JP2022538010A - ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベース診断 - Google Patents

Abstract

本発明は、クラスター化され、規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）ベースリボ核酸検出システムに関する。本発明はさらに、かかるシステムを利用してサンプル中の標的核酸分子の存在又は不在を決定するための方法及び本発明に係るリボ核酸検出システムを含むデバイスに関する。

Description

分野
本明細書に記載の発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連核酸検出システム及び診断用途におけるその広範な使用に関する。

１．緒言
過去１０年間にわたり、分子生物学の世界では、それ自体の分野をはるかに超えるまでに達する結果となったいくつかの画期的な発見がなされてきた。疑う余地もないことだが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化され、規則的な配置の短い回文配列リピート、ＣＲＩＳＰＲ／関連遺伝子）は、これらの発見の１つとみなされうる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、原核生物適応免疫系として同定され、バクテリオファージやプラスミドのように外来の遺伝的エレメントに対して配列特異的防御を提供する。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、すべてではないにしてもほとんどの生物において遺伝的な摂動を与えることが可能となり、あらゆる技術分野に多大な影響を与えることになる。

ＣＲＩＳＰＲによる防御は、３段階：適応、発現、及び干渉からなるプロセスとして記述可能である（Rath et al.,2015.Biochimie 117:119-128、Makarova et al.,2011.Nat Rev Microbiol 9:467-477）。適応段階では、遺伝子断片は、外来侵入実体から獲得され、ＣＲＩＳＰＲメモリーに保存される（Jackson et al.,2017.Science 356:eaal5056）。このメモリーは、繰返しＤＮＡ配列（リピート）により分離されたスペーサーと呼ばれる外来ＤＮＡ配列を含む。ＣＲＩＳＰＲ座位の発現（段階ＩＩ）は、ロングＲＮＡ分子の転写をもたらし、これは続いて複数のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる（Brouns et al.,2008.Science 321:960-964）。そのほか、細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのエフェクターであるＣａｓタンパク質を発現し、これはｃｒＲＮＡを取り込むことによるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。外来遺伝的要素がｃｒＲＮＡに対する配列相補性に基づいて検出されると、関連Ｃａｓタンパク質は、そのヌクレアーゼ活性を用いて侵入実体を分解し、多くの場合、ＣＲＩＳＰＲ防御プロセスの干渉段階として記述される。

過去１０年間にわたるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに特化した膨大な量の研究により、多数のシステムが細菌界及び古細菌界の中で発見されてきた（Fenner et al.,2007.J Biomol Screen 20:1027-1039、van der Oost et al.,2009.Trends Biochem Sciences 34:401-407）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのカテゴリー化が行われてきた。クラスＩシステムは、マルチサブユニットＣａｓ複合体を利用し、一方、クラスＩＩシステムは、単一Ｃａｓタンパク質のみを使用してその活性を媒介する。異なるタイプは、一般にシグネチャー遺伝子の存在に基づいて特徴付けられる（Wright et al.,2016.Cell 164:29-44）。

多くのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの区別を可能にする差異とは対照的に、大多数は機能的類似性を共有する。ほぼすべてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタイプは、多数のＤＮＡベース侵入実体に関連する可能性の高いＤＮＡ標的化ＲＮＰとして機能する。これとは対照的に、原核生物の世界ではＲＮＡベース性の侵入エレメントにあまり遭遇しない。したがって、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＲＮＡ配列を標的とするように進化してきたことはいくらか驚くべきことである（Wright et al.,2016.Cell 164:29-44、Hale et al.,2009.Cell 139:945-956）。研究によると、この異常な活性は、侵入バクテリオファージを起源とする転写物の分解に帰属されており、細胞がライシスされるのを防ぐ（Jiang et al.,2016.Cell 164:710-721、Goldberg et al.,2014.Nature 514:633-637）。ＩＩＩ型システムはクラスＩに属する。つまり、ＲＮＰは複数のサブユニットからなる。

ヌクレアーゼ活性には３つの異なるタイプがあり、ＩＩＩ型システムは、ユニークな存在といえる。さらに、メッセンジャー分子環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）の生成は、いずれの他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにも割り当てられてこなかった。こうした特徴を活用すれば、標的認識を可視化する新しい方法がもたらされる可能性があり、ＩＩＩ型システムは、新規診断ツールに適用適している。

２．発明の簡単な説明
本発明は、ａ）ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連エフェクタータンパク質（Ｃａｓ）と、標的核酸分子に結合する少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、を含むエフェクター複合体と、ｂ）環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）のレベルを直接的又は間接的に決定するための手段と、を含むＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）ベースリボ核酸検出システムを提供する。前記検出システムは、好ましくはＩＩＩ型である。Ｃａｓは、ＩＩＩＢ型Ｃａｓ、好ましくはＩＩＩＢ型Ｃｍｒである。前記ＩＩＩ型Ｃａｓは、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）などの好温生物由来である。

ＩＩＩ型Ｃａｓは、好ましくは、たとえばＣｍｒ４サブユニットのＤ２６Ｎ突然変異又は他のサブユニットの同等の突然変異により切断活性を欠如している。さらに好ましい切断活性不活化突然変異は、Ｃｍｒ４ Ｄ２６Ａ、Ｃｍｒ４のＥ２２７Ａ及びＥ２２８の二重突然変異体、並びにＣｍｒ４ Ｄ８６Ａを含む（Ramia et al.,2014.Cell Reports 9: 1610-1617、Zhu and Ye,2015.Nucleic Acids Res 43:1257-1267）。そのほか、Ｃｓｍ３ Ｄ３２Ａは、切断活性不活化ＩＩＩＡ型Ｃｓｍ突然変異体に対する良好な候補である（Samai et al.,2015.Cell 161:1164-1174）。

本発明に係る好ましい検出システムでは、ｃＯＡのレベルを直接的又は間接的に決定するための前記手段は、ピロリン酸（ＰＰｉ）のレベルを決定するための手段を含む。本発明に係る好ましい検出システムは、無機ピロホスファターゼをさらに含みうる。前記無機ピロホスファターゼは、好ましくは、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）などの好温生物由来であり、好ましいＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに適合可能にするとともに等温検出を可能にする。

本発明に係る好ましい検出システムは、Ｃｓｘ１などのｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼをさらに含む。

本発明に係る好ましい検出システムは、Ｃｓｘ１などのｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼと、前記エンドリボヌクレアーゼに対する検出可能基質とをさらに含む。

本発明はさらに、本発明に係るリボ核酸検出システムと共にサンプルを提供することと、ｃｒＲＮＡをその標的核酸分子に結合させる条件下でサンプルをインキュベートすることと、環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）のレベルを直接的又は間接的に決定することと、を含む、サンプル中の標的核酸分子の存在又は不在を決定するための方法であって、対照と比較して、決定されたｃＯＡレベルの増加が、前記サンプル中の前記標的分子の存在の指標となる、方法を提供する。

ｃＯＡのレベルは、ピロリン酸のレベル又は無機ピロホスファターゼが検出システムに存在する場合には無機リン酸のレベルを決定することにより決定されうる。ピロリン酸又は無機リン酸のレベルは、好ましくは、比色測定、蛍光測定、蛍光、又は生物発光ベースアッセイにより決定される。

ｃＯＡのレベルは、Ｃｓｘ１などのｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼのレベルを前記エフェクターエンドリボヌクレアーゼに対する検出可能基質の検出により決定することにより、間接的に決定されうる。

本発明に係る好ましい方法は、３７℃～８５℃、好ましくは約６５℃の温度でリボ核酸検出システムによりサンプルをインキュベートすることを含む。

本発明はさらに、本発明に係るリボ核酸検出システムを含むデバイスを提供する。前記デバイスは、好ましくは、本発明に係る複数のアレイリボ核酸検出システムを含む。前記複数のアレイリボ核酸検出システムは、好ましくは、異なる標的核酸分子を有する。

本発明はさらに、ａ）ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連エフェクタータンパク質（Ｃａｓ）と、標的核酸分子に結合する少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、を含むエフェクター複合体と、ｂ）環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）のレベルを直接的又は間接的に決定するための手段と、を含む部品のキットを提供する。

３．図の説明
IDT Codon Optimization Tool（eu.idtdna.com/codonoptで入手可能）を用いたコドン最適化ＣｍｒＣａｓタンパク質。 ＣｍｒとＣｓｍとの配列アライメント。 内因性ＴｔＣｍｒ複合体によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮａｓｅ活性アッセイ。ｃｒＲＮＡに相補的な５’－リン－３２標識標的ＲＮＡを用いて内因性ＴｔＣｍｒ複合体と共にインキュベートした活性アッセイの変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析。一本鎖ＲＮＡマーカー（「Ｍ」）を左側に示されるサイズ標準として使用した。 再構成ＴｔＣｍｒ複合体によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮａｓｅ活性アッセイ。パネルＡに類似した活性アッセイであるが、再構成複合体を使用した。 ＴｔＣｍｒのＲＮＡｓｅ活性は、ｃｒＲＮＡの最初のガイドヌクレオチド中にミスマッチを有する標的による影響を受けない。 ｃＯＡ生成は、ヌクレオチド位置１、２、及び５のミスマッチによる有意な影響を受ける。 指示ヌクレオチド位置にミスマッチを有する標的ＲＮＡ（表４）と共にインキュベートされたＴｔＣｍｒ４０によるｃＯＡ生成アッセイ。 指示ヌクレオチド位置にミスマッチを有する標的ＲＮＡ（表４）と共にインキュベートされたＴｔＣｍｒ４６によるｃＯＡ生成アッセイ。 ｃｒＲＮＡの３’末端のフレキシブルシード領域。内因性ＴｔＣｍｒ（「ＴｔＣｍｒ）複合体を用いて指示セグメントにミスマッチを有する標的ＲＮＡ（表４）と共にインキュベートした標的ＲＮＡ分解及びｃＯＡ生成アッセイ。 ｃｒＲＮＡの３’末端のフレキシブルシード領域。４６ヌクレオチド（ｎｔ）ｃｒＲＮＡとの再構成ＴｔＣｍｒ複合体（「ＴｔＣｍｒ－４６」）を用いて指示セグメントにミスマッチを有する標的ＲＮＡ（表４）と共にインキュベートした標的ＲＮＡ分解及びｃＯＡ生成アッセイ。 ｃｒＲＮＡの３’末端のフレキシブルシード領域。４０ｎｔ ｃｒＲＮＡとの再構成ＴｔＣｍｒ複合体（「ＴｔＣｍｒ－４０」）を用いて指示セグメントにミスマッチを有する標的ＲＮＡ（表４）と共にインキュベートした標的ＲＮＡ分解及びｃＯＡ生成アッセイ。 標的ＲＮＡとＴｔＣｍｒ結合ｃｒＲＮＡとの塩基対合は、ｃｒＲＮＡの３’末端で開始される。ＴｔＣｍｒ結合ｃｒＲＮＡにミスマッチする５ｎｔストレッチを各々含有する異なる標的ＲＮＡ（表４）と共にインキュベートした内因性ＴｔＣｍｒ複合体の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）分析。 標的ＲＮＡとＴｔＣｍｒ結合ｃｒＲＮＡとの塩基対合は、ｃｒＲＮＡの３’末端で開始される。ＴｔＣｍｒ結合ｃｒＲＮＡの指示ヌクレオチドに相補的なショート１１ｎｔ標的ＲＮＡ（表４）と共にインキュベートした内因性ＴｔＣｍｒ複合体のＥＭＳＡ解析。 指示通りＣｍｒにより一連の添加標的ＲＮＡ濃度でＰｉ検出の比色測定出力の吸光度を決定した。反応時間を１ｈ、発色時間を３０分に設定した（マラカイトグリーンアッセイを用いた直接ｃＯＡ検出）。 増加倍率単位の経時的Ｐｉレベル決定による標的ＲＮＡ検出の比色測定出力吸光度（マラカイトグリーンアッセイを用いた直接ｃＯＡ検出）。 ｓｓＲＮＡ及びｓｓＤＮＡのクエンチャー－フルオロフォア配列を用いたＣｓｘ１のｃＯＡ媒介ＲＮＡｓｅ活性の検出。（間接ｃＯＡ検出）。 天然標的ＲＮＡ４．５に対するＴ．サーモフィルス（T.thermophilus）ＩＩＩＢ型Ｃｍｒシステムの感度範囲。間接ｃＯＡ可視化法を用いて標的認識をモニターした。陰性オフターゲット対照として類似の長さのランダムＲＮＡを使用した。 天然標的ＲＮＡ４．５に対するＣｍｒ４突然変異体Ｄ２６Ｎを含有するＴ．サーモフィルス（T.thermophilus）ＩＩＩＢ型Ｃｍｒシステムの感度範囲。間接ｃＯＡ可視化法を用いて標的認識をモニターした。陰性オフターゲット対照として類似の長さのランダムＲＮＡを使用した。 野生型Ｃｍｒ複合体及びｄＣｍｒ複合体のノロウイルス標的ＲＮＡ検出限界の比較。間接ｃＯＡ可視化法を用いて標的認識をモニターした。このアッセイの生のシグナル出力を提示する。陰性オフターゲット対照として類似の長さのランダムＲＮＡを使用した。 相補的標的ＲＮＡの添加後のＩＩＩＡ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によるｃＯＡ生成。 ワンポットＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１９ Ｎ遺伝子検出アッセイの結果。グラフは、６５℃での「シグナル生成インキュベーション」のデータを示す。 ミンクサンプルでのワンポットＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１９ Ｎ遺伝子検出アッセイの結果。グラフは、６５℃での「シグナル生成インキュベーション」のデータを示す。

４．発明の詳細な説明
４．１ 定義
本明細書で用いられる「ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）」という用語は、原核微生物のゲノム中のＤＮＡの１つ以上の特殊領域を意味する。これらの領域は、侵入エレメントとの事前遭遇に由来する類似の長さのユニークスペーサー配列により分離された、スペーサー配列が介在するヌクレオチドリピート（典型的には約２５～約３８ｂｐのダイレクトＤＮＡリピート）の存在により特徴付けられる（Grissa et al.,2007）。これは、次に感染した際に、侵入者を素早く攻撃するための記憶として機能する。ゲノミック領域は、ＣＲＩＳＰＲ座位の近くに位置する１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連エフェクタータンパク質（Ｃａｓ）コード遺伝子を含む。

本明細書で用いられる「ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡ」という用語は、スペーサー配列と５及び３リピート由来末端とを含むＣＲＩＳＰＲ由来ＲＮＡ分子を意味する。前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡは、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、より好ましい少なくとも３４ヌクレオチド、より好ましい少なくとも４０ヌクレオチド、より好ましい少なくとも４６ヌクレオチドの長さを有する。前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡは、好ましくは１０００ヌクレオチド未満、好ましくは２００ヌクレオチド未満、好ましくは１００ヌクレオチド未満である。前記ＲＮＡ分子は、リボ核酸ヌクレオチドアナログ、たとえば、イノシン、ウリジン、キサンチン、ヒポキサンチン、２，６－ジアミノプリン、及び６，８－ジアミノプリン系のリボヌクレオチド及びデスオキシリボヌクレオチドを含みうる。

本明細書で用いられる「ＣＲＩＳＰＲ関連エフェクタータンパク質」（Ｃａｓ）という用語は、ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡに関連するタンパク質を意味する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、現在、２つのクラスに分類される。クラスＩシステムは、マルチサブユニットＣａｓ複合体を利用し、一方、クラスＩＩシステムは、単一Ｃａｓタンパク質のみを使用してその活性を媒介する。クラスＩのＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、とりわけＲＮＡ配列を標的とするように進化してきた。これらのシステムのユニークタンパク質は、クラスＩシステムのＣａｓ３、クラスＩＩシステムのＣａｓ９、及びクラスＩのＩＩＩ型システムのＣａｓ１０である。

本明細書で用いられる「エフェクター複合体」という用語は、ヌクレアーゼ活性を有するとともに、ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡのスペーサー配列に対する相補配列を含む侵入核酸配列を切断して不活性化しうる、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓリボ核タンパク質複合体を意味する。

本明細書で用いられる「環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）」という用語は、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の３～６分子を含む環構造を意味する。ｃＯＡの形成は、ＩＩＩ型エフェクターシステムの一部であるＣａｓ１０のシクラーゼドメインにより触媒される。

本明細書で用いられる「ＩＩＩ型Ｃａｓ」という用語は、少なくともＣａｓ１０タンパク質を含むＲＮＡ標的化複数サブユニットＣＲＩＳＰＲ関連複合体を意味する。

本明細書で用いられる「ＩＩＩＡ型Ｃａｓ」という用語は、標的ＲＮＡ分子への結合時に非特異的ＤＮａｓｅ活性を有するＲＮＡ標的化３型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を意味する。ＩＩＩＡ型Ｃａｓとしては、たとえば、スタフィロコッカス・サーモフィルス（Staphylococcus thermophilus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、及びスタフィロコッカス・エピデルミス（Staphylococcus epidermis）由来のＩＩＩＡ型Ｃｓｍ複合体が挙げられる。

本明細書で用いられる「ＩＩＩＢ型Ｃａｓ」という用語は、非特異的ＤＮａｓｅ活性を欠如するＲＮＡ標的化３型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を意味する。前記ＩＩＩＢ型Ｃａｓ複合体は、６～７つのタンパク質で構成される。ＩＩＩＢ型Ｃａｓとしては、たとえば、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、及びスルフォロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来のＩＩＩＢ型Ｃｍｒ複合体が挙げられる。

本明細書で用いられる「ＰＰｉ」又は、ホスホナトリン酸という用語は、ピロリン酸の塩又はエステルを意味する。代替名は、ピロリン酸、二リン酸、及びジポリリン酸である。

本明細書で用いられる「無機ピロホスファターゼ」又は無機ジホスファターゼという用語は、１つのピロリン酸イオンから２つのリン酸イオンへの変換を触媒する酵素を意味する。酵素は、酵素クラスＥＣ３．６．１．１である。

本明細書で用いられる「ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼ」という用語は、ＨＥＰＮ（高等真核生物及び原核生物のヌクレオチド結合）活性部位を用いてＲＮＡを非特異的に分解するリボヌクレアーゼを意味する。このヌクレアーゼは、そのＣＲＩＳＰＲ関連ロスマンフォールド（ＣＡＲＦ）ドメインを用いてｃＯＡメッセンジャーの結合により活性化される。かかる非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの例は、Ｃａｓアクセサリータンパク質Ｃｓｘ１及びＣｓｍ６である。

本明細書で用いられる「バイオセンサー」又は「生物学的センサー」という用語は、本発明に係るＣＲＩＳＰＲベースリボ核酸システムを含むセンシングデバイスを意味する。ＣＲＩＳＰＲベースリボ核酸システムがｃｒＲＮＡに相補的なＲＮＡ分子と相互作用したときに発生するシグナル、たとえば、比色測定、蛍光測定、蛍光、又は生物発光のシグナルは、トランスデューサーに結合されてシグナルの定量を可能にする。シグナルは、好ましくは、好適なトランスデューサーを利用して電流や電圧などの測定可能な電気的パラメーターに変換される。

４．２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システム
ある一態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）ベースリボ核酸（ＲＮＡ）検出システムを提供する。前記システムは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連エフェクタータンパク質（Ｃａｓ）と、標的核酸分子に結合する少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、を含むエフェクター複合体と、環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）のレベルを直接的又は間接的に決定するための方法及び手段と、を含む。

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システムは、好ましくは、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、スルフォロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）などの好熱生物に由来する。好熱生物由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システムの利点は、昇温で、たとえば、４０℃～８０℃、好ましくは５０℃～７０℃、たとえば、５５℃～６５℃、好ましくは約６５℃で検出を実施可能なことである。この温度でのインキュベーションは、より低温のインキュベーションと比較したとき、ｃＯＡ合成反応を加速しうる。そのほか、前記昇温は、サンプル中に存在するＤＮａｓｅやＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼ又はプロテアーゼを不活性化しうる。

そのほか、好熱生物由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システムの利点は、システムに安定性の増加を提供しうるとともに、その結果、中温生物由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システムと比較したとき、それをより長期間にわたり保存しうる。

前記リボ核酸検出システムは、真核生物ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）システムに類似して、侵入ウイルス及びプラスミドから原核細胞を保護するように後天性免疫システムを構成する原核生物ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに基づく（Makarova et al.,2006.Biol Direct 1:1-7）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ免疫反応は、３つの識別可能な段階：１）侵入者の標的ＤＮＡの一部を切除してＣＲＩＳＰＲアレイに挿入する適応と、２）ＣＲＩＳＰＲ（ｃｒ）ＲＮＡの発現及び成熟並びにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の会合と、３）ｃｒＲＮＡをガイドとして用いてウイルス又はプラスミドの侵入ゲノム中の成熟ＣＲＩＳＰＲ配列に相補的な配列を認識するときの干渉、それに続くＣａｓヌクレアーゼによる外来核酸の切断及び不活性化と、からなる

ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の一般構造は、Ｃａｓ７及びＣａｓ１１の複数のサブユニットを含むものであり（Staals et al.,2013.Mol.Cell 52:135-145、Staals et al.,2014.Mol.Cell 56:518-530）、片側がＣａｓ５及びＣａｓ１０によりキャップして仕上げられている。これらのうち、Ｃａｓ７は、プレロードＲＮＡガイドによる標的ＲＮＡの認識時にＲＮａｓｅ活性を提供する。

標的認識は、Ｃａｓ１０パームドメインによる環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）の生成を促進することが示されてきた（Kazlauskiene et al.,2017.Science 357:605-609、Niewoehner et al.,2017.Nature 548:543-548）。ｃＯＡ種は、真核生物では既知のシグナリング分子であるが、かかる活性は原核宿主では報告されなかった。しかしながら、ｃＯＡの存在は、Ｃｓｍ６又はＣｓｘ１ファミリーメンバーによるＲＮａｓｅ活性の大きな増加をもたらすことが、研究により示唆される。これらのタンパク質は、多くの場合、ＩＩＩ型座位にコードされるが、リボ核タンパク質複合体に直接関連しない。その代わりに、侵入者のＲＮＡ転写物の認識は、Ｃａｓ７による標的ＲＮＡ分解、クラスＩのＩＩＩＡ型Ｃａｓ１０による非特異的ＤＮＡ分解、さらにはＣｓｍ６又はＣｓｘ１の活性化をもたらして他の近くの一本鎖ＲＮＡ分子の付随的切断を引き起こすｃＯＡ生成を生じうる。

ｃＯＡのレベルを直接決定する方法は、好ましくはピロリン酸又はＰＰｉのレベルを決定する方法を含む。ピロリン酸の形成は、Ｃａｓ１０などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質によるＡＴＰからのｃＯＡの形成に結び付けられる。３～６ＡＭＰ単位からなるｃＯＡの形成は、３～６分子のＰＰｉの同時形成をもたらす。

代替案として、本発明に係る検出システムは、各ＰＰｉ分子に対してＰＰｉの分解及び２つの無機リン酸分子の形成をもたらす無機ピロホスファターゼを含みうる。そのため、無機リン酸のレベルを決定することにより、検出可能分子の数は、１分子のｃＯＡのから６～１２分子のＰｉまで増幅される。

好ましい無機ピロホスファターゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓベースＲＮＡ検出システムと同一又は類似の温度で活性な酵素である。そのほか、無機ピロホスファターゼは、同一又は類似のｐＨ及び同一又は類似の塩濃度を含めて、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓベースＲＮＡ検出システムと同一又は類似の条件下で活性であることが好ましい。たとえば、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓベースＲＮＡ検出システムが５０℃で最適活性を有する場合、無機ピロホスファターゼは、この温度で活性であることが好ましい。好ましくは、５０℃での無機ピロホスファターゼの活性は本質的にすべてのＰＰｉ分子を無機リン酸分子に分解する活性であるものとする。前記分解は、好ましくは瞬間的である。同様に、選ばれたｐＨ及び塩濃度での無機ピロホスファターゼの活性は、本質的にすべてのＰＰｉ分子を無機リン酸分子に分解する活性であるものとする。前記分解は、好ましくは瞬間的である。

好ましい無機ピロホスファターゼは、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、スルフォロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）などの好温生物由来であり、同時等温検出を可能にする。こうして、ｃＯＡのレベルは、Ｐｉのレベルを決定することにより直接決定可能である。

ＰＰｉ及びＰｉは、比色測定、蛍光測定、蛍光、又は生物発光ベースアッセイをはじめとする当技術分野で公知の方法を用いて検出可能である。

ＰＰｉのレベルを決定するのに好適な方法としては、蛍光測定及び／又は比色測定ピロリン酸（ＰＰｉ）アッセイキット（Biovision Inc.,Milpitas,CA）、蛍光EnzChek（登録商標）ピロリン酸検出キット（ThermoFisher Scientific; Waltham,MA）、蛍光測定ピロリン酸アッセイキット（SigmaAldrich,Saint Louis,MO）、及び発光PPiLight（商標）アッセイ（Lonza Group A.G.,Bazel,Switzerland）が挙げられる。

無機リン酸又はＰｉのレベルを決定するのに好適な方法としては、比色測定PiColorLock（商標）アッセイ（Expedeon,Cambridge,UK）、比色測定マラカイトグリーンリン酸アッセイキット（SigmaAldrich,Saint Louis,MO）、蛍光リン酸センサー（ThermoFisher Scientific;Waltham,MA）、ＡＴＰからＡＤＰへの変換に従うルミネッセントリードアウト（米国特許出願公開第２０１４０２７３０３６Ａ号）、蛍光ケモセンサー（Meng et al.,2015.RSC Advances 5:53189-53197）、及びユウロピウムイオンと組み合わされたフォトルミネセントグラフェン量子ドット（Bai et al.,2013.Chemistry 19:3822-3826）が挙げられる。

環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）のレベルを直接決定するための方法及び手段は、好ましくは、少なくとも１種の基質と、所要によりＰＰｉ又はＰｉに対する指示検出方法の少なくとも１つを可能にする酵素と、を含む。

好ましい方法は、ｃＯＡのレベルの直接決定としてＰＰｉ又はＰｉのレベルの高速決定を可能にするマラカイトグリーンリン酸アッセイキットなどの比色測定法である。

ｃＯＡのレベルを間接的に決定する方法としては、好ましくはＣＲＩＳＰＲ補助ヌクレアーゼ１（Ｃａｎ１）やＣａｎ２などのｃＯＡ依存非特異的エフェクターヌクレアーゼの活性を決定する方法及び好ましくはＣｓｘ１などのｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの活性を決定する方法が挙げられる。このため、いずれの本発明に係る検出システムも、好ましくはＣｓｘ１などのｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼを含む。

前記ｃＯＡ依存非特異的エフェクターヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼは、好ましくは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓベースＲＮＡ検出システムと同一又は類似の温度で活性な酵素である。そのほか、ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼは、同一又は類似のｐＨ及び同一又は類似の塩濃度を含めて、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓベースＲＮＡ検出システムと同一又は類似の条件下で活性であることが好ましい。たとえば、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓベースＲＮＡ検出システムが６５℃で最適活性を有する場合、ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼは、この温度で活性であることが好ましい。好ましくは、６５℃でのｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの活性は、ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼのｃＯＡ誘導活性が前記ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの基質の検出可能量の反応生成物の生成をもたらす活性であるものとする。同様に、選ばれたｐＨ及び塩濃度でのｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの活性は、ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼのｃＯＡ誘導活性が前記ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの基質の検出可能量の反応生成物の生成をもたらす活性であるものとする。

ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの基質は、好ましくは、切断の検出が可能なＲＮＡ分子である。検出は、当技術分野で公知のいずれかの方法により実施されうる。たとえば、検出は、質量分析、たとえば、超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）が正のエレクトロスプレーイオン化モードのタンデム質量分析と組み合わされた（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により直接実施されうる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、たとえば、三連四重極質量分析計と組み合わされたハイエンドＵＨＰＬＣクロマトグラフィーシステムを用いることにより実施されうる。

検出はさらに、液液相分離により実施されうる（ＬＬＰＳ、Spoelstra et al.,2018.BioRXiv,CSHL （doi.org/10.1101/471482）。

ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの好ましい基質は、一方の末端が蛍光レポーター分子及び他方の末端がクエンチャーでタグ付けされたＲＮＡ分子である。クエンチャーへのレポーターの密な近接は、その蛍光の検出を防止する。ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの活性化による基質の切断は、レポーター－クエンチャー近接を破壊し、ひいては蛍光の放出をクエンチできなくするので、レーザーによる励起後にその検出が可能となる。したがって、ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの活性の増加は、基質の切断及び蛍光レポーターをクエンチするクエンチャーの除去に基づいて比例的に蛍光の増加を引き起こす。

非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの活性化から切り離して又はそれに加えて、標的認識のレベルの決定はまた、前記ヌクレアーゼの適切な基質を用いてＩＩＩＡ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター複合体に存在する非特異的エフェクターＤＮａｓｅ活性の活性化を決定することにより実施されうる。前記適切な基質は、好ましくは、一方の末端が蛍光レポーター分子及び他方の末端がクエンチャーでタグ付けされたＤＮＡ分子である。クエンチャーへのレポーターの密な近接は、その蛍光の検出を防止する。ｃＯＡ依存非特異的エフェクターＤＮａｓｅの活性化による基質の切断は、レポーター－クエンチャー近接を破壊し、ひいては蛍光の放出をクエンチできなくするので、レーザーによる励起後にその検出が可能となる。したがって、ｃＯＡ依存非特異的エフェクターＤＮａｓｅの活性の増加は、基質の切断及び蛍光レポーターをクエンチするクエンチャーの除去に基づいて比例的に蛍光の増加を引き起こす。非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの活性化及び非特異的エフェクターＤＮａｓｅの活性化の両方を用いることにより、一方が非特異的エフェクターＤＮａｓｅを特異的に活性化し、他方がｃＯＡレベルの間接又は直接決定を特異的に可能にする２種の独立したリボ核タンパク質複合体を使用すれば、１回の単一アッセイで２種の独立した標的ＲＮＡ分子の存在又は不在の決定が可能になる。ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼ及び非特異的エフェクターＤＮａｓｅの活性化による基質上に存在する蛍光標識は、ｃＯＡのレベルを決定するための尺度として各活性のレベルを決定できるように十分に異なるものでなければならないことが、当業者であれば理解されよう。

好ましい蛍光標識は、Atto425（ATTO-TEC GmbH,Siegen,Germany）、Atto 647N（ATTO-TEC GmbH,Siegen,Germany）、YakimaYellow（Epoch Biosciences Inc,Bothell,WA,USA）、Cal610（BioSearch Technologies,Petaluma,CA,USA）、Cal635（BioSearch Technologies,Petaluma,CA,USA）、FAM（Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA）、TET（Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA）、HEX（Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA）、Cy5、Cy5.5、Cy3、Cy3.5、Cy7などのシアニン色素（Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA）、Alexa dyes（Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA）、Tamra（Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA)、ROX（Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA）、JOE（Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC,Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA）、Yakima Yellow（登録商標）（YY;Epoch Biosciences,Bothell,Washington）、及びテトラメチルローダミン（TRITC,Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA）から選択されうる。前記基質は、検出可能な標識、好ましくは蛍光標識で好ましくは５’末端が標識される。

クエンチャー、たとえば、テトラメチルローダミンＴＡＭＲＡ、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチドマイナーグルーブバインダーは、当技術分野で公知である。好ましいクエンチャーとしては、Black Hole Quencher（登録商標）-1（BHQ1）及びBHQ2（Biosearch Technologies,Petaluma,CA,USA）が挙げられる。BHQ1ダーククエンチャーは、４８０ｎｍ～５８０ｎｍに強い吸収を有し、FAM、TET、CAL Fluor（登録商標）Gold 540、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、Quasar（登録商標）５７０色素などのこの範囲内に蛍光を発するフルオロフォアのクエンチングを提供する。BHQ2ダーククエンチャーは、599nm～670nmに強い吸収を有し、Quasar（登録商標）570、TAMRA、CAL Fluoｒ（登録商標）Red 590、CAL Fluor Red 610、ROX、CAL Fluor Red 635、Pulsar（登録商標）650、Quasar 670、Quasar 705色素などのこの範囲内に蛍光を発するフルオロフォアのクエンチングを提供する。BHQ1及びBHQ2は、ＦＲＥＴ及び静的クエンチング機序の両方により蛍光をクエンチしうる。

好適な市販の基質は、RNaseAlert（登録商標）Lab Test Kit v2（ThermoFisher Scientific;Waltham,MA）により提供される。

好ましいｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼは、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、スルフォロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）などの好温生物由来であり、ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの活性の同時等温検出を可能にする。

環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）のレベルを間接的に決定するための方法及び手段は、好ましくはｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼと前記ｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼの基質とを含む。

４．３ タンパク質の生成
本発明に係るリボ核酸検出システムは、リボ核タンパク質複合体、好ましくはＩＩＩＢ型複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリーに基づく。所要のＣａｓタンパク質は、好ましくは、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）などの好熱生物由来である。前記タンパク質は、好ましくは、好適な発現システムから発現されて精製される。

異種タンパク質生成のために通常使用される発現システムは、大腸菌（E.coli）、バチルス属（Bacillus）の種、バキュロウイルス、酵母、真菌、最も好ましくは糸状真菌又は酵母、たとえば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）、真核細胞、たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、及びPER.C6（登録商標）細胞（Thermo Fisher Scientific,MA,USA）、並びに植物を含む。異種システムでの組換えタンパク質の発現の効率は、転写レベル及び翻訳レベルの両方に関して、多くの因子に依存する。

好ましくは、Ｃａｓタンパク質は、原核細胞、好ましくは大腸菌（E.coli）を用いて生成される。好ましくは、前記Ｃａｓタンパク質は、対象の原核細胞、好ましくは大腸菌（E.coli）へのタンパク質の発現クローニングにより生成される。好ましくは、前記発現構築物、好ましくは、ＤＮＡは、ポリメラーゼ、制限酵素、及びリガーゼの使用を含めて、当業者に公知のように、組換え技術により生成される。代替的に、前記発現構築物は、当業者に公知のように、人工遺伝子合成により、たとえば、部分的若しくは完全にオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成により、又は有機化学と組換え技術との組合せにより提供される。

代替案として又は追加として、Ｃａｓタンパク質は、好熱生物でのタグ付きＣａｓタンパク質の発現及びタグに基づく前記Ｃａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体の単離により、好熱生物から単離されうる。前記単離されるリボ核タンパク質複合体は、タグ付きＣａｓタンパク質を用いて単離可能である。

好ましくは、前記発現構築物は、対象の原核細胞、好ましくは大腸菌（E.coli）でのＣａｓタンパク質の発現を増強するためにコドン最適化される。さらなる最適化は、好ましくは、潜在スプライス部位の除去、潜在ポリＡテールの除去、及び／又はｍＲＮＡの不利なフォールディングをもたらす配列の除去を含む。そのほか、発現構築物は、好ましくは、原核生物の細胞からペリプラズム中へのＣａｓタンパク質の分泌のためのタンパク質エクスポートシグナルをコードし、Ｃａｓタンパク質の効率的精製を可能にする。

Ｃａｓタンパク質の精製方法は、当技術分野で公知であり、一般的には、汚染物を除去するためにアフィニティークロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーに基づく。汚染物のほか、分解物や凝集物などの生成物自体の望ましくない誘導体を除去することが必要になることもありうる。好適な精製プロセス工程は、Berthold and Walter,1994（Berthold and Walter,1994.Biologicals 22:135-150）に提供される。

代替案として又は追加として、組換えＣａｓタンパク質は、タグに特異的なカラムにタンパク質が装着されるように、したがって不純物から単離されるように、遺伝子工学操作により１種以上の特異的タグでタグ付けされうる。次いで、精製タンパク質は、アフィニティーカラムからデカップリング試薬で置き換えられる。この方法は、組換えタンパク質を精製するためにますます適用されるようになってきた。タンパク質に対する従来タグたとえばヒスチジンタグは、タンパク質を他の不純物から単離するためにタグを特異的にキャプチャーするアフィニティーカラム（たとえば、ヒスチジンタグに対してＮｉ－ＩＤＡカラム）と共に使用される。次いで、タンパク質は、特異的タグに対応するデカップリング試薬（たとえば、ヒスチジンタグに対してイミダゾール）を用いてカラムから置き換えられる。この方法は、伝統的精製方法と比較したとき、より特異的である。

好適なさらなるタグとしては、Chatterjee,2006（Chatterjee,2006.Cur Opin Biotech 17,353-358）に提示されるように、ｃ－ｍｙｃドメイン（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ヘマグルチニンタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧタグペプチド、ビオチンアクセプターペプチド、ストレプトアビジン結合ペプチド、及びカルモジュリン結合ペプチドが挙げられる。これらのタグの採用方法は、当技術分野で公知であり、Ｃａｓタンパク質の精製に使用されうる。

大腸菌（E.coli）での発現タンパク質法は、当技術分野で公知であり、Ｃａｓタンパク質の発現及び精製に使用可能である。

好ましい方法では、Ｃａｓタンパク質は、コドン最適化発現構築物から大腸菌（E.coli）で発現される。前記構築物は、Ｎ末端にＳｔｒｅｐタグとアミノ酸配列Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）（そのアミノ酸配列はタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼにより認識される）とを含有するバイシストロニック発現プラスミドに配置される。発現プラスミドは、大腸菌（E.coli）たとえばＢｌ２１（ＤＥ３）株にトランスフォームされる。約０．６のＯＤ６００まで所望の培養体積で３７℃で成長させた後、培養物を氷上に１時間配置し、その後、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドを０．１ｍＭの最終濃度になるように添加する。次いで、培養物を１８℃で約１６時間（一晩）インキュベートする。細胞を採取して超音波処理により緩衝液Ａ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中でライシスし、続いて、４５分にわたり３０．０００ｇで遠心沈降させる。清澄化ライセートを濾過し、あらかじめ平衡化されたStrepTrap FPLCカラム（GE Healthcare,Chicago, IL）上に流す。フロースルー中にもはやタンパク質が存在しなくなるまで緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、緩衝液Ｂ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び２．５ｍＭ Ｄ－デスチオビオチン）を用いて対象タンパク質を溶出する。ＴＥＶプロテアーゼの添加によりタンパク質をアフィニティータグから切断し、４℃で一晩放置してインキュベートする。HisTrap及びStrepTrapアフィニティークロマトグラフィー工程により混合物から対象タンパク質を分離し、それをフロースルーから捕集する。所要により、より高純度を達成するために、追加のサイズ排除クロマトグラフィーを加える。

好ましいＣａｓタンパク質は、Ｃｓｍ又はＣｍｒタンパク質、少なくともＣｍｒ１及びＣｍｒ４、好ましくはＣｍｒ１～６、又は少なくともＣｓｍ２及びＣａｓ１０（Ｃｓｍ１）、好ましくはＣｓｍ２～５及びＣａｓ１０、より好ましくはＣｓｍ１～６を含む。

好ましいタンパク質は、表２で参照されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質、好ましくは表２で参照されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。しかしながら、挿入突然変異体、欠失突然変異体、キメラタンパク質、及びアミノ酸置換タンパク質を含めて、前記タンパク質の突然変異体もまた、本発明に係るＣＲＩＳＰＲベースリボ核酸システムに使用されうる。

ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ検出法の感度を増加させるために、好ましくは触媒機能を喪失した（catalytically dead）突然変異体Ｃｍｒ及び／又はＣｓｍ複合体を作製し、本発明の検出システムに使用する。「触媒機能を喪失した」という用語は、本発明に係るＣＲＩＳＰＲベースリボ核酸システムの標的ＲＮＡ消化活性を意味する。これらの突然変異体は、ｄＣｍｒ及びｄＣｓｍといわれる。突然変異は、標的結合及び切断に関与するＣｍｒ４及びＣｓｍ３サブユニットに導入され、標的結合を維持しつつ標的切断を消失させるように選択される。Ｃｍｒ４タンパク質中のいくつかの突然変異（Ｈ１５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｅ２７７Ａ）が記載されており、最も強い触媒障害は、Ｃｍｒ４ Ｄ２６Ａ及びＤ２６Ｎ突然変異で観測されている（Benda et al.,2014.Molecular Cell 56:43-54、Ramia et al.,2014.Cell Reports 9:1610-1617)。この不活性化突然変異は、パイロコッカス・フリオシス（Pyrococcus furiosis）で機能することが実験的に証明されており、Ｃｍｒ４オルソログの配列アライメントは、このアミノ酸が高度に保存されていることを示す（データは示されていない）。そのほか、この特定アミノ酸は、標的ＲＮＡが結合すると予想される複合体のグループに位置することが、結晶解析データから示される（データは示されていない）。まとめると、Ｄ２６アミノ酸残基はＣｍｒ４の触媒活性に重要であることが、これらの結果から示唆される。この残基の改変は、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）ｄＣｍｒ４突然変異体をもたらすであろう。この次に、Ｐｆ＿Ｃｍｒ４アミノ酸配列とＣｓｍ３のオルソログとのアライメントはまた、Ｄ２６が２つのＩＩＩ型システム間で保存されているわずかなアミノ酸の１つであり、したがって、ｄＣｓｍ３突然変異体の作製にも使用可能であることを示す。さらなる切断活性不活化突然変異は、Ｃｍｒ４のＥ２２７Ａ及びＥ２２８の二重突然変異体、並びにＣｍｒ４ Ｄ８６Ａを含む（Ramia et al.,2014.Cell Reports 9:1610-1617、Zhu and Ye,2015.Nucleic Acids Res 43:1257-1267）。そのほか、Ｃｓｍ３ Ｄ３２Ａは、切断活性不活化ＩＩＩＡ型Ｃｓｍ突然変異体に対する良好な候補である（Samai et al.,2015.Cell 161:1164-1174）。

そのほか、Jiaら及びParkらは、Ｄ３６Ａ置換により作製されたｄＣｓｍ３突然変異体を記載している（Jia et al.,2019.Mol Cell 73:264-277、Park et al.,2017.EMBO reports 18:826-840）。二重突然変異体Ｋ５６Ａ及びＲ６０Ａも述べられているが、Ｃｓｍ３での標的切断を十分に消失しなかった。

追加のタイプの突然変異は、天然ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベース防御システムによる損傷抑制に基づく。Ｃｓｘ１／Ｃｓｍ６中のＣＲＩＳＰＲ関連ロスマンフォールド（ＣＡＲＦ）ドメインへのｃＯＡの結合後、その高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合（ＨＥＰＮ）ドメインが活性化され、タンパク質は区別なくＲＮＡを切断し始めるであろう（Kazlauskiene et al.,2017.Science 357:605-609）。通常の生物学的状況では、ｃＯＡは、持続活性化ひいては持続ＲＮａｓｅ活性を回避するためにＣｓｘ１／Ｃｍｓ６自体により分解される（Athukoralage et al.,2019.J Mol Biol 431:2894-2899、Garcia-Doval et al.,2020.Nature Communications 11:1-9）最近、このｃＯＡ分解の機序は、Ｃｓｘ１／Ｃｓｍ６タンパク質の突然変異体形を利用することにより明らかにされた。Ｔ１０Ａ、Ｔ１０Ａ／Ｔ１１Ａ、又はＴ１１Ａ Ｃｓｘ１／Ｃｓｍ６突然変異体は、ｃＯＡを分解できず、長期ＲＮａｓｅ活性をもたらすことが示された（Athukoralage et al.,2019.J Mol Biol 431:2894-2899、Garcia-Doval et al.,2020.Nature Communications 11:1-9）。Ｃｓｘ１／Ｃｓｍ６によるこの長期ＲＮａｓｅ活性、たとえば、Ｔ１０Ａ、Ｔ１０Ａ／Ｔ１１Ａ、又はＴ１１Ａ Ｃｓｘ１／Ｃｓｍ６突然変異体又はそれらの等価体の利用によるものは、診断目的でより敏感且つ迅速なリードアウトを得るために活用可能である。

４．４ リボ核タンパク質複合体のアセンブリー
異なるＩＩＩ型サブタイプ（Ｃｍｒ、Ｃｓｍ）間に差異が存在するが、一般構造は、Ｃａｓ７及びＣａｓ１１の複数のサブユニットからなり（Staals et al.,2013.Mol.Cell 52:135-145、Staals et al.,2014.Mol.Cell 56:518-530）、片側がＣａｓ５及びＣａｓ１０によりキャップして仕上げられている。これらのうち、Ｃａｓ７は、プレロードＲＮＡガイドによる標的ＲＮＡの認識時にＲＮａｓｅ活性を提供する。さらに、この認識はまた、Ｃａｓ１０ ＨＤドメインによるＤＮａｓｅ活性をもたらす（Kazlauskiene et al.,2016.Mol Cell 62:295-306）。

ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩＩＡ型Ｃｓｍ及びＩＩＩＢ型Ｃｍｒを含めて各種サブタイプにさらに区分されうる（Staals et al.,2013,2014. Ibid）。サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）Ｃｍｒのエフェクター複合体（ｔｔＣｍｒ４６）は、Ｃｍｒ１１２１３１４４５３６１（Staals et al.,2014.Ibid、Taylor et al.,2015.Science 348:581-586）と４６ｎｔ ｃｒＲＮＡとの化学量論比の１２のサブユニットからなる。Staalsらによる新規研究により、４０ｎｔ ｃｒＲＮＡとの類似複合体が明らかにされた（表１）。

ＩＩＩＡ型Ｃｓｍ複合体は、Ｃｍｒ（Ｃｓｍ１１２３３５４１５１）と同様に構成される（Tamulaitis et al.,2017.Trends Microbiol 25:49-61）。この複合体は、すべてのサブユニットを適正モル比で添加し、３０分などの時間にわたり６０℃や６５℃などのインキュベーション温度で反応混合物を放置してインキュベートすることによりアセンブル可能である。

精製されたＣａｓタンパク質、たとえばＣｓｍ又はＣｍｒタンパク質は、好適なｃｒＲＮＡ上にアセンブルされる。一実施形態では、前記ｃｒＲＮＡ及びアセンブルされたリボ核タンパク質複合体は、水性溶液中に存在する。ｃＯＡレベルの後続決定のために、必要であれば、Ｃａｓタンパク質の１つ、たとえばＣＡＰ Ｃａｓ、たとえばＣｍｒ６に、たとえばヒスチジンタグ及び／又はｓｔｒｅｐタグでタグ付けし、表面に、好ましくは表面の規定位置に装着しうる。前記表面は、ガラス、プラスチック、シリコンなどの固形表面でありうる。前記表面は、カップなどのレセプタクル中、たとえばエッペンドルフチューブ中、又はマイクロプレートのウェル中、又はデバイス中に存在しうる。

Mogilaらによる最近の研究により、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓtreptococcus thermophilus）Ｃｓｍ（ＳｔＣｓｍ）の個別サブユニットの役割が明らかにされた（Mogila et al.,2019.Cell Reports 26:2753-2765）。そのほか、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、及びＣａｓ１０（Ｃｍｒ１）サブユニット（及びｃｒＲＮＡ）のみを含有する最小Ｃｓｍ複合体が設計され、それは依然として３つすべての触媒活性（ＲＮａｓｅ、ｓｓＤＮａｓｅ、ｃＯＡシンターゼ）を保持した。

すべての触媒活性を依然として保持しつついくつかのサブユニットを消失させることにより、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの実用時のインテグレーションが期待できる。最も注目すべきこととして、ｃＯＡ生成が影響を受けるとの報告はなかった（Mogila et al.,2019.Ibid）。

これらの最小複合体は、Mogilaらにより記載されるように、ＩＩＩＡ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓではＣｍｒ１、３、及び４、並びにＩＩＩＢ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓではＣｍｒ２、３、及び４を含み、これらのサブユニットのコピー数の変動は可能であろう。ｃＯＡ生成並びに標的検出の特異性及び感度を増加させるために、Ｃｓｍ３／Ｃｍｒ４サブユニットの数を増加させうる。

そのほか、それらの活性を最適化するために、これらのサブユニットを突然変異させることも可能である。

前記Ｃｍｒタンパク質は、好ましくは、１：１：４：１のＣｍｒ１：Ｃｍｒ３：Ｃｍｒ４：ｃｒＲＮＡ及び１：１：１：４：３：１：１のＣｍｒ１：２：３：４：５：６：ｃｒＲＮＡの化学量論比で好適なｃｒＲＮＡと共に提供される。

核タンパク質複合体は、以下のようにＴｔＣｍｒ４６ ｃｒＲＮＡにアセンブル可能である。

最初に、３．５μＬ ｃｒＲＮＡ（７００ｎｇ）を３．５μＬ １×Ｃｍｒ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に添加した。続いて、サブユニットを特定の順序（Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｍｒ１）で、それぞれ、．５μＭ、２．５μＭ、１０μＭ、７．５μＭ、２．５μＭ、及び２．５μＭの最終濃度になるように反応混合物に添加して、２０μＬの合計反応体積を構成した。反応混合物を６５℃で３０分間インキュベートしうる。

クラスＩの３Ａ型複合体を再構成する好ましい方法は、３．５μＬ ｃｒＲＮＡ（７００ｎｇ）を３．５μＬ １×Ｃｍｒ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に添加し、続いてＣｓｍ４、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ５の順序で、それぞれ、２．５μＭ、２．５μＭ、１２．５μＭ、７．５μＭ、及び２．５μＭの最終濃度になるようにサブユニットを添加して、２０μＬの合計反応体積を構成することを含む。反応混合物を６０℃又は６５℃で３０分間インキュベートしうる。

４．５ ＲＮＡの検出方法
診断目的で使用されている従来ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、たとえば、Ｃａｓ１２／Ｃａｓ１４ベースシステム（UC Berkeley,CA,USA）及びＣａｓ１３ベースシステム（Broad Institute,MA,USA）は、標的部位に近接する特異的モチーフの存在に依存する。この機序は、生物学的状況では、自己と非自己とを識別するために使用される。このモチーフなしでは、これらのＣａｓタンパク質は、それらの標的を切断できないので、診断システムにそれらを使用できない。Ｃａｓ１２及びＣａｓ１３では、これらのモチーフは、それぞれ、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）及びプロトスペーサーフランキング部位と呼ばれる（ＰＦＳ）［Westra et al.,2013.PLoS Genet 9:e1003742、Abudayyeh et al.,2016.Science 353:aaf5573］。いくつかのＣａｓ１２／Ｃａｓ１４タンパク質の場合には、この所要のＰＡＭは、ＴＴＴＮ／ＴＴＴＡであり、標的配列の選択を大きく制限する。Ｃａｓ１３では、所要のモチーフは、それほど制限がなく、標的配列に近接するＨヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｕ）が有利である。

ＩＩＩ型（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃｒＲＮＡの５’リピートタグと、対応する３’プロトスペーサーフランキング配列と、の相補性をチェックすることにより自己免疫を防止する異なる自己対非自己機序を採用する［Guo et al.,2019.RNA Biol 16:1513-1520］。これらの２つの領域間の相補性は、ある特定の範囲内で相対ｃＯＡ生成に影響を及ぼすが、ある特定のＰＡＭ／ＰＦＳ様配列にはＩＩＩ型が所望の機能を発揮するための要件が存在しないので、現在使用されているシステムよりも優れた大きな利点を与える［Guo et al.,2019.RNA Biol 16:1513-1520］。

そのうえ、Ｃａｓ１３標的選択の使用はまた、標的ＲＮＡ中に形成される潜在的２次構造により制限される［Smargon et al.,2017.Mol Cell 65:618-630］。現在使用されている診断用途では、６５℃で機能するサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）のＩＩＩＢ型システムとは対照的に、３７℃で機能する［Staals et al.,2013.Mol Cell,52:135-145］。この昇温は、標的ＲＮＡ配列中に潜在的に形成される２次ＲＮＡ構造の量を低減する［Wan et al.,2012.Mol Cell 48:169-181］。

特異的ＲＮＡ配列を検出する本発明の方法は、ヒトヘルスケア、獣医学的診断、植物病原体検出、水汚染物検出、並びに食品及び飼料の汚染物検出で使用されうる。そのほか、特異的ＲＮＡ配列を検出する本発明の方法は、有益生物の検出に使用されうる。一般的には、本発明の方法は、細菌、真菌、古細菌、原生生物、原生動物、真核生物、ウイルス、及びウイロイド病原体の検出に使用可能である。そのほか、本発明の方法はまた、ヒト、動物、及び植物において、ＲＮＡ分子として発現される遺伝的改変又は形質の検出及び診断に使用されうる。

ヒトヘルスケア及び獣医学的診断では、好ましくは、ＲＮＡをはじめとする核酸物質は、生物学的流体から、好ましくは脳脊髄液、唾液、鼻咽頭分泌物、口腔咽頭分泌物、汗、尿糞便、又は血液から単離される。「血液」という用語は、遠心分離などにより赤血球及び白血球を除去することにより調製される血漿並びに血餅の形成及び遠心分離機などによる血餅の除去により調製される血清を含む。好ましい生物学的流体は血液である。生物学的流体とくに血液からの核酸物質の単離のための方法及び組成物は、好ましくは、有機溶媒及びカオトロピック塩を使用することなく水性溶媒を採用する。

必要であれば、ＲＮＡをはじめとする核酸物質は、たとえば、物理的方法と化学的方法との組合せを用いて、サンプルから精製されうる。好ましくは、核酸単離のための市販のシステム、たとえば、NucliSENS（登録商標）easyMAG（登録商標）若しくはNucliSENS（登録商標）minMAG（登録商標）核酸抽出システム（bioMerieux,Marcy l’Etoile,France）又はMagNA Pure 96 System（Roche Diagnostics,Almere,The Netherlands）を使用する。

このために、ＲＮＡは、当技術分野で公知のいずれかの技術によりサンプルから単離されうるとともに、好適な市販のＲＮＡ単離キットとしては、限定されるものではないが、Trizol（Invitrogen;Carlsbad,California）、RNAqueous（登録商標）（Applied Biosystems/Ambion,Austin,Tx）、Qiazol（登録商標）（Qiagen,Hilden,Germany）、Agilent Total RNA Isolation Lits（Agilent;Santa Clara,California）、RNA-Bee（登録商標）（Tel-Test.Friendswood,Texas）、RNeasy mini kit（Qiagen,Venlo,The Netherlands）、及びMaxwell（商標）16 Total RNA Purification Kit（Promega; Madison, Wisconsin）が挙げられる。単離されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、好ましくは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用して一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡに逆転写される。

診断目的での本発明に係るＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの使用としては、限定されるものではないが、医療診断、たとえば、尿路感染症、気道感染症、とりわけＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）によるも、血液感染症（敗血症）、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）マーカーや広域スペクトルベータラクタマーゼマーカーなどの抗生物質耐性マーカーの発現、胃腸感染症、皮膚感染症、歯性感染症、膣感染症、たとえば、カンジダ症、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）感染症、及びガードネレラ属（Gardnerella）感染症、男性生殖系感染症、熱帯性感染疾患、たとえば、マラリア、トリパノソーマ、デング熱、ジカ熱、チクングニア熱の検出、クラミジア（Chlamydia）属の種に起因する性感染疾患、淋病、ヒト免疫不全ウイルスに起因するもの、ヘルペス属（Herpes）の種に起因するもの、梅毒、並びに癌及び自己免疫性疾患をはじめとする遺伝的欠損の検出が挙げられる。

本発明に係るＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓはさらに、ウシ感染疾患、たとえば、乳腺炎、ブルータング病、口蹄疫、サルモネラ属（Salmonella）の種、クレブシエラ属（Klebsiella）の種、カンピロバクター属（Campylobacter）の種に起因するもの、ブタ感染疾患、たとえば、呼吸器疾患、皮膚炎、下痢、及びブタパルボウイルス感染症、ヒツジ及びヤギの感染疾患、たとえば、クロストリジウム疾患、伝染性膿瘡、肺炎、及びリフトバレー疾患ウイルス感染症、家禽感染疾患、たとえば、伝染性気管支炎、サルモネラ属（Salmonella）の種に起因するもの、ネコ感染疾患、たとえば、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）及びネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）による感染症、呼吸器感染症、イヌ感染疾患、たとえば、狂犬病、ならびボルデテラ属（Bordetella）、レプトスピラ属（Leptospira）、及びボリエラ属（Boriella）による感染症の検出をはじめとする獣医学的診断に使用されうる。

本発明に係るＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ検出システムはさらに、植物病原体の検出、たとえば、ある特定の真菌、たとえば、子嚢菌綱（Ascomycetes）の種及び担子菌綱（Basidiomycetes）の種、ある特定の真菌様生物、たとえば、卵菌及びネコブカビ菌、ある特定の細菌、たとえば、バークホルデリア属（Burkholderia）、プロテオバクテリア、及びシュードモナス属（Pseudomonas）の種、ウイルス、ウイロイド、及びウイルス様生物、たとえば、タバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、線虫、たとえば、メロイドギネ・キトウッディ（Meloidogyne chitwoodi）及びＭ．ファラクス（M. fallaｘ）、並びに原生動物及び藻類、たとえば、フィトモナス属（Phytomonas）及びセファレウロ属（Cephaleuro）の検出に使用されうる。

本発明に係るＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ検出システムはさらに、細菌汚染、たとえば、ビブリオ・コレラ（Ｖibrio cholerae）、大腸菌（E. coli）、シゲラ属（Shigella）の種、レジオネラ属（Legionella）の種、サルモネラ属（Salmonella）の種、ウイルス汚染、たとえば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、藻類汚染、たとえば、デスモデスムス属（Desmodesmus）の種の存在、及び寄生生物汚染、たとえば、ドラキュンキュリアシス属（Dracunculiasis）の種の存在の検出を含めて、水汚染物の検出に使用されうる。

本発明に係るＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ検出システムはさらに、細菌汚染、たとえば、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）、大腸菌（E. coli）、リステリア属（Listeria）の種、サルモネラ属（Salmonella）の種、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）の存在、ウイルス汚染、たとえば、エンテロウイルス属（Enterovirus）の種、Ａ型肝炎ウイルス、ノロウイルス種、及びロタウイルス種の存在、寄生生物汚染、たとえば、ジアルジア属（Giardia）の種及びトリキネラ属（Trichinella）の種の存在、並びに真菌汚染を含めて、食品及び飼料の汚染物の検出に使用されうる。

より具体的には、本発明に係るＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ検出システムはさらに、すべての生物が感染時にＲＮＡを発生する限り、いずれの生物の検出にも使用されうる。前記生物としては、細菌、たとえば、バチルス属（Bacillus）の種、クロストリジウム属（Clostridium）の種、エンテロバクター属（Enterobacter）の種、エシェリキア属（Escherichia）の種、エンテロコッカス属（Enterococcus）の種、クレブシエラ属（Klebsiella）の種、リステリア属（Listeria）の種、レジオネラ属（Legionella）の種、サルモネラ属（Salmonella）の種、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）の種、ストレプトコッカス属（Streptococcus）の種、及びそれらの組合せ、ＤＮＡウイルスをはじめとするウイルス、たとえば、Ｂ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＲＮＡウイルス、たとえば、インフルエンザウイルス、Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、タバコモザイクウイルス、コロナウイルス、及びＨＩＶ、ウイロイド、古細菌、真菌、たとえば、アスペルギルス属（Aspergillus）の種、子嚢菌綱（Ascomycetes）の種、カンジダ属（Candida）の種、原生動物、並びに寄生生物、たとえば、トリパノソーマ属（Trypanosoma）の種が挙げられる。

ＲＮＡの検出のための本発明に係るＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ検出システムの使用は、診断状況で明確な利益をもたかすであろう。２つのかかる診断状況についてこれ以降で詳述する。しかしながら、当業者であれば、なんの疑いもなく、ＲＮＡの検出のための本発明に係るＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ検出システムが奏効するであろう追加の診断状況を見いだすことができよう。

最初の例は、最近の世界的発生により例示される。精度の良いポイントオブケア（ＰｏＣ）検出は、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックで多くの利益を提供するであろう。ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックをもたらす最近のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アウトブレイクは、その発見の何ヶ月か後以内に世界中に広がった。疾患の広がりを遅らせるために、多くの国々は、国民の運動及び移動を制限する予防手段を制定してきた。こうした制限は、全国的ヘルスケアシステムを管理可能な状態に維持することを意図して及びできる限り多くの生命を救うために、最終的には「その曲線を平坦化する」はずである。しかしながら、いくつかの国は、明らかに他の国よりもかなり効果的に感染の上昇を管理できてきた。たとえば、シンガポール、韓国、及び台湾での感染数及び後続の死亡数が限定されているのは、それらの迅速な対応が奏効したことの現れであると思われる。こうした奏効の主な要因は、他の国々ではしなかった又はできなかった大量の試験及び後続の自己検疫の早期の広範にわたる活用であった。この診断スクリーニングプログラムは、感染した人々を特定して隔離するのに役立ち、ウイルスの広がりをかなり遅らせて、より少ない感染及びより低い死亡率をもたらしてきた。このほか、ＷＨＯは、出現するパンデミックに迅速に対応できるように、分散された広範にわたる試験の必要性を表明している。ＣＯＶＩＤ－１９試験に使用される最も重要な診断ツールは、ウイルス由来の遺伝的物質（ＲＮＡ）を検出する（ＲＴ）－ＰＣＲに基づく。この試験は信頼できる結果を４～６時間で生じるが、集中検査室のみが試験を行う認定を受けているため、サンプル輸送を必要とするとともに、１回の試験当たり少なくとも２４時間の予想ターンアラウンド時間を必要とする。先進国でさえも、最近の試験量の増加は、こうした要求を満たさない。唯一利用可能なＰｏＣ試験は、過去の感染と現在の感染とを識別しないイムノアッセイであり、これは急性期診断に使用できない。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ核酸検出診断は、分散スクリーニングプラットフォームを構成する解決策を提供する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベース診断は、ＰＣＲよりも高速であり且つオンサイトでより安価に実施されると主張されてきた（Sheridan,2020.Nat Biotechnol 38:382-384）。我々は、革新的な所有権付きＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓベースＰｏＣ ＣＯＶＩＤ－１９診断アプローチを開発中であり、これはウイルスモニタリング能力の改善に寄与するため、ＣＯＶＩＤ－１９及び他のウイルスの広がりを限定するであろう。

第２の例は、尿路感染症（ＵＴＩ）の検出により提供される。現在のＵＴＩ診断は、一定の水準に達しているとはいえない。とりわけ第１選択ヘルスケアでは、一般医は、わずか６１％の陽性的中率の信頼性のないディップスティックに依存しなければならない。このため、疾患陰性患者の大量治療及び抗生物質の不必要な処方をもたらす（Eriksen and Bing-Jonsson,2016.Forskning 1-42、sykepleien.no/forskning/2016/09/kan-ikke-stole-blindt-pa-urinstiksで入手可能）。

ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ検出システムを用いる精度の良いポイントオブケア診断は、本方法全体にわたり主要な利点を提供するであろう。その特異的ＲＮＡ検出能力に基づいて、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ検出システムは、抗生物質耐性マーカーの迅速な種同定及び検出を可能にする。

ＵＴＩのほとんど（７０～９０％）の症例は、尿路病原性大腸菌（E.coli）により引き起こされるが、一連の他の病原体により引き起こされることもある（Flores-Mireles et al.,2015.Nat Rev Microbiol 13:269-284）。どの特異的病原体が感染を引き起こすかを同定すれば、追加情報が提供されて抗生物質の適正投与の可能性が増加するであろう。

たとえば、特異的病原体の同定は、特異的１６ＳリボソームＲＮＡ種の発現に基づきうる。Van der Zeeらは、７種のＵＴＩ原因病原体間の鑑別が１６ＳベースｑＰＣＲに基づきうることを示した（van der Zee et al.,2016.PLOS ONE 11:e0150755）。使用されたプライマーのいくつかの例は、表３に提供される（Van der Zee et al.,2016.Ibid）。これらのプライマーの標的は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド配列に適合化可能である。同様に、抗生物質耐性マーカーの検出用のＰＣＲプライマー領域もまた、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベース検出に適するように適合化可能である。

他の例は、生乳製品中のリステリア菌の検出により提供される。リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）は、致命的なリステリア症の原因となる可能性のある周知の食品媒介病原体である。リステリア菌は、野菜、乳製品、肉製品などの食品を汚染することが明らかにされてきた。欧州ではすべての生乳の１～４．４％で、さらにはある特定の非パスツール殺菌チーズでは１．１～６５％でリステリア菌の存在が報告されてきた（Lunden et al.,2004.J Dairy Science 87,E6-E12）。リステリア菌のＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベース遺伝的検出は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）などの他の潜在的病原体の検出と組合せ可能である。

迅速診断を用いた食品媒介病原体の迅速検出により、汚染乳製品の使用及び摂取を防止できる可能性がある。この検出が農場で可能になれば、乳加工プラントへの汚染乳の輸送が防止されるとともに汚染の潜在的広がりが防止され、リステリア症の可能性が減少されるであろう。

最初の例のように、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓベースＲＮＡ検出は、類似のＰＣＲ標的配列に基づいて設計可能である。乳の前処理が必要とされる可能性があるうえに低検出限界が必要とされる可能性の高いという厄介な問題を生じるおそれがある。

必要であれば、たとえば、検出レベルを増加させるために、特異的ＲＮＡ配列を検出する本発明の方法に先行して標的配列の増幅を行うことが可能である。増幅は、たとえば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、等温リボ核酸増幅システム、たとえば、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）及びＲＮＡの切断ベースシグナル増幅、転写媒介増幅、鎖置換増幅、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をはじめとするいずれかの好適な増幅システムにより実施されうる。当業者に公知のように、ＲＮＡは、好ましくは、増幅反応前又は増幅反応時に逆転写される。

好ましい増幅反応は、単一管等温反応、たとえ、ＮＡＳＢＡ、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応、及びニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）である。好ましい単一管等温反応はＲＰＡ）反応である（TwistDx Ltd.,Cambridge,UK）。

前記単一管等温反応たとえばＲＰＡは、好ましくは、「ワンポット」反応システムとして本発明のＣＲＩＳＰＲベースリボ核酸検出システムとインテグレートされる。かかるワンポット又は単一管システムの利点は、サンプルの汚染又は異なるサンプルの交差汚染のリスクが低減されることである。

直接ｃＯＡ検出法を利用することによるｃＯＡの検出では、サンプルは、内因性レベルのＰＰｉ及びＰｉを含みうる。とりわけ、血漿、血清、尿、滑液などの生物学的流体は、ＰＰｉ及びＰｉをそれぞれ０．１６～３．４２マイクロＭ及び０．３１ｍＭ（血漿）、それぞれ３．５マイクロＭ及び１～１．５ｍＭ（血清）、Ｐｉを１．５ｍＭ（尿）、並びにそれぞれ０．１マイクロＭ及び０．３ｍＭ（滑液）の量で含有しうる（Russell et al.,1970.Lancet 296:899-902、Silcox and McCarty,1973.J Clin Invest 52:1863-1870、Bansal,1990.Serum Inorganic Phosphorus.In:Clinical Methods:The History,Physical,and Laboratory Examinations （Butterworths)、Le,2008.First aid for the USMLE step 1 2018）。これらのレベルは、経時的に及び疾患の過程で変動しうる（Armstrong et al.,1975.Clin Chem 21:104-108）。

高い内因性ＰＰｉ又はＰｉレベルを有するサンプルの前処理は、特異的ＲＮＡ配列の検出前にＰｉやＰＰｉなどの低分子を除去することにより実施されうる。内因性ＰＰｉ又はＰｉレベルによるリードアウト干渉を防止するために、限定されるものではないが以下に列挙される方法を含めて、化学沈殿、透析、陽イオン交換カラムの使用などのいくつかの方法を採用可能である。

ＰｉやＰＰｉなどの低分子の除去は、たとえば、１，０００未満、好ましくは５００未満の分子量カットオフのフィルターにサンプルを通して濾過することにより、実施されうる。分子量カットオフは、既知の分子量の溶質の９０％超が膜に保持される最低分子量（ダルトン単位）として定義される。

試験結果に及ぼす内因性リン種の影響はまた、患者サンプルからの遺伝的物質（とくに標的配列）の単離及びＰＰｉ／Ｐｉフリー媒体中／上への後続適用により打ち消されうる。核酸物質の単離方法としては、限定されるものではないが、有機抽出、キレックス抽出、固相抽出、磁気ビーズ、及び／又は陰イオン交換が挙げられる。

内因性Ｐｉレベルの低減のほか、サンプル調製工程はまた、限定されるものではないが、患者サンプル中のプロテアーゼ、塩濃度、及びｐＨをはじめとする他の因子によるリードアウト干渉を解決することが必要とされる。

４．６ 適したデバイス
本発明に係るＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システムは、好ましくはデバイス中に存在する。前記デバイスは、好ましくは、１種以上の特異的ＲＮＡ配列を標的とする１つ以上の検出システムを含む。前記デバイスは、デバイスへの及びデバイスからの流体の導入及び抽出のために入口ポートや出口ポートなどの開口を含みうる。前記開口は、バルブ、チューブ、チャネル、チャンバー、シリンジ、及び／又はポンプに接続されうる。デバイスは、マイクロ流体デバイス内の流体の指向性運動を可能にする流体フローアクチュエーターに接続されうる。アクチュエーター例としては、限定されるものではないが、流体の運動を強制することが意図されたシリンジポンプ、機械的作動再循環ポンプ、電気浸透圧ポンプ、バルブ、ベロー、ダイヤフラム、又はバブルが挙げられる。ある特定の実施形態例では、デバイスは、流体をデバイスに通して移動させるために一体的に動作するプログラマブルバルブを備えたコントローラーに接続される。そのほか、加熱機構は、所望の温度で反応混合物をインキュベートするためのものでありうる。

好ましくは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システムは、好ましくは使い捨てカートリッジを用いることにより、バイオセンサー中に存在する。好ましいバイオセンサーは、標的核酸とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システムとの相互作用を検出するための方法及び手段を提供する。好ましいバイオセンサーは、サンプルの自動分析のために単純プッシュボタン操作を行う能力のある再使用可能ハンドヘルドリーダー、並びに病原体などの複数の臨床関連作用因子の最適検出及び／又は定量を提供するように機能化された費用効果的使い捨てカートリッジ、好ましくは使い捨てマイクロ流体センサーカートリッジを含む。可能なバイオセンサーは、たとえば磁気粒子などの定量可能物質の蓄積に基づくラテラルフロー試験デバイスである。

ある実施形態では、前記デバイス又はバイオセンサーは、ポイントオブケア（ＰＯＣ）試験デバイスであり、トランスポータブル、ポータブル、及びハンドヘルド機器又は試験キットであり、必要に応じて治療計画を調整できるように、サンプルを捕集して患者の位置又はその近くで非常に短時間で結果が得られるようにしたものである。好ましくは、前記デバイスは、標的核酸の存在又は不在、好ましくは前記標的核酸の定量を迅速に低コストで信頼性をもって決定できる手段を含む。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システムを含むＰＯＣは、好ましくは、５種以下の標的核酸分、４種以下の標的核酸分、３種以下の標的核酸分、たとえば、２種の標的核酸分子及び１種の標的核酸分子を含めて、限られた数の標的核酸分子の検出を対象とする。このため、ｃｒＲＮＡリボ核タンパク質複合体は、好ましくは、離散位置リボ核酸検出システムに存在し、個別ｃｒＲＮＡリボ核タンパク質複合体の各々に対してｃＯＡのレベルを決定できるようにする。

好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システムを含む前記アレイは、少なくとも５種の異なる標的核酸分子、好ましくは少なくとも異なる１０種の標的核酸分子、好ましくは少なくとも異なる２０種の標的核酸分子、好ましくは少なくとも異なる５０種の標的核酸分子、好ましくは少なくとも異なる１００種の標的核酸分子を標的とする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システムを含む前記アレイは、好ましくは２～１２．０００種の識別可能な標的核酸分子を標的とする。

当業者には明らかであろうが、ｃｒＲＮＡ分子の各々が、異なる標的生物、たとえば、異なる細菌、ウイルス、真菌、原生動物、及び／又は寄生生物に由来するとともに、それらを検出するために使用されるように、前記異なる標的核酸分子はすべて、異なる生物を対象としうる。前記異なるｃｒＲＮＡ分子はまた、異なるｃｒＲＮＡ分子のサブセットが同一生物を対象とするように選ばれうる。前記サブセットは、２種の異なるｃｒＲＮＡ分子、３種の異なるｃｒＲＮＡ分子、４種の異なるｃｒＲＮＡ分子、５種の異なるｃｒＲＮＡ分子を含みうる。同一生物を対象とする異なるｃｒＲＮＡ分子の数は、好ましくは最大１０に制限される。すべての異なるｃｒＲＮＡ分子による標的生物の検出により、標的生物の同定が適正であるという確認が提供されることは、明らかであろう。

そのほか、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースリボ核酸検出システムでは、特異的ｃｒＲＮＡ分子は、たとえば、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、１９２ウェルプレート、３８４ウェルプレート、７６８ウェルプレートなどのマイクロタイタープレートの複数のウェル中に、複数のコピーで存在しうる。ｃｒＲＮＡ分子の複数のコピーによる標的生物の検出は、標的生物の同定が適正であるという確認を提供する。

５．実施例
実施例１
材料及び方法
Ｃｍｒ複合体の精製並びに組換えＣｍｒタンパク質の発現及び精製の詳細な説明
Staals et al.,2013に記載のように、Ｃａｓタンパク質及びＣａｓ複合体を精製した（Staals et al.,2013.Mol Cell 52:135-145）。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）及び５’３２Ｐ－γ－ＡＴＰによりＲＮＡ基質（表４）を５’標識し、その後、ＲＮＡゲル溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳ）を用いて変性ＰＡＧＥから精製した。標識ＲＮＡ基質及び４００ｎＭのＴｔＣｍｒを用いてＴｔＣｍｒ活性アッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、及び２ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中でｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイを行った。とくに明記されていない限り、反応を６５℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＲＮＡローディング色素（９５％ホルムアミド含有）をサンプルに添加し、９５°で５分間煮沸した。２０％変性ポリアクリルアミドゲル（７Ｍウレア含有）上でサンプルを１５ｍＡで約３～４時間又は一定の４ｍＡで一晩泳動させた。フォスファーイメージングを用いて画像を可視化した。

Ｃｍｒ４６及びＣｍｒ４０の複合体再構成
最初に、３．５μＬ ｃｒＲＮＡ（７００ｎｇ）を３．５μＬ １×Ｃｍｒ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に添加した。続いて、Ｃｍｒ４６では、サブユニットを特定の順序（Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｍｒ１）で、それぞれ、２．５μＭ、２．５μＭ、２．５μＭ、１０μＭ、７．５μＭ、及び２．５μＭの最終濃度になるように反応混合物に添加して、２０μＬの合計反応体積を構成した。反応混合物を６５℃で３０分間インキュベートした。同様に、Ｃｍｒ４０では、サブユニット（Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｍｒ１）の最終濃度を、それぞれ、２．５μＭ、２．５μＭ、１．８７５μＭ、６．６６μＭ、７．５μＭ、及び２．５μＭとした。

直接ｃＯＡ検出アッセイ
Ｃｍｒ４０複合体又はＣｍｒ４６複合体（６２．５ｎＭ）さらにはＲＮＡ基質（２００ｎＭ、表４に列挙される）が添加されたＴｔＣｍｒ活性アッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、及び０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃＯＡ検出アッセイを行った。反応を６５℃で１時間インキュベートし、その後、０．０５単位のピロホスファターゼ（ThermoFisher EF0221）を添加し、続いて、２５℃で３０分間インキュベートした。Sigma-Aldrich（MAK307）によるマラカイトグリーンリン酸アッセイキットを用いてシグナルを可視化した。

電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
Ｃｍｒ結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で標識標的ＲＮＡ（表４）と共に４００ｎＭ内因性ＴｔＣｍｒ複合体をインキュベートすることにより、ＥＭＳＡを実施した。すべての反応を６５℃で１時間インキュベートし、１時間後、１５ｍＡで２．５時間又は一定の４ｍＡで一晩にわたりネイティブ５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）上で電気泳動を行った。フォスファーイメージングで画像を可視化した。

結果
異なるサイズのＴｔＣｍｒ複合体のＲＮＡ切断活性
Ｔ．サーモフィルス（T.thermophilus）ＨＢ８から精製された天然Ｃｍｒ複合体に異なる長さの一連の成熟ｃｒＲＮＡガイドをロードしたところ、ｃｒＲＮＡ－４．５（Ｔ．サーモフィルス（T.thermophilus）ＣＲＩＳＰＲアレイ４、スペーサー５）が最も豊富であることが、我々の以前の試験で示された（Staals et al.,2013.Mol.Cell 52:135-145）。内因性Ｃｍｒ複合体は、６ｎｔインターバルで相補的５’標識標的ＲＮＡ（４．５標的ＲＮＡ）を特異的に切断し、主に２１、２７、３３、及び３９ヌクレオチドの５’標識分解フラグメントをもたらす（図３Ａ）。しかしながら、内因性Ｃｍｒ複合体のｃｒＲＮＡ含有率の不均一性は、これらの結果の解釈を複雑化する（Staals et al.,2013.Ibid,Taylor et al.,2015.Science 348:581-586）。したがって、標的ＲＮＡ切断の機序をさらにプローブするために、我々は、異なる長さの単一ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ－４．５）に結合された再構成Ｃｍｒ複合体で内因性Ｃｍｒ複合体を置き換えた。

我々は、我々の以前のＲＮＡシーケンシングデータでの存在量に基づいて、３４（ＴｔＣｍｒ－３４）、４０（ＴｔＣｍｒ－４０）、及び４６ｎｔ（ＴｔＣｍｒ－４６）のｃｒＲＮＡ長さを含むように選んだ（Staals et al.,2013.Ibid）。内因性複合体で観測された５’標識分解物とは対照的に、再構成複合体の各々は、主に１つのサイズの規定の分解物を生成した（図３Ｂ）。これは、複合体の長さがｃｒＲＮＡの長さにより決定され、より大きな複合体（たとえばＴｔＣｍｒ－４６）が標的ＲＮＡの５’（標的）末端のより近くで切断するという考え方に一致する。より小さな複合体（すなわちＴｔＣｍｒ－４０及びＴｔＣｍｒ－３４）は、それぞれ、１又は２つのＣａｓ７～Ｃａｓ１１（Ｃｍｒ４～Ｃｍｒ５）骨格セグメントを欠如し、したがって、より離れた位置（５’標識からさらに離れる）で標的ＲＮＡを切断し、より大きな分解物をもたらす。内因性ＴｔＣｍｒ複合体の集団は、より大きな複合体とより小さな複合体との不均一混合物であり、さまざまな位置でそれらの同族の標的ＲＮＡを切断することが、これらの結果から示される。

ＴｔＣｍｒのシード配列
異なる化学量論比を有するこれらのＩＩＩ型複合体の有意性を調べるために、我々は、標的化要件とシード要件との差をプローブするように活性アッセイを構成した。構造的に類似したＩ型エフェクター複合体（すなわちカスケード複合体）では、標的化は、２つの因子：ＰＡＭ（プロトスペーサー近接モチーフ）及びシード（Mojica et al.,2009.Microbiol 155: 733-740、Semenova et al.,2011. Proc Natl Acad Sci U S A 108:10098-10103、Wiedenheft et al.,2011.Proc Natl Acad Sci U S A 108:10092-10097）により支配される。しかしながら、ＩＩＩ型システムでは、自己識別は、ｃｒＲＮＡの８ｎｔ ５’ハンドル（ヌクレオチド－８～－１といわれる）とプロトスペーサーにフランキングする対応する３’領域との間の相補性をチェックするいわゆるｒＰＡＭにより付与される［Elmore et al.,2016.Genes Dev 2016.30:447-459、Kazlauskiene et al.,2016.Mol Cell 62:295-306.、Marraffini and Sontheimer,2010.Nature 463:568-571］。相補性の場合、Ｃａｓ１０のＤＮａｓｅ活性は消失される。ＨＤドメインを欠如するＮ末端トランケートＣａｓ１０タンパク質に起因して（データは示されていない）、ＴｔＣｍｒはＤＮａｓｅ活性が欠けているので（Staals et al.,2013.Ibid）、我々は、ｃｒＲＮＡの５’ハンドルに対するマッチを有する標的ＲＮＡによりＲＮａｓｅ活性が影響を受けるかを試験した。しかしながら、これらの基質は、ＲＮＡ切断活性に認識可能な影響を及ぼさないことが活性アッセイにより示されたことから、ＴｔＣｍｒによるＲＮＡ標的化は、他のＩＩＩ型システムに類似して、自己ＲＮＡ（たとえば、ＣＲＩＳＰＲアレイからのアンチセンス転写物）の標的化をチェックしないことが示唆される（Tamulaitis et al.,2014.Mol Cell 56:506-517、Samai et al.,2015.Cell 161:1164-1174）。

その次に、我々は、ｃｒＲＮＡのガイド部分の最初の８ｎｔ（プロトスペーサーと塩基対合するｃｒＲＮＡの非リピートセグメント）に突然変異を有する活性アッセイを構成することにより、ＴｔＣｍｒがＩ型システムに類似したシードを利用するかを試験した。３９ｎｔ分解物の欠失により実証されるように、位置５のミスマッチは近接切断部位をブロックし消失したが、ＲＮＡ標的化は、これらの突然変異により影響を受けないことが、結果から示された（図４Ａ、Ｂ）。図４Ａで実証されるように、ｃｒＲＮＡのガイド部分の最初の８ｎｔの突然変異は、標的ＲＮＡ分解に影響を及ぼさない。しかしながら、ｃＯＡ生成及び後続の非特異的ＲＮＡ分解に対するその影響はまだ解明されていなかった。ｃＯＡの生成に及ぼす単一ヌクレオチドミスマッチの影響についてのさらなる洞察力は、新規アッセイを利用することにより達成された。

内因性ＴｔＣｍｒ複合体さらには再構成Ｃｍｒ複合体（４６ｎｔ及び４０ｎｔ、図５）では、ｃＯＡの生成のためにｎｔ位置１、２、及び５に相補性を有することの重要性が、結果から明らかに実証される（図３）。ｃＯＡ生成は、１、２、及び５と比較したとき、ｎｔ位置４でのミスマッチによりそれほど影響を受けない。注目すべき点として、ｎｔ位置３、６、及び７のミスマッチは、セカンドメッセンジャー分子の生成にほとんど影響を及ぼさないように思われる。

この領域では、十分な相補性は不必要であり、その代わりにシードは異なる領域に位置する可能性があることが、これらの結果から示唆される。実際に、スルフォロブス・アイランディカス（Sulfolobus islandicus）由来のＩＩＩＢ型Ｃｍｒ複合体に関する初期の研究（Peng et al.,2015. Nucleic Acids Res 43:406-417）では、ｃｒＲＮＡの３’末端の厳密な塩基対合の必要性が示された。

この可能性を調べるために、我々は、内因性ＴｔＣｍｒ複合体と、異なるミスマッチングセグメントを有するＲＮＡ標的と、を用いて活性アッセイを実施した（図６Ａ）。従来の知見に一致して、第１のセグメント（ヌクレオチド１～５）にミスマッチを有するＲＮＡ標的は、ミスマッチセグメントの下流の１つの切断部位をスキップするにもかかわらず、標的分解に干渉しなかった。しかしながら、ｃＯＡ生成に及ぼす影響は非常に有意であり、それをほぼ完全に消失する（図６）。第２及び第３のミスマッチセグメント（ヌクレオチド７～１２及び１３～１７）では、上流及び下流の切断部位を両方ともスキップするが、他の切断部位は影響を受けなかった。第２のセグメントミスマッチは、ｃＯＡの生成を完全に消失したが、第３のセグメントミスマッチでは、有意量のｃＯＡ生成が観測された。しかしながら、第４及び第５のセグメント（ヌクレオチド１９～２３及び２５～２９）にミスマッチを導入したとき、ＲＮＡ分解は完全に消失されたが、第４のセグメントミスマッチでのみｃＯＡ生成が影響を受けた。最後のセグメント（ヌクレオチド３１～３５）のミスマッチは、上流切断部位をスキップする以外はＲＮＡ分解にもｃＯＡ生成にも影響を及ぼさなかった。第４及び第５のセグメントにまたがる領域での塩基対合は、標的認識及び分解にきわめて重要であるが、ｃＯＡ生成開始にも役割を果たすことが示唆される。

内因性複合体はより長い複合体とより短い複合体との混合物であるので、このきわめて重要な領域をより精度良く示すために、我々は、４６（ＴｔＣｍｒ－４６）又は４０ｎｔ ｃｒＲＮＡ（ＴｔＣｍｒ－４０）を有する再構成複合体の使用に切り替えた。ＴｔＣｍｒ－４６複合体は、内因性複合体により得られた結果をほぼ完全に反映したので、第４及び第５のセグメント内のミスマッチに対するＲＮＡ分解の感度並びに第１、第２、及び第４のセグメントがｃＯＡ生成に及ぼす有意な影響を示す（図５Ｂ）。しかしながら、この必須領域は、ＴｔＣｍｒ－４０複合体では１セグメントだけシフトさせて出現させたので、第３及び第４のセグメントでの厳密な塩基対合要件を有する（図５Ａ）。まとめると、これらの結果は、より小さなｃｒＲＮＡ（したがって複合体）サイズではガイドの５’末端方向に著しくシフトするＴｔＣｍｒ内の３’位置シード領域を強く示唆する。我々は、これらの領域が一緒に又は非依存的にＴｔＣｍｒ内でシード配列として機能すると提案する。

我々は、このシード配列が相補的ＲＮＡ標的の認識時に結合の開始に関与すると仮定した。こうした理由から、我々は、内因性ＴｔＣｍｒ複合体を用いてＥＭＳＡで同一のミスマッチＲＮＡ標的の結合親和性を試験した（図６Ａ）。活性アッセイに一致して、我々は、最初の３つのセグメント（ヌクレオチド１～５、７～１１、及び１３～１７）にミスマッチを有する標的がＴｔＣｍｒ複合体への結合に干渉せずに、十分に相補的なＲＮＡ標的対照に類似して泳動することを観測した。しかしながら、第４及び第５のセグメント（ヌクレオチド１９～２３及び２５～２９）中のミスマッチは、ゲル上の泳動ＴｔＣｍｒ標的ＲＮＡ三次複合体に実質的に影響を及ぼした。泳動はその非結合状態とは異なっていたが、我々は、これが標的ＲＮＡの他の下流（相補的部分）部分への部分的結合を表しうると予想する。

塩基対合がｃｒＲＮＡの３’末端で開始されることをさらに確証するために、我々は、ＥＭＳＡでショート１１ｎｔ標的ＲＮＡを設計した。ｃｒＲＮＡの５’部分に相補的な標的はｃｒＲＮＡと塩基対合できなかったが、提案された３’シード領域と塩基対合する標的は結合可能であった（図６Ｂ）ガイドの５’末端は、どういうわけかその同族の標的ＲＮＡとの塩基対合相互作用からシールドされていることが、これらの結果から示唆された。むしろ、ｃｒＲＮＡ：標的二本鎖形成は、ガイドの３’末端で開始された後で５’末端に向かって伝播するように思われる。

我々は、以前、異なるサイズのアポ及びｓｓＲＮＡ標的結合ＴｔＣｍｒ複合体のクライオＥＭ構造を解明した（Taylor et al.,2015.Science 348:581-585）。その結果、標的ＲＮＡ結合に伴い、複合体は、サブユニットの協調的な再構成を起こすことが確認された。最も注目すべきこととして、Ｃａｓ１１（Ｃｍｒ５）フィラメントは、複合体の中心から離れるように回転し、それによりｃｒＲＮＡのより５’位置の部分をチャネル内に露出して、ｃｒＲＮＡ：標的ＲＮＡ二本鎖のさらなる伝播を可能にする。こうした観測は、本研究で同定されたシード領域によく一致している。たとえば、提案されたシードは、より高いアクセス性の領域に存在し、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ６、及びＣｍｒ４サムとの相互作用を有する。それはまた、トップからＣｍｒ５に近接するｃｒＲＮＡの第１のセグメントである。このことから、初期標的結合は、Ｃｍｒ１ヘッドの最もアクセス可能な「オープン」領域で始まる可能性があることが示唆されるが、しかしながら、きわめて重要なシード配列残基は、「クローズド」メジャー（Ｃｍｒ４）及びマイナー（Ｃｍｒ５）骨格間に挿入することにより、複合体内で構造変化を開始することが必要とされる。シード領域が結合したら、ＴｔＣｍｒのチャネルは開くことができ、基質の残りの部分が塩基対合できるので、それにより、協奏的な構造変化が伝播する。

実施例２
材料及び方法
Ｃｍｒ４６複合体再構成
最初に、３．５μＬ ｃｒＲＮＡ（７００ｎｇ）を３．５μＬ １×Ｃｍｒ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に添加した。続いて、サブユニットを特定の順序（Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｍｒ１）で、それぞれ、２．５μＭ、２．５μＭ、１０μＭ、７．５μＭ、２．５μＭ、及び２．５μＭの最終濃度になるように反応混合物に添加して、２０μＬの合計反応体積を構成した。反応混合物を６５℃で３０分間インキュベートした。

アッセイに使用される標的ＲＮＡ配列は、配列：

を含み、アンダーライン付きヌクレオチドはデスオキシ系ヌクレオチドであった。この標的ＲＮＡはＣｍｒ複合体により切断できない。

Ｐｉ検出アッセイ
Ｃｍｒ複合体（６２．５ｎＭ）さらにはＲＮＡ基質（とくに明記されていない限り２００ｎＭ）が添加されたＴｔＣｍｒ活性アッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、及び０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２単位の熱安定性無機ピロホスファターゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２９６Ｓ））中で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃＯＡ検出アッセイを行った。とくに明記されていない限り、６５℃で反応を１時間インキュベートした。Sigma-Aldrich（MAK307）によるマラカイトグリーンリン酸アッセイキットを用いてシグナルを可視化した。

Ｃｓｘ１原理証明実験
Ｃｓｘ１原理証明実験では、６５℃で１ｈインキュベートした後に９５℃でサンプルを１０分熱不活性化した以外は「Ｐｉ検出アッセイ」に記載のように、ｃＯＡ検出アッセイを実施した。熱不活性化後、１３．０００ｇでサンプルを１０分遠心沈降し、その後、上清を－２０℃で貯蔵した。ＴｔＣｍｒ活性緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、及び０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２単位の熱安定性無機ピロホスファターゼ（NEB#M0296S）と約１．５μｇＣｓｘ１（TTHB144）とを含む反応混合物に、２μＬの以上で取得された上清を添加し、そして６５℃で１０分インキュベートした。インキュベーション後、RNase alert（IDT#11-04-03-03）又はDNase alert（IDT#11-04-03-04）のどちらかの試薬を提供されたマニュアルに従って添加した。この反応を３７℃で３０分間インキュベートした後、蛍光を測定した。

結果
感度実験
反応時間（Ａ）を１時間及び発色時間を３０分に設定してシステムの感度を探究した。図８Ａに示されるように、５００ｐＭ～１ｎＭ標的ＲＮＡ範囲内で測定可能リードアウト（非標的に対する増加倍率約２）が得られた。標的ＲＮＡを切断して有効感度を増加させる能力を欠如する突然変異体サブユニットを作製するというストラテジーを、複合体が切断できない標的ＲＮＡを用いることにより模倣した。

時系列実験
特定時間点で測定可能シグナル（ブランクサンプルに対する増加倍率で表される）が決定されるように実験を構成した。合計反応時間は、２つの部分：Ａ）標的ＲＮＡ添加時のＰｉ生成反応及びＢ）呈色試薬添加後の比色反応からなっていた。最終出力は、両方の反応時間を組み合わせた終了時の吸光度で測定された増加倍率であった。所望の測定可能閾値（ブランクサンプル陰性対照に対する増加倍率）により最終用途での合計反応時間の時間幅を設定した。図８Ｂでは、１５分の設定呈色反応時間（Ｂ）及び可変Ｐｉ生成反応時間（Ａ）を用いてデータセットを選んだ。これを任意に選んでシステムのアイデアが与えられるようにした。

Ｃｓｘ１媒介原理証明実験
Ｃｓｘ１の標的ＲＮＡ誘導活性化を検査するために、図８Ｃに示されるこの原理証明実験を行った。ｃＯＡが生成されるように標的ＲＮＡの存在下でインキュベートされた反応混合物の一部を、Ｃｓｘ１とｓｓＲＮＡ又はｓｓＤＮＡのクエンチャー－フルオロフォア配列のどちらかを含有する新しい反応に添加した。棒グラフに描かれた結果は、明らかにｃＯＡ含有混合物の添加時のｓｓＲＮＡ分解を示す。このことから、標的ＲＮＡの認識時にＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＣａｓシステムによりＣｓｘ１を間接的に活性化可能であることが示唆される。

実施例３
材料及び方法
Ｃａｓタンパク質及びＣａｓ複合体
標的突然変異誘発によりＣｍｒ４ Ｄ２６Ｎ切断活性不活化突然変異体を発生させた。Ｃａｓタンパク質コード配列はすべて、異種発現宿主大腸菌（E.coli）との適合性に関してコドン最適化を行った後、合成gBlock（Integrated DNA Technologies (IDT)）として発生させた。コード配列はすべて、当業者に公知の標準的クローニング方法を用いて発現ベクター中にクローニングされた。さらに、Ｃｍｒ４ Ｄ２６Ｎ切断活性不活化突然変異体は、Ｃｍｒ４ ｇＢｌｏｃｋの標的突然変異誘発により作製された。発現ベクターは、Ｎ又はＣ末端Ｓｔｒｅｐタグ、任意にＴＥＶ切断部位、バイシストロニック設計エレメント、Ｔ７プロモーター配列、ターミネーター配列、ｐ１５Ａ低コピー複製起点、及びカナマイシン耐性マーカーを含有していた。発現ベクター自体は、ｐ１５Ａクローニングベクター（Addgene Plasmid #41187）由来であった。発現ベクターはすべて、タンパク質発現のために大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（DE3）にトランスフォームされる。

組換え株を２Ｌ溶原性ブロス（ＬＢ）培地で培養し、約０．６のＯＤ６００に達するまで成長させた。培養物を氷上に１時間配置した後、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドを０．２ｍＭの最終濃度になるように添加した。続いて、培養物を１８℃で約１６時間（一晩）インキュベートした。細胞を採取して（１０分で５．０００ｇ）超音波処理により緩衝液Ａ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中でライシスし、続いて、４５分にわたり３０．０００ｇで遠心沈降させた。清澄化ライセートを濾過し、あらかじめ平衡化されたStrepTrap FPLCカラム（GE Healthcare,Chicago,IL）上に流した。フロースルー中にもはやタンパク質が存在しなくなるまで緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、緩衝液Ｂ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び２．５ｍＭ Ｄ－デスチオビオチン）を用いて対象タンパク質を溶出させた。所要により、ＴＥＶプロテアーゼ（Genscript Cat.No.Z03030）の添加によりタンパク質をアフィニティータグから切断し、そして４℃で一晩放置してインキュベートした。HisTrapアフィニティークロマトグラフィー工程により混合物から対象タンパク質を分離し、それをフロースルーから捕集した。所要により、より高純度を達成するために、追加のサイズ排除クロマトグラフィーを加えた。

Ｃｍｒ４６複合体及びｄＣｍｒ４６複合体再構成
最初に、３．５μＬ ｃｒＲＮＡ（７００ｎｇ）を３．５μＬ １×Ｃｍｒ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に添加した。続いて、サブユニットを特定の順序（Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ４又はＣｍｒ４ Ｄ２６Ｎ、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｍｒ１）で、それぞれ、２．５μＭ、２．５μＭ、１０μＭ、７．５μＭ、２．５μＭ、及び２．５μＭの最終濃度になるように反応混合物に添加して、２０μＬの合計反応体積を構成した。反応混合物を６５℃で３０分間インキュベートした。

間接ｃＯＡ検出アッセイ
再構成Ｃｍｒ４６複合体（６２．５ｎＭ）、可変濃度のＲＮＡ基質（表４又は表５に列挙される）、Ｃｓｘ１（１μＭ）、及び０．５μＬ RNaseAlert QCシステム（Thermo Scientific、マニュアルに従って調製した）が添加されたＴｔＣｍｒ活性アッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、及び０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃＯＡ検出アッセイを行った。２分インターバルで蛍光出力を測定して（４９５／５２０ｎｍ励起／吸光）、ｑＰＣＲサーモサイクラーにより６５℃で反応をインキュベートしたか、又は１５秒間インターバルで蛍光出力を測定して（４９５／５２０ｎｍ励起／吸光）、Genie III（Optigene）により６５℃でインキュベートした。さまざまな濃度の標的ＲＮＡでの測定を用いてシステムの感度範囲を決定した。

結果
ｄＣｍｒ４６に対する標的ＲＮＡ結合の能力及び後続のＣｍｒ２／Ｃａｓ１０活性化の確認
Ｃｍｒ４ Ｄ２６Ｎ突然変異体は、複合体の切断能力のみに影響し、結合能力やその後のＣｍｒ２／Ｃａｓ１０サブユニットの活性化には影響しないと仮定して作製された。このことを証明するために、先に記載した間接ｃＯＡ可視化法を用いて標的結合能を測定した。実際に、突然変異タンパク質は、全長ＩＩＩＢ型複合体（Ｃｍｒ４６）の標的結合を消失しなかった（図９、１０）。

加えて、全長触媒活性不活化型ＩＩＩＢ複合体（ｄＣｍｒ４６）は、野生型ＩＩＩＢ型複合体と比較したとき、標的ＲＮＡ感度を増加させることが実測された（図９、１０）。そのほか、ｄＣｍｒ４６は、野生型Ｃｍｒ４６と比較したとき、同一タイムフレームでより多くのｃＯＡを生成することが、アッセイのシグナル出力から示唆される（図１１）。我々は、Ｃｍｒ４ Ｄ２６Ｎのこれらの特性を診断目的で活用することを目指し、この突然変異をｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに応用することで、より高い標的感度を得ることを目指しているこれにより、アッセイサンプル中の標的物質をより低濃度で検出したり、検出限界に達するために必要なプレ増幅のレベルを低くすることができるという利点がある。

実施例４．サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）由来のＩＩＩＡ型システム（Ｃｓｍ）
材料及び方法
ｃＯＡ検出アッセイ
内因性Ｃｓｍ複合体（～2 μg;Staals et al.,2014.Mol Cell 56:518-530）さらにはＲＮＡ基質（２００ｎＭ、表４に列挙される）が添加されたＴｔＣｍｒ活性アッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、及び０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃＯＡ検出アッセイを行った。反応を６５℃で１時間インキュベートし、その後、０．０５単位のピロホスファターゼ（ThermoFisher EF0221）を添加し、続いて、２５℃で３０分間インキュベートした。Sigma-Aldrich（MAK307）によるマラカイトグリーンリン酸アッセイキットを用いてシグナルを可視化した。表６に示されるレイアウトに従って実験を行った。

結果
図１２は、ＩＩＩａ型Ｃｓｍ ｃＯＡ生成アッセイの結果を示す。このＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体もまた、相補的標的ＲＮＡの添加後にｃＯＡ生成を示す。

実施例５．ワンポットＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出
材料及び方法
ＩＩＩＢ型Ｃｍｒ ｃｒＲＮＡ及びＲＰＡプライマーの設計
世界保健機関（World Health Organization）（WHO）及び疾病管理予防センター（Centers for Disease Control and Prevention）（CDC）による報告によると、Ｎ遺伝子はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出に好適な標的として同定された。複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２様コロナウイルスに保存されるＮ遺伝子（CDCではＮ３といわれる）の領域に対してｃｒＲＮＡを設計した。
ｃｒＲＮＡ＿Ｎ３： ５’－ＡＵＵＧＣＧＡＣＧＣＡＧＣＡＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＧＡＴＴＧＣＧＧＧＴＧＣＣＡＡＴＧＴＧＡＴＣ ３’

Ｎ３領域を増幅するために、TwistAmp Liquid Basicキット（TwistDx Ltd,Maidenhead,UK）により提案されたパラメーターに従って、ＲＰＡ用ＤＮＡプライマーを設計した。そのほか、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために、フォワードプライマーの５’にＴ７プロモーター配列を付加した。増幅がうまくいくように複数の候補をスクリーニングすることにより、最も性能の良いプライマー対を特定した。
ｎＣＯＶ＿Ｎ３＿ＲＰＡ＿Ｆ１： ５’ ＧＧＣＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＡＡＴＧＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴ ３’
ｎＣＯＶ＿Ｎ３＿ＲＰＡ＿Ｒ１： ５’ ＣＴＣＣＡＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＴＴＧＡＡＴＣＴＧ ３’

ｃｒＲＮＡ＿Ｎ３を用いて以上に記載のようにＣｍｒ４６複合体を再構成した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出アッセイは、単一反応でＲＰＡとＩＩＩＢ型Ｃｍｒ検出とを組み合わせる。合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムを標的ＲＮＡとして使用した。このゲノムは、Twist Biosciences（South San Francisco,CA）により約１０^６コピー／マイクロリットルで６種の非オーバーラップ５ｋｂ ＲＮＡ断片として提供された。参照ゲノムは、単離物Wuhan-Hu-1（GenBank ID:MN908947.3）に基づいて作製された。

TwistAmp Liquid Basicキット（TwistDx）は、ＲＰＡによる増幅用の試薬を提供した。小サンプル体積で操作できるように、供給元により提供されたＲＰＡ反応混合物をすべて４等分した。そのほか、これらの混合物にオリゴヌクレオチドプライマー、リバーストランスクリプターゼ用の成分、及びＴ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を組み込んだ：１．５μＬプライマー混合物（１０ｍＭ、Integrated DNA Technologies）、０．５μＬ Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ（１００Ｕ／μＬ、Invitrogen）、０．５μＬ ＤＴＴ（５０ｍＭ、Invitrogen）、０．２５μＬネズミＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ、New England Biolabs (NEB)）、０．５μＬ Ｔ７ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ、NEB社）、２．２５μＬのｄＮＴＰ溶液ミックス（１０ｍＭ、NEB）、及び２．２５μＬ ＮＴＰはミックス（２０ｍＭ、NEB)。ＲＰＡ混合物の次に、０．１２５μＬ RNaseAlert QCシステム（Thermo Scientific、製造業者により提供された乾燥ペレット、１ｍＬの代わりに１００μＬで再懸濁）、１μＬ Ｃｓｘ１（１０μＭ）、約６０ｎＭの最終反応混合物濃度になるようにＣｍｒ４６複合体、及び１ｍＭの最終反応混合物濃度になるようにＡＴＰを組み合わせることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃｍｒ混合物を作製した。両方の反応溶液を混合した後、１６．５μＬ ＲＰＡ混合物と、４．２５μＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｃｍｒ混合物及び１μＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２合成ゲノム鋳型と、を組み合わせた。１００，０００コピー／μＬ～１０コピー／μＬの範囲内のゲノム鋳型を含有する複数の混合物を作製した。Genie III（OptiGene）により反応を３７℃で３０分及び６５℃で４５分インキュベートした。３０分から始めて４９５／５２０ｎｍ（励起／発光）で蛍光リードアウトを機器により実施した。

結果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出アッセイは、標的遺伝物質の増幅と検出を１回の反応で行うものである。このワンポット反応混合物を３７℃で４５分間インキュベート（プレ増幅）し、その後、温度を６５℃に増加させた（シグナル生成）。図１３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２合成ゲノムのインキュベーション時間によるデータを描いたものである。その結果、６５℃でのインキュベーション後数分で、陰性対象（ＮＣ）と比較して、シグナルが有意に増加することがわかった。一般に、６５℃で５分間インキュベートした後には、すでにシグナル生成が確認できるため、プレ増幅時間はさらに短縮可能であると推定される。

実施例６．ワンポットＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出の検証
材料及び方法
Wageningen Bioveterinary Research（WBVR）との共同で、小スケール試験を実施してミンクサンプルでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワンポットＩＩＩ型検出アッセイを検証した。Direct Zol RNAミニプレップキット（Zymo Research）を用いて４匹のＣＯＶＩＤ陽性ミンクの直腸スワブサンプルでＲＮＡ抽出を実施した（GenBank ID MT396266、MT457390、及びMT457399）。１００μＬ ＲＮａｓｅフリー水でサンプルを溶出し、その５μＬを鋳型として検出アッセイに使用した。TwistAmp（商標）nfoキット（TwistDx）は、ＲＰＡによる増幅用の試薬を提供した。小サンプル体積で操作できるように、供給元により提供されたＲＰＡ反応混合物をすべて４等分した。提供されたプライマーフリー再水和緩衝液と、１反応当たり１．０５μＬプライマー混合物（５ｍＭフォワード及びリバース、Integrated DNA Technologies）と、を組み合わせ、続いて、提供されたＲＰＡペレットを再水和するために使用した。そのほか、４．５μＬ再構成Ｃｍｒ４６複合体（約６０ｎＭの最終反応混合物濃度になるように、Ｎ３遺伝子ｃｒＲＮＡがロードされている）、０．１２５μＬ RNaseAlert QCシステム（Thermo Scientific、製造業者により提供された乾燥ペレット、１ｍＬの代わりに１００μＬで再懸濁）、０．２５μＬ ＡＴＰ（８０ｍＭ、Sigma Aldrich）と、１μＬ Ｃｓｘ１（１０μＭ）、０．５μＬ M-MLV RT（１００Ｕ／μＬ、Invitrogen）、０．５μＬ ＤＴＴ（５０ｍＭ、Invitrogen）、０．２５μＬネズミＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ、Ｎew England Biolabs (NEB)）、０．５μＬ Ｔ７ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ、NEB）、及び２μＬ ＮＴＰ溶液ミックス（２０ｍＭ、NEB）と、を組み合わせることにより、ＩＩＩＢ型Ｃｍｒ混合物を作製した。各アッセイ反応に対して、８．４２５μＬ ＲＰＡ混合物と、５．６２５μＬ Ｃｍｒ混合物、０．６２５μＬ ＭｇＯＡｃ（２８０ｍＭ、ＴｗｉｓｔＤｘ）、及び５μＬ鋳型又はＲＮａｓｅフリーＭＱと、を組み合わせて、合計１９．６７５μＬになるようにした。陽性対照として、５μＬの１００コピー／μＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２合成ゲノム（実施例５参照）を使用した。Genie III（OptiGene）分光測光器により反応混合物を３７℃で４５分間、続いて６５℃で３０分間インキュベートした。６５℃インキュベーション時間の間、１５秒間インターバルで４９５ｎｍ／５２０ｎｍ（励起／発光）で蛍光を測定して、データ収集を行った。

結果
２０２０年４月の終りにオランダのミンク飼育場でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が最初にアウトブレイクして以来、ＷＢＶＲは、オランダでのミンクのすべての診断検査に関与してきた。抽出ＲＮＡサンプルを提供し、その後、１回の反応で標的遺伝的物質の増幅と検出とを組み合わせた診断アッセイを使用した。このワンポット反応混合物を３７℃で４５分間インキュベート（プレ増幅）し、その後、温度を６５℃に増加させた（シグナル生成）。ミンクＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サンプルのインキュベーション時間からのデータを、図１４に示す。これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出が、６５℃でのインキュベーション後３０分以内で可能であることを明確に示しており、本技術が実際の複雑なサンプルマトリックスに適用可能性が示される。

Claims (17)

1. ａ）ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連エフェクタータンパク質（Ｃａｓ）と、標的核酸分子に結合する少なくとも１種ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、を含むエフェクター複合体と、
   ｂ）環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）のレベルを直接的又は間接的に決定するための手段と、
   を含む、クラスター化され、規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）ベースリボ核酸検出システム。
2. 前記ＩＩＩ型ＣａｓがＩＩＩＢ型Ｃａｓ、好ましくはＩＩＩＢ型Ｃｍｒである、請求項１に記載の検出システム。
3. 前記ＩＩＩ型Ｃａｓがサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）などの好温生物由来である、請求項１又は２に記載の検出システム。
4. 前記ＩＩＩ型Ｃａｓが切断活性を欠如する、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出システム。
5. ｃＯＡのレベルを直接的又は間接的に決定するための前記手段が、ピロリン酸のレベル（ＰＰｉ）を決定するための手段を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の検出システム。
6. 無機ピロホスファターゼをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の検出システム。
7. 前記無機ピロホスファターゼがサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）などの好温生物由来であり、等温検出を可能にする、請求項６に記載の検出システム。
8. Ｃｓｘ１などのｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の検出システム。
9. Ｃｓｘ１などのｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼと、前記エンドリボヌクレアーゼの検出可能基質と、をさらに含む、請求項８に記載の検出システム。
10. 請求項１～９のいずれか一項に記載のリボ核酸検出システムと共にサンプルを提供すること、
    前記ｃｒＲＮＡをその標的核酸分子に結合させる条件下で前記サンプルをインキュベートすること、及び
    環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）のレベルを直接的又は間接的に決定すること、
    を含む、サンプル中の標的核酸分子の存在又は不在を決定するための方法であって、
    対照と比較して、前記決定されたｃＯＡレベルの増加が、前記サンプル中の前記標的分子の存在の指標となる、方法。
11. ｃＯＡのレベルが、ピロリン酸のレベル又は無機ピロホスファターゼが検出システムに存在する場合に、無機リン酸のレベルを決定することにより決定される、請求項１０に記載の方法。
12. ピロリン酸又は無機リン酸のレベルが、比色測定、蛍光測定、蛍光、又は生物発光ベースアッセイにより決定される、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. ｃＯＡの活性のレベルが、請求項８～９のいずれか一項に記載の検出システムを利用してエフェクターエンドリボヌクレアーゼの検出可能基質を検出することによりＣｓｘ１などのｃＯＡ依存非特異的エフェクターエンドリボヌクレアーゼのレベルを決定することにより間接的に決定される、請求項１０に記載の方法。
14. 前記サンプルが、３７℃～８５℃、好ましくは約６５℃の温度で前記リボ核酸検出システムでインキュベートされる、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 請求項１～９のいずれか一項に記載のリボ核酸検出システムを含むデバイス。
16. 異なる標的核酸分子を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の複数のアレイリボ核酸検出システムを含む、請求項１５に記載のデバイス。
17. ａ）ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連エフェクタータンパク質（Ｃａｓ）と、標的核酸分子に結合する少なくとも１種ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、を含むエフェクター複合体と、
    ｂ）環状オリゴアデニル酸（ｃＯＡ）のレベルを直接的又は間接的に決定するための手段と、
    を含む部品のキット。

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