CN113502339B

CN113502339B - 肠球菌的恒温核酸同步放大检测方法及其专用检测试剂盒

Info

Publication number: CN113502339B
Application number: CN202010672845.0A
Authority: CN
Inventors: 高伟; 徐希媛; 郑立; 居金良; 崔振玲; 张帝
Original assignee: Shanghai Rendu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Rendu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-07-14
Filing date: 2020-07-14
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2040-07-14
Also published as: CN113502339A

Abstract

本发明公开了一种肠球菌的恒温核酸同步放大检测方法及其专用检测试剂盒，属于生物技术方法领域。本发明提供的试剂盒包括核酸提取液、检测液a、检测液b和SAT酶液，通过分步添加各组分进行反应可以实现对肠球菌快速、准确检测，并且特异性好，灵敏度高，扩增产物RNA易于降解，不会由于检测引起样本交叉污染或环境污染，并且具有对仪器设备要求低和成本低的优点，大大降低了对肠球菌检测的成本。

Description

肠球菌的恒温核酸同步放大检测方法及其专用检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术方法领域，具体涉及一种肠球菌的恒温核酸同步放大检测方法及利用RNA的探针法恒温核酸同步放大检测方法(Probe Sequence Amplification andTest，pSAT)检测肠球菌的专用检测试剂盒。

背景技术

船舶压载水中含有细菌等大量微生物，其中一部分会随着压载水转移入新的地理性隔离水域，成为外来入侵种，威胁到这些海湾、河口或内陆水域的生态系统结构及其物种多样性，其中有害的病原菌甚至可能导致当地物种的灭绝。近年来香港多次发生有压载水传播细菌造成红潮，使鱼、贝类感染并导致当地居民食物中毒事件。随着国际航运产业不断壮大，以及人们对海洋环境保护意识的不断增强，船舶压载水的排放所带来的外来海洋生物入侵问题引起了社会各界的广泛关注。

肠球菌(Enterococcus.En.)是拟杆菌门肠球菌科肠球菌属的病原微生物，大小约0.6～2.0μm×0.6～2.5μm，为圆形或椭圆形单个或成对或短链状排列的革兰氏阳性球菌，无芽胞，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。肠球菌属包括粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌、酪黄肠球菌等13个种，广泛分布于自然环境及人和动物消化道内，肠球菌除了作为医院感染的重要病原菌，环境中肠球菌的监测也尤为重要，而食品和水中肠球菌检验早在2007年就已列入出入境检验检疫中。

传统的肠球菌检测通常采用琼脂平板培养法，这种方法主要依靠培养基进行培养、分离及生化鉴定，操作过程繁杂且费时费力，一般需2-3天才能完成，无法适应快速检测的要求。杜邦、梅里埃、默克等国际跨国公司在微生物快速检测市场投入巨资，分别研制了如

和

等快速检测系统，对微生物污染进行准确、快速和标准化的检测，自动化同步完成任何微生物的基因鉴定和分子分型，实现环境、设备、人员等各个生产环节上全方位的微生物风险评估和污染溯源。例如CN110760600A公开一种采用Q-PCR技术测定肠球菌的快速检测方法，虽然其缩短了检测时间且克服了传统平板培养方法检测肠球菌操作繁琐、耗时耗力的问题，并提高了鉴别的准确度，但是该文献公开的方法的扩增产物为DNA，由于DNA难于降解会造成样本交叉污染或环境污染，并且该PCR方法对反应设备有较高要求，使用的设备价格较高，会大大增加国内相关企业检测成本。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明提供一种肠球菌的恒温核酸同步放大检测试剂盒，其包括：

(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针A的固相支持物和探针B，其中，

所述捕获探针A用于捕获检测序列，

所述探针B的3’端序列为与靶标序列特异性结合的序列，5’端序列为第一引物的序列，所述第一引物的5’端为启动子序列，3’端序列为与靶标序列不同源的序列；

(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与靶标序列的互补序列特异性结合；

(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标序列的转录RNA特异性结合；

(4)SAT酶液：其包含至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶和逆转录酶。

上述试剂盒还包括：

(5)样品保存液，其包含高浓度去垢剂；

任选地，所述试剂盒还包括：

(6)En外标，其为含有系列稀释浓度肠球菌的菌液；

(7)En阴性对照：其为不含有肠球菌的体系；和

(8)定量标准曲线，其纵坐标为检测荧光dt值，横坐标为肠球菌的浓度Log值。

上述第一引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；所述第二引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；所述靶标检测探针的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:3所示，靶标检测探针的序列的两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。

上述固相支持物为磁性颗粒，所述特异性捕获探针A的核苷酸序列如序列表中SEQID NO:5所示；和/或所述探针B的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。

上述检测液a的组分为：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl₂，1-10mMNTPS，0.5-5mM dNTPs，1-10％PVP40，1-10％甘油，0-25％DMSO，0.1～0.5μM的第二引物。

上述检测液b的组分为：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl₂，1-10mMNTPS，0.5-5mM dNTPs，1-10％PVP40，1-10％甘油，0.1～0.5μM的第一引物，0.1～0.5μM的靶标检测探针。

上述SAT酶液的组分为：RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)200～2000U/反应、逆转录酶400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH 7.5、10～100mM N-acetyl-L cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mMKCl、1～10mM EDTA、2～20％v/v Triton X-100、10～40％v/v glycerol。

用于上述的试剂盒中的引物和探针组也属于本发明的内容，其中引物和探针组包括：

特异性捕获探针A，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；

探针B，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；

第一引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

第二引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；和

靶标检测探针，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，并在序列的两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。

本发明还提供一种肠球菌的核酸检测方法，其利用上述的试剂盒，包括以下步骤：

1)向试样中加入核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；所述试样为环境样本；

2)向所述分析检测样品中加入检测液a进行第一步反应，获得第一步反应液；

3)向所述第一步反应液中加入SAT酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；

4)向所述第二步反应液中加入检测液b进行第三步反应，同时进行实时荧光检测，获得实时荧光检测的dt值；

5)建立定量标准曲线或直接利用试剂盒提供的定量标准曲线，其纵坐标为dt值，横坐标为肠球菌浓度的log值；

6)根据步骤4)获得的实时荧光检测的dt值，基于所述定量标准曲线得到检测结果。

上述方法中，步骤1)中进行核酸提取步骤为：

11)向所述试样中加入核酸提取液后，在55℃-65℃静置5-15min，室温放置5-15min；磁力架上吸磁4-6min，弃上清；

12)加入洗涤液(HEPES 10mM，NaCl 50mM，1％SDS，EDTA 5mM)震荡洗涤20-40s，磁力架上吸磁4-6min，弃上清；

13)重复步骤12)，获得所述分析检测样品。

上述方法中，步骤2)中所述第一步反应的条件为37℃-45℃保温4-6min；

步骤3)中使用SAT酶液前事先预热，预热的条件为41-43℃；

步骤3)中所述第二步反应的条件为37℃-45℃恒温反应4-6min；其中恒温可以为在指定的温度条件下上下波动0.5℃以下、1℃以下、2℃以下或3℃以下，只要波动后的温度在限定的温度范围之内；

步骤4)中所述第三步反应的条件为37℃-45℃恒温反应40-50min。

上述方法中，步骤6)中的检测结果指标为：

71)当dt值>13.72时，肠球菌浓度<10CFU/ml；

72)当11.71<dt值≤13.72时，10CFU/ml≤肠球菌浓度<100CFU/ml；

73)当dt值≤11.71时，肠球菌浓度≥100CFU/ml，并判定为阳性；

74)当dt值≤7.7时，肠球菌浓度≥10000CFU/ml，并判定为强阳性。

基于以上技术方案提供的肠球菌核酸的RNA恒温同步放大检测方法利用RNA的探针法核酸恒温同步放大检测方法的基本原理，可以实现对肠球菌的快速、准确检测，并且特异性好，灵敏度高，实施例结果表明本发明方法检测肠球菌的分析灵敏度可达100CFU/ml，扩增产物RNA在自然环境下易于降解，不会因检测引起样本交叉污染或环境污染，并且具有对仪器设备要求低和成本低的优点，大大降低了国内相关企业对肠球菌检测的成本。提供的试剂盒中包括核酸提取液、检测液a、检测液b和SAT酶液，在使用过程中通过分步添加进行反应，可以避免不同引物探针之间的相互干扰，实现高灵敏度检测；并且反应过程为恒温反应，可以避免传统PCR方法中升温降温程序及循环过程，因而所需检测时间可以大大缩短，同时降低了对所用PCR仪器设备的设计成本和生产成本。除用于医学领域的肠球菌检测，本发明还可以用于对非医学诊断用样本，例如海水、船舶压载水等环境水样、以及饮用水、食品等样本中肠球菌的检测，适合大范围推广使用。

附图说明

图1为组1引物探针的灵敏度扩增曲线；

图2为组2引物探针的灵敏度扩增曲线；

图3为利用本发明提供的试剂盒在使用过程中进行样本定量的标准曲线；其中X轴为样本中肠球菌浓度的log值，Y轴为dt值；

图4为本发明提供的检测试剂盒的灵敏度检测曲线；

图5为利用本发明提供的试剂盒检测海水环境中肠球菌阳性样本的扩增曲线；

图6为实施例4的样本组的检测扩增曲线。

具体实施方式

针对现有技术中存在的肠球菌检测方法的缺陷，本发明提供一种利用RNA探针法核酸恒温同步放大的方法检测肠球菌，并提供了用于肠球菌检测的专用试剂盒，其同样能够实现对肠球菌的快速、准确检测。

以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明提及的所有引物和荧光探针用已有技术合成。

以下试剂可用于本发明：

样品保存液(上海仁度生物科技有限公司商售试剂，商品号为沪浦械备20150012)、Tris、TritonX-100、KCl、MgCl₂、NTPS、dNTPs、EDTA、PVP40、DMSO、HEPES pH7.5、N-acetyl-L cysteine、zinc acetate、trehalose、Tris-HCl pH 8.0、glycerol、逆转录酶和RNA聚合酶等，其中：

以下实施例中检测液a的组分为：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl₂，1-10mM NTPS，0.5-5mM dNTPs，1-10％PVP40，1-10％甘油，0-25％DMSO，0.1～0.5μM第二引物(5’-GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG-3'，SEQ ID NO:1)；

以下实施例中检测液b的组分为：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl₂，1-10mM NTPS，0.5-5mM dNTPs，1-10％PVP40，1-10％甘油，0.1～0.5μM第一引物(5’-AATTTAA TACGACTCACTATAGGGAGAGATGATGTAGTTCTGACCTTGC-3'(SEQ ID NO:2，其中斜体下划线部分为T7启动子序列，加粗部分为与靶标核酸不同源的人工合成序列，作为共同引物序列，共同引物序列一般长度在15-40bp，含有共同引物序列的引物需要满足一般引物设计的要求，例如自身不存在连续4个以上互补碱基，3’端无二级结构；G-C含量保持在40％-60％))，0.1～0.5μM靶标检测探针(5’-GCCUCGGGACGAAAGUCUGACCGAGACGAGGC-3'，SEQ ID NO:3)；

以下实施例中SAT酶液的组分为：RNA聚合酶(T7 RNA聚合酶(美国RD BioSciences公司))200～2000U/反应、逆转录酶(例如MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶，美国RDBioSciences公司)400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mM N-acetyl-Lcysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH8.0、40～200mM KCl、1～10mM EDTA、2～20％v/v Triton X-100、10～40％v/v glycerol。

实施例1：引物和探针设计

该实施例通过对Genbank数据库已有的肠球菌核酸序列(GenBank:DQ411810.1)以及文献(Designation of the provisional new enterococcus species CDC PNS-E2 asEnterococcus sanguinicola sp.nov.,isolated from human blood,andidentification of a strain previously named Enterococcus CDC PNS-E1 asEnterococcus italicus Fortina,Ricci,Mora,和Manachini 2004.J.Clin.Microbiol.46(10),3473-3476(2008))中公开的肠球菌核酸序列进行序列比对分析，基于肠球菌的保守基因片段(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示)选择其中无二级结构且高度保守的区段(在SEQ ID NO:4位置的第210bp-441bp)为检测序列设计引物及探针。

该实施例共设计了多组引物和探针，其中选择以下两组引物和探针(组1和组2)对肠球菌阳性参考品和阴性参考品(即阴性对照)进行检测验证，从而筛选出特异性、灵敏度和重复性均较好的引物和探针组，以用于检测肠球菌。

组1：

捕获探针A：

5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTAATGCACCGCGGGTCCATCCATCAG-3'(SEQID NO:5)；

探针B：

5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATGATGTAGTTCTGACCTTGCTTCTTCTCTAACAACAGAGTTTTA-3'(SEQ ID NO:6)；

第一引物：

5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATGATGTAGTTCTGACCTTGC-3’(SEQ ID NO:2)；

第二引物：5'-GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG-3'(SEQ ID NO:1)；

靶标检测探针：5'-GCCUCGGGACGAAAGUCUGACCGAGACGAGGC-3'(SEQ ID NO:3)，其荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为DABCYL；

其中在检测序列上的第一引物和第二引物的扩增区域作为靶标序列，靶标检测探针与该靶标序列的RNA拷贝特异性结合；

组2：

捕获探针A-1，同捕获探针A(SEQ ID NO:5)；

探针B-1：

5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATGATGTAGTTCTGACCTTGCCTAACAACAGAGTTTTACGATCCG-3'(SEQ ID NO:7)；

第一引物-1：

5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATGATGTAGTTCTGACCTTGC-3'(SEQ ID NO:2)；

第二引物-1：5’-CGGGAGGCAGCAGTAGGGA-3'(SEQ ID NO:8)；

靶标检测探针-1：5’-CUCGGGACGAAAGUCUGACCGAGACGAG-3'(SEQ ID NO:9)，其荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为DABCYL；

该实施例中使用到的阳性参考品和阴性参考品的制备方法为：以培养和测序鉴定为阳性的肠球菌作为阳性参考品；对培养至OD值约为1的肠球菌菌液进行梯度稀释并依次涂布平板，37℃培养12h后对平板上的菌落进行多次计数，并向多次计数获得肠球菌菌液标准品中加入等体积的样本保存液保存作为阳性菌液。实验前，用样本保存液将阳性菌液进行梯度稀释至10⁰CFU/ml，作为系列阳性标准品。以样本保存液作为阴性参考品。

分别使用上述组1和组2的引物和探针组对系列阳性标准品和阴性参考品进行检测，其中检测方法详见以下实施例4中描述的方法，组1和组2的引物和探针组对系列阳性标准品和阴性参考品的扩增曲线分别如图1和图2所示。可见组1的引物和探针组能够检测至10⁰CFU/ml，而组2的引物和探针组只能够检测至10³CFU/ml，因此，组1的引物和探针组的检测灵敏度远远高度组2的引物和探针组的检测灵敏度，以下实施例中选择组1的引物和探针组对肠球菌进行检测。

实施例2：肠球菌(En)的核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)

该实施例提供的用于肠球菌核酸检测的试剂盒基于RNA核酸恒温同步放大检测原理，利用该试剂盒的核酸提取体系和反应体系可参照现有文献(CN101333565A)公开的内容，使用该试剂盒进行提纯靶标RNA的磁珠-RNA富集方法也可参照现有文献(CN101333564A)公开的内容。

2.1、肠球菌(En)的核酸检测试剂盒的组分

该实施例提供的试剂盒包含以下组分：

(1)样本保存液：其含有高浓度去垢剂(上海仁度生物科技有限公司商售试剂)，用于对待测样品进行稀释或作为阴性参考品；

(2)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针A(实施例1中组1所示)的固相支持物(磁性颗粒，例如磁珠)和0.1～0.5μM的探针B(实施例1中组1所示)，其中所述捕获探针A用于捕获靶序列，所述探针B的3’端序列为与靶标序列(第一引物和第二引物的扩增区域)特异性结合的序列，5’端序列为第一引物的序列(实施例1中组1所示)，所述第一引物的5’端为T7启动子序列(其还可以为其他启动子序列，例如T3、M13或SP6启动子序列)，3’端序列为与靶标序列不同源的序列；

(3)检测液a：其包含10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl₂，1-10mM NTPS，0.5-5mM dNTPs，1-10％(V/V)甘油，1-10％PVP40，0-25％DMSO，0.1～0.5μM的第二引物(实施例1中组1所示)；优选检测液a的组分为：25mM Tris，20mM KC1，10mM MgCl₂，5mM NTPs，1mM dNTPs，5％(V/V)甘油，2％PVP40。

(4)检测液b：其包含10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl₂，1-10mM NTPS，0.5-5mM dNTPs，1-10％(V/V)甘油，1-10％PVP40，0.1～0.5μM的第一引物(实施例1中组1所示)，0.1～0.5μM的靶标检测探针(实施例1中组1所示)；优选检测液b的组分为：25mM Tris，20mM KC1，10mM MgCl₂，5mM NTPs，1mM dNTPs，5％(V/V)甘油，2％PVP40。

(5)SAT酶液：T7 RNA聚合酶200～2000U/反应、MMLV逆转录酶400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mM N-acetyl-L cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mM KCl、1～10mM EDTA、2～20％v/v Triton X-100、10～40％v/v glycerol。

为使用方便，该实施例提供的试剂盒还包含：

(6)En外标：其为含10⁴～10¹CFU/ml肠球菌的菌液；

(7)En阴性对照：其为不含有肠球菌的体系，如去离子水。

另外，该实施例提供的试剂盒还可包含用于样品中肠球菌的浓度定量的标准曲线(以下描述绘制方法)以及结果指标，该标准曲线以检测的荧光dt值作为纵坐标，以肠球菌浓度的log值作为横坐标，其中dt值表示样本实时荧光扩增曲线与阈值线交点对应的横坐标读数，刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点的与横坐标平行的线作为阈值线。结果判定标准为：

71)当dt值>13.72时，肠球菌浓度<10CFU/ml；

72)当11.71<dt值≤13.72时，10CFU/ml≤肠球菌浓度<100CFU/ml；

73)当dt值≤11.71时，肠球菌浓度≥100CFU/ml，并判定为阳性；

74)当dt值≤7.7时，肠球菌浓度≥10000CFU/ml，并判定为强阳性。

其中当7.7≤dt值≤13.72时，可以依据标准曲线获得肠球菌的浓度大小。

该实施例提到的标准曲线的绘制方法为：

将实施例1中的肠球菌阳性标准品使用样本保存液梯度稀释获得10¹-10⁴CFU/ml样本，使用本实施例提供的试剂盒对梯度稀释样本进行多次重复检测(检测方法以下实施例4详述)，获得每个浓度样本的实时荧光扩增曲线，从扩增曲线中获取荧光dt值，绘制以检测的荧光dt值作为纵坐标，以肠球菌浓度的log值作为横坐标的标准曲线，如图3所示，示出了该标准曲线，标准曲线方程为：y＝-2.072x+15.725，R²＝0.9862，可以用于计算样本中肠球菌的浓度。

在该实施例提供的试剂盒中，特异性捕获探针A可与肠球菌检测序列特异性结合，用于提取富集样本中的肠球菌核酸，探针B的3’端与靶标序列特异性结合，进而使得第一引物序列随着探针B的结合与靶标序列特异性结合；第一引物和第二引物是一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生靶标序列的DNA拷贝的检测引物，靶标检测探针则是一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据产生的靶标序列的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异性结合的检测探针，这些引物和探针的组合使用实现对肠球菌的快速、准确、特异和高灵敏度检测，该实施例提供的试剂盒检测肠球菌的灵敏度可达10⁰CFU/ml(如图1所示)。

实施例3：试剂盒的检测灵敏度

该实施例使用实施例2提供的试剂盒对肠球菌阳性标准品进行检测，具体包括：

将实施例1中的肠球菌阳性标准品使用样本保存液梯度稀释获得1×10⁰-1×10⁶CFU/ml样本，使用实施例2提供的试剂盒对梯度稀释样本进行多次重复检测(检测方法以下实施例4详述)，如图4所示，示出了实时荧光扩增曲线结果(纵坐标为相对荧光强度)，可见本发明提供的试剂盒可检测至1×10⁰CFU/ml。

为了验证本发明提供的试剂盒是否能够用于检测海水环境中的肠球菌，将实施例1中的肠球菌阳性标准品使用样本保存液梯度稀释获得1×10²-1×10⁶CFU/ml样本，分别取10μl的1×10²-1×10⁶CFU/ml样本，加入990μl无菌海水，制备1×10⁰-1×10⁴CFU/ml的肠球菌海水样品，使用无菌海水作为阴性对照，使用本发明提供的试剂盒对各梯度稀释的海水样本进行检测(检测方法以下详述)，检测结果如图5所示(纵坐标为相对荧光强度)，可见其能够检测至1×10⁰CFU/ml，表明海水环境不影响本发明提供的试剂盒的最低检出限，本发明试剂盒可以用于检测海水环境中的肠球菌。

实施例4：使用试剂盒对海水样本进行检测

该实施例使用实施例2提供的试剂盒对待测海水样本进行检测，以评价待测海水样本中是否含有肠球菌及其浓度，具体包括以下步骤：

(1)取海水样本1ml于无菌样品管中，加入等体积样本保存液，涡旋振荡1min，使其充分混合均匀，保存备用；

(2)准备样品处理管(1.5ml离心管)，分别标记待处理样品编号及阳性对照和阴性对照；

(3)将上述步骤(2)中的样本处理管分为3组，分别为样本组、阳性对照组和阴性对照组。各处理管中加入200μl核酸提取液；阳性对照组中分别继续加入不同浓度的阳性标准品(参照实施例1)250μl；样本组中继续加入250μl海水样品，阴性对照组中继续加入250μl阴性标准品(无菌海水)。每加一个样本换一次枪头，涡旋混匀；

(4)60℃反应10min，室温放置10min；

(5)将各样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5分钟(如果在磁珠吸附过程中有个别磁珠难以吸附至管壁则应适当延长吸附时间)；

(6)待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠；

(7)用洗涤液(HEPES 10mM，NaCl 50mM，1％SDS，EDTA 5mM，洗涤液如果有白色絮状沉淀物，用之前应先42℃加热，直至澄清)洗涤，加入700μl洗涤液后取下样品处理管震荡30秒后置于磁珠分离装置上，静置5分钟；保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠；

(8)重复上述步骤(7)，且第二次洗涤后，分离磁珠之前先低速微离，以保证管盖上粘附的磁珠能够被洗涤；

(9)将样品处理管移离磁珠分离装置，管中的磁珠-核酸复合物备用(此步应清晰可见磁珠)；

(10)向每个样品处理管中加入42μl检测液a洗涤磁珠，震荡混匀；

(11)取上述步骤(10)中40μl检测液a(包含磁珠)至洁净96孔板，42℃保温3min；同时将SAT酶液也预热到42℃；

(12)向96孔板中每孔加入25μl已预热的SAT酶液，加酶后贴上封板膜，42℃反应5min；

(13)向96孔板中每孔加入35μl检测液b，贴上封板膜；

(14)将96孔板快速转至恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次，从实时荧光扩增曲线中获取检测荧光dt值，根据提供的定量标准曲线，获得待测海水样本中的肠球菌浓度；检测结果如图6所示，为样本组的扩增曲线，其中a、b、c为样本组的三个重复，可见该扩增曲线的检测荧光dt值大约为11.5，根据实施例2中的标准曲线，可以计算出样本组中的肠球菌的浓度大约为110CFU/ml，判定为肠球菌阳性样品，分析该海水样本受到肠球菌污染。

(15)反应结束后，直接将96孔板取出浸泡于10％84消毒液中，取96孔板应小心操作，严禁打开封板膜(防止污染反应区)，实验结束后用10％的84消毒液清洁工作区及用具，最后用清水擦拭干净。

参照本实施例，同样可以对饮用水、食品(检测前先制成水样)等样本中肠球菌进行检测，当然也同样适用临床样本中肠球菌的检测，不再一一赘述。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海仁度生物科技有限公司

<120> 肠球菌的恒温核酸同步放大检测方法及其专用检测试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaggcagca gtagggaatc ttcgg 25

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aatttaatac gactcactat agggagagat gatgtagttc tgaccttgc 49

<210> 3

<211> 32

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccucgggac gaaagucuga ccgagacgag gc 32

<210> 4

<211> 1480

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gctttttctt tcaccggagc 60

ttgctccacc gaaagaaaag gagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca 120

tcagaagggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgt ataacaatag aaaccgcatg 180

gtttctattt gaaaggcgct tttgcgtcac tgatggatgg acccgcggtg cattagctag 240

ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcatagcc gacctgagag ggtgatcggc 300

cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg 360

caatggacga aagtctgacc gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa 420

aactctgttg ttagagaaga acaaggatga gagtaaaatg ttcatccctt gacggtatct 480

accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540

tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc 600

ccccggctca accggggagg gtcattggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggagag 660

tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aggaacacca gtggcgaagg 720

cggctctctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag 780

ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttggagggt ttccgccctt 840

cagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac 900

tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 960

gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ttgaccactc tagagataga gcttcccctt 1020

cgggggcaaa gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080

taagtcccgc aacgagcgca acccttattg ttagttgcca tcatttagtt gggcactcta 1140

gcgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1200

tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg ggaagtacaa cgagtcgcga agtcgcgagg 1260

ctaagctaat ctcttaaagc ttctctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg 1320

aagccggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380

gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt 1440

ttggagccag ccgcctaagg tgggatagat gattggggtg 1480

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gctaatgcac cgcgggtcca tccatcag 58

<210> 6

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatttaatac gactcactat agggagagat gatgtagttc tgaccttgct tcttctctaa 60

caacagagtt tta 73

<210> 7

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatttaatac gactcactat agggagagat gatgtagttc tgaccttgcc taacaacaga 60

gttttacgat ccg 73

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgggaggcag cagtaggga 19

<210> 9

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cucgggacga aagucugacc gagacgag 28

Claims

1.一种肠球菌的恒温核酸同步放大检测试剂盒，其特征在于，包括：

（1）核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针A的固相支持物和探针B，其中，

所述捕获探针A用于捕获检测序列，

（2）检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与靶标序列的互补序列特异性结合；

（3）检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标序列的RNA拷贝特异性结合；

（4）SAT酶液：其包含至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶和逆转录酶；

所述第一引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；所述第二引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；所述靶标检测探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，靶标检测探针的序列的两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团；

所述固相支持物为磁性颗粒，所述特异性捕获探针A的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:5所示，所述探针B的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：

（5）样品保存液，其包含高浓度去垢剂；

（6）肠球菌外标，其为含有系列稀释浓度肠球菌的菌液；

（7）肠球菌阴性对照：其为不含有肠球菌的体系；和

（8）定量标准曲线，其纵坐标为检测荧光dt值，横坐标为肠球菌的浓度Log值。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，

所述检测液a的组分为：10-50mM Tris，5-40 mM KCl，10-40mM MgCl₂，1-10mM NTPS，0.5-5mM dNTPs，1-10％ PVP40，1-10 %甘油，0-25％ DMSO，0.1~0.5μM的第二引物；

所述检测液b的组分为：10-50mM Tris，5-40mM KCl，10-40mM MgCl₂，1-10mM NTPS，0.5-5mM dNTPs，1-10％ PVP40，1-10 %甘油，0.1~0.5μM的第一引物，0.1~0.5μM的靶标检测探针；

所述SAT酶液的组分为：RNA聚合酶200～2000U/反应、逆转录酶 400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH 7.5、10～100mM N-acetyl-L cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mM KCl、1～10mM EDTA、2～20%v/v Triton X-100、10～40% v/v glycerol。

4.一种根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒中的引物和探针组，其包括：

特异性捕获探针A，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；

探针B，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；

第一引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

第二引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；和

5.一种非疾病诊断的肠球菌的核酸检测方法，利用权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：

1）向试样中加入核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；所述试样为非医学诊断用样本；

2）向所述分析检测样品中加入检测液a进行第一步反应，获得第一步反应液；

3）向所述第一步反应液中加入SAT 酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；

4）向所述第二步反应液中加入检测液b进行第三步反应，同时进行实时荧光检测，获得实时荧光检测的dt值；

5）建立定量标准曲线或直接利用试剂盒提供的定量标准曲线，其纵坐标为dt值，横坐标为肠球菌浓度的log值；

6）根据步骤4）获得的实时荧光检测的dt值，基于所述定量标准曲线得到检测结果。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1）中进行核酸提取步骤为：

11）向所述试样中加入核酸提取液后，在55℃-65℃静置5-15min，室温放置5-15min；磁力架上吸磁4-6min，弃上清；

12）加入洗涤液震荡洗涤20-40s，磁力架上吸磁4-6min，弃上清；所述洗涤液包括以下组分：HEPES 10mM，NaCl 50mM，1%SDS，EDTA 5mM；

13）重复步骤12），获得所述分析检测样品。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述第一步反应的条件为37℃-45℃保温4-6min；

步骤3）中使用SAT 酶液前事先预热，预热的条件为41-43℃；

步骤3）中所述第二步反应的条件为37℃-45℃恒温反应4-6min；

步骤4）中所述第三步反应的条件为37℃-45℃恒温反应40-50min。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤6）中的检测结果指标为：

71）当dt值>13.72时，肠球菌浓度<10 CFU/ml；

72）当11.71<dt值≤13.72时，10 CFU/ml≤肠球菌浓度<100 CFU/ml；

73）当dt值≤11.71时，肠球菌浓度≥100 CFU/ml，并判定为阳性；

74）当dt值≤7.7时，肠球菌浓度≥10000 CFU/ml，并判定为强阳性。