CN111500753A

CN111500753A - 一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的rpa引物组合物和方法

Info

Publication number: CN111500753A
Application number: CN202010340645.5A
Authority: CN
Inventors: 范一灵; 王淑娟; 李琼琼; 宋明辉; 秦峰; 刘浩; 杨美成
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority date: 2020-04-26
Filing date: 2020-04-26
Publication date: 2020-08-07
Also published as: WO2021218006A1

Abstract

本发明公开了一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的RPA引物组合物和方法，该引物组合物用于检测stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e和stx2g共9种基因亚型，其包括序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4的引物对和序列为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12的引物对。本发明提供的方法操作简单，特异性好、灵敏度高，适合于现场快速检测，可在20min内完成核酸的检测，可以为监管部门对上市产品的监督检查和突发事件处理提供快速的筛查结果。同时，本发明首次设计、筛选的引物和探针组合可有效检测9种stx基因亚型，分别为stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e和stx2g基因。结合离心圆盘式微流控芯片技术可实现极小体积内(5μL)对食品、药品、畜牧养殖产品中STEC进行快速、高通量检测。

Description

一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的RPA引物组合物和方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的RPA 引物组合物和方法。

背景技术

产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)是一类可引起人类腹泻、肠出血、溶血性尿毒综合征、肾衰竭、溶血性贫血以及死亡的食源性致病微生物，可存在于水体、植物、动物尤其是反刍动物体内。食品中低于100CFU的STEC菌体就可能导致人类患病。STEC共有超400种血清型，美国疾控中心发布的数据显示，仅2016 年美国有5441例经确认的STEC感染事件，预估有超过26万名患者，导致30 人死亡。

目前，检测STEC的主要分子靶点是编码志贺毒素的stx基因。国际标准化组织(ISO)和美国农业部(USDA)均采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR) 对疑似含STEC的增菌培养物进行初筛。然而，RT-PCR方法需要温度在50℃-100℃ 间不停变化，反应速度慢，对相关检测设备要求较高，无法便携携带，较难满足基层实验室和现场快速检测的需求。

以恒温方式扩增目标核酸的方法被逐步应用于微生物检测领域。如环介导等温扩增技术(LAMP)、基于核酸序列的扩增技术(NASBA)、解旋酶依赖等温扩增技术(HAD)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和滚环扩增技术(RCA) 等。其中，RPA技术可在较低温度(38℃-42℃)快速扩增目标核酸，扩增速度快、准确度高，对设备要求低，可用于现场检测。

微流控芯片(Microfluidic chip)技术是在特殊材质的芯片上使用微米甚至纳米级微管道将样品制备、分散和检测等步骤进行集成的技术。因其具有微型化、集成化的特点，适用于微量的分子检测，可提高检测效率，节省试剂成本。离心式微流控芯片借助离心力将芯片中的液体经微孔道分散达到检测目的，摆脱了传统微流控芯片对加样器和压力泵的限制，操作简单，容易实现高通量和便携式检测。

stx基因亚型的突变和重组现象较普遍，其中，stx1基因三个亚型，分别为stx1a，stx1c，stx1d；尤其是stx₂基因，除stx_2a到stx_2g亚型外，新的亚型也不断被发现。虽然，也有研究人员开发了检测STEC的RPA方法(MURINDA SE,IBEKWE AM, ZULKAFFLY S,et al.,Real-Time Isothermal Detection of Shiga Toxin–Producing Escherichia coliUsing Recombinase Polymerase Amplification[J].Foodborne Pathogens&Disease,11(7):529-536)，但通过MEGA X比较其引物序列，该序列缺少简并碱基，与stx_2b、stx_2e、stx_2f、stx_2g等基因亚型无法完全匹配，其测试数据缺少可检测基因亚型的确认，该方法能检测的基因亚型范围不明确。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的RPA 引物组合物和方法，具体提供一种速度快、灵敏度高、特异性强的检测STEC的 RPA引物、探针及基于微流控芯片的快速检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的RPA引物组合物，用于检测stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e和stx2g 9 种基因亚型，其包括序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4的引物对和序列为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12的引物对。

本发明的第二方面是提供一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，采用RPA 技术；所述等温快速检测方法包括如下步骤：

步骤一，配制包含本发明第一方面提供的RPA引物组合物中的任一引物对的反应体系；

步骤二，将上述反应体系充分混匀，恒温条件下进行扩增反应；

步骤三，反应完成后，纯化扩增产物；

步骤四，纯化后的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳方法进行分离、染色，并观察。

进一步地，上述反应体系还包括基础型DNA恒温快速扩增试剂盒中的反应预混液A和缓冲液B、DNA模板和水。

进一步优选地，上述反应体系包括如下组分及其体积：反应预混液A29.4μL、引物(10μmol/L)各2μL、DNA模板1.5-13.5μL、缓冲液B(含280mmol/L Mg²⁺) 0.5-5.5μL、加水至50μL。

更优地，上述反应体系包括如下组分及其体积：反应预混液A 29.4μL、引物 (10μmol/L)各2μL、DNA模板1.5μL、缓冲液B(含280mmol/L Mg²⁺)2.5μL、加水至50μL。

进一步地，上述扩增反应的温度为37-42℃，反应时间为20min。

进一步优选地，上述扩增反应的温度为39℃，反应时间为20min。

本发明的第三方面是提供一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，采用荧光 RPA技术；所述等温快速检测方法包括如下步骤：

步骤一，配制包含本发明第一方面提供的RPA引物组合物中的任一所述引物对的反应体系；

步骤二，将所述反应体系充分混匀，恒温条件下进行扩增反应；

步骤三，反应完成后，读取数据并分析。

进一步地，上述反应体系还包括荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒中的反应预混液A和缓冲液B、探针、DNA模板和水。

进一步优选地，上述反应体系包括如下组分及其体积：反应预混液A 2.95μL、引物(10μmol/L)各0.1μL、探针0.1μL、DNA模板1.5μL、缓冲液B(含280mmol/L Mg²⁺)0.25μL。

进一步地，上述扩增反应的温度为37-42℃，反应时间为20min。

进一步地，上述探针的序列为SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17。

本发明的第四方面是提供一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，采用荧光 RPA微流控芯片技术同时检测stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、 stx2e和stx2g9种基因亚型；所述方法包括如下步骤：

步骤一，将荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒中的反应预混液A、如本发明第一方面提供的RPA引物组合物中的任一引物对和对应的探针预先加入微流控芯片反应区中，风干，然后用塑封膜密封；

步骤二，测试时，将核酸模板、所述荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒中的缓冲液B和水混合，加入所述微流控芯片中，离心，然后恒温孵育反应；

步骤三，反应完成后，读取数据并分析。

进一步地，上述探针的序列为SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17。

进一步地，上述微流控芯片包括8套相同的微流控结构区，每个所述微流控结构区分别都有1个加样区、1个液体分配区和4个独立反应区，同时进行32 个反应。

进一步地，步骤二中所述离心采用两步离心法，第一步离心采用的速度为1500rpm，使混合液体进入分配区，被定量分成4等份；第二步离心采用的速度为4500rpm，使混合液体从分配区进入反应区。

进一步地，孵育反应的温度为39℃，持续时间为20min。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明筛选出检测stx1和stx2基因的高特异性引物、探针组合，与美国农业部微生物实验室技术指南中RT-PCR方法相比，目标基因检测的包容性和排他性均为100％。荧光RPA微流控芯片法可同时进行32个反应，检测STEC菌体灵敏度为9.5×10³CFU/mL。经增菌培养后在人工污染牛肉样品中可检测1CFU/25g 的STEC污染，方法的相对正确度和相对检出水平均为100％。本发明采用两段离心式微流控芯片的管路设计，将反应预混液提前预置在芯片中。与传统RT-PCR 检测方法相比，操作者省去了复杂的体系配制，只需一步加样混合，便可同时进行多平行和多靶点测试，反应在39℃迅速启动，实现高通量和便捷化的测试结果。

综上所述，本发明提供的方法操作简单，特异性好，适合于现场快速检测，可在20min内完成核酸的检测，可以为监管部门对上市产品的监督检查和突发事件处理提供快速的筛查结果。同时，本发明首次设计、筛选引物、探针组合可有效检测9种stx基因亚型，分别为stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、 stx2d、stx2e和stx2g基因。结合离心圆盘式微流控芯片技术可实现极小体积内 (5μL)对食品、药品或畜牧养殖产品中STEC进行快速、高通量检测。

附图说明

图1为本发明一实施例中不同引物组合的普通RPA反应产物电泳图；其中，图1A为检测stx1基因的普通RPA反应产物电泳条带：1.DNA Marker；2和3.阴性对照；4.F1-R1组合；5.F1-R2组合；6.F1-R3组合；7.F1-R4组合；8.F2-R1 组合；9.F2-R2组合；10.F2-R3组合；11.F2-R4组合；12.F3-R1组合；13.F3-R2 组合；14.F3-R3组合；15.F3-R4组合；图1B为检测stx2基因的普通RPA反应产物电泳条带：1.DNA Marker；2和3.阴性对照；4.F1-R1组合；5.F1-R2组合；6.F1-R3组合；7.F1-R4组合；8.F1-R5组合；9.F2-R1组合；10.F2-R2组合；11.F2-R3组合；12.F2-R4组合；13.F2-R5组合；14.F3-R1组合；15.F3-R2 组合；16.F3-R3组合；17.F3-R4组合；18.F3-R4组合；

图2为本发明一实施例中荧光RPA检测E.coli CICC 21530基因组核酸灵敏度试验的结果图；其中，图2A采用引物STX1-F1与STX1-R1组合检测stx1基因；

图2B采用引物STX2-F2与STX2-R2组合检测stx2基因：图中A-H分别代表E.coliCICC 21530基因组核酸浓度分别为1.28×10⁵pg/μL、1.28×10⁴pg/μL、 1.28×10³pg/μL、1.28×10²pg/μL、1.28×10¹pg/μL、1.28pg/μL、1.28×10^-1pg/μL和 1.28×10^-2pg/μL；

图3为本发明一实施例中荧光RPA检测E.coli CICC 21530菌体的灵敏度试验的结果图；其中，图3A采用引物STX1-F1与STX1-R1组合检测stx₁基因；图3B采用引物STX2-F2与STX2-R2组合检测stx₂基因：图中A-H分别代表E.coli CICC 21530细菌菌体浓度分别为9.5×10⁷CFU/mL、9.5×10⁶CFU/mL、9.5×10⁵CFU/mL、 9.5×10⁴CFU/mL、9.5×10³CFU/mL、9.5×10²CFU/mL、9.5×10¹CFU/mL和9.5 CFU/mL；

图4为本发明一实施例中荧光RPA微流控芯片检测E.coli CICC 21530菌体的灵敏度试验的结果图；其中，图4A采用引物STX1-F1与STX1-R1组合检测stx₁基因；图4B采用引物STX2-F2与STX2-R2组合检测stx₂基因：图中A-H分别代表 E.coli CICC 21530细菌菌体浓度分别为9.5×10⁷CFU/mL、9.5×10⁶CFU/mL、 9.5×10⁵CFU/mL、9.5×10⁴CFU/mL、9.5×10³CFU/mL、9.5×10²CFU/mL、9.5×10¹ CFU/mL和9.5CFU/mL。

具体实施方式

本发明提供了一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的RPA引物组合物和方法，具体提供一种速度快、灵敏度高、特异性强的检测STEC的RPA引物、探针及基于微流控芯片的快速检测方法。

第一方面，本发明提供了一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的RPA引物组合物，用于检测stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e和stx2g 9 种基因亚型，其包括序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4的引物对和序列为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12的引物对。

第二方面，本发明提供一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，采用RPA 技术；所述等温快速检测方法包括如下步骤：

步骤三，反应完成后，纯化扩增产物；

在本发明一优选的实施例中，上述反应体系包括如下组分及其体积：反应预混液A 29.4μL、引物(10μmol/L)各2μL、DNA模板1.5μL、缓冲液B(含280mmol/L Mg²⁺)2.5μL、加水至50μL。

在本发明一优选的实施例中，上述扩增反应的温度为37-42℃，反应时间为20min；更优地，上述扩增反应的温度为39℃，反应时间为20min。

第三方面，本发明提供一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，采用荧光 RPA技术；所述等温快速检测方法包括如下步骤：

步骤三，反应完成后，读取数据并分析。

在本发明一优选的实施例中，上述反应体系包括如下组分及其体积：反应预混液A 2.95μL、引物(10μmol/L)各0.1μL、探针0.1μL、DNA模板1.5μL、缓冲液B(含280mmol/LMg²⁺)0.25μL。

在本发明一优选的实施例中，上述扩增反应的温度为37-42℃，反应时间为20min；更优地，扩增反应的温度为39℃，反应时间为20min。

在本发明一优选的实施例中，上述探针的序列为SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17。

第四方面，本发明提供一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，采用荧光 RPA微流控芯片技术同时检测stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、 stx2e和stx2g 9种基因亚型；所述方法包括如下步骤：

步骤三，反应完成后，读取数据并分析。

在本发明一优选的实施例中，上述微流控芯片包括8套相同的微流控结构区，每个所述微流控结构区分别都有1个加样区、1个液体分配区和4个独立反应区，同时进行32个反应。

在本发明一优选的实施例中，步骤二中离心采用两步离心法，第一步离心采用的速度为1500rpm，使混合液体进入分配区，被定量分成4等份；第二步离心采用的速度为的速度为4500rpm，使混合液体从分配区进入反应区。

在本发明一优选的实施例中，孵育反应的温度为39℃，持续时间为20min。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1

本实施例提供一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的RPA引物组合物和探针，具体的设计过程包括如下步骤：

从GeneBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中下载stx₁和stx₂基因亚型的核酸序列，包含stx₁基因亚型3种(stx_1a、stx_1c、stx_1d)和stx₂基因亚型7 种(stx_2a、stx_2b、stx_2c、stx_2d、stx_2e、stx_2f、stx_2g)。采用Primer Premier 5.0软件按TwistDx公司RPA设计原则设计引物和探针组合(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1检测产志贺毒素大肠埃希菌的RPA引物和探针序列

采用RPA技术筛选适宜的RPA扩增引物，具体的操作步骤如下：

(1)将检测stx₁和stx₂基因的备选RPA反应的上下游引物分别进行两两组合，以E.coli CICC 21530基因组核酸为模板。

(2)配制反应体系：选用基础型DNA恒温快速扩增试剂盒(安普未来生物科技有限公司)。在干粉反应管中加入29.4μL反应预混液A，上下游引物 (10μmol/L)各2μL，DNA模板1.5μL(最高可至13.5μL)，加水至47.5μL，最后加入缓冲液B(含280mmol/L Mg²⁺)2.5μL配成50μL反应体系。

(3)将上述反应体系充分混匀，39℃(温度范围37-42℃)恒温反应20min。

(4)用柱式PCR产物纯化试剂盒纯化扩增产物。取5μL已纯化产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用GelRed溶液(Biotium)10μg/mL浸泡染色10min，置紫外成像仪内观察。其中，DNA分子量标准选用DL2000 DNA Marker(宝生物工程大连有限公司)。

由图1可知，F1-R1组合的引物对的扩增效率较高，且产物条带单一，可作为检测stx₁基因的引物；F2-R2组合的引物对的扩增效率较高，且产物条带单一，可作为检测stx₂基因的引物。

实施例2

本实施例提供一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，采用荧光RPA技术；包括如下步骤：

步骤一，荧光RPA反应选用荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒(安普未来生物科技有限公司)。在干粉反应管中加入2.95μL反应预混液A，实施例一中筛选的引物和提供的探针(10μmol/L)各0.1μL，DNA模板1.5μL，最后加入缓冲液B (含280mmol/L Mg²⁺)0.25μL，配成5μL反应体系。

步骤二，充分混匀，置39℃(温度范围37-42℃)恒温反应20min，每30s 采集一次荧光信号，共40个循环。

步骤三，反应完成后，读取数据并分析。

以下通过检测基因组核酸和菌体细胞，对本实施例提供的采用荧光RPA技术的的方法的灵敏度进行验证：

(1)对E.coli CICC 21530的基因组核酸进行10倍梯度系列稀释，浓度分别为1.28×10⁵pg/μL、1.28×10⁴pg/μL、1.28×10³pg/μL、1.28×10²pg/μL、1.28×10¹pg/μL、1.28pg/μL、1.28×10^-1pg/μL和1.28×10^-2pg/μL，用以考察荧光RPA技术检测基因组核酸的灵敏度，结果如图2。

由图2可知，分别以引物STX1-F1与STX1-R1组合(图2A)和引物STX2-F2 与STX2-R2组合(图2B)检测STEC基因组核酸的灵敏度均为12.8pg/μL。

(2)对E.coli CICC 21530的TSB培养物进行10倍梯度系列稀释，菌体浓度分别为9.5×10⁷CFU/mL、9.5×10⁶CFU/mL、9.5×10⁵CFU/mL、9.5×10⁴CFU/mL、 9.5×10³CFU/mL、9.5×10²CFU/mL、9.5×10¹CFU/mL和9.5CFU/mL，用以考察荧光RPA技术检测菌体细胞的灵敏度，结果如图3。

由图3可知，以引物STX1-F1与STX1-R1组合检测STEC菌体的灵敏度为 9.5×10³CFU/mL(图3A)；虽然引物STX2-F2与STX2-R2组合在9.5×10²CFU/mL 时检测到阳性扩增信号，但出现信号的循环数偏大，荧光信号与背景信号差异偏小，因此，STX2-F2与STX2-R2引物组合检测STEC菌体的灵敏度为 9.5×10³CFU/mL(图3B)。

实施例3

本实施例提供一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，采用荧光RPA微流控芯片技术同时检测stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e和 stx2g 9种基因亚型。

其中，试验所用圆盘离心式微流控芯片组件和芯片检测仪(SX-MA2000 plus) 由上海速芯生物科技有限公司提供。芯片由聚碳酸酯材料经微注塑成圆盘式结构，每张芯片有8套相同的微流控结构区，每区分别都有1个加样区、1个液体分配区和4个独立反应区，可同时进行32个反应。

上述方法包括如下步骤：

步骤一，将反应预混液A、上下游引物和探针按5μL荧光RPA反应体系预先加入芯片反应区中，每个结构区中对stx₁和stx₂基因分别做两个重复测试，风干约 15min后用塑封膜密封，储存于-20℃备用。

步骤二，测试时，每个加样区按4个5μL荧光RPA反应液的反应体系，将核酸模板与缓冲液B混合，加水使混合液体积为20μL。

步骤三，将待测混合液加入芯片中，经1500rpm离心使液体进入分配区，被定量分成4等份，再将芯片经4500rpm离心使液体进入反应区。

步骤四，在芯片检测仪内维持39℃孵育20min，每30s检测一次荧光信号。

通过检测E.coli CICC 21530的TSB培养物的10倍梯度系列稀释液进行检测验证本实施例方法的灵敏度，结果如图4所示。

由图4可知，引物STX1-F1与STX1-R1组合可检测的菌体灵敏度为 9.5×10⁴CFU/mL(图4A)；引物STX2-F2与STX2-R2组合可检测菌体灵敏度为 9.5×10³CFU/mL(图4B)。在相同核酸上样量的情况下，微流控芯片检测stx₁基因的灵敏度有所降低，对stx₂基因的检测灵敏度维持不变。但由于微流控芯片体系采用反应体系预置干燥形式，最大可将核酸上样量增加至4.75μL，可提高检测的灵敏度。

验证实施例1

本实施例采用实施例2提供的方法检测试验菌株基因组核酸来判定该方法的包容性和排他性。具体的试验菌株和操作方法如下：

试验所用测试菌株共40株(表2)。其中，15株Non-O157 STEC和1株E.coli O157:H7菌株来自中国食品药品检验研究院(标注为FC和ST编号菌株)，采用 Scheutz^[11]方法对stx基因进行分型确认；3株E.coli O157:H7标准菌株、7株普通 E.coli标准菌株和14株其他微生物菌种由上海市食品药品检验所提供。14株其他微生物菌种包括：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa CMCC 10104)、乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi BCMCC 50094)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CMCC 63501)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)、志贺氏菌(CMCC 51572)、阪崎肠杆菌(ATCC29544)、神户肠杆菌(Enterobacter kobei)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefasciens)、豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)、蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei)、摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii)、普通变形杆菌(Proteusvulgari)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)和布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)各1株，非标准菌株分离于市售牛肉样品。

上述微生物菌种接种于胰酪大豆胨液体培养基中(Tryptic SoyBroth，TSB)(Merck)，置36℃±1℃过夜培养。采用VITEC 2Compact(法国生物梅里埃公司)生化鉴定仪确认。取TSB增菌培养物1mL至离心管中，选用细菌基因组提取试剂盒(DNeasy Blood andTissue Kit，QIAGEN)，按说明书操作，最后将提取的基因组核酸溶解于TE缓冲液(Tris-EDTA buffer solution)100μL，置-20℃ 保存。用核酸蛋白定量检测仪(BioPhotometerPlus，Eppendorf)测定核酸浓度。

采用本实施例提供的方法对上述核酸进行检测，结果如表2所示。

此外，STEC菌种的stx基因携带情况按美国农业部微生物实验室技术指南(Microbiology laboratory guidebook,MLG)5B.05中RT-PCR方法进行验证。反应体系为1×PCR反应预混液(TAKARA Premix Taq Version 2.0)，上下游引物各1.25 μmol/L，stx₁和stx₂基因探针各0.25μmol/L，DNA模板5μL，加水配成25μL反应体系。反应程序为95℃加热3min；95℃退火15s，59℃延伸1min，共45个循环，结果如表2所示。

表2.试验所用菌株及stx基因的RT-PCR和荧光RPA检测结果

a.FC与ST编号菌种及相关菌株信息由中国食品药品检定研究院提供；b./:未知，+:阳性， -:阴性；

采用荧光RPA方法检测试验菌株基因组核酸，目标菌stx₁和stx₂基因的判断与菌种确认的基因信息一致，非目标菌基因组核酸测试结果均为阴性(表1)。荧光RPA方法可在七种常见的STEC血清型(O157、O26、O45、O103、O111、O145、 O121)中有效检测9种stx基因亚型，分别为stx_1a、stx_1c、stx_1d、stx_2a、stx_2b、stx_2c、 stx_2d、stx_2e和stx_2g基因，方法包容性和排他性均为100％。

验证实施例2

本实施例通过对人工污染样品的检测来验证实施例3提供的方法，具体的步骤和结果如下：

(1)取市售牛肉馅样品，混匀后分成25份，每份约25g。随机取1份作对照，其余样品分为3组，分别加入E.coliCICC 21530的菌悬液，每组样品的接种量分别约为10CFU/25g、1CFU/25g和小于1CFU/25g。

(2)按照《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》 (GB4789.6-2016)的方法进行增菌培养。分别取肠道增菌肉汤培养物1mL，500×g离心1min；取上清液至一新的无菌离心管中，10000×g离心5min；弃去上清液，加入500μL生理盐水，重悬，10000×g离心3min；弃去上清液，加入 TE缓冲液100μL，重悬；99℃加热15min，置室温冷却2min，13000×g离心4 min；取上清液即为样品基因组核酸溶液。剩余的肉汤培养物按国标方法检测。将国标方法与荧光RPA微流控芯片方法的结果进行比较和评价，分析方法的相对正确度和相对检出水平。

(3)对人工污染样品同时进行荧光RPA微流控芯片法(替代方法)和国标 GB4789.6-2016方法(参考方法)的配对检测比较，将检测结果按ISO 16140-2:2016标准中替代方法和参考方法的试验结果进行统计分析(表3)。

表3.荧光RPA微流控芯片法和国标GB 4789.6-2016方法的试验结果比较

由表3可知，采用上述两种方法对接种量为10CFU/25g和1CFU/25g污染水平的样品检测结果均为阳性；在＜1CFU/25g污染水平的样品中，有2份检测结果为阴性，该浓度阴性样品比例为30％(2/6)。荧光RPA微流控芯片法的相对正确度和相对检出水平均为100％，方法未见假阳性和假阴性结果。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海市食品药品检验所

<120> 一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的RPA引物组合物和方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

attgttgaac gaaataattt atatgtgaca g 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

acaggatttg ttaacaggac aaayaatgtt 30

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttcacatgtt acctttccag gtacaasagc g 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

agaagtagtc arcgaatggc gatttatctg ca 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

agggaggttc ctctatrcga catyaaatcc ag 32

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ttcagctgtc acagtaacaa accgtaacat 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ccactgagat catccagtgt tgtacgaaat 30

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ctgcaacgtg tcgcagcgct ggaacgttcc g 31

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aatgcaaatc agtcgtcact cactggtttc at 32

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tatctggcgt taatggagtt cagtggtaat a 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ccdgacgaaa ttctctctgt atytgcctga a 31

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tcatcgtata macaggagca gtttcagaca g 31

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ctgattckcc cccagttcag dgtgaggtcc ac 32

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ccabcctctc cccgawactc cggaagcaca tt 32

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

agtatcgctg atatattatt aaaggatatt 30

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

tctggtgaca gtagctatac cacgttacag cgtgtgcagg gatcagtcgt ac 52

<210> 17

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

accagagahg catccagagc agttctgcgt ttgtcactgt bacagcaga 49

Claims

1.一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的RPA引物组合物，其特征在于，所述RPA引物组合物用于检测stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e和stx2g 9种基因亚型，包括序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4的引物对和序列为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12的引物对。

2.一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，其特征在于，采用RPA技术；所述等温快速检测方法包括如下步骤：

步骤一，配制包含如权利要求1所述RPA引物组合物中的任一所述引物对的反应体系；

步骤三，反应完成后，纯化扩增产物；

3.根据权利要求2所述的检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，其特征在于，所述反应体系还包括基础型DNA恒温快速扩增试剂盒中的反应预混液A和缓冲液B、DNA模板和水。

4.根据权利要求2所述的检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，其特征在于，所述扩增反应的温度为37-42℃，反应时间为20min。

5.一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，其特征在于，采用荧光RPA技术；所述等温快速检测方法包括如下步骤：

步骤三，反应完成后，读取数据并分析。

6.根据权利要求5所述的检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，其特征在于，所述反应体系还包括荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒中的反应预混液A和缓冲液B、探针、DNA模板和水。

7.根据权利要求6所述的检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，其特征在于，所述探针的序列为SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17。

8.一种检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，其特征在于，采用荧光RPA微流控芯片技术同时检测stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e和stx2g9种基因亚型；所述方法包括如下步骤：

步骤一，将荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒中的反应预混液A、如权利要求1所述RPA引物组合物中的任一引物对和对应的探针预先加入微流控芯片反应区中，风干，然后用塑封膜密封；

步骤三，反应完成后，读取数据并分析。

9.根据权利要求8所述的检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，其特征在于，所述探针的序列为SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17。

10.根据权利要求8所述的检测产志贺毒素大肠埃希菌的方法，其特征在于，所述微流控芯片包括8套相同的微流控结构区，每个所述微流控结构区分别都有1个加样区、1个液体分配区和4个独立反应区，同时进行32个反应。