CN107385102A - 阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒及其应用 - Google Patents

阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒及其应用 Download PDF

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王琳琛
杨春艳
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Abstract

本发明提供了一组用于快速鉴定阪崎肠杆菌的特异性引物，以及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速鉴定阪崎肠杆菌的方法。本发明根据阪崎肠杆菌16‑23S基因设计了6条引物，与目的基因的6个区域相结合，具有特异性强、灵敏度高的特点。本发明能够在60min内完成扩增反应，且技术要求低，具有快速、简便等优点，解决了传统检测方法时间长，结果可靠性差等问题，适合各级实验室及基层单位推广使用。

Description

阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)，具体涉及一种用于检测阪崎肠杆菌的核酸检测试剂盒，可定性、定量检测食品中阪崎肠杆菌的残留量。
背景技术
近年来，食品安全事件频繁发生，食品安全问题越来越受社会各界的关注。WHO曾经报道食源性疾病是全球关注的卫生问题，是影响人类健康的重要因素，而病原微生物感染是导致食源性疾病发生最主要的因素。阪崎肠杆菌在2002年被国际食品微生物标准化委员会(ICMSF)确定为食源性致病菌。阪崎肠杆菌感染可以引起婴幼儿尤其是新生儿患病，产生比较严重的疾病如脑膜炎、菌血症及坏死性小肠结肠炎等，甚至会引起严重的后遗症或者死亡。目前发现，只有婴幼儿奶粉与疾病的暴发相关。
传统的致病微生物检测方法有国标法和纸片法，这些操作复杂且测试周期长的检测方法无法跟上经济发展的步伐，不能满足我国快速发展的食品行业对食品检测方面的需要，因此，建立一种在婴幼儿奶粉中快速、高效灵敏的检测阪崎肠杆菌的方法是至关重要的。
本发明是采用环介导等温扩增技术开发的一种快速检测食品中阪崎肠杆菌的方法。
环介导等温基因扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法)日本荣研株式社研究出来的核酸等温扩增方法，其利用4个特殊的引物特异的识别靶基因的6个特定区域，用具有强链置换活性的BstDNA聚合酶，实现在恒温条件下的体外扩增。
本发明根据阪崎肠杆菌16-23S基因设计了6条引物，与目的基因的6个区域相结合，具有特异性强、灵敏度高的特点。本试剂盒能在60min内完成扩增反应，且技术要求低，具有快速、简便等优点，解决了传统检测方法时间长，结果可靠性差等问题，适合各级实验室及基层单位推广使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于快速鉴定阪崎肠杆菌的特异性引物，及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速鉴定阪崎肠杆菌的方法。本鉴定方法方便快捷、简便，适于推广应用。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明根据阪崎肠杆菌16-23S基因设计了6条引物，利用环介导等温扩增技术，在65℃等温扩增60分钟，根据显色剂显示的颜色来区分阪崎肠杆菌与非阪崎肠杆菌。
用于快速鉴定阪崎肠杆菌与非阪崎肠杆菌的特异性引物，包括：
内引物1：5’-CCGTGTACGCTTGTTCGCTTAACTCTCTCAAACTCGCAGCAC-3’
(SEQ ID No.1)；
内引物2：5’-CCTGGCAGTCAGAGGCGATGCGCCGGTTATAACGGTTCA-3’
(SEQ ID No.2)；
外引物1：5’-AAATGCGCGGTGTGTCAG-3’(SEQ ID No.3)；
外引物2：5’-GGTTTCCCCATTCGGACAT-3’(SEQ ID No.4)；
环引物1：5’-GACTTCTTCGGGTTGTGAGG-3’(SEQ ID No.5)；
环引物2：5’-GATTAGCACGTCCTTCATCG-3’(SEQ ID No.6)；
一种快速鉴定阪崎肠杆菌与非阪崎肠杆菌的方法，具体包括如下步骤：
(1)模板DNA的提取：提取待检样品的DNA，所述待检样品为添加阪崎肠杆菌的样本。
(2)环介导等温基因扩增反应：在200μL PCR管配制反应体系：外引物终浓度为0.2μM，内引物、环引物终浓度为0.6μM，1×buffer反应缓冲液，3mM MgSO4，0.5mM dNTP，8U BstDNA聚合酶，样本模板2.5μl，超纯水补足25μL，然后加入30μl的密封液，将上述反应管于65℃反应60min；
(3)结果判断：在上述反应管中加入1μL显色剂1000×SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为阪崎肠杆菌，橙色则为非阪崎肠杆菌。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
一、环介导等温基因扩增反应体系
1.环介导等温基因扩增反应体系的准备：
1)6条引物分别为：
内引物1：
5’-TAGCCAACCGATGTTTCTGTATCAA-ACAATACTACAAAGGTGCTTTCG-3’
(SEQ ID No.1)；
内引物2：5’-AGAAGTCATTAGCGAACAGGCTAC-GCGTAAGATTCTTGCTCAGTAG-3’(SEQ IDNo.2)；
外引物1：5’-GTGAGAACGGGACCATCA-3’(SEQ ID No.3)；
外引物2：5’-CTTGTTTTTGTAGGGTTTGGA-3’(SEQ ID No.4)。
环引物1：5’-GACTTCTTCGGGTTGTGAGG-3’(SEQ ID No.5)；
环引物2：5’-GATTAGCACGTCCTTCATCG-3’(SEQ ID No.6)；
2)DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；
3)dNTP：浓度为25mM
4)MgSO4：浓度为50mM
5)Buffer缓冲液：10×buffer
6)显色剂：荧光染料1000×SYBR Green I。
7)DNA提取液
2.用上述反应体系按以下方法对阪崎肠杆菌与非阪崎肠杆菌进行鉴定。本实验所述待检样品为添加阪崎肠杆菌的奶粉样本。
(1)模板DNA提取：
1)将1ml的样本置于1.5ml离心管；
2)12000r/min离心2min，弃上清；
3)加入80ul DNA提取液，煮沸10min；
4)离心取上清液转移至另一支离心管中作为模板DNA。
(2)环介导等温基因扩增反应：在200μl PCR管配制反应体系：外引物终浓度为0.2μM，内引物、环引物终浓度为0.6μM，1×buffer反应缓冲液，3mM MgSO4，0.5mM dNTP，8U BstDNA聚合酶，样本模板2.5μl，超纯水补足25μl，然后加入30μl的密封液，将上述反应管于65℃反应60min。
(3)结果判定：在上述反应管中加入1μl 1000×SYBR Green I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为阪崎肠杆菌，橙色则为非阪崎肠杆菌。
本实施例中，PCR管显绿色，表明待检样品所感染的致病菌为阪崎肠杆菌。
二、特异性与灵敏度
1.检测材料及方法
1.1菌株
金黄色葡萄球菌ATCC 6538；
单增李斯特菌CMCC(B)54002；
副溶血性弧菌ATCC 17802；
福氏志贺氏菌CMCC(B)51572；
鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028；
阪崎肠杆菌CMCC 45410；
阴沟肠杆菌CMCC45301；
赫氏艾希氏菌；
肺炎克雷伯氏菌；
大肠埃希氏菌O157：H7 ATCC 43888；
大肠埃希氏菌25922；
威氏李斯特CICC21672；
绵羊李斯特CICC21633；
格氏李斯特CICC21670。
1.2食品样本
幼儿配方奶粉、米粉、营养快线、奶片、钙奶饼干
1.3检测方法
对各个样本的检测严格按照说明书进行操作，同时与国标方法GB 4789.40-2010进行对比。
2.试验结果
2.1特异性
对常见食源性致病菌菌株及同源性高的菌株提取基因组DNA(按说明书制备基因组DNA)，采用核酸检测试剂盒进行单一和交叉污染检测，每个样品进行2次重复检测，并同时检测试剂盒的阴性和阳性对照。
特异性实验结果(“+”代表阳性；“-“代表阴性)
注：15-18为交叉污染样品
结果显示，仅含阪崎肠杆菌样品显示阳性结果，其余样品均为阴性，表明试剂盒具有高度特异性。
2.2灵敏度
纯菌灵敏度(CFU/ml)：取计数后菌液进行梯度稀释(100ul菌液+900ul超纯水)，按说明书提取DNA模板。取不同浓度梯度测试，每个梯度两个平行。
实际样本灵敏度(CFU/25g(ml))：取计数后菌液进行梯度稀释(100ul菌液+900ul超纯水)，分别取约为≥10CFU、＜10CFU稀释液进行样本添加，置于均质袋内，按国标方式培养，取200ul培养液上清提取模板检测。
①纯菌灵敏度
冻干批次 灵敏度
1014 4.5*102CFU/ml
1018 4.5*102CFU/ml
1025 3.25*102CFU/ml
结果显示：纯菌灵敏度数量级为102，但大量实验结果证实由于模板提取，稀释误差等原因灵敏度数量级可能为103。因此，纯菌灵敏度约为102-103CFU/ml。
②实际样本灵敏度
样本 试剂盒检测限 国标方法检测限
婴幼儿配方奶粉 ＜10CFU/25g ＜10CFU/25g
奶片 ＜10CFU/25g ＜10CFU/25g
营养快线 ＜10CFU/25g 10CFU/25g
钙奶饼干 ＜10CFU/25g ＜10CFU/25g
米粉 10CFU/25g 10CFU/25g
结果显示：实际样本的灵敏度均可达到≤10CFU/25g，个别样本灵敏度试剂盒方法高于国标方法。
2.3批间、批内差(“+”为阳性、“-”为阴性)
选择婴幼儿配方奶粉为样本，进行不同量的阳性菌添加(无添加、≥10CFU、＜10CFU)，制备成不同浓度的样品，每个样品三个平行，三次重复，测试三批检测试剂，同时设立阴阳对照。
根据实验结果，按照公式计算，试剂盒的批内差为0％，批间差为0％，说明试剂盒稳定性较好。
2.4国标符合率
选择婴幼儿配方奶粉、奶片、营养快线、钙奶饼干、米粉为样本，使用不同浓度阳性菌进行样本添加，采用核酸检测试剂盒与国标方法同时进行检测，比较两种方法的检测结果，每个检测样本进行3个重复检测，同时设立试剂盒的阴性对照和阳性对照。
阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒与国标方法检测结果
结果显示，不同样本检测结果与国标一致。因此，试剂盒检测方法与国标检测方法的符合率为100％。
3.验证评价
验证实验表明，本公司研发的阪崎肠杆菌核酸检测方法简单、快捷，不需要大型仪器设备；纯菌检测灵敏度约为102-103CFU/mL，实际样本灵敏度均可达到≤10CFU/25g，试剂盒具有较高特异性，产品批内及批间无明显差异，实际样本检测国标符合率为100％。
序列表
<110> 北京勤邦生物技术有限公司
<120> 阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒及其应用
<141> 2017-09-18
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列内引物1(人工序列)
<400> 7
ccgtgtacgc ttgttcgctt aactctctca aactcgcagc ac 42
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列内引物2(人工序列)
<400> 8
cctggcagtc agaggcgatg cgccggttat aacggttca 39
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列外引物1(人工序列)
<400> 9
aaatgcgcgg tgtgtcag 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列外引物2(人工序列)
<400> 10
ggtttcccca ttcggacat 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列环引物1(人工序列)
<400> 12
gacttcttcg ggttgtgagg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列环引物2(人工序列)
<400> 12
gattagcacg tccttcatcg 20

Claims (2)

1.一种应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌的检测引物组，其特征在于：由下列引物组成：
内引物1：5’-CCGTGTACGCTTGTTCGCTTAACTCTCTCAAACTCGCAGCAC-3’(SEQ ID No.1)；
内引物2：5’-CCTGGCAGTCAGAGGCGATGCGCCGGTTATAACGGTTCA-3’(SEQ ID No.2)；
外引物1：5’-AAATGCGCGGTGTGTCAG-3’(SEQ ID No.3)；
外引物2：5’-GGTTTCCCCATTCGGACAT-3’(SEQ ID No.4)；
环引物1：5’-GACTTCTTCGGGTTGTGAGG-3’(SEQ ID No.5)；
环引物2：5’-GATTAGCACGTCCTTCATCG-3’(SEQ ID No.6)。
2.一种阪崎肠杆菌的检测方法，其特征在于：环介导等温基因扩增反应需要的外引物终浓度为0.2μM，内引物、环引物终浓度为0.6μM，以及需要1×buffer反应缓冲液，3mMMgSO4，0.5mM dNTP，8U Bst DNA聚合酶，样本模板2.5μl，超纯水补足25μL，然后加入30μl的密封液，将上述反应管于65℃反应60min。
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