 961 secuencias contiguas
("contigs") que se muestran en las 961secuencias, cuyo
solapamiento se usó para construir la secuencia única de longitud
completa que se muestra en la SEC DE ID Nº 1 en el Apéndice A de la
misma, usando el Ensamblador TIGR [G. S. Sutton y col., TIGR
Assembler: A New Tool for Assembling Large Shotgun Sequencing
Projects, Genome Science and Technology, 1: 9-19
(1995)]. Algunos de los nucleótidos en las contigs se han liberado
anteriormente. (Véase ftp:11ftp.tigr.org/pub/data/n_meningitidis en
la página web o "WWW"). Se presentan en el Apéndice A de la
solicitud '573 las coordenadas de las 2508 secuencias liberadas en
las presentes contigs. Estos datos incluyen el número de contig (o
i.d.) según se presenta en la primera columna; el nombre de la
secuencia que se encuentra en la WWW está en la segunda columna;
con las coordenadas de las contigs en la tercera y cuarta columnas,
respectivamente. Las secuencias de algunas ORF de MenB se presentan
en el Apéndice B de la solicitud '573 que presenta la Solicitud de
Patente Internacional presentada por Chiron SpA el 9 de Octubre de
1998 (PCT/IB98/01665) y el 14 de Enero de 1999 (PCT/IB99/00103)
respectivamente. El Apéndice B de la misma proporciona un listado
de 2158 marcos de lectura abiertos contenidos en el interior de la
secuencia de longitud completa que se encuentra en la SEC DE ID Nº
1 en el Apéndice A de la misma. La información que se muestra en el
Apéndice B de la misma incluye el nombre "NMB" de la
secuencia, el presunto producto de traducción, y el comienzo y el
final de las posiciones de los nucleótidos en el interior de la SEC
DE ID Nº 1 que comprende los marcos de lectura abiertos. Estos
marcos de lectura abiertos se refieren en el presente documento a
los "marcos de lectura abiertos NMB".
En un primer aspecto, la descripción proporciona
el ácido nucleico que incluye la secuencia de nucleótidos de N.
meningitidis que se muestra en la SEC DE ID Nº 1 en el Apéndice
A de la misma. Describe también el ácido nucleico que comprende las
secuencias que tienen identidad de la secuencia con la secuencia de
nucleótidos descrita en el presente documento. Dependiendo de la
secuencia concreta, el grado de identidad de la secuencia es
preferiblemente mayor del 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,
99% o más). Estas secuencias incluyen, por ejemplo, las variantes
mutantes y alélicas. El grado de identidad de la secuencia citado en
el presente documento se determina a lo largo de la longitud de la
secuencia determinada mediante el algoritmo de búsqueda de
homología Smith-Waterman que se implementa en el
programa MPSRCH (Oxford Molecular) usando una búsqueda de intervalo
fino con los siguientes parámetros: penalización de intervalo
abierto 12, penalización de extensión de intervalo 1.
La descripción proporciona también el ácido
nucleico que incluye un fragmento de una o más de las secuencias de
nucleótidos que se muestran en el presente documento, que incluyen
los marcos de lectura abiertos NMB que se muestran en el Apéndice B
del mismo. El fragmento debería comprender al menos n nucleótidos
consecutivos de las secuencias y, dependiendo de la secuencia
concreta, n es 10 o más (por ejemplo, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 100 o
más). Preferiblemente, el fragmento es único en el genoma de N.
meningitidis, es decir que no está presente en el genoma de otro
organismo. Más preferiblemente, el fragmento es único en el genoma
de la cepa B de N. meningitidis. La descripción proporciona
también el ácido nucleico que hibrida a aquellos que se proporcionan
en el presente documento. Se describen en el presente documento las
condiciones de hibridación.
La descripción proporciona también el ácido
nucleico que incluye las secuencias complementarias a las descritas
anteriormente (por ejemplo, para las de sentido contrario, para las
sondas, o para los cebadores de la amplificación).
El ácido nucleico de acuerdo con la descripción
puede, por supuesto, prepararse de muchas maneras (por ejemplo,
mediante síntesis química, a partir de las bibliotecas de ADN, a
partir de los propios organismos, etc.) y puede tomar diversas
formas (por ejemplo, de cadena única, de doble cadena, vectores,
sondas, cebadores, etc.). El término "ácido nucleico" incluye
el ADN y el ARN, y también sus análogos, tales como los que
contienen esqueletos modificados, y también el ácido nucleico
péptido (PNA) etc.
Se apreciará que, como las SEC DE ID N^{os}:
1-961 de la solicitud '573 representan el genoma
sustancialmente completo del organismo, con solapamiento parcial,
las referencias a las SEC DE ID N^{os}: 1-961 de
la solicitud '573 incluyen en su alcance referencias a la secuencia
genómica completa, esto es, la SEC DE ID Nº 1 de la misma. Por
ejemplo, cuando dos SEC DE ID N^{os} se solapan, la descripción
abarca la secuencia única formada por el ensamblaje de las dos
secuencias solapantes, cuya secuencia completa se podrá encontrar en
la la SEC DE ID Nº 1 de la misma. De esta manera, por ejemplo, una
secuencia de nucleótidos que enlaza dos SEC DE ID N^{os} pero que
no está presente en su totalidad en cualquier SEC DE ID Nº sigue
estando dentro del alcance de la descripción. Dicha secuencia
estará presente en su totalidad en la secuencia única de longitud
completa de la SEC DE ID Nº 1 de la presente
solicitud.
solicitud.
La descripción proporciona también vectores que
incluyen las secuencias de nucleótidos de la descripción (por
ejemplo, vectores de expresión, vectores de secuenciación, vectores
de clonación, etc.) y las células huésped transformadas con dichos
vectores.
De acuerdo con un aspecto adicional, la
descripción proporciona una proteína que incluye una secuencia de
aminoácidos codificada en el interior de una secuencia de
nucleótidos de N. meningitidis que se muestra en el presente
documento. Describe también las proteínas que comprenden las
secuencias que tienen identidad de la secuencia con aquellas
proteínas. Dependiendo de la secuencia concreta, el grado de
identidad de la secuencia es preferiblemente mayor del 50% (por
ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más). La identidad de la
secuencia se determina como se describe anteriormente. Estas
proteínas homólogas incluyen variantes mutantes y alélicas,
codificadas en el interior de la secuencia de nucleótidos de N.
meningitidis que se muestra en el presente documento.
La descripción proporciona además proteínas que
incluyen fragmentos de una secuencia de aminoácidos codificada en
el interior de la secuencia de nucleótidos de N. meningitidis
que se muestra en el listado de secuencias. Los fragmentos deberían
comprender al menos n aminoácidos consecutivos de las
secuencias y, dependiendo de la secuencia concreta, n es 7 o
más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o más). Preferiblemente,
los fragmentos comprenden un epitopo procedente de la
secuencia.
Las proteínas de la descripción pueden, por
supuesto, prepararse de diversos medios (por ejemplo, expresión
recombinante, purificación a partir del cultivo celular, síntesis
química, etc.) y en diversas formas (por ejemplo, natural,
fusiones, etc.). Se preparan preferiblemente en forma
sustancialmente aislada (es decir, sustancialmente libres de
otras proteínas celulares huésped de N. meningitidis).
Se pueden usar diversos ensayos para evaluar la
inmunogenia in vivo de las proteínas de la descripción. Por
ejemplo, se pueden expresar las proteínas de manera recombinante o
sintetizarse químicamente y usarse para seleccionar los sueros del
paciente mediante inmunotransferencia. Una reacción positiva entre
la proteína y el suero del paciente indica que el paciente ha
articulado anteriormente una respuesta inmune a la proteína en
cuestión, es decir, la proteína es un inmunógeno. Se puede usar
también este procedimiento para identificar las proteínas
inmunodominantes.
La descripción proporciona también un ácido
nucleico que codifica una proteína de la invención.
En un aspecto adicional, la descripción
proporciona un ordenador, una memoria informática, un medio de
almacenamiento informático (por ejemplo, un disco flexible, un
disco fijo, CD-ROM, etc.), y/o una base de datos
informática que contiene la secuencia de nucleótidos del ácido
nucleico de acuerdo con la descripción. Preferiblemente, contiene
una o más de las secuencias de nucleótidos de N. meningitidis
que se muestran en el presente documento.
Esto se puede usar en el análisis de las
secuencias de nucleótidos de N. meningitidis que se muestran
en el presente documento. Por ejemplo, esto se puede usar en una
búsqueda para identificar los marcos de lectura abiertos (ORF) o
las secuencias de codificación en el interior de las secuencias.
En un aspecto adicional, la descripción
proporciona un procedimiento para identificar una secuencia de
aminoácidos que comprende la etapa de buscar los presuntos marcos
de lectura abiertos o las secuencias que codifican la proteína en
el interior de una secuencia de nucleótidos de N.
meningitidis que se muestra en el presente documento. De forma
similar, la descripción proporciona el uso de una secuencia de
nucleótidos de N. meningitidis que se muestra en el presente
documento en una búsqueda de los presuntos marcos de lectura
abiertos o las secuencias que codifican la proteína.
El análisis del marco de lectura abierto o la
secuencia que codifica la proteína se lleva a cabo generalmente en
un ordenador usando técnicas bioinformáticas estándar. Los
algoritmos típicos o el programa usado en el análisis incluyen
ORFFINDER (NCBI), GENMARK [Borodovsky y McIninch (1993) Computers
Chem 17: 122-133], y GLIMMER [Salzberg y col.
(1998) Nucl Acids Res 26: 544-548].
Una búsqueda de un marco de lectura abierto o
secuencia que codifica la proteína puede comprender las etapas de
buscar una secuencia de nucleótidos de N. meningitidis que se
muestra en el presente documento para un codón de iniciación y
buscar la secuencia en la dirección 5' para un codón de terminación
en el interior del marco. Los codones que intervienen representan
una presunta secuencia de codificación de la proteína. Normalmente,
se buscarán los seis marcos de lectura posibles de una
secuencia.
Se puede expresar una secuencia de aminoácidos
identificada de esta manera usando cualquier sistema adecuado para
proporcionar una proteína. Se puede usar esta proteína para aumentar
los anticuerpos que reconocen los epitopos en el interior de la
secuencia de aminoácidos identificada. Se pueden usar estos
anticuerpos para seleccionar N. meningitidis para detectar
la presencia de una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos identificada.
Además, una vez que se identifica un ORF o
secuencia que codifica la proteína, se puede comparar la secuencia
con las bases de datos de secuencias. Se pueden encontrar
herramientas de análisis de secuencias en NCBI (http://www.
Ncbi.nlm.nih.gov) por ejemplo, los algoritmos BLAST, BLAST2, BLASTn,
BLASTp, tBLASTn, BLASTx, y tBLASTx [véase también Altschul y col.
(1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: new Generation
of protein Database search programs. Nucleic Acids Research 25:
2289-3402]. Las bases de datos adecuadas para
comparación incluyen las secuencias no redundantes del GenBank,
EMBL, DDBJ y PDB, y las traducciones CDS no redundantes del
GenBank, secuencias PDB, SwissProt, Spupdate y PIR. Esta
comparación puede proporcionar una indicación de la función de una
proteína.
Se pueden predecir las regiones hidrófobas en la
secuencia de aminoácidos usando algoritmos tales como los basados
en los estudios estadísticos de Esposti y col. [Critical evaluation
of the hydropathy of membrane proteins (1990) Eur j Biochem 190:
207-219] Las regiones hidrófobas representan
potenciales regiones transmembrana o secuencias líder hidrófobas,
lo que sugiere que se pueden segregar las proteínas o localizarse
en la superficie. Estas propiedades son normalmente representativas
de buenos inmunógenos.
De forma similar, se pueden predecir las
regiones transmembrana o las secuencias líder usando el algoritmo
PSORT (http://www.psort.nibb.ac.jp), y se pueden predecir
las regiones funcionales usando el programa MOTIFS (GCG Wisconsin
& PROSITE).
La descripción proporciona también un ácido
nucleico que incluye un marco de lectura abierto o secuencia que
codifica una proteína presente en una secuencia de nucleótidos de
N. meningitidis que se muestra en el presente documento.
Además, la descripción proporciona una proteína que incluye la
secuencia de aminoácidos codificada por este marco de lectura
abierto o secuencia que codifica la proteína.
De acuerdo con un aspecto adicional, la
descripción proporciona anticuerpos que se unen a estas proteínas.
Estos pueden ser policlonales o monoclonales y se pueden producir
mediante cualquier medio adecuado conocido por aquellas personas
expertas en la técnica.
Se pueden usar los anticuerpos de la descripción
en una variedad de formas, por ejemplo, para la confirmación de que
se expresa una proteína, o para confirmar dónde se expresa una
proteína. Se puede incubar el anticuerpo marcado (por ejemplo,
marcado fluorescente para FACS) con bacterias intactas y la
presencia de la marca sobre la superficie bacteriana confirma la
localización de la proteína, por ejemplo.
De acuerdo con un aspecto adicional, la
descripción proporciona composiciones que incluyen la proteína, el
anticuerpo, y/o el ácido nucleico de acuerdo con la invención. Estas
composiciones pueden ser adecuadas como vacunas, como composiciones
inmunógenas, o como reactivos de diagnóstico.
La descripción proporciona también un ácido
nucleico, proteína o anticuerpo de acuerdo con la descripción para
uso como medicamentos (por ejemplo, como vacunas) o como reactivos
de diagnóstico. Proporciona también el uso de un ácido nucleico,
proteína, o anticuerpo de acuerdo con la descripción en la
fabricación de (I) un medicamento para tratar o evitar la infección
debida a la bacteria Neisserial (ii) un reactivo diagnóstico para
detectar la presencia de la bacteria Neisserial o de los anticuerpos
aumentados contra la bacteria Neisseria. Dichas bacterias
Neisseriales pueden ser cualquier especie o cepa (tal como N.
gonorrhoeae) pero son preferiblemente N. meningitidis,
especialmente la cepa A, cepa B o cepa C.
En otro aspecto adicional más, la presente
descripción proporciona composiciones que incluyen proteínas,
moléculas de ácido nucleico, o anticuerpos. Los aspectos más
preferibles de la presente descripción se dirigen a las
composiciones inmunógenas de las proteínas. Los aspectos preferibles
adicionales de la presente descripción contemplan las composiciones
inmunógenas farmacéuticas de las proteínas o las vacunas y el uso de
las mismas en la fabricación de un medicamento para el tratamiento
o prevención de la infección debida a la bacteria Neisserial,
preferiblemente, la infección de MenB.
La descripción proporciona un procedimiento para
tratar un paciente, que comprende administrar al paciente una
cantidad terapéuticamente eficaz de ácido nucleico, proteína, y/o
anticuerpo de acuerdo con la invención.
De acuerdo con los aspectos adicionales, la
descripción proporciona diversos procedimientos.
Se proporciona un procedimiento para producir
las proteínas de la descripción, que comprende la etapa de cultivar
la célula huésped de acuerdo con la descripción en condiciones que
induzcan la expresión de la proteína. Un procedimiento que puede
incluir además la síntesis química de las proteínas y/o la síntesis
química (al menos en parte) de los nucleótidos.
Se proporciona un procedimiento para detectar
los polinucleótidos de la descripción, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una sonda nucleica de acuerdo con la
descripción con una muestra biológica bajo condiciones de
hibridación para formar dúplex; y (b) detectar dichos dúplex.
Se proporciona un procedimiento para detectar
las proteínas de la descripción, que comprende las etapas de: (a)
poner en contacto un anticuerpo de acuerdo con la descripción con
una muestra biológica en las condiciones adecuadas para la
formación de complejos antígeno-anticuerpo; y (b)
detectar dichos complejos.
Otro aspecto de la presente descripción
proporciona un procedimiento para detectar anticuerpos que se unen
de manera seleccionable a los antígenos o polipéptidos o proteínas
específicas de cualquier especie o cepa de bacteria Neisserial y
preferiblemente a cepas de N. gonorrhoeae pero más
preferiblemente a cepas de N. meningitidis, especialmente la
cepa A, cepa B o cepa C, más preferiblemente MenB, en el que el
procedimiento comprende las etapas de: (a) poner en contacto el
antígeno o polipéptido o proteína de acuerdo con la descripción con
una muestra biológica en condiciones adecuadas para la formación de
complejos antígeno-anticuerpo, y (b) detectar
dichos complejos.
Habiendo ahora descrito de manera general la
descripción, la misma será más fácilmente comprensible a través de
referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan como
ilustración.
Esta descripción proporciona secuencias del
nucleótido MenB de Neisseria meningitidis, secuencias de
aminoácidos codificadas de las anteriores. Con estas secuencias
descritas, se pueden producir ensayos de sondas de ácidos nucleicos
y casetes y vectores de expresión. Se pueden sintetizar también
químicamente las proteínas. Se pueden transformar los vectores de
expresión en las células huésped para producir proteínas. Se pueden
usar polipéptidos purificados o aislados para producir anticuerpos
para detectar las proteínas MenB. También, se pueden utilizar
células huésped o extractos para los ensayos biológicos para aislar
agonistas o antagonistas. Además, con estas secuencias se puede
buscar identificar marcos de lectura abiertos e identificar
secuencias de aminoácidos. Se pueden usar también las proteínas en
composiciones inmunógenas y como componentes de vacunas.
La práctica de la presente descripción empleará,
a no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de
biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e
inmunobiología, que están comprendidas dentro del alcance de la
persona experta en la técnica, Dichas técnicas se explican
completamente en la bibliografía, por ejemplo, Sambrook Molecular
Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); DNA Cloning,
Volúmenes I y ii (D. N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis
(M. J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames &
S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames
& S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney
ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B.
Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods
in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente los
volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H.
Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);
Mayer y Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and
Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein
Purification: Principles and Practice, Segunda Edición
(Springer-Verlag, N.Y.), y Handbook of Experimental
Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell
eds. 1986).
En esta memoria se usan abreviaturas estándar de
nucleótidos y aminoácidos.
Se pueden expresar las secuencias de nucleótidos
MenB de Neisseria en una variedad de diferentes sistemas de
expresión; por ejemplo, aquellos usados con células de mamíferos,
células de plantas, baculovirus, bacterias, y levaduras.
Se conocen en la técnica los sistemas de
expresión en mamíferos. Un promotor de mamífero es cualquier
secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de mamífero e
iniciar la transcripción en la dirección 3' (3') de una secuencia
de codificación (por ejemplo, un gen estructural) en el ARNm. Un
promotor tendrá una región iniciadora de la transcripción, que se
sitúa normalmente próxima al extremo 5' de la secuencia de
codificación, y una secuencia TATA, localizada normalmente
25-30 pares de bases (pb) en la dirección 5' del
emplazamiento de iniciación de la trascripción. Se piensa que la
secuencia TATA dirige la síntesis de la ARN polimerasa II para
iniciar la síntesis de ARN en el emplazamiento correcto. Un promotor
de mamífero contendrá también un elemento promotor en la dirección
5', localizado normalmente a unos 100 a 200 pb en la dirección 5' de
la secuencia TATA. Un elemento promotor en la dirección 5'
determina la velocidad a la cual se inicia la transcripción y puede
actuar en cualquier orientación (Sambrook y col. (1989)
"Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells". En Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed.).
Los genes víricos en mamíferos se expresan muy a
menudo y tienen un amplio intervalo de huéspedes; por tanto, las
secuencias que codifican los genes víricos en mamíferos proporcionan
secuencias de promotor particularmente útiles. Los ejemplos
incluyen el promotor temprano de SV40, el promotor LTR del virus del
tumor mamario de ratón, promotor principal tardío del adenovirus
(Ad MLP), y el promotor del virus del herpes simple, Además, las
secuencias derivadas de los genes no víricos, tales como el gen de
la metalotionenina de murino, proporcionan también secuencias de
promotor útiles. La expresión puede ser tanto constitutiva como
regulada (inducible). Dependiendo del promotor seleccionado, muchos
promotores pueden ser inducibles usando sustratos conocidos, tales
como el uso del promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV)
con el elemento responsable del glucocorticoide (GRE), que está
inducido por el glucocorticoide en las células transformadas
responsables de la hormona (véase por ejemplo, la Patente de los
Estados Unidos 5.783.681).
La presencia de un elemento potenciador
(potenciador), combinado con los elementos del promotor descritos
anteriormente, aumentará normalmente los niveles de expresión. Un
potenciador es una secuencia reguladora de ADN que puede estimular
la transcripción hasta 1000 veces cuando se une a los promotores
homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis en el emplazamiento
normal de partida del ARN. Los potenciadores son también activos
cuando se sitúan en la dirección 5' o en la dirección 3' del
emplazamiento de inicio de la transcripción, en cualquier
orientación normal o girada, o a una distancia de más de 1000
nucleótidos del promotor (Maniatis y col. (1987) Science 236: 1237;
Alberts y col. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2ª ed.). Los
elementos potenciadores derivados de los virus pueden ser
particularmente útiles, debido a que normalmente tienen un
intervalo de huéspedes más amplio. Los ejemplos incluyen el
potenciador del gen temprano de SV40 (Dijkema y col (1985) EMBO J.
4: 761) y los potenciadores/promotores derivados de la repetición
terminal larga (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Gorman y col.
(1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777) y del citomegalovirus
humano (Boshart y col. (1985) Cell 41: 521). Adicionalmente, algunos
potenciadores son regulables y llegan a ser activos únicamente en
presencia de un inductor, tal como una hormona o ión metálico
(Sassone-Corsi y Borelli (1986) Trends Genet. 2:
215; Maniatis y col. (1987) Science 236: 1237).
Se puede expresar intracelularmente una molécula
de ADN en células de mamíferos. Se puede unir directamente una
secuencia del promotor con la molécula de ADN, en cuyo caso el
primer aminoácido en el término N de la proteína recombinante será
siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio
ATG. Si se desea, se puede escindir el término N de la proteína
mediante incubación in vitro en bromuro de cianógeno.
Alternativamente, se pueden segregar también las
proteínas extrañas dese la célula a los medios de crecimiento
creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de
fusión comprendida por un fragmento de secuencia líder que
proporciona la secreción de la proteína extraña en las células de
mamíferos. Preferiblemente, existen emplazamientos de procesamiento
codificado entre el fragmento líder y el gen extraño que se pueden
escindir tanto in vivo como in vitro. El fragmento de
secuencia líder codifica normalmente un péptido señal comprendido
de aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína
desde la célula. El líder tripartito adenovírico es un ejemplo de
secuencia líder que proporciona la secreción de una proteína extraña
en las células de mamíferos.
Normalmente, la terminación de la transcripción
y las secuencias de poliadenilación reconocidas por las células de
mamíferos son regiones reguladoras localizadas en el extremo 3' del
codón de parada de la traducción y de esta manera, conjuntamente
con los elementos del promotor, flanquean la secuencia de
codificación. El término 3' del ARNm maduro está formado por la
rotura post-transcripcional específica del
emplazamiento y la poliadenilación (Birnstiel y col. (1985) Cell
41: 349; Proudfoot y Whitelaw (1988) "Termination and 3' end
processing of eukaryotic RNA". En Transcription and splicing
(ed. B.D. Hames y D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem.
Sci. 14:105). Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm
que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Los
ejemplos de señales terminadoras/de poliadenilación de la
transcripción incluyen aquellas derivadas de SV40 (Sambrook y col
(1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian
cells." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
Normalmente, los componentes anteriormente
descritos, que comprenden un promotor, la señal de poliadenilación,
y la secuencia de terminación de la transcripción se ponen juntos en
los constructos de expresión. Se pueden incluir también
potenciadores, intrones con emplazamientos donantes y aceptores con
ayustamiento funcional, y secuencias líder en un constructo de
expresión, si se desea. Los constructos de expresión se mantienen a
menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por
ejemplo, plásmidos) capaz de mantenimiento estable en un huésped,
tal como células de mamíferos o bacterias. Los sistemas de
replicación en mamíferos incluyen aquellos derivados de virus
animales, que requieren factores de trans-actuación
para replicarse. Por ejemplo, los plásmidos que contienen los
sistemas de replicación de los papovavirus, tales como SV40 (Gluzman
(1981) Cell 23: 175) o los poliomavirus, se replican con un número
de copias extremadamente elevado en presencia de un antígeno T
vírico apropiado. Los ejemplos adicionales de replicones de
mamíferos incluyen los derivados del papilomavirus bovino y el
virus Epstein-Barr. Adicionalmente, el replicón
puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo de esta manera
que éste se mantenga, por ejemplo, en células de mamíferos para la
expresión y en un huésped procariota para la clonación y la
amplificación. Los ejemplos de dichos vectores lanzadera de
bacterias de mamíferos incluyen pM72 (Kaufman y col. (1989) Mol.
Cell. Biol. 9: 946 y pHEBO (Shimizu y col. (1986) Mol. Cell. Biol.
6: 1074).
El procedimiento de transformación usado depende
del huésped que se va a trasformar. Se conocen en la técnica los
procedimientos de introducción de polinucleótidos heterólogos en
células de mamíferos e incluyen la transfección mediada por
dextrano, la precipitación con fosfato de calcio, la transfección
mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación,
encapsulación del(de los) polinucleótido(s) en
liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos.
Se conocen en la técnica líneas celulares de
mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión e incluyen
muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American
Type Culture Collection (ATCC), que incluyen, pero no se limitan a,
células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de
riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS),
células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2, y
otras numerosas líneas celulares.
Se conocen en la técnica muchos cultivos
celulares de plantas y sistemas completos de expresión genética en
plantas. Los sistemas de expresión genética celular de plantas a
modo de ejemplo incluyen aquellos descritos en patentes, tales
como: documento US 5.693.506; documento US 5.659.122; y documento US
5.608.143. Se han descrito ejemplos adicionales de expresión
genética en cultivos celulares de plantas por Zenk, Phytochemistry
30: 3861-3863 (1991). Se pueden encontrar
descripciones de los péptidos señal de proteínas de plantas además
de las referencias descritas anteriormente en Vaulcombe y col., Mol.
Gen. Genet. 209: 33-40 (1987); Chandler y col.,
Plant Molecular Biology 3: 407-418 (1984); Rogers,
J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985); Rothstein y
col., Gene 55: 353-356 (1987); Whittier y col.,
Nucleic Acids Research 15: 2515-2535 (1987); Wirsel
y col., Molecular Microbiology 3: 3-14 (1989); Yu y
col., Gene 122: 247-253 (1992). Se puede encontrar
una descripción de la regulación de la expresión génica en plantas
mediante la fitohormona, ácido giberélico y enzimas segregadas
inducidas por el ácido giberélico en R. L Jones y J. MacMillin,
Gibberellins: en: Advanced Plant Physiology,. Malcolin B. Wilkins,
ed., 1984 Pitman Publishing Limited, Londres, pp.
21-52. Referencias que describen otros genes
metabólicamente regulados: Sheen, Plant Cell, 2:
1027-1038 (1990); Maas y col., EMBO J.
9:3447-3452 (1990); Benkel y Hickey, Proc. Natl.
Acad. Sci. 84: 1337-1339 (1987).
Normalmente, usando técnicas conocidas en la
técnica, se inserta una secuencia de polinucleótidos deseada en un
casete de expresión que comprende los elementos reguladores
genéticos diseñados para la operación en plantas. El casete de
expresión se inserta en un vector de expresión deseado con
secuencias parejas en la dirección 5' y en la dirección 3' del
casete de expresión adecuado para la expresión en una planta
huésped. Las secuencias parejas serán de plásmido o de origen
vírico y proporcionarán al vector las características necesarias
para permitir que los vectores muevan el ADN desde un huésped de
clonación original, tal como una bacteria, hasta el huésped de la
planta deseado. El constructo del vector bacteriano/planta básico
proporcionará preferiblemente un origen de replicación procariota
con amplio intervalo de huéspedes; un marcador seleccionable
procariota, y, para las transformaciones de Agrobacterias, las
secuencias de ADN T para la transferencia mediada por Agrobacterias
en cromosomas de plantas. Cuando no se consigue fácilmente la
detección del gen heterólogo, el constructo tendrá también
preferiblemente un gen marcador seleccionable adecuado para
determinar si se ha transformado una célula de planta. Se encuentra
una revisión general de marcadores adecuados, por ejemplo para los
miembros de la familia de las herbáceas, en Wilmink y Dons, 1993,
Plant Mol. Biol. Reptr, 11 (2): 165-185.
Se recomiendan también las secuencias adecuadas
para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el
genoma de la planta. Estas deben incluir secuencias de transposones
y similares para la recombinación homóloga así como secuencias Ti
que permitan la inserción aleatoria de un casete de expresión
heterólogo en un genoma de planta. Los marcadores seleccionables
procariotas adecuados incluyen resistencia a los antibióticos tales
como ampicilina o tetraciclina. Pueden estar también presentes en el
vector otras secuencias de ADN que codifican funciones adicionales,
según se conoce en la técnica.
Se pueden incluir moléculas de ácido nucleico de
la invención sujeto en un casete de expresión para la expresión de
la(s) proteína(s) de interés. Normalmente, habrá
únicamente un casete de expresión, aunque son factibles dos o más.
El casete de expresión recombinante contendrá además de la proteína
heteróloga que codifica la secuencia los siguientes elementos, una
región del promotor, las secuencias 5' no traducidas de la planta,
el codón de iniciación dependiendo de si el gen estructural viene o
no equipado con uno, y la secuencia de terminación de la
transcripción y la traducción. Los emplazamientos del enzima de
restricción único en los extremos 5' y 3' del casete permiten una
fácil inserción en un vector preexistente.
Una secuencia de codificación heteróloga puede
ser para cualquier proteína relacionada con la presente invención.
La secuencia que codifica la proteína de interés codificará un
péptido señal que permite el procesamiento y las translocación de
la proteína, según sea apropiado, y carecerá normalmente de
cualquier secuencia que pueda dar como resultado la unión de la
proteína deseada de la invención con una membrana. Debido a que,
para la mayor parte, la región de iniciación transcripcional será
un gen que se expresa y transloca durante la germinación, empleando
el péptido señal que proporciona la translocación, se puede
proporcionar también la translocación de la proteína de interés. De
esta forma, la(s) proteína(s) de interés se
translocarán a partir de las células en las que se expresan y se
pueden cosechar eficientemente. Normalmente, la secreción en
semillas es a través de la aleurona o capa de epitelio escutelar en
el endosperma de la semilla. Aunque no se requiere que se segregue
la proteína a partir de las células en las que se produce la
proteína, esto facilita el aislamiento y la purificación de la
proteína recombinante.
Debido a que la expresión última del producto
génico deseado será en una célula eucariota es deseable determinar
si cualquier porción del gen clonado contiene las secuencias que
serán procesadas en forma de intrones por la maquinaria del
ayustosoma del huésped. Si acaso, se puede llevar a cabo la
mutagénesis dirigida al emplazamiento de la región del
"intrón" para evitar la pérdida de una porción del mensaje
genético como un código de intrón falso, Reed y Maniatis, Cell 42:
95-105, 1985.
Se puede microinyectar el vector directamente en
las células de la planta mediante el uso de micropipetas para
transferir mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen.
Genet, 202: 179-185, 1985. Se puede transferir
también el material genético a la célula de la planta usando
polietilenglicol, Krens, y col., Nature, 296,
72-74, 1982. Otro procedimiento de introducción de
segmentos de ácido nucleico es la penetración balística a elevada
velocidad mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico tanto
en el interior de la matriz de perlas o partículas pequeñas, como
en la superficie, Klein, y col., Nature, 327, 70-73,
1987 y Knudsen y Muller, 1991, Planta, 185: 330-336
muestran el bombardeo de partículas de endosperma de malta para
crear malta transgénica. Otro procedimiento más de introducción
sería la fusión de protoplastos con otras entidades, ya sean
minicélulas, células, lisosomas u otros cuerpos
lípido-superficiales fusionables, Fraley, y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 79, 1859-1863,
1982.
Se puede introducir también el vector en las
células de la planta mediante electroporación. (Fromm y col., Proc.
Natl Acad. Sci. EEUU 82: 5824, 1985). En esta técnica, los
protoplastos de la planta se electroporan en presencia de plásmidos
que contienen el constructo del gen. Los impulsos eléctricos de alta
intensidad de campo permeabilizan de manera reversible las
biomembranas permitiendo la introducción de los plásmidos. Los
protoplastos de la planta electroporada reforman la pared celular,
dividen, y forman el callo de la planta.
Todas las plantas de las cuales se pueden aislar
y cultivar los protoplastos para proporcionar plantas regeneradas
completas se pueden transformar mediante la presente invención de
tal manera que las plantas completas que se recuperan contengan el
gen transferido. Se sabe que prácticamente todas las plantas se
pueden regenerar a partir de células o tejidos cultivados,
incluyendo pero sin limitarse a todas las especies principales de
caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, frutales y otros
árboles, legumbres y vegetales. Algunas plantas adecuadas incluyen,
por ejemplo, especies de los géneros Fragaria, Lotus, Medicago,
Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium,
Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa,
Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum,
Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca,
Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium,
Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis,
Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, y
Datura.
Los medios para la regeneración varían de
especie a especie de planta, pero generalmente, se proporciona en
primer lugar una suspensión de protoplastos transformados que
contiene las copias del gen heterólogo. Se forma el tejido del
callo y se pueden inducir los brotes a partir del callo y
posteriormente enraizarse. Alternativamente, se puede inducir la
formación del embrión a partir de la suspensión de protoplastos.
Estos embriones germinan como embriones naturales para formar
plantas. Los medios de cultivo contendrán generalmente diversos
aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citoquinas. Es también
ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente
para las mencionadas especies como maíz y alfalfa. Normalmente, los
brotes y las raíces se desarrollan simultáneamente. La regeneración
eficiente dependerá del medio, del genotipo, y de la historia del
cultivo. Si se controlan estas tres variables, entonces la
regeneración es completamente reproducible y repetible.
En algunos sistemas de cultivo de células de
plantas, la proteína deseada de la invención se puede excretar o
alternativamente, la proteína se puede extraer a partir de la planta
completa. Cuando la proteína deseada de la invención se segrega en
el medio, ésta se puede recoger. Alternativamente, los embriones y
las semillas semiembrionadas u otro tejido de la planta se pueden
perturbar mecánicamente para liberar cualquier proteína segregada
entre las células y los tejidos. Se puede suspender la mezcla en una
disolución tampón para recuperar las proteínas solubles. A
continuación se usarán los procedimientos de aislamiento y
purificación de proteínas convencionales para purificar la proteína
recombinante. Se ajustarán los parámetros de tiempo, temperatura,
pH, oxígeno, y los volúmenes mediante procedimientos rutinarios para
optimizar la expresión y la recuperación de la proteína
heteróloga.
Se puede insertar también el polinucleótido que
codifica la proteína en un vector de expresión de insecto adecuado,
y que se une de manera operable a los elementos de control en el
interior de este vector. La construcción del vector emplea técnicas
que se conocen en la técnica. Generalmente, los componentes del
sistema de expresión incluyen un vector de transferencia,
normalmente un plásmido bacteriano, que contiene un fragmento del
genoma del baculovirus, y un emplazamiento de restricción
conveniente para la inserción del gen o genes heterólogos que se
van a expresar; un baculovirus de tipo natural con una secuencia
homóloga a la del fragmento específico del baculovirus en el vector
de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen
heterólogo en el genoma del baculovirus); y las células huésped de
insectos apropiadas y los medios de crecimiento.
Tras insertar la secuencia de ADN que codifica
la proteína en el vector de transferencia, el vector y el genoma
vírico de tipo natural se transfectan a una célula huésped de
insecto en la que se deja recombinar el vector y el genoma vírico.
Este virus recombinante empaquetado se expresa y las placas
recombinantes se identifican y purifican. Los materiales y
procedimientos para los sistemas de expresión de baculovirus/células
de insectos están comercialmente disponibles en forma de kit de,
entre otros, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac").
Las personas expertas en la técnica conocen generalmente estas
técnicas y se describen completamente en Summers y Smith, Texas
Agricultural Experiment Station Bulletin Nº 1555 (1987) (a partir de
ahora en el presente documento "Summers y Smith").
Antes de insertar la secuencia de ADN que
codifica la proteína en el genoma del baculovirus, los componentes
anteriormente descritos, que comprenden un promotor, la secuencia
líder (si se desea) la secuencia de codificación de interés, y la
secuencia de terminación de la transcripción, se ensamblan
normalmente en un constructo de sustitución intermedio (vector de
transferencia). Este constructo puede contener un único gen y los
elementos reguladores unidos de manera operable; múltiples genes,
cada uno con su propio conjunto de elementos reguladores unidos de
manera operable; o múltiples genes regulados por el mismo conjunto
de elementos reguladores. Los constructos de sustitución
intermedios se mantienen a menudo en un replicón, tal como un
elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz del
mantenimiento estable en un huésped, tal como una bacteria. El
replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo de esta
manera que éste se mantenga en un huésped adecuado para la
clonación y la amplificación.
Actualmente, el vector de transferencia más
comúnmente usado para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373.
Se han diseñado también otros muchos vectores, conocidos por
aquellas personas expertas en la técnica. Estos incluyen, por
ejemplo, pVL985 (que altera el codón de inicio de la polihedrina de
ATG a ATT, y que introduce 32 pares de bases del emplazamiento de
clonación BamHI en la dirección 3' de ATT; véase Luckow y Summers,
Virology (1989) 17: 31.
El plásmido contiene también normalmente la
señal de poliadenilación de la polihedrina (Miller y col. (1988)
Ann. Rev. Microbiol., 42: 177) y un gen procariota de resistencia a
la ampicilina (amp) y el origen de la replicación para la
selección y propagación en E. coli.
Los vectores de transferencia de baculovirus
contienen normalmente un promotor de baculovirus. Un promotor de
baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN
polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción en la
dirección 3' (5' a 3') de una secuencia de codificación (por
ejemplo, un gen estructural) en el ARNm. Un promotor tendrá una
región de inicio de la transcripción que se sitúa normalmente
proximal al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región
de iniciación de la transcripción incluye normalmente un
emplazamiento de unión a la ARN polimerasa y una región de inicio de
la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus puede
tener también una segunda región denominada potenciador, que, si
está presente, es normalmente distal al gen estructural. La
expresión puede ser tanto regulada como constitutiva.
Los genes estructurales, abundantemente
transcritos en los últimos tiempos en un ciclo de infección vírica,
proporcionan secuencias de promotor particularmente útiles. Los
ejemplos incluyen las secuencias derivadas procedentes del gen que
codifica la proteína poliédrica vírica, Friesen y col., (1986)
"The Regulation of Baculovirus Gene Expression," en: The
Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); Publ. EPO
N^{os}. 127 839 y 155 476; y the gene encoding the p10 protein,
Vlak y col., (1988), J. Gen. Virol. 69: 765.
Se puede derivar el ADN que codifica las
secuencias señal adecuadas a partir de genes de las proteínas
segregadas de insectos o baculovirus, tales como el gen de la
polihedrina de baculovirus (Carbonell y col. (1988) Gene, 73: 409).
Alternativamente, debido a que las señales de las modificaciones
postraduccionales de las células de mamíferos (tales como la rotura
del péptido señal, la rotura proteolítica, y la fosforilación)
parecen ser reconocidas por las células de insectos, y las señales
requeridas para la secreción y la acumulación nuclear también
parecen conservarse entre las células de invertebrados y las células
de vertebrados, se pueden usar también las secuencias líder de
origen no insecto, tales como aquellas derivadas de los genes que
codifican el \alpha-interferón (alfa) humano,
Maeda y col., (1985), Nature 315: 592; human
gastrin-releasing peptide,
Lebacq-Verheyden y col., (1988), Molec. Cell. Biol.
8: 3129; human IL-2, Smith y col., (1985) Proc. Nat
Acad. Sci. EEUU, 82:8404; mouse IL-3, (Miyajima y
col., (1987) Gene 58: 273; and human glucocerebrosidase, Martin y
col. (1988) DNA, 7: 99, para proporcionar la secreción en
insectos.
Se puede expresar un polipéptido o poliproteína
recombinante intracelularmente o, si se expresa con las secuencias
reguladoras apropiadas, se puede segregar. La buena expresión
intracelular de las proteínas extrañas no fusionadas requiere
normalmente genes heterólogos que idealmente tienen una secuencia
líder corta que contiene señales de iniciación de la traducción
adecuadas que preceden a una señal de inicio de ATG. Si se desea, se
puede escindir la metionina en el término N a partir de la proteína
madura mediante incubación in vitro con bromuro de
cianógeno.
Alternativamente, se pueden segregar las
poliproteínas o proteínas recombinantes que no se segregan
naturalmente a partir de la célula de insectos creando moléculas de
ADN quimérico que codifican una proteína de fusión comprendida por
un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción de la
proteína extraña en insectos. El fragmento de secuencia líder
codifica normalmente un péptido señal comprendido por aminoácidos
hidrófobos que dirigen la translocación de la proteína en el
retículo endoplásmico.
Tras la inserción de la secuencia de ADN y/o el
gen que codifica el producto de expresión precursor de la proteína,
un huésped de célula de insecto se transforma simultáneamente con el
ADN heterólogo del vector de transferencia y el ADN genómico del
baculovirus de tipo natural -normalmente mediante transfección
simultánea. El promotor y la secuencia de terminación de la
transcripción del constructo comprenderán normalmente una sección
de 2-5 kb del genoma del baculovirus. Se conocen en
la técnica los procedimientos para introducir el ADN heterólogo en
el emplazamiento deseado en el virus baculovirus. (Véase Summers y
Smith más arriba; Ju y col. (1987); Smith y col., Mol. Cell. Biol.
(1983) 3: 2156; y Luckow y Summers (1989)). Por ejemplo, la
inserción puede ser en un gen tal como el gen de la polihedrina,
mediante recombinación homóloga de doble entrecruzamiento; la
inserción puede ser también en un emplazamiento del enzima de
restricción construido mediante ingeniería genética en el gen de
baculovirus deseado. Miller y col., (1989), Bioessays 4: 91. Cuando
se clona la secuencia de ADN en lugar del gen de la polihedrina en
el vector de expresión, está flanqueada en 5' y 3' por las
secuencias específicas de la polihedrina y se posiciona en la
dirección 3' del promotor de la polihedrina.
El vector de expresión de baculovirus formado de
nuevo se empaqueta posteriormente en un baculovirus recombinante
infeccioso. La recombinación homóloga se produce a baja frecuencia
(entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 5%); de esta
manera, la mayoría del virus producido tras la transfección
simultánea sigue siendo un virus de tipo natural. Por tanto, es
necesario un procedimiento para identificar los virus recombinantes.
Una ventaja del sistema de expresión es una selección visual que
permite distinguir los virus recombinantes. La proteína
polihedrina, que está producida por el virus nativo, se produce a
niveles muy elevados en los núcleos de las células infectadas en
los últimos momentos después de la infección vírica. La proteína
polihedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que contienen
también partículas incluidas. Estos cuerpos de oclusión, de hasta
15 \mum de tamaño, son muy refráctiles, lo que les proporciona una
apariencia luminosa brillante, que se visualiza fácilmente bajo el
microscopio óptico. Las células infectadas con virus recombinantes
carecen de cuerpos de oclusión. Para distinguir los virus
recombinantes de los virus de tipo natural, se plaquea el
sobrenadante de la transfección sobre una monocapa de células de
insecto mediante técnicas conocidas por aquellas personas expertas
en la técnica. Concretamente, las placas se seleccionan bajo el
microscopio óptico para la presencia (indicativa de virus de tipo
natural) o la ausencia (indicativa de virus recombinante) de cuerpos
de oclusión. Current Protocols in Microbiology Vol. 2 (Ausubel y
col. eds) en 16.8 (Supl. 10, 1990); Summers y Smith, supra;
Miller y col. (1989).
Se han desarrollado vectores recombinantes de
expresión de baculovirus para la infección en diversas células de
insectos. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes
para, entre otros: Aedes aegypti, Autographa
californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster,
Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni (Pub. PCT
Nº. WO 89/046699; Carbonell y col., (1985) J. Virol. 56: 153; Wright
(1986) Nature 321: 718; Smith y col., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:
2156; y véase generalmente, Fraser, y col. (1989) In Vitro Cell.
Dev. Biol. 25: 225).
Las células y los medios de cultivos celulares
están comercialmente disponibles para la expresión directa y
mediante fusión de los polipéptidos heterólogos en un sistema de
expresión de baculovirus, las personas expertas en la técnica
conocen generalmente la tecnología del cultivo celular.
Véase, por ejemplo, Summers y Smith más arriba.
A continuación se pueden hacer crecer las
células de insecto modificadas en un medio nutriente apropiado, que
permita el mantenimiento estable de(de los)
plásmido(s) presentes en el huésped de insecto modificado.
Cuando el gen del producto de expresión está bajo control inducible,
se puede hacer crecer el huésped hasta una densidad elevada, e
inducir la expresión. Alternativamente, cuando la expresión es
constitutiva, el producto se expresará continuamente en el medio, y
debe circularse continuamente el medio nutriente, retirando a la
vez el producto de interés y aumentando los nutrientes agotados. Se
puede purificar el producto mediante técnicas tales como
cromatografía, por ejemplo, HPLC, cromatografía de afinidad,
cromatografía de intercambio iónico, etc.; electroforesis;
centrifugación por gradiente de densidad; extracción del disolvente,
o similar. Según sea apropiado, el producto se puede purificar
además, según se requiera, con el fin de eliminar sustancialmente
cualquier proteína de insecto que se secrete también en el medio o
sea el resultado de la lisis de las células de insecto, con el fin
de proporcionar un producto que esté al menos sustancialmente libre
de residuos del huésped, por ejemplo, proteínas, lípidos y
polisacáridos.
Con el fin de obtener la expresión de la
proteína, se incuban las células huésped recombinantes derivadas de
los transformantes en condiciones que permitan la expresión de la
secuencia de codificación de la proteína recombinante. Estas
condiciones variarán, dependientes de la célula huésped
seleccionada. Sin embargo, las condiciones son fácilmente
determinables para aquellas personas normalmente expertas en la
técnica, basándose en las que se conocen en la técnica.
Se conocen en la técnica las técnicas de
expresión bacteriana. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia
de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la
transcripción en la dirección 3' (3') de una secuencia de
codificación (por ejemplo, un gen estructural) en el ARNm. Un
promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que se
sitúa normalmente proximal al extremo 5' de la secuencia de
codificación. Esta región de iniciación de la transcripción incluye
normalmente un emplazamiento de unión a la ARN polimerasa y un
emplazamiento de iniciación de la transcripción. Un promotor
bacteriano puede tener también una segunda región denominada
operador, que puede solapar un emplazamiento de unión a la ARN
polimerasa adyacente en el cual se inicia la síntesis de ARN. El
operador permite la transcripción regulada negativa (inducible), a
medida que la proteína represora del gen puede unirse al operador e
inhibir por tanto la transcripción de un gen específico. Se puede
producir la expresión constitutiva en ausencia de los elementos
reguladores negativos, tales como el operador. Además, se puede
conseguir la regulación positiva mediante una secuencia de unión a
la proteína activadora del gen, que, si está presente, es
normalmente proximal (5') a la secuencia de unión de la ARN
polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de gen es la
proteína activadora del catabolito (CAP), que ayuda a iniciar la
transcripción del operón lac en Escherichia coli (E.
coli) (Raibaud y col. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173). La
expresión regulada puede por tanto ser tanto positiva como negativa,
potenciando o reduciendo de esta manera la transcripción.
Las secuencias que codifican las enzimas de la
ruta metabólica proporcionan secuencias de promotor particularmente
útiles. Los ejemplos incluyen secuencias de promotor derivadas de
las enzimas que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa
(lac) (Chang y col. (1977) Nature 198: 1056), y maltosa. Los
ejemplos adicionales incluyen secuencias de promotor derivadas de
enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) (Goeddel y
col. (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057; Yelverton y col. (1981) Nucl.
Acids Res. 9: 731; Patente de los Estados Unidos 4.738.921; Publ.
EPO N^{os}. 036 776 y 121 775). El sistema promotor de la beta
lactamasa (bla) (Weissmann (1981) "The cloning of
interferon and other mistakes." En Interferon 3 (ed. I.
Gresser)), el bacteriófago lambda PL (Shimatake y col. (1981)
Nature 292: 128) y los sistemas promotores de T5 (Patente de los
Estados Unidos 4.689.406) proporcionan también secuencias de
promotor útiles.
Además, los promotores sintéticos que no se
producen en la naturaleza funcionan también como promotores
bacterianos, Por ejemplo, se pueden unir las secuencias de
activación de la transcripción de un promotor bacteriano o
bacteriófago con las secuencias de operón de otro promotor
bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético
(Patente de los Estados Unidos 4.551.433). Por ejemplo, el promotor
tac es un promotor trp-lac híbrido comprendido
por las secuencias del promotor trp y el operón lac
que está regulado por el represor lac (Amann y col. (1983)
Gene 25: 167; de Boer y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21).
Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se
producen naturalmente de origen no bacteriano que tienen la
capacidad de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la
transcripción. Un promotor de origen no bacteriano que se produce
naturalmente puede acoplarse también a una ARN polimerasa compatible
para producir niveles elevados de expresión de algunos genes en
procariotas. El sistema ARN polimerasa/promotor del bacteriófago T7
es un ejemplo de sistema promotor acoplado (Studier y col. (1986) J.
Mol. Biol. 189: 113; Tabor y col. (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82:
1074). Además, un promotor híbrido también puede estar comprendido
por un promotor bacteriófago y una región de operador de E.
coli (Publ. EPO Nº 267 851).
Además de una secuencia promotora en
funcionamiento, es también útil un emplazamiento eficiente de unión
al ribosoma para la expresión de los genes extraños en procariotas.
En E. coli, el emplazamiento de unión al ribosoma se
denomina la secuencia Shine-Dalgamo (SD) e incluye
un codón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9
nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos
en la dirección 5' del codón de iniciación (Shine y col. (1975)
Nature 254: 34). Se piensa que la secuencia SD promueve la unión del
ARNm con el ribosoma mediante el emparejamiento de bases entre la
secuencia SD y el extremo 3' del ARNr de la subunidad 16S de E.
coli (Steitz y col. (1979) "Genetic signals and nucleotide
sequences in messenger RNA." En Biological Regulation and
Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger)). Para expresar
los genes eucariotas y los genes procariotas con emplazamientos de
unión al ribosoma débiles, a menudo es necesario optimizar la
distancia entre la secuencia SD y la ATG del gen eucariota
(Sambrook y col. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia
coli." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
Se puede expresar una molécula de ADN
intracelularmente. Se puede unir directamente una secuencia del
promotor con la molécula de ADN, en cuyo caso, el primer aminoácido
en el término N será siempre una metionina, que está codificada por
el codón de inicio ATG. Si se desea, se puede escindir la metionina
en el término N de la proteína mediante incubación in vitro
con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vivo o
in vitro con una peptidasa N terminal de metionina
bacteriana (Publ. EPO Nº 219237).
Las proteínas de fusión proporcionan una
alternativa a la expresión directa. Normalmente, una secuencia de
ADN que codifica la porción N terminal de una proteína bacteriana
endógena, u otra proteína estable, se fusiona en el extremo 5' de
las secuencias de codificación heterólogas. Tras la expresión, este
constructo proporcionará una fusión de dos secuencias de
aminoácidos. Por ejemplo, se puede unir el gen celular del
bacteriófago lambda en el término 5' de un gen extraño y expresarse
en la bacteria. La proteína de fusión resultante retiene
preferiblemente un emplazamiento de un enzima de procesamiento
(factor Xa) para escindir la proteína del bacteriófago procedente
del gen extraño (Nagai y col. (1984) Nature 309: 810). Se pueden
preparar proteínas de fusión con secuencias de los genes
lacZ (Jia y col.(1987) Gene 60: 197), trpE (Allen y
col. (1987) J. Biotechnol. 5: 93; Makoff y col. (1989) J. Gen.
Microbiol. 135: 11), y Chey (Publ. EPO Nº. 324 647). La
secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos
puede codificar o no un emplazamiento escindible. Otro ejemplo es
la proteína de fusión de la ubiquitina. Dicha proteína de fusión se
prepara con la región de la ubiquitina que retiene preferiblemente
un emplazamiento para el enzima de procesamiento (por ejemplo,
proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir
la ubiquitina a partir de la proteína extraña. Mediante este
procedimiento, se puede aislar la proteína extraña natural (Miller
y col. (1989) Biol Technology 7:698).
Alternativamente, se pueden segregar también las
proteínas extrañas desde la célula creando moléculas de ADN
quiméricas que codifican una proteína de fusión comprendida por un
fragmento de secuencia de péptido señal que proporciona la
secreción de la proteína extraña en la bacteria (Patente de los
Estados Unidos 4.336.336). El fragmento de secuencia señal codifica
normalmente un péptido señal comprendido de aminoácidos hidrófobos
que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula. La
proteína se secreta tanto en el medio de crecimiento (bacterias
gram positivas) como en el espacio periplásmico, localizado entre la
membrana interna y externa de la células (bacterias gram
negativas). Preferiblemente, existen emplazamientos de
procesamiento, que se pueden escindir tanto in vivo como
in vitro codificados entre el fragmento del péptido señal y
el gen extraño.
Se puede derivar el ADN que codifica secuencias
señal adecuadas a partir de los genes de las proteínas bacterianas
segregadas, tales como el gen de la proteína de membrana externa de
E. coli (ompA) (Masui y col. (1983), en: Experimental
Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb y col. (1984) EMBO J. 3:
2437) y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina de E.
coli (phoA) (Oka y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:
7212). Como ejemplo adicional, se puede usar la secuencia señal del
gen de la alfa-amilasa de diversas cepas de Bacillus
para segregar las proteínas heterólogas de B. subtilis (Palva y
col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 79: 5582; Publ. EPO Nº. 244
042).
Normalmente, las secuencias de terminación de la
transcripción reconocidas por las bacterias son regiones
reguladoras 3' localizadas en el codón de inicio de la traducción, y
de esta manera, junto con el promotor, flanquean la secuencia de
codificación. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm
que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Las
secuencias de terminación de la transcripción incluyen
frecuentemente las secuencias de ADN de aproximadamente 50
nucleótidos capaces de formar estructuras de tallo y lazo que
ayudan en la terminación de la transcripción. Los ejemplos incluyen
las secuencias de terminación de la transcripción derivadas de
genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E.
coli así como otros genes biosintéticos.
Normalmente, los componentes anteriormente
descritos, que comprenden un promotor, la secuencia señal (si se
desea), la secuencia de codificación de interés, y la secuencia de
terminación de la transcripción, se introducen juntos en los
constructos de expresión. Los constructos de expresión se mantienen
a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por
ejemplo, plásmidos) capaz del mantenimiento estable en un huésped,
tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación,
permitiéndole mantenerse de esta manera en un huésped procariota
para la expresión o para la clonación y la amplificación. Además, un
replicón puede ser un plásmido con un número de copias tanto alto
como bajo. Un plásmido con un alto número de copias tendrá por lo
general un número de copias que oscila entre aproximadamente 5 y
aproximadamente 200, y normalmente de 10 a aproximadamente 150. Un
huésped que contiene un plásmido con un alto número de copias
contendrá preferiblemente al menos aproximadamente 10, y más
preferiblemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Se puede
seleccionar cualquier vector con un alto o bajo número de copias.
Dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña en el
huésped.
Alternativamente, se pueden integrar los
constructos de expresión en el genoma bacteriano con un vector de
integración. Los vectores de integración contienen normalmente al
menos una secuencia homóloga del cromosoma bacteriano que permite
integrarse al vector. Las integraciones parecen ser el resultado de
recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma
bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos
con el ADN de diversas cepas de Bacilos se integran en el cromosoma
del Bacilo (Publ. EPO Nº 127 328). Los vectores de integración
pueden estar comprendidos también por bacteriófagos o secuencias de
transposones.
Normalmente, los constructos de expresión
extracromosómica y de integración pueden contener marcadores
seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que
se han transformado. Se pueden expresar los marcadores
seleccionables en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que
vuelven a las bacterias resistentes a los fármacos tales como
ampicilina, cloramfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina), y
tetraciclina (Davies y col. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 4569).
Los marcadores seleccionables pueden incluir también genes
biosintéticos, tales como aquellos en las rutas biosintéticas de
histidina, triptófano, y leucina.
Alternativamente, alguno de los componentes
anteriormente descritos pueden colocarse juntos en vectores de
transformación. Los vectores de transformación están normalmente
comprendidos por un marcador seleccionable, que es cualquiera que
se mantiene en un replicón o se desarrollas en un vector de
integración, tal como se ha descrito anteriormente.
Se han desarrollado vectores de expresión y
transformación, tanto replicones extracromosómicos como vectores de
integración, para la transformación en muchas bacterias, Por
ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre
otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis (Palva y
col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 79: 5582; Publ. EPO
N^{os}. 036 259 y 063 953; Publ. PCT Nº. WO 84/04541), Escherichia
coli (Shimatake y col. (1981) Nature 292: 128; Amann y col. (1985)
Gene 40: 183; Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Publ.
EPO N^{os}. 036 776, 136 829 y 136 907), Streptococcus
cremoris (Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:
655); Streptococcus lividans (Powell y col. (1988) Appl.
Environ. Microbiol. 54: 655), Streptomyces lividans (Patente
de los Estados Unidos 4.745.056).
Se conocen bien en la técnica los procedimientos
para introducir ADN exógeno en huéspedes bacterianos, e incluyen
normalmente cualquiera de la transformación de bacterias tratadas
con CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes divalentes y
DMSO. Se puede introducir también el ADN en las células bacterianas
mediante electroporación. Los procedimientos de transformación
varían normalmente con las especies bacterianas que se van a
transformar. (Véase por ejemplo, use of Bacillus: Masson
et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 273; Palva y col.
(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 79: 5582; Publ. EPO N^{os}. 036
259 y 063 953; Publ. PCT Nº. WO 84/04541; use of
Campylobacter: Miller y al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:
856; y Wang y col. (1990) J. Bacteriol. 172: 949; use of
Escherichia coli: Cohen y col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci.
69: 2110; Dower y col. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner
(1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli
with ColE1-derived plasmids. En Genetic
Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic
Engineering (eds. H.W. Boyer y S. Nicosia); Mandel y col. (1970) J.
Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318;
use of Lactobacillus: Chassy y col. (1987) FEMS Microbiol.
Lett. 44: 173; use of Pseudomonas: Fiedler y col. (1988)
Anal. Biochem 170: 38; use of Staphylococcus: Augustin y col.
(1990) FEMS Microbiol. Lett. 66: 203; use of Streptococcus:
Barany y col. (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987)
"Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, En:
Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III); Perry y
col. (1981) Infect. Immun. 32: 1295; Powell y col. (1988) Appl.
Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti y col. (1987) Proc. 4º Evr.
Cong. Biotechnology
1:412.
1:412.
Una persona normalmente experta en la técnica
conoce también los sistemas de expresión en levaduras. Un promotor
de levadura es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN
polimerasa de la levadura e iniciar la transcripción en la
dirección 3' (3') de una secuencia de codificación (por ejemplo, un
gen estructural) en el ARNm. Un promotor tendrá una región de
iniciación de la transcripción que se sitúa normalmente proximal al
extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de
iniciación de la transcripción incluye normalmente el emplazamiento
de unión con la ARN polimerasa (la "secuencia TATA" y el
emplazamiento de iniciación de la transcripción. Un promotor de
levadura puede tener también una segunda región denominada secuencia
activadora en la dirección 5' (UAS), que, si está presente, es
normalmente distal al gen estructural. La UAS permite la expresión
regulada (inducible). La expresión constitutiva se produce en
ausencia de una UAS. La expresión regulada puede ser tanto positiva
como negativa potenciando o reduciendo por tanto la
transcripción.
La levadura es un organismo fermentativo con una
ruta metabólica activa, por tanto, los enzimas que codifican las
secuencias en la ruta metabólica proporcionan secuencias de promotor
particularmente útiles. Los ejemplos incluyen alcohol
deshidrogenasa (ADH) (Publ. EPO Nº. 284 044), enolasa, glucoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
(GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa,
3-fosfoglycerate mutasa, y piruvato quinasa (PyK)
(Publ. EPO Nº. 329 203). El gen pHO5 de levadura, que
codifica la fosfatasa ácida, proporciona también secuencias de
promotor útiles (Myanohara y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU
80: 1).
Además, los promotores sintéticos que no se
producen en la naturaleza funcionan también como promotores de
levadura. Por ejemplo, se pueden unir las secuencias UAS de un
promotor de levadura con la región de activación de la
transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor
híbrido sintético. Los ejemplos de dichos promotores híbridos
incluyen la secuencia reguladora de ADH y la secuencia unida a la
región de activación de la transcripción de GAP (Patentes de los
Estados Unidos N^{os} 4.876.197 y 4. 880.734). Otros ejemplos de
promotores híbridos incluyen promotores que están constituidos por
secuencias reguladores de cualquiera de los genes ADH2, GAL4,
GAL10, OR PHO5, combinadas con la región de activación
transcripcional de un gen del enzima glicolítico tal como GAP o PyK
(Publ. EPO Nº 164 556). Además, un promotor de levadura puede
incluir promotores que se producen naturalmente de origen no
levadura que tienen la capacidad de unirse a la ARN polimerasa de
levadura e iniciar la transcripción. Los ejemplos de dichos
promotores incluyen, entre otros, (Cohen y col. (1980) Proc.
Natl. Acad Sci. EEUU 77: 1078; Henikoff y col. (1981) Nature 283:
835; Hollenberg y col. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:
119; Hollenberg y col. (1979) "The Expression of Bacterial
Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces
cerevisiae," en: Plasmids of Medical, Environmental and
Commercial Importance (eds. K.N. Timmis y A. Puhler);
Mercerau-Puigalon y col. (1980) Gene 11:163;
Panthier y col. (1980) Curr. Genet. 2: 109;).
Se puede expresar una molécula de ADN
intracelularmente en levaduras. Se puede unir directamente una
secuencia de promotor con la molécula de ADN, en cuyo caso, el
primer aminoácido en el término N de la proteína recombinante será
siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio
ATG. Si se desea, se puede escindir la metionina en el término N a
partir de la proteína mediante incubación in vitro con
bromuro de cianógeno.
Las proteínas de fusión proporcionan una
alternativa para los sistemas de expresión de levaduras, así como
en sistemas de expresión de mamíferos, plantas, baculovirus y
bacterianos. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica la
porción N terminal de una proteína de levadura endógena, u otra
proteína estable, se fusiona con el extremo 5' de las secuencias de
codificación heterólogas. Tras la expresión, este constructo
proporcionará una fusión de dos secuencias de aminoácidos. Se
pueden por ejemplo unir la levadura o el gen de la superóxido
dismutasa humana (SOD) en el término 5' de un gen extraño y
expresarse en la levadura. La secuencia de ADN en la unión de las
dos secuencias de aminoácidos puede o no codificar un emplazamiento
escindible. Véase por ejemplo, Publ. EPO Nº 196056. Otro ejemplo es
una proteína de fusión de la ubiquitina. Dicha proteína de fusión
se prepara con la región de la ubiquitina que retiene
preferiblemente un emplazamiento para el enzima de procesamiento
(por ejemplo, proteasa de procesamiento específica de ubiquitina)
para escindir la ubiquitina a partir de la proteína extraña.
Mediante este procedimiento, por tanto, se puede aislar la proteína
extraña natural (por ejemplo, documento WO88/024066).
Alternativamente, se pueden segregar también las
proteínas extrañas a partir de la célula en los medios de
crecimiento creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una
proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia líder
que proporciona la secreción en la levadura de la proteína extraña.
Preferiblemente, hay emplazamientos de procesado codificados entre
el fragmento líder y el gen extraño que se pueden escindir tanto
in vivo como in vitro. El fragmento de secuencia líder
que codifica normalmente un péptido señal comprendido por
aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína
procedente de la célula.
Se puede derivar el ADN que codifica las
secuencias señal adecuadas a partir de los genes de las proteínas
de levadura segregadas, tales como el gen de la invertasa de
levadura (Publ. EPO No. 012 873; JPO Publ. No. 62: 096.086) y el
gen del factor A (Patente de los Estados Unidos 4.588.684).
Alternativamente, las secuencias líder de origen no levadura, tales
como el interferón líder, existen de tal manera que proporcionan
también la secreción en levaduras (Publ. EPO Nº 060 057).
Una clase preferida de secuencias líderes de
secreción son aquellas que emplean un fragmento del gen del factor
alfa de levadura, que contiene una secuencia señal "pre", y una
región "pro". Los tipos de fragmentos del factor alfa que se
pueden emplear incluyen secuencias líder del factor alfa
pre-pro de longitud completa (aproximadamente 83
residuos de aminoácido) así como secuencias líderes del factor alfa
truncadas (normalmente aproximadamente 25 a aproximadamente 50
residuos de aminoácidos) (Patentes de los Estados Unidos N^{os}
4.546.083 y 4.870.008; Publ. EPO Nº 324 274). Las secuencias
líderes adicionales que emplean un fragmento líder del factor alfa
que proporciona la secreción incluyen secuencias líderes del factor
alfa híbridas preparadas tanto con una presecuencia de una primera
levadura, como con una región pro de un segundo factor alfa de
levadura (véase por ejemplo, Publ. PCT Nº WO 89/02463).
Normalmente, las secuencias de terminación de la
transcripción reconocidas por la levadura son regiones reguladoras
3' localizadas en el codón de inicio de la traducción, y de esta
manera, junto con el promotor, flanquean la secuencia de
codificación. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm
que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN.
Ejemplos de secuencia terminadora de la transcripción y otras
secuencias de terminación reconocidas por la levadura, son tales
como las que codifican los enzimas glicolíticos.
Normalmente, los componentes anteriormente
descritos comprendiendo un promotor, un líder (si se desea)
secuencia de codificacación de interés y secuencia de terminación
de la transcripción, se introducen juntos en los constructos de
expresión. Los constructos de expresión se mantienen a menudo en un
replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo,
plásmidos) capaces del mantenimiento estable en un huésped, tal como
una levadura o bacterias. El replicón puede tener dos sistemas de
replicación, permitiendo de esta manera que se mantenga, por
ejemplo, en la levadura para la expresión y en el huésped
procariota para la clonación y la amplificación. Los ejemplos de
dichos vectores lanzadera levadura-bacteria incluyen
YEp24 (Botstein y col. (1979) Gene 8: 17-24), pCl/l
(brake y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci EEUU 81:
4642-4646), e YRp17 (Stinchcomb y col. (1982) J.
Mol. Biol. 158: 157). Además, un replicón puede ser un plásmido con
número de copias tanto alto como bajo. Un plásmido con número de
copias alto tendrá generalmente un número de copias que oscila entre
aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y normalmente
aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un huésped que contiene un
plásmido con número de copias alto tendrá preferiblemente al menos
aproximadamente 10 y más preferiblemente al menos aproximadamente
20. Se puede seleccionar un vector con un número de copias alto o
bajo, dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña en
el huésped. Véase por ejemplo, Brake y col, más
arriba.
Alternativamente, se pueden integrar los
constructos de expresión en el genoma de la levadura con un vector
de integración. Los vectores de integración contienen normalmente al
menos una secuencia homóloga a un cromosoma de levadura que permite
al vector integrar, y preferiblemente contener dos secuencias
homólogas que flanquean el constructo de expresión. Las
integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN
homólogo en el vector y el cromosoma de la levadura
(Orr-Weaver y col. (1983) Methods in Enzymol. 101:
228-245). Se puede dirigir un vector de integración
a un locus específico en la levadura seleccionando la secuencia
homóloga apropiada para la inclusión en el vector. Véase
Orr-Weaver y col., más arriba. Se pueden
integrar uno o más constructos de expresión, afectando posiblemente
los niveles de la proteína recombinante producida (Rine y col.
(1983) Pro. Natl. Acad Sci EEUU 80: 6750) Se pueden producir
cualquiera de las secuencias cromosómicas incluidas en el vector
como un segmento único en el vector, que da como resultado la
integración del vector completo, o dos segmentos homólogos a
segmentos adyacentes en el cromosoma y flanqueando el constructo de
expresión en el vector, lo que puede dar como resultado en la
integración estable de únicamente el constructo de expresión.
Normalmente, los constructos de expresión
extracromosómica y de integración pueden contener marcadores
seleccionables para permitir la selección de las cepas de levadura
que se han transformado. Los marcadores seleccionables pueden
incluir genes biosintéticos que se pueden expresar en la levadura
huésped, tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRPI, y
ALG7, y el gen de la resistencia G418, que confiere
resistencia en las células de levadura a la tunicamicina y G418,
respectivamente. Además, se puede proporcionar también un marcador
seleccionable adecuado de la levadura con la capacidad de crecer en
presencia de compuestos tóxicos, tales como metales. Por ejemplo,
la presencia de CUP1 permite a la levadura crecer en
presencia de iones de cobre (Butt y col. (1987) Microbiol, Rev. 51:
351).
Alternativamente, algunos de los componentes
anteriormente descritos se pueden introducir juntos en vectores de
transformación. Los vectores de transformación están comprendidos
normalmente por un marcador seleccionable que es tanto mantenido en
un replicón como desarrollado en un vector de integración, tal como
se ha descrito anteriormente.
Se han desarrollado vectores de expresión y
transformación, tanto replicones extracromosómicos como vectores de
integración, para la transformación en muchas levaduras. Por
ejemplo, se han desarrollado vectores y procedimientos de expresión
para introducir ADN exógeno en levaduras huéspedes, para, entre
otras, las siguientes levaduras: Candida albicans (Kurtz, y
col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142); Candida maltosa (Kunze,
y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141); Hansenula
polymorpha (Gleeson, y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459;
Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302);
Kluyveromyces fragilis (Das, y col. (1984) J. Bacteriol.
158: 1165); Kluyveromyces lactis (De Louvencourt y col.
(1983) J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg y col. (1990)
Bio/Technology 8: 135); Pichia guillerimondii (Kunze y col.
(1985) J. Basic Microbiol. 25: 141); Pichia pastoris (Cregg,
y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Patentes de los Estados
Unidos. 4.837.148 y 4.929.555); Saccharomyces cerevisiae
(Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 75: 1929; Ito y
col. (1983) J. Bacteriol. 153: 163); Schizosaccharomyces
pombe (Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706); y Yarrowia
lipolytica (Davidow, y col. (1985) Curr. Genet. 10: 380471
Gaillardin, y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49).
Se conocen bien en la técnica los procedimientos
para introducir ADN exógeno en huéspedes de levaduras, y
normalmente incluyen tanto la transformación de esferoplastos como
la de células de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos.
Los procedimientos de transformación varían normalmente con las
especies de levaduras que se van a transformar. Véase por ejemplo,
[Kurtz y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze y col. (1985)
J. Basic Microbiol. 25: 141; Candida]; [Gleeson y col. (1986) J.
Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen.
Genet. 202: 302; Hansenula]; [Das y col. (1984) J. Bacteriol. 158:
1165; De Louvencourt y col. (1983) J. Bacteriol. 154: 1165; Van den
Berg y col. (1990) Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg y
col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze y col. (1985) J. Basic
Microbiol. 25: 141; Patentes de los Estados Unidos. 4.837.148 y
4.929.555; Pichia]; [Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci.
EEUU 75; 1929; Ito y col. (1983) J. Bacteriol. 153: 163
Saccharomyces]; [Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706;
Schizosaccharomyces]; [Davidow y col. (1985) Curr. Genet. 10:39;
Gaillardin y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49; Yarrowia].
Una composición que contiene X está
"sustancialmente libre de" Y cuando al menos el 85% en peso del
total de X+Y en la composición es X, Preferiblemente, X comprende
al menos aproximadamente el 90% en peso del total de X+Y en la
composición, más preferiblemente aproximadamente el 95% o incluso el
99% en peso.
El término "heterólogo" se refiere a dos
componentes biológicos que no se encuentran juntos en la naturaleza,
los componentes pueden ser células huéspedes, genes, o regiones
reguladoras, tales como promotores. Aunque los componentes
heterólogos no se encuentran juntos en la naturaleza, pueden
funcionar conjuntamente, así como cuando un promotor heterólogo en
un gen se une de manera operable al gen. Otro ejemplo es cuando la
secuencia Neisserial es heteróloga en una célula huésped de
ratón.
Un "origen de replicación" es una secuencia
de polinucleótidos que inicia y regula la replicación de los
polinucleótidos, tal como un vector de expresión. El origen de la
replicación se comporta como una unidad de replicación de
polinucleótidos autónoma en el interior de una célula, capaz de
replicación bajo su propio control. Se puede necesitar un origen de
replicación de un vector para replicarse en una célula huésped
concreta. Con algunos orígenes de replicación se puede reproducir
un vector de expresión con un número alto de copias en presencia de
las proteínas apropiadas en el interior de la célula. Ejemplos de
orígenes son las secuencias autónomamente replicativas, que son
eficazs en levaduras, y el antígeno T vírico, efectivo en las
células COS-7.
Se define una secuencia "mutante" como una
secuencia de ADN, ARN o de aminoácidos que difiere de, pero que
tiene homología con la secuencia natural o descrita. Dependiendo de
la secuencia concreta, el grado de homología entre la secuencia
natural o descrita y la secuencia mutante es preferiblemente mayor
del 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o más) que se
calcula tal como se ha descrito anteriormente. Tal como se usa en
el presente documento, una "variante alélica" de una molécula o
región de ácido nucleico, para cuya secuencia de ácido nucleico se
proporciona en el presente documento, es una molécula, o región de
ácido nucleico, que se produce esencialmente en el mismo locus en
el genoma de otro o segundo aislado, y que, debido a la variación
natural producida por, por ejemplo, mutación o recombinación, tiene
una secuencia de ácido nucleico similar, pero no idéntica. Una
variante alélica de la región de codificación codifica normalmente
una proteína que tiene actividad similar a la de la proteína
codificada por el gen al cual se está comparando. Una variante
alélica puede comprender también una alteración en las regiones 5' o
3' no traducidas del gen. Tal como en las regiones de control
regulador (véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos
5.753.235).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de
polipéptidos compuestos por al menos un emplazamiento de
combinación del anticuerpo. Un "emplazamiento de combinación del
anticuerpo" es un espacio de unión tridimensional con una forma
de superficie interna y una distribución de carga complementarias
de las características de un epitopo de un antígeno, que permite una
unión del anticuerpo con el antígeno. "Anticuerpo" incluye,
por ejemplo, anticuerpos de vertebrados, anticuerpos híbridos,
anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos
alterados, anticuerpos univalentes, proteínas Fab, y anticuerpos de
región única.
Los anticuerpos frente a las proteínas de la
invención son útiles para la cromatografía de afinidad,
inmunoensayos, y la distinción/identificación de las proteínas MenB
de Neisseria. Los anticuerpos estimulados frente a las
proteínas de la presente invención se unen a los polipéptidos o
proteínas antigénicas o fragmentos de proteínas que están presentes
y asociados específicamente alas cepas de MenB de Neisseria
meningitidis. En algunos ejemplos se pueden asociar estos
antígenos con cepas específicas, tales como aquellos antígenos
específicos para las cepas MenB. Se pueden inmovilizar los
anticuerpos de la invención en una matriz y utilizarse en un
inmunoensayo o en una columna de cromatografía de afinidad para
permitir la detección y/o separación de los polipéptidos, proteínas
o fragmentos de proteínas o células que comprenden dichos
polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas.
Alternativamente, se pueden inmovilizar dichos polipéptidos,
proteínas o fragmentos de proteínas con el fin de detectar los
anticuerpos que se pueden unir específicamente con los
anteriores.
Los anticuerpos de las proteínas de la
invención, tanto policlonales como monoclonales, se pueden preparar
mediante procedimientos convencionales. En general, la proteína se
usa en primer lugar para inmunizar un animal adecuado,
preferiblemente un ratón, rata, conejo o cabra. Se prefieren los
conejos y cabras para la preparación de sueros policlonales debido
al volumen de suero que se puede obtener, y la disponibilidad de
anticuerpos anti-conejo y
anti-cabra marcados. La inmunización se lleva a cabo
generalmente mezclando o emulsionando la proteína en solución
salina, preferiblemente en un adyuvante tal como el adyuvante
completo de Freund, e inyectando la mezcla o emulsión
parenteralmente (generalmente por vía subcutánea o intramuscular).
Una dosis de 50-200 \mug/inyección es normalmente
suficiente. La inmunización se estimula generalmente
2-6 semanas después con una o más inyecciones de la
proteína en solución salina, usando preferiblemente adyuvante
incompleto de Freund. Se pueden generar alternativamente
anticuerpos mediante inmunización in vitro usando
procedimientos conocidos en la técnica, que, para los objetivos de
esta invención se consideran equivalentes a la inmunización in
vivo. Los antisueros policlonales se obtienen extrayendo sangre
del animal inmunizado en un contenedor de vidrio o plástico,
incubando la sangre a 25ºC durante una hora, seguido por la
incubación a 4ºC durante 2-18 horas. El suero se
recupera mediante centrifugación (por ejemplo, 1.000 g durante 10
minutos). Se pueden obtener de conejos aproximadamente
20-50 ml por extracción de sangre.
Se preparan anticuerpos monoclonales usando el
procedimiento estándar de Koheler y Milstein (1975) 256:
495-96), o una modificación del mismo. Normalmente,
se inmuniza un ratón o rata tal como se ha descrito anteriormente.
Sin embargo, en lugar de extraer sangre del animal para extraer el
suero, se retira el bazo (y opcionalmente algunos nódulos
linfáticos grandes) y se disocian en células únicas. Si se desea, se
pueden seleccionar las células de bazo (tras la eliminación de las
células no específicamente adherentes) aplicando una suspensión
celular a una placa o pocillo recubierto con el antígeno de la
proteína. Las células B que expresan la inmunoglobulina unida a
membrana específica para el antígeno se unen a la placa, y no se
eliminan por lavado con el resto de la suspensión. Las células B
resultantes, o todas las células de bazo disociadas, se inducen a
continuación a fusionarse con células de mieloma para formar
hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, medio
de hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Los hibridomas
resultantes se plaquean mediante dilución limitante, y se evalúan
para la producción de anticuerpos que se unen específicamente al
antígeno inmunizante (y que no se unen a los antígenos no
relacionados). Los hibridomas que segregan el MAb seleccionado se
cultivan a continuación tanto in vitro (por ejemplo, en
botellas de cultivo de tejidos o reactores de fibra hueca), como
in vivo (como ascites en ratones).
Si se desea, se pueden marcar los anticuerpos
(tanto policlonales como monoclonales) usando las técnicas
convencionales. Las marcas adecuadas incluyen fluoróforos,
cromóforos, átomos radioactivos (concretamente ^{32}P y
^{125}I), reactivos densos en electrones, enzimas, y ligandos que
tienen parejas de unión específicas. Los enzimas se detectan
normalmente por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano
picante se detecta normalmente por su capacidad para convertir
3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) en un pigmento
azul, cuantificable con un espectrofotómetro. "pareja de unión
específica" se refiere a una proteína capaz de unirse a una
molécula ligando con una especificidad elevada, tal como por
ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal
específico del anterior. Otras parejas de unión específica incluyen
biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y numerosos
pares receptor-ligando conocidos en la técnica.
Debería entenderse que en la anterior descripción no se pretende
clasificar las diversas marcas en clases distintas, así como que la
misma marca puede servir de diversos modos diferentes. Por ejemplo,
^{125}I puede servir como marca radioactiva o como reactivo denso
en electrones. HRP puede servir como enzima o como antígeno para un
MAb. Además, se pueden combinar diversas marcas para el efecto
deseado. Por ejemplo, los MAb y la avidina requieren también marcas
en la práctica de esta invención: de esta manera, se puede marcar un
MAb con biotina, y detectar su presencia con avidina marcada con
^{125}I, o con una antibiotina MAb marcada con HRP. Otras
permutaciones y posibilidades serán fácilmente aparentes para
aquellas personas normalmente expertas en la técnica, y se
consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente
invención.
Los antígenos, inmunógenos, polipéptidos,
proteínas o fragmentos de proteínas de la presente invención
estimulan la formación de anticuerpos con pareja de unión
específica. Estos antígenos, inmunógenos, polipéptidos, proteínas o
fragmentos de proteínas de la presente invención comprenden
composiciones inmunógenas de la presente invención. Dichas
composiciones inmunógenas pueden comprender o incluir además
adyuvantes, vehículos, u otras composiciones que promueven o
potencian o estabilizan los antígenos, polipéptidos, proteínas o
fragmentos de proteínas de la presente invención. Dichos adyuvantes
y vehículos serán fácilmente aparentes para aquellas personas
normalmente expertas en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir
cualesquiera de los polipéptidos, anticuerpos, o ácidos nucleicos
de la descripción. Las composiciones farmacéuticas comprenderán una
cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los polipéptidos,
anticuerpos, o polinucleótidos de la invención desvelada.
El término "cantidad terapéuticamente
eficaz" tal como se usa en el presente documento se refiere a una
cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar, o evitar
una enfermedad o dolencia deseada, o para presentar un efecto
terapéutico o preventivo detectable. El efecto se puede detectar
mediante, por ejemplo, marcadores químicos o niveles de antígeno.
Los efectos terapéuticos también incluyen la reducción de los
síntomas físicos, tales como la disminución de la temperatura
corporal, cuando se proporcionan a un paciente que tiene fiebre. La
cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del tamaño y la
salud del sujeto, la naturaleza y extensión de la dolencia, y de
los compuestos terapéuticos o combinación de compuestos terapéuticos
seleccionados para la administración. De esta manera, no es útil
especificar una cantidad eficaz exacta por adelantado. Sin embargo,
se puede determinar la cantidad eficaz para una situación dada
mediante experimentación rutinaria y está dentro del juicio del
médico.
Para los objetivos de la presente descripción,
una dosis eficaz estará entre aproximadamente 0,01 mg/kg y 50 mg/kg
o 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de los constructos de ADN en
el individuo al cual se administra.
Una composición farmacéutica puede contener
también un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término
"vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un
vehículo para la administración de un agente terapéutico, tal como
anticuerpos o un polipéptido, genes, y otros agentes terapéuticos.
El término se refiere a cualquier vehículo farmacéutico que no
induce por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para
el individuo que recibe la composición, y que se pueden administrar
sin toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden ser
macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tales como
proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos
poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos,
y partículas de virus inactivos. Dichos vehículos son bien
conocidos por aquellas personas normalmente expertas en la
técnica.
Se pueden usar sales farmacéuticamente
aceptables en el presente documento, por ejemplo, sales de ácido
mineral tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos,
y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos,
propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. Está disponible una
descripción completa de los excipientes farmacéuticamente
aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.
J. 1991).
Los vehículos farmacéuticamente aceptables en
las composiciones terapéuticas pueden contener líquidos como agua,
solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, sustancias
auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes,
sustancias tamponantes del pH, y similares, pueden estar presentes
en dichos vehículos. Normalmente, las composiciones terapéuticas se
preparan como inyectables, cualquiera como en soluciones o
suspensiones líquidas; se pueden preparar también formas sólidas
adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos
antes de la inyección. Se incluyen liposomas dentro de la definición
de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una vez formuladas, las composiciones de la
descripción se pueden administrar directamente al sujeto. Los
sujetos que se van a tratar pueden ser animales; en concreto, se van
a tratar seres humanos.
La administración directa de las composiciones
se llevará a cabo generalmente mediante inyección, cualquiera de
subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, o intramuscular o
administrarse en el espacio intersticial de un tejido. Se pueden
administrar también las composiciones en una lesión. Otros modos de
administración incluyen la administración oral y pulmonar,
supositorios, y aplicaciones transdérmicas y transcutáneas, agujas,
y cañones de genes o hipopulverizaciones. El tratamiento de
dosificación puede ser una pauta de dosis única o una pauta de
dosis múltiples.
Las vacunas de acuerdo con la descripción pueden
ser tanto profilácticas (es decir, para evitar la infección) como
terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad después de la
infección).
Dichas vacunas comprenden el(los)
antígeno(s) o inmunógeno(s) inmunizantes, el
polipéptido inmunógeno, la(s) proteína(s) o
fragmentos de proteínas, o los ácidos nucleicos (por ejemplo, ácido
ribonucleico o ácido desoxirribonucleico), normalmente en
combinación con "vehículos farmacéuticamente aceptables" que
incluyen cualquier vehículo que no induce por sí mismo la
producción de anticuerpos perjudiciales en el individuo que recibe
la composición. Los vehículos adecuados son normalmente
macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tales como
proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos
poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos,
agregados lípidos (tales como gotitas de aceite o liposomas), o
partículas de virus inactivos. Dichos vehículos son bien conocidos
por aquellas personas normalmente expertas en la técnica.
Adicionalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes
inmunoestimulantes ("adyuvantes"). Además, se puede conjugar el
inmunógeno o antígeno con un toxoide bacteriano, tal como un
toxoide de difteria, tétanos, cólera, H. pylori, etc.,
patógenos.
Los adyuvantes preferidos para potenciar la
efectividad de la composición incluyen, pero no se limitan a: (1)
sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato
de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de
emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes
inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo
(véase a continuación) o componentes de pared celular bacteriana),
tales como por ejemplo (a) MF59 (Publ. PCT Nº WO 90/14837), que
contiene escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, y Span 85 al 0,5%)
conteniendo opcionalmente diversas cantidades de
MTP-PE (véase a continuación), aunque no se
requiere), formulado en partículas submicrométricas usando un
microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y
(Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, conteniendo escualeno al 10%,
Tween 80 al 0,4%, polímero L121 bloqueado con plurónico al 5%, y
thr-MDP (véase a continuación) tanto microfluidizado
en emulsión submicrométrica como sometido a vortización para
generar una emulsión de tamaño de partícula más grande, y (c) el
sistema de adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton,
MT) conteniendo escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2%, y uno o más
componentes de pared celular bacteriana del grupo constituido por
monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y
esqueleto de pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS
(Detox^{TM}); (3) se pueden usar adyuvantes de la saponina, tales
como Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o
partículas generadas a partir del anterior tales como los ISCOM
(complejos inmunoestimulantes); (4) Adyuvante de Freund completo
(CFA) y adyuvante de Freund incompleto (IFA); (5) citoquinas, tales
como interleucinas (por ejemplo, IL-1,
IL-2, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-12,
etc.), interferones (por ejemplo, gamma interferón), factor
estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF),
factor de necrosis tumoral (TNF), etc; (6) mutantes detoxificados
de toxina ribosilante de ADP bacteriano tal como toxina del cólera
(CT) una toxina pertussis (PT), o una toxina de E. coli lábil al
calor (LT), concretamente LT-K63,
LT-R72, CT-S109,
PT-K9/G129; véanse, por ejemplo, los documentos WO
93/13302 y WO 92/19265; y (7) otras sustancias que actúan como
agentes inmunoestimulantes para potenciar la efectividad de la
composición. Se prefieren alum y MF59.
Tal como se ha mencionado anteriormente, los
péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a,
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina
(thr-MDP),
N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina
(nor-MDP),
N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina
(MTP-PE), etc.
Las composiciones de vacuna que comprenden
composiciones inmunógenas (por ejemplo, que pueden incluir el
antígeno, el vehículo farmacéuticamente aceptable, y el adyuvante)
contendrán normalmente diluyentes, tales como agua, solución
salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, pueden estar
presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares, tales como
agentes humectantes o emulsificantes, sustancias tamponantes del pH,
y similares. Alternativamente, las composiciones de vacuna que
comprenden composiciones inmunógenas pueden comprender un antígeno,
polipéptido, proteína, fragmento de proteína o ácido nucleico en un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Más específicamente, las vacunas que comprenden
composiciones inmunógenas comprenden una cantidad inmunológicamente
eficaz de los polipéptidos inmunógenos, así como cualquier otro de
los componentes anteriormente mencionados, según se necesite. Por
"cantidad inmunológicamente eficaz", se entiende que la
administración de la cantidad en un individuo, tanto en una dosis
única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la
prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición
física del individuo que se va a tratar, el grupo taxonómico del
individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano,
primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para
sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la
formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por
parte del doctor que dirige el tratamiento, y otros factores
relevantes. Se espera que la cantidad
esté comprendida en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos rutinarios.
esté comprendida en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos rutinarios.
Normalmente, las composiciones de vacuna o
composiciones inmunógenas se preparan como inyectables, bien como
soluciones o suspensiones líquidas; se pueden preparar también
formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en,
vehículos líquidos antes de la inyección. Se puede emulsionar o
encapsular también la preparación en liposomas para potenciar el
efecto adyuvante, tal como se ha descrito anteriormente para los
vehículos farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones inmunógenas se administran
convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, mediante
inyección, tanto subcutánea como intramuscularmente. Las
formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de
administración incluyen formulaciones orales y pulmonares,
supositorios, y aplicaciones transdérmicas y transcutáneas. El
tratamiento de dosificación puede ser una pauta de dosis única o una
pauta de dosis múltiples. Se puede administrar la vacuna en
conjunción con otros agentes inmunoreguladores.
Como alternativa a las vacunas basadas en
proteínas, se puede emplear la vacunación de ADN (por ejemplo,
Robinson y Torres (1997) Seminars in Immunology 9:
271-283; Donnelly y col. (1997) Annu Rev Immunol 15:
617-648).
Se puede administrar terapia génica, vehículos
para la administración de constructos, que incluyen una secuencia
de codificación de un compuesto terapéutico de la descripción, que
se va a administrar al mamífero para la expresión en el mamífero,
tanto local como sistémicamente, Estos constructos pueden utilizar
soluciones de vectores víricos o no víricos en modalidad in
vivo o ex vivo. Se puede inducir la expresión de dicha
secuencia de codificación usando promotores endógenos de mamíferos o
heterólogos. La expresión de la secuencia de codificación in
vivo puede ser tanto constitutiva como regulada.
Esta descripción incluye vehículos de
administración de genes capaces de expresar las secuencias de ácidos
nucleicos contempladas.
El vehículo de administración del gen es
preferiblemente un vector vírico y, más preferiblemente, un vector
retrovírico, adenovírico, vírico adenoasociado (AAV), herpesvírico,
o alfavírico. El vector vírico puede ser también un astrovirus,
coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, para mixovirus, parvovirus,
picornavirus, poxvirus, o vector vírico de togavirus. Véase en
general, Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1: 51-64;
Kimura (1994) Human Gene Therapy 5: 845-852;
Connelly (1995) Human Gene Therapy 6: 185-193; y
Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153.
Se conocen bien en la técnica los vectores
retrovíricos, que incluyen los retrovirus de tipo B, C y D, los
retrovirus xenotrópicos (por ejemplo, NZB-X1,
NZB-X2 y NZB9-1 (véase O'Neill
(1985) J. Virol. 53: 160), los retrovirus politrópicos, por
ejemplo, MCF y MCF-MLV (véase Kelly 81983) J. Virol,
45: 291), los espumavirus y los lentivirus. Véase RNA Tumor
Viruses, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.
Se pueden derivar porciones del vector de
terapia génica retrovírico a partir de diferentes retrovirus. Por
ejemplo, se pueden derivar los retrovectores LTR a partir del Virus
de Sarcoma Murino, un emplazamiento de unión al ARNt del Virus del
Sarcoma de Rous, una señal empaquetada de un Virus de Leucemia
Murino, y un origen de síntesis de segunda cepa de un Virus de
Leucosis Aviaria.
Se pueden usar estos vectores retrovíricos
recombinantes para generar la transducción competente de las
partículas de vector retrovírico introduciéndolas en líneas
celulares de empaquetado apropiado (véase la patente de los Estados
Unidos 5.591.624). Se pueden construir vectores retrovíricos para la
integración específica del emplazamiento en el ADN de la célula
huésped mediante la incorporación de un enzima integrasa quimérico
en la partícula retrovírica (véase documento WO 96/37626). Es
preferible que el vector vírico recombinante sea un virus
recombinante defectivo de la replicación.
Se conocen bien en la técnica las líneas
celulares empaquetadas adecuadas para el uso con los vectores
retrovíricos anteriormente descritos, se preparan fácilmente (véase
documentos WO95/30763 y WO92/05266), y se pueden usar para crear
líneas celulares productoras (denominadas también líneas celulares
de vectores o "VCL") para la producción de partículas de
vectores recombinantes. Preferiblemente, las líneas celulares
empaquetadas se preparan a partir de células parentales humanas
(por ejemplo, células HT1080) o líneas parentales de visón, que
eliminan la inactivación en suero humano.
Los retrovirus preferidos para la construcción
de vectores retrovíricos de terapia génica incluyen el Virus de la
Leucosis Aviaria, el Virus de la Leucemia Bovina, el Virus de la
Leucemia Murina, El Virus que induce el Foco Celular de Visón, el
Virus del Sarcoma Murino, el Virus de la Reticuloendoteliosis y el
Virus del Sarcoma de Rous. Los Virus de la Leucemia Murina
particularmente preferidos incluyen 4070A y 1504A (Hartley y Rowe
(1976) J Virol 19: 19-25), Abelson (ATCC Nº.
VR-999), Friend (ATCC Nº. VR-245),
Graffi, Gross (ATCC Nº VR-590), Kirsten, Virus del
Sarcoma de Harvey y Rauscher (ATCC Nº. VR-998) y el
Virus de la Leucemia Murina de Moloney (ATCC Nº.
VR-190). Se pueden obtener dichos retrovirus a
partir de depositarios o colecciones tales como la American Type
Culture Collection ("ATCC") en Rockville, Maryland o aislarse
de Fuentes conocidas usando las técnicas comúnmente
disponibles.
Los vectores retrovíricos de terapia génica
ejemplares conocidos que se pueden usar en esta descripción incluyen
aquellos descritos en las solicitudes de patente GB2200651,
EP0415731, EP0345242, EP0334301, WO89/02468; WO89/05349,
WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, WO93/25698,
WO93/25234, WO93/11230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825,
WO95/07994, US 5.219.740, US 4.405.712, US 4.861.719, US 4.980.289,
US 4.777.127, US 5.591.624. Véanse también Vile (1993) Cancer Res
53: 3860-3864; Vile (1993) Cancer Res 53:
962-967; Ram (1993) Cancer Res 53 (1993)
83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:
493-503; Baba (1993) J Neurosurg 79:
729-735; Mann (1983) Cell 33: 153; Cane (1984) Proc
Natl Acad Sci 81: 6349; y Miller (1990) Human Gene Therapy 1.
Se conocen también en la técnica y se pueden
usar en esta descripción vectores adenovíricos humanos de terapia
génica. Véanse, por ejemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6: 616 y
Rosenfeld (1991) Science 252: 431, y los documentos WO93/07283,
WO93/06223, y WO93/07282. Los vectores adenovíricos de terapia
génica conocidos a modo de ejemplo se pueden usar en esta
descripción incluyen aquellos descritos en los documentos
anteriormente referenciados y en los documentos WO94/12649,
WO93/03769, WO93/19191, WO94/28938, WO95/11984 WO95/00655
WO95/27071, WO95/29993, WO95/34671, WO96/05320, WO94/08026,
WO94/11506, WO93/06223, WO94/24299, WO95/14102, WO95/24297,
WO95/02697, WO94/2815, WO94/24299, WO95/09241, WO95/25807,
WO95/05835, WO94/18922 y WO95/09654. Alternativamente, se puede
emplear la administración de ADN unido a adenovirus muerto según se
describe en Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:
147-154. Los vehículos de administración de genes de
la descripción incluyen también vectores víricos asociados a
adenovirus (AAV). Los ejemplos principales y preferidos de dichos
vectores para uso en esta invención son los vectores basados en
AAV-2 descritos en Srivastava, documento WO93/09239.
Los vectores AAV más preferidos comprenden las dos repeticiones
terminales invertidas AAV en las que las secuencias D naturales
están modificadas mediante la sustitución de los nucleótidos, de tal
manera que al menos 5 nucleótidos naturales y hasta 18 nucleótidos
naturales, preferiblemente al menos 10 nucleótidos naturales hasta
18 nucleótidos naturales, más preferiblemente 10 nucleótidos
naturales están retenidos y los nucleótidos restantes de la
secuencia D se eliminan o sustituyen con nucleótidos no naturales.
Las secuencias D naturales de las repeticiones terminales
invertidas AAV son secuencias de 20 nucleótidos consecutivos en cada
repetición terminal invertida AAV (es decir, existe una secuencia
en cada extremo) que no están implicadas en la formación de HP. El
nucleótido de sustitución no natural puede ser cualquier nucleótido
diferente del nucleótido que se encuentra en la secuencia D natural
en la misma posición. Otros vectores AAV a modo de ejemplo se pueden
usar son pWP-19, pWN-1, los cuales
se describen en Nahreini (1993) Gene 124: 257-262.
Otro ejemplo de dicho vector AAV es psub201 (véase Samulski (1987)
J. virol. 61: 3096). Otro vector AAV a modo de ejemplo es el vector
ITR Doble D. Se describe la construcción del vector ITR Doble D en
la Patente de los Estados Unidos 5.478.745. Otros vectores
adicionales son aquellos descritos por Carter en la Patente de los
Estados Unidos 4.797.368 y Muzyczka en la Patente de los Estados
Unidos 5.139.941, por Chartejee en la Patente de los Estados Unidos
5.474.935, y por Kotin en el documento WO94/288157. Un ejemplo
adicional más de un vector AAV que se puede usar en esta invención
es SSV9AFABTKneo, que contiene el potenciador AFP y el promotor de
la albúmina y dirige la expresión predominantemente en el hígado.
Se describen su estructura y construcción en Su (1996) Human Gene
Therapy 7: 463-470. Se describen vectores AAV de
terapia génica adicionales en los documentos US 5.354.678, US
5.173.414, US 5.139.941, y US 5.252.479.
Los vectores de terapia génica que comprenden
las secuencias de la descripción incluyen los vectores del herpes.
Los vectores principales y preferidos son los vectores del virus del
herpes simple que contienen una secuencia que codifica un
polipéptido de la timidina quinasa tal como aquellos descritos en
los documentos US 5.288.641 y EP0176170 (Roizman). Los vectores del
virus del herpes simple a modo de ejemplo adicional incluyen
HFEM/ICP6-LacZ descrito en el documento WO95/04139
(Wistar Institute), pHSVlac descrito en Geller (1998) Science 241:
1667-1669 y en los documentos WO90/09441 y
WO92/07945, Us3::pgC-lacZ descrito en Fink (1992)
Human Gene Therapy 3: 11-19 y HSV 7134, 2 RH 105 y
GAL4 descrito en el documento EP 0453242 (Breakefield), y aquellos
depositados con la ATCC con números de acceso ATCC
VR-977 y ATCC VR-260.
También se contemplan los vectores de terapia
génica del virus alfa que se pueden emplear en esta descripción.
Los vectores del virus alfa preferidos son los vectores de los virus
Sindbis. Los togavirus, el virus del bosque Semliki (ATCC
VR-67; ATCC VR-1247), el virus
Middleberg (ATCC VR-370, el virus Ross River (ATCC
VR-373; ATCC VR-1246), el virus de
la encefalitis equina de Venezuela (ATCC VR293; ATCC
VR-1250; ATCC VR-1249, ATCC
VR-532), y aquellos descritos en las patentes de los
Estados Unidos 5.091.309, 5.217.879 y el documento WO92/10578. Más
concretamente, se pueden usar aquellos vectores del virus alfa
descritos en el documento de los Estados Unidos con nº de serie
08/405.627, presentado el 15 de Marzo de 1995, y en los documentos
WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, US 5.091.309 y US 5.217.879. Se
pueden obtener dichos virus alfa de los depositarios o colecciones
tales como la ATCC en Rockville, Maryland o aislarse de fuentes
conocidas usando las técnicas comúnmente disponibles.
Preferiblemente, se usan los vectores del Alfavirus con
citotoxicidad reducida (véase documento USSN 08/679640).
Los sistemas de vectores de ADN tales como los
sistemas de expresión eucariota en capas son también útiles para
expresar los ácidos nucleicos de la descripción. Véase el documento
WO95/07994 para una descripción detallada de los sistemas de
expresión eucariota en capas. Preferiblemente los sistemas de
expresión eucariota en capas de la descripción se derivan de los
vectores de Alfavirus y más preferiblemente de los vectores víricos
del los virus Sindbis.
Otros vectores víricos adecuados para el uso en
la presente descripción incluyen aquellos derivados de los
poliovirus, por ejemplo ATCC VR-58 y aquellos
descritos en Evans, Nature 339 (1989) 385 y Sabin (1973) J. Biol.
Standardization 1: 115; los rinovirus, por ejemplo ATCC
VR-1110 y aquellos descritos en Arnold (1990) J.
Cell Biochem L401; los virus de la viruela tales como los virus de
la viruela de los canarios o el virus vaccinia, por ejemplo ATCC
VR-111 y ATCC VR-2010 y aquellos
descritos en Fisher-Hoch 81989) Proc Natl Acad Sci
86: 317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569: 86, Flexner (1990)
Vaccine 8: 17; en los documentos US 4.603.112 y US. 4.769.330 y
WO89/01973; el virus SV40, por ejemplo ATCC VR-305 y
aquellos descritos en Mulligan (1979) Nature 277: 108 y Madzak
81992) J Gen Virol 73: 1533; el virus de la gripe, por ejemplo ATCC
VR-797 y los virus recombinantes de la gripe
preparados empleando técnicas genéticas inversas tal como se
describe en el documento US 5.166.057 y en Enami (1990) Proc Natl
Acad Sci 87: 3802-3805; Enami y Palese (1991) J
Virol 65: 2711-26713 y Luytjes (1989) Cell 59: 110,
(véase también McMichael (1983) NEJ Med 309: 13, y Yap (1978) Nature
273: 238 y Nature (1979) 277: 108); el virus de la
inmunodeficiencia humana tal como se describe en el documento
EP-0386882 y en Buchschacher (1992) J. Virol. 66:
2731; el virus de la varicela, por ejemplo ATCC
VR-67 y VR-1247 y aquellos
descritos en el documento EP-0440219; el virus Aura,
por ejemplo ATCC VR-368; el virus Bebaru, por
ejemplo ATCC VR-600 y ATCC VR-1240;
el virus Cabassou, por ejemplo ATCC VR-922; el virus
Chikungunya, por ejemplo ATCC VR-64 y ATCC
VR-1241; el Virus Fort Morgan, por ejemplo ATCC
VR-924; el virus Getah, por ejemplo ATCC
VR-369 y ATCC VR-1243; el virus
Kyzylagach, por ejemplo ATCC VR-927; el virus
Mayaro, por ejemplo ATCC VR-66; el virus Mucambo,
por ejemplo ATCC VR-580 y ATCC
VR-1244; el virus Ndumu, por ejemplo ATCC
VR-371; el virus Pixuna, por ejemplo ATCC
VR-372 y ATCC VR-1245; el virus
Tonate, por ejemplo ATCC VR-925; el virus Triniti,
por ejemplo ATCC VR-469; el virus Una, por ejemplo
ATCC VR-374; el virus Whataroa, por ejemplo ATCC
VR-926; el virus
Y-62-33, por ejemplo ATCC
VR-375; el virus O'Nyong, el virus de la encefalitis
oriental, por ejemplo ATCC VR-65 y ATCC
VR-1242; el virus de la encefalitis occidental, por
ejemplo ATCC VR-70, ATCC VR-1251,
ATCC VR-622 y ATCC VR-1252; y los
coronavirus, por ejemplo ATCC VR-740 y aquellos
descritos en Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121:190.
La administración de las composiciones de esta
descripción en células no se limita a los vectores víricos
anteriormente mencionados. Se pueden emplear otros procedimientos y
medios de administración tales como, por ejemplo, vectores de
expresión de ácidos nucleicos, ADN condensado policatiónico unido o
no unido sólo a adenovirus muerto, por ejemplo, véanse el documento
de los Estados Unidos con nº de Serie 08/366.787, presentado el 30
de Diciembre de 1994 y Curiel (1992) Hum Gen Ther 3:
147-154 ligando unido al ADN, por ejemplo véanse Wu
(1989) J Biol Chem 264:16985-16987, células
eucariotas, células como vehículo de administración, por ejemplo
véanse el documento de los Estados Unidos con Nº de Serie
08/240.030, presentado el 9 de mayo de 1994, y el documento de los
Estados Unidos con nº de Serie 08/404.796, deposición de materiales
de hidrogel fotopolimerizado, y pistola de partículas de
transferencia de genes controlada manualmente, tal como se describe
en la patente de los Estados Unidos 5.149.655, radiación ionizante
tal como se describe en los documentos US 5.206.152 y WO92/11033,
neutralización o fusión de la carga nucleica con membranas
celulares. Se describen soluciones adicionales en Philip (1994) Mol
Cell Biol 14: 2411-2418 y en Woffendin (1994) Proc
Natl Acad Sci 91: 1581-1585.
Se puede emplear la transferencia de genes
mediada por partículas, véase, por ejemplo, el documento de los
Estados Unidos con Nº de Serie 60/023.867. De manera breve, se puede
insertar la secuencia en vectores convencionales que contienen
secuencias control convencionales para la expresión de un nivel
elevado, y a continuación incubarse con moléculas sintéticas de
transferencia de genes tales como cationes de unión al ADN
polimérico similares a la polilisina, protamina, y albúmina, unidos
a ligandos dirigidos a células tales como asialoorosomucoide, tal
como se describe en Wu y Wu (1987) J. Biol. Chem. 262;
4429-4432, insulina, tal como se describe en Hucked
(1990) Biochem Pharmacol 40: 253-263, galactosa, tal
como se describe en Plank (1992) Bioconjugate Chem 3:
533-539, lactosa o transferrina.
\newpage
Se puede emplear también ADN desnudo para
transformar una célula huésped. Se describen los procedimientos de
introducción de ADN desnudo a modo de ejemplo en los documentos WO
90/11092 y US 5.580.859. Se puede mejorar la eficiencia de
captación usando perlas de látex biodegradable. Los ADN recubiertos
con perlas de látex son eficientemente transportados en las células
después del inicio de la endocitosis por las perlas. Se puede
mejorar el procedimiento mediante el tratamiento de las perlas para
aumentar la hidrofobia y facilitar por tanto la perturbación del
endosoma y la liberación del ADN en el citoplasma.
Se describen en los documentos US. 5.422.120,
WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 y EP-524.968 los
liposomas que pueden actuar como vehículos de administración de
genes. Tal como se describe en el documento USSN. 60/023.867, sobre
la administración no vírica, se pueden insertar las secuencias de
ácidos nucleicos que codifican un polipéptido en vectores
convencionales que contienen secuencias control convencionales para
expresión de alto nivel, y a continuación incubarse con moléculas
de transferencia de genes sintéticos tales como cationes de unión
al ADN polimérico similares a polilisina, protamina, y albúmina,
unidos a ligandos dirigidos a células tales como
asialoorosomucoide, insulina, galactosa, lactosa, o transferrina.
Otros sistemas de administración incluyen el uso de liposomas para
encapsular el ADN que comprenden el gen bajo el control de una
variedad de promotores específicos del tejido o ubicuamente
activos. Además, la administración no vírica adecuada para el uso
incluye sistemas de administración mecánica tales como la solución
descrita en Woffendin y col (1994) Proc. Natl. Acad Sci EEUU
91(24): 11581-11585. Además, se pueden
administrar la secuencia de codificación y el producto de expresión
de los anteriores mediante la deposición de materiales de hidrogel
fotopolimerizado. Otros procedimientos convencionales para la
administración de genes que se pueden usar para la administración
de la secuencia de codificación incluyen, por ejemplo, el uso de
pistola de partículas de transferencia de genes controlada
manualmente, tal como se describe en el documento U.S. 5.149.655;
uso de radiación ionizante para activar el gen transferido, tal
como se describe en los documentos U.S. 5.206.152 y WO92/11033.
Los vehículos de administración de genes
policatiónicos y liposomas a modo de ejemplo son aquellos descritos
en los documentos US 5.422.120 y 4.762.915; en los documentos WO
95/13796; WO94/23697; y WO91/14445; en el documento
EP-0524968; y en Stryer, Biochemistry, páginas
236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka
(1980) Biochem Biophys Acta 600: 1; Bayer (1979) Biochem Biophys
Acta 550: 464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149: 119; Wang (1987)
Proc Natl Acad Sci 84: 7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.
Una composición de polinucleótidos puede
comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un vehículo de
terapia génica, según se define el término anteriormente. Para los
objetivos de la presente descripción, una dosis eficaz estará entre
aproximadamente 0,01 mg/kg y 50 mg/kg o 0,05 mg/kg a aproximadamente
10 mg/kg de los constructos de ADN en el individuo al cual se va a
administrar.
Una vez formuladas, las composiciones de
polinucleótidos de la descripción se pueden administrar (1)
directamente al sujeto; (2) administrarse ex vivo, a las
células derivadas procedentes del sujeto, o (3) in vitro
para la expresión de proteínas recombinantes. Los sujetos que se van
a tratar pueden ser mamíferos o pájaros. También, se pueden tratar
sujetos humanos.
La administración directa de las composiciones
se llevará a cabo generalmente mediante inyección, cualquiera de
por vía subcutánea, intraperitoneal, transdérmica, o transcutánea,
intravenosa o intramuscular o administrarse en el espacio
intersticial de un tejido. Se pueden administrar también las
composiciones en un tumor o lesión. Otros modos de administración
incluyen la administración oral y pulmonar, supositorios, y
aplicaciones transdérmicas, agujas, y cañones de genes o
hipopulverizadores. La dosificación de tratamiento puede ser una
pauta de dosis única o una pauta de dosis múltiple. Véase documento
WO98/20734.
Se conocen en la técnica procedimientos para la
administración y reimplante ex vivo de las células
transformadas en un sujeto y se describen en, por ejemplo, el
documento WO93/14778. Los ejemplos de células útiles en aplicaciones
ex vivo incluyen, por ejemplo, células madre, concretamente
hematopoyéticas, células linfoides, macrófagos, células
dendríticas, o células tumorales.
Generalmente, se puede llevar a cabo la
administración de ácidos nucleicos para aplicaciones ex vivo
e in vitro mediante los siguientes procedimientos, por
ejemplo, transfección mediada con dextrano, precipitación con
fosfato de calcio, transfección mediada con polibreno, fusión de
protoplastos, electroporación, encapsulación del(de los)
polinucleótido(s) en liposomas, y microinyección directa del
ADN en los núcleos, todos bien conocidos en la técnica.
Además de los vehículos y sales
farmacéuticamente aceptables descritos anteriormente, se pueden usar
los siguientes agentes adicionales con las composiciones de
polinucleótidos y/o polipéptidos.
Un ejemplo son los polipéptidos que incluyen,
sin limitación: asialoorosomucoide (ASOR); transferrina;
asialoglicoproteínas; anticuerpos; fragmentos de anticuerpos;
ferritina; interleucinas; interferones, granulocitos, factor
estimulante de las colonias de macrófagos (GM-CSF),
factor estimulante de las colonias de granulocitos
(G-CSF), factor estimulante de las colonias de
macrófagos (M-CSF), factor de células madre y
eritropoyetina. Se pueden usar también antígenos víricos, tales
como las proteínas de la envuelta. También las proteínas de otros
organismos invasivos, tales como el péptido de 17 aminoácidos
procedente de la proteína del circumsporozoito de plasmodium
falciparum conocido como RII.
Otros grupos que se pueden incluir en una
composición farmacéutica incluyen, por ejemplo: hormonas,
esteroides, andrógenos, estrógenos, hormona tiroidea, o vitaminas,
ácido fólico.
También, se puede incluir polialquilenglicol en
composiciones farmacéuticas con los polinucleótidos y/o polipéptidos
deseados. En una forma de realización preferida, el
polialquilenglicol es polietilenglicol. Además, se pueden incluir
mono, di, o polisacáridos. En una forma de realización preferida de
este aspecto, el polisacárido es dextrano o
DEAE-dextrano. También, se pueden incluir quitosano
y poli(láctido-co-glicólido)
en una composición farmacéutica.
Se puede también encapsular el polinucleótido o
polipéptido deseado en lípidos o empaquetarse en liposomas antes de
la administración al sujeto o a las células derivadas del
anterior.
La encapsulación en lípidos se lleva a cabo
generalmente usando liposomas que son capaces de unir o atrapar
establemente y retener el ácido nucleico o polipéptido. La relación
de polinucleótido condensado a la preparación de lípido puede
variar pero generalmente estará alrededor de 1:1 (mg de ADN:
micromoles de lípidos), o más de lípido. Para una revisión del uso
de liposomas como vehículos para la administración de ácidos
nucleicos, véanse Hug y Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta.
1097: 1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:
512-527.
Las preparaciones liposómicas para uso en la
presente descripción incluyen preparaciones catiónicas (cargadas
positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras: Se ha
demostrado que los liposomas catiónicos median la administración
intracelular de ADN plásmido (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.
EEUU 84: 7413-7416); ARNm (Malone (1989) Proc.
Natl. Acad. Sci. EEUU 86: 6077-6081); y factores de
transcripción purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:
10189-10192), en forma funcional.
Los liposomas catiónicos están fácilmente
disponibles. Por ejemplo, están disponibles liposomas de
M(1.2,3.dioleiloxi)propil)-N,N,N-trietilamonio
(DOTMA) bajo la marca comercial lipofectina, de GIBCO BRL, Grand
Island, NY. (Véase, también, Felgner, más arriba). Otros liposomas
comercialmente disponibles incluyen transfectace
(DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger). Se pueden preparar otros liposomas catiónicos a partir de materiales fácilmente disponibles usando las técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 75: 4194-4198; documento WO90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas de DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano).
(DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger). Se pueden preparar otros liposomas catiónicos a partir de materiales fácilmente disponibles usando las técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 75: 4194-4198; documento WO90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas de DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano).
De forma similar, están fácilmente disponibles
los liposomas aniónicos y neutros, tales como de Avanti Polar
Lipids (Birmingham, AL), o se pueden preparar fácilmente usando
materiales fácilmente disponibles. Dichos materiales incluyen
fosfatidil colina, colesterol, fosfatidil etanolamina,
dioleoilfosfatidil colina (DOPC), dioleoilfosfatidil glicerol
(DOPG), dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE), entre otros. Se
pueden mezclar también estos materiales con los materiales de
partida de DOTMA y DOTAP en las relaciones apropiadas. Se conocen
bien en la técnica los procedimientos para preparar liposomas usando
estos materiales.
Los liposomas pueden comprender vesículas
multilamelares (MLV), vesículas unilamelares pequeñas (SUV), o
vesículas unilamelares grandes (LUV). Los diversos complejos
liposoma-ácido nucleico se preparan usando los procedimientos
conocidos en la técnica. Véanse por ejemplo, Straubinger (1983)
Meth. Immunol. 101: 512-527; Szoka (1978) Proc.
Natl. Acad Sci. EEUU 75: 4194-4198; Papahadjopoulos
(1975) Biochim. Biophys. Acta 394: 483; Wilson (1979) Cell 17: 77);
Deamer y Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443: 629; Ostro
(1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76: 836; Fraley (1979) Proc.
Natl. Acad. Sci. EEUU 76: 3348); Enoch y Strittmatter (1979) Proc.
Natl. Acad. Sci. EEUU 76: 145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980)
255: 10431; Szoka y Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci.
EEUU 75: 145; y Schaefer-Ridder (1982) Science 215:
166.
Además, se pueden incluir lipoproteínas con el
polinucleótido o polipéptido que se va a administrar. Los ejemplos
de lipoproteínas que se van a utilizar incluyen; quilomicrones, HDL,
IDL, LDL, y VLDL. Se pueden usar también mutantes, fragmentos, o
fusiones de estas proteínas. También, se pueden usar modificaciones
de lipoproteínas que se producen naturalmente, tales como LDL
acetilada. Estas lipoproteínas pueden dirigir la administración de
polinucleótidos en las células que expresan los receptores de
lipoproteínas. Preferiblemente, si se incluyen lipoproteínas con el
polinucleótido que se va a administrar, no se incluye otro ligando
director en la composición.
Las lipoproteínas que se producen naturalmente
comprenden una porción de lípido y proteína. Las porciones de
proteínas se conocen como apoproteínas. Hasta el momento, se han
aislado e identificado las apoproteínas A, B, C, D, y E. Al menos
dos de éstas contienen diversas proteínas, designadas por los
números romanos, AI, AII, AIV; CI, CII, CIII.
Una lipoproteína puede comprender más de una
apoproteína. Por ejemplo, los quilomicrones que se producen
naturalmente comprenden A, B, C, y E; con el tiempo, estas
lipoproteínas pierden A y adquieren las apoproteínas C y E. VLDL
comprende las apoproteínas A, B, C, y E, LDL comprende la
apoproteína B; y HDL comprende las apoproteínas A, C, y E.
Se conocen las secuencias de aminoácidos de
estas apoproteínas y se describen en, por ejemplo, Breslow (1985)
Annu Rev. Biochem 54: 699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151: 162;
Chen (1986) J Biol Chem 261: 12918; Kane (1980) Proc Natl Acad Sci
EEUU 77: 2465; y Utermann (1984) Hum Genet 65: 232.
Las lipoproteínas contienen una variedad de
lípidos que incluyen, triglicéridos, colesterol (libre y ésteres),
y fosfolípidos. La composición de los lípidos varía en las
lipoproteínas que se producen naturalmente. Por ejemplo, los
quilomicrones comprenden los triglicéridos principales. Se puede
encontrar una descripción más detallada del contenido lípido de las
lipoproteínas que se producen naturalmente, por ejemplo, en Meth.
Enzymol. 129 (1986). La composición de los lípidos se escoge para
ayudar en la conformación de la apoproteína para la actividad de
unión con el receptor. Se puede escoger también la composición de
los lípidos para facilitar la interacción y asociación hidrófoba
con la molécula de unión al polinucleótido.
Se pueden aislar las lipoproteínas que se
producen naturalmente a partir del suero mediante
ultracentrifugación, por ejemplo. Se describen dichos
procedimientos en Meth. Enzymol. (más arriba); Pitas (1980)
J. Biochem. 255: 5454-5460 y Mahey (1979) J Clin.
Invest 64: 743-750.
Se pueden producir también las lipoproteínas
mediante procedimientos recombinantes e in vitro mediante la
expresión de los genes de la apoproteína en una célula huésped
deseada. Véase, por ejemplo, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem
15: 403 y Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30: 443.
Se pueden adquirir las lipoproteínas de
suministradores comerciales, tales como Biomedical Technologies,
Inc., Stougton, Massachusetts, EEUU.
Se puede encontrar una descripción adicional de
las lipoproteínas en Zuckermann y col., Solicitud PCT nº
US97/
14465.
14465.
Se pueden incluir agentes policatiónicos, con o
sin lipoproteína, en una composición con el polinucleótido y/o el
polipéptido deseados que se van a administrar.
Los agentes policatiónicos, normalmente,
presentan una carga neta positiva a pH fisiológico relevante y son
capaces de neutralizar la carga eléctrica de los ácidos nucleicos
para facilitar la administración en una localización deseada. Estos
agentes tienen aplicaciones in vitro, ex vivo, e in
vivo. Se pueden usar agentes policatiónicos para administrar
ácidos nucleicos en un sujeto vivo cualquiera de por vía
intramuscular, subcutánea, etc.
Los siguientes son ejemplos de polipéptidos
útiles como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina,
poliornitina y protamina. Otros ejemplos de polipéptidos útiles
incluyen histonas, protaminas; albúmina de suero humano, proteínas
de unión con el ADN, proteínas cromosómicas no histona, proteínas
recubiertas procedentes de virus de ADN, tales como \PhiX174,
factores transcripcionales que contienen también regiones que se
unen al ADN y por tanto pueden ser útiles como agentes condensantes
de ácidos nucleicos. De manera breve, los factores
transcripcionales tales como C/CEBP, c-jun,
c-fos, AP-1, AP-2,
AP-3, CPF, Prot-1,
Sp-1, Oct-1, Oct-2,
CREP, y TFIID contienen regiones básicas que se unen a secuencias
de ADN.
Los agentes policatiónicos orgánicos incluyen,
espermina, espermidina, y putrescina.
Se pueden extrapolar las dimensiones y las
propiedades físicas de un agente policatiónico a partir de la lista
anterior, para construir otros agentes policatiónicos polipéptidos o
para producir agentes policatiónicos sintéticos.
Los agentes policatiónicos sintéticos que son
útiles en las composiciones farmacéuticas incluyen, por ejemplo,
DEAE-dextrano, polibreno. Lipofectina^{TM}, y
lipofectAMINE^{TM} son monómeros que forman complejos
policatiónicos cuando se combinan con polinucleótidos o
polipéptidos.
\newpage
Se pueden usar antígenos MenB de
Neisseria, o fragmentos antigénicos de la misma, de la
descripción, en inmunoensayos para detectar niveles de anticuerpo
(o, inversamente, se pueden usar anticuerpos MenB
anti-Neisseria para detectar niveles de antígeno).
Se pueden desarrollar inmunoensayos basados en antígenos
recombinantes bien definidos para sustituir procedimientos
diagnósticos invasivos. Se pueden detectar anticuerpos de proteínas
MenB de Neisseria o fragmentos de la misma en el interior de
muestras biológicas, que incluyen, por ejemplo, muestras de sangre
o suero. El diseño de los inmunoensayos es objeto de una gran
amplitud de variaciones, y se conocen en la técnica amplia variedad
de éstas. Los protocolos para el inmunoensayo pueden estar basados,
por ejemplo, en la competición, o la reacción directa, o los ensayos
tipo sándwich, Los protocolos pueden también, por ejemplo, usar
soportes sólidos, o pueden ser mediante inmunoprecipitación. La
mayor parte de los ensayos implica el uso de un anticuerpo o
polipéptido marcado; las marcas pueden ser, por ejemplo, moléculas
fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas, o de tinte. Se
conocen también los ensayos que amplifican las señales de la sonda,
ejemplos de los cuales son los ensayos que utilizan biotina y
avidina, y los inmunoensayos marcados con enzima y mediados, tales
como los ensayos
ELISA.
ELISA.
Los kits adecuados para la inmunodiagnosis y que
contienen los reactivos marcados apropiados se construyen
empaquetando los materiales apropiados, que incluyen las
composiciones de la invención, en contenedores adecuados, junto con
los reactivos y materiales restantes (por ejemplo, tampones
adecuados, soluciones salinas, etc.) requeridas para la
realización del ensayo, así como el conjunto de instrucciones de
ensayo adecuado.
"Hibridación" se refiere a la asociación de
dos secuencias de ácidos nucleicos entre sí mediante enlace de
hidrógeno. Normalmente, una secuencia se fijará a un soporte sólido
y otra estará libre en solución. A continuación las dos secuencias
se colocarán en contacto entre sí en condiciones que favorecen el
enlace de hidrógeno. Los factores que afectan este enlace incluyen:
el tipo y volumen del disolvente; la temperatura de reacción; el
tiempo de hibridación; la agitación, los agentes para bloquear la
unión no específica de la secuencia de la fase líquida al soporte
sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO); la concentración de las
secuencias; el uso de los compuestos para aumentar la velocidad de
asociación de las secuencias (sulfato de dextrano o
polietilenglicol), y la restricción de las condiciones de lavado
tras la hibridación. Véase Sambrook y col. (más arriba) Volumen 2,
capítulo 9, páginas 9.47 a 9.57.
"Restricción" se refiere a las condiciones
en una reacción de hibridación que favorecen la asociación de
secuencias muy similares sobre secuencias que difieren. Por
ejemplo, deberían escogerse la combinación de la temperatura y la
concentración de sal que es aproximadamente de 120 a 200º C por
debajo de la Tm calculada del híbrido en estudio. Las condiciones
de temperatura y sal se pueden determinar a menudo empíricamente en
los experimentos preliminares en los cuales las muestras de ADN
genómico inmovilizado sobre filtros se hibridan con la secuencia de
interés y a continuación se lavan bajo condiciones de diferentes
restricciones. Véase Sambrook y col. en la página 9.50
Las variables a considerar cuando se lleva a
cabo, por ejemplo, una inmunotransferencia Southern son (1) la
complejidad del ADN que se está inmunotransfiriendo y (2) la
homología entre la sonda y las secuencias que se están detectando.
La cantidad total del(de los) fragmento(s) que se
estudian puede variar una magnitud de 10, desde 0,1 a 1 \mug para
un plásmido o fago digerido de 10^{-9} a 10^{-8} para un gen de
copia única en un genoma eucariota muy complejo. Para los
polinucleótidos de menor complejidad, se pueden usar la
inmunotransferencia sustancialmente más corta, la hibridación, y los
tiempos de exposición, una cantidad más pequeña de polinucleótidos
de partida, y menor actividad específica de las sondas. Por ejemplo,
se puede detectar un gen de levadura de copia única con un tiempo
de exposición de sólo 1 hora comenzando con 1 \mug de ADN de
levadura, inmunotransferencia durante dos horas, e hibridación
durante 4-8 horas con una sonda de 10^{8}
cpm/\mug. Para un gen de mamífero de copia única una solución
conservativa podría comenzar con 10 \mug de ADN,
inmunotransferencia durante la noche, e hibridar durante la noche en
presencia de sulfato de dextrano al 10% usando una sonda mayor de
10^{8} cpm/\mug, dando como resultado un tiempo de exposición de
\sim 24 horas.
Diversos factores pueden afectar la temperatura
de fusión (Tf) de un híbrido de ADN-ADN entre la
sonda y el fragmento de interés, y consecuentemente, las
condiciones apropiadas para la hibridación y el lavado. En muchos
casos, la sonda no es un 100% homóloga con el fragmento. Otras
variables que se encuentran comúnmente incluyen la longitud y el
contenido G+C total de las secuencias de hibridación y la fuerza
iónica y el contenido de formamida del tampón de hibridación. Se
pueden aproximar los efectos de todos estos factores mediante una
ecuación única: Tf = 81 + 16,6 (log_{10}Ci) + 0,4(%(G+C)) - 0,6 (%
formamida) - 600/n - 1,5 (% sin emparejar) en el que Ci es
la concentración de sal (iones monovalentes) y n es la longitud del
híbrido en pares de bases (modificada ligeramente de Meinkoth y
Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284).
Al diseñar un experimento de hibridación, se
pueden alterar convenientemente algunos factores que afectan la
hibridación del ácido nucleico: La temperatura de la hibridación y
los lavados y la concentración de sal durante los lavados son lo
más simple de ajustar. A medida que la temperatura de la hibridación
aumenta (es decir, restricción), se vuelve menos probable que se
produzca la hibridación entre las cadenas que no son homólogas, y
como resultado, el fondo disminuye. Si la sonda radiomarcada no es
completamente homóloga con el fragmento inmovilizado (tal como es
frecuentemente el caso en la familia de genes y en los experimentos
de hibridación interespecies), se debe reducir la temperatura de
hibridación, y el fondo aumentará. La temperatura de los lavados
afecta a la intensidad de la banda de hibridación y al grado de
fondo de una manera similar. Se aumenta también la restricción de
los lavados con la disminución de las concentraciones de sal.
En general, las temperaturas de hibridación
convenientes en presencia de formamida al 50% son 42ºC para una
sonda que es un 95% a un 100% homóloga con el fragmento diana, 37ºC
para un 90% a 95% de homología, y 32ºC para un 85% a un 90% de
homología. Para homologías menores, debería disminuir el contenido
de formamida y ajustarse la temperatura de acuerdo con esto, usando
la ecuación anterior. Si la homología entre la sonda y el fragmento
diana no se conoce, la solución más simple es comenzar con la
hibridación y las condiciones de lavado que no sean restrictivas.
Si se observan bandas específicas o mucho fondo tras la
autorradiografía, se puede lavar el filtro con restricción elevada
y volverse a exponer. Si el tiempo requerido para la exposición
hace esta solución imposible de realizar, deberían ensayarse en
paralelo diversas restricciones de la hibridación y o el
lavado.
Procedimientos tales como la PCR, ensayos de
sonda de ADN ramificado, o técnicas de inmunotransferencia que
utilizan sondas de ácido nucleico de acuerdo con la descripción
pueden determinar la presencia de ADNc o ARNm. Se dice que una
sonda se "hibrida" con una secuencia de la descripción si esta
puede formar un dúplex o un complejo de doble cadena, que es
suficientemente estable para detectarse, Las sondas de ácido
nucleico hibridarán a las secuencias de nucleótidos Neisseriales de
la descripción (incluyendo las cadenas de sentido directo y sentido
contrario. Se piensa que muchas secuencias de nucleótidos diferentes
codificarán la secuencia de aminoácidos, se prefiere la secuencia
Neisserial natural debido a que es la secuencia real presente en las
células. El ARNm representa una secuencia de codificación y de esta
manera una sonda debería ser complementaria con la secuencia de
codificación; el ADNc de cadena única es complementario con el ARNm,
y de esta manera una sonda de ADNc debería ser complementaria con
la secuencia no codificante.
La secuencia de la sonda no necesita ser
idéntica a la secuencia Neisserial (o su complemento) -alguna
variación en la secuencia y la longitud puede conducir a aumentar
la sensibilidad del ensayo si la sonda de ácido nucleico puede
formar un dúplex con los nucleótidos diana, que se pueden detectar.
También, la sonda de ácido nucleico puede incluir nucleótidos
adicionales para estabilizar el dúplex formado. Puede ser también
saludable una secuencia Neisserial adicional como una marca para
detectar el dúplex formado. Por ejemplo, se puede unir una
secuencia de nucleótidos no complementaria al extremo 5' de la
sonda, siendo complementaria con el resto de la secuencia de la
sonda de una secuencia Neisserial. Alternativamente, se pueden
intercalar bases no complementarias o secuencias más largas en la
sonda, proporcionando que la secuencia de la sonda tenga suficiente
complementariedad con una secuencia Neisserial con el fin de
hibridar la anterior y por tanto formar un dúplex que se pueda
detectar.
La longitud y la secuencia exacta de la sonda
dependerán de las condiciones de hibridación, tales como la
temperatura, la condición de sal y similar, Por ejemplo, para
aplicaciones diagnósticas, dependiendo de la complejidad de la
secuencia del analito, la sonda de ácido nucleico contiene
normalmente al menos 10-20 nucleótidos,
preferiblemente 15-25, y más preferiblemente al
menos 30 nucleótidos, aunque puede ser más corta que esto. Los
cebadores cortos requieren generalmente temperaturas más frías para
formar complejos híbridos suficientemente estables con la
plantilla.
Se pueden producir sondas mediante
procedimientos sintéticos, tales como el procedimiento triéster de
Matteucci y col. (J. Am. Chem. Soc. (1981) 103: 3185), o de acuerdo
con Urdea y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU (1983) 80: 7461), o
usando los sintetizadores de oligonucleótidos automatizados
comercialmente disponibles.
Se puede seleccionar la naturaleza química de la
sonda de acuerdo con las preferencias. Para algunas aplicaciones,
son apropiados ADN o ARN. Para otras aplicaciones, se pueden
incorporar modificaciones, por ejemplo, se pueden usar
modificaciones en el esqueleto tales como fosforotioatos o
metilfosfonatos, para aumentar la semivida in vivo, alterar
la afinidad del ARN, aumentar la resistencia a la nucleasa
etc (por ejemplo, véase Agrawal y Iyer (1995) Curr Opin
Biotechnol 6: 12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14:
376-387); se pueden usar también análogos como
ácidos nucleicos péptidos (por ejemplo, véase Corey (1997) TIBTECH
15: 224-229; Buchardt y col. (1993) TIBTECH 11:
384-386).
Un ejemplo de un ensayo de hibridación de
nucleótidos se describe por Urdea y col. en la solicitud de patente
internacional WO92/02526 (véase también la Patente de los Estados
Unidos 5.124.246).
Alternativamente, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) es otro medio bien conocido para detectar pequeñas
cantidades de ácidos nucleicos diana. Se describe el ensayo en:
Mullis y col. (Meth. Enzymol. (1987) 155: 335-350);
patente de los Estados Unidos 4.683.195; y patente de los Estados
Unidos 4.683.202. Dos nucleótidos "cebadores" hibridan con los
ácidos nucleicos diana y se usan para cebar la reacción. Los
cebadores pueden comprender la secuencia que no hibrida con la
secuencia de la amplificación diana (o su complemento) para ayudar
en la estabilidad del dúplex o, por ejemplo, para incorporar un
emplazamiento de restricción conveniente. Normalmente, dicha
secuencia flanqueará la secuencia Neisserial deseada.
Una polimerasa termoestable crea copias de los
ácidos nucleicos diana a partir de los cebadores usando los ácidos
nucleicos diana originales como plantilla. Después que se genera una
cantidad umbral de ácidos nucleicos diana por la polimerasa, se
pueden detectar mediante más procedimientos tradicionales, tales
como las inmunotransferencias Southern; Cuando se usa el
procedimiento de la inmunotransferencia Southern, la sonda marcada
hibridará con la secuencia Neisserial (o su complemento).
También, se puede detectar el ARNm o el ADNc
mediante las técnicas de inmunotransferencia tradicionales descritas
en Sambrook y col (más arriba).. se puede purificar
el ARNm, o el ADNc generado a partir de ARNm usando un enzima
polimerasa, y separarse usando electroforesis en gel. A continuación
se inmunotransfieren los ácidos nucleicos en el gel sobre un
soporte sólido, tal como nitrocelulosa. El soporte sólido se expone
a una sonda marcada y a continuación se lava para eliminar
cualquier sonda no hibridada. A continuación, se detectan los
dúplex que contienen la sonda marcada. Normalmente, la sonda se
marca con un resto radioactivo.
Se incluyen los aspectos de los siguientes
ejemplos que no se refieren específicamente a la invención
reivindicada para ilustración y comprobación.
La descripción se basa en las 961 secuencias de
nucleótidos procedentes del genoma de N. meningitidis que se
muestran en el Apéndice C, SEC DE ID N^{os}: 1-961
de la solicitud '573, que representan sustancialmente en conjunto
el genoma completo del serotipo B de N. meningitidis, así
como la secuencia del genoma de longitud completa que se muestra en
el Apéndice D, SEC DE ID Nº 1068 de la solicitud '573, y la
secuencia del genoma d longitud completa que se muestra en el
apéndice A de la presente, SEC DE ID Nº 1.
Será muy evidente para la persona experta en la
técnica cómo esta información de la secuencia se puede utilizar de
acuerdo con la invención, tal como se ha descrito anteriormente.
Las técnicas y procedimientos estándar que se
pueden emplear con el fin de llevar a cabo la descripción (por
ejemplo, para utilizar las secuencias descritas para predecir los
polipéptidos útiles para objetivos de vacunación o diagnóstico) se
han resumido anteriormente. Este resumen no es una limitación sobre
la descripción sino, más bien, proporciona ejemplos que se pueden
usar, pero que no se necesitan.
Estas secuencias se derivan de las contig que se
muestran en el Apéndice C (SEC DE ID N^{os}
1-961(y de la secuencia del genoma de
longitud completa que se muestra en el Apéndice D (SEC DE ID Nº
1068), que se prepararon durante la secuenciación del genoma de
N. meningitidis (cepa B). La secuencia de longitud completa
se ensambló usando el ensamblador TIGR tal como se describe por G.
S. Sutton y col., TIGR Assembler: A New Tool for Assembling Large
Shotgun Sequencing Projects, Genome Science and Technology, 1:
9-19 (1995) [véanse también R. D. Fleischmann, y
col., Science 269, 496-512 (1995); C. M. Fraser, y
col., Science 270, 397-403 (1995); C. J. Bult, y
col., Science 273, 1058-73 (1996); C. M. Fraser, y
col, Nature 390, 580-586 (1997); J.-F. Tomb, y
col., Nature 388, 539-547 (1997); H. P. Klenk, y
col., Nature 390, 364-70 (1997); C. M. Fraser, y
col., Science 281, 375-88 (1998); M. J. Gardner, y
col., Science 282, 1126-1132-(1998); K. E. Nelson, y
col., Nature 399, 323-9 (1999)]. A continuación,
usando los procedimientos anteriormente descritos, se determinaron
los presuntos productos de la traducción de las secuencias. Se
determinaron los análisis asistidos por ordenador de los productos
de la traducción basándose en las comparaciones de las bases de
datos; Las secuencias del gen y la proteína correspondiente, si
acaso, se identificaron en Neisseria meningitidis (cepa A) y
Neisseria gonorrhoeae. A continuación se expresaron las
proteínas, se purificaron, y se caracterizaron para evaluar su
antigenia e inmunogenia.
En concreto, se usaron los siguientes
procedimientos para expresar, purificar, y caracterizar
bioquímicamente las proteínas.
Se hizo crecer la cepa 2996 de N.
meningitidis hasta fase exponencial en 100 ml de medio GC, se
cosechó mediante centrifugación, y se volvió a suspender en 5 ml de
tampón (sacarosa al 20%, Tris-HCl 50 mM, EDTA 50
mM, ajustados a pH 8,0). Tras 10 minutos de incubación en hielo, se
lisaron las bacterias añadiendo 10 ml de solución de lisis (NaCl 50
mM, Na-Sarkosil al 1%, 50 \mug/ml de Proteinasa K)
y se incubó la suspensión a 37ºC durante 2 horas. Se llevaron a
cabo dos extracciones fenólicas (equilibradas a pH 8) y una
extracción de ChCl_{3}/alcohol isoamílico (24:1). Se precipitó el
ADN mediante la adición de acetato de sodio 0,3 M y 2 volúmenes de
etanol, y se recogió mediante centrifugación. Se lavó el residuo una
vez con etanol al 70% y se volvió a disolver en 4 ml de tampón
(Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). Se midió la
concentración de ADN leyendo la DO a 260 nm.
Se diseñaron los cebadores de los
oligonucleótidos sintéticos en función de la secuencia de
codificación de cada ORF, usando (a) la secuencia del meningococo B
cuando se encuentra disponible, o (b) la secuencia del
gonococo/meningococo A, adaptada al uso del codón de preferencia del
meningococo. Se omitieron cualquiera de los péptidos señal
predichos, deduciendo la secuencia del cebador de la amplificación
en el extremo 5' inmediatamente en la dirección 3' desde la
secuencia líder predicha.
Para la mayor parte de los ORF, los cebadores 5'
incluyeron dos emplazamientos de reconocimiento del enzima de
restricción (BamHI-NdeI, BamHI-NheI o
EcoRI-NheI, dependiendo del modelo de restricción del
gen); los cebadores 3' incluyeron un emplazamiento de restricción
XhoI. Se estableció este procedimiento con el fin de dirigir
la clonación de cada producto de amplificación (correspondiente a
cada ORF) en dos sistemas de expresión diferentes:
pGEX-KG (usando cualquiera de
BamHI-XhoI o EcoRI-XhoI), y pET21b+
(usando cualquiera de NdeI-XhoI o
NheI-XhoI).
Para algunos ORF, se llevaron a cabo dos
amplificaciones diferentes para clonar cada ORF en los dos sistemas
de expresión. Se usaron dos cebadores 5' diferentes para cada ORF,
se usó el mismo 3' XhoI como antes
Se clonaron otros ORF en el vector de expresión
pTRC y se expresaron como un aminotérmino de fusión etiquetado con
His. Se puede incluir el péptido señal predicho en el producto
final. Se incorporaron los emplazamientos de restricción
NheI-BamHI usando los cebadores
Así como conteniendo las secuencias de
reconocimiento del enzima de restricción, los cebadores incluyeron
los nucleótidos que se hibridaron con la secuencia que se va a
amplificar, El número de nucleótidos de hibridación depende de la
temperatura de fusión del cebador completo, y se determinó para cada
cebador usando las fórmulas:
La temperatura promedio de fusión de los oligos
seleccionados fue de 65-70ºC para el oligo completo
y de 50-55ºC para la región de hibridación
sola.
Se sintetizaron los oligos mediante un
Sintetizador de ADN/ARN 394 de Perkin Elmer, eluidos a partir de las
columnas en 2 ml de NH_{4}-OH y desprotegidos
mediante 5 horas de incubación a 56ºC. se precipitaron los oligos
mediante la adición de Na-Acetato 0,3 M y 2
volúmenes de etanol. A continuación se centrifugaron las muestras y
se volvieron a suspender los residuos en cualquiera de 100 \mul o
1 ml de agua. Se determinó la DO_{260} usando un
espectrofotómetro Lambda Bio de Perkin Elmer y se determinó la
concentración y se ajustó a 2-10 pmol/\mul.
La tabla 1 muestra los cebadores directo en
inverso usados para cada amplificación. En algunos casos, debe
señalarse que la secuencia de los cebadores no empareja exactamente
la secuencia en el ORF. Cuando se llevan a cabo las amplificaciones
iniciales, no se puede conocer la secuencia 5' y/o 3' completa para
algunos ORF meningocócicos, aunque se pueden haber identificado las
secuencias correspondientes en gonococo. Par la amplificación, se
usarían de esta manera las secuencias gonocócicas como la base para
el diseño del cebador, alteradas para tener en cuenta el codón de
preferencia. En concreto, se pueden cambiar los siguientes codones:
ATA \rightarrow ATT; TCG \rightarrow TCT; CAG \rightarrow
CAA; AAG \rightarrow AAA; GAG\rightarrow GAA; CGA y CGG
\rightarrow CGC; GGG \rightarrow GGC.
El protocolo estándar de PCR fue como sigue:
50-200 ng de ADN genómico se usaron como plantilla
en presencia de 20-40 \muM de cada oligo,
400-800 \muM de solución de dNTP, tampón de PCR 1x
(incluyendo MgCl_{2} 1,5 mM), 2,5 unidades de polimerasa
Taq/DNA (usando un equipo Perkin-Elmer
AmpliTaQ, GIBCO Platinum, Pwo DNA polimerasa, o Tahara Shuzo Taq
polimerasa).
En algunos casos, la PCR se optimizó por
adicción de 10 \mul de DMSO o 50 \mul de betaína 2 M.
Tras inicio caliente (añadiendo la polimerasa
durante una incubación preliminar de 3 minutos de la mezcla
complete a 95ºC), cada muestra experimenta una amplificación de
doble paso: los 5 primeros ciclos se realizaron usando como
temperatura de hibridación una de las de los oligos excluyendo las
colas de las enzimas de restricción seguidas por 30 ciclos
realizados según la temperatura de hibridación de los oligos de
longitud completa. Los ciclos fueron seguidos por una etapa final
de 10 minutos de duración a 72ºC.
Los ciclos convencionales son como sigue:
El tiempo de elongación varía según la longitud
del ORF a amplificar.
Las amplificaciones se realizaron usando un
sistema Perkin Elmer GeneAmp PCR System bien 9600 ó 2400. Para
comprobar los resultados, 1/10 del volumen amplificado se introdujo
en un gel de agarosa al 1-1.5% y se comparó el
tamaño de cada fragmento amplificado con un marcador de peso
molecular de ADN.
El ADN amplificado bien se introduce
directamente en un gel de agarosa al 1% o se precipita primero con
etanol y se vuelve a suspender en un volumen adecuado a introducir
en un gel de agarosa al 1%. El fragmento de ADN correspondiente a
la banda de tamaño adecuado se eluye y purifica a continuación del
gel, usando el kit Qiagen Gel Extraction Kit, siguiendo las
instrucciones del fabricante. El volumen final del fragmento de ADN
fue de 30 \mul o 50 \mul bien en agua o Tris 10 mM, pH 8.5.
El ADN purificado correspondiente al fragmento
amplificado se dividió en dos alícuotas y se digirió doblemente
con:
NdeI/XhoI o NheI/XhoI para clonar en el
pET-21b+ y expresión adicional de la proteína como
fusión His-etiqueta en el término C.
BamHI/XhoI o EcoRI/XhoI para clonar en el
pGEX-KG y expresión adicional de la proteína como
fusión GST en el término N.
Para ORF 76, NheI/BamHI para clonar en el
vector pTRC-HisA y expresión adicional de la
proteína como fusión His-etiqueta en el término
N.
Cada fragmento de ADN purificado se incubó (37ºC
durante de 3 horas a toda la noche) con 20 unidades de cada enzima
de restricción (New England Biolabs) en un volumen final de 30 ó 40
\mul en presencia del tampón apropiado. El producto de digestión
se purificó a continuación usando el kit de purificación QIAquick
PCR, siguiendo las instrucciones del fabricante, y se eluyó hasta
un volumen final de 30 (ó 50) \mul bien de agua o
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5. La concentración final de
ADN se determinó por electroforesis en gel de agarosa al 1% en
presencia de un marcador de peso molecular valorado.
10 \mug de plásmido se digirieron por
duplicado con 50 unidades de cada enzima de restricción en un
volumen de reacción de 200 \mul en presencia del tampón adecuado
mediante incubación durante la noche a 37ºC. Tras cargar la
digestión completa en un gel de agarosa al 1%, se purificó la banda
correspondiente al vector digerido del gel usando el kit de
extracción Qiagen QIAquick Gel Extraction y el ADN se eluyó en 50
\mul de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. Se evaluó la
concentración de ADN midiendo la DO_{260} de la muestra y se
ajustó a 50 \mug/\mul. Se usó 1 \mul de plásmido en cada
procedimiento de clonación.
Los fragmentos correspondientes a cada ORF,
anteriormente digeridos y purificados, si ligaron a ambos pET22b y
pGEX-KG. En un volumen final de 20 \mul, se unió
una relación molar 3:1 fragmento/vector usando 0.5 \mul de NEB T4
ADN ligasa (400 unidades/\mul), en presencia del tampón
suministrado por el fabricante. La reacción se incubó a temperatura
ambiente durante 3 horas. En algunos experimentos, la unión se
realizó usando el "Rapid Ligation Kit" de Boheringer,
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Con el fin de introducir el plásmido
recombinante en una cepa adecuada, se incubaron 100 \mul de
células E. coli DH5 competentes con la disolución de reacción de la
ligasa durante 40 minutos sobre hielo, a continuación a 37ºC
durante 3 minutos, a continuación, tras añadir 800 \mul de caldo
LB, de nuevo a 37ºC durante 20 minutos. A continuación las células
se centrifugaron a máxima velocidad en una microcentrífuga Eppendorf
y se volvieron a suspender en aproximadamente 200 \mul del
sobrenadante. A continuación la suspensión se plaqueó sobre
ampicilina LB (100 mg/ml).
La selección de los clones recombinantes se
realizó haciendo crecer 5 colonias de clones aleatoriamente
seleccionadas durante la noche a 37ºC bien en 2 ml (clones pGEX o
pTC) o 5 ml (clones pET) de caldo LB + 100 \mug/ml de ampicilina.
A continuación las células se aglomeraron y se extrajo el ADN usando
el Kit Qiagen prep Spin Miniprep, siguiendo las instrucciones del
fabricante, hasta un volumen final de 30 \mul. 5 \mul de cada
minipreparación individual (aproximadamente 1 g) se digirieron bien
con NdeI/XhoI o BamHI/XhoI y la digestión completa se
cargó sobre un gel de agarosa al 1-1,5% (dependiendo
del tamaño esperado del inserto), en paralelo con el marcador de
peso molecular (1Kb DNA Ladder, GIBCO). La selección de los clones
positivos se realizó sobre la base del tamaño correcto del
inserto.
Algunos ORF se pueden clonar en el vector
pGEX-HIS usando emplazamientos de clonación
EcoRI-PstI, EcoRI-SalI, o
SalI-PstI. Tras clonación, los plásmidos
recombinantes se pueden introducir en el huésped E. coli
W3110.
Cada ORF clonado en el vector de expresión puede
a continuación ser transformado en la cepa adecuada para expresión
del producto de proteína recombinante. Se usó 1 \mul de cada
constructo para transformar 30 \mul de E. coli BL21
(vector pGEX), E. coli TOP 10 (vector pTRC) o E. coli
BL21-DE3 (vector pET), según se ha descrito
anteriormente. En el caso del vector pGEX-His, se
usó la misma cepa E. coli (W3110) para la clonación y
expresión inicial. Colonias recombinantes simples se inocularon en
2ml de LB+Amp (100 \mug/ml), se incubaron a 37ºC durante la
noche, a continuación se diluyeron 1:30 en 20 ml de LB+Amp (100
\mug/ml) en frascos de 100 ml, asegurándose de que la DO_{600}
estaba comprendida entre 0,1 y 0,15. Los frascos se incubaron a
30ºC en agitadores giratorios con baño de agua hasta que la DO
indicó crecimiento exponencial adecuado para la inducción de la
expresión (DO 0,4-0,8 para los vectores pET y TRC;
DO 0.8-1 para los vectores pGEX y pGEXHis). Para
los vectores pET, pTRC y pGEX-His, se indujo la
expresión de proteínas por adición de IPTG 1 mM, mientras que en el
caso del sistema pGEX, la concentración final de IPTG fue 0,2 mM.
Tras 3 horas de incubación a 30ºC, se comprobó la concentración
final de la muestra mediante la DO. Para comprobar la expresión, se
retiró 1 ml de cada muestra, se centrifugó en una microcentrífuga,
el residuo se volvió a suspender en PBS, y se analizó mediante
SDS-PAGE al 12% con tinción de azul Coomassie. La
muestra completa se centrifugó a 6000g y el residuo se volvió a
suspender en PBS para uso posterior.
Se hizo crecer una única colonia durante la
noche a 37ºC sobre una placa de agar LB+Amp. Las bacterias se
inocularon en 20 ml de cultivo líquido LB+Amp en un agitador con
baño de agua y se hicieron crecer durante la noche. Las bacterias
se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio fresco y se dejaron crecer a
temperatura óptima (20-37ºC) hasta DO_{550}
0,8-1. Se indujo la expresión de proteína con IPTG
0,2 mM seguido por tres horas de incubación. El cultivo se
centrifugó a 8000 rpm a 4ºC. Se descartó el sobrenadante, y el
residuo bacteriano se volvió a suspender en 7,5 ml de PBS frío. Las
células se rompieron por sonicación sobre hielo durante 30 s a 40 W
usando un sonificador Branson B-15, se congelaron y
descongelaron dos veces y se volvieron a centrifugar. Se recogió el
sobrenadante y se mezcló con 150 \mul de resina
Glutation-Sefarosa 4B (Pharmacia) (previamente
lavada con PBS) y se incubó a temperatura ambiente durante 30
minutos. La muestra se centrifugó a 700 g durante 5 minutos a 4ºC.
La resina se lavó dos veces con 10 ml de PBS frío durante 10
minutos, se volvió a suspender en 1 ml de PBS frío, y se introdujo
en una columna desechable. La resina se lavó dos veces con 2 ml de
PBS frío hasta que el flujo pistón alcanzó una OD_{280} de
0,02-0,06. La proteína de fusión GST se eluyó por
adición de 700 \mul de tampón de elución de glutatión 10 mM frío
(glutatión reducida 10 mM, Tris-HCl 50 mM) y las
fracciones se recogieron hasta que la OD_{280} fue de 0,1. 21
\mul de cada fracción se cargaron en un gel SDS al 12% usando el
patrón de peso molecular de intervalo amplio bien de Biorad
SDS-PAGE (M1) (200, 116,25, 97,4, 66,2, 45, 31,
21,5, 14,4, 6,5 kDa) o de Amersham Rainbow Marker (M'') (220, 66,
46, 30, 21,5, 14,3 kDa) como patrones. Como el PM de GST es 26 kDa,
este valor debe añadirse al PM de cada proteína de fusión GST.
Se hizo crecer una única colonia durante la
noche a 37ºC sobre una placa de agar. Las bacterias se inocularon
en 20 ml de cultivo líquido LB+Amp en un agitador con baño de agua y
se incubaron durante la noche en un agitador con baño de agua. Las
bacterias se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio fresco y se dejaron
crecer a temperatura óptima (20-37ºC) hasta
DO_{550} 0,8-1. Se indujo la expresión de proteína
con IPTG 0,2 mM y el cultivo se incubó tres horas. El cultivo se
centrifugó a 8000 rpm a 4ºC, se descartó el sobrenadante y el
residuo bacteriano se volvió a suspender en 7,5 ml de tampón de
imidazol 10 mM frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 10
mM, pH 8). Las células se rompieron por sonicación sobre hielo
durante 30 s a 40 W usando un sonificador Branson
B-15, se congelaron y descongelaron dos veces y se
volvieron a centrifugar. Se recogió el sobrenadante y se mezcló con
150 \mul de resina Ni^{2+} (Pharmacia) (previamente lavada con
tampón imidazol 10 mM) y se incubaron a temperatura ambiente con
agitación suave durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 700
g durante 5 minutos a 4ºC. La resina se lavó dos veces con 10 ml de
tampón imidazol 10 mM frío durante 10 minutos, se volvió a
suspender en 1ml de tampón imidazol 10 mM frío y se introdujo en una
columna desechable. La resina se lavó a 4ºC con 2 ml tampón
imidazol hasta que el flujo pistón alcanzó una OD_{280} de
0,02-0,06. La proteína de fusión His se eluyó por
adición de 700 \mul de tampón imidazol 250 mM frío (NaCl 300 mM,
tampón fosfato 50 mM, imidazol 250 mM, pH 8) y las fracciones se
recogieron hasta que la OD_{280} fue de 0,1. 21 \mul de cada
fracción se cargaron en un gel SDS al 12%.
Se hizo crecer una única colonia durante la
noche a 37ºC sobre una placa de agar. Las bacterias se inocularon
en 20 ml de cultivo líquido LB+Amp en un agitador con baño de agua y
se hicieron crecer durante la noche en un agitador con baño de
agua. Las bacterias se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio fresco y
se dejaron crecer a temperatura óptima (20-37ºC)
hasta DO_{550} 0,6-0,8. Se indujo la expresión de
proteína por adición de IPTG 1 mM y el cultivo se incubó tres horas
más. El cultivo se centrifugó a 8000 rpm a 4ºC, se descartó el
sobrenadante y el residuo bacteriano se volvió a suspender en 7,5 ml
de tampón B (urea 8 M, Tris-HCl 10 mM, tampón
fosfato 10 mM, pH 8,8). Las células se rompieron por sonicación
sobre hielo durante 30 s a 40 W usando un sonificador Branson
B-15, se congelaron y descongelaron dos veces y se
volvieron a centrifugar. El sobrenadante se almacenó a -20ºC,
mientras que el residuo se volvió a suspender en 2 ml de tampón de
guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, tampón fosfato 100 mM,
Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) y se trató en un
homogenizador durante 10 ciclos. El producto se centrifugó a 13.000
rpm durante 40 minutos. El sobrenadante se mezcló con 150 \mul de
resina Ni^{2+} (Pharmacia) (previamente lavada con tampón B) y se
incubó a temperatura ambiente con agitación suave durante 30
minutos. La muestra se centrifugó a 700 g durante 5 minutos a 4ºC.
La resina se lavó dos veces con 10 ml de tampón B durante 10
minutos, se volvió a suspender en 1ml de tampón B y se introdujo en
una columna desechable. La resina se lavó a temperatura ambiente con
2 ml de tampón B hasta que el flujo pistón alcanzó una OD_{280}
de 0,02-0,06. La resina se lavó con 2 ml de tampón C
(urea 8 M, Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM,
pH 6,3) hasta que el flujo pistón alcanzó una OD_{280} de
0,02-0,06. La proteína de fusión His se eluyó por
adición de 700 \mul de tampón de elución (urea 8 M,
Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH 4,5) y
las fracciones se recogieron hasta que la OD_{280} fue de 0,1. 21
\mul de cada fracción se cargaron en un gel SDS al 12%.
Se añadió glicerol al 10% a las proteínas
desnaturalizadas. A continuación las proteínas se diluyeron hasta
20 \mug/ml usando tampón de diálisis I (glicerol al 10%, arginina
0,5 M, tampón fosfato 50 mM, glutatión reducido 5 mM, glutatión
oxidado 0,5 mM, urea 2 M, pH 8,8) y se sometió a diálisis contra el
mismo tampón a 4ºC durante 12-14 horas. La proteína
se dializó adicionalmente contra tampón de diálisis II (glicerol al
10%, arginina 0,5 M, tampón fosfato 50 mM, glutatión reducido 5 mM,
glutatión oxidado 0,5 mM, pH 8,8) durante 12-14
horas a 4ºC. Se evaluó la concentración de proteínas mediante la
fórmula:
Proteína \
(mg/ml) = (1,55 \ x \ OD_{280}) - (0,76 \ x \
OD_{260})
Se usaron 20 \mug de cada proteína purificada
para inmunizar ratones intraperitonealmente. En el caso de algunos
ORF los ratones Balb-C se inmunizaron con
Al(OH)_{3} como coadyuvante los días 1, 21 y 42, y
se siguió la respuesta inmune con muestras tomadas el día 56. Para
otros ORF, los ratones CD1 se inmunizarían usando el mismo
protocolo. Para otros ORF, los ratones CD1 se inmunizarían usando
adyuvante de Freund, y se usó el mismo protocolo de inmunización,
excepto en que la respuesta inmune se midió el día 42, en lugar del
56. De manera similar, para otros ORF adicionales, los ratones CD1
se inmunizarían usando adyuvante de Freund pero la respuesta inmune
se mediría el día 49.
Se plaqueó la cepa MenB M7 acapsulada en placas
de agar chocolate y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se
recogieron las colonias bacterianas de las placas de agar usando un
hisopo dracon estéril y se inocularon en 7 ml de caldo
Mueller-Hinton (Difco) conteniendo glucosa al 0,25%.
Se controló el crecimiento bacteriano cada 30 minutos siguiendo la
DO_{620}. Se dejó crecer las bacterias hasta que la DO alcanzó el
valor de 0,3-0,4. El cultivo se centrifugó durante
10 minutos a 10000 rpm. Se descartó el sobrenadante, y las bacterias
se lavaron una vez con PBS, se volvieron a suspender en PBS
conteniendo formaldehido al 0.025% y se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente y a continuación durante la noche a 4ºC con
agitación. Se añadieron 100 \mul de células bacterianas a cada
pocillo de una placa Greiner de 96 pocillos y se incubaron durante
la noche a 4ºC. A continuación los pocillos se lavaron tres veces
con tampón de lavado PBT (Tween-20 al 0,1% en PBS).
Se añadieron 200 \mul de tampón de saturación
(Polivinilpirrolidona 10 al 2,7% en agua) a cada pocillo y las
placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Los pocillos se lavaron
tres veces con PBT. 200 \mul del suero diluido (tampón de
dilución: BSA al 1%, Tween-20 al 0,1%, NaN_{3} al
0,1% en PBS) se añadieron a cada pocillo, y las placas se incubaron
durante 90 minutos a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con
PBT. 100 \mul de suero de conejo anti-ratón
conjugado con HRP (Dako) diluidos 1:2000 en tampón de dilución se
añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron durante 90
minutos a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón PBT
buffer. 100 \mul de tampón sustrato para HRP (25 ml de tampón
citrato pH 5, 10 mg de O-fenildiamina y 10 \mul
de H_{2}O) se añadieron a cada pocillo y las placas se dejaron a
temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron 100 \mul de
H_{2}SO_{4} a cada pocillo, y se siguió la DO_{490}. El ELISA
se consideró positivo cuando la DO_{490} fue 2,5 veces la
correspondiente del suero preinmune.
Se plaqueó la cepa MenB M7 acapsulada en placas
de agar chocolate y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se
recogieron las colonias bacterianas de las placas de agar usando un
hisopo dracon estéril y se inocularon en 4 tubos que contenían cada
uno 8 ml de caldo Mueller-Hinton (Difco) conteniendo
glucosa al 0,25%. Se controló el crecimiento bacteriano cada 30
minutos siguiendo la DO_{620}. Se dejó crecer las bacterias hasta
que la DO alcanzó el valor de 0,35-0,5. El cultivo
se centrifugó durante 10 minutos a 4000 rpm. Se descartó el
sobrenadante, y el residuo se volvió a suspender en tampón de
bloqueo (BSA al 1%, NaN_{3} al 0,4%) y se centrifugó durante 5
minutos a 4000 rpm. Las células se volvieron a suspender en tampón
de bloqueo para alcanzar una DO_{620} de 0,07. 100 \mul de
células bacterianas se añadieron a cada pocillo de una placa Costar
de 96 pocillos. 100 \mul de suero diluido (1:200) (en tampón de
bloqueo) se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron
durante 2 horas a 4ºC. Las células se centrifugaron durante 5
minutos a 4000 rpm, se aspiró el sobrenadante, y las células se
lavaron por adición de 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo en
cada pocillo. 100 \mul de F(ab)_{2} cabra
anti-ratón conjugado con
R-Phicoerytrin diluido 1:100, se añadieron a cada
pocillo, y placas se incubaron durante 1 hora a 4ºC. Las células se
rompieron por centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos y se
lavaron por adición de 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo. Se
aspiró el sobrenadante y las células se volvieron a suspender en
200 \mul/pocillo de PBS, formaldehido al 0,25%. Las muestras se
transfirieron a tubos FACScan y se leyeron. El estado el escenario
FACScan fue: FL1 on, FL2y FL3 off; umbral FSC-H:
92; Voltaje FSC PMT: E 02; SSC PMT: 474; Ganancia de amplificado
7,1; FL-2 PMT: 539. Valores de
compensación: 0.
compensación: 0.
Las bacterias se hicieron crecer durante la
noche en 5 placas GC, se cosecharon con un asa de siembra y se
volvieron a suspender en 10 ml de Tris-HCl 20 mM. Se
realizó inactivación por calor a 56ºC durante 30 minutos y las
bacterias se rompieron con sonicación durante 10 minutos sobre hielo
(50% ciclo de carga, 50% sin carga). Las células sin romper se
retiraron por centrifugación a 5000 g durante 10 minutos y se
recuperó la fracción total de cubiertas celulares mediante
centrifugación a 50000 g a 4ºC durante 75 minutos. Para extraer las
proteínas de la membrana citoplasmática de las membranas exteriores
brutas, la fracción completa se volvió a suspender en sarkosilo al
2% (Sigma) y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. La
suspensión se centrifugó a 10000 g durante 10 minutos para eliminar
agregados, y el sobrenadante se ultracentrifugó adicionalmente a
50000 g durante 75 minutos para aglomerar las membranas externas.
Las membranas externas se volvieron a suspender en
Tris-HCl 10 mM, pH8 y se midió la concentración de
proteínas con el ensayo Bio-Rad Protein, usando BSA
como patrón.
Las bacterias se hicieron crecer durante la
noche en una placa GC, se cosecharon con un asa de siembra y se
volvieron a suspender en 1 ml de Tris-HCl 20 mM. La
inactivación por calor se realizó a 56ºC durante 30 minutos.
Proteínas purificadas (500 ng/hilera, vesículas
de la membrana externa (5 \mug) y extractos celulares totales
(25
\mug) derivados de la cepa MenB 2996 se cargaron en SDS-PAGE al 15% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La transferencia se realizó durante 2 horas a 150 mA a 4ºC, en tampón de transferencia (base Tris al 0,3%, glicina al 1,44%, metanol al 20%). La membrana se saturó por incubación durante la noche a 4ºC en tampón de saturación (leche desnatada al 10%, Triton X100 al 0,1% en PBS). La membrana se lavó dos veces con tampón de lavado (leche desnatada al 3%, Triton X100 al 0,1% en PBS) y se incubó durante 2 horas a 37ºC con suero de ratón diluido 1:200 en tampón de lavado. La membrana se lavó dos veces y se incubó durante 90 minutos con una dilución 1:2000 de Ig anti-ratón marcada con peroxidasa de rábano picante. La membrana se lavó dos veces con Triton X100 al 0,1% en PBS y se reveló con el kit Opti-4CN Substrate Kit (Bio-#Rad). Se detuvo la reacción añadiendo agua.
\mug) derivados de la cepa MenB 2996 se cargaron en SDS-PAGE al 15% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La transferencia se realizó durante 2 horas a 150 mA a 4ºC, en tampón de transferencia (base Tris al 0,3%, glicina al 1,44%, metanol al 20%). La membrana se saturó por incubación durante la noche a 4ºC en tampón de saturación (leche desnatada al 10%, Triton X100 al 0,1% en PBS). La membrana se lavó dos veces con tampón de lavado (leche desnatada al 3%, Triton X100 al 0,1% en PBS) y se incubó durante 2 horas a 37ºC con suero de ratón diluido 1:200 en tampón de lavado. La membrana se lavó dos veces y se incubó durante 90 minutos con una dilución 1:2000 de Ig anti-ratón marcada con peroxidasa de rábano picante. La membrana se lavó dos veces con Triton X100 al 0,1% en PBS y se reveló con el kit Opti-4CN Substrate Kit (Bio-#Rad). Se detuvo la reacción añadiendo agua.
Se hizo crecer la cepa MC58 durante la noche a
37ºC en placas de agar chocolate. Se recogieron 5-7
colonias que se usaron para inocular 7 ml de caldo
Mueller-Hinton. La suspensión se incubó a 37ºC en un
nutator y se dejó crecer hasta que la DO_{620} estuvo comprendida
entre 0,5-0,8. El cultivo repartió en alícuotas en
tubos Eppendorf estériles de 1,5 ml y se centrifugó durante 20
minutos a máxima velocidad en una microcentrífuga. El residuo se
lavó una vez en tampón de Gey (Gibco) y se volvió a suspender en el
mismo tampón hasta una DO_{620} de 0,5, se diluyó 1:20000 en
tampón de Gey y se almacenó a 25ºC.
Se añadieron 50 \mul de tampón de Gey/BSA al
1% a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96
pocillos. Se añadieron 25 \mul de suero de ratón diluido (1:100)
(tampón de dilución: tampón de Gey/BSA al 0,2%) a cada pocillo y la
placa se incubó a 4ºC. Se añadieron 25 \mul a cada pocillo de la
suspensión bacteriana anteriormente descrita. Se añadieron a cada
pocillo 25 \mul de complemento de cría de conejo bien inactivada
por calor (baño de agua a 56ºC durante 30 minutos) o normal.
Inmediatamente tras la adición del complemento de cría de conejo,
se plaquearon
22 \mul de cada muestra/pocillo en placas de agar Mueller-Hinton (tiempo 0). La placa de 96 pocillos se incubó durante 1 hora a 37ºC con rotación y a continuación 22 \mul de cada muestra/pocillo se plaquearon en placas de agar Mueller-Hinton (tiempo 1). Tras incubación durante la noche se contaron las colonias correspondientes al tiempo 0 y al
tiempo 1 h.
22 \mul de cada muestra/pocillo en placas de agar Mueller-Hinton (tiempo 0). La placa de 96 pocillos se incubó durante 1 hora a 37ºC con rotación y a continuación 22 \mul de cada muestra/pocillo se plaquearon en placas de agar Mueller-Hinton (tiempo 1). Tras incubación durante la noche se contaron las colonias correspondientes al tiempo 0 y al
tiempo 1 h.
Las siguientes secuencias de ADN y aminoácido se
identifican por los títulos de la siguiente forma: [g, m, o a]
[#].[sec o pep], en la que "g" significa una secuencia
procedente de N. gonorrhoeae, "m" significa una
secuencia procediente de N. meningitidis B, y "a"
significa una secuencia procediente de N. meningitidis A;
"#" significa el número de la secuencia; "sec" significa
una secuencia de ADN, y "pep" significa una secuencia de
aminoácido. Por ejemplo, "g001.sec" se refiere a una secuencia
de ADN de N. gonorrohoeae número 1. La presencia del
sufijo
"-1" o "-2" en dichas secuencias indica una secuencia adicional encontrada en el mismo ORF. Además, los marcos de lectura abiertos se identifican como ORF #, en el que "#" significa el número del ORF, correspondiente al número de la secuencia que codifica el ORF, y las designaciones del ORF pueden tener un sufijo con ".ng" o ".a", indicando que el ORF corresponde a una secuencia de N. gonorrhoeae o a una secuencia de N. meningitidis A respectivamente. Se realizó análisis asistido por ordenador durante las comparaciones que siguen entre las secuencias de péptido
"g", "m", y "a" y en estas el sufijo "pep" queda implícito dónde no se define expresamente.
"-1" o "-2" en dichas secuencias indica una secuencia adicional encontrada en el mismo ORF. Además, los marcos de lectura abiertos se identifican como ORF #, en el que "#" significa el número del ORF, correspondiente al número de la secuencia que codifica el ORF, y las designaciones del ORF pueden tener un sufijo con ".ng" o ".a", indicando que el ORF corresponde a una secuencia de N. gonorrhoeae o a una secuencia de N. meningitidis A respectivamente. Se realizó análisis asistido por ordenador durante las comparaciones que siguen entre las secuencias de péptido
"g", "m", y "a" y en estas el sufijo "pep" queda implícito dónde no se define expresamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se predijeron los siguientes ORF a partir de las
secuencias contig y/o las secuencias de longitud completa usando
los procedimientos descritos en el presente documento.
- ORF:
- CONTIG
- 279
- gnm4.sec
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 2>:
m279.sec
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 3; ORF 279>:
m279.pep
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 4>:
g279.sec
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 5; ORF 279.ng>:
g279.pep
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El ORF 279 muestra una identidad del 89,5% sobre
un solapamiento del aa 152 con un ORF predicho
(ORF 279.ng) procedente de N. gonorrhoeae:
(ORF 279.ng) procedente de N. gonorrhoeae:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 6>:
a.279.sec
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 7; ORF 279.a>:
a279.pep
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
m279/a279 Los ORF 279 y 279.a mostraron una
identidad del 88,2% en el solapamiento del aa 152
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 8>
m519.sec (parcial)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 9; ORF 519>:
m519.pep (parcial)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 10>
g519.sec
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
>SEC DE ID 11; ORF 519.ng>:
g519.pep
El ORF 519 muestra una identidad del 87,5% sobre
un solapamiento del aa 200 con un ORF predicho (ORF 519.ng)
procedente de N. gonorrhoeae:
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 12>:
a519.sec
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 13; ORF 519.a>:
a519.pep
\vskip1.000000\baselineskip
m519/a519 Los ORF 519 y 519.a mostraron una
identidad del 99,5% en el solapamiento del aa 199
\vskip1.000000\baselineskip
El trabajo reveló además la siguiente secuencia
de ADN identificada en N. meningitidis <SEC DE ID
14>:
m519.1.sec
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 15; ORF 519-1>:
m519-1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia de ADN en
N. gonorrhoeae <SEC DE ID 16>:
g519-1.sec
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 17; ORF 519-1.ng>:
g519-1.pep
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
m519-1/g519-1
Los ORF 519-1 y 519-1.ng mostraron
una identidad del 99,0% en el solapamiento del aa 315
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia de ADN en
N. meningitidis <SEC DE ID 18>:
a519-1.sec
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 19; ORF 519-1.a>:
a519-1.pep.
\vskip1.000000\baselineskip
m519-1/a519-1
Los ORF 519-1 y 519-1.a mostraron
una identidad del 99,0% en el solapamiento del aa 315
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 20>:
m576.sec.. (parcial)
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 21; ORF 576>:
m576.pep.. (parcial)
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 22>:
g576.sec.. (parcial)
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SECDE ID 23; ORF 576.ng>:
g576.pep.. (parcial)
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis asistido por ordenador de esta
secuencia de aminoácidos proporcionó los siguientes resultados:
m576/g576 Identidad del 97,2% en el solapamiento
del aa 215
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 24>
a576.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 25; ORF 576.a>:
a576.pep
\vskip1.000000\baselineskip
m576/a576 Los ORF 576 y 576.a mostraron una
identidad del 99,5% en el solapamiento del aa 222
El trabajo adicional reveló la siguiente
secuencia de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 26>:
m576-1.sec
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 27; ORF 576-1>:
m576-1.pep
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia de ADN en
N. gonorrhoeae <SEC DE ID 28>:
g576-1.sec
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 29; ORF 576-1.ng>:
g576-1.pep
g576-1/m576-1
Los ORF 576-1 y 576-1.ng mostraron
una identidad del 97,8% en el solapamiento del aa 272
Se identificó la siguiente secuencia de ADN en
N. meningitidis <SEC DE ID 30>:
a576-1.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 31; ORF 576-1.a>:
a576-1.pep
a576-1/m576-1
Los ORF 576-1 y 576-1.a mostraron
una identidad del 99,6% en el solapamiento del aa 272
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 32>
m919.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 33; ORF 919>:
m919.pep
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 34>:
m919-2.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 35; ORF 919-2>:
m919-2.pep
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 36>:
g919.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 37; ORF 919.ng>:
g919.pep
\newpage
El ORF 919 muestra una identidad del 95,9% sobre
un solapamiento del aa 441 con un ORF predicho (ORF 919.ng)
procedente de N. gonorrhoeae:
m919/g919
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 38>:
a919.sec
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 39; ORF 919.a>:
a919.pep
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
m919/a919 Los ORF 919 y 919.a mostraron una
identidad del 98,6% en el solapamiento del aa 441
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 40>:
m121.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 41; ORF 121>:
m121.pep
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 42>:
g121.sec
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 43; ORF 121.ng>:
g121.pep
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El ORF 121 muestra una identidad del 73,5% sobre
un solapamiento del aa 366 con un ORF predicho (ORF121.ng)
procedente de N. gonorrhoeae:
m121/g121
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 44>:
a121.sec
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 45; ORF 121.a>:
a121.pep
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
m121/a121 Los ORF 121 y 121.a mostraron una
identidad del 74,0% en el solapamiento del aa 366
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El trabajo adicional reveló la secuencia de ADN
identificada en N. meningitidis <SE DE ID 46>:
m121-1.sec
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 47; ORF 121-1>:
m121-1.pep
\vskip1.000000\baselineskip
m121-1/g121 Los ORF
121-1 y 121.ng mostraron una identidad del 95,6% en
el solapamiento del aa 366
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 48>:
a121-1.sec
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 49; ORF 121-1.a>:
a121-1.pep
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
m121-1/a121-1
Los ORF 121-1 y 121-1.a mostraron
una identidad del 96,4% en el solapamiento del aa 366
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
128 y 128-1
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 50>
m128.sec (parcial)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 51; ORF 128>:
m128.pep (parcial)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 52>
g128.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 53; ORF 128.ng>:
g128.pep
El ORF 128 muestra una identidad del 91,7% sobre
un solapamiento del aa 475 con un ORF predicho (ORF 128.ng)
procedente de N. gonorrhoeae:
m128/g128
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 54>:
a128.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 55; ORF 128.a>:
a128.pep
\newpage
m128/a128 Los ORF 128 y 128.a mostraron una
identidad del 66,0% en el solapamiento del aa 677
\vskip1.000000\baselineskip
El trabajo adicional reveló la secuencia de ADN
identificada en N. meningitidis <SEC DE ID 56>:
m128-1.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 57; ORF 128-1>:
m128-1.pep.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 58>:
g128-1.sec (parcial)
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 59; ORF 128-1.ng>:
m128.sec (parcial)
\vskip1.000000\baselineskip
m128-1/g128-1
Los ORF 128-1 y 128-1.ng mostraron
una identidad del 94,5% en el solapamiento del aa 491
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia de ADN en
N. meningitidis <SEC DE ID 60>
a128-1.sec
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 61; ORF 128-1.a>:
a128-1.pep
m128-1/a128-1
Los ORF 128-1 y 128-1.a mostraron
una identidad del 97,8% en el solapamiento del aa 677
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 62>
m206.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 63; ORF 206>:
m206.pep..
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la secuencia parcial de ADN en
N. gonorrhoeae <SEC DE ID 64>:
g206.sec
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 65; ORF 206.ng>:
g206.pep
\vskip1.000000\baselineskip
El ORF 206 muestra una identidad del 96,0% sobre
un solapamiento del aa 177 con un ORF predicho (ORF 206.ng)
procedente de N. gonorrhoeae:
m206/g206
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 66>:
a206.sec
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 67; ORF 206.a>:
a206.pep..
\newpage
m206/a206 Los ORF 206 y 206.a mostraron una
identidad del 99,4% en el solapamiento del aa 177
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 68>:
m287.sec
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 69; ORF 287>:
m287.pep
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 70>:
g287.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 71; ORF 287.ng>:
g287.pep
m287/g287 Los ORF 287 y 287.ng mostraron una
identidad del 70,1% en el solapamiento del aa 499
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 72>:
a287.sec
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 73; ORF 287.a>:
a287.pep
m287/a287 Los ORF 287 y 287.a mostraron una
identidad del 77,2% en el solapamiento del aa 501
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 74>:
m406.sec
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 75; ORF 406>:
m406.pep
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 76>:
g406.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 77; ORF 406.ng>:
g406.pep
El ORF 406.ng muestra una identidad del 98,8%
sobre un solapamiento del aa 320 con un ORF predicho (ORF 406.a)
procedente de N. gonorrhoeae:
g406/m406
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 78>:
a406.sec
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 79; ORF 406.a>:
a406.pep
\newpage
m406/a406 Los ORF 406 y 406.a mostraron una
identidad del 98,8% en el solapamiento del aa 320
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 80>:
m726.sec
\newpage
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
>SEC DE ID 81; ORF 726>:
m726.pep
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 82>:
m907-2.sec
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 83; ORF 907-2>:
m907-2.pep
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 84>:
m953.sec
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 85; ORF 953>:
m953.pep
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 86>:
orfl-1.sec
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 87; ORF oral-1>:
orfl-1.pep
\newpage
Se identificó la siguiente secuencia parcial de
ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 88>:
orf46-2.sec
\vskip1.000000\baselineskip
Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos
<SEC DE ID 89; ORF orf46-2>:
orf46-2.pep
\newpage
Usando los procedimientos anteriormente
descritos, se emplearon los siguientes cebadores de oligonucleótidos
en el ensayo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el
fin de clonar los ORF según se ha indicado:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF
919 para localizar y clonar el ORF 919. Se clonó el gen 919
predicho en el vector pET y se expresó en E. coli. Se analizó
el producto de expresión y purificación de la proteína mediante
SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de
la purificación de la proteína de fusión 919-His.
Se inmunizaron los ratones con la 919-His purificada
y se usó el suero para la inmunotransferencia occidental (panel B),
el análisis FACS (panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el
ensayo ELISA (panel E). Símbolos: M1, marcador de peso molecular;
PP, proteína purificada, TP, extracto de proteína total de N.
meningitidis; OMV, preparación de vesículas de membrana externa
de N. meningitidis. Las flechas indican la posición del
producto de proteína recombinante principal (A) y la banda
inmunorreactiva de N. meningitidis (B). Estos experimentos
confirman que 919 es una proteína expuesta a la superficie y que es
un inmunógeno útil. En la Figura 10 se proporcionan las
representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y
las regiones anfipáticas de ORF 919. Se usó el programa AMPHI para
predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989,
J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human
Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl
11:9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos
nucleicos de ORF 919 y por tanto la secuencia de aminoácidos
codificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF
279 para localizar y clonar ORF 279. Se clonó el gen 279 predicho
en el vector pGex y se expresó en E. coli. Se analizó el
producto de expresión y purificación de la proteína mediante
SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de
la purificación de 279-GST. Se inmunizaron los
ratones con la 279-GST purificada y se usó el suero
para el análisis de la inmunotransferencia occidental (panel B), el
análisis FACS (panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el
ensayo ELISA (panel E). Símbolos: M1, marcador de peso molecular;
TP, extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV,
preparación de vesículas de membrana externa de N.
meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de
proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de
N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que 279 es
una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil.
En la Figura 11 se proporcionan las representaciones gráficas de la
hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF
279. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos
de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y
col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992,
Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la
secuencia de ácidos nucleicos de ORF 279 y por tanto la secuencia
de aminoácidos codificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF
576 para localizar y clonar ORF 576. Se clonó el gen 576
predicho en el vector pGex y se expresó en E. coli. Se
analizó el producto de purificación de la proteína mediante
SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de
la purificación de la proteína de fusión 576-GST.
Se inmunizaron los ratones con la 576-GST purificada
y se usó el suero para la inmunotransferencia occidental (panel B),
el análisis FACS (panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el
ensayo ELISA (panel E). Símbolos: M1, marcador de peso molecular;
TP, extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV,
preparación de vesículas de membrana externa de N.
meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de
proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de
N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que ORF
576 es una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno
útil. En la Figura 12 se proporcionan las representaciones gráficas
de la hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas
de ORF 576. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos
epitopos de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007;
Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y
col. 1992, Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se
proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF 279 y por tanto
la secuencia de aminoácidos codificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF
519 para localizar y clonar ORF 519. Se clonó el gen 519
predicho en el vector pEt y se expresó en E. coli. Se analizó
el producto de purificación de la proteína mediante
SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de
la purificación de la proteína de fusión 510-His.
Se inmunizaron los ratones con la 519-His purificada
y se usó el suero para la inmunotransferencia occidental (panel B),
el análisis FACS (panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el
ensayo ELISA (panel E). Símbolos: M1, marcador de peso molecular;
TP, extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV,
preparación de vesículas de membrana externa de N.
meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de
proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de
N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que 519 es
una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil.
En la Figura 13 se proporcionan las representaciones gráficas de la
hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF
519. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos
de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y
col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992,
Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la
secuencia de ácidos nucleicos de ORF 519 y por tanto la secuencia
de aminoácidos codificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF
121 para localizar y clonar ORF 121. Se clonó el gen 121
predicho en el vector pEt y se expresó en E. coli. Se analizó
el producto de purificación de la proteína mediante
SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de
la purificación de la proteína de fusión 121-His.
Se inmunizaron los ratones con la 121-His purificada
y se usó el suero para el análisis de la inmunotransferencia
occidental (panel B), el análisis FACS (panel C), el ensayo
bactericida (panel D), y el ensayo ELISA (panel E). Los resultados
muestran que 121 es una proteína expuesta a la superficie. Símbolos:
M1, marcador de peso molecular; TP, extracto de proteína total de
N. meningitidis; OMV, preparación de vesículas de membrana
externa de N. meningitidis. Las flechas indican la posición
del producto de proteína recombinante principal (A) y la banda
inmunorreactiva de N. meningitidis (B). Estos experimentos
confirman que 121 es una proteína expuesta a la superficie y que es
un inmunógeno útil. En la Figura 14 se proporcionan las
representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y
las regiones anfipáticas de ORF 121. Se usó el programa AMPHI para
predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989, J.
Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses
12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl 11: 9). En el
Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF
121 y por tanto la secuencia de aminoácidos codificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF
128 para localizar y clonar ORF 128. Se clonó el gen 128
predicho en el vector pEt y se expresó en E. coli. Se analizó
el producto de purificación de la proteína mediante
SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de
la purificación de la 128-His. Se inmunizaron los
ratones con la 128-His purificada y se usó el suero
para la inmunotransferencia occidental (panel B), el análisis FACS
(panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el ensayo ELISA (panel
E). Los resultados muestran que 128 es una proteína expuesta a la
superficie. Símbolos: M1, marcador de peso molecular; TP, extracto
de proteína total de N. meningitidis; OMV, preparación de
vesículas de membrana externa de N. meningitidis. Las
flechas indican la posición del producto de proteína recombinante
principal (A) y la banda inmunorreactiva de N. meningitidis
(B). Estos experimentos confirman que 128 es una proteína expuesta a
la superficie y que es un inmunógeno útil. En la Figura 15 se
proporcionan las representaciones gráficas de la hidrofilia, el
índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF 128. Se usó el
programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos de las células
T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS
Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol
Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos
nucleicos de ORF 128 y por tanto la secuencia de aminoácidos
codificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF
206 para localizar y clonar ORF 206. Se clonó el gen 206
predicho en el vector pEt y se expresó en E. coli. Se analizó
el producto de purificación de la proteína mediante
SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de
la purificación de 206-His. Se inmunizaron los
ratones con la 206-His purificada y se usó el suero
para la inmunotransferencia occidental (panel B). No tiene mayor
importancia que la banda inmunorreactiva en los extractos de
proteínas del meningococo sea de 38 kDa en vez de 17 kDa (panel A).
Para obtener información sobre la naturaleza de esta tinción de
anticuerpo los inventores expresaron ORF 206 en E. coli sin
la etiqueta His e incluyeron el péptido líder predicho. Los
análisis de inmunotransferencia sobre los extractos de proteína
total de E. coli que expresaban esta forma nativa de la proteína
206 mostraron una banda reactiva en una posición de 38 kDa, tal
como se observó en meningococo. Los inventores concluyen que la
banda de 38 kDa en el panel B) es específica y que los anticuerpos
anti-206, reconocen probablemente un complejo de
proteínas multiméricas. En el panel C se muestra el análisis FACS,
en el panel D el ensayo bactericida, y en el panel E el ensayo
ELISA. Los resultados muestran que 206 es una proteína expuesta a
la superficie. Símbolos: M1, marcador de peso molecular; TP,
extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV,
preparación de vesículas de membrana externa de N.
meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de
proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de
N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que 206 es
una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil.
En la Figura 16 se proporcionan las representaciones gráficas de la
hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF
519. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos
de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y
col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992,
Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la
secuencia de ácidos nucleicos de ORF 206 y por tanto la secuencia
de aminoácidos codificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF
287 para localizar y clonar ORF 287. Se clonó el gen 287 predicho
en el vector pGex y se expresó en E. coli. Se analizó el
producto de purificación de la proteína mediante
SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de
la purificación de la proteína de fusión 287-GST. Se
inmunizaron los ratones con la 287-GST purificada y
se usó el suero para el análisis FACS (panel B), el ensayo
bactericida (panel C), y el ensayo ELISA (panel D). Los resultados
muestran que 287 es una proteína expuesta a la superficie.
Símbolos: M1, marcador de peso molecular. Las flechas indican la
posición del producto de proteína recombinante principal (A). Estos
experimentos confirman que 287 es una proteína expuesta a la
superficie y que es un inmunógeno útil. En la Figura 17 se
proporcionan las representaciones gráficas de la hidrofilia, el
índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF 287. Se usó el
programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos de las células
T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS
Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol
Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos
nucleicos de ORF 287 y por tanto la secuencia de aminoácidos
codificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF
406 para localizar y clonar ORF 406. Se clonó el gen 406
predicho en el vector pEt y se expresó en E. coli. Se analizó
el producto de purificación de la proteína mediante
SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de
la purificación de la proteína de fusión 406-His.
Se inmunizaron los ratones con la 406-His purificada
y se usó el suero para el análisis de inmunotransferencia
occidental (panel B), el análisis FACS (panel C), el ensayo
bactericida (panel D), y el ensayo ELISA (panel E). Los resultados
muestran que 406 es una proteína expuesta a la superficie. Símbolos:
M1, marcador de peso molecular; TP, extracto de proteína total de
N. meningitidis; OMV, preparación de vesículas de membrana
externa de N. meningitidis. Las flechas indican la posición
del producto de proteína recombinante principal (A) y la banda
inmunorreactiva de N. meningitidis (B). Estos experimentos
confirman que 406 es una proteína expuesta a la superficie y que es
un inmunógeno útil. En la Figura 18 se proporcionan las
representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y
las regiones anfipáticas de ORF 406. Se usó el programa AMPHI para
predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989, J.
Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses
12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl 11: 9). En el
Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF
406 y por tanto la secuencia de aminoácidos codificada.
Se pretende que los anteriores ejemplos
ilustren, pero no limiten la invención.
Claims (8)
1. Una proteína constituida por la secuencia de
aminoácidos codificada por los nucleótidos 1363680 a 1364114 de la
SEC DE ID Nº: 1.
2. Una proteína constituida por una secuencia de
aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos codificada
por los nucleótidos 1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1, cuya
secuencia tiene un 95% o más de identidad con la secuencia de
aminoácidos codificada por los nucleótidos 1363680 a 1364114 de la
SEC DE ID Nº: 1.
3. Un anticuerpo que se une a una proteína de
acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.
4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
5. El ácido nucleico que codifica una proteína
de acuerdo con la reivindicación 1, constituido por los nucleótidos
1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1.
6. Un vector de expresión que comprende el ácido
nucleico de la reivindicación 5.
7. El ácido nucleico constituido por una
secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ácidos
nucleicos según se define en la reivindicación 5.
8. Una composición que comprende una proteína,
un ácido nucleico, o un anticuerpo de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior.
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