CN108531632A

CN108531632A - 一种用于检测大肠杆菌o157:h7活性的荧光raa引物、探针及检测方法

Info

Publication number: CN108531632A
Application number: CN201810644210.2A
Authority: CN
Inventors: 周冬根; 罗洁; 应清界; 俞雪钧
Original assignee: NINGBO INTERNATIONAL TRAVEL SANITARY HEALTH-CARE CENTER
Current assignee: NINGBO INTERNATIONAL TRAVEL SANITARY HEALTH-CARE CENTER
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2018-09-14

Abstract

本发明提供了一种用于检测粪便样品中大肠杆菌O157:H7活性的荧光RAA引物和探针及检测方法，该荧光RAA引物和荧光探针可以快速、定性检测粪便样本中的大肠杆菌O157:H7活性，能在39℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；该荧光RAA引物和荧光探针特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。

Description

一种用于检测大肠杆菌O157:H7活性的荧光RAA引物、探针及检测方法

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及一种用于检测粪便样品中大肠杆菌O157:H7活性的荧光RAA引物和探针及检测方法。

背景技术

大肠杆菌O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力试验呈阳性。其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性。大肠杆菌O157:H7 具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小时；耐低温，能在冰箱内长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；不耐热，75℃1分钟即被灭活；对氯敏感，被1mg/L的余氯浓度杀灭。大肠杆菌O157:H7的最适生长温度为 33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生长不良，45.5℃停止生长。因此，为及时有效发现大肠杆菌O157:H7，将该细菌防范于国门之外，建立快速、敏感、特异的检测方法十分必要。

随着全球化发展，方便、快捷的交通运输工具使旅游及不同国家和地区动物、动物产品的跨境移动日益频繁，也给传染病的传播和流行创造了有利条件。此外，大肠杆菌O157:H7早期感染呈现不典型症状，与其它细菌感染症状类似，很难区分。而且目前尚无针对大肠杆菌O157:H7感染的有效治疗药物，无疑进一步加大了大肠杆菌O157:H7的防控。因此，建立快速诊断大肠杆菌O157:H7 感染的实验室方法显得尤为重要。

传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在症状时期检测到细菌的感染，并且快速灵敏，目前已被广泛的应用于大肠杆菌O157:H7的检测。目前，国内外已建立的大肠杆菌O157:H7检测方法有实时PCR检测方法、半巢式PCR检测方法、LAMP检测方法等，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，而LAMP方法引物较复杂，必须用特殊的软件设计，且用LAMP方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。

发明内容

本发明目的是提供一种用于重组酶介导核酸扩增技术检测大肠杆菌 O157:H7活性的荧光RAA引物和荧光探针以及使用该荧光RAA引物和荧光探针对大肠杆菌O157:H7活性的检测方法，该检测方法可以快速、定性检测粪便样本中的大肠杆菌O157:H7活性。

本发明的一个目的是提供一种用于检测大肠杆菌O157:H7的引物对，所述引物对包括下述1)-3)中的至少一种：

1)序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；和在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用 2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述具有相同功能具体包括能用于检测或特异性扩增大肠杆菌O157:H7基因组中的特异保守区域核苷酸序列。

本发明的再一个目的是提供一种用于检测大肠杆菌O157:H7的探针，所述探针包括下述1)-3)中的至少一种：

1)所述探针的核苷酸序列为：

5'-GAGGCAATAGTCAATCATCTTCAAGAGCCNMNAGCGTAAGCAGAAAC-3'，

其中，所述N代表任意核苷酸或任意修饰后的核苷酸，所述M代表具环状结构的化合物；再具体的，所述N代表任意荧光基团或荧光淬灭基团修饰后的核苷酸；

2)在高严谨条件下可与1)所述的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)所述的探针的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具体的，所述N代表携带有荧光素基团FAM的胸腺嘧啶脱氧核苷酸FAM-dT 或携带有荧光淬灭基团BHQ的胸腺嘧啶脱氧核苷酸BHQ-dT，所述M代表四氢呋喃。

具体的，所述探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测大肠杆菌O157:H7的组合物，所述组合物包括下述1)和2)：

1)本发明所述的引物对；

2)本发明任一所述的探针。

本发明的还一个目的是提供一种用于检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，所述试剂盒包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)本发明所述的引物对；

2)本发明任一所述的探针；

3)本发明所述组合物。

具体的，当所述试剂盒同时包括所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为21：21：6。

本发明的再一个目的是提供一种大肠杆菌O157:H7的检测方法，所述检测方法不包括疾病的诊断或治疗的方法；所述检测方法包括使用下述1)-3)中的至少一种进行检测：

1)本发明所述的引物对；

2)本发明任一所述的探针；

3)本发明所述组合物。

具体的，所述检测方法还包括下述1)-2)中的至少一种：

1)当所述检测方法同时使用了所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为21：21：6；

2)提取待检测样品的DNA作为模板，进行RAA反应，所述RAA反应的反应温度包括37-39℃，再具体的，为39℃；反应时间包括20分钟以上。

本发明的又一个目的是提供本发明任一所述引物对、本发明任一所述探针、本发明任一所述组合物、本发明任一所述试剂盒、本发明任一所述检测方法在检测大肠杆菌O157:H7中的应用，所述应用不包括涉及疾病的诊断或治疗方法的应用。

本发明的还一个目的是提供本发明任一所述引物对、本发明任一所述探针、本发明任一所述组合物、本发明任一所述试剂盒、本发明任一所述检测方法在制备检测大肠杆菌O157:H7相关产品中的应用。

本发明的有益效果包括：

本发明目的是提供一种用于重组酶介导核酸扩增技术检测大肠杆菌O157:H 7活性的荧光RAA引物和荧光探针以及该荧光RAA引物和荧光探针在检测大肠杆菌O157:H7中的应用，该荧光RAA引物和荧光探针可以快速、定性检测血清样本中的大肠杆菌O157:H7。

本发明提供的荧光RAA引物和荧光探针，应用该荧光RAA引物和荧光探针检测大肠杆菌O157:H7时，不依赖于昂贵的PCR仪器，且检测时间较PCR方法或荧光PCR显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至更高。

在RAA反应过程中，大肠杆菌O157:H7DNA通过利用重组酶代替PCR高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止DNA链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以DNA为模板合成目的产物。反应在39℃下进行20 分钟.此外，RAA技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套RAA多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式PCR技术无法相比的。RAA 技术不依赖于PCR仪器的便捷性能，且检测时间较PCR方法或荧光荧光PCR显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至更高，是革命性的技术突破，能充分扩大核酸扩增技术的应用领域。

本发明可以实现单管现场、快速检测大肠杆菌O157:H7，与其它检测技术相比具有以下优点：

1、全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；

2、不依赖于PCR等贵重仪器，甚至能在37-39℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；

3、本发明提供的荧光RAA引物和荧光探针特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为灵敏度实验结果图。

图2为特异性实验结果图。

图3为临床样品检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于检测大肠杆菌O157:H7活性的荧光RT-RAA引物、探针的设计

针对于大肠杆菌O157:H7的特异保守区域为靶标区域，设计特异性引物及荧光RAA探针，其序列分别是：

正向引物，如序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列：

5'-TCCACATTGAGGGGACTGGAGGCAATAGTC-3'

反向引物，如序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列：

5'-GATCACCTCCTACTGCTCCGATTCCAGATG-3'

寡核苷酸探针，如序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列：

5'-GAGGCAATAGTCAATCATCTTCAAGAGCC(FAM-dT)(THF)(BHQ-dT)AGCGTAAGCAGAAAC-3'；

其中：

FAM-dT表示携带有荧光素基团FAM(6-Carboxyfluorescein)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；

THF表示四氢呋喃(tetrahydrofuran)连接子；

BHQ-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ(black hole quencher)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

实施例2、一种用于检测大肠杆菌O157:H7的荧光RAA方法的建立

(一)荧光RAA反应

1)粪便样品中DNA的提取：所述粪便样品中DNA的提取可以采用DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。

2)采用实施例1设计的正向引物、反向引物和探针，以及RAA反应试剂盒 (本实施例具体采用了江苏奇天基因生物科技有限公司的RAA基础试剂盒)，以本实施例步骤1)提取的粪便样品中DNA为模板，进行扩增反应，其中反应体系如下：

25μl RAA反应缓冲液(江苏奇天基因生物科技有限公司RAA基础试剂盒提供)；

实施例1设计的正向引物、反向引物(10μM)各2.1μL；

0.6μL实施例1设计的探针(10μM)；

1μL步骤1)提取的粪便样品中DNA模板；

加16.5μL双蒸水至47.5μL，混合均匀，然后加入到有干粉(江苏奇天基因生物科技有限公司RAA基础试剂盒提供)的反应管中，再次混匀。各管加入2.5μL 280mM醋酸镁溶液并混匀。

(二)荧光检测

将上述反应管放置于RAA F-6100荧光基因检测仪(江苏奇天基因生物科技有限公司)，在39℃反应20min，进行荧光检测。

阴性对照：FAM通道无扩增曲线，且无Tt值；

阳性对照：FAM通道有扩增曲线，Tt值均≤8min

上述对阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。

样品检测结果判读：

当所检测的样品FAM通道均有扩增曲线，质量控制正常时，可判定大肠杆菌O157:H7阳性；

当所检测的样品FAM通道无扩增曲线，且Tt值显示为Undet或No Tt，质量控制正常时，可判定大肠杆菌O157:H7阴性。

(三)灵敏度实验

标准品DNA的制备：大肠杆菌O157:H7标准菌株及分离菌株在BPW培养基中扩培4－8小时，加入DNA提取液加热100℃5min，进行分装备用，冻存于 -80℃。

该实验验证该检测方法的最低检测限，采用浓度为1.0×10⁶copies/mL、 1.0×10⁵copies/mL、1.0×10⁴copies/mL、1.0×10³copies/mL、 1.0×10²copies/mL、10copies/mL的阳性标准品DNA作为检测限参比品，RAA 荧光反应过程、反应体系(除模板DNA浓度不同，其它均相同)均与本实施例步骤(一)和(二)相同。

通过该实验表明该检测方法的检测限达到10copies/mL，具体实验结果如图1所示。

图1中10⁶拷贝、10⁵拷贝、10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝、10拷贝分别表示浓度为1.0×10⁶copies/mL、1.0×10⁵copies/mL、1.0×10⁴copies/mL、 1.0×10³copies/mL、1.0×10²copies/mL、10copies/mL的阳性标准品DNA的扩增曲线，阴性为阴性对照，横坐标表示反应时间，纵坐标mV表示荧光值。图1 所示结果表明，该检测方法的检测限达到10copies/mL。

(四)特异性实验

该实验选择与大肠杆菌O157:H7具有相同感染感染部位的常见病原体作为特异性参考品。特异性参考品分别为沙门氏菌、霍乱弧菌以及金黄色葡萄球菌。利用DNA提取试剂盒提取以上样本中的DNA作为模板进行实验，RAA荧光反应过程、反应体系(除模板DNA种类不同外，其它均相同)均与本实施例步骤(一) 和(二)相同。

特异性实验结果如图2所示。

图2中横坐标表示反应时间，纵坐标mV表示荧光值。图2所示结果表明， 4种特异性参考品均未有扩增曲线，只有大肠杆菌O157:H7检测出相应的特异性扩增曲线，无交叉反应，说明该检测方法的特异性良好。

(五)临床阳性样品检测实验

该实验室选择2例临床分离阳性样本对该方法进行检测、验证。RAA荧光反应过程、反应体系(除模板DNA不同外，其它均相同)均与本实施例步骤(一) 和(二)相同具体实验结果如图3所示。

图3中横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图3实验数据表明该检测方法均能检出2例临床分离阳性样本，扩增效果优异。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 宁波国际旅行卫生保健中心

<120> 一种用于检测大肠杆菌O157:H7活性的荧光RAA引物、探针及检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccacattga ggggactgga ggcaatagtc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatcacctcc tactgctccg attccagatg 30

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n=FAM-dT

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> m=THF

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> n=BHQ-dT

<400> 3

gaggcaatag tcaatcatct tcaagagccn mnagcgtaag cagaaac 47

Claims

1.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的引物对，其特征在于，所述引物对包括下述1)-3)中的至少一种：

2.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的探针，其特征在于，所述探针包括下述1)-3)中的至少一种：

1)所述探针的核苷酸序列为：

5'-GAGGCAATAGTCAATCATCTTCAAGAGCCNMNAGCGTAAGCAGAAAC-3'，

其中，所述N代表任意核苷酸或任意修饰后的核苷酸，所述M代表具环状结构的化合物；

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID№：3所示核苷酸序列。

4.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的组合物，其特征在于，所述组合物包括下述1)和2)：

1)权利要求1所述的引物对；

2)权利要求2或3任一所述的探针。

5.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)权利要求1所述的引物对；

2)权利要求2或3任一所述的探针；

3)权利要求4所述组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒同时包括所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为21：21：6。

7.一种大肠杆菌O157:H7的检测方法，其特征在于：所述检测方法不包括疾病的诊断或治疗的方法；所述检测方法包括使用下述1)-3)中的至少一种进行检测：

1)权利要求1所述的引物对；

2)权利要求2或3任一所述的探针；

3)权利要求4所述组合物。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括下述1)-2)中的至少一种：

2)提取待检测样品的DNA作为模板，进行RAA反应，所述RAA反应的反应温度包括37-39℃；反应时间包括20分钟以上。

9.权利要求1所述引物对、权利要求2或3任一所述探针、权利要求4所述组合物、权利要求5-6任一所述试剂盒、权利要求7-8任一所述检测方法在检测大肠杆菌O157:H7中的应用，所述应用不包括涉及疾病的诊断或治疗方法的应用。

10.权利要求1所述引物对、权利要求2或3任一所述探针、权利要求4所述组合物、权利要求5-6任一所述试剂盒、权利要求7-8任一所述检测方法在制备检测大肠杆菌O157:H7相关产品中的应用。