CN108424973B - 一种用于rna恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于rna恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法。本发明特异性检测引物探针以及含有该检测引物探针的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过RNA恒温扩增的检测方法具有灵敏度高、特异性强、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)、快速的特点，对仪器要求低，操作过程简单，适合食品企业和基层检测机构自检使用，适用于现场检测，尤其适用于奶粉快速检测和保障奶粉安全。

Description

一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及 检测方法
技术领域
本发明涉及致病菌微生物检测技术领域，具体涉及一种基于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属(CS)快速检测技术，特别涉及检测克罗诺杆菌的特异性检测引物探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
克罗诺杆菌属(Cronobacter)，原称为阪崎肠杆菌，阪崎肠杆菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科。它是乳制品中近几年新发现的引起广泛关注的一种致病菌。克罗诺杆菌毒力强，能导致新生儿脑膜炎、致死性小肠结肠炎和菌血症等疾病，尽管使用抗生治疗可以康复，但伴随着严重的神经系统后遗症、发育障碍等症状，由该菌引起的感染死亡率高达50％以上。近年来，婴儿配方奶粉中污染克罗诺杆菌的报道较多，其散发和爆发的病例在全球范围内相继出现，已引起世界多国相关部门的重视。因此，快速检测婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌属，不仅能够及时有效地预防治疗相关疾病，同时也是保障人民身体健康的必要手段。
近年来，食源性致病菌的快速检测和鉴定方法发展较为迅速，以免疫学为基础的ELISA技术、免疫磁珠技术、全自动免疫酶标检测系列、免疫胶体金技术等，以分子生物学为基础的RNA指纹图谱技术、实时荧光PCR技术、基因芯片技术等，以纸片法为代表的细菌代谢为基础的酶触反应技术等，这些快速检测方法大大缩短了致病菌检验的时间，提高了检验效率，但也存在一些问题难以解决。国标培养法检测阪崎肠杆菌需要4～7天，行标实时荧光PCR法需要2～5天，实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)检测阪崎肠杆菌需要6小时，Nucleic Acid Sequence Based Amplification(NASBA)和Transcription MediatedAmplification(TMA)暂无阪崎肠杆菌相关检测试剂盒。
传统阪崎肠杆菌检测方法由于菌浓度较低且培养条件要求较高，耗费时间长、检验效率低，从而导致不能及时监控阪崎肠杆菌，不能实现现场检测。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法，实现对克罗诺杆菌的现场快速、准确检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的引物探针，所述引物序列为：
上游引物：CTTACCAGGTGTTGACATCC；
下游引物：
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAACATCTCAGAACACGTGCT；
所述探针为荧光探针，其序列为：
CACCGAGUGCCUUCGGGAACGGUG。
优选的，所述荧光探针5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
本发明还提供了一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的试剂盒，所述试剂盒包括含有上述技术方案所述引物探针的检测液，含有T7RNA聚合酶和M-mLV反转录酶的酶液和反应液。
优选的，所述试剂盒还包括：裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。
进一步优选的，所述试剂盒中包括以下试剂组成：
(1)裂解液：10％Triton X-100，4.5～5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCI，pH8.0；
(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μΜ捕获探针；
(3)洗涤液：2～2.5mmol/L NaCl，4.5mol/L～5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L TrisHCI，pH 8.0，10％SDS；
(4)反应液：10mmol/L Tris HCI，40mmol/L MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mMNTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4；
(5)检测液：5～15pmol/L上游引物CS nT7，5～15pmol/L下游引物CS T7，5～10pmol/LCS荧光探针，1mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，DEPC水；
(6)酶液：500～1000U/反应M-mLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA；
(7)阳性对照：克罗诺杆菌属菌液；
(8)阴性对照：生理盐水。
本发明还提供了一种克罗诺杆菌属的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)提取待检样品中的菌体RNA；
(2)利用上述技术方案所述的引物探针对待检样品中的菌体RNA进行RNA恒温扩增，记录待检样品反应的ct值。FAM通道：ct≤55的样本为阳性；55＜ct＜60的样本建议重新检测，复检结果FAM通道：ct＜60的样本为阳性。FAM通道ct无数值或为60的样本为阴性。根据ct值判定是否含有克罗诺杆菌属菌体RNA。
优选的，所述待检样品为婴幼儿配方食品。
优选的，所述扩增反应体系为：5～15pmol上游引物CS nT7，5～15pmol下游引物CST7，5～10pmol CS荧光探针，10～40mM MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，500～1500UT7RNA聚合酶，500～1000U M-mLV反转录酶。
优选的，所述扩增反应条件为荧光PCR仪中42℃±0.1℃反应40～60min。
优选的，所述克罗诺杆菌属的检测方法由上述技术方案所述的试剂盒进行检测，具体操作方法包括：
(1)用所述裂解液裂解待测样品中的菌体，得到含有菌体核酸的裂解液；
(2)向步骤(1)的裂解液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标RNA结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到菌体RNA；
(3)将步骤(2)提取得到的菌体RNA加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，在60℃±0.1℃下温育8～12min后，再在42±0.1℃℃下温育4～6min，然后加入所述酶液，由此开始在42℃±0.1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；
(4)根据荧光信号产生的时间和强度，参照阳性对照和阴性对照结果对待测样品进行检测及判定；所述判定方法为：检测结果为阳性，则样品中有克罗诺杆菌属活菌，阴性则样品中没有克罗诺杆菌属活菌。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌的引物探针、试剂盒及检测克罗诺杆菌的方法，与现有的CS检测相比，本发明具有以下优点：
⑴高特异性：本发明针对CS靶核酸设计的特异性荧光探针，可高效、特异性检测CS的RNA；
⑵高灵敏度：本发明以RNA为模板扩增，菌株基底RNA浓度是DNA的1000倍，灵敏度可达102CFU/mL；
⑶快速检测：本发明将核酸的扩增与检测同步进行，扩增效率高，以100～1000拷贝/循环速率扩增，15～30min可将模板放大109倍。而且整个过程为恒温，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要50min，培养加检测5h即可得到结果，相比国标法时间大大缩短。
⑷能有效区别检测物中的死菌和活菌，检测更准确，更科学，避免假阳性。
⑸污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。
⑹设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。
可见，本发明试剂盒能够检测食品样本中的CS RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达102CFU/mL)、准确(避免假阳性)检测、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(50min完成扩增检测)的特点，将在克罗诺杆菌属快速检测中发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明：
图1为本发明实施例3中灵敏度检测结果；
图2为本发明实施例4中增菌后检测结果；
图3为本发明实施例5中特异性检测结果；
图4为本发明实施例6中食品样本的检测结果；
图5为本发明实施例7中CS菌灭菌后的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了上述技术方案中利用RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的引物探针，所述引物和探针均为特异性序列，可特异性检测阪崎肠杆菌。
本发明所述引物的序列分别为：
上游引物为CS nT7：CTTACCAGGTGTTGACATCC；
下游引物为CS T7：AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAA CATCTCAGAACACGTGCT；下游引物上具有T7RNA聚合酶识别的启动子序列。
在本发明中，所述CS荧光探针为分子信标，是具有一个环和一个自身互补的茎的发夹结构，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，分子信标的环部分和标靶互补，两头由于互补而成为茎。本发明所述探针的核酸分子序列为：
CACCGAGUGCCUUCGGGAACGGUG。本发明所述CS荧光探针5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。探针遇到靶标RNA探针将优先和靶RNA结合而不是形成发夹结构，由于茎结构被破坏，荧光报告物质与猝灭剂相互分离，报告物质得以发射荧光。探针在没有靶RNA存在的情况下荧光剂与猝灭剂可以稳定地结合在一起，不发射荧光，因而背景很低。
本发明提供了一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的试剂盒，所述试剂盒包括含有上述技术方案所述引物探针的检测液、含有T7RNA聚合酶和M-mLV反转录酶的酶液和反应液，还包括裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。
优选的，本发明用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的试剂盒中，包括以下各种试剂：
(1)裂解液：10％Triton X-100，4.5～5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCI，pH8.0，更优选为：10％Triton X-100，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCI，pH 8.0；
(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μΜ捕获探针，更优选为：150mM EDTA，400mg/L磁珠，40μΜ捕获探针；
(3)洗涤液：2～2.5mmol/L NaCl，4.5mol/L～5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L TrisHCI，pH 8.0，10％SDS，更优选为：2mmol/L NaCl，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCI，pH 8.0，10％SDS；
(4)反应液：10mmol/L Tris HCI，40mmol/L MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mMNTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4，更优选为10mmol/L TrisHCI，40mmol/L MgCl2，2.5mM dNTPs，5mM NTPs，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/LKH2PO4；
(5)检测液：5～15pmol/L上游引物CS nT7，5～15pmol/L下游引物CS T7，5～10pmol/LCS荧光探针，1mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，DEPC水，更优选为：10pmol/L上游引物CS nT7，10pmol/L下游引物CS T7，10pmol/LCS荧光探针，1mmol/L Tris-HCl pH8.0，EDTA，DEPC水；
(6)酶液：500～1000U/反应M-mLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA，更优选为：500U/反应M-mLV反转录酶、500U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA；
(7)阳性对照：克罗诺杆菌属菌液；
(8)阴性对照：生理盐水。
其中，所述阳性对照中，克罗诺杆菌属菌液中优选含有104～106CFU/mL的克罗诺杆菌。本发明所述试剂盒中的试剂均为本领域中的常规试剂，本发明对试剂来源没有限定，均可市购。
本发明检测克罗诺杆菌属的试剂盒采用的是RNA恒温扩增检测方法，使用M-mLV反转录酶和T7RNA多聚酶来同时实现核酸扩增，M-mLV反转录酶用于产生靶标RNA的一个DNA拷贝，T7RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的探针与扩增的靶标RNA特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。该试剂盒能够检测克罗诺杆菌属中的RNA，具有特异性高、灵敏度高和污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)的特点。
本发明还提供了一种克罗诺杆菌属的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)提取待检样品中的菌体RNA；
(2)利用上述任意一项所述技术方案的引物探针对待检样品中的菌体的RNA进行RNA恒温扩增，记录待检样品反应的ct值，根据ct值判定是否含有克罗诺杆菌菌体RNA。
在本发明中，所述待检样品优选为婴幼儿配方食品，所述婴幼儿配方食品来源没有特殊限定，任意制备或贮藏的婴幼儿配方食品或市售任何品牌的婴幼儿配方食品均可进行检测。本发明优选将待检样品溶解于生理盐水，裂解菌体后，提取菌体的RNA做为恒温扩增的模板。本发明所述裂解菌体及提取RNA的试剂优选采用本发明上述技术方案所述试剂盒中的试剂进行，所述方法均采用本领域技术人员所熟知的方法。
本发明所述恒温扩增反应体系优选为：5～15pmol上游引物CS nT7，5～15pmol下游引物CS T7，5～10pmol CS荧光探针，10～40mM MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，500～1500U T7RNA聚合酶，500～1000UM-mLV反转录酶；更优选为：10pmol上游引物CS nT7，10pmol下游引物CS T7，10pmolCS荧光探针，40mM MgCl2，2.5mM dNTPs，5mM NTPs，500UT7RNA聚合酶，500U M-mLV反转录酶。
本发明所述扩增反应可选的在荧光PCR仪中进行，所述反应温度优选为40～44℃，更优选为42℃，反应时间优选为40～60min，更优选为50min。
在本发明中，所述克罗诺杆菌属的检测方法优选由上述任意一项技术方案所述的试剂盒进行检测，具体操作方法包括：
(1)用所述裂解液裂解待测样品中的菌体，得到含有菌体核酸的溶液；
(2)向步骤(1)的所述溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标RNA结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到菌体RNA；
(3)将步骤(2)提取得到的菌体RNA加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，在60℃±0.1℃下温育10min后，再在42℃±0.1℃下温育5min，然后加入所述酶液，由此开始在42℃±0.1℃下反应50min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；
(4)根据荧光信号产生的时间和强度，参照CS阳性对照和CS阴性对照结果对待测样品进行检测及判定；所述判定方法为：检测结果为阳性，则样品中有克罗诺杆菌属活菌，阴性则样品中没有克罗诺杆菌属活菌。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属(CS)的专用引物和探针的设计
本发明选择CS细菌高度保守区段SEQ ID NO：1作为扩增靶序列区域，根据引物探针设计原理，使用DNAman软件人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测克罗诺杆菌属(CS)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：
⑴一对用于在M-mLV反转录酶作用下产生CS靶标核酸(CS RNA)的DNA拷贝的CS检测引物，所述CS检测引物由上游引物CS nT7和下游引物CS T7组成，上游引物CS nT7引物序列为5’-CTTACCAGGTGTTGACATCC-3’(SEQ ID NO：2)，下游引物CS T7引物序列为5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAACATCTCAGAACACGAGCT-3’，(SEQ ID NO：3)；
⑵一条用于在T7RNA聚合酶作用下根据所述CS靶标核酸(CS RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的CS检测探针CS Probe，所述CS检测探针CS Probe的核苷酸序列为5’-CACCGAGTGCCTTCGGGAACGGTG-3’，(SEQ ID NO：4)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
实施例2
制备克罗诺杆菌属(CS)的RNA恒温扩增检测试剂盒
利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明克罗诺杆菌属(CS)的RNA恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有CS T7引物、CS nT7引物、CS检测探针、M-mLV反转录酶和T7RNA聚合酶。
所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述CS T7引物、CS nT7引物和CS检测探针存在于CS检测液中，所述M-mLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于酶液中；具体来讲，试剂盒主要成分如下：
⑴裂解液：10％Triton X-100，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCI，pH 8.0；
⑵核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μΜ捕获探针；
⑶洗涤液：2mmol/L NaCl，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCI，pH 8.0，10％SDS；
⑷CS反应液：10mmol/L Tris-HCI，40mmol/L MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mMNTPs，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4；
⑸CS检测液：5～15pmol/L上游引物CS nT7，5～15pmol/L下游引物CS T7，5～10pmol/L荧光探针CS Probe，1mmol/L Tris～HCl PH8.0，EDTA，DEPC水。
⑹酶液：500～1000U/反应M-mLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/L Tris～HCl pH8.0，2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA；
⑺CS阳性对照：含有104～106CFU/mL克罗诺杆菌属的菌液；
⑻CS阴性对照：生理盐水。
实施例3
克罗诺杆菌属的RNA恒温扩增检测的灵敏度
用本发明试剂盒(组成见实施例2)检测奶粉中的克罗诺杆菌属(CS),具体方法包括以下步骤：
⑴菌液稀释
测定浓度为1×108CFU/mL的克罗诺菌培养物，10倍梯度分别稀释到107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL、100CFU/mL。
⑵核酸提取
在1.5mL EP管中加入200μL裂解液、100μL核酸提取液、200μL菌液，混匀，60℃温育10min，室温放置10min。将离心管置于磁珠分离器上，静置5min。保持离心管置于磁珠分离器上，吸取液体，保留磁珠；加入1mL洗涤液，震荡混匀后再放回磁珠分离器上，重复洗涤一次，将样品处理管移离磁珠分离器，管中为磁珠-核酸复合物，备用。
⑶恒温扩增检测
向样品处理管中加入40μL反应检测液(40μL CS反应液+2.5μL CS检测液)，CS检测液中CS T7引物浓度为10pmol，CS nT7引物浓度为10pmol，CS检测探针浓度为5pmol。
取振荡混匀的上述反应检测液30μL加至微量反应管，60℃保温10min，42℃保温5min；向微量反应管中加入10μL已预热至42℃的酶液，1200rpm振荡15s钟混匀。
将微量反应管移至天隆TL988PCR仪Ⅳ通道(西安天隆公司产品)，42℃反应50min，设定每50s检测一次荧光，共检测60次。
⑷结果判定
根据PCR扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取ct值，判定结果。
阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。ct表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数；
①阳性结果判定：
FAM通道：ct≤55的样本为阳性；55＜ct＜60的样本建议重新检测，复检结果FAM通道：ct＜60的样本为阳性。
②阴性结果判定：FAM通道ct无数值或为60。
⑸结果
图1显示灵敏度的检测图，CS菌液的浓度为102CFU/mL，检测结果为阳性，即检测下限灵敏度可以达到102CFU/mL。
实施例4
克罗诺杆菌属预增菌后的RNA恒温扩增检测灵敏度
本检测模式为本发明的另一个应用：试剂盒组成同实施例2，检测方法同实施例3，检测中所用试剂量同实施例3，具体方法包括以下步骤：
⑴菌液稀释
测定浓度为1×108CFU/mL的CS培养物，10倍梯度稀释到107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL、100CFU/mL、100CFU/10mL、100CFU/100mL、100CFU/1000mL，其中103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL、100CFU/mL、100CFU/10mL、100CFU/100mL、100CFU/1000mL，进行预增菌。
⑵核酸提取
⑶恒温扩增检测
⑷结果判定
步骤(2)～(4)的具体操作同实施例3。
⑸结果
根据F1通道的ct值情况，图2显示结果的检测图，CS菌液的浓度为100CFU/1000mL增菌后，检测结果为阳性，即增菌后检测下限可以达到100CFU/1000mL。
实施例5
克罗诺杆菌属的RNA恒温扩增检测特异性
本检测模式为本发明的另一个应用：试剂盒组成同实施例2；特异性参考品处理的方法如下：11例阴性参考品包括沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157:H7、普通变形杆菌、柠檬酸杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯氏菌，另设阳性对照(克罗诺杆菌属)一个。检测方法同实施例3，检测中所用试剂量同实施例3。
使用本发明试剂盒的检测结果如图3，11个阴性参考品的扩增曲线与阈值线无交叉，可明确判定为阴性。通过图3可以说明本发明的试剂盒对克罗诺杆菌属特异性好，能够准确检测。
实施例6
实际食品样本的RNA恒温扩增检测
本检测模式为本发明的另一个应用：试剂盒组成同实施例2，检测方法同实施例3，检测中所用试剂量同实施例3，克罗诺杆菌属检测食品样本类型包括：婴幼儿配方食品、乳和乳制品，具体方法包括以下步骤：
⑴食品样本处理：
取检样100g(或100mL)置灭菌锥形瓶中，加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，用手缓缓地摇动至充分溶解。克罗诺杆菌属样本编号为CS食品标本1～10，其中标本1～7及标本10为市售不同品牌的配方奶粉，涵盖婴儿奶粉的1段至3段。标本8和标本9为市售两种配方米粉。另设阳性对照(含有105CFU/mL克罗诺杆菌属的菌液)、阴性对照(生理盐水)各一个。
⑵核酸提取
具体操作步骤同实施例3。
⑶恒温扩增检测
同实施例3。
⑷结果判定：
①阳性结果判定：
F1通道(FAM通道)：ct≤55的样本为阳性；55＜ct＜60的样本建议重新检测，检测结果F1通道：ct＜60的样本为阳性。
②阴性结果判定：F1通道ct无数值或为60则为阴性。
质量控制：每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照F1通道：ct≤55；阴性对照F1通道：ct无数值或为60，否则此次检测结果视为无效。
⑸结果
根据F1通道的ct值情况，判定样本1、3、6、7检测为阳性，其余样本为阴性(样本2、4、5、8、9、10显示为阴性)，见图4。
实施例7
RNA恒温扩增检测活菌死菌对比
本次检测为本发明的另一个应用：试剂盒组成，检测方法及试剂用量同实施例3，具体方法包括如下步骤：
⑴样本处理
取阪崎标准菌株的培养物(108CFU/mL)，用生理盐水分别稀释到107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL等梯度，经过121℃水蒸气高压灭菌30min，灭菌后在常温放置12小时。
⑵核酸提取与恒温扩增检测
恒温检测方法同实施例3。
⑶检测结果
对各梯度样本进行检测，本方法可检出108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL，而105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL均未检出(图5)，实际样本中死菌含量低于106CFU/mL，可见本发明可区分死活菌，具有较高的灵敏度。
根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的克罗诺杆菌属(CS)RNA恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。
Figure GDA0001716796070000141
Figure GDA0001716796070000151
Figure RE-IDA0001729503710000011
Figure RE-IDA0001729503710000021

Claims (9)

1.一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的引物探针，其特征在于，所述引物序列为：
上游引物为：CTTACCAGGTGTTGACATCC；
下游引物为：
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAACATCTCAGAACACGAGCT；
所述探针为荧光探针，其序列为：CACCGAGUGCCUUCGGGAACGGUG；
所述荧光探针5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
2.一种用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物探针的检测液，T7RNA聚合酶，M-mLV反转录酶和反应液。
3.根据权利要求2所述用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。
4.根据权利要求2或3所述用于RNA恒温扩增检测克罗诺杆菌属的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括以下试剂组成：
(1)裂解液：10％Triton X-100，4.5～5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCI，pH8.0；
(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μΜ捕获探针；
(3)洗涤液：2～2.5mmol/L NaCl，4.5～5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCI，pH8.0，10％SDS；
(4)反应液：10mmol/L Tris HCI，40mmol/L MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4；
(5)检测液：5～15pmol/L上游引物CS nT7，5～15pmol/L下游引物CS T7，5～10pmol/LCS荧光探针，1mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，DEPC水；
(6)酶液：500～1000U/反应M-mLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/LTris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA；
(7)阳性对照：克罗诺杆菌属菌液；
(8)阴性对照：生理盐水。
5.一种非诊断目的的克罗诺杆菌属的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)提取待检样品中的菌体RNA；
(2)利用权利要求1所述的引物探针对待检样品中的菌体RNA进行RNA恒温扩增，记录待检样品反应的ct值，根据ct值判定是否含有克罗诺杆菌属菌体RNA：FAM通道：ct≤55的样本为阳性；55＜ct＜60的样本建议重新检测，复检结果FAM通道：ct＜60的样本为阳性；
FAM通道ct无数值或为60的样本为阴性。
6.根据权利要求5所述的非诊断目的的克罗诺杆菌属的检测方法，其特征在于，所述待检样品为婴幼儿配方食品。
7.根据权利要求5所述的非诊断目的的克罗诺杆菌属的检测方法，其特征在于，所述扩增反应体系为：5～15pmol上游引物CS nT7，5～15pmol下游引物CS T7，5～10pmolCS荧光探针，10～40mM MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，500～1500U T7RNA聚合酶，500～1000U M-mLV反转录酶。
8.根据权利要求5所述的非诊断目的的克罗诺杆菌属的检测方法，其特征在于，所述扩增反应条件为荧光PCR仪中42℃±0.1℃反应40～60min。
9.一种非诊断目的的克罗诺杆菌属的检测方法，其特征在于，由权利要求3或4所述的试剂盒进行检测，具体操作方法包括：
(1)用所述裂解液裂解待测样品中的菌体，得到含有菌体核酸的溶液；
(2)向步骤(1)的所述溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标RNA结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到菌体RNA；
(3)将步骤(2)提取得到的菌体RNA加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，在60℃±0.1℃下温育8～12min后，再在42℃±0.1℃下温育4～6min，然后加入含有
T7RNA聚合酶和M-mLV反转录酶的酶液，由此开始在42℃±0.1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；
(4)根据荧光信号产生的时间和强度，参照阳性对照和阴性对照结果对待测样品进行检测及判定；所述判定方法为：检测结果为阳性，则样品中有克罗诺杆菌属活菌，阴性则样品中没有克罗诺杆菌属活菌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110923346A (zh) * 2019-09-02 2020-03-27 张家口健垣科技有限公司 一种用于rna恒温扩增检测牛支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法
CN110791589A (zh) * 2019-10-18 2020-02-14 张家口健垣科技有限公司 一种用于rna恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针、试剂盒及检测方法
CN111647675A (zh) * 2020-06-03 2020-09-11 张家口富熙生物科技有限公司 一种用于rna恒温扩增检测布氏杆菌的引物和探针、试剂盒及检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101333564A (zh) * 2007-06-27 2008-12-31 上海仁度生物科技有限公司 提取、纯化靶核酸的方法及其应用
EP2634254A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-04 QIAGEN GmbH Method for isolating nucleic acids from a food sample
CN105624329A (zh) * 2014-10-29 2016-06-01 上海仁度生物科技有限公司 单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
CN107385102A (zh) * 2017-09-18 2017-11-24 北京勤邦生物技术有限公司 阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101333564A (zh) * 2007-06-27 2008-12-31 上海仁度生物科技有限公司 提取、纯化靶核酸的方法及其应用
EP2634254A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-04 QIAGEN GmbH Method for isolating nucleic acids from a food sample
CN105624329A (zh) * 2014-10-29 2016-06-01 上海仁度生物科技有限公司 单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
CN107385102A (zh) * 2017-09-18 2017-11-24 北京勤邦生物技术有限公司 阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"3种食品致病菌实时荧光核酸恒温扩增试剂盒方法验证比对研究";陈秀云等;《食品安全质量检测学报》;20170331;第8卷(第3期);摘要，第1049页第2.4.2节，第1052页左栏第2段 *
"A validated simple and rapid method for the simultaneous detection of both Cronobacter spp. and Salmonella spp. for infant formula quality control";Marcal Soler等;《Dairy Sci. & Technol.》;20120112;第92卷;第151-166页 *
"Real time PCR using TaqMan and SYBR Green for detection of Enterobacter sakazakii in infant formula";Yin Liu等;《Journal of Microbiological Methods》;20050803;第65卷;第21-31页 *
"阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)分子检测方法研究进展";王翔等;《食品科学》;20111231;第32卷(第13期);第351页第1.1.1节 *

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