JP2011087534A - 夾雑物の影響を排除する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を利用するＲＮＡ検出方法において夾雑物の影響による非特異的増幅反応を抑制し、標的ＲＮＡの検出特異性・検出感度を向上させること。
【解決手段】 リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を利用するＲＮＡ検出方法において、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分にはハイブリダイズせず、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡとのみハイブリダイズする一種以上のオリゴヌクレオチドＤＮＡを添加することで前記課題を解決する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分をその３’端領域に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を利用して逆転写する工程を含む増幅操作に供するための試料処理法に関する。より詳細には、本発明はリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素を利用するＲＮＡ増幅操作に供するための試料の処理法に関し、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドＤＮＡを添加することを特徴とするものである。

核酸は、増幅操作によって特異的かつ高感度に増幅することができる。その用途は生化学、分子生物学又は医療分野等多岐にわたり、例えば増幅操作と同時に又はその終了後に検出を行うことによって、特定の遺伝子の発現量を評価したり、試料中に特定の微生物・ウイルスが存在しているか否かを明らかにすることができる。

核酸の増幅操作は、標的とする核酸がＤＮＡかＲＮＡかによって２つに大別され、増幅操作の目的によって適宜選択される。例えば試料中の特定の微生物やウイルスの検出を目的とする場合、これら特定の微生物やウイルスに存在する核酸を増幅し、検出することになるが、その標的としてはリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等が利用される。かかるＲＮＡは、細胞あたり数〜数千又はそれ以上のコピー数が存在するからである。ゲノムＤＮＡを標的とすることも可能であるが、ゲノムＤＮＡは細胞あたり１又は数コピーしか存在しないため、当該目的ではＤＮＡよりもＲＮＡを検出する方が高感度である。また、細胞内のＲＮＡは微生物が死滅後に速やかに分解されるが、ＤＮＡは微生物が死滅後にも分解されにくいため、生存している微生物を検出する目的においてはＤＮＡではなくＲＮＡを標的とすることが好適である。またウイルスにはＤＮＡウイルスとＲＮＡウイルスが存在するが、ＲＮＡウイルスを検出する場合にはＲＮＡを標的とした増幅操作を実施する必要がある。そして細胞内の遺伝子発現量を測定する場合、ＲＮＡを標的とした増幅操作が使用されるのは言うまでもない。

標的とするＲＮＡ（標的ＲＮＡ）の増幅操作は、標的ＲＮＡ中に存在する特定の塩基配列部分（特定塩基配列部分）であって、標的ＲＮＡに特異的な部分（他のＲＮＡ（非標的ＲＮＡ）には見いだすことのできない部分）に対して実施される。例えば、ＲＮＡを標的とする増幅操作であるＲＴ−ＰＣＲ法は、特定塩基配列部分の３’端領域に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を利用してまず逆転写を行い、続いて逆転写の産物であるｃＤＮＡについて、プライマー存在下で反応温度を昇降させてＰＣＲ法を実施するものである。

他のＲＮＡの増幅操作として、一定温度（４０℃から６５℃程度）で実施可能なＮＡＳＢＡ法（特許文献１及び２）、ＴＭＡ法（特許文献３）、ＴＲＣ法（特許文献４及び非特許文献１）が知られている。これらの操作では、ＰＣＲ法のように反応液を昇降温する必要がなく、またＲＮＡの逆転写とその後の増幅反応を分けて実施する必要がない。具体的には、（１）特定塩基配列部分の３’端領域に相補的な第一のＤＮＡプライマーが標的ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により特定塩基配列部分に相補的なｃＤＮＡを合成し、特定塩基配列部分とのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、（２）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列部分の５’端領域と相同的な配列を有する第二のＤＮＡプライマーがハイブリダイズし（ここで第二又は第一のＤＮＡプライマーの５’端には、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列部分又は前記特定塩基配列部分に相補的な配列のＲＮＡを転写可能な、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、及び（４）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写する工程（ここで、該ＲＮＡが前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となり、連鎖的にＲＮＡ増幅産物が生成される）からなる操作法である。

以上のような標的ＲＮＡの増幅操作に用いるＤＮＡプライマーは、既知の高ストリンジェント条件で特定塩基配列部分とハイブリダイズするように設計される。しかし、標的ＲＮＡのみならず、特定塩基配列部分と類似の塩基配列部分を有する非標的ＲＮＡが試料に含まれる場合、特定塩基配列部分のみを完璧に区別して増幅できるプライマーの設計は一般に困難であり、プライマー設計以外で非標的ＲＮＡの増幅防止を講じる必要がある。例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ等は生物種間で共通に保持されており、種特異的な又は属特異的な検出のための標的ＲＮＡとして好適である。しかし、これらＲＮＡは類縁の生物種間で配列が酷似している場合があり、標的ＲＮＡに特異的な塩基配列部分をＤＮＡプライマーの結合領域（プライミング領域）として選択しても、試料中に酷似した塩基配列部分を有する非標的ＲＮＡが存在するとＤＮＡプライマーがミスプライミングを起こし、非標的ＲＮＡが増幅される可能性がある。

加えて、本発明者らの知見では、試料中に標的ＲＮＡの量と比較して大過剰量の非標的ＲＮＡが混在すると、ＤＮＡプライマーの標的ＲＮＡへのプライミングと非標的ＲＮＡへのミスプライミングはもとより、その後の逆転写等において標的ＲＮＡとの反応と非標的ＲＮＡとの反応が競合し、標的ＲＮＡの反応が抑制されて標的ＲＮＡの検出感度が低下することがある。即ち、ＤＮＡプライマーの、標的ＲＮＡとの反応と非標的ＲＮＡとの反応等は、ＤＮＡプライマー、酵素、基質類をとりあう競合反応であるため、ＤＮＡプライマーと非標的ＲＮＡとの反応等を抑制することで、標的ＲＮＡの検出感度の低下を防止できるのである。

さらに言えば、特定塩基配列部分の増幅産物とそれ以外の増幅産物がその長さと塩基配列において類似している場合には、前者のみを識別して検出するのは困難である。このような場合、特定塩基配列部分の増幅産物以外を検出しないようにする方法として、非標的核酸を非標識プローブによりキャッピングする方法が提案されている（特許文献５）。しかしながら、この方法は検出の段階で適用されるものであって、増幅操作における特定塩基配列部分以外の塩基配列部分の増幅による標的ＲＮＡの検出感度の低下することは避けられない。

特許第２６５０１５９号 特許第３１５２９２７号 特許第３２４１７１７号 特開２０００−０１４４００号公報 特許第２７８３５６８号 特開２００８−１６１１６５ 特開２００３−１５９１００ Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，１２４７−１２５２（２００３）．

試料に対し、非標的核酸に対してＤＮＡプライマーがミスプライミングする部位にプライマーに競合して結合するＤＮＡを添加することにより、上記したような標的ＲＮＡの検出感度の低下を防止する方法も提案されている（特許文献６及び７）。しかしながら、この方法を実施するには標的ＲＮＡへのＤＮＡプライマーのプライミングが影響を受けないように厳密に温度制御を行う必要があるため、そもそも比較的低温で実施される前記一定温度で実施するＲＮＡ増幅操作には適していないという課題がある。また、わずかでもプライマーの非標的ＲＮＡへのミスプライミングが生じると、非標的ＲＮＡに由来する増幅産物はＤＮＡプライマーに相補的な塩基配列を含むため、前記方法を採用していても、以後ＤＮＡプライマーは標的ＲＮＡと非標的ＲＮＡを区別することができず、非標的ＲＮＡに由来する増幅産物が指数的に増幅されてしまう。このように、前記提案された方法では、わずかでもＤＮＡプライマーのミスプライミングが生じてしまった後には、標的ＲＮＡの検出感度の低下を防止することはできない。

本発明は、前記したＲＮＡの増幅操作に用いるＤＮＡプライマーが標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分および非標的ＲＮＡにミスプライミングすることによって、標的ＲＮＡの検出感度が低下することを防止するためになされたものである。具体的には、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分（特定塩基配列部分）をその３’端領域に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を利用して逆転写する工程を含む増幅操作に供するための試料処理法であって、標的ＲＮＡ及び非標的ＲＮＡを含む試料に対し、高ストリンジェントな条件で特定塩基配列部分にはハイブリダイズせず、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡとのみハイブリダイズする一種以上のオリゴヌクレオチドＤＮＡ及びリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を同時に又は順次添加して試料中の標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡとオリゴヌクレオチドＤＮＡのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、形成された２本鎖のＲＮＡ部分を分解する試料処理法である。

また本発明は、特定塩基配列部分をその３’端領域に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を利用して逆転写する工程を含む増幅操作に供するための試料処理試薬であって、高ストリンジェントな条件で特定塩基配列部分にはハイブリダイズせず、標的ＲＮＡ中の他の部分又は非標的ＲＮＡとのみハイブリダイズする一種以上のオリゴヌクレオチドＤＮＡ及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素とからなる試料処理試薬である。以下、本発明を詳細に説明する。

なお、本明細書においてヌクレオチド又は核酸とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合からなるヌクレオチド（ＲＮＡ及びＤＮＡの双方を含む）のことをいう。また、一般的にそのオリゴマー（例えば、２から１００塩基程度）をオリゴヌクレオチド、ポリマー（例えば、１００塩基以上）をポリヌクレオチドと呼ぶこともあるが、本明細書では特に断った場合を除いてこれらを区別しない。さらに、その一部又は全部が人工的な構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基対結合をする限り、本発明のヌクレオチド又は核酸の範疇に含まれる。ヌクレオチド誘導体の中には、核酸の増幅操作において ３’端からの酵素的な伸長反応を防ぐために ３’端水酸基を化学的に修飾（例えばアミノ化、リン酸化、ビオチン化、ハロゲン化、蛍光色素化など）した核酸、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）及びこれらを組み合わせたものを例示することができるが、本発明はこれに限定されるものではない。

特定塩基配列部分は、ＲＮＡ増幅操作によって増幅される、標的ＲＮＡの一部分であって、標的ＲＮＡに特異的で、少なくとも他のＲＮＡ（非標的ＲＮＡ）には見いだすことのできない部分である。特定塩基配列部分はその全てに渡る部分の塩基の配列が標的ＲＮＡに特異的である必要はなく、増幅操作で使用されるＤＮＡプライマーのプライミング部位が特異的であれば良い。増幅操作の最中に、又は増幅操作の後に特定塩基配列の検出を行う場合には、例えば特定塩基配列中の検出用プローブのハイブリダイズ部位もまた、特異的であることが好ましい。

上記本発明の試料の前処理方法は、ＲＮＡの増幅操作に供する試料を処理するための方法である。本発明でいうＲＮＡ増幅操作とは、前記特定塩基配列の３’端領域に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を利用して逆転写する工程を含む増幅操作をいい、前述したＲＴ−ＰＣＲ法やＲＴ−ＬＡＭＰ法等の増幅操作であっても良い。しかし、一定温度でＲＮＡを増幅するＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法等が好ましいＲＮＡの増幅操作として例示できる。ＴＲＣ法であれば、より具体的には（１）特定塩基配列部分の３’端領域に相補的な第一のＤＮＡプライマーが標的ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により特定塩基配列部分に相補的なｃＤＮＡを合成し、特定塩基配列部分とのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、（２）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列部分の５’端領域と相同的な配列を有する第二のＤＮＡプライマーがハイブリダイズし（ここで第二又は第一のプライマーの５’端には、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列部分又は前記特定塩基配列部分に相補的な配列のＲＮＡを転写可能な、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、及び（４）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写する工程（ここで、該ＲＮＡが前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となり、連鎖的にＲＮＡ増幅産物が生成される）という各工程からなる。このプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する部位であるが、種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列が公知であり、本発明では特に制限なくこれら公知のプロモーターを使用することができるが、分子生物学的実験などで通常用いられている、入手が容易なＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、又はＴ３プロモーターが好ましいプロモーターとして例示できる。プロモーターは、転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。

本発明中のＤＮＡプライマーとは、核酸増幅反応において、標的ＲＮＡ、あるいは標的ＲＮＡ由来のｃＤＮＡ鎖又はＲＮＡ、とハイブリダイズし、核酸増幅反応を開始するのに必要なヌクレオチドのことをいう。さらに詳細には、本発明中の第一のＤＮＡプライマーとは、標的ＲＮＡ内の特定塩基配列の３’端領域にハイブリダイズする塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをいう。本発明中の第二のＤＮＡプライマーとは、標的ＲＮＡ内の特定塩基配列と相補的な配列の３’端領域にハイブリダイズする塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、第一及び第二のプライマーは通常１０から１００塩基、好ましくは１５から３０塩基の鎖長を有するＤＮＡであるが、特に限定されるものではない。また、第一あるいは第二のＤＮＡプライマーのいずれかは、その５’端にプロモーター配列が付加されてなる。

本発明は、標的ＲＮＡと非標的ＲＮＡを含む試料を上記したようなＲＮＡ増幅操作に供するためのものであり、かかる試料に対し、高ストリンジェントな条件で特定塩基配列部分にはハイブリダイズせず、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡとのみハイブリダイズする一種以上のオリゴヌクレオチドＤＮＡ及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を同時に又は順次添加するものである。高ストリンジェントな条件とは、ワトソン・クリック塩基対が正確に形成可能な条件を意味し、一例として特許文献４又は非特許文献１に記載された核酸増幅反応条件や、高温条件（例えば５０℃以上）、を例示することができるがこれに限定されるものではない。

本明細書中で、単にハイブリダイズすると記載する場合は、高ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能であることを指す。前記した好ましいＲＮＡ増幅操作に供する試料を得るための具体的な態様について説明すれば、オリゴヌクレオチドＤＮＡは、前記増幅操作における第一のプライマー又は第二のプライマーが特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡに対してミスプライミングすることにより生じ得るＲＮＡ増幅産物とハイブリダイズするものである。このようなミスプライミングすることにより生じ得るＲＮＡ増幅産物とは、ＲＮＡの増幅操作において、標的ＲＮＡを増幅するために用いられたプライマーの一部が過剰量の非標的ＲＮＡ等にハイブリダイズし、その結果、プライマーからの酵素的な伸長が生じることが実験的あるいは理論的に推定された特定の塩基配列部分やそれを含むＲＮＡを意味する。

しかし、前記のようにデザインされたオリゴヌクレオチドＤＮＡは、試料中の特定塩基配列部分以外、即ち非標的ＲＮＡや標的ＲＮＡ中の特定塩基配列以外の部分にハイブリダイズしてＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成する。従って、オリゴヌクレオチドＤＮＡに先立って、同時に又はその後に試料に添加されるＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡは分解されることになる。オリゴヌクレオチドＤＮＡは、増幅操作のためのＤＮＡプライマーのミスプライミング領域以外の領域にハイブリダイズするよう設計することが最も好ましい。

前記ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性を有するものであれば特に制限はないが、後述するようにＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といったＲＮＡ増幅操作と同時に試料を処理する場合には、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用することが好ましい。即ち、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅＨ活性及びＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の三つの活性を有する酵素を試料処理のためのＲＮａｓｅＨとして使用すれば、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するのみで、本発明の処理とＲＮＡ増幅操作の双方を実施することが可能になる。

かかる酵素として、分子生物学的実験などで汎用されているＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素及びこれらの誘導体から選ばれるものが好ましいが、ＡＭＶ逆転写酵素とその誘導体が最も好ましいものとして例示できる。また、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、及びこれらの誘導体を例示できる。

本発明の処理方法は、前述の通り、増幅操作における逆転写の工程を実施するために必要な試薬とオリゴヌクレオチドＤＮＡ等を共存させることによって、増幅操作と同時に試料を処理することもできる。特にＲＮＡの増幅操作として好ましいＴＲＣ法等では、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を増幅操作のためにも使用することから、増幅操作を実施する反応液の中に、単にオリゴヌクレオチドＤＮＡを添加するだけで、標的ＲＮＡの検出感度の低下を防止できるＲＮＡの増幅を実現することが可能になる。

本発明で使用するオリゴヌクレオチドＤＮＡは、通常１０から１００塩基程度の鎖長、好ましくは１５から３０塩基程度の鎖長を有するＤＮＡであれば良いが、当該鎖長に限られるものではない。また、その一部、もしくは全体が人工的な構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基対結合をすることができる限り、本発明において特に制限なく使用することができる。

オリゴヌクレオチドＤＮＡは、ＲＮＡ増幅操作におけるＤＮＡプライマーとしての機能をも有する。すなわち、オリゴヌクレオチドＤＮＡが例えば非標的ＲＮＡとミスプライミングを生じ、オリゴヌクレオチドＤＮＡを含むＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖が形成されると、それに対してＲＮＡ増幅操作で使用されるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが作用し、オリゴヌクレオチドＤＮＡの伸長反応が生じることになる。そこで本発明では、オリゴヌクレオチドＤＮＡの３’端水酸基からの伸長反応を防ぐため、その３’端が化学的に修飾されているものを用いることが好ましい。化学的な修飾として、３’端の水酸基をアミノ基とすることが例示できる。

本発明によって処理した試料は、これを増幅操作に供して増幅した後、標的ＲＮＡの検出を行った場合に検出感度の低下が防止される。標的ＲＮＡの検出は、具体的には特定塩基配列部分の検出であり、例えば増幅操作の後に電気泳動等によって検出する、いわゆるツリーアッセイ等によって検出する、等が例示できる。特に、特定塩基配列部分と相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計した蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを、増幅操作を終了した後、又は増幅操作中の試料に添加し、その蛍光特性の変化を測定することが、操作の簡便性等の面から好ましい検出方法として例示できる（例えば非特許文献１等）。この蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとしては、より具体的にオキサゾールイエロー等の公知のインターカレーター性蛍光色素を適当な長さのリンカーを介してＤＮＡに結合したインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが例示できる。

本発明は、種々のＲＮＡを標的ＲＮＡとして適用することが可能である。中でも、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ等、生物種間で共通性が保持されており、類縁の生物種間で配列が酷似している場合があるために注意深くＤＮＡプライマーのプライミング領域を選択しても、試料中に酷似した塩基配列部分を有する非標的ＲＮＡが過剰に存在するとＤＮＡプライマーがミスプライミングを起こして標的ＲＮＡの検出感度が低下する可能性のある標的ＲＮＡに適用することが効果的である。

そのような例として、細菌のｒＲＮＡを標的ＲＮＡとして増幅、検出する場合に、試料中に近縁種の細菌のｒＲＮＡが含まれている場合を例示することができる。両者は類似した塩基配列部分を有するため、注意深く目的の細菌ｒＲＮＡの増幅のためのＤＮＡプライマーのプライミング領域を選択しても、試料中に大過剰の類似の細菌由来のｒＲＮＡが含まれているとＤＮＡプライマーがミスプライミングを起こして標的ＲＮＡの検出感度が低下する可能性がある。

本発明は、例えば一種以上のオリゴヌクレオチドＤＮＡ及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素とからなる反応液を調製しておけば、これを試料に添加することによって実施することが可能である。むろん、オリゴヌクレオチドＤＮＡの溶液とＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素の溶液を別個に用意しておき、実施の際に試料に添加することもできる。

本発明の原理を以下、簡単に説明する。試料中に非標的ＲＮＡが含まれる場合、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡとのみハイブリダイズする一種以上のオリゴヌクレオチドＤＮＡが、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡにハイブリダイズし、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡとオリゴヌクレオチドＤＮＡのハイブリッドが形成される。前記ハイブリッド中の標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡはＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により特異的に分解される。このため、ＤＮＡプライマーがミスプライミングしうるＲＮＡが分解され、これを増幅操作した場合には、結果的に標的ＲＮＡの検出感度が低下するという現象を抑制することが可能となる。

むろん、本発明の方法をＲＮＡ増幅の操作と同時に実施する場合、特に好適な場合には、非標的ＲＮＡに由来するＲＮＡ増幅産物に対してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドＤＮＡを設計して試料に添加しておくことで、オリゴヌクレオチドＤＮＡがＲＮＡ増幅産物に結合することによって前記同様の効果を達成し得る。

本発明によれば、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡとのみハイブリダイズする一種以上のオリゴヌクレオチドＤＮＡ、及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を利用して、ＲＮＡを増幅して検出する方法における非特異的増幅反応を抑制し、検出の特異性を向上させることができる。さらには非標的ＲＮＡが混在する試料において、標的ＲＮＡの検出感度を向上させることができる。本発明のＲＮＡ検出方法は、生化学・分子生物学・医療分野などに提供することができる。

さらに、本発明はＲＮａｓｅＨ活性あるいはＲＮａｓｅＨ活性を付随的に有する酵素を利用する核酸増幅法に非標的ＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドＤＮＡを添加するだけで効果があり、特殊な機器、煩雑な作業を要することなく、簡便に特異性を向上させることができる。

各オリゴヌクレオチド（配列番号３−１３）のモデルＲＮＡ１（配列番号１）及びＲＮＡ２（配列番号２）へのハイブリダイズ可能領域の概略図。 モデルＲＮＡ１を試料として，１−１０μＭの配列番号７−１３のオリゴヌクレオチドをＲＮＡ増幅反応系に添加して反応させ，生成した増幅反応物の電気泳動分析による解析結果。図中，ＲＶ２，６，１７，１８，１９，２０，２５は配列番号７〜１３のオリゴヌクレオチド及び添加濃度を示し，ｎｏｎｅは前記オリゴヌクレオチドを加えなかった対照区。前記オリゴヌクレオチドを添加しなかった対照区では，矢印で示したＲＮＡのバンドが認められるのに対し，添加した系では，矢印の領域に増幅産物は認められない。 モデルＲＮＡ２を試料として，１μＭの配列番号７のオリゴヌクレオチドを増幅反応系に添加若しくは添加することなく反応させ，生成した増幅反応物の電気泳動分析による解析結果。図中ＲＶ２５は配列番号７のオリゴヌクレオチドを添加したもの（ｎ＝２），ｎｏｎｅは添加しなかった対照区（ｎ＝２）。モデルＲＮＡ２ではＲＶ２５オリゴヌクレオチド（配列番号７）を添加しても，標的領域の核酸増幅に影響がないことがわかる。

以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。

モデルＲＮＡ１を用いた検証
モデルＲＮＡ１（配列番号１）を試料として，下記の記載の標的ＲＮＡがモデルＲＮＡ２（配列番号２）である核酸増幅系に供し，増幅産物を解析した。

（１）定法に従いインビトロ転写によりモデルＲＮＡ１（配列番号１）を調製し、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用い、１０^８コピー／５μＬになるように希釈し、これをＲＮＡ試料として使用した。

（２）以下の組成の反応液２０．０μＬを０．５ｍＬ容チューブに分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。

各反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後（３０μＬ中）の最終濃度）は以下のとおり。

６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１７．０ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１．０ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
１．０μＭ モデルＲＮＡ２（配列番号２）増幅用の第一のプライマー（配列番号３）
１．０μＭ モデルＲＮＡ２（配列番号２）増幅用の第二のプライマー（配列番号４：当該プライマーはその５’端にＴ７プロモーター配列が付加されている）
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（配列番号５：当該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基はアミノ化されている）
１４．０ｎＭ モデルＲＮＡ１及び２共通検出用のインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（配列番号６）
６．０Ｕ リボヌクレアーゼインヒビター
１３．０％ ＤＭＳＯ
１〜１０μＭ ＲＶ２５（配列番号７），ＲＶ６（配列番号８），ＲＶ１９（配列番号９），ＲＶ２０（配列番号１０），ＲＶ１７（配列番号１１），ＲＶ２（配列番号１２），ＲＶ１８（配列番号１３）（各反応系に前記オリゴヌクレオチドの何れか１つ若しくはそれらの組み合わせを添加）
容量調整用蒸留水
ＲＶ２５（配列番号７），ＲＶ６（配列番号８），ＲＶ１９（配列番号９），ＲＶ２０（配列番号１０），ＲＶ１７（配列番号１１），ＲＶ２（配列番号１２），ＲＶ１８（配列番号１３）はモデルＲＮＡ１（配列番号１）とはハイブリダイズするが，モデルＲＮＡ２（配列番号２）を試料とした配列番号３，配列番号４及び配列番号５のオリゴヌクレオチドを用いたＲＮＡ増幅系の増幅領域にはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドＤＮＡであり，該オリゴヌクレオチドＤＮＡの配列は第一（配列番号３）および第二のＤＮＡプライマー（配列番号４）がモデルＲＮＡ１（配列番号１）に結合しうる箇所を考慮し設計したものである。また、これらのオリゴヌクレオチドＤＮＡの３’端の水酸基はアミノ化されている。

尚，各オリゴヌクレオチド（配列番号３−１３）のモデルＲＮＡ１（配列番号１）及びモデルＲＮＡ２（配列番号２）への結合領域の概略を図１に示した。

（３）（２）の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成の酵素溶液５．０μＬを添加し、４３℃で３０分間反応させた。

酵素溶液の組成（反応時（３０μＬ中）の最終濃度）
２．０％ ソルビトール
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
３．６μｇ 牛血清アルブミン
容量調整用蒸留水
（４）反応後のサンプルは以下のいずれかの方法で電気泳動した。
Ａ．反応後のサンプル１μＬを尿素変性５％ポリアクリルアミドゲル（１５０Ｖ，３０分間）
Ｂ．反応後のサンプル０．５μＬを４％アガロースゲル（１００Ｖ、１時間）
電気泳動後のゲルをＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ＩＩ （タカラバイオ社）にて染色し、トランスイルミネーターで検出した。結果を図２に示す。大過剰のモデルＲＮＡ１をサンプルとすると、前記オリゴヌクレオチドＤＮＡ（図１参照）を添加しない場合、モデルＲＮＡ１に由来する長さの異なる２種の非特異ＲＮＡ産物が増幅されており（図２の矢印）、これは第一および第二のプライマーが増幅反応中にモデルＲＮＡ１に対し図１のようにミスプライミングしてしまい、非特異的増幅反応が起こった結果と推定された。図１に示したように、ＲＶ１９（配列番号９）およびＲＶ２０（配列番号１０）はプライマーのミスプライミング領域に設定されており、プライマーのミスプライミングと競合する効果も期待されたが、図２に示したように、ＲＶ１９（配列番号９）およびＲＶ２０（配列番号１０）を添加しても２種の非特異ＲＮＡ産物を部分的に抑制することはできたが、完全に抑制することはできなかった。

一方、ミスプライミング領域を含まない、ミスプライミング領域の内側に設計されたオリゴヌクレオチドＤＮＡを添加した際には、２種の非特異ＲＮＡ産物の生産は顕著に抑制された。
すなわち、前記オリゴヌクレオチドＤＮＡは、第一のプライマーおよび／または第二のプライマーの非標的ＲＮＡへのミスプライミングにより生じるＲＮＡのうち前記プライマーのミスプライミング領域を含まない領域で設計することが特に効果的であることが示された。

モデルＲＮＡ２を用いた検証
実施例１と同様に、モデルＲＮＡ２（配列番号２）を試料として，実施例１に記載した標的ＲＮＡがモデルＲＮＡ２（配列番号２）である核酸増幅系に供し，増幅産物を解析した。

モデルＲＮＡ２を１０^４コピー／５μＬになるように調製し、これをＲＮＡ試料として使用した。次に実施例１と同様に前記ＲＮＡ試料を反応させた。ただし、オリゴヌクレオチドＤＮＡとして１．０μＭ のＲＶ２５（配列番号２）を反応系に添加した。電気泳動後のゲルのＲＮＡの検出は実施例１に準じた。結果を図３に示す（図３の矢印の部分が標的ＲＮＡの増幅産物）。前記オリゴヌクレオチドＤＮＡを添加して反応させても標的ＲＮＡを感度よく特異的に検出可能であることがわかる。

夾雑物共存下での選択的増幅
モデルＲＮＡ２を５０コピー／５μＬ、モデルＲＮＡ１を１０^６コピー／５μＬとなるよう調製し、これをＲＮＡ試料として使用した。次に実施例１と同様に前記ＲＮＡ試料を反応させた。ただし、オリゴヌクレオチドＤＮＡとしてＲＶ２５（配列番号７）、ＲＶ６（配列番号８）、ＲＶ１７（配列番号１１）、ＲＶ２（配列番号１２）を１．０μＭとなるように反応系に添加した。また、反応チューブは直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、酵素溶液添加と同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に２０分間測定した。酵素添加時の時刻を０分としたとき、反応２０分後の反応液の蛍光強度比（２０分後の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）を表１に示す。前記オリゴヌクレオチドＤＮＡを添加することで、蛍光強度比の増加が観察され、１．２を超えた場合にモデルＲＮＡ２が検出されたと判断した。前記オリゴヌクレオチドＤＮＡを添加することによりモデルＲＮＡ１存在下におけるモデルＲＮＡ２の検出感度が向上していることが明らかとなった。

以上に示された実施例の結果から，本法を用いることで塩基配列がにかよったＲＮＡが共存した場合でも，一方のＲＮＡを選択的に増幅検出できることが示された。

Claims (10)

1. 標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分（特定塩基配列部分）をその３’端領域に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を利用して逆転写する工程を含む増幅操作に供するための試料処理法であって、標的ＲＮＡ及び非標的ＲＮＡを含む試料に対し、高ストリンジェントな条件で特定塩基配列部分にはハイブリダイズせず、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡとのみハイブリダイズする一種以上のオリゴヌクレオチドＤＮＡ及びリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有する酵素を同時に又は順次添加して、試料中の標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡとオリゴヌクレオチドＤＮＡのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、形成された２本鎖のＲＮＡ部分を分解する試料処理法。
2. 前記増幅操作が、（１）特定塩基配列部分の３’端領域に相補的な第一のＤＮＡプライマーが標的ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により特定塩基配列部分に相補的なｃＤＮＡを合成し、特定塩基配列部分とのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、（２）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列部分の５’端領域と相同的な配列を有する第二のＤＮＡプライマーがハイブリダイズしＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、２本鎖ＤＮＡを生成する工程、及び（４）前記２本鎖ＤＮＡがＰＣＲ法によって連鎖的に増幅される工程、からなることを特徴とする、請求項１に記載の試料処理法。
3. 前記増幅操作が、（１）特定塩基配列部分の３’端領域に相補的な第一のＤＮＡプライマーが標的ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により特定塩基配列部分に相補的なｃＤＮＡを合成し、特定塩基配列部分とのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、（２）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成する工程、（３）該１本鎖ＤＮＡに、前記特定塩基配列部分の５’端領域と相同的な配列を有する第二のＤＮＡプライマーがハイブリダイズし（ここで第二又は第一のプライマーの５’端には、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列部分又は前記特定塩基配列部分に相補的な配列のＲＮＡを転写可能な、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、及び（４）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写する工程（ここで、該ＲＮＡが前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となり、連鎖的にＲＮＡ増幅産物が生成される）からなることを特徴とする、請求項１に記載の試料処理法。
4. 試料に対し、ＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を含む前記増幅操作に要する試薬、前記オリゴヌクレオチドＤＮＡ及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を添加することにより、増幅と同時に前記処理を実施することを特徴とする、請求項１〜３に記載の試料処理法。
5. 前記オリゴヌクレオチドＤＮＡが、その３’端水酸基からの酵素的な伸長反応を防ぐために化学的に修飾されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の試料処理法。
6. 前記化学的修飾が、アミノ基であることを特徴とする、請求項５に記載の試料処理法。
7. 前記オリゴヌクレオチドＤＮＡが、前記増幅操作において前記第一のＤＮＡプライマー又は第二のＤＮＡプライマーが標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡに対してミスプライミングすることにより生じ得るＲＮＡ増幅産物とハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１又は３に記載の試料処理法。
8. 標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分（特定塩基配列部分）をその３’端領域に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を利用して逆転写する工程を含む増幅操作に供するための試料処理試薬であって、高ストリンジェントな条件で特定塩基配列部分にはハイブリダイズせず、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列部分以外の部分又は非標的ＲＮＡとのみハイブリダイズする一種以上のオリゴヌクレオチドＤＮＡ及びリボヌクレアーゼ Ｈ活性を有する酵素とからなる試料処理試薬。
9. 前記オリゴヌクレオチドＤＮＡが、その３’端水酸基からの酵素的な伸長反応を防ぐために化学的に修飾されていることを特徴とする、請求項８に記載の試料処理試薬。
10. 前記化学的修飾が、アミノ基であることを特徴とする、請求項９に記載の試料処理試薬。

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