CN110669856A - 一种赫氏埃希氏菌的微滴式数字pcr快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种赫氏埃希氏菌的微滴式数字PCR快速检测方法，首先提取待测样品增菌液的基因组DNA并稀释备用；再利用赫氏埃希氏菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物和探针；然后使用该引物和探针对待测样品增菌液的基因组DNA进行微滴式数字PCR扩增和检测。经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。微滴式数字PCR可以直接得出DNA分子的个数，能对样品中的赫氏埃希氏菌进行绝对定量。具有灵敏高、定量精确、检测的线性范围宽、特异性好、费用适中的优点。

Description

一种赫氏埃希氏菌的微滴式数字PCR快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种赫氏埃希氏菌（Escherichia hermannii)的微滴式数字PCR快速检测方法。
背景技术
赫氏埃希氏菌（Escherichia hermannii)是肠杆菌科、埃希氏菌属的一个种，是一种条件性致病菌。赫氏埃希氏菌为杆状菌，1.1～1.5×6μm。周生鞭毛运动或不运动，无芽孢，革兰氏阴性菌。兼性厌氧，在普通培养基上生长迅速。可发酵乳糖产气，产生吲哚，甲基红反应(+)，VP反应(-)。赫氏埃希氏菌不仅是一种食品腐败微生物，也能够引起人原发性和继发性感染，如腹泻、化脓性关节炎、头颅血肿、伤口感染和骨髓炎。研究发现赫氏埃希氏菌也具有发酵产胞外多糖的功能（冯雪萍. 产高粘度微生物多糖的菌种筛选及其单糖组分分析，江南大学硕士论文，2013）。研究结果表明，产胞外多糖最佳发酵培养组成为：麦芽糖30g/L，复合氮源5g/L（其中NaNO380%，酵母粉20%），K2HPO42g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，初始pH6.0，发酵温度为30℃，接种量5%（v/v），装液量100mL/500mL。该优化条件下赫氏埃希氏菌的多糖产量为11.5g/L，发酵液粘度为1160mPa·s，较初始发酵条件下多糖产量3.8g/L，发酵液粘度141mPa·s，两者分别增加为原来的3倍和8倍。对多糖进行完全酸水解，利用离子色谱法测定多糖水解物中的单糖组分，确定该胞外多糖主要由鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和半乳糖组成。大肠埃希菌O157·H7是肠出血性大肠埃希菌的主要血清型，也是引起食物中毒的重要的食源性病源菌。赫氏埃希氏菌也存在与大肠埃希氏菌O157·H7相同或相关的抗原，因而影响对大肠埃希氏菌O157·H7结果的判定。
当前，赫氏埃希氏菌的检测方法主要是传统的增菌培养——纯分离培养——生化鉴定，该方法的缺点是操作繁琐、检测时间长，而且生化鉴定的项目较多。随着人们生活水平的提高，对食品安全的需求越来越高，传统检测方法的低效率已经不能满足当前的检测任务。因而，开发赫氏埃希氏菌高效、快速检测方法很有必要。微滴式数字PCR技术是近年来发展起来的一种核酸定量技术，是一种核酸分子的绝对定量技术。相较于荧光定量PCR和普通PCR，微滴式数字PCR可以直接得出DNA分子的个数，能对食品中的致病微生物进行绝对定量。其原理是通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元至少包含一个拷贝的目标分子( DNA 模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度。同荧光定量PCR一样，在 PCR反应体系中也引入了荧光标记的探针，具有灵敏高、定量精确、检测的线性范围宽、特异性好的特点。微滴式数字PCR技术真正实现了PCR从定性到绝对定量的飞跃，有效解决了PCR污染和对模板定量不准确的问题。目前，该技术已初步应用于食源性微生物检测领域。然而，迄今国内还未见有利于微滴式数字PCR方法快速检测赫氏埃希氏菌的报道。
其特点是灵敏高、定量精确、检测的线性范围宽、特异性好、费用适中，是一种很有前途的分子定量检测手段。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的不足，提供一种检测速度快、灵敏度高、能够实现绝对定量的快速检测赫氏埃希氏菌的微滴式数字PCR方法。
本发明的技术解决方案是：一种赫氏埃希氏菌的微滴式数字PCR快速检测方法，其特征在于有如下步骤：
首先提取待测样品增菌液的基因组DNA并稀释备用。
然后进行微滴式数字PCR 反应，每个微滴式数字PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA 2μl；PCR预混液（2×ddPCR Master Mix）12.5μl；赫氏埃希氏菌上、下游引物各1μl (10 pmol/μl)，探针0.5μl (10 pmol/μl)；最后加ddH2O至25μl。将充分混匀的PCR体系转移到微滴发生卡中，并向微滴发生卡中加入70μl微滴发生专用油，将微滴发生卡放到微滴发生器中进行反应。将生成的微滴全部转入到96 孔反应板，用封膜仪对96孔板封膜，进行PCR扩增。PCR 反应程序参数为：95℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火50 s，40 个循环；98℃固化微滴10 min。最后用微滴分析仪对扩增产物进行计数分析。
其中赫氏埃希氏菌特异性引物为：
E.herm-1：5’-CCCGGATGCCGTCACGCAGTT-3’；
E.herm -2：5’-ATCTTCTGCGGCGAAGAGGTATCGC-3’。
特异性探针为：
E.herm-3：5’-FAM- ATGCGCGGGATCGGCGACCATGTGACCCG-3’。
经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。
本发明提供了扩增赫氏埃希氏菌的特异引物E.herm -1、E.herm -2和探针E.herm-3，从而提供一种赫氏埃希氏菌的微滴式数字PCR快速检测方法，同现有技术相比具有如下优点：
1．检测速度快，直接利用增菌液的基因组DNA进行检测，省去了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤，而分离纯化和生化鉴定一般需要48～72h。
2．成本低，由于省略了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤，节省了革兰氏染色、分离纯化培养基和生化试剂的费用，降低了检测成本。
3．灵敏度高，由于该技术在 PCR反应体系中引入了荧光标记的探针，提高了检测的灵敏度，数字PCR中荧光信号的产生过程基本与实时定量PCR相同。
4．能实现绝对定量，通过把一个样本的反应体系均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，独立地进行PCR扩增，利用油包水原理完成微滴信号检测，最终根据泊松分布以及荧光信号阳性的反应单元数量占所有反应单元的比例来计算目的核酸序列的拷贝数。
具体实施方式
首先无菌操作取1g待测样品，加入盛有9ml YM培养基的灭菌容器内，30℃±1℃，需氧条件下培养24h。取培养的菌液加入离心管中，以12000 rpm离心l min，弃上清液，利用菌体沉淀提取基因组DNA并稀释备用。
然后进行微滴式数字PCR 反应，每个微滴式数字PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA 2μl；PCR预混液（2×ddPCR Master Mix）12.5μl；赫氏埃希氏菌上、下游引物各1μl (10 pmol/μl)，探针0.5μl (10 pmol/μl)；最后加ddH2O至25μl。将充分混匀的PCR体系转移到微滴发生卡中，并向微滴发生卡中加入70μl微滴发生专用油，将微滴发生卡放到微滴发生器中进行反应。将生成的微滴全部转入到96 孔反应板，用封膜仪对96孔板封膜，进行PCR扩增。PCR 反应程序参数为：95℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火50 s，40个循环；98℃固化微滴10 min。最后用微滴分析仪对扩增产物进行计数分析。
其中赫氏埃希氏菌特异性引物为：
E.herm-1：5’- CCCGGATGCCGTCACGCAGTT -3’；
E.herm -2：5’- ATCTTCTGCGGCGAAGAGGTATCGC-3’。
特异性探针为：
E.herm-3：5’- FAM- ATGCGCGGGATCGGCGACCATGTGACCCG -3’。
经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。
序列表
<110> 临沂大学
<120> 一种赫氏埃希氏菌的微滴式数字PCR快速检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccggatgcc gtcacgcagt t 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcttctgcg gcgaagaggt atcgc 25
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcgcggga tcggcgacca tgtgacccg 29

Claims (4)

1.一种赫氏埃希氏菌的微滴式数字PCR快速检测方法，其特征在于，首先提取待测水产品样品增菌液的基因组DNA并稀释备用；再利用赫氏埃希氏菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物和探针；然后使用该引物和探针对待测水产品样品增菌液的基因组DNA进行微滴式数字PCR扩增和检测，其中所述的赫氏埃希氏菌特异性引物为：E.herm-1：5’-CCCGGATGCCGTCACGCAGTT-3’；E.herm-2：5’-ATCTTCTGCGGCGAAGAGGTATCGC-3’；特异性探针为：E.herm-3：5’-FAM-ATGCGCGGGATCGGCGACCATGTGACCCG-3’。
2.如权利要求1所述的一种赫氏埃希氏菌的微滴式数字PCR快速检测方法，其基因组提取方法为：首先无菌操作取1g待测样品，加入盛有9ml YM培养基的灭菌容器内，30℃±1℃，需氧条件下培养24h，取培养的菌液加入离心管中，以12000 rpm离心l min，弃上清液，利用菌体沉淀提取基因组DNA并稀释备用。
3.如权利要求1所述的一种赫氏埃希氏菌的微滴式数字PCR快速检测方法，其加样参数为：每个微滴式数字PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA 2μl；PCR预混液（2×ddPCR Master Mix）12.5μl；赫氏埃希氏菌上、下游引物各1μl (10 pmol/μl)，探针0.5μl(10 pmol/μl)；最后加ddH2O至25μl，将充分混匀的PCR体系转移到微滴发生卡中，并向微滴发生卡中加入70μl微滴发生专用油，将微滴发生卡放到微滴发生器中进行反应，将生成的微滴全部转入到96 孔反应板，用封膜仪对96孔板封膜，进行PCR扩增，PCR 反应程序参数为：95℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火50 s，40个循环；98℃固化微滴10 min。
4.如权利要求1所述的一种赫氏埃希氏菌的微滴式数字PCR快速检测方法，其产物分析方法为：经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。
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