CN110791589A - 一种用于rna恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于rna恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针、试剂盒及检测方法。本发明特异性检测引物探针以及含有该检测引物和探针的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过RNA恒温扩增的检测方法具有灵敏度高、特异性强、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)、快速的特点，对仪器要求低，操作过程简单等优势。

Description

一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针、试剂盒及 检测方法
技术领域
本发明涉及病毒微生物检测技术领域，具体涉及一种基于RNA恒温扩增检测诺如病毒快速检测技术，特别涉及检测诺如病毒的特异性检测引物探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
诺如病毒，又称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses，NV)是人类杯状病毒科(HumanCalicivirus，HuCV)中诺如病毒(Norovirus，NV)属的一种病毒。是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90％是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15％左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。
近年来，病毒的快速检测和鉴定方法发展较为迅速，以免疫学为基础的ELISA技术、免疫磁珠技术、全自动免疫酶标检测系列、免疫胶体金技术等，以分子生物学为基础的RNA指纹图谱技术、实时荧光PCR技术、基因芯片技术等，以纸片法为代表的细菌代谢为基础的酶触反应技术等，这些快速检测方法大大缩短了致病病毒检验的时间，提高了检验效率。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的引物探针、试剂盒及检测方法，实现对诺如病毒的现场快速(150min内)、准确检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针，所述引物为：
上游引物NV nT7包含：TATTCATCACTGGAT、GGCCATGTTCCGCTGG，或其同源序列中的至少8个核苷酸序列；
下游引物NV T7包含：T7启动子序列和靶标引物序列；其中所述标靶引物序列包含CAATACATCA CAGGG、AGAAGCATTA ACCTCCGG或其同源序列中的至少8个核苷酸序列；其中所述T7启动子序列包含AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA，或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；其中所述探针具有环和自身互补的茎的发夹结构。
根据本发明的某些实施方式，所述上游引物NV nT7包含：TATTCATCACTGGAT或GGCCATGTTCCGCTGG。
根据本发明的某些实施方式，所述下游引物NV T7包含：
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA CAATACATCA CAGGG或
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGAAGCATTAACCTCCGG。
根据本发明的某些实施方式，所述上游引物NV nT7是TATTCATCACTGGAT或GGCCATGTTCCGCTGG。
根据本发明的某些实施方式，所述下游引物NV T7是
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA CAATACATCA CAGGG或
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGAAGCATTAACCTCCGG。
根据本发明的某些实施方式，所述探针的两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团，优选所述荧光基团包含FAM、HEX或VIC，所述淬灭基团包含DABCYL。
根据本发明的某些实施方式，所述探针为荧光探针。
根据本发明的某些实施方式，所述探针序列包含：CGACGC AAUAUUGUGCAAGCCACGCGUCG、CCAGGGAUUGUGGACAGGAGAUCCUGG，或其同源序列中的至少10个核苷酸。
根据本发明的某些实施方式，所述同源序列指的是与所述序列至少70％相同的核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，所述同源序列具有与本发明公开的序列有基本相同的活性。
根据本发明的某些实施方式，所述探针序列包含CGACGC AAUAUUGUGCAAGCCACGCGUCG或CCAGGGAUUGUGGACAGGAGAUCCUGG。
根据本发明的某些实施方式，所述探针序列是CGACGC AAUAUUGUGCAAGCCACGCGUCG或CCAGGGAUUGUGGACAGGAGAUCCUGG。
本发明还提供了一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的试剂盒，所述试剂盒包括反应液，含有上述技术方案所述引物和探针的检测液，以及含有T7RNA聚合酶和M-MLV反转录酶的酶液。
根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含5～15mmol/L Tris HCL，35～45mmol/L MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，5～15mmol/LNa2HPO4，1.5～2.5mmol/L KH2PO4。
根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5～15pmol/L上游引物NV nT7，5～15pmol/L下游引物NV T7，5～10pmol/L NV荧光探针，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH6.0～10.0，0.5～1.5mmol/L EDTA，余量为DEPC水。
根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，0.5～1.5mmol/L EDTA，5％～15％BSA。
根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒包括：
反应液：所述反应液包含5～15mmol/L Tris HCL，35～45mmol/L MgCl2，0.5～5mMdNTPs，1～10mM NTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，5～15mmol/L Na2HPO4，1.5～2.5mmol/LKH2PO4；
检测液：所述检测液包含5～15pmol/L上游引物NV nT7，5～15pmol/L下游引物NVT7，5～10pmol/L NV荧光探针，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH6.0～10.0，0.5～1.5mmol/LEDTA，余量为DEPC水；和
酶液：所述酶液包含500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7 RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，0.5～1.5mmol/L EDTA，5％～15％BSA。
根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒中包括：
反应液：所述反应液包含10mmol/L Tris-HCl，40mmol/L MgCl2，2.5mM dNTPs，6mMNTPs，2.7mmol/L KC1，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4；
检测液：所述检测液包含10pmol/L上游引物NV nT7，10pmol/L下游引物NV T7，7.5pmol/L荧光探针NV Probe，1mmol/L Tris～HCl PH8.0，1mmol/L EDTA，DEPC水；和
酶液：所述酶液包含750U/反应M-MLV反转录酶、1000U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/LTris～HCl pH8.0，2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA。
优选的，所述试剂盒还包括：裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。
根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含8％～12％Triton X-100，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0。
根据本发明的某些实施方式，所述核酸提取液包含40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μM捕获探针。
根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含的捕获探针为Oligo(dT)。
根据本发明的某些实施方式，所述Oligo(dT)的长度是10-26。
根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2～2.5mmol/L NaCl，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0，8％～12％SDS。
根据本发明的某些实施方式，所述阳性对照包含诺如病毒RNA(104～106拷贝/反应)。
根据本发明的某些实施方式，所述阴性对照包含生理盐水。
根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒中还包括：
(1)裂解液：8％～12％Triton X-100，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0；
(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μM捕获探针；
(3)洗涤液：2～2.5mmol/L NaCl，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/LTris HCL，pH 6.0～10.0，8％～12％SDS；
(4)阳性对照：诺如病毒RNA(104～106拷贝/反应)；
(5)阴性对照：生理盐水。
根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒中还包括：
(1)裂解液：8％～12％Triton X-100，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0；
(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μM捕获探针；所述捕获探针为Oligo(dT)；
(3)洗涤液：2～2.5mmol/L NaCl，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/LTris HCL，pH 6.0～10.0，8％～12％SDS；
(4)阳性对照：诺如病毒RNA(104～106拷贝/反应)；
(5)阴性对照：生理盐水。
根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒中还包括：
(1)裂解液：8％～12％Triton X-100，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0；
(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μM捕获探针；所述捕获探针为Oligo(dT)，所述Oligo(dT)的长度是10-26；
(3)洗涤液：2～2.5mmol/L NaCl，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/LTris HCL，pH 6.0～10.0，8％～12％SDS；
(4)阳性对照：诺如病毒RNA(104～106拷贝/反应)；
(5)阴性对照：生理盐水。
进一步优选的，所述试剂盒中包括：
(1)裂解液：8％～12％Triton X-100，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0；
(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μM捕获探针；
(3)洗涤液：2～2.5mmol/L NaCl，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/LTris HCL，pH 6.0～10.0，8％～12％SDS；
(4)反应液：5～15mmol/L Tris HCL，35～45mmol/L MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，5～15mmol/L Na2HPO4，1.5～2.5mmol/L KH2PO4；
(5)检测液：5～15pmol/L上游引物NV nT7，5～15pmol/L下游引物NV T7，5～10pmol/L NV荧光探针，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH6.0～10.0，0.5～1.5mmol/L EDTA，余量为DEPC水；
(6)酶液：500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，0.5～1.5mmol/L EDTA，5％～15％BSA；
(7)阳性对照：诺如病毒RNA(104～106拷贝/反应)；
(8)阴性对照：生理盐水。
进一步优选的，所述试剂盒中包括：
(1)裂解液：8％～12％Triton X-100，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0；
(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μM捕获探针；所述捕获探针为Oligo(dT)；
(3)洗涤液：2～2.5mmol/L NaCl，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/LTris HCL，pH 6.0～10.0，8％～12％SDS；
(4)反应液：5～15mmol/L Tris HCL，35～45mmol/L MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，5～15mmol/L Na2HPO4，1.5～2.5mmol/L KH2PO4；
(5)检测液：5～15pmol/L上游引物NV nT7，5～15pmol/L下游引物NV T7，5～10pmol/L NV荧光探针，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH6.0～10.0，0.5～1.5mmol/L EDTA，余量为DEPC水；
(6)酶液：500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，0.5～1.5mmol/L EDTA，5％～15％BSA；
(7)阳性对照：诺如病毒RNA(104～106拷贝/反应)；
(8)阴性对照：生理盐水。
进一步优选的，所述试剂盒中包括：
(1)裂解液：8％～12％Triton X-100，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0；
(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μM捕获探针；所述捕获探针为Oligo(dT)，所述Oligo(dT)的长度是10-26；
(3)洗涤液：2～2.5mmol/LNaCl，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/LTris HCL，pH 6.0～10.0，8％～12％SDS；
(4)反应液：5～15mmol/L Tris HCL，35～45mmol/L MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，5～15mmol/L Na2HPO4，1.5～2.5mmol/L KH2PO4；
(5)检测液：5～15pmol/L上游引物NV nT7，5～15pmol/L下游引物NV T7，5～10pmol/L NV荧光探针，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH6.0～10.0，0.5～1.5mmol/L EDTA，余量为DEPC水；
(6)酶液：500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，0.5～1.5mmol/L EDTA，5％～15％BSA；
(7)阳性对照：诺如病毒RNA(104～106拷贝/反应)；
(8)阴性对照：生理盐水。
根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒中包括：
(1)裂解液：10％Triton X-100，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCl，pH 8.0；
(2)核酸提取液：120mM EDTA，250mg/L磁珠，25μM捕获探针；所述捕获探针为Oligo(dT)，所述Oligo(dT)的长度是20；
(3)洗涤液：2mmol/L NaCl，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCl，pH 8.0，10％SDS；
(4)反应液：10mmol/L Tris-HCl，40mmol/L MgCl2，2.5mM dNTPs，6mM NTPs，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4；
(5)检测液：10pmol/L上游引物NV nT7，10pmol/L下游引物NV T7，7.5pmol/L荧光探针NV Probe，1mmol/L Tris～HCl PH8.0，1mmol/L EDTA，DEPC水；
(6)酶液：750U/反应M-MLV反转录酶、1000U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/L Tris～HCl pH8.0，2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA；
(7)阳性对照：含有105拷贝/反应诺如病毒RNA；
(8)阴性对照：生理盐水。
本发明还提供了一种使用所述试剂盒检测诺如病毒的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待检样品中的靶标RNA；
(2)利用上述技术方案所述的引物探针对待检样品中的靶标RNA进行RNA恒温扩增；
(3)记录待检样品反应的ct值：ct≤45的样本为阳性；45＜ct＜50的样本建议重
新检测，复检结果：ct＜50的样本为阳性；ct无数值或为50的样本为阴性。
根据本发明的某些实施方式，根据ct值判定是否含有诺如病毒RNA。
根据本发明的某些实施方式，所述检测使用FAM通道、HEX通道、或VIC通道。
优选的，所述扩增反应体系为所述反应液和检测液的混合溶液。
优选的，所述扩增反应条件为荧光PCR仪中42℃±1℃反应40～60分钟。
根据本发明的某些实施方式，所述提取待检样品中的靶标RNA包括用所述裂解液裂解待测样品中的病毒，得到含有靶标RNA的裂解溶液；和向裂解溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标RNA结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到靶标RNA。
优选的，所述诺如病毒的检测方法由上述技术方案所述的试剂盒进行检测，具体操作方法包括：
(1)用所述裂解液裂解待测样品中的病毒，得到含有靶标RNA的裂解溶液；向所述裂解溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标RNA结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到靶标RNA；
(2)将步骤(1)提取得到的靶标RNA加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，在60℃±2℃下温育8～12min后，再在42±1℃下温育3～5min，然后加入所述酶液，由此开始在42℃±1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；
(3)根据荧光信号产生的时间和强度，记录待检样品反应的ct值：ct≤45的样本为阳性；45＜ct＜50的样本建议重新检测，复检结果：ct＜50的样本为阳性；ct无数值或为50的样本为阴性。
根据本发明的某些实施方式，参照阳性对照和阴性对照结果对待测样品进行检测及判定；所述判定方法为：检测结果为阳性，则样品中有诺如病毒，阴性则样品中没有诺如病毒。
发明详述
用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针
本发明提供了一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针，所述引物的下游引物包括T7启动子。
根据本发明的某些实施方式，上游引物NV nT7序列包含：TATTCATCACTGGAT、GGCCATGTTCCGCTGG，或其同源序列中的至少8个核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，下游引物NV T7(包含T7启动子的引物)序列包含：T7启动子序列和靶标引物序列。
根据本发明的某些实施方式，所述靶标引物序列包含CAATACATCA CAGGG、AGAAGCATTA ACCTCCGG或其同源序列中的至少8个核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，所述T7启动子序列包含AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA，或其同源序列中的至少10个核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，所述探针具有环和自身互补的茎的发夹结构。
根据本发明的某些实施方式，所述同源序列指的是与所述序列至少70％相同的核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，所述同源序列具有至少70％相同的核苷酸序列，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，所述同源序列具有与本发明公开的序列有基本相同的活性，例如具有与本发明公开的序列活性的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。
根据本发明的某些实施方式，所述上游引物NV nT7序列包含至少8个核苷酸序列，例如至少10个、至少12个、至少14个、至少15个、至少16个核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，所述下游引物NV T7中的靶标引物序列包含至少8个核苷酸序列，例如至少8个、至少10个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，所述下游引物NV T7中的T7启动子序列包含至少10个核苷酸序列，例如至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，所述下游引物NV T7中，所述T7启动子序列位于所述靶标引物序列的5’末端。
根据本发明的某些实施方式，所述下游引物NV T7中，所述T7启动子序列位于所述靶标引物序列的3’末端。
根据本发明的某些实施方式，所述上游引物NV nT7包含：TATTCATCACTGGAT或GGCCATGTTCCGCTGG。
根据本发明的某些实施方式，所述下游引物NV T7包含：AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA CAATACATCA CAGGG或AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGAAGCATTAACCTCCGG。
根据本发明的某些实施方式，所述上游引物NV nT7是TATTCATCACTGGAT或GGCCATGTTCCGCTGG。
根据本发明的某些实施方式，所述下游引物NV T7是AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA CAATACATCA CAGGG或AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGAAGCATTAACCTCCGG。
根据本发明的某些实施方式，所述引物序列为：
上游引物为：TATTCATCACTGGAT；
下游引物为：AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA CAATACATCA CAGGG。
根据本发明的某些实施方式，所述探针为荧光探针。
根据本发明的某些实施方式，所述探针为分子信标。
根据本发明的某些实施方式，所述探针具有环和自身互补的茎的发夹结构。
根据本发明的某些实施方式，所述探针具有一个环和一个自身互补的茎的发夹结构。
根据本发明的某些实施方式，所述探针的环部分和靶标互补。
根据本发明的某些实施方式，所述探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。
根据本发明的某些实施方式，所述探针的两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团。
根据本发明的某些实施方式，所述荧光探针为分子信标，所述分子信标具有一个环和一个自身互补的茎的发夹结构，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎。
根据本发明的某些实施方式，所述探针具有一个环和一个自身互补的茎的发夹结构，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎。
根据本发明的某些实施方式，所述探针序列包含：CGACGC AAUAUUGUGCAAGCCACGCGUCG、CCAGGGAUUGUGGACAGGAGAUCCUGG，或其同源序列中的至少10个核苷酸。
根据本发明的某些实施方式，所述同源序列指的是与所述序列至少70％相同的核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，所述同源序列具有至少70％相同的核苷酸序列，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，所述同源序列具有与本发明公开的序列有基本相同的活性，例如具有与本发明公开的序列活性的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。
根据本发明的某些实施方式，所述探针序列包含至少10个核苷酸序列，例如至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个、至少26个、至少27个、至少30个、至少32个核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方式，所述探针序列包含：CGACGC AAUAUUGUGCAAGCCACGCGUCG或CCAGGGAUUGUGGACAGGAGAUCCUGG。
根据本发明的某些实施方式，所述探针序列是CGACGC AAUAUUGUGCAAGCCACGCGUCG或CCAGGGAUUGUGGACAGGAGAUCCUGG。
优选的，所述探针5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。
优选的，所述探针5’端含有淬灭基团，3’端含有荧光基团。
优选的，所述荧光基团包含FAM、HEX或VIC。
优选的，所述淬灭基团包含DABCYL。
优选的，所述探针5’端用FAM、HEX或VIC标记，3’端用DABCYL标记。优选的，所述荧光探针5’端用DABCYL标记，3’端用FAM、HEX或VIC标记。
试剂盒
本发明还提供了一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的试剂盒，所述试剂盒包括反应液，含有上述技术方案所述引物和探针的检测液，以及含有T7RNA聚合酶和M-MLV反转录酶的酶液。
本发明中，所述反应液和所述检测液组成的溶液又称为扩增反应液。
优选的，所述试剂盒还包括：裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。
反应液
根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含5～15mmol/L Tris HCl，35～45mmol/L MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，5～15mmol/LNa2HPO4，1.5～2.5mmol/L KH2PO4。
根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含5～15mmol/L Tris HCl，例如8～15mmol/L、10～15mmol/L、12～15mmol/L、5～12mmol/L、8～12mmol/L、10～12mmol/L、5～10mmol/L、8～10mmol/L或5～8mmol/L Tris HCl。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、或15mmol/L Tris HCl。
根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含35～45mmol/L MgCl2，例如38～45mmol/L、40～45mmol/L、42～45mmol/L、38～45mmol/L、38～42mmol/L、38～40mmol/L、40～45mmol/L、40～42mmol/L或42～45mmol/LMgCl2。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含35mmol/L、38mmol/L、40mmol/L、42mmol/L、45mmol/LMgCl2。
根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含0.5～5mM dNTPs，例如0.5～4mM、0.5～3mM、0.5～2mM、0.5～1mM、1～5mM、1～4mM、1～3mM、1～2mM、2～5mM、2～4mM、2～3mM、3～5mM、3～4mM或4～5mM dNTPs。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mMdNTPs。
根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含1～10mM NTPs，例如1～8mM、1～5mM、1～3mM、3～10mM、3～8mM、3～5mM、5～10mM、5～8mM或8～10mM NTPs。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mMNTPs。
根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含2.5～2.7mmol/L KCl，例如2.5～2.6mmol/L或2.6～2.7mmol/LKCl。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含2.5mmol/L、2.51mmol/L、2.52mmol/L、2.53mmol/L、2.54mmol/L、2.55mmol/L、2.56mmol/L、2.57mmol/L、2.58mmol/L、2.59mmol/L、2.6mmol/L、2.61mmol/L、2.62mmol/L、2.63mmol/L、2.64mmol/L、2.65mmol/L、2.66mmol/L、2.67mmol/L、2.68mmol/L、2.69mmol/L或2.7mmol/L KCl。
根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含5～15mmol/L Na2HPO4，例如8～15mmol/L、10～15mmol/L、12～15mmol/L、5～12mmol/L、8～12mmol/L、10～12mmol/L、5～10mmol/L、8～10mmol/L或5～8mmol/L Na2HPO4。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、或15mmol/L Na2HPO4。
根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含1.5～2.5mmol/L KH2PO4，例如2.0～2.5mmol/L、1.5～2.0mmol/L KH2PO4。根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含1.5mmol/L、1.6mmol/L、1.7mmol/L、1.8mmol/L、1.9mmol/L、2mmol/L、2.1mmol/L、2.2mmol/L、2.3mmol/L、2.4mmol/L或25mmol/L KH2PO4。
根据本发明的某些实施方式，所述反应液包含：10mmol/L Tris-HCL，40mmol/LMgCl2，2.5mM dNTPs，6mM NTPs，2.7mmol/LKCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4。
含有引物和探针的检测液
根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5～15pmol/L上游引物NV nT7，5～15pmol/L下游引物NV T7，5～10pmol/L NV荧光探针，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH6.0～10.0，0.5～1.5mmol/L EDTA，余量为DEPC水。
根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5～15pmol/L上游引物NV nT7，例如5～12pmol/L、5～10pmol/L、5～8pmol/L、8～15pmol/L、8～12pmol/L、8～10pmol/L、10～15pmol/L、10～12pmol/L、12～15pmol/L上游引物NV nT7。根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5pmol/L、6pmol/L、7pmol/L、8pmol/L、9pmol/L、10pmol/L、11pmol/L、12pmol/L、13pmol/L、14pmol/L或15pmol/L上游引物NV nT7。
根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5～15pmol/L下游引物NV T7，例如5～12pmol/L、5～10pmol/L、5～8pmol/L、8～15pmol/L、8～12pmol/L、8～10pmol/L、10～15pmol/L、10～12pmol/L、12～15pmol/L下游引物NV T7。根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5pmol/L、6pmol/L、7pmol/L、8pmol/L、9pmol/L、10pmol/L、11pmol/L、12pmol/L、13pmol/L、14pmol/L或15pmol/L下游引物NV T7。
根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5～10pmol/L NV荧光探针，例如5～8pmol/L或8～10pmol/L NV荧光探针。根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含5pmol/L、6pmol/L、7pmol/L、8pmol/L、9pmol/L或10pmol/L NV荧光探针。
根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含0.5～1.5mmol/L Tris-HCl，例如0.5～1.0mmol/L或1.0～1.5mmol/L Tris-HCl。根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1mmol/L、1.1mmol/L、1.2mmol/L、1.3mmol/L、1.4mmol/L或1.5mmol/L Tris-HCl。
根据本发明的某些实施方式，所述Tris-HCl的pH是pH6.0～pH10.0，例如pH8.0～pH10.0或pH6.0～pH8.0。根据本发明的某些实施方式，所述裂解液的pH是pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0或pH10.0。
根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含0.5～1.5mmol/L EDTA，例如0.5～1.0mmol/L或1.0～1.5mmol/L EDTA。根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1mmol/L、1.1mmol/L、1.2mmol/L、1.3mmol/L、1.4mmol/L或1.5mmol/L EDTA。
根据本发明的某些实施方式，所述检测液包含10pmol/L上游引物NV nT7，10pmol/L下游引物NV T7，7.5pmol/L荧光探针NV Probe，1mmol/L Tris～HCl PH8.0，1mmol/LEDTA，DEPC水。
含有T7RNA聚合酶和M-MLV反转录酶的酶液
根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，0.5～1.5mmol/L EDTA，5％～15％BSA。
根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含500～1000U/反应M-MLV反转录酶，例如500～900U/反应、500～800U/反应、500～700U/反应、500～600U/反应、600～1000U/反应、600～900U/反应、600～800U/反应、600～700U/反应、700～1000 U/反应、700～900U/反应、700～800U/反应、800～1000U/反应、800～900U/反应或900～1000U/反应M-MLV反转录酶。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含500U/反应、550U/反应、600U/反应、650U/反应、700U/反应、750U/反应、800U/反应、850U/反应、900U/反应、950U/反应或1000U/反应M-MLV反转录酶。
根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含500～1500U/反应T7RNA聚合酶，例如500～1200U/反应、500～1000U/反应、500～800U/反应、800～1500U/反应、800～1200U/反应、800～1000U/反应、1000～1500U/反应、1000～1200U/反应或1200～1500U/反应T7RNA聚合酶。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含500U/反应、600U/反应、700U/反应、800U/反应、900U/反应、1000U/反应、1100U/反应、1200U/反应、1300U/反应、1400U/反应或1500U/反应T7RNA聚合酶。
根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，例如0.5～1.0mmol/L或1.0～1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1mmol/L、1.1mmol/L、1.2mmol/L、1.3mmol/L、1.4mmol/L或1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0。
根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含2.5～2.7mmol/L KCl，例如2.5～2.6mmol/L或2.6～2.7mmol/L KCl。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含2.5mmol/L、2.51mmol/L、2.52mmol/L、2.53mmol/L、2.54mmol/L、2.55mmol/L、2.56mmol/L、2.57mmol/L、2.58mmol/L、2.59mmol/L、2.6mmol/L、2.61mmol/L、2.62mmol/L、2.63mmol/L、2.64mmol/L、2.65mmol/L、2.66mmol/L、2.67mmol/L、2.68mmol/L、2.69mmol/L或2.7mmol/L KCl。
根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含0.5～1.5mmol/L EDTA，例如0.5～1.0mmol/L或1.0～1.5mmol/L EDTA。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1mmol/L、1.1mmol/L、1.2mmol/L、1.3mmol/L、1.4mmol/L或1.5mmol/L EDTA。
根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含5％～15％BSA，例如10％～15％或5％～10％BSA。根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含5％、6％、7％、8％、9％、10％11％、12％、13％、14％或15％BSA。
根据本发明的某些实施方式，所述酶液包含750U/反应M-MLV反转录酶、1000U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/L Tris～HCl pH8.0，2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA。
优选的，所述试剂盒还包括：裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。
裂解液
根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含8％～12％Triton X-100，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0。
根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含8％～12％Triton X-100，例如8％～10％或10％～12％Triton X-100。根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含8％、9％、10％、11％或12％Triton X-100。
根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，例如5mol/L～6.5mol/L或3mol/L～5mol/L异硫氰酸胍。根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含3mol/L、3.5mol/L、4mol/L、4.5mol/L、5mol/L、5.5mol/L、6mol/L或6.5mol/L异硫氰酸胍。
根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含5～15mmol/L Tris HCl，例如10～15mmol/L或5～10mmol/L Tris HCl。根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L或15mmol/L Tris HCl。
根据本发明的某些实施方式，所述裂解液的pH是pH6.0～pH10.0，例如pH6.0～pH8.0或pH8.0～pH10.0。根据本发明的某些实施方式，所述裂解液的pH是pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0或pH10.0。
根据本发明的某些实施方式，所述裂解液包含10％Triton X-100，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCl，pH 8.0。
核酸提取液
根据本发明的某些实施方式，所述核酸提取液包含40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μM捕获探针。
根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含40～200mM EDTA，例如40～150mM、40～100mM、40～60mM、60～200mM、60～150mM、60～100mM、100～200mM、100～150mM或150～200mM EDTA。根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM EDTA。
根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含50～500mg/L磁珠，例如50～400mg/L、50～300mg/L、50～200mg/L、50～100mg/L、100～500mg/L、100～400mg/L、100～300mg/L、100～200mg/L、200～500mg/L、200～400mg/L、200～300mg/L、300～500mg/L、300～400mg/L或400～500mg/L磁珠。根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含50mg/L、60mg/L、70mg/L、80mg/L、90mg/L、100mg/L、130mg/L、150mg/L、180mg/L、200mg/L、230mg/L、250mg/L、280mg/L、300mg/L、330mg/L、350mg/L、380mg/L、400mg/L、430mg/L、450mg/L、480mg/L或500mg/L磁珠。
根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含1～50μM捕获探针，例如1～40μM、1～30μM、1～20μM、1～10μM、10～50μM、10～40μM、10～30μM、10～20μM、20～50μM、20～40μM、20～30μM、30～50μM、30～40μM或40～50μM捕获探针。根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM或50μM捕获探针。
根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含的捕获探针为Oligo(dT)。
根据本发明的某些实施方式，所述Oligo(dT)的长度是10-26，例如10-20、10-18、10-15、10-12、12-26、12-20、12-18、12-15、15-26、15-20、15-18、18-26、18-20或20-26。根据本发明的某些实施方式，所述Oligo(dT)的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26。
根据本发明的某些实施方式，所述提取液包含120mM EDTA，250mg/L磁珠，25μM捕获探针。
洗涤液
根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2～2.5mmol/L NaCl，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0，8％～12％SDS。
根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2～2.5mmol/L NaCl，例如2～2.3mmol/L或2.3～2.5mmol/LNaCl。根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2mmol/L、2.1mmol/L、2.2mmol/L、2.3mmol/L、2.4mmol/L或2.5mmol/LNaCl。
根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，例如5mol/L～6.5mol/L或3mol/L～5mol/L异硫氰酸胍。根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含3mol/L、3.5mol/L、4mol/L、4.5mol/L、5mol/L、5.5mol/L、6mol/L或6.5mol/L异硫氰酸胍。
根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液5～15mmol/L Tris HCl，例如8～15mmol/L、10～15mmol/L、12～15mmol/L、5～12mmol/L、8～12mmol/L、10～12mmol/L、5～10mmol/L、8～10mmol/L或5～8mmol/LTris HCl。根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、或15mmol/L Tris HCl。
根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液的pH是pH 6.0～10.0，例如pH6.0～pH8.0或pH8.0～pH10.0。根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液的pH是pH6.0、pH 6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0、pH 9.5或pH 10.0。
根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含8％～12％SDS，例如8％～10％或10％～12％SDS。根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含8％、9％、10％、11％或12％SDS。
根据本发明的某些实施方式，所述洗涤液包含2mmol/L NaCl，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCL，pH 8.0，10％SDS。
对照
根据本发明的某些实施方式，所述阳性对照包含诺如病毒RNA(104～106拷贝/反应)，例如104～105或105～106拷贝/反应的诺如病毒RNA。根据本发明的某些实施方式，所述阳性对照包含104、105、106拷贝/反应的诺如病毒RNA。
根据本发明的某些实施方式，所述阴性对照包含生理盐水。
根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒中包括：
(1)裂解液：8％～12％Triton X-100，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0；
(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μM捕获探针；
(3)洗涤液：2～2.5mmol/LNaCl，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/LTris HCL，pH 6.0～10.0，8％～12％SDS；
(4)反应液：5～15mmol/L Tris HCL，35～45mmol/L MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，5～15mmol/L Na2HPO4，1.5～2.5mmol/L KH2PO4；
(5)检测液：5～15pmol/L上游引物NV nT7，5～15pmol/L下游引物NV T7，5～10pmol/L NV荧光探针，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH6.0～10.0，0.5～1.5mmol/L EDTA，余量为DEPC水；
(6)酶液：500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，0.5～1.5mmol/L EDTA，5％～15％BSA；
(7)阳性对照：诺如病毒RNA(104～106拷贝/反应)；
(8)阴性对照：生理盐水。
根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒中包括：
(1)裂解液：10％Triton X-100，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCl，pH 8.0；
(2)核酸提取液：120mM EDTA，250mg/L磁珠，25μM捕获探针；
(3)洗涤液：2mmol/L NaCl，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCL，pH 8.0，10％SDS；
(4)NV反应液：10mmol/L Tris-HCL，40mmol/L MgCl2，2.5mM dNTPs，6mM NTPs，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4；
(5)NV检测液：10pmol/L上游引物NV nT7，10pmol/L下游引物NV T7，7.5pmol/L荧光探针NV Probe，1mmol/L Tris～HCl PH8.0，1mmol/L EDTA，DEPC水；
(6)酶液：750U/反应M-MLV反转录酶、1000U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/L Tris～HCl pH8.0，2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA；
(7)NV阳性对照：含有105拷贝/反应诺如病毒RNA；
(8)NV阴性对照：生理盐水。
根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒中包括：
(1)裂解液：10％Triton X-100，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCl，pH 8.0；
(2)核酸提取液：120mM EDTA，250mg/L磁珠，25μM捕获探针；所述捕获探针为Oligo(dT)；
(3)洗涤液：2mmol/L NaCl，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCL，pH 8.0，10％SDS；
(4)NV反应液：10mmol/L Tris-HCL，40mmol/L MgCl2，2.5mM dNTPs，6mM NTPs，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4；
(5)NV检测液：10pmol/L上游引物NV nT7，10pmol/L下游引物NV T7，7.5pmol/L荧光探针NV Probe，1mmol/L Tris～HCl PH8.0，1mmol/L EDTA，DEPC水；
(6)酶液：750U/反应M-MLV反转录酶、1000U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/L Tris～HCl pH8.0，2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA；
(7)NV阳性对照：含有105拷贝/反应诺如病毒RNA；
(8)NV阴性对照：生理盐水。
根据本发明的某些实施方式，所述试剂盒中包括：
(1)裂解液：10％Triton X-100，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCl，pH 8.0；
(2)核酸提取液：120mM EDTA，250mg/L磁珠，25μM捕获探针；所述捕获探针为Oligo(dT)，所述Oligo(dT)的长度是20；
(3)洗涤液：2mmol/L NaCl，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCL，pH 8.0，10％SDS；
(4)NV反应液：10mmol/L Tris-HCL，40mmol/L MgCl2，2.5mM dNTPs，6mM NTPs，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4；
(5)NV检测液：10pmol/L上游引物NV nT7，10pmol/L下游引物NV T7，7.5pmol/L荧光探针NV Probe，1mmol/L Tris～HCl PH8.0，1mmol/L EDTA，DEPC水；
(6)酶液：750U/反应M-MLV反转录酶、1000U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/L Tris～HCl pH8.0，2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA；
(7)NV阳性对照：含有105拷贝/反应诺如病毒RNA；
(8)NV阴性对照：生理盐水。
诺如病毒的检测方法
本发明还提供了一种使用所述试剂盒检测诺如病毒的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待检样品中的靶标RNA；
(2)利用上述技术方案所述的引物探针对待检样品中的靶标RNA进行RNA恒温扩增；
(3)记录待检样品反应的ct值：ct≤45的样本为阳性；45＜ct＜50的样本建议重
新检测，复检结果：ct＜50的样本为阳性；ct无数值或为50的样本为阴性。
根据本发明的某些实施方式，根据ct值判定是否含有诺如病毒RNA。
根据本发明的某些实施方式，45＜ct＜50的ct值为灰区即临界值，需要复检确认。
根据本发明的某些实施方式，所述检测使用FAM通道、HEX通道、或VIC通道。
根据本发明的某些实施方式，所述探针包含FAM荧光标记时，所述检测使用FAM通道。根据本发明的某些实施方式，所述探针包含HEX荧光标记时，所述检测使用HEX通道。根据本发明的某些实施方式，所述探针包含VIC荧光标记时，所述检测使用VIC通道。
优选的，所述待检样品为食品。
优选的，所述食品可能感染诺如病毒。
优选的，所述扩增反应体系为所述反应液和检测液的混合溶液。
优选的，所述扩增反应条件为荧光PCR仪中42℃±1℃反应40～60分钟。
优选的，所述扩增的反应条件为荧光PCR仪中是在42℃±1℃反应，例如在41-42℃或42-43℃反应。优选的，所述扩增的反应条件为荧光PCR仪中是在41℃、42℃或43℃反应。
优选的，所述扩增的反应条件为荧光PCR仪中反应40～60分钟，例如40～50分钟或50～60分钟。优选的，所述扩增反应条件为荧光PCR仪中反应40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟或60分钟。
根据本发明的某些实施方式，所述提取待检样品中的靶标RNA包括用所述裂解液裂解待测样品中的病毒，得到含有靶标RNA的裂解病毒后的裂解溶液；和向裂解溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标RNA结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到靶标RNA。
根据本发明的某些实施方式，所述利用引物和探针对待检样品中的靶标RNA进行RNA恒温扩增包括将步骤(1)提取得到的靶标RNA加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，进行第一次温育和第二次温育，然后加入所述酶液，在42℃±1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化。
根据本发明的某些实施方式，所述利用引物和探针对待检样品中的靶标RNA进行RNA恒温扩增包括将步骤(1)提取得到的靶标RNA加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，进行第一次温育和第二次温育，所述第一次温育是在60℃±2℃下温育8～12min后，所述第二次温育是在42±1℃下温育3～5min，然后加入所述酶液，由此开始在42℃±1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；
优选的，所述诺如病毒的检测方法由上述技术方案所述的试剂盒进行检测，具体操作方法包括：
(1)用所述裂解液裂解待测样品中的病毒，得到含有靶标RNA的裂解溶液，向所述裂解溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标RNA结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到靶标RNA；
(2)将步骤(1)提取得到的靶标RNA加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，在60℃±2℃下温育8～12min后，再在42±1℃下温育3～5min，然后加入所述酶液，由此开始在42℃±1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；
(3)根据荧光信号产生的时间和强度，记录待检样品反应的ct值：ct≤45的样本为阳性；45＜ct＜50的样本建议重新检测，复检结果：ct＜50的样本为阳性；ct无数值或为50的样本为阴性。
根据本发明的某些实施方式，所述第一次温育是在60℃±2℃下温育8～12min。
根据本发明的某些实施方式，所述第一次温育是在60℃±2℃下温育，例如58-60℃或60-62℃下温育。根据本发明的某些实施方式，所述第一次温育是在58℃、59℃、59.5℃、59.8℃、60℃、60.2℃、60.5℃、61℃或62℃下温育。
根据本发明的某些实施方式，所述第一次温育是温育8～12min，例如温育8～10min或10～12min。根据本发明的某些实施方式，所述第一次温育是温育8min、9min、10min、11min或12min。
根据本发明的某些实施方式，所述第二次温育是在42±1℃下温育3～5min。根据本发明的某些实施方式，所述第二次温育是在42±1℃下温育，例如例如41-42℃或42-43℃下温育。根据本发明的某些实施方式，所述第二次温育是在41℃、41.5℃、41.8℃、42℃、42.2℃、42.5℃或43℃下温育。
根据本发明的某些实施方式，所述第二次温育是温育3～5min，例如温育3～4min或4～5min。根据本发明的某些实施方式，所述第一次温育是温育3min、4min或5min。
根据本发明的某些实施方式，所述利用引物和探针对待检样品中的靶标RNA进行RNA恒温扩增包括加入所述酶液，在42℃±1℃下反应40～60min。
根据本发明的某些实施方式，所述利用引物和探针对待检样品中的靶标RNA进行RNA恒温扩增包括加入所述酶液，在42℃±1℃下反应，例如在41-42℃或42-43℃下反应。根据本发明的某些实施方式，所述利用引物和探针对待检样品中的靶标RNA进行RNA恒温扩增包括加入所述酶液，在41℃、41.5℃、41.8℃、42℃、42.2℃、42.5℃或43℃下反应。
根据本发明的某些实施方式，所述利用引物和探针对待检样品中的靶标RNA进行RNA恒温扩增包括加入所述酶液，反应40～60min，例如40～50min或50～60min。根据本发明的某些实施方式，所述利用引物和探针对待检样品中的靶标RNA进行RNA恒温扩增包括加入所述酶液，反应40min、41min、42min、43min、44min、45min、46min、47min、48min、49min、50min、51min、52min、53min、54min、55min、56min、57min、58min、59min或60min。
根据本发明的某些实施方式，(4)中ct≤45的样本为阳性，例如ct≤40、ct≤35、ct≤30、ct≤25、ct≤20、ct≤15、ct≤10、ct≤5的样本为阳性。根据本发明的某些实施方式，(4)中ct≤45的样本为阳性，例如ct是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45的样本为阳性。
根据本发明的某些实施方式，(4)中45＜ct＜50的样本建议重新检测，例如45＜ct＜49、45＜ct＜48、45＜ct＜47、45＜ct＜46、46＜ct＜50、46＜ct＜49、46＜ct＜48、46＜ct＜47、47＜ct＜50、47＜ct＜49、47＜ct＜48、48＜ct＜50、48＜ct＜49、49＜ct＜50的样本建议重新检测。根据本发明的某些实施方式，(4)中ct是46、47、48或49的样本建议重新检测。
根据本发明的某些实施方式，(4)复检结果中ct＜50的样本为阳性，例如ct＜45、ct＜40、ct＜35、ct＜30、ct＜25、ct＜20、ct＜15、ct＜10或ct＜5的样本为阳性。根据本发明的某些实施方式，(4)复检结果中ct＜60的样本为阳性，例如ct是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49的样本为阳性。
根据本发明的某些实施方式，参照阳性对照和阴性对照结果对待测样品进行检测及判定。
根据本发明的某些实施方式，所述判定方法为：检测结果为阳性，则样品中有诺如病毒，阴性则样品中没有诺如病毒。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的引物探针、试剂盒及检测诺如病毒的方法，与现有的NV检测相比，本发明具有以下优点：
(1)高特异性：本发明针对NV靶核酸设计的特异性荧光探针，可高效、特异性检测NV的RNA；
(2)高灵敏度：本发明以RNA为模板扩增，病毒基底RNA浓度是DNA的1000倍，灵敏度可达103拷贝/反应；
(3)快速检测：本发明将核酸的扩增与检测同步进行，扩增效率高，以100～1000拷贝/循环速率扩增，15～30分钟可将模板放大109倍。而且整个过程为恒温，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要50min，培养加检测5h即可得到结果，相比国标法时间大大缩短。
(4)污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。
(5)设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。
可见，本发明试剂盒能够检测食品样本中的NVRNA，具有特异性高、灵敏度高(可达103拷贝/反应)、准确(避免假阳性)检测、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(50min完成扩增检测)的特点，将在诺如病毒快速检测中发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明：
图1为本发明实施例3中灵敏度检测结果；
图2为本发明实施例4中特异性检测结果；
图3为本发明实施例4中特异性干扰检测结果；
图4为本发明实施例5中重复性的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了上述技术方案中利用RNA恒温扩增检测诺如病毒的引物探针，所述引物和探针均为特异性序列，可特异性检测诺如病毒。
本发明所述引物的序列分别为：
上游引物为NV nT7：TATTCATCACTGGAT，或GGCCATGTTCCGCTGG；
下游引物为NV T7：AATTTAATAC GACTC ACTAT AGGGAGA CAATACATCACAGGG、AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGAAGCATTAACCTCCGG；下游引物上具有T7 RNA聚合酶识别的启动子序列。
在本发明中，所述NV荧光探针为分子信标，是具有一个环和一个自身互补的茎的发夹结构，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，分子信标的环部分和标靶互补，两头由于互补而成为茎。
本发明所述探针的核酸分子序列为：CGACGC AAUAUUGUGCAAGCCAC GCGUCG或CCAGGGAUUGUGGACAGGAGAUCCUGG。
本发明所述NV荧光探针5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
探针遇到靶标RNA探针将优先和靶标RNA结合而不是形成发夹结构，由于茎结构被破坏，荧光报告物质与猝灭剂相互分离，报告物质得以发射荧光。探针在没有靶RNA存在的情况下荧光剂与猝灭剂可以稳定地结合在一起，不发射荧光，因而背景很低。
本发明提供了一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的试剂盒，所述试剂盒包括含有上述技术方案所述引物探针的检测液、含有T7 RNA聚合酶和M-MLV反转录酶的酶液和反应液，还包括裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。
优选的，本发明用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的试剂盒中，包括以下各种试剂：
(1)裂解液：8％～12％Triton X-100，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCl，pH 6.0～10.0；
(2)核酸提取液：40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μM捕获探针；
(3)洗涤液：2～2.5mmol/LNaCl，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/LTris HCl，pH 6.0～10.0，8％～12％SDS；
(4)反应液：5～15mmol/L Tris HCl，35～45mmol/L MgCl2，0.5～5mM dNTPs，1～10mM NTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，5～15mmol/L Na2HPO4，1.5～2.5mmol/L KH2PO4；
(5)检测液：5～15pmol/L上游引物NV nT7，5～15pmol/L下游引物NV T7，5～10pmol/l NV荧光探针，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH6.0～10.0，0.5～1.5mmol/L EDTA，余量为DEPC水；
(6)酶液：500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，0.5～1.5mmol/L EDTA，5％～15％BSA；
(7)阳性对照：诺如病毒RNA(104～106拷贝/反应)；
(8)阴性对照：生理盐水。
其中，所述阳性对照中，诺如病毒中优选含有104～106拷贝/反应的诺如病毒。本发明所述试剂盒中的试剂均为本领域中的常规试剂，本发明对试剂来源没有限定，均可市购。
本发明检测诺如病毒的试剂盒采用的是RNA恒温扩增检测方法，使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现核酸扩增，M-MLV反转录酶用于产生靶标RNA的一个DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的探针与扩增的靶标RNA特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。该试剂盒能够检测诺如病毒中的RNA，具有特异性高、灵敏度高和污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)的特点。
本发明还提供了一种诺如病毒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)提取待检样品中的靶标RNA；
(2)利用上述技术方案所述的引物探针对待检样品中的靶标RNA进行RNA恒温扩增；
(3)记录待检样品反应的ct值：ct≤45的样本为阳性；45＜ct＜50的样本建议重新检测，复检结果：ct＜50的样本为阳性；ct无数值或为50的样本为阴性。
本发明优选将待检样品溶解于生理盐水，裂解病毒后，提取病毒的RNA做为恒温扩增的模板。本发明所述裂解病毒及提取RNA的试剂优选采用本发明上述技术方案所述试剂盒中的试剂进行，所述方法均采用本领域技术人员所熟知的方法。
本发明所述恒温扩增反应体系是所述反应液和检测液的混合溶液。
本发明所述扩增反应可选的在荧光PCR仪中进行，所述反应温度优选为40～44℃，更优选为42℃，反应时间优选为40～60min，更优选为50min。
在本发明中，所述诺如病毒的检测方法优选由上述任意一项技术方案所述的试剂盒进行检测，具体操作方法包括：
(1)用所述裂解液裂解待测样品中的病毒，得到含有病毒核酸的裂解溶液；向裂解溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标RNA结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得靶标RNA；
(2)将步骤(1)提取得到的靶标RNA加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，在60℃±1℃下温育10min后，再在42℃±1℃下温育5min，然后加入所述酶液，由此开始在42℃±1℃下反应50min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；
(3)根据荧光信号产生的时间和强度，参照NV阳性对照和NV阴性对照结果对待测样品进行检测及判定；所述判定方法为：检测结果为阳性，则样品中有诺如病毒，阴性则样品中没有诺如病毒。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：用于RNA恒温扩增检测诺如病毒(NV)的专用引物和探针的设计
本实施例设计用于RNA恒温扩增检测诺如病毒(NV)的上游引物NVnT7、下游引物NVT7和NV检测探针。
本发明选择NV病毒高度保守区段SEQ ID NO：1作为扩增靶序列区域，根据引物探针设计原理，使用DNAman软件人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测诺如病毒(NV)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：
(1)一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生NV靶标核酸(NV RNA)的DNA拷贝的NV检测引物，所述NV检测引物由上游引物NV nT7和下游引物NV T7组成，上游引物NV nT7引物序列为5’-TATTCATCACTGGAT-3’(SEQ ID NO：2)，下游引物NV T7引物序列为5’-AATTTAATACGACTC ACTAT AGGGAGACAATACATCA CAGGG-3’，(SEQ ID NO：3)；
(2)一条用于在T7 RNA聚合酶作用下根据所述NV靶标核酸(NV RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的NV检测探针NV Probe，所述NV检测探针NV Probe的核苷酸序列为5’-CGACGC AAUAUUGUGCAAGCCAC GCGUCG-3’，(SEQ ID NO：4)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。
实施例2：制备诺如病毒(NV)的RNA恒温扩增检测试剂盒
本实施例制备诺如病毒(NV)的RNA恒温扩增检测试剂盒。
利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明诺如病毒(NV)的RNA恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有T7引物、nT7引物、NV检测探针、M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶。
所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和NV检测探针存在于NV检测液中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于酶液中；具体来讲，试剂盒主要成分如下：
(1)裂解液：10％Triton X-100，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCl，pH 8.0；
(2)核酸提取液：120mM EDTA，250mg/L磁珠，25μM捕获探针；所述捕获探针为Oligo(dT)，所述Oligo(dT)的长度是20；
(3)洗涤液：2mmol/L NaCl，5mol/L异硫氰酸胍，10mmol/L Tris HCl，pH 8.0，10％SDS；
(4)NV反应液：10mmol/L Tris-HCl，40mmol/L MgCl2，2.5mM dNTPs，6mM NTPs，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4；
(5)NV检测液：10pmol/L上游引物NV nT7，10pmol/L下游引物NV T7，7.5pmol/L荧光探针NV Probe，1mmol/L Tris～HCl PH8.0，1mmol/L EDTA，DEPC水；
(6)酶液：750U/反应M-MLV反转录酶、1000U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/L Tris～HCl pH8.0，2.7mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，10％BSA；
(7)NV阳性对照：含有105拷贝/反应诺如病毒RNA；
(8)NV阴性对照：生理盐水。
实施例3：诺如病毒的RNA恒温扩增检测的灵敏度
本实施例检测诺如病毒的RNA恒温扩增检测的灵敏度。
用本发明试剂盒(组成见实施例2)检测样品中的诺如病毒(NV)，具体方法包括以下步骤：
(1)RNA稀释
测定浓度为1×1010拷贝/反应的诺如病毒RNA，10倍梯度分别稀释到106拷贝/反应、105拷贝/反应、104拷贝/反应、103拷贝/反应、102拷贝/反应、101拷贝/反应、100拷贝/反应。
(2)恒温扩增检测
向样品处理管中加入40μL反应检测液(40μL NV反应液+2.5μL NV检测液)，NV检测液中T7引物浓度为2.5pmol，nT7引物浓度为10pmol，NV检测探针浓度为7.5pmol。
取振荡混匀的上述反应检测液30μL加至微量反应管，60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μL已预热至42℃的酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。
将微量反应管移至天隆TL988 PCR仪IV通道(西安天隆公司产品)，42℃反应50分钟，设定每60秒检测一次荧光，共检测50次。
(3)结果判定
根据PCR扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取ct值，判定结果。
阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。ct表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数；
①阳性结果判定：
FAM通道：ct≤45的样本为阳性；45＜ct＜50的样本建议重新检测，复检结果FAM通道：ct＜50的样本为阳性。
(2)阴性结果判定：FAM通道ct无数值或为50。
(4)结果
图1显示灵敏度的检测图，NV病毒的浓度为103拷贝/反应，检测结果为阳性，即检测下限灵敏度可以达到103拷贝/反应。对低浓度污染的样品有更高的识别度，所以对质控检测来说，本试剂盒更安全更省时。
实施例4：诺如病毒的RNA恒温扩增检测特异性
本实施例检测诺如病毒的RNA恒温扩增检测特异性。
本检测模式为本发明的另一个应用：试剂盒组成同实施例2；特异性参考品处理的方法如下：15例阴性参考品包括沙门氏菌、粪肠球菌、无乳链球菌、阪崎肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157：H7、普通变形杆菌、柠檬酸杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯氏菌，另设阳性对照(诺如病毒)一个。检测方法同实施例3，检测中所用试剂量同实施例3。
使用本发明试剂盒的检测结果如图2、3，15个阴性参考品的扩增曲线与阈值线无交叉，可明确判定为阴性。通过图2、3可以说明本发明的试剂盒对诺如病毒特异性好，能够准确检测。
通过图2可以说明本发明的试剂盒对诺如病毒特异性好，能够准确检测出诺如病毒，而不会受到其他多种细菌的干扰。
实施例5：诺如病毒的RNA恒温扩增检测重复性
本实施例检测诺如病毒的RNA恒温扩增检测重复性。
本检测模式为重复病毒RNA浓度梯度查看线性实验，重复性参考品处理的方法如下：将诺如病毒RNA，10倍梯度分别稀释到105拷贝/反应、104拷贝/反应、103拷贝/反应、102拷贝/反应，将每个浓度梯度重复3次平行检测。检测方法同实施例3，检测中所用试剂量同实施例3。
使用本发明试剂盒的检测结果如图4，9个阳性参考品扩增曲线，每3个浓度梯度线性梯度及重复性好。
通过图4可以说明本发明的试剂盒对诺如病毒重复性良好，能够准确检测。
本专利首用RNA恒温扩增SAT方法去检测诺如病毒，且本方法实验后可知灵敏度高、特异性强、污染低、重复性强、快速的特点，给出了基于RNA为模板的一种检测方法，该方法对仪器要求低，操作过程简单，给检测行业又提供了一种新的检测方法和途径。
序列表
<110> 张家口健垣科技有限公司
<120> 一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针、试剂盒及检测方法
<130> TQZX2019-ZL1207
<141> 2019-10-18
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1410
<212> RNA
<213> Norwalk Viruses spp
<400> 1
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ctgcacttcg ggataagc 21
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
aatttaatac gactcactat agggagacca caccgctaaa cg 45
<210> 4
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
cugcgggacc accggaugca ugucgcag 31

Claims (10)

1.一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针，所述引物为：
上游引物NV nT7：所述上游引物NV nT7包含：TATTCATCACTGGAT、GGCCATGTTCCGCTGG，或其同源序列中的至少8个核苷酸序列；
下游引物NV T7：所述下游引物NV T7包含：T7启动子序列和靶标引物序列；其中所述标靶引物序列包含CAATACATCA CAGGG、AGAAGCATTAACCTCCGG或其同源序列中的至少8个核苷酸序列；其中所述T7启动子序列包含AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA，或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；
其中所述探针具有环和自身互补的茎的发夹结构。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其中，所述探针的两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团，优选所述荧光基团包含FAM、HEX或VIC，所述淬灭基团包含DABCYL。
3.根据权利要求1所述的引物和探针，其中，所述探针序列包含：CGACGCAAUAUUGUGCAAGCCAC GCGUCG、CCAGGGAUUGUGGACAGGAGAUCCUGG，或其同源序列中的至少10个核苷酸。
4.根据权利要求1或3所述的引物和探针，其中，所述同源序列指的是与所述序列至少70％相同的核苷酸序列，优选所述同源序列具有与本发明公开的序列有基本相同的活性。
5.一种用于RNA恒温扩增检测诺如病毒的试剂盒，所述试剂盒包括反应液，含有权利要求1-4中任一项所述引物和探针的检测液，以及含有T7 RNA聚合酶和M-MLV反转录酶的酶液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
反应液：所述反应液包含5～15mmol/L Tris HCL，35～45mmol/LMgCl2，0.5～5mMdNTPs，1～10mM NTPs，2.5～2.7mmol/L KCl，5～15mmol/L Na2HPO4，1.5～2.5mmol/LKH2PO4；
检测液：所述检测液包含5～15pmol/L上游引物NV nT7，5～15pmol/L下游引物NV T7，5～10pmol/L NV荧光探针，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH6.0～10.0，0.5～1.5mmol/LEDTA，余量为DEPC水；和
酶液：所述酶液包含500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，2.5～2.7mmol/L KCl，0.5～1.5mmol/L EDTA，5％～15％BSA。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含：
(1)裂解液：所述裂解液包含8％～12％Triton X-100，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0；
(2)核酸提取液：所述核酸提取液包含40～200mM EDTA，50～500mg/L磁珠，1～50μM捕获探针；优选所述捕获探针为Oligo(dT)，优选所述Oligo(dT)的长度是10-26；
(3)洗涤液：所述洗涤液包含2～2.5mmol/L NaCl，3mol/L～6.5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/L Tris HCL，pH 6.0～10.0，8％～12％SDS；
(4)阳性对照：所述阳性对照包含104～106拷贝/反应的诺如病毒RNA；
(5)阴性对照：所述阴性对照包含生理盐水。
9.一种使用权利要求5-8中任一所述试剂盒检测诺如病毒的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待检样品中的靶标RNA；
(2)利用上述技术方案所述的引物探针对待检样品中的靶标RNA进行RNA恒温扩增；
(3)记录待检样品反应的ct值：ct≤45的样本为阳性；45＜ct＜50的样本建议重新检测，复检结果：ct＜50的样本为阳性；ct无数值或为50的样本为阴性。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法包括：
(1)用所述裂解液裂解待测样品中的病毒，得到含有靶标RNA的裂解溶液；向所述裂解溶液中加入所述核酸提取液，使磁珠上的捕获探针与靶标RNA结合，用所述洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到靶标RNA；
(2)将步骤(1)提取得到的靶标RNA加入由所述反应液和所述检测液组成的扩增反应液中，在60℃±2℃下温育8～12min后，再在42±1℃下温育3～5min，然后加入所述酶液，由此开始在42℃±1℃下反应40～60min，用检测仪同步记录荧光信号的变化；
(3)根据荧光信号产生的时间和强度，记录待检样品反应的ct值：ct≤45的样本为阳性；45＜ct＜50的样本建议重新检测，复检结果：ct＜50的样本为阳性；ct无数值或为50的样本为阴性。
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