CN112126698A - 检测大肠埃希氏菌o157的实时荧光raa的引物、探针、试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法，引物的序列中上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示；探针的序列为如SEQ ID NO.3所示；试剂盒包括引物、探针、缓冲液和纯化水，RAA检测方法：提取样品DNA，以样品DNA为模板，利用试剂盒进行RAA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测；本发明的实时荧光RAA检测方法的特异性达100％，灵敏度达8.0×10¹cfu/mL，15min内可得到结果，比实时荧光PCR方法更快速。该方法简便、快速、灵敏、便携、价格低廉，可用于疾病监测、食品安全检测，适合基层实验室推广应用。

Description

检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒 和检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法。

背景技术

大肠埃希氏菌O157是肠出血性大肠埃希氏菌最重要的一群，具有极低的感染剂量(小于100个细胞)，可导致腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒综合症等。自首次发现因该致病菌引起的食物中毒以来，O157引起的疫情开始逐渐扩散和蔓延，相继在英国、加拿大和日本等多个国家引起腹泻爆发和流行。目前已发现可通过多种食物传播，包括香肠、未消毒的牛奶、生菜、香瓜、苹果汁和萝卜苗等。传统的O157检测方法依赖形态及生化特性，因此存在操作复杂繁琐、检测周期长、自动化程度低和无法批量化处理等缺点，难以满足短保质期食品快速放行、现场执法监管、食品安全突发事件应对处理以及举办重大活动时快速检测的需求。近年来，基于免疫和核酸的各种快速检测方法发展起来，免疫方法特异性和灵敏度较差，而基于核酸的方法具有快速、灵敏和准确等优点，主要以实时荧光PCR法为主。然而，实时荧光PCR基于热循环仪，仪器昂贵，且对操作人员要求高，因此在基层实验室推广应用较为困难。

重组酶等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)是新一代核酸分子检测技术，该技术利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温(37-39℃)条件下进行核酸扩增，结合荧光探针实现即时检测，是一种精准、方便、快速的核酸检测技术，实现5-15min完成检测输出结果，比实时荧光PCR技术更快速和便捷。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物和探针。

本发明的第二个目的是提供包括上述引物和探针的试剂盒。

本发明的第三个目的是提供利用上述试剂盒的RAA检测方法。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物和探针，引物的序列为：

上游引物：TTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCG；SEQ ID NO.1；

下游引物：TCAGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCTATAGC；SEQ ID NO.2；

探针的序列为：TAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTT(FAM)-THF-T(BHQ1)-AGGCTACAATTATAG(3'blocker)；SEQ ID NO.3。

进一步地，上游引物为30bp，下游引物为32bp，探针为49bp，探针共有4个修饰基团，分别为荧光基团、四氢呋喃、淬灭基团和C3-spacer，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，FAM和BHQ1均在T位置修饰，FAM和BHQ1中间间隔1个碱基，被四氢呋喃替换，C3-sapacer位于3’端末尾。

为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：

一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的试剂盒，其包括上述的引物、探针、缓冲液和纯化水。

为达到上述第三个目的，本发明的解决方案是：

一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的方法，其包括如下步骤：

(1)、提取样品DNA；

(2)、以样品DNA为模板，利用上述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

进一步地，步骤(2)中，重组酶介导等温核酸扩增的反应体系为：缓冲液为25μL，上游引物为10μmol/L、2.1μL，下游引物为10μmol/L、2.1μL，探针为10μmol/L、0.6μL，纯化水为13.7μL，总体积为43.5μL。

进一步地，步骤(2)中，重组酶介导等温核酸扩增的反应条件为：39℃反应30min。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明所建立的实时荧光RAA检测方法的特异性达100％，灵敏度达8.0×10¹cfu/mL，与现有技术中实时荧光PCR方法相当，15min内得到结果，比实时荧光PCR方法更快速。该方法简便、快速、灵敏、便携、价格低廉，可用于疾病监测、食品安全检测，适合基层实验室推广应用。

附图说明

图1为本发明的大肠埃希氏菌O157的RAA优化的引物和探针设计示意图，其中，引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示。

图2为本发明的实施例3中RAA方法的无菌水和第2株至第14株菌株的特异性检测结果图(1：无菌水、2：大肠埃希氏菌AS1.90、3：克罗诺杆菌ATCC25944、4：副溶血性弧菌ATCC17802、5：大肠埃希氏菌88b(食品样品中分离菌株)、6：大肠埃希氏菌70d STEC(食品样品中分离菌株)、7：大肠埃希氏菌96STEC(食品样品中分离菌株)、8：大肠埃希氏菌23b(食品样品中分离菌株)、9：大肠埃希氏菌CICC10669(O157)、10：大肠埃希氏菌CICC10668、11：大肠埃希氏菌908e STEC(食品样品中分离菌株)、12：大肠埃希氏菌CICC10670(O157)、13：大肠埃希氏菌FSCC149015(O157)、14：大肠埃希氏菌ATCC03820(O157))。

图3为本发明的实施例3中RAA方法的无菌水和第15株至第23株菌株的特异性检测结果图(15：蜡样芽胞杆菌ATCC11778、16：肺炎克雷伯菌ATCC13883、17：福氏志贺氏菌CMCC(B)51572、18：溶血性链球菌ATCC21059、19：铜绿假单胞菌ATCC27853、20：单增李斯特菌ATCC BAA751、21：伊氏李斯特菌ATCC19119、22：无菌水、23：大肠埃希氏菌FSCC149015(O157))。

图4为本发明的实施例3中RAA方法的第24株至第29株大肠埃希菌的特异性检测结果图(24：大肠埃希氏菌EAEC CICC24186、25：大肠埃希氏菌ETEC CICC10667、26：大肠埃希氏菌EIEC CICC24188、27：大肠埃希氏菌EPEC CICC24189、28：大肠埃希氏菌EHECCICC24187(O157)、29：大肠埃希氏菌STEC CICC10670(O157))。

图5为本发明的实施例3中RAA方法的无菌水和第31株至第35株菌株的特异性检测结果图(30：无菌水、31：奇异变形杆菌ATCC12543、32：鼠伤寒沙门氏菌CMCC50013、33：大肠埃希氏菌ATCC25922、34：大肠埃希氏菌FSCC149015(O157)、35：大肠埃希氏菌CICC10907(O157))。

图6为本发明的实施例4中FSCC149015(O157)实时荧光RAA纯菌灵敏度检测结果(1：原液浓度8.0×10⁷cfu/m，2：10^-1稀释液浓度为8.0×10⁶cfu/mL，3：10^-2稀释液浓度为8.0×10⁵cfu/mL，4：10^-3稀释液浓度为8.0×10⁴cfu/mL，5：10^-4稀释液浓度为8.0×10³cfu/mL，6：10^-5稀释液浓度为8.0×10²cfu/mL，7：10^-6稀释液浓度为8.0×10¹cfu/mL，8：10^-7稀释液浓度为8.0cfu/mL，9：10^-8稀释液浓度为0.8cfu/mL，10：无菌水)。

图7为本发明的实施例4中FSCC149015(O157)实时荧光PCR纯菌灵敏度检测结果(1：原液浓度8.0×10⁷cfu/mL，2：10^-1稀释液浓度为8.0×10⁶cfu/mL，3：10^-2稀释液浓度为8.0×10⁵cfu/mL，4：10^-3稀释液浓度为8.0×10⁴cfu/mL，5：10^-4稀释液浓度为8.0×10³cfu/mL，6：10^-5稀释液浓度为8.0×10²cfu/mL，7：10^-6稀释液浓度为8.0×10¹cfu/mL，8：10^-7稀释液浓度为8.0cfu/mL，9：10^-8稀释液浓度为0.8cfu/mL，10：无菌水)。

具体实施方式

本发明提供了一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法。

RAA扩增的实时检测依赖于核酸外切酶Ⅲ，它会切断exo－探针中的四氢呋喃(THF)，导致荧光基团和荧光淬灭基团的分离，扩增结果通过exo－探针检测。此探针携带一个荧光基团和一个荧光淬灭基团，分别与一个胸腺嘧啶结合，中间由一个四氢呋喃(THF)碱基隔开，当此结构完整时，荧光强度低。当探针与靶序列结合时，连接荧光基团和淬灭基团的THF碱基位点就会被核酸外切酶Ⅲ识别并酶解，下游的淬灭基团被释放，荧光强度增强。酶切后产生的游离3'－OH作为DNA聚合酶的靶点并扩增此探针，荧光强度也会随着其扩增而增强。荧光强度信号实时检测由荧光信号检测器或扫描仪完成，其敏感度强、特异性强，检测所需时间短。具体地，本发明公开了一种实时荧光重组酶等温核酸扩增技术检测的方法，包括上游引物、下游引物和exo－探针。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：引物和探针设计

大肠埃希氏菌O157含有特有的rfbE基因，因此通过查找到的O157 rfbE序列(AF163329.1)，进行多序列比对，经同源性分析之后，以此目的片段进行荧光检测引物和探针设计。

O157 rfbE序列(AF163329.1)

其中，大肠埃希氏菌O157实时荧光RAA引物和探针见表1。

表1大肠埃希氏菌O157实时荧光RAA引物和探针信息

上述引物和探针均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2：

RAA检测方法，包括如下步骤：

(1)、提取样品DNA；

a.增菌液模板DNA的制备

i)吸取1mL菌液加入1.5mL离心管中，12000g离心3min，弃上清；

ii)加入1mL 0.85％无菌生理盐水，完全溶解沉淀，12000g离心3min，弃上清；

iii)加入100μL无菌水混匀后沸水浴10min，置冰上冷却；

iv)12000g离心12min，上清液即为模板DNA。

b.可疑菌落模板DNA的制备

对于分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落再按照iii步骤制备模板DNA以待检测。

(2)、以样品DNA为模板，利用实施例1中的引物和探针进行RAA检测。

(3)、收集荧光信号，得出样品检测结果。

其中，RAA检测的反应体系和反应条件：

RAA各反应组分见表2，将表2各组分按“样品数量(n)+1”份倍比添加混匀后，分装43.5μL混合液至荧光基础反应单元中，轻柔手弹使冻干粉充分重溶均匀，短暂离心，打开反应单元，向每个反应单元的管盖上加入2.5μL乙酸镁，然后向各反应单元加入4μL模板DNA，充分混匀并离心，将反应管放入荧光检测仪(江苏奇天恒温核酸扩增检测仪)中39℃反应30min。

表2大肠埃希氏菌O157 RAA反应体系表

实施例3：特异性试验

采用实施例2中的RAA检测方法对以下材料进行检测。

材料：共采用29株菌株进行特异性测试，包含性测试6株O157菌株：大肠埃希氏菌CICC10669、大肠埃希氏菌CICC10670、大肠埃希氏菌FSCC149015、大肠埃希氏菌ATCC03820、肠出血性大肠埃希氏菌CICC24187、大肠埃希氏菌CICC10907。排外性测试共23株，包括12株非O157的大肠埃希氏菌和11株非大肠埃希氏菌。12株非O157的大肠埃希氏菌包括：大肠埃希氏菌AS1.90、大肠埃希氏菌88b(食品样品中分离菌株)、大肠埃希氏菌70d STEC(食品样品中分离菌株)、大肠埃希氏菌96STEC(食品样品中分离菌株)、大肠埃希氏菌23b(食品样品中分离菌株)、大肠埃希氏菌CICC10668、大肠埃希氏菌908e STEC(食品样品中分离菌株)、肠聚集性大肠埃希氏菌EAEC CICC24186、肠产毒性大肠埃希氏菌ETEC CICC10667、肠侵袭性大肠埃希氏菌EIEC CICC24188、肠致病性大肠埃希氏菌EPEC CICC24189、大肠埃希氏菌ATCC 25922；11株非大肠埃希氏菌包括：克罗诺杆菌ATCC25944、副溶血性弧菌ATCC17802、蜡样芽胞杆菌ATCC11778、肺炎克雷伯菌ATCC13883、福氏志贺氏菌CMCC(B)51572、溶血性链球菌ATCC21059、铜绿假单胞菌ATCC27853、单增李斯特菌ATCC BAA751、伊氏李斯特菌ATCC19119、奇异变形杆菌ATCC12543、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50013。检测反应条件为：39℃反应30min。

本方法对所有6株O157检测结果均为阳性，对所有12株非O157的大肠埃希氏菌和11株非大肠埃希氏菌检测结果均为阴性，与非O157无交叉反应，特异性达100％(图2至图5)。

实施例4：灵敏度试验

用棉签挑取血平板上新鲜生长的大肠埃希氏菌FSCC149015(O157)在10mL 0.85％氯化钠盐水中混匀，依次吸取2mL菌悬液在18mL 0.85％氯化钠盐水中，制成10^-1-10^-8的稀释液。从每个稀释度管子中分别吸取1mL菌悬液提取DNA，进行实时荧光RAA反应和实时荧光PCR反应，实时荧光PCR所用引物探针参考美国FDA BAM(上游引物：CTCGATAAATTGCGCATTCTATTC，下游引物：CAATACGGAGAGAAAAGGACCAA，探针：6FAM-ACTTAGTGGCTGGGAATGCATCGGC-BHQ1)。同时分别吸取100μL涂布于麦康凯琼脂平板上，36±1℃培养24h，对不同梯度菌液进行计数，计算RAA方法灵敏度(cfu/mL)。

由图6和图7可知，实时荧光RAA方法和实时荧光PCR方法均对8.0×10¹cfu/mL、8.0×10²cfu/mL、8.0×10³cfu/mL、8.0×10⁴cfu/mL、8.0×10⁵cfu/mL、8.0×10⁶cfu/mL和8.0×10⁷cfu/mL的大肠埃希氏菌FSCC149015(O157)均可检出，对小于8.0×10¹cfu/mL的大肠埃希氏菌FSCC149015(O157)均未检出，因此该方法对大肠埃希氏菌O157纯菌的灵敏度达8.0×10¹cfu/mL，与实时荧光PCR相当；但实时荧光RAA方法检测时间更短，15min内对8.0cfu/mL及以上浓度的菌悬液均能全部检出，而实时荧光PCR需要约1h(40个循环)。

综上可知，本发明的实时荧光RAA检测方法的特异性达100％，灵敏度达8.0×10¹cfu/mL，与美国FDA BAM公布的实时荧光PCR方法相当。一般5min内可得到结果，对于浓度低至8.0×10¹cfu/mL的O157，15min内可得到结果，比实时荧光PCR方法更快速。该方法简便、快速、灵敏、便携、价格低廉，可用于疾病监测、食品安全检测，适合基层实验室推广应用。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心

<120> 检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法

<141> 2020-11-03

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ttgtcacgaa tgacaaaaca ctttatgacc g 31

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tcagcttgtt ctaactgggc taatcctata gc 32

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tagctgtaca taggcaatat tggcatgacg ttataggcta caattatag 49

Claims (7)

1.一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物和探针，其特征在于，所述引物的序列为：

上游引物：TTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCG；SEQ ID NO.1；

下游引物：TCAGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCTATAGC；SEQ ID NO.2；

探针的序列为：TAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTT(FAM)-THF-T(BHQ1)-AGGCTACAATTATAG(3'blocker)；SEQ ID NO.3。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，上游引物为30bp，下游引物为32bp，探针为49bp，探针共有4个修饰基团，分别为荧光基团、四氢呋喃、淬灭基团和C3-spacer，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，FAM和BHQ1均在T位置修饰，FAM和BHQ1中间间隔1个碱基，被四氢呋喃替换，C3-sapacer位于3’端末尾。

3.一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物和探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液和纯化水。

5.一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)、提取样品DNA；

(2)、以样品DNA为模板，利用试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测；

所述试剂盒为权利要求3所述的试剂盒。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组酶介导等温核酸扩增的反应体系为：缓冲液为25μL，上游引物为10μmol/L、2.1μL，下游引物为10μmol/L、2.1μL，探针为10μmol/L、0.6μL，纯化水为13.7μL，总体积为43.5μL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组酶介导等温核酸扩增的反应条件为：39℃反应30min。

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