CN113136444B - 医用食品中海氏肠球菌的微滴数字pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针引物，包括：海氏肠球菌引物正向序列：5'‑CCACTCAGCTTGATGTAA‑3'；反向序列：5'‑GTTTGTTCAATAATCTTCAGATC‑3'；探针序列：5'‑6‑FAM‑ACAACAGCACCACGACGAT‑TAMRA‑3'；一种医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：称取25 g样品至盛有225 mL无菌水的均质袋中，充分混匀后10倍梯度稀释，得到待测样品；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；获得鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针；将所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液后进行检测与分析。结果表明该引物对海氏肠球菌的扩增具有特异性；同时微滴数字PCR对其扩增稳定，具有重复性；取浓度为102‑107copies/µL的质粒标准品、102‑107 CFU/mL的菌液纯培养物及含有海氏肠球菌浓度为103‑107 CFU/g的模拟污染样品进行检测，灵敏度较好。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法。
背景技术
微滴数字PCR的工作原理在于将被标记的样品分割形成若干独立的反应体系，每个独立反应体系中不含或含有一个及以上待测靶标序列，含有待测靶标的为阳性，不含待测靶标的为阴性。在每个独立反应体系中对被标记的样品进行PCR反应，反应到达终点后，含有待测基因靶标的反应体系中可检测到荧光信号，不含待测基因靶标时没有信号积累，读取阴性、阳性微滴的数量后传至数据处理软件得到最终结果。微滴数字PCR精准性高、检出限低、重复性及稳定性好。其灵敏度优于传统方法及qPCR等方法，可达到qPCR方法的10倍甚至更高；在一定检测范围内，线性关系良好，标准偏差小，准确度高，且不同实验室或检测机构间重复实验结果波动小。在检测过程中只需读取最终结果，不需要依赖标准曲线，可以避免制作标准曲线过程中引起的检测误差，也可减少实验成本。数字PCR检测所需时间短，从提取DNA到完成检测仅需1 d，弥补了传统培养法耗时久的缺陷。
海氏肠球菌（Enterococcus hirae）可产乳酸链球菌素Nisin，能够作为潜在益生菌用于养殖中抗致病性弧菌，但由于部分海氏肠球菌能够引起心内膜炎、细菌性肺炎等感染性疾病，并且具有多重抗药性，对人体健康能够造成一定危险，因此对食品中海氏肠球菌的检测有着重要的意义。本发明基于海氏肠球菌gyrb基因序列设计引物探针，建立了数字PCR检测方法，为海氏肠球菌在医用食品中的定量检测提供参考。
发明内容
本发明是为了解决现有方法对海氏肠球菌检测过程中定量检测限较高、耗时较久等问题，建立一种快速、灵敏度高的医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法。
医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：
1）海氏肠球菌标准菌株使用MRS液体培养基，37 °C静置培养18 h得到海氏肠球菌纯培养液；其他非目标菌株使用LB液体培养基37 °C培养24 h；称取25 g样品至有225 mL无菌水的无菌均质袋中，充分混匀后10倍梯度稀释；
2）分别取1 mL阳性对照、阴性对照、待测样品提取DNA；
3）获得鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针；
4）将步骤2中所得DNA进行微滴式数字PCR扩增，反应体系为：2× ddPCR Supermixfor Probes（No dUTP）10 µL、引物（10 µM）各0.4 µL、探针（10 µM）0.4 µL、DNA模版1 µL，ddH2O补足至20 µL。充分混匀后轻微离心，20 µL混合液全量转移至Bio-Rad DG8TM 微滴生成卡中，去除其中气泡，添加70 µL微滴生成油，固定微滴生成卡衬垫后，放置于QX100TMDroplet Generator仪器中生成油包水液滴。生成后微滴全量转移至96孔板中，封膜后使用普通PCR仪进行扩增反应。PCR反应程序为：95°C 10 min，1个循环；95 °C 30 s，56°C 30 s，40个循环；98°C 10 min，1个循环；12 °C降温保存产物。
5）反应结束后使用QX100TM Droplet Reader对步骤4）中反应液读取微滴数及荧光信号，并进行数据处理。
步骤3）中所述的鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针，包括：海氏肠球菌引物正向序列：5'-CCACTCAGCTTGATGTAA-3'；反向序列：5'-GTTTGTTCAATAATCTTCAGATC-3'；探针：5'-6-FAM-ACAACAGCACCACGACGAT-TAMRA-3'。
步骤1）中所述的非目标菌株为：粪肠球菌（CCTCC AB2012096）、屎肠球菌（CCTCCAB2018155）、鸟肠球菌（ATCC 14025）、铅黄肠球菌（ATCC 700327）、鹑鸡肠球菌（ATCC49573）、戊糖片球菌（实验室分离）、植物乳杆菌（ATU 8014）、鼠李糖乳杆菌（ATU 7469）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠希埃氏菌（ATCC 25922）、肠沙门氏菌（CICC 10982）、蜡样芽孢杆菌（ATCC 11778-VA-1）、枯草芽孢杆菌（CCTCC WB2008974）；37°C培养24 h。
步骤2）中所述的提取使用细菌基因组DNA提取试剂盒（索莱宝），具体包括以下步骤：取样品或菌液1 mL，12,000 rpm离心1 min，去除上清；加入200 µL溶液A，使菌体充分悬浮后加入20 µL RNase A（10 mg/mL），充分颠倒混匀，室温放置15-30 min。向管中加入20 µL蛋白酶K（10 mg/mL），充分混匀，55°C消化30-60 min，颠倒混匀数次。加入200 µL溶液B，充分颠倒混匀；加入200 µL无水乙醇，充分混匀，将溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱中，静置2 min。12,000 rpm离心2 min，弃废液；加入600 µL漂洗液，12,000 rpm离心1min，弃废液，重复两次。12,000 rpm离心2 min，将吸附柱敞口置于室温放置数分钟。将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加100 µL经 65°C水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12,000 rpm离心1 min；离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min，得到待测样品DNA。
附图说明：
图1 海氏肠球菌特异性实验实时荧光定量PCR荧光信号图。
图2 海氏肠球菌质粒标准品微滴数字PCR检测灵敏度梯度散点图。
图3 海氏肠球菌菌液纯培养物微滴数字PCR检测灵敏度梯度散点图。
图4 海氏肠球菌模拟污染样品微滴数字PCR检测灵敏度梯度散点图。
具体实施方式
实施例1 医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法
1、增菌培养
海氏肠球菌样品标准菌株使用MRS液体培养基，37 °C静置培养18 h得到海氏肠球菌纯培养液；其他非目标菌株使用LB液体培养基37 °C培养24 h；获得目标菌株纯培养物及对照组非目标菌株的增菌液。
所述的非目标菌株如下：粪肠球菌（CCTCC AB2012096）、屎肠球菌（CCTCCAB2018155）、鸟肠球菌（ATCC 14025）、铅黄肠球菌（ATCC 700327）、鹑鸡肠球菌（ATCC49573）、戊糖片球菌（实验室分离）、植物乳杆菌（ATU 8014）、鼠李糖乳杆菌（ATU 7469）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠希埃氏菌（ATCC 25922）、肠沙门氏菌（CICC 10982）、蜡样芽孢杆菌（ATCC 11778-VA-1）、枯草芽孢杆菌（CCTCC WB2008974）。
2、模拟污染样品制备
海氏肠球菌培养18 h后，取1 mL增菌液与24 g医用食品样品混合，添加至含有225mL无菌水的均质袋中，充分混匀得到模拟污染样品。
3、质粒标准品制备
使用普通PCR对海氏肠球菌进行扩增，上游引物 5'-CCACTCAGCTTGATGTAA-3'，下游引物 5'-GTTTGTTCAATAATCTTCAGATC-3'。反应体系：2×Taq PCR Master Mix II 12.5 µL、上游引物1 µL、下游引物1 µL、DNA模版1 µL，ddH2O补至25 µL。反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。2%琼脂糖凝胶电泳确定片段大小后进行胶回收。
1）胶回收使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒（TaKaRa），步骤如下：在紫外灯下切出含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，并尽量减小不含有DNA的凝胶体积，提高回收率。将含有目的DNA的凝胶称量并切碎后放入1.5 mL离心管中，每1 mg凝胶加入5 µL胶块溶解液 Buffer GM，混合均匀后置于室温溶解5-10 min，间断震荡混合，使胶块完全溶解，并加入终浓度为20%的异丙醇。将试剂盒中的Spin Column安置于 Collection Tube上，胶溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1 min，弃滤液，将滤液再加入 Spin Column 中再次离心。将 700 µL Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm 离心30 s，弃滤液，重复两次。将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1 min。将Spin Column安置于新的1.5 mL离心管上，在 Spin Column 膜的中央处加入30 µL 60 °C加热后的灭菌水或 Elution Buffer，室温静置1 min。室温12,000 rpm离心1 min洗脱 DNA，得到纯化后的DNA。
2）载体构建使用pMDTM18-T Vector Cloning Kit试剂盒（TaKaRa），步骤如下：在微量离心管中加入1 µL pMD18-T Vector、1 µL 纯化后的DNA、3 µL 无菌水、5 µL提前置于冰上溶解的Solution I，16 °C反应30 min。反应后试液用于后续大肠杆菌感受态制备。
3）大肠杆菌感受态制备使用E.coliDH5α Competent Cells（TaKaRa），步骤如下：E.coliDH5 α置于冰上融化，轻微混匀，取100 µL于1.5 mL离心管中，加入上一步骤中反应结束后的全部液体（10 µL）。冰中放置30 min，42 °C放置45 s，冰中放置2 min。向离心管中添加890 µL提前在37 °C预热的SOC培养基，37 °C振荡培养1 h，180 rpm。取培养后的菌液100 µL，在含有AMP（终浓度为100 µg/mL）的LB琼脂平板培养基上37°C培养过夜，挑取单菌落进行PCR及琼脂糖凝胶电泳，验证DNA片段大小。挑取单菌落接种至4 mL含有AMP（终浓度为50 µg/mL）的LB液体培养基中，37 °C、180 rpm振荡培养15 h。
4）质粒提取使用MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0（TaKaRa），步骤如下：取1 mL于37 °C、180 rpm振荡培养15 h的菌液，12,000 rpm离心2 min，弃上清。加入250 µL Solution I（含RNase A)，使用漩涡振荡器剧烈振荡使菌体充分悬浮。加入 250 µLSolution II轻轻上下翻转混合5次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。加入350 µL的4°C预冷的Solution III，轻轻上下翻转混合5次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2min。室温12,000 rpm离心10 min，取上清。将Spin Column 安置于Collection Tube上。将离心后的上清液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。将500 µL的Buffer WA加入Spin Column中，12,000 rpm离心30s，弃滤液。将700 µL的Buffer WB（已加入无水乙醇）加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 s，弃滤液，重复两次。重新将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心1 min，除尽残留洗液。将 Spin Column 安置于新的1.5 mL的离心管上，在 Spin Column 膜的中央处加入50 µL经过60°C 预热的ElutionBuffer， 室温静置 1 min。12,000 rpm 离心1 min后洗脱DNA，得到纯化后的质粒DNA。
4、DNA提取
使用细菌基因组DNA提取试剂盒（索莱宝），具体包括以下步骤：取样品或菌液1mL，12,000 rpm离心1 min，去除上清；加入200 µL溶液A，使菌体充分悬浮后加入20 µLRNase A（10 mg/mL），充分颠倒混匀，室温放置15-30 min。向管中加入20 µL蛋白酶K（10mg/mL），充分混匀，55 °C消化30-60 min，颠倒混匀数次。加入200 µL溶液B，充分颠倒混匀；加入200 µL无水乙醇，充分混匀，将溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱中，静置2 min。12,000rpm离心2 min，弃废液；加入600 µL漂洗液，12,000 rpm离心1min，弃废液，重复两次。12,000 rpm离心2 min，将吸附柱敞口置于室温或 50 °C温箱放置数分钟。将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加100 µL经 65°C水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12,000 rpm离心1 min；离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min，得到待测样品DNA。
5、实时荧光定量PCR扩增反应
上游引物 5'-CCACTCAGCTTGATGTAA-3'
下游引物 5'-GTTTGTTCAATAATCTTCAGATC-3'
探针 5'-6-FAM-ACAACAGCACCACGACGAT-TAMRA-3'
反应体系：TaKaRa Premix Ex Taq™ （Probe qPCR）10 µL, 引物（10 µM）各0.4 µL，探针（10 µM）0.4 µL，ROX 0.4 µL，DNA模版1 µL，ddH2O补足至20 µL。反应程序 95 ℃ 10min，1个循环；95℃ 5 s，56℃ 20 s，40个循环。
6、数字PCR扩增反应
1）引物及探针序列如下
上游引物 5'-CCACTCAGCTTGATGTAA-3'
下游引物 5'-GTTTGTTCAATAATCTTCAGATC-3'
探针 5'-6-FAM-ACAACAGCACCACGACGAT-TAMRA-3'
将得到如下的反应体系及扩增参数（使用Bio-Rad公司生产的试剂耗材）。
微滴数字PCR反应体系如下：
2× ddPCR Supermix for Probes：10µL；上游引物（10 µM）：0.4µL；下游引物（10µM）：0.4µL；探针（10 µM）：0.4µL；模版DNA：1µL；ddH2O：7.8µL。
2）微滴数字PCR反应程序
反应体系充分混匀后进行反应。反应程序为：95°C 10 min，1个循环；95 °C 30 s，56°C 30 s，40个循环；98°C 10 min，1个循环；12 °C降温保存产物。微滴读取荧光分析步骤采用FAM通道。
7、检测方法
1）实时荧光定量PCR扩增的特异性实验
对海氏肠球菌进行检测的同时，对粪肠球菌（CCTCC AB2012096）、屎肠球菌（CCTCCAB2018155）、鸟肠球菌（ATCC 14025）、铅黄肠球菌（ATCC 700327）、鹑鸡肠球菌（ATCC49573）、戊糖片球菌（实验室分离）、植物乳杆菌（ATU 8014）、鼠李糖乳杆菌（ATU 7469）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠希埃氏菌（ATCC 25922）、肠沙门氏菌（CICC 10982）、蜡样芽孢杆菌（ATCC 11778-VA-1）、枯草芽孢杆菌（CCTCC WB2008974）使用该方法进行检测，该方法能检出海氏肠球菌，实验结果见图1。结果表明上述引物探针对海氏肠球菌的扩增具有特异性。
2）质粒标准品微滴数字PCR检测灵敏度
测得浓度为1011 copies/µL的质粒标准品使用ddH2O进行10倍梯度稀释，得到浓度为101-107 copies/µL的DNA模版进行检测，结果见图2。结果表明，该方法能够检出浓度为102 copies/µL以上的海氏肠球菌质粒标准品。
3）菌液纯培养物微滴数字PCR检测灵敏度
将测得浓度为107CFU/m的菌液纯培养物DNA提取液使用ddH2O进行10倍梯度稀释，得到浓度为102-107 CFU/mL的DNA模版进行检测，结果见图3。结果表明，该方法能够检出浓度为102 CFU/mL以上的菌液纯培养物。
4）模拟污染样品微滴数字PCR检测灵敏度
将模拟污染浓度为107CFU/g的模拟污染样品DNA提取液使用ddH2O进行10倍梯度稀释，得到对应浓度为102-107 CFU/g的DNA模版进行检测，结果见图4。结果表明，该方法能够检出浓度为103 CFU/g以上的模拟污染样品。
序列表
<110> 临沂大学
<120> 医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccactcagct tgatgtaa 18
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtttgttcaa taatcttcag atc 23
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acaacagcac cacgacgat 19
Claims (1)
1.医用食品中海氏肠球菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：
1）海氏肠球菌样品标准菌株使用MRS液体培养基，37 °C静置培养24 h得到海氏肠球菌纯培养液；其他非目标菌株使用LB液体培养基37 °C培养24 h；称取25g样品至有225 mL无菌水的无菌均质袋中，充分混匀后10倍梯度稀释；
2）分别取1 mL阳性对照、阴性对照、待测样品提取DNA；
3）获得鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针；
4）将步骤2中所得DNA进行微滴式数字PCR扩增，反应体系为：不含dUTP 的2× ddPCRSupermix for Probes10 µL、10 µM的引物各0.4 µL、10 µM的探针0.4 µL、DNA模版1 µL，ddH2O补足至20 µL；充分混匀后轻微离心，20 µL混合液全量转移至Bio-Rad DG8微滴生成卡中，去除其中气泡，添加70 µL微滴生成油，固定微滴生成卡衬垫后，放置于QX100Droplet Generator仪器中生成油包水液滴；生成后微滴全量转移至96孔板中，封膜后使用普通PCR仪进行扩增反应；PCR反应程序为：95°C 10 min，1个循环；95 °C 30 s，56°C 30 s，40个循环；98°C 10 min，1个循环；12 °C降温保存产物；
5）反应结束后使用QX100 Droplet Reader对步骤4）中反应液读取微滴数及荧光信号，并进行数据处理；
步骤3）中所述的鉴定海氏肠球菌的PCR扩增引物及探针，包括：海氏肠球菌引物正向序列：5'-ccactcagcttgatgtaa-3'；反向序列：5'-gtttgttcaataatcttcagatc-3'；探针：5'-6-FAM-acaacagcaccacgacgat-TAMRA-3'。
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