CN113564267A - gusA基因在检测饮用水大肠埃希氏菌浓度中的应用、检测试剂、检测方法和检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其是涉及gusA基因在检测饮用水大肠埃希氏菌浓度中的应用、检测试剂、检测方法和检测装置。本发明首次将gusA基因用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度和制备用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的产品中，并同时给出了适用的核苷酸探针、检测试剂、检测方法和检测装置，实现了快速、定量检测饮用水中大肠埃希氏菌，且经验证使用上述核苷酸探针、检测试剂的检测方法具有高的特异性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其是涉及gusA基因在检测饮用水大肠埃希氏菌浓度中的应用、检测试剂、检测方法和检测装置。
背景技术
大肠埃希氏菌，属于革兰氏阴性短杆菌，鞭毛周生，能运动，无芽孢，兼性厌氧生长，是人体和动物肠道中的正常寄居细菌。当人体机体免疫功能降低时，这类细菌会表现出对人体的致病性，通常表现为腹泻、肠炎等症状，因此也被归类为条件致病菌。在水质检测领域，国内外水质标准中广泛地把大肠埃希氏菌作为水体受粪便污染的检测指标，当水样中大肠埃希氏菌含量越高时，表示水样被粪便污染越严重。《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)对生活饮用水提出明确要求，即每100mL水体中不得检出大肠埃希氏菌。而目前国标方法对大肠埃希氏菌均需要经过培养后再计数，检测结果具有滞后性。因此，如何使用快速和灵敏的方法检测大肠埃希氏菌仍需进一步研究。
目前，大肠埃希氏菌荧光定量PCR检测大多针对O157：H7型菌株进行引物设计，在食品和医疗检测领域已有应用。在水质检测领域，基于国标方法是针对大肠埃希氏菌属进行达标评价，因此需要设计大肠埃希氏菌属的引物进行检测。另外，在样品前处理方法上，如何浓缩水样收集大肠埃希氏菌暂时没有统一的方法。对大肠埃希氏菌的DNA提取目前大多采用试剂盒提取法进行，操作的步骤较多，需要探索一种简便可行的提取方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供gusA基因在检测饮用水大肠埃希氏菌浓度和制备用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的产品中的应用，并同时给出了适用的核苷酸探针、检测试剂、检测方法和检测装置，以实现快速、定量检测饮用水中大肠埃希氏菌。
为了解决上述问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供gusA基因在检测饮用水大肠埃希氏菌浓度中的应用。
第二方面，本发明提供gusA基因在制备用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的产品中的应用，所述产品以gusA基因或gusA基因片段为靶序列；
优选地，所述gusA基因片段具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供一种用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的核苷酸探针，所述核苷酸探针以gusA基因片段为靶序列，所述gusA基因片段具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述核苷酸探针包括具有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的探针。
在可选的实施方式中，所述核苷酸探针包括双标记探针。
优选地，所述双标记包括至少一个荧光标记。
优选地，所述双标记均为荧光标记。
优选地，所述荧光标记包括FAM标记或TAMRA标记。
第四方面，本发明提供一种用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的试剂，所述试剂包括前述实施方式所述的核苷酸探针，还包括扩增试剂和/或扩增耗材。
在可选的实施方式中，所述扩增试剂包括引物对，所述引物对由用于扩增gusA基因片段的上游引物和下游引物组成，所述gusA基因片段具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述引物对与核苷酸探针在与gusA基因片段结合的结合位点上无重叠或部分重叠。
在可选的实施方式中，所述引物对具有如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
第五方面，本发明提供一种检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的方法，所述方法包括，配制已知gusA基因拷贝数的标准阳性样品A、已知大肠埃希氏菌系列浓度的标准阳性样品B和待测饮用水样品，采用前述实施方式所述的核苷酸探针或者前述实施方式任一项所述的试剂分别检测标准阳性样品A、标准阳性样品B和待测饮用水样品中gusA基因片段的拷贝数，根据标准阳性样品A和标准阳性样品B的检测结果分别绘制Ct值与gusA基因片段的拷贝数的标准曲线A，和，gusA基因片段的拷贝数与大肠埃希氏菌系列浓度的标准曲线B，根据标准曲线A和B，通过待测饮用水样品的Ct检测结果，计算得到待测饮用水中大肠埃希氏菌浓度。
优选地，待测饮用水样品包括管网水或出厂水。
优选地，所述标准阳性样品的DNA提取方法包括沸水浴法。
在可选的实施方式中，所述方法还包括配制不含大肠埃希氏菌的标准阴性样品，和采用前述实施方式所述的核苷酸探针或者前述实施方式所述的试剂检测标准阴性样品中gusA基因片段的拷贝数的步骤，所述标准阳性样品和标准阴性样品的检测结果作为质控标准。
优选地，所述质控达标标准为标准阴性样品的Ct值为N/A，标准阳性样品的Ct值小于等于35，且标准阳性样品出现扩增曲线。
优选地，Ct值大于35的待测饮用水样品重复检测；检测结果无Ct值的待测饮用水样品为阴性样品；检测结果有Ct值，且出现扩增曲线的待测饮用水样品为阳性样品。
第六方面，本发明提供一种饮用水大肠埃希氏菌浓度检测装置，所述检测装置包括：
获取单元，用于配制标准阳性样品、待测饮用水样品和标准阴性样品，还用于储存前述实施方式所述的核苷酸探针或前述实施方式任一项所述的试剂；
处理单元，用于采用核苷酸探针或者试剂分别检测标准阳性样品、待测饮用水样品和标准阴性样品中gusA基因片段的拷贝数，根据标准阳性样品的检测结果绘制标准曲线；
输出单元，根据前述实施方式所述的质控标准输出待测饮用水样品的阴性样本标识或阳性样本标识，根据标准曲线输出待测饮用水样品中大肠埃希氏菌浓度。
本发明首次将gusA基因用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度和制备用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的产品中，并同时给出了适用的核苷酸探针、检测试剂、检测方法和检测装置，实现了快速、定量检测饮用水中大肠埃希氏菌，且经验证使用上述核苷酸探针、检测试剂的检测方法具有高的特异性和灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中系列浓度标准阳性样品A的扩增曲线；
图2为本发明实施例1绘制的Ct值与gusA基因片段的拷贝数的标准曲线A；
图3为本发明实施例1灵敏度检测结果；
图4为本发明实施例2绘制的gusA基因片段的拷贝数与大肠埃希氏菌系列浓度的标准曲线B。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在某一具体实施方式中，本发明提供了gusA基因在检测饮用水大肠埃希氏菌浓度中的应用。gusA基因是一种水解酶，催化各种类型的β-葡糖苷酸裂解，大肠杆菌的β-葡糖苷酸酶通常以四价体形式存在，十分稳定，不仅能够对抗多种去垢剂，而且在环境条件变化较大的情况下仍然具有活性，因此，该酶广泛应用于分光光度分析、荧光分析和组织化学分析，特别是植物分子生物学领域，然而目前还没有将其应用于饮用水大肠埃希氏菌浓度检测的报道。
第二方面，本发明提供gusA基因在制备用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的产品中的应用，所述产品以gusA基因或gusA基因片段为靶序列；
优选地，所述gusA基因片段具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
gusA基因的全序列如SEQ ID No.1所示，为了提高检测效率和检测准确度，本发明在gusA基因全序列基础上，进行片段筛选，发现具有如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的gusA基因片段能够在保证特异度、灵敏度和准确度的情况下，替换gusA基因全序列，显著缩短扩增时间，提高检测效率。
第三方面，本发明提供一种用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的核苷酸探针，所述核苷酸探针以gusA基因片段为靶序列，所述gusA基因片段具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述核苷酸探针包括具有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的探针。
在可选的实施方式中，所述核苷酸探针包括双标记探针。
优选地，所述双标记包括至少一个荧光标记。
优选地，所述双标记均为荧光标记。
优选地，所述荧光标记包括FAM标记或TAMRA标记。
在可选的实施方式中，核苷酸探针的5’端和3’端可分别连接有荧光标记FAM标记和TAMRA标记，即所述的核苷酸探针为FAM-AAGTGTACGTATCACCGTT-TAMARA，该核苷酸探针与上下游引物间的距离较近，可减少扩增过程碱基的错配，5’端使用报告基因FAM共价结合，3’端与淬灭荧光基因TAMARA结合，荧光的信号强度能与扩增的PCR产物量呈显著的正相关。
第四方面，本发明提供一种用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的试剂，所述试剂包括前述实施方式所述的核苷酸探针，还包括扩增试剂和/或扩增耗材。
在可选的实施方式中，所述扩增试剂包括引物对，所述引物对由用于扩增gusA基因片段的上游引物和下游引物组成，所述gusA基因片段具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述引物对与核苷酸探针在与gusA基因片段结合的结合位点上无重叠或部分重叠。
在可选的实施方式中，所述引物对具有如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。经NCBI的Primer-blast分析，前向与反向引物Tm值在60℃附近(分别为60℃和59℃)，GC％在40％-60％(分别为55％和50％)，3’互补数值均小于3(分别为2和0)，能较好地满足PCR的扩增要求，减少引物间与引物本身的互补配对，降低假阳性的结果。
第五方面，本发明提供一种检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的方法，所述方法包括，配制已知gusA基因拷贝数的标准阳性样品A、已知大肠埃希氏菌系列浓度的标准阳性样品B和待测饮用水样品，采用前述实施方式所述的核苷酸探针或者前述实施方式任一项所述的试剂分别检测标准阳性样品A、标准阳性样品B和待测饮用水样品中gusA基因片段的拷贝数，根据标准阳性样品A和标准阳性样品B的检测结果分别绘制Ct值与gusA基因片段的拷贝数的标准曲线A，和，gusA基因片段的拷贝数与大肠埃希氏菌系列浓度的标准曲线B，根据标准曲线A和B，通过待测饮用水样品的Ct检测结果，计算得到待测饮用水中大肠埃希氏菌浓度。
优选地，待测饮用水样品包括管网水或出厂水。
优选地，所述标准阳性样品的DNA提取方法包括沸水浴法。
在可选的实施方式中，所述方法还包括配制不含大肠埃希氏菌的标准阴性样品，和采用前述实施方式所述的核苷酸探针或者前述实施方式所述的试剂检测标准阴性样品中gusA基因片段的拷贝数的步骤，所述标准阳性样品和标准阴性样品的检测结果作为质控标准。
优选地，所述质控达标标准为标准阴性样品的Ct值为N/A，标准阳性样品的Ct值小于等于35，且标准阳性样品出现扩增曲线。
优选地，Ct值大于35的待测饮用水样品重复检测；检测结果无Ct值的待测饮用水样品为阴性样品；检测结果有Ct值，且出现扩增曲线的待测饮用水样品为阳性样品。
第六方面，本发明提供一种饮用水大肠埃希氏菌浓度检测装置，所述检测装置包括：
获取单元，用于配制标准阳性样品、待测饮用水样品和标准阴性样品，还用于储存前述实施方式所述的核苷酸探针或前述实施方式任一项所述的试剂；
处理单元，用于采用核苷酸探针或者试剂分别检测标准阳性样品、待测饮用水样品和标准阴性样品中gusA基因片段的拷贝数，根据标准阳性样品的检测结果绘制标准曲线；
输出单元，根据前述实施方式所述的质控标准输出待测饮用水样品的阴性样本标识或阳性样本标识，根据标准曲线输出待测饮用水样品中大肠埃希氏菌浓度。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例提供了一种标准曲线的绘制方法，包括如下步骤：
(1)制备已知gusA基因片段拷贝数的标准阳性样品A
以化学合成法合成大肠埃希氏菌属β-葡萄糖醛酸酶gusA基因片段，如SEQ IDNo.2所示，根据计算公式：拷贝数(Copies/μL)＝NA×标准品浓度(ng/μL)×10-9/(标准品碱基数/(bp)×660)，其中NA为6.02×1023(Copies/mol)，本发明合成的初始标准品浓度为40ng/μL，标准品碱基数为562bp，单个碱基的物质的摩尔质量为660g/mol/bp。计算出的标准品拷贝数为6.49×1010Copies/μL。使用无菌水稀释成1.0×108Copies/μL，此拷贝数作为标准曲线的初始标准阳性样品A浓度。
(2)设置标准阳性样品A浓度梯度
使用无菌水对初始标准阳性样品A进行10倍梯度稀释，制备成1.0×108Copies/μL、1.0×107Copies/μL、1.0×106Copies/μL、1.0×105Copies/μL、1.0×104Copies/μL、1.0×103Copies/μL、1.0×102Copies/μL、1.0×101Copies/μL的系列浓度标准品。
(3)PCR反应体系
10μmol/L的上游引物2.5μL，10μmol/L的下游引物2.5μL，10μmol/L探针2.5μL，2×itaq Mix 12.5μL，DNA模板2μL，无菌水补充至25μL。其中上游引物序列见SEQ ID No.4，下游引物序列见SEQ ID No.5，探针序列如下：
CACGCCGTATGTTATTGCCG(SEQ ID No.4)
AGTCTGCCAGTTCAGTTCGT(SEQ ID No.5)
FAM-AAGTGTACGTATCACCGTT-TAMARA
(4)PCR反应程序
95℃预变性5min；95℃变性5s，60℃延伸30s，循环次数40次，延伸阶段读取荧光信号，荧光通道选择FAM模式。
(5)检测结果及标准曲线绘制
图1显示系列浓度标准阳性样品A的扩增曲线，从左至右依次是1.0×108Copies/μL、1.0×107Copies/μL、1.0×106Copies/μL、1.0×105Copies/μL、1.0×104Copies/μL、1.0×103Copies/μL和1.0×102Copies/μL的系列浓度标准阳性样品A，由图1可以看出不同扩增曲线间的间隔明显，且具有明显的扩增指数期，表明梯度浓度的阳性标准品可用于标准曲线的构建。
分别以拷贝数对数值和Ct值为横纵坐标绘制标准曲线，结果如图2所示，可以看出标准曲线的线性范围为1.0×108～1.0×102Copies/μL。
(6)标准曲线的验证
设置不含有gusA基因片段的阴性对照、含有gusA基因片段100Copies/μL的阳性对照A和含有gusA基因片段10Copies/μL的阳性对照B，重复步骤(3)和(4)，对阴性对照、阳性对照A和阳性对照B进行PCR扩增。结果显示，阴性对照Ct值为N/A，阳性对照A的Ct值为32.20，代入步骤(5)绘制的标准曲线计算得到gusA基因拷贝数为93Copies/μL，相对标准偏差为5.13％。阳性对照B的Ct值为35.71，大于35，进行重复扩增，Ct值为N/A，结果为阴性，因此本方法的检测灵敏度为10Copies/μL～100Copies/μL，此外，图3中显示的扩增曲线从左至右对应的拷贝数的浓度依次为1.0×108～1.0×101Copies/μL，以Ct值35为质控标准，可以看出，Ct值为35时，1.0×108～1.0×102Copies/μL对应的浓度均表现出明显的扩增曲线，而1.0×101Copies/μL浓度对应曲线并未表现出扩增曲线，也证明了，本方法的检测灵敏度为10Copies/μL～100Copies/μL。
实施例2
本实施例使用已知含有不同浓度大肠埃希氏菌菌株的水样对实施例1提供标准曲线的可靠性进行验证。
(1)采用以下方法制备不同梯度浓度的大肠埃希氏菌的标准阳性样品B：
对大肠埃希氏菌干粉菌株进行复苏后传代培养，第三代的培养物作为实验用菌株。使用接种环挑取培养后的菌落接种于肉汤培养基，经培养把肉汤培养物添加到1号麦氏比浊标准管内，对照标准管的细菌浓度使用0.9％灭菌的生理盐水进行稀释，麦氏比浊的标准对照表见表1所示。以系列稀释方式制备100CFU/mL、200CFU/mL、500CFU/mL、1000CFU/mL、1500CFU/mL、2000CFU/mL浓度的标准阳性样品B。
表1麦氏比浊标准对照表
(2)标准阳性样品B水样浓缩
每种标准阳性样品B取100mL，使用离心机离心待测样品，离心条件为12000rpm/min，离心10min，留取下层含有湿菌体的液体10mL，充分混匀后分次转移到1.5mL离心管，每次转移后均需要离心，离心条件为7500rpm/min离心5min，离心后需小心弃去上清液。
(3)沸水浴法提取大肠埃希氏菌DNA
对离心后的标准阳性样品B沉淀物使用100μL无菌水进行充分混匀，在100℃沸水中水浴10min，水浴结束后12000rpm/min，离心10min，吸取上清液作为检测用DNA模板。
(4)PCR检测
按照检测样品数n(n＝标准阳性样品B样品数+阳性对照+阴性对照)配制荧光定量PCR反应体系，所述阳性对照与实施例1相同，一个检测样品反应体系按照如下配制：10μmol/L的上游引物2.5μL，10μmol/L的下游引物2.5μL，10μmol/L探针2.5μL，2×itaq Mix12.5μL，无菌水3μL，所有试剂混合于一管，于振荡器振荡混匀，分装于PCR管内，最后在每个PCR管内加入各2μL的检测样品DNA模板。其中，阳性对照模板使用含有靶标基因的阳性标准品，阴性对照模板使用无菌水。
设置荧光定量PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性5s，60℃延伸30s，循环次数40次，延伸阶段读取荧光信号，荧光通道选择FAM模式。
使用本发明方法对标准阳性样品B进行检测，将含标准菌株的水样浓度值与荧光定量PCR结果进行显著性差异及相关性分析，得到gusA基因片段的拷贝数与大肠埃希氏菌系列浓度的标准曲线B：y＝1.1231x-13.064，使用配对t检验方法进行结果评价，分析结果表明，P＝0.42，数值大于0.05，配对t检验结果的绝对值|t|＝0.21,小于t双尾临界值，表示两组数据在α＝0.05的置信水平上无差异，见表2所示。其中阴性对照Ct值为N/A，阳性对照Ct值为32.00，计算得到相对标准偏差为4.78％。两组数据的相关系数r2＝0.9945，见图4所示，表明相关性较高。综上表明本发明的检测结果准确性较高，能较好地应用于水体中大肠埃希氏菌的检测。
表2相关性分析对照表
实施例3
本实施例使用实施例1和实施例2得到的标准曲线对出厂水和管网水中含有大肠杆菌浓度进行检测，具体步骤如下：
采集某饮用水厂的出厂水(三个不同位点的水样：1#出厂水、2#出厂水和3#出厂水)、某同一水库的管网水(三个不同位点的水样：1#管网水、2#管网水和3#管网水)和某水库的水库水(三个不同位点的水样：1#水库水、2#水库水和3#水库水)，每个水样使用100mL进行荧光定量PCR。同时配制与实施例2相同的阳性标准品和阴性对照模板。而后采用与实施例2步骤(2)～(4)记载的检测方法对出厂水和管网水中进行检测，检测结果如表3所示，由表3可以看出，该水厂三个不同位点的出厂水和三个不同位点的网管水检测结果大肠杆菌浓度均为0，由于本发明提供的检测方法的灵敏度为10Copies/μL～100Copies/μL，证明该水厂的出厂水和网管水中大肠杆菌浓度均小于100Copies/μL。而水库水的检测结果证明，同一水库的不同位点的大肠杆菌浓度存在差异，与实际情况相符。
表3实施例3中水样检测结果
实施例3
本实施例采用实施例2所述的检测方法对16株不同来源大肠埃希氏菌和10株其它种类菌株进行荧光定量PCR检测，评估方法的特异性。检测结果见表4所示。数据显示本发明能检出不同来源的大肠埃希氏菌，对非大肠埃希氏菌的菌株结果均为未检出，表明方法的特异性强，能实际应用于不同菌株的检测。
表4 26株菌株检测结果
注：1.N/A表示阴性结果。
其中，编号1～16为不同来源的大肠埃希氏菌，编号17～18为铜绿假单胞菌，编号19～20为沙门氏菌，编号21～22为志贺氏菌，编号23～24为产气荚膜梭状芽胞杆菌，编号25～26为金黄色葡萄球菌。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东粤港供水有限公司
<120> gusA基因在检测饮用水大肠埃希氏菌浓度中的应用、检测试剂、检测方法和
检测装置
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1811
<212> DNA
<213> Escherichia coli（大肠埃希氏菌）
<400> 1
atgttacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60
ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120
gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180
cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240
ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300
aatcaggaag tgatggagca tagggcggct atacgccatt tgaagccgat gtcacgccgt 360
atgttattgc cgggaaaagt gtacgtatca ccgtttgtgt gaacaacgaa ctgaactggc 420
agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag cagtcttact 480
tccatgattt ctttaactat gccgggatcc atcgcagcgt aatgctctac accacgccga 540
acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgtcgc gcaagactgt aaccacgcgt 600
ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt gatgcggatc 660
aacaggtggt tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg aatccgcacc 720
tctggcaacc gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa agccagacag 780
agtgtgatat ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag ggcgaacagt 840
tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa gatgcggact 900
tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta atggactgga 960
ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg ctcgactggg 1020
cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt aacctctctt 1080
taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa gaggcagtca 1140
acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg cgtgacaaaa 1200
accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt ccgcaaggtg 1260
cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg acgcgtccga 1320
tcacctgcgt caatgtaatg ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc gatctctttg 1380
atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat ttggaaacgg 1440
cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat cagccgatta 1500
tcatcaccga atacggcgtg gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac accgacatgt 1560
ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt gatcgcgtca 1620
gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg caaggcatat 1680
tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg aagtcggcgg 1740
cttttctgct gcaaaaacgc tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg cagcagggag 1800
gcaaacaatg a 1811
<210> 2
<211> 562
<212> DNA
<213> Escherichia coli（大肠埃希氏菌）
<400> 2
agcatagggc ggctatacgc catttgaagc cgatgtcacg ccgtatgtta ttgccgggaa 60
aagtgtacgt atcaccgttt gtgtgaacaa cgaactgaac tggcagacta tcccgccggg 120
aatggtgatt accgacgaaa acggcaagaa aaagcagtct tacttccatg atttctttaa 180
ctatgccggg atccatcgca gcgtaatgct ctacaccacg ccgaacacct gggtggacga 240
tatcaccgtg gtgacgcatg tcgcgcaaga ctgtaaccac gcgtctgttg actggcaggt 300
ggtggccaat ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg gatcaacagg tggttgcaac 360
tggacaaggc actagcggga ctttgcaagt ggtgaatccg cacctctggc aaccgggtga 420
aggttatctc tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag acagagtgtg atatctaccc 480
gcttcgcgtc ggcatccggt cagtggcagt gaagggcgaa cagttcctga ttaaccacaa 540
accgttctac tttactggct tt 562
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagtgtacgt atcaccgtt 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cacgccgtat gttattgccg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agtctgccag ttcagttcgt 20
Claims (10)
1.gusA基因在检测饮用水大肠埃希氏菌浓度中的应用。
2.gusA基因在制备用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的产品中的应用，所述产品以gusA基因或gusA基因片段为靶序列；
优选地，所述gusA基因片段具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
3.一种用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的核苷酸探针，其特征在于，所述核苷酸探针以gusA基因片段为靶序列，所述gusA基因片段具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述核苷酸探针包括具有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的探针。
4.根据权利要求3所述的核苷酸探针，其特征在于，所述核苷酸探针包括双标记探针；
优选地，所述双标记包括至少一个荧光标记；
优选地，所述双标记均为荧光标记；
优选地，所述荧光标记包括FAM标记或TAMRA标记。
5.一种用于检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求3或4所述的核苷酸探针，还包括扩增试剂和/或扩增耗材。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述扩增试剂包括引物对，所述引物对由用于扩增gusA基因片段的上游引物和下游引物组成，所述gusA基因片段具有如SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列，所述引物对与核苷酸探针在与gusA基因片段结合的结合位点上无重叠或部分重叠。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述引物对具有如SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5所示的核苷酸序列。
8.一种检测饮用水大肠埃希氏菌浓度的方法，其特征在于，所述方法包括，配制已知gusA基因拷贝数的标准阳性样品A、已知大肠埃希氏菌系列浓度的标准阳性样品B和待测饮用水样品，采用权利要求3或4所述的核苷酸探针或者权利要求5～7任一项所述的试剂分别检测标准阳性样品A、标准阳性样品B和待测饮用水样品中gusA基因片段的拷贝数，根据标准阳性样品A和标准阳性样品B的检测结果分别绘制Ct值与gusA基因片段的拷贝数的标准曲线A，和，gusA基因片段的拷贝数与大肠埃希氏菌系列浓度的标准曲线B，根据标准曲线A和B，通过待测饮用水样品的Ct检测结果，计算得到待测饮用水中大肠埃希氏菌浓度；
优选地，待测饮用水样品包括管网水或出厂水；
优选地，所述标准阳性样品的DNA提取方法包括沸水浴法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括配制不含大肠埃希氏菌的标准阴性样品，和采用权利要求3或4所述的核苷酸探针或者权利要求5～7任一项所述的试剂检测标准阴性样品中gusA基因片段的拷贝数的步骤，所述标准阳性样品和标准阴性样品的检测结果作为质控标准；
优选地，所述质控达标标准为标准阴性样品的Ct值为N/A，标准阳性样品的Ct值小于等于35，且标准阳性样品出现扩增曲线；
优选地，Ct值大于35的待测饮用水样品重复检测；检测结果无Ct值的待测饮用水样品为阴性样品；检测结果有Ct值，且出现扩增曲线的待测饮用水样品为阳性样品。
10.一种饮用水大肠埃希氏菌浓度检测装置，其特征在于，所述检测装置包括：
获取单元，用于配制标准阳性样品、待测饮用水样品和标准阴性样品，还用于储存权利要求3或4所述的核苷酸探针或权利要求5～7任一项所述的试剂；
处理单元，用于采用核苷酸探针或者试剂分别检测标准阳性样品、待测饮用水样品和标准阴性样品中gusA基因片段的拷贝数，根据标准阳性样品的检测结果绘制标准曲线；
输出单元，根据权利要求9所述的质控标准输出待测饮用水样品的阴性样本标识或阳性样本标识，根据标准曲线输出待测饮用水样品中大肠埃希氏菌浓度。
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