CN112553378B - 检测2019-nCoV的试剂、试剂盒及应用 - Google Patents

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    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了检测2019‑nCoV的试剂、试剂盒及应用。该检测2019‑nCoV的试剂，包含扩增引物对和/或crRNA；所述扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.13所示。该检测2019‑nCoV的试剂，可以实现同管一步法稳定、高灵敏地检测2019‑nCoV：无需对RT‑RPA扩增产物实行移液操作，从而去除了移液操作产生的扩增产物气溶胶污染的风险，适合于规模化检测。

Description

检测2019-nCoV的试剂、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及检测2019-nCoV的试剂、试剂盒及应用。
背景技术
目前新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)核酸检测普遍采取real-time RT-PCR的方法，自检测试剂盒供应量上来后，不少案例发现，试剂盒检测为阴性的，但是实际已经感染新冠病毒，而且，real-time RT-PCR检测耗时长、操作复杂，难以满足疑似病例排查需求。因此，对检测试剂盒的灵敏性、检测速度、价格、操作简便性等方面存在改进需求。
近年来，一种发展起来的以成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR)为特征的基因检测技术发展起来。CRISPR是发现于细菌和古细菌的调控型RNA，含与特定基因互补序列的CRISPR和CRISPR相关蛋白(Cas)形成的复合体具有针对特定基因的内切酶效应，是近年来十分热门和有前景的基因编辑工具。在CRISPR/Cas系统中，Cas蛋白在CrRNA(CRISPR-derivedRNA，其基本构成为：锚定序列+向导序列)的引导下，识别目标序列后启动“附带切割”活性。一般的CRISPR/Cas系统用于DNA靶序列切割，2016年张锋研究组首次描述了RNA靶向CRISPR酶，现在称为Cas13a，可以用于切割细菌细胞中的特殊RNA序列。Cas13a与DNA靶向CRISPR酶(如Cas9和Cpf1)不同，这种酶在切割其靶向RNA后可保持活性，而且可能表现“旁切割”(collateral cleavage)，继续切割其它非靶向RNA。这意味着Cas13a检测到其靶标后可攻击所有RNA。这种活性可以被用作一个自动放大检测器，作为一种低成本的诊断已成为一种可能。到目前为止，共发现来源于三种不同种属来具有的旁切割效应的Cas13蛋白，包括：PsmCas13b、LwaCas13a和Cca13b，而且它们之间还有不同的旁切割碱基序列的偏好性。研究结果表明：CRISPR/Cas13和RPA扩增技术(等温扩增技术)结合起来的新系统能够以极低浓度检测单RNA和DNA分子，可将检测的灵敏度提高到埃摩尔(aM)，而且检测总时间可控制在40min内。
2020年2月，张锋教授团队发布了使用基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技术检测新型冠状病毒的详细操作流程，其技术方案的特征是用CrRNA/LwaCas13a分别检测2019-nCoVS基因和ORF1ab。其检测是通过两步法实现的：第一步是加入提取的2019-nCoV RNA样品进行RT-RPA预扩增,。第二步是取一定量的扩增产物加入含T7转录酶的CrRNA/LwaCas13a检测液中，在将第一步的扩增产物重新转录成RNA的基础上检测目标基因。虽然相比PCR方法这种两步法的检测时间较短，但缺陷也很明显：不仅增加了操作次数，而且预扩增产物开管取样过程极易因气溶胶污染会导致检测结果呈假阳性的风险。鉴于两步法造成的假阳性风险和操作的不便利很难在临床上推广，因此对于加入RNA检测样本后无需移管操作且可在同一管内实现RPA扩增基础上的CRISPR检测的一步法反应(one-pot reaction)的技术或方法是有客观需求的。但至目前为止，只发现张峰在RPA+CAS13联用的技术方案中在检测DNA基因靶标时用到一步法检测；而在检测包括2019-nCoV核酸在内的单链RNA基因靶标方面，现有公开的文献方法都是两步法，没有发现提供检测单链RNA的一步法操作的技术方案。
发明内容
为了克服现有引物对/CrRNA不能有效用于一步法检测2019-nCoV的问题，本发明的第一方面的目的，在于提供一种检测2019-nCoV的试剂。
本发明的第二方面的目的，在于提供上述试剂在制备COVID-19诊断和/或预后评估的产品中的应用。
本发明的第三方面的目的，在于提供一种包含检测2019-nCoV的试剂的试剂盒。
本发明的第四方面的目的，在于提供第一方面的试剂或第三方面的试剂盒在非诊断目的的2019-nCoV检测中的应用。
本发明的第五方面的目的，在于提供一种非诊断目的的2019-nCoV检测方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种检测2019-nCoV的试剂，包含扩增引物对和/或crRNA；
所述扩增引物对用于扩增2019-nCoV ORF1ab基因特定片段；
所述2019-nCoV ORF1ab基因特定片段的序列如2019-nCoV基因(登录号：MW281864.1)的第13302～13396位核苷酸序列所示；
所述扩增引物对包括正向引物和反向引物；
所述反向引物包含T7启动子序列；
所述crRNA包含锚定序列和向导序列，所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述向导序列与所述2019-nCoV ORF1ab基因的负链特异性识别。
优选的，所述T7启动子的序列为TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.14)或GAAATTAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.15)。
优选的，所述扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.13所示。
本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的试剂在制备COVID-19诊断和/或预后评估的产品中的应用。
本发明的第三方面，提供一种包含第一方面的试剂的试剂盒。
所述试剂盒还包括Cas蛋白、信号报告探针。
所述Cas蛋白优选为Cas13a；更优选为LwaCas13a。
所述信号报告探针包含核酸序列，所述核酸序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。
所述信号报告探针的核酸序列为UUUUU。
所述试剂盒还包括RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、NTPs、醋酸镁、氯化镁。
本发明的第四方面，提供第一方面的试剂和/或第三方面的试剂盒在非诊断目的的2019-nCoV检测中的应用。
本发明的第五方面，提供一种非诊断目的的2019-nCoV检测方法，包括如下步骤：
(1)样本提取：取待测样本，提取基因组；
(2)如M1)或M2)：
M1)：一步检测：将步骤(1)提取的基因组与上述扩增引物对、crRNA、Cas蛋白、信号报告探针、RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、NTPs、醋酸镁、氯化镁混合，进行RT-RPA扩增和CRISPR反应检测，读取检测信号，即得；
M2)：两步检测：
M21)RT-RPA扩增：将步骤(1)提取的基因组与上述扩增引物对、RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液混合，进行RT-RPA扩增，得到扩增产物；
M22)CRISPR检测：将步骤M21)得到的扩增产物与上述crRNA、Cas蛋白、信号报告探针、NTPs、醋酸镁、氯化镁混合，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，即得。
步骤M1)检测的条件优选为36～38℃下恒温反应25～30min。
步骤M21)中RT-RPA扩增的条件优选为36～38℃下恒温反应25～30min。
步骤M22)中检测的条件优选为36～38℃下恒温反应25～30min。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种检测2019-nCoV的试剂，可以实现同管一步法稳定、高灵敏地检测2019-nCoV：无需对RT-RPA扩增产物实行移液操作，从而去除了移液操作产生的扩增产物气溶胶污染的风险，适合于规模化检测；
本发明提供的非诊断目的的2019-nCoV检测方法，反应全程在37℃左右的温度下进行，不需要如PCR扩增那样需要精细的温控元件及复杂的温度变化，非常适合基层单位用相对廉价的即时检测(POCT)设备进行检测，同时，其检测速度快，可在30min内有检测结果。
附图说明
图1是不同引物/CrRNA组两步法检测ORF1ab基因效果图。
图2是不同引物/CrRNA组一步法检测ORF1ab基因效果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1合成检测2019-nCoV的引物对和CrRNA
委托广州博徕斯生物科技股份有限公司合成本申请的引物对和CrRNA、文献1(Development and evaluation of a rapid CRISPR-based diagnostic for COVID-19，PLOS Pathogens，https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008705August 27,2020)与文献2(A protocol for detection of COVID-19using CRISPR diagnostics(v.20200214))公开的两步法检测ORF1ab基因用到的引物对和CrRNA，具体信息如表1和表2所示：本申请提供的引物对将T7启动子序列添加在反向引物(reverse primer)的5’端，而文献1和文献2提供的引物对中T7启动子序列位于正向引物(forward primer)5’端；本申请提供的CrRNA3中的向导序列(spacer area)识别RNA靶基因的负链，而文献1和文献2提供的CrRNA1、CrRNA2中的向导序列识别RNA靶基因的正链。合成的引物对用无RNA酶纯化水溶解成母液(24μM)，合成的CrRNA用无RNA酶纯化水溶解成40X母液(900nM)，分装后贮存于-20℃备用。
表1不同扩增ORF1ab基因特定片段的RT-RPA引物对信息
Figure BDA0002867537210000041
Figure BDA0002867537210000051
注：下划线为T7聚合酶启动子识别区；靶序列位置根据NCBI的2019-nCoVSequence ID:MW281864.1(Length:29871)的序列进行确定。
表2不同针对ORF1ab基因LwaCas13a CrRNA序列信息
Figure BDA0002867537210000052
注：靶序列位置根据NCBI的2019-nCoV Sequence ID:MW281864.1(Length:29871)的序列进行确定。
实施例2合成Cas13酶使用的ssRNA报告探针
委托广州博徕斯生物科技股份有限公司合成Cas13酶使用的ssRNA报告探针，序列信息如表3所示。合成的ssRNA报告探针分别用无RNA酶纯化水溶解成母液(20μM)，分装后贮存于-20℃备用。
表3 LwaCas13a蛋白酶使用的报告探针具体序列信息
Figure BDA0002867537210000053
Figure BDA0002867537210000061
实施例3不同引物/CrRNA组合两步法检测效果
1.2019-nCoV RNA样本的制备
取MS噬菌体假病毒样品(含2019-nCoV ORF1ab+E+N基因正链RNA,MS噬菌体假病毒样品来源于广州邦德盛公司，已附每毫升样液中基因组拷贝数信息，货号：BDS-IQC-276)，用天根生化公司的病毒RNA抽提试剂盒按其说明书操作提取RNA，最后用无RNA酶纯化水定容至50、25、5拷贝/uL并分装。将不同拷贝数的待测样本-20℃贮存备用。
另取qPCR Human Reference Total RNA样本(来源于Clontech公司，636690)，用无RNA酶纯化水混匀定容至1ug/uL，分装后-20℃贮存备用。
2.利用不同引物/CrRNA组进行两步法检测ORF1ab基因效果
(1)RT-RPA扩增
分别采用杭州众测生物科技有限公司的RT-RPA试剂盒(50μL体系)用不同的引物对(文献1的引物对、文献2的引物对、本申请的引物对)对不同拷贝数的COVID-19RNA(终浓度分别为0、5、25、50、100拷贝/管)进行RT-RPA扩增，分别按表4中各组分含量添加各试剂，添加完毕后闭管上下颠倒5次并且短暂离心混匀，37℃反应30min，得到扩增产物。
表4 RT-RPA扩增体系
Figure BDA0002867537210000062
Figure BDA0002867537210000071
(2)LwaCas13a CRISPR检测
分别按表5中各组分含量添加各试剂(各组加入对应的CrRNA)，添加各试剂完毕后闭管短暂离心混匀，置于实时荧光定量PCR仪(ABI7500QPCR)中，37℃反应10min，并检测FAM荧光信号，结果如表6及图1所示：本申请提供的引物对3/CrRNA3、文献1公开的引物对1/CrRNA1、文献2公开的引物对2/CrRNA2均能通过两步法检测2019-nCoV ORF1ab基因，且阳性检出率为100％。
表5 LwaCas13a CRISPR检测体系
Figure BDA0002867537210000072
表6不同引物/CrRNA组进行两步法检测ORF1ab基因效果
Figure BDA0002867537210000073
Figure BDA0002867537210000081
实施例4不同引物/CrRNA组合一步法检测效果
1.一步法待检样本制备
取MS噬菌体假病毒样品(含2019-nCoV ORF1ab+E+N基因正链RNA,MS噬菌体假病毒样品来源于广州邦德盛公司，已附每毫升样液中基因组拷贝数信息)，用天根生化公司的病毒RNA抽提试剂盒按其说明书操作提取RNA，最后用无RNA酶纯化水定容至100、50、25、5拷贝/uL并分装，然后制备一步法RNA待检样品，具体步骤如下：
ddH2O与qPCR Human Reference Total RNA样本(1ug/uL)按体积比1：1(各取2.5uL)混合，得到0拷贝一步法RNA待检样品；
5拷贝2019-nCoV RNA样本用ddH2O稀释成2拷贝/uL后与qPCR Human ReferenceTotal RNA样本(1ug/uL)按体积比1：1(各取2.5uL)混合，得到5拷贝一步法RNA待检样品；
25拷贝2019-nCoV RNA样本用ddH2O稀释成10拷贝/uL后与qPCR Human ReferenceTotal RNA样本(1ug/uL)按体积比1：1(各取2.5uL)混合，得到25拷贝一步法RNA待检样品；
50拷贝2019-nCoV RNA样本用ddH2O稀释成20拷贝/uL后与qPCR Human ReferenceTotal RNA样本(1ug/uL)按体积比1：1(各取2.5uL)混合，得到50拷贝一步法RNA待检样品；
100拷贝2019-nCoV RNA样本用ddH2O稀释成50拷贝/uL后与qPCR HumanReference Total RNA样本(1ug/uL)按体积比1：1(各取2.5uL)混合，得到125拷贝一步法RNA待检样品。
2.利用不同引物/CrRNA组进行一步法检测ORF1ab基因效果
取杭州众测生物科技有限公司的RT-RPA试剂盒(50μL体系)及不同的引物对(文献1的引物对、文献2的引物对、本申请的引物对)按表7中各组分含量配置检测反应液，混匀后分装至PCR管(20μL/管)中，-20℃保存备用，PCR管解冻后加入5μL步骤1得到的不同拷贝数的一步法RNA待测样本(最终得到0、5、25、50、125拷贝数的样品)，混匀，闭管后置于实时荧光定量PCR仪(ABI7500QPCR)中，37℃反应30min，并检测FAM荧光信号，结果如表8及图2所示：文献1公开的引物对1/CrRNA1、文献2公开的引物对2/CrRN A2运用于一步法检测2019-nCoV RNA样本时存在检测管间出现信号波动较大的问题，对阳性样本出现较高比例的假阴性检测结果，表明其不能利用于一步法检测；而本申请提供的引物对3/CrRNA3在5～125拷贝范围内皆可稳定地检测出信号，信号强度高，且未对阳性样本出现假阴性检测结果，表明可运用于一步法检测包含2019-nCoV ORF1ab基因的RNA。
表7检测反应液体系
Figure BDA0002867537210000091
注：终浓度*按配制后加入待检样本(20μL)后总体积为100μL的体积计算；本体系用杭州众测RT-RPA试剂盒中RT-RPA酶制剂冻干粉的50μL体系用量构建100μL检测反应液体系。
表8不同引物/CrRNA组一步法检测ORF1ab基因结果
Figure BDA0002867537210000092
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州白云山拜迪生物医药有限公司
<120> 检测2019-nCoV的试剂、试剂盒及应用
<130>
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
taatacgact cactataggg acataaacaa gctttgtgaa gaaatgctgg ac 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttgagcagta gcaaaagctg catatgatgg aagg 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaaattaata cgactcacta tagggcgaag ttgtaggaga cattatactt aaacc 55
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<212> DNA
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<400> 4
tagtaagact agaattgtct acataagcag c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtgctaatg accctgtggg ttttacactt 30
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
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gaaattaata cgactcacta tagggcggag ttgatcacaa ctacagccat aac 53
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<212> RNA
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aaacucugag gcuauagcuu guaagguu 28
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<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
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ccaaccucuu cuguaauuuu uaaacuau 28
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccgucugcgg uauguggaaa gguuaugg 28
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<212> RNA
<213> 人工序列
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gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaac 36
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca aacucugagg cuauagcuug 60
uaagguu 67
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<212> RNA
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<400> 12
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacccaa ccucuucugu aauuuuuaaa 60
cuau 64
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<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 13
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacccgu cugcgguaug uggaaagguu 60
augg 64
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<212> DNA
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<400> 14
taatacgact cactataggg 20
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gaaattaata cgactcacta taggg 25

Claims (9)

1.一种试剂，包含扩增引物对和crRNA；
所述扩增引物对用于扩增2019-nCoV ORF1ab基因特定片段；
所述2019-nCoV ORF1ab基因特定片段的序列如2019-nCoV基因的第13302～13396位核苷酸序列所示；
所述2019-nCoV基因的登录号为MW281864.1；
所述扩增引物对包括正向引物和反向引物；
所述反向引物包含T7启动子序列；
所述crRNA包含锚定序列和向导序列，所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述向导序列与所述2019-nCoV ORF1ab基因特定片段的负链特异性识别；
所述扩增引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
所述crRNA的序列如SEQ ID NO.13所示。
2.权利要求1所述的试剂在制备COVID-19诊断和/或预后评估的产品中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Cas蛋白、信号报告探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：
所述Cas蛋白为Cas13a；
所述信号报告探针包含核酸序列，所述核酸序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包括RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、NTPs、醋酸镁和氯化镁。
7.权利要求1所述的试剂和/或权利要求3~6中任一项所述的试剂盒在非诊断目的的2019-nCoV检测中的应用。
8.一种非诊断目的的2019-nCoV检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）样本提取：取待测样本，提取基因组；
（2）如M1）或M2）：
M1）：一步检测：将步骤（1）提取的基因组与权利要求6所述的扩增引物对、crRNA、Cas蛋白、信号报告探针、RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液、 T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、NTPs、醋酸镁、氯化镁混合，进行RT-RPA扩增和CRISPR反应检测，读取检测信号，即得；
M2）：两步检测：
M21）RT-RPA扩增：将步骤（1）提取的基因组与权利要求6所述的扩增引物对、RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液混合，进行RT-RPA扩增，得到扩增产物；
M22）CRISPR检测：将步骤M21）得到的扩增产物与权利要求6所述的crRNA、Cas蛋白、信号报告探针、NTPs、醋酸镁、氯化镁混合，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，即得。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
步骤M1）检测的条件为36～38℃下反应25～30min；
步骤M21）中RT-RPA扩增的条件为36～38℃下反应25～30min；
步骤M22）中检测的条件为36～38℃下反应25～30min。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111270012A (zh) * 2020-03-10 2020-06-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种用于检测新型冠状病毒（2019-nCoV）的CRISPR核酸检测试剂盒
CN111363847A (zh) * 2020-02-12 2020-07-03 广州微远基因科技有限公司 基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组及其用途
CN111363860A (zh) * 2020-05-27 2020-07-03 吴江近岸蛋白质科技有限公司 一种检测新型冠状病毒covid-19的核酸组合物及应用
CN111560482A (zh) * 2020-06-11 2020-08-21 亚能生物技术（深圳）有限公司 基于CRISPR/Cas和核酸试纸的检测方法和人乳头瘤病毒检测试剂盒
CN111560469A (zh) * 2020-03-30 2020-08-21 广州和盛医疗科技有限公司 一组检测新冠病毒基因的引物及crispr序列组合及其应用
CN111808991A (zh) * 2020-07-09 2020-10-23 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 一种基于RT-RPA体系和CRISPR/Cas体系的基因检测方法及系统及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3987058A1 (en) * 2019-06-19 2022-04-27 Wageningen Universiteit Type iii crispr/cas-based diagnostics
CN111593145B (zh) * 2020-06-11 2023-05-30 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒
CN111850174A (zh) * 2020-08-07 2020-10-30 宜明(苏州)细胞生物科技有限公司 一种检测2019-nCov的CRISPR试剂及其用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363847A (zh) * 2020-02-12 2020-07-03 广州微远基因科技有限公司 基于CRISPR技术的2019-nCoV快速检测引物组及其用途
CN111270012A (zh) * 2020-03-10 2020-06-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种用于检测新型冠状病毒（2019-nCoV）的CRISPR核酸检测试剂盒
CN111560469A (zh) * 2020-03-30 2020-08-21 广州和盛医疗科技有限公司 一组检测新冠病毒基因的引物及crispr序列组合及其应用
CN111363860A (zh) * 2020-05-27 2020-07-03 吴江近岸蛋白质科技有限公司 一种检测新型冠状病毒covid-19的核酸组合物及应用
CN111560482A (zh) * 2020-06-11 2020-08-21 亚能生物技术（深圳）有限公司 基于CRISPR/Cas和核酸试纸的检测方法和人乳头瘤病毒检测试剂盒
CN111808991A (zh) * 2020-07-09 2020-10-23 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 一种基于RT-RPA体系和CRISPR/Cas体系的基因检测方法及系统及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA;Maturada Patchsung等;《nature biomedical engineering》;20200826;第4卷;第1140-1149页 *
development and evaluation of a rapid CRISPR-based diagnostic for COVID-19;Tieying Hou等;《PLOS PATHOGENS》;20200827;第16卷(第8期);e1008705 *
新型冠状病毒核酸检测方法;许金和等;《国际检验医学杂志》;20200915;第41卷(第17期);第2138-2142页 *

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