CN110073005A - 检测诺如病毒的方法 - Google Patents

检测诺如病毒的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110073005A
CN110073005A CN201780046821.0A CN201780046821A CN110073005A CN 110073005 A CN110073005 A CN 110073005A CN 201780046821 A CN201780046821 A CN 201780046821A CN 110073005 A CN110073005 A CN 110073005A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
gii
gene group
seq
target nucleic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780046821.0A
Other languages
English (en)
Inventor
P·李
R·黄
K·拉莫斯
J·陈
M·泰布
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Diagnostics Investment Ltd
Quest Diagnostics Investments LLC
Original Assignee
Diagnostics Investment Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Diagnostics Investment Ltd filed Critical Diagnostics Investment Ltd
Publication of CN110073005A publication Critical patent/CN110073005A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开文本提供了用于测定展现急性胃肠炎的患者是否将受益于用抑制诺如病毒基因群I(GI)或诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂治疗的方法和组合物。本文所公开的方法是基于在进行实时反转录PCR之前不从临床样本提取病毒核酸的情况下检测粪便样品中的诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)。本公开文本还提供了用于实践该方法的试剂盒。

Description

检测诺如病毒的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月3日申请的美国申请号62/345,331的权益和优先权，将该申请的内容通过引用以其全文结合在此。
技术领域
本公开文本提供了用于测定患有急性胃肠炎的患者是否将受益于抑制诺如病毒基因群I(GI)或诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂治疗的方法和组合物。本技术的方法是基于在进行实时反转录PCR(RT-PCR)之前不从临床样本提取病毒核酸的情况下检测粪便样品中的诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)。本公开文本还提供了用于实践该方法的试剂盒。
发明背景
下文提供对本公开文本的背景的说明只为了帮助读者理解本公开文本，并且不承认该说明描述或构成本公开文本的现有技术。
诺如病毒是杯状病毒科(Caliciviridae)的无包膜单链RNA病毒，并且引起全世界所有人类胃肠炎暴发的60％至80％。人类诺如病毒每年在美国引起约两千一百万至两千三百万胃肠炎病例和800例死亡，并且在发展中国家引起超过218,000例死亡，主要是小于5岁的儿童。
人类诺如病毒具有约24小时的孵育期和约24-72小时的疾病长度。最常见症状是恶心、呕吐和腹泻，但是还可包括腹绞痛、发热、头痛和脱水。诺如病毒主要通过粪口途径传播，但也可通过雾化的呕吐物飞沫、被污染的食物或水和污染物传播。人类诺如病毒具有高传染性并且可在包括医疗机构、游船、饭店和学校的众多种环境中引起大爆发。
快速准确地检测诺如病毒感染对于在医疗和非医疗环境中防止病毒传播非常重要。诺如病毒分为六个基因群(GI-GVI)。GII基因型4(GII.4)诺如病毒每年引起所有人类诺如病毒胃肠炎的约60％-90％。GI和GII基因群在人类感染中最普遍，但人们认为，由于二者之间的巨大抗原差异而缺少共同的中和表位。显著的病毒多样性使得很难研发广谱保护性人类诺如病毒疫苗。
因此，业内非常需要可快速检测并区分临床粪便样品中的多种诺如病毒基因群(例如诺如病毒基因群I(GI)或诺如病毒基因群II(GII))的更稳健并且更灵敏的方法。
发明概述
本公开文本提供了用于检测和区分诸如粪便等复合生物样品中的多种诺如病毒基因群(例如诺如病毒基因群I(GI)或诺如病毒基因群II(GII))的组合物和方法。本技术的方法可对未经处理的粪便样品实施，得到直接的流线型的样品到结果的过程。在另一方面中，本技术的方法和组合物可用于选择用于患有急性胃肠炎的受试者的最佳治疗方案。预期本文所公开的方法允许快速、灵敏且同时地检测一个或多个对应于诺如病毒基因群I(GI)或诺如病毒基因群II(GII)的靶核酸序列。
因此，在一个方面中，本公开文本提供了用于检测粪便样品中至少一种诺如病毒基因群的存在的方法，该方法包括：使粪便样品与以下各项接触：(i)扩增诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的第一引物对，该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；和(ii)扩增诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的第二引物对，该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸，以在如下条件下产生反应-样品混合物：其中在不从粪便样品提取靶核酸的情况下，进行粪便样品中诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸(如果存在)的扩增。在一些实施方案中，该方法还包括(a)使反应-样品混合物经历实时反转录聚合酶链式反应(“RT-PCR”)条件，在该条件下，粪便样品中存在的每一靶核酸经扩增以产生荧光信号；(b)检测步骤(a)中产生的每一经扩增靶核酸生成的荧光信号；和(c)通过评估每一靶核酸的荧光信号来检测粪便样品中至少一种诺如病毒基因群的存在，其中检测到诺如病毒基因群I(GI)靶核酸指示粪便样品中存在诺如病毒基因群I(GI)；并且检测到诺如病毒基因群II(GII)靶核酸指示粪便样品中存在诺如病毒基因群II(GII)；并且其中在扩增前不对粪便样品进行提取或纯化步骤。实时RT-PCR扩增可在与集成热循环仪协作的直接扩增盘中进行。在一些实施方案中，诺如病毒基因群I(GI)包含选自下组的一个或多个基因型，该组由以下各项组成：GI.1、GI.2、GI.3、GI.4、GI.5、GI.6、GI.7、GI.8、GI.9、GI.10和GI.14。在某些实施方案中，诺如病毒基因群II(GII)包含选自下组的一个或多个基因型，该组由以下各项组成：GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.5、GII.6、GII.7、GII.8、GII.9、GII.10、GII.11、GII.12、GII.13、GII.14、GII.15、GII.16、GII.17、GII.18、GII.19、GII.20、GII.21、GII.22和GII.23。在一些实施方案中，粪便样品包含未成形粪便、成形粪便或储存于液体Amies培养基中的直肠拭子。
所有引物对可在接触粪便样品之前一起含于还包含DNA聚合酶、dNTP和PCR缓冲液的扩增主混合物中。另外，扩增主混合物可以还包含在严格条件下与对照靶核酸特异性地杂交的第三引物对。
可使粪便样品单独或同时与一种或多种引物对接触。如果接触是同时进行(即多重)，则使第一和第二引物对中的一个或两个与粪便样品接触并与彼此接触以扩增靶核酸序列。
在该方法的一些实施方案中，第一引物对由包含5'd CGYTGGATGCGITTYCATGA 3'(SEQ ID NO:5)的第一正向引物和包含5'd TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC 3'(SEQ ID NO:6)的第一反向引物组成。另外或可替代地，在一些实施方案中，第二引物对由包含5'dTGTTYAGGTGGATGAGRTTCTCIGA 3'(SEQ ID NO:9)的第二正向引物和包含5'dTCGACGCCATCTTCATTCACA 3'(SEQ ID NO:10)的第二反向引物组成。
任选地，扩增混合物中可包括对照靶核酸和与该对照靶核酸互补的第三引物对。在一些实施方案中，对照靶核酸包含SEQ ID NO:12或其互补体。在某些实施方案中，第三引物对由包含5'd CTCGTCGACAATGGCGGAA 3'(SEQ ID NO:13)的第三正向引物和包含5'dTTCAGCGACCCCGTTAGC 3'(SEQ ID NO:14)的第三反向引物组成。
在一些实施方案中，该方法还包括使粪便样品与第一核酸探针接触，该第一核酸探针能够与SEQ ID NO:2或其互补体的诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中第一核酸探针经可检测方式标记并且包含5'dTGGACAGGAGAYCGCIATCTCYTGCCCGA 3'(SEQ ID NO:7)或其互补体。另外或可替代地，在一些实施方案中，该方法还包括使粪便样品与第二核酸探针接触，该第二核酸探针能够与SEQID NO:2或其互补体的诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中第二核酸探针经可检测方式标记并且包含5'd TGGACAGGAGATCGCAATCTACTGCCTGA 3'(SEQ ID NO:8)或其互补体。
另外或可替代地，在一些实施方案中，该方法还包括使粪便样品与第三核酸探针接触，该第三核酸探针能够与SEQ ID NO:4或其互补体的诺如病毒基因群II(GII)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中第三核酸探针经可检测方式标记并且包含5'dACGTGGGAGGGCGATCGCAATCT 3'(SEQ ID NO:11)或其互补体。
在该方法的某些实施方案中，第一核酸探针经CFR610荧光团以可检测方式标记，第二核酸探针经CFR610荧光团以可检测方式标记，并且第三核酸探针经FAM荧光团以可检测方式标记。
在上文任一实施方案中，该方法还包括使粪便样品与第四核酸探针接触，该第四核酸探针与对照靶核酸或其互补体的区段特异性地杂交，其中第四核酸探针经可检测方式标记并且包含5'd GCTTGGGGCGACAGTCACGTCGC 3'(SEQ ID NO:15)或其互补体。在一些实施方案中，第四核酸探针经Q670荧光团以可检测方式标记。
在另一方面中，本公开文本提供选择患有急性胃肠炎的患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂治疗的方法，该方法包括：使从该患者获得的粪便样品与以下各项接触：(i)扩增诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的第一引物对，该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；和(ii)扩增诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的第二引物对，该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸，以在如下条件下产生反应-样品混合物：其中在不从粪便样品提取靶核酸的情况下，进行粪便样品中诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸(如果存在)的扩增。在一些实施方案中，该方法还包括(a)使反应-样品混合物经历实时RT-PCR条件，在该条件下粪便样品中存在的每一靶核酸经扩增以产生荧光信号；(b)检测步骤(a)中产生的每一经扩增靶核酸生成的荧光信号；和(c)如果检测到诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的荧光信号，则选择该患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂治疗，其中在扩增前不对粪便样品进行提取或纯化步骤。在一些实施方案中，实时RT-PCR扩增是在与集成热循环仪协作的直接扩增盘中进行。
在该方法的一些实施方案中，第一引物对由包含5'd CGYTGGATGCGITTYCATGA 3'(SEQ ID NO:5)的第一正向引物和包含5'd TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC 3'(SEQ ID NO:6)的第一反向引物组成。另外或可替代地，在一些实施方案中，第二引物对由包含5'dTGTTYAGGTGGATGAGRTTCTCIGA 3'(SEQ ID NO:9)的第二正向引物和包含5'dTCGACGCCATCTTCATTCACA 3'(SEQ ID NO:10)的第二反向引物组成。
任选地，扩增混合物中可包括对照靶核酸和与该对照靶核酸互补的第三引物对。在一些实施方案中，对照靶核酸包含SEQ ID NO:12或其互补体。在某些实施方案中，第三引物对由包含5'd CTCGTCGACAATGGCGGAA 3'(SEQ ID NO:13)的第三正向引物和包含5'dTTCAGCGACCCCGTTAGC 3'(SEQ ID NO:14)的第三反向引物组成。
在一些实施方案中，该方法还包括使粪便样品与第一核酸探针接触，该第一核酸探针能够与SEQ ID NO:2或其互补体的诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中第一核酸探针经可检测方式标记并且包含5'dTGGACAGGAGAYCGCIATCTCYTGCCCGA 3'(SEQ ID NO:7)或其互补体。另外或可替代地，在一些实施方案中，该方法还包括使粪便样品与第二核酸探针接触，该第二核酸探针能够与SEQID NO:2或其互补体的诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中第二核酸探针经可检测方式标记并且包含5'd TGGACAGGAGATCGCAATCTACTGCCTGA 3'(SEQ ID NO:8)或其互补体。另外或可替代地，在一些实施方案中，该方法还包括使粪便样品与第三核酸探针接触，该第三核酸探针能够与SEQ ID NO:4或其互补体的诺如病毒基因群II(GII)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中第三核酸探针经可检测方式标记并且包含5'dACGTGGGAGGGCGATCGCAATCT 3'(SEQ ID NO:11)或其互补体。
在该方法的某些实施方案中，第一核酸探针经CFR610荧光团以可检测方式标记，第二核酸探针经CFR610荧光团以可检测方式标记，并且第三核酸探针经FAM荧光团以可检测方式标记。
在上文任一实施方案中，该方法还包括使粪便样品与第四核酸探针接触，该第四核酸探针与对照靶核酸或其互补体的区段特异性地杂交，其中第四核酸探针经可检测方式标记并且包含5'd GCTTGGGGCGACAGTCACGTCGC 3'(SEQ ID NO:15)或其互补体。在一些实施方案中，第四核酸探针经Q670荧光团以可检测方式标记。
在一些实施方案中，抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂是选自下组的一种或多种药剂，该组由以下各项组成：GII.4/VA387源P颗粒疫苗(Kocher J等人，J Virol.88(17):9728–9743(2014))、GII.4源病毒样颗粒(VLP)疫苗(Souza M等人，Vaccine 25(50):8448–8459(2007)；Debbink K等人，J Virol.88(13):7256–7266(2014))、具有铝胶佐剂的源自共有GII.4序列和诺沃克病毒的VLP(Parra GI等人，Vaccine 30(24):3580–3586(2012))、以及源自GII.4人类诺如病毒VP1和轮状病毒VP6抗原的VLP(Blazevic V等人，Vaccine 29(45):8126–8133(2011))。
在一个方面中，本公开文本提供选择患有急性胃肠炎的患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂和抑制诺如病毒基因群I(GI)的另一治疗剂治疗的方法，该方法包括：使从该患者获得的粪便样品与以下各项接触：(i)扩增诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的第一引物对，该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；和(ii)扩增诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的第二引物对，该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸，以在如下条件下产生反应-样品混合物：其中在不从粪便样品提取靶核酸的情况下，进行粪便样品中诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸(如果存在)的扩增。在一些实施方案中，该方法还包括(a)使反应-样品混合物经历实时RT-PCR条件，在该条件下粪便样品中存在的每一靶核酸经扩增以产生荧光信号；(b)检测步骤(a)中产生的每一经扩增靶核酸生成的荧光信号；和(c)如果检测到(i)诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的荧光信号和(ii)诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的荧光信号，则选择该患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂和抑制诺如病毒基因群I(GI)的另一治疗剂治疗，其中在扩增前不对粪便样品进行提取或纯化步骤。
在该方法的一些实施方案中，抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂是选自下组的一种或多种药剂，该组由以下各项组成：GII.4/VA387源P颗粒疫苗(Kocher J等人，JVirol.88(17):9728–9743(2014))、GII.4源病毒样颗粒(VLP)疫苗(Souza M等人，Vaccine25(50):8448–8459(2007)；Debbink K等人，J Virol.88(13):7256–7266(2014))、具有铝胶佐剂的源自共有GII.4序列和诺沃克病毒的VLP(Parra GI等人，Vaccine 30(24):3580–3586(2012))、以及源自GII.4人类诺如病毒VP1和轮状病毒VP6抗原的VLP(Blazevic V等人，Vaccine 29(45):8126–8133(2011))。
在该方法的一些实施方案中，抑制诺如病毒基因群I(GI)的另一治疗剂是选自下组的一种或多种药剂，该组由以下各项组成：血清组织血型抗原(HBGA)阻断抗体、利巴韦林(ribavirin)、法匹拉韦(favipiravir)、2'-C-甲基胞苷、舒拉明(suramin)相关化合物、IFNα、β或γ、诺如病毒3CL蛋白酶的二肽基抑制剂(Kankanamalage等人，J Med Chem.58(7):3144–3155(2015)；Takahashi等人，Virus Res.178(2):437–444(2013))、吡哆醛-5'-磷酸-6-(2'-萘基偶氮-6'-硝基-4',8'-二磺酸)四钠盐(PPNDS)、人类诺如病毒RNA依赖性RNA聚合酶的萘-磺酸盐抑制剂(Tarantino等人，Antiviral Res.2014；102:23–28)、萘二磺酸盐(NAF2)、非核苷抑制剂、GI.1加GII.4共有VLP二价疫苗(Treanor JJ等人，J InfectDis.210(11):1763–1771(2014))和小分子去泛素化酶抑制剂(Gonzalez-Hernandez MJ等人，PLoS ONE 9(4):e94491(2014))。
在另一方面中，本公开文本提供包含寡核苷酸的试剂盒，该寡核苷酸可为用于进行如本文所述的扩增的引物或探针。
发明详述
人类诺如病毒在世界范围内是急性非细菌性胃肠炎的主要病因。粪便是诊断病毒性和细菌性胃肠炎的病例的极佳样品来源(Tenover等人，J Mol Diagn.13(6):573-582(2011)；Liu等人，J Clin Virol.50:308-315(2011))。然而，从粪便分离高质量核酸较困难。粪便中酚类化合物、代谢物和多糖的存在使得非常难分离不含PCR抑制剂的高质量核酸样品(Monteiro等人，J Clin Microbiol.35(4):995-998(1997))。另外，粪便中RNA酶和DNA酶的存在造成在样品采集和运输期间发生呈核酸分解形式的逻辑问题(Nechvatal等人，JMicrobiol Meth.72:124-132(2008))。当前技术需要冷冻粪便样品或向粪便样品中引入防腐剂以保存样品内致病微生物的核酸。
本公开文本提供用于测定患有急性胃肠炎的患者是否将受益于抑制诺如病毒基因群I(GI)或诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂的治疗的方法，并且是基于通过使用实时RT-PCR测定诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的存在来检测粪便样品中的诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)。所公开方法包括：(a)使粪便样品与以下各项接触：(i)与诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列(如果存在)特异性地杂交的第一引物对；和(ii)与诺如病毒基因群II(GII)靶核酸序列(如果存在)特异性地杂交的第二引物对，以在如下条件下产生反应-样品混合物：其中在不从粪便样品提取靶核酸的情况下，进行粪便样品中诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸(如果存在)的扩增；(b)使反应-样品混合物经历实时RT-PCR条件，在该条件下粪便样品中存在的每一靶核酸经扩增以产生荧光信号；(c)使用集成热循环系统检测每一荧光团所产生荧光信号的量；和(d)通过比较靶核酸所生成的荧光的量来测定粪便样品中诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)中的一个或多个的存在。本公开文本还提供了用于实践该方法的试剂盒。
定义
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
除非上下文另外说明或另有表示，否则如本文所用的涉及数字的术语“约”通常视为包括落在该数字任一方向(大于或小于)1％–10％范围内的数字。
如本文所用，关于核酸序列的术语“扩增(amplify)”或“扩增(amplification)”是指增加样品中核酸序列群体的表现的方法。扩增反应中在体外生成的特定靶核酸序列的拷贝称为“扩增子”或“扩增产物”。扩增可为指数性的或线性的。靶核酸可为DNA(例如，基因组DNA和cDNA)或RNA。尽管下文中所描述的实例性方法是指使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，但本领域技术人员熟知多种其他方法，例如等温法、滚环法等。本领域技术人员应理解，这些其他方法可代替PCR方法来使用或与PCR方法一起使用。参见，例如Saiki,“Amplification of Genomic DNA”，PCR Protocols,Innis等人编辑，Academic Press，圣地亚哥，加利福尼亚州，1990，第13-20页；Wharam等人，Nucleic Acids Res.29(11):E54-E54(2001)。
如本文所用的“扩增混合物”是用于核酸扩增反应的试剂混合物，但不含引物或样品。扩增混合物包含缓冲液、dNTP和DNA聚合酶。扩增混合物可以还包含MgCl2、KCl、非离子型和离子型清洁剂(包括阳离子型清洁剂)中的至少一种。
“扩增主混合物”包含用于扩增一种或多种靶核酸的扩增混合物和引物，但不含要扩增的样品。
如本文所用的关于多核苷酸(即核苷酸序列，例如寡核苷酸或靶核酸)的术语“互补体”、“互补的”或“互补性”是指Watson/Crick碱基配对原则。如本文所用的核酸序列的互补体是指寡核苷酸，该寡核苷酸在与核酸序列比对以使一个序列的5'端与另一序列的3'端配对时，呈“反向平行结合”。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。在本文所述核酸中可包括天然存在的核酸中通常不存在的某些碱基。例如，这些碱基包括肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。互补性无需完美；稳定双链体可含有错配碱基对、变性或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可在考虑多个变量后凭经验确定双链体稳定性，该变量包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、错配碱基对的离子强度和发生率。互补序列还可为与DNA序列或其互补序列互补的RNA序列，并且还可为cDNA。
如本文所用术语“基本上互补”意指，两个序列在严格杂交条件下杂交。所属领域技术人员应理解，基本上互补的序列无需沿其整个长度杂交。具体而言，基本上互补的序列可包含不与靶序列杂交的连续碱基序列，定位于在严格杂交条件下与靶序列杂交的连续碱基序列的3'或5'。
如本文所用，分析物的“循环阈值”(Ct)是PCR循环，荧光信号在该循环跨过指定荧光阈值。Ct取决于扩增反应效率，包括开始模板拷贝数、生物体溶解、PCR扩增、荧光探针的杂交或裂解以及检测灵敏度。Ct提供PCR反应中的靶核酸浓度的相对量度。除了靶核酸浓度以外的多种因素可影响Ct的绝对值。然而，来自反应混合或仪器的改变与Ct计算相关的荧光测量的假象将导致Ct值的与模板无关的变化。
如本文所用术语“检测”是指测定样品中靶核酸的存在。检测不要求方法提供100％灵敏度和/或100％特异性。
如本文所用术语“直接扩增”是指核酸扩增反应，其中在不进行预先纯化、提取或浓缩的情况下从样品扩增靶核酸。
如本文所用术语“提取”是指用于从样品中存在的其他(非核酸)材料移除核酸的任何动作。术语提取包括机械或化学溶解、添加清洁剂或蛋白酶、或沉淀并移除非核酸(例如蛋白质)。
如本文所用术语“荧光团”是指吸收特定波长(激发频率)的光，且随后发射较长波长(发射频率)的光的分子。如本文所用的术语“供体荧光团”意指荧光团，该荧光团在紧密靠近淬灭剂部分时，向淬灭剂贡献或转移发射能量。由于向淬灭剂部分贡献能量，供体荧光团在不存在靠近定位的淬灭剂部分时其会具有的特定发射频率下，本身将发射较少的光。
如本文所用术语“杂交”是指两个基本上互补的核酸链(在至少14至25个核苷酸的延伸段上至少约65％互补，至少约75％或至少约90％互补)在适当严格的条件下彼此复性，以通过在互补碱基对之间形成氢键而形成双链体或异源双链体的过程。杂交通常且优选地是用探针长度的核酸分子来实施，优选地长度为15-100个核苷酸，更优选地长度为18-50个核苷酸。核酸杂交技术为本领域所熟知。参见，例如Sambrook等人，1989,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Press,Plainview，纽约。杂交和杂交强度(即核酸之间的结合强度)受到诸如以下等因素的影响：核酸之间的互补程度、所涉及条件的严格度以及所形成杂合体的热熔点(Tm)。本领域技术人员了解如何估计和调整杂交条件的严格度，使得具有至少所需互补水平的序列可稳定杂交，而具有较低互补性的序列不会杂交。杂交条件和参数的例子参见例如Sambrook等人，1989,MolecularCloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press,Plainview，纽约；Ausubel,F.M.等人，1994,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Secaucus，新泽西州。在一些实施方案中，在严格杂交条件下发生特异性杂交。对靶核酸具有特异性的寡核苷酸或多核苷酸(例如，探针或引物)将与靶核酸在适宜条件下“杂交”。
如本文所用术语“个体”、“患者”或“受试者”可为个别生物体、脊椎动物、哺乳动物或人类。在优选实施方案中，个体、患者或受试者是人类。
如本文所用术语“多重PCR”是指在同一反应容器内同时生成两种或更多种PCR产物或扩增子。每种PCR产物使用不同引物对来启动。多重反应可进一步包括每种产物的特异性探针，该探针经不同的可检测部分标记。
如本文所用，“寡核苷酸”是指在主链上具有核酸碱基序列的分子，该主链主要以确定间隔包括相同单体单元。碱基在主链上的排列方式使得其可与具有与该寡核苷酸的碱基互补的碱基序列的核酸结合。最常见寡核苷酸具有糖-磷酸单元的主链。可区分不具有2'位羟基的寡脱氧核糖核苷酸与具有2'位羟基的寡核糖核苷酸。寡核苷酸也可包括衍生物，其中羟基中的氢由有机基团(例如，烯丙基)替代。用作引物或探针的寡核苷酸通常长度为至少约10-15个核苷酸，或长度为最多约70、100、110、150或200个核苷酸，并且更优选地长度为至少约15至25个核苷酸。用作特异性扩增或特异性检测特定靶核酸的引物或探针的寡核苷酸通常能够与靶核酸特异性地杂交。
如本文所用“阳性对照核酸”或“内部阳性扩增对照”是已知以一定量或水平存于样品中的核酸。在一些实施方案中，阳性对照核酸并不天然存在于样品中，并且是在使反应-样品混合物进行实时RT-聚合酶链式反应之前添加至样品中，如本技术用于检测样品中诺如病毒基因群的存在的方法中所公开。
如本文所用术语“引物”是指寡核苷酸，其在置于诱导与靶核酸链互补的引物延长产物合成的条件下时能用作核酸序列合成的起始点，该条件即在适当缓冲液(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅因子等)中的不同核苷酸三磷酸和聚合酶存在下以及适宜温度下。引物的一个或多个核苷酸可经修饰，例如通过添加甲基、生物素或地高辛配基部分、荧光标签来修饰，或通过使用放射性核苷酸来修饰。引物序列无需反映模板的确切序列。例如，非互补核苷酸片段可附接至引物的5'端，引物序列的其余部分与该链基本上互补。如本文所用术语引物包括可合成引物的所有形式，包括肽核酸引物、锁核酸引物、磷硫酰修饰引物、经标记引物等。如本文所用术语“正向引物”意指与双链DNA(dsDNA)的反义链或cDNA复性的引物。“反向引物”与dsDNA的有义链或RNA复性。
引物长度通常为10、15、18或30个核苷酸，或长度为最多约100、110、125或200个核苷酸。在一些实施方案中，引物长度优选地介于约15至约60个核苷酸之间，并且长度最优选地介于约25至约40个核苷酸之间。在一些实施方案中，引物长度为15至35个核苷酸。对于最佳杂交或聚合酶链式反应扩增，没有标准长度。用于特定引物应用的最佳长度可以H.Erlich,PCR Technology,Principles and Application for DNA Amplification,(1989)中所述的方式容易地确定。
“引物延长反应”是指合成反应，其中寡核苷酸引物与靶核酸杂交，并且通过个别互补核苷酸的聚合酶依赖性3'加成产生靶核酸的互补拷贝。在一些实施方案中，引物延长反应是PCR。
如本文所用术语“引物对”是指可一起用于扩增目标核酸的给定区域的正向和反向引物对(即左侧和右侧引物对)。
如本文所用“探针”是指与靶核酸通过杂交相互作用的核酸。探针可与靶核酸序列完全互补或部分互补。互补水平将取决于多种因素，通常是基于探针功能。探针可以本领域中熟知的多种方式中的任一种方式经标记或未标记，或经修饰。探针可与靶核酸特异性地杂交。探针可为DNA、RNA或RNA/DNA杂合体。探针可为寡核苷酸、人工染色体、片段化人工染色体、基因组核酸、片段化基因组核酸、RNA、重组核酸、片段化重组核酸、肽核酸(PNA)、锁核酸、环状杂环的寡聚体或核酸的偶联物。探针可包含经修饰核碱基、经修饰糖部分和经修饰核苷酸间连接。探针可用于检测甲基化靶核酸的存在或不存在。探针长度通常为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100个核苷酸或更长。
如本文所用“探针元件”是指核苷酸的延伸段，其(a)与引物结合，其中该延伸段与引物核酸序列连接或与引物核酸序列相邻定位，并且(b)在严格条件下与要检测的靶核酸序列特异性地杂交。
如本文所用术语“引物-探针检测系统”是指用于实时PCR的方法。此方法利用双功能分子(本文中称为引物-探针)，其含有通过聚合酶阻断基团与探针元件共价连接的PCR引物元件。另外，每个引物-探针分子含有与淬灭剂相互作用以减少背景荧光的荧光团。在一些实施方案中，引物-探针可包含具有5'延长探针尾的3'引物，该探针尾包含具有荧光团/淬灭剂对的发夹结构。在PCR期间，通过引入六乙二醇(HEG)阻断聚合酶延伸至探针尾中。在第一轮扩增期间，3'靶特异性引物与靶核酸复性并且延长使得现在将引物-探针纳入新合成链中，该新合成链具有用于5'探针的新合成靶区域。在下一轮变性和复性期间，引物-探针发夹环的探针区域将与靶杂交，由此分离荧光团与淬灭剂并产生可测量信号。所述引物-探针描述于Whitcombe等人，Nature Biotech 17:804-807(1999)中。SCORPION引物是实例性引物-探针。
如本文所用术语“淬灭剂部分”意指紧密靠近供体荧光团的分子，其吸收供体生成的发射能量，并使能量作为热量耗散，或发射波长长于供体发射波长的光。在后一种情况下，将淬灭剂视为受体荧光团。淬灭部分可通过近端(即碰撞)淬灭或通过或荧光共振能量转移(“FRET”)来作用。通过FRET淬灭通常用于探针中，而近端淬灭用于分子信标和ScorpionTM型探针中。
如本文所用“反应-样品混合物”是指含有扩增主混合物和样品的混合物。
如本文所用术语“样品”是指从患者或经分离微生物获得的临床样品。在优选实施方案中，样品是从生物来源获得(即“生物样品”)，例如从受试者采集的组织、体液或微生物。样品来源包括但不限于粪便、粘液、痰(经处理或未经处理)、支气管肺泡灌洗液(BAL)、支气管冲洗液(BW)、血液、体液、脑脊髓液(CSF)、尿液、血浆、血清或组织(例如，活检材料)。优选样品来源包括未成形或成形粪便样品。未成形粪便是指软质且无定形的粪便。成形粪便是指固态、坚实、成块且润滑的粪便。在一些实施方案中，样品是储存在液体Amies培养基中的直肠拭子。
如本文所用，关于本技术方法的术语“灵敏度”是方法在异质性序列群中检测到预选序列变体的能力的量度。如果给定样品中预选序列变体是以样品中序列的至少F％存在，方法可以C％的预选置信度、S％的次数检测到预选序列，那么方法对F％的变体具有S％的灵敏度。举例而言，如果给定样品中预选变体序列是以样品中序列的至少5％存在，方法可以99％的预选置信度、10次有9次检测到预选序列(F＝5％；C＝99％；S＝90％)，那么方法对5％的变体具有90％灵敏度。实例性灵敏度包括至少50、60、70、80、90、95、98和99％。
如本文所用关于寡核苷酸引物的术语“特异性”意指，在比对寡核苷酸与核酸时，引物的核苷酸序列与要扩增的核酸的一部分具有至少12个碱基的序列一致性。对核酸具有特异性的寡核苷酸引物是在严格杂交或洗涤条件下，能够与目标靶杂交并且基本上不与非目标核酸杂交的引物。较高序列一致性水平是优选的，并且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％且更优选地至少98％序列一致性。序列一致性可使用采用本领域熟知算法的市售电脑程序以默认设置来测定。如本文所用，具有“高序列一致性”的序列至少在约50％的所比对核苷酸位置，优选地至少在约60％的所比对核苷酸位置，且更优选地至少在约75％的所比对核苷酸位置具有相同核苷酸。
如本文所用“特异性”是方法区分真实存在的预选序列变体与测序假象或其他密切相关序列的能力的量度。它是避免假阳性检测的能力。假阳性检测可由以下各项引起：在样品制备期间引入目标序列中的错误、测序误差或密切相关序列(假基因或基因家族成员)的疏忽测序。如果在应用于N总个序列的样品集(其中X真实序列是真实变体并且X非真实是非真实变体)时，方法选择至少X％的非真实变体为非变体，那么方法具有X％的特异性。例如，如果在应用于1,000个序列的样品集(其中500个序列式真实变体并且500个序列是非真实变体)时，方法选择500个非真实变体序列中的90％为非变体，那么方法具有90％的特异性。实例性特异性包括至少50、60、70、80、90、95、98和99％。
如本文所用术语“严格杂交条件”是指至少像以下一样严格的杂交条件：在50％甲酰胺、5x SSC、50mM NaH2PO4、pH 6.8、0.5％SDS、0.1mg/mL超声处理的鲑鱼精子DNA和5xDenhart's溶液中，在42℃下杂交过夜；用2x SSC、0.1％SDS在45℃下洗涤；并用0.2x SSC、0.1％SDS在45℃下洗涤。在另一例子中，严格杂交条件应不允许两个在20个连续核苷酸的延伸段上相差多于两个碱基的核酸杂交。
如本文所用“PCR检测系统”是指用于实时PCR的方法。在此方法中，在扩增主混合物中包括与所扩增核酸区段杂交的探针。探针在探针任一端上包含彼此足够靠近的供体和淬灭剂荧光团，使得淬灭剂吸收供体的荧光。然而，在探针与所扩增区段杂交时，Taq聚合酶的5'-外切核酸酶活性裂解探针，由此允许供体荧光团发射可检测荧光。
如本文所用术语“靶核酸”或“靶序列”是指待分析样品中要检测和/或定量的目标核酸序列。靶核酸可由以下各项组成：染色体区段、具有或不具有基因间序列的完整基因、具有或不具有基因间序列的基因的区段或部分、或针对其设计探针或引物的核酸序列。靶核酸可包括野生型序列、突变、缺失、插入或重复、串联重复元件、目标基因、目标基因区域或其任何上游或下游区域。靶核酸可代表特定基因的可替代序列或等位基因。靶核酸可源自基因组DNA、cDNA或RNA。
生物样品采集和制备
通过提取总核酸(例如，通过非特异性沉淀方法)从诸如成形或未成形粪便基质等复杂样品分离病毒核酸可具有挑战性，因为从粪便样品分离的总核酸包含生物干扰物，例如来自肠道细菌的核酸以及来自受试者的核酸。此外，常规方法和试剂盒主要设计为从小样品(例如质量小于1克，例如50至200毫克的样品)制备DNA或RNA，从而将来自复杂样品的靶核酸的产率限制为极少量。其他缺点在于，大多数常规技术无法有效移除PCR抑制剂，并且通常需要长处理步骤，例如孵育。使用常规方法或试剂盒获得实现高检测灵敏度所需的起始数量需要对多个样品进行多次DNA提取(例如，使用多个试剂盒)，还需要额外的纯化步骤以移除抑制剂。
本技术的方法和组合物可用于在进行实时RT-PCR之前不从粪便样品提取病毒核酸的情况下，检测从受试者获得的粪便样品中的诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)，并且使得无需冷冻所采集粪便样品或无需向所采集粪便样品添加防腐剂来防止粪便样品中的病毒核酸分解。
本文所公开的方法可用于检测得自无菌和/或非无菌部位的生物样品中的诺如病毒基因群(GI和GII)。“无菌部位”包括体液，例如全血、血浆、无细胞血浆、尿液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、心包液、眼内液、组织活检或气管内吸取液。如本文所用“无细胞血浆”是指含有按体积计少于1％细胞的血浆。“非无菌部位”包括痰、粪便、皮肤拭子、腹股沟拭子、鼻拭子和咽喉拭子。在一些实施方案中，生物样品包含成形或未成形粪便样品或储存于液体Amies培养基中的直肠拭子。在其他实施方案中，生物样品包含病毒培养基。样品还可包括病毒分离物。
可怀疑生物粪便样品含有诺如病毒基因群(GI和GII)和/或一个或多个诺如病毒基因群(GI和GII)的核酸。另外，生物粪便样品可得自怀疑感染一个或多个诺如病毒基因群(GI和GII)的受试者。可使生物粪便样品与用于微流体/微电子离心平台的扩增主混合物接触。
尽管所公开方法优选地采用未经处理的生物粪便样品，由此得到直接的流线型的样品到结果的过程，但如果用于根据本领域技术人员熟知的任何方法从生物粪便样品纯化的经分离核酸(DNA或RNA)，本文公开的检测方法将是有效的。如果需要，可通过离心等方式采集或浓缩粪便样品。可通过例如酶处理、热表面活性剂、超声处理或其组合，对样品的细胞进行溶解。可替代地，可使用市售核酸提取试剂盒来处理生物粪便样品。
在一些实施方案中，在与生物粪便样品接触之前，扩增主混合物中存在一个或多个引物对，该扩增主混合物还包含DNA聚合酶、dNTP和PCR缓冲液。诺如病毒基因群(例如，GI和GII)靶核酸的扩增优选地以多重模式进行。可替代地，还可使用用于每一多拷贝插入序列的个别PCR反应。可使生物粪便样品与引物对和/或与扩增主混合物在直接扩增盘中接触以形成反应-样品混合物。例如，可使生物粪便样品与扩增主混合物在直接扩增盘(例如Focus Diagnostics,Inc.(Cypress,加利福尼亚州，美国)出售的直接扩增盘)中接触，作为SIMPLEXATM直接实时RT-PCR测定的一部分，以与集成循环仪系统协同工作。直接扩增盘是圆形薄盘，含有多个指定区域，每个指定区域含有用于接收扩增主混合物的孔和用于接收未处理患者样品的关联孔。在添加扩增主混合物和样品时或在添加后，在直接扩增盘中产生样品-反应混合物。
实时PCR
可通过本领域中熟知的多种方法中的任一种来检测靶核酸的扩增，例如凝胶电泳、柱色谱、与探针杂交、测序、熔融曲线分析或“实时”检测。
对于实时检测，引物和/或探针可以可检测方式经标记，以在能监控反应期间的荧光变化的仪器中允许在纳入引物时或在例如探针杂交和扩增时的荧光差异。用于核酸扩增的实时检测方法为人所熟知并且包括例如系统、ScorpionTM引物系统和在双链核酸中使用嵌入染料。
在实时定量PCR中，在靶DNA的标准稀释液和含有未知量的靶DNA的样品二者中连续测量扩增产物的积累。通过将标准样品中的初始模板浓度与产生特定阈值浓度的产物所需的PCR循环数(Ct)相关联来构建标准曲线。在测试样品中，在相同Ct后测量靶PCR产物积累，这使得可插入来自标准曲线的靶DNA浓度。
在一些实施方案中，通过与特异性探针杂交来检测经扩增核酸。可使用与经扩增靶序列的一部分互补的探针寡核苷酸来检测经扩增片段。在一些实施方案中，可实时检测杂交。在备选实施方案中，杂交并非实时检测。每一靶序列的经扩增核酸可同时检测(即在同一反应容器中，例如多重PCR)或个别检测(即在单独反应容器中)。在某些实施方案中，使用两种或更多种以可区别方式标记(例如，通过不同可检测部分，例如色彩)的基因特异性寡核苷酸探针同时检测多个靶核酸，其中一种探针与第一靶序列杂交且另一种探针与第二靶序列杂交。
在一些实施方案中，用不同的可区别可检测部分标记不同引物对。因此，例如，HEX和FAM荧光染料可存在于多重PCR中的不同引物对上并且与所得扩增子相结合。在其他实施方案中，正向引物经一个可检测部分标记，而反向引物经不同的可检测部分标记，例如FAM染料用于正向引物且HEX染料用于反向引物。使用不同的可检测部分可用于区分具有相同长度或长度极为相近的经扩增产物。
对于序列经修饰的核酸，靶可独立地选自顶部链或底部链。因此，所有要检测的靶可都包含顶部链、底部链或顶部链与底部链靶的组合。
一种用于实时PCR的通用方法使用荧光探针，例如探针、分子信标和Scorpion引物-探针。与检测最终经扩增产物的量的其他形式的定量PCR相比，实时PCR以更高特异性、灵敏度和再现性对模板的初始量进行定量。实时PCR不检测扩增子的尺寸。ScorpionTM和技术中采用的探针是基于荧光淬灭原理并且涉及供体荧光团和淬灭部分。
实时PCR是使用能检测PCR扩增产物积累的任何适宜仪器来进行。更通常地，该仪器能检测来自一种或多种荧光标记的荧光。例如，在仪器(例如，ABI实时PCR系统序列检测器)上的实时检测在每一PCR循环期间监控荧光并计算报道信号的测量或Rn值。阈值循环或Ct值是荧光与阈值相交的循环。阈值可通过序列检测系统软件或以人工方式测定。
在一些实施方案中，所采用探针以可检测方式经标记并且检测是通过检测每一扩增产物的探针标记来完成。淬灭剂可进一步与可检测标记相结合，以防止在探针的靶扩增之前就检测到该标记。探针是所述探针的例子。
探针(Heid等人，Genome Res.6:986-994,1996)使用Taq聚合酶的荧光5'外切核酸酶活性来测量DNA样品中靶序列的量。探针是含有通常位于5'碱基处或附近的供体荧光团和通常位于3'碱基处或附近的淬灭部分的寡核苷酸。淬灭剂部分可为染料，例如TAMRA；或可为非荧光分子，例如4-(4-二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL)。参见Tyagi等人，16Nature Biotechnology 49-53(1998)。在被辐照时，所激发的荧光供体通过FRET而非发荧光将能量转移至附近的淬灭部分。因此，供体与淬灭剂紧密靠近在探针完整时防止供体荧光发射。
探针设计为与PCR产物的内部区域复性。在聚合酶复制探针结合于其上的模板时，其5'外切核酸酶活性裂解探针。这终止了淬灭剂(无FRET)的活性，并且供体荧光团开始发射荧光，该荧光在每一循环中与探针裂解率成比例增加。PCR产物的积累是通过监控报道染料荧光的增加来检测。如果淬灭剂是受体荧光团，那么PCR产物的积累可通过监控受体荧光团的荧光的减少来检测。
在某些实施方案中，实时PCR是使用双功能引物-探针检测系统(例如，ScorpionTM引物)来进行。使用Scorpion引物时，序列特异性启动和PCR产物检测是使用单一分子来实现。Scorpion引物维持呈未杂交状态的茎-环构造。荧光团附接至5'端并通过与3'端偶合的部分来淬灭，但在某些实施方案中，可切换这种配置。茎和/或环的3'部分还含有与引物延长产物互补并且通过不可扩增单体与特定引物的5'端相连的序列。在引物部分延长后，特定探针序列能结合至其在经延长扩增子内的互补体，由此打开发夹环。这防止荧光淬灭并观察到信号。特定靶通过反向引物和ScorpionTM引物的引物部分扩增，得到延长产物。荧光信号是由于ScorpionTM引物的探针元件与延长产物结合，导致荧光团与淬灭剂分离而生成。
在一些实施方案中，所公开方法中所用的探针包含设计为检测具有遗传变异的DNA序列节段的短荧光标记DNA序列或由其组成，例如French等人，Mol Cell Probes,5(6):363-74(2001)中公开的那些探针，该文献是通过引用全文结合在此。是这类探针的例子。
在该方法的一些实施方案中，每个引物对的至少一个引物或扩增反应中的至少一个探针包含可检测部分。可替代地，可检测部分可位于附接至引物的探针上，例如与引物-探针一起。在一些实施方案中，可检测部分或标记是荧光团。适宜荧光部分包括但不限于以下荧光团：4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸基均二苯乙烯-2,2'二磺酸、吖啶和衍生物(吖啶、吖啶异硫氰酸酯)、Alexa Fluors(Alexa350、Alexa488、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647(MolecularProbes))、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5-二磺酸酯(荧光黄VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、R-6G、530/550、FL、亮黄、Cal荧光红(CFR610)、香豆素和衍生物(香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151))、焰红染料、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、5'、5”-二溴焦没食子酚-磺酞(溴焦酚红)、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素、二乙烯三胺五乙酸酯、4,4'-二异硫氰酸基二氢-均二苯乙烯-2,2'-二磺酸、4,4'-二异硫氰酸基均二苯乙烯-2,2'-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)、4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL)、4-二甲基氨基苯基偶氮基苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)、EclipseTM(Epoch Biosciences Inc.)、曙红和衍生物(曙红、曙红异硫氰酸酯)、赤藓红和衍生物(赤藓红B、赤藓红异硫氰酸酯)、胡米胺、荧光素和衍生物(5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、QFITC(XRITC)、四氯荧光素(TET)、荧光胺、IR144、IR1446、镧系磷光体、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-甲基伞形酮、邻甲酚酞、硝基酪氨酸、副玫瑰苯胺、酚红、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、Oregon碘化丙啶、芘和衍生物(芘、芘丁酸酯、琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯)、7、9、21、35(MolecularProbes)、反应红4(亮红3B-A)、罗丹明和衍生物(6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明绿、罗丹明X异硫氰酸酯、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、核黄素、玫红酸、铽螯合物衍生物、Quasar和
适宜淬灭剂是基于特定荧光团的荧光光谱来选择。可用淬灭剂包括例如BlackHoleTM淬灭剂BHQ-1、BHQ 2和BHQ-3(Biosearch Technologies,Inc.)以及ATTO系列淬灭剂(ATTO 540Q、ATTO 580Q和ATTO 612Q；Atto-Tec GmbH)。
在该方法的一些实施方案中，使反应-样品混合物经历实时RT-PCR条件，在该条件下，存于生物样品中的每一靶核酸发生扩增并且检测和测量扩增产物。在一些实施方案中，在不进行单独的前端样本制备的情况下将生物样品直接加载至直接扩增盘中，之后在同一盘中对靶分析物进行实时RT-PCR检测和区分。在某些实施方案中，扩增是在直接扩增盘(8孔盘，来自Focus Diagnostics,Inc.)中进行。在一些实施方案中，实时RT-PCR扩增是使用SIMPLEXATM直接测定在直接扩增盘中进行，并且检测是使用集成热循环仪来进行，例如由Focus Diagnostics(Cypress，加利福尼亚州，美国)出售的集成循环仪。集成循环仪可接收直接扩增盘并且能在每个盘上进行多个测定。这种装置可以>5℃/秒加热并以>4℃/秒冷却。循环参数可变，取决于要延长的扩增产物的长度。在某些实施方案中，内部阳性扩增对照(IPC)可包括于样品中，利用寡核苷酸引物、探针和/或引物-探针。
检测靶核酸的备选方法
可替代地，靶核酸的检测可通过测量反应终点来进行。在终点检测中，扩增子可通过以下方式来检测：首先对扩增子进行尺寸分离，之后检测经尺寸分离的扩增子。不同尺寸扩增子的分离可通过以下各项来完成：凝胶电泳、柱色谱、毛细管电泳或本领域已知的其他分离方法。
可将可检测标记纳入核酸中，与核酸结合或与核酸偶联。标记可通过不同长度的间隔体臂附接，以减少潜在的位阻或对其他有用或所需性质的影响。参见，例如Mansfield,9Mol.Cell.Probes 145-156(1995)。可通过共价或非共价方式将可检测标记纳入核酸中，例如，通过转录，例如通过使用Klenow聚合酶进行随机引物标记，或切口平移，或扩增，或如本领域中已知的等效方式。例如，将核苷酸碱基偶联至可检测部分，例如荧光染料，随后将其在核酸合成或扩增期间纳入核酸中。
帮助检测靶核酸的其他有用标记的例子包括放射性同位素(例如，32P、35S、3H、14C、125I、131I)、电子致密试剂(例如，金)、酶(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记(例如，胶体金)、磁性标记(例如，DynabeadsTM)、生物素、地高辛配基或可获得针对其的抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。其他标记包括能分别与相应受体或寡核苷酸互补体形成复合物的配体或寡核苷酸。可将标记直接纳入要检测的核酸中，或可将标记附接至与要检测的核酸杂交或结合的探针(例如，寡核苷酸)或抗体。
在其他实施方案中，可使用荧光核苷酸类似物来标记核酸，参见，例如Jameson,Methods.Enzymol.278:363-390(1997)；Zhu,Nucl.Acids Res.22:3418-3422(1994)。美国专利第5,652,099号和第6,268,132号也描述了用于通过酶或化学合成纳入核酸(例如DNA和/或RNA)或寡核苷酸中以产生荧光寡核苷酸的核苷类似物。美国专利第5,135,717号描述用作荧光标记的酞菁和四苯并三氮杂卟啉试剂。
在一些实施方案中，以可检测方式经标记的探针可用于杂交测定中，包括但不限于RNA印迹、DNA印迹、微阵列、斑点或槽印迹以及原位杂交测定，例如荧光原位杂交(FISH)，以检测生物样品内的靶核酸序列。某些实施方案可采用杂交方法来测量多核苷酸基因产物(例如mRNA)的表达。用于实施多核苷酸杂交测定的方法已在本领域中发展成熟。杂交测定程序和条件将根据应用而改变，并且根据已知通用结合方法加以选择，包括以下文献中所提到的那些：Maniatis等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)(第2版，Cold Spring Harbor，纽约,1989)；Berger和Kimmel Methods inEnzymology,第152卷，分子克隆技术指南(Guide to Molecular Cloning Techniques)(Academic Press,Inc.,圣地亚哥，加利福尼亚州，1987)；Young和Davis,PNAS.80:1194(1983)。
本技术的诺如病毒筛选测定
在本公开文本的多个实施方案中，引物和探针在本文所述方法中用于扩增和检测诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)的靶核酸序列。另外，引物也可用于扩增一种或多种对照核酸序列。在一些实施方案中，对照核酸序列包含CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAA(SEQ ID NO:12)，并且包含5'dCTCGTCGACAATGGCGGAA 3'(SEQ ID NO:13)的正向引物、包含5'd TTCAGCGACCCCGTTAGC 3'(SEQ ID NO:14)的反向引物和包含5'd GCTTGGGGCGACAGTCACGTCGC 3'(SEQ ID NO:15)的以可检测方式标记的核酸探针用于扩增对照核酸序列。
本技术的引物和探针在本文所述方法中用于扩增和检测包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的序列的诺如病毒基因群I(GI)靶核酸，以及包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的序列的诺如病毒基因群II(GII)靶核酸。本文所述靶核酸可利用用于每一靶的个别标记个别检测或以多重模式检测。
用于扩增和检测对诺如病毒基因群I(GI)具有特异性的标记物基因的全部或片段的特异性引物、探针和引物-探针包括针对诺如病毒基因群I(GI)中存在但在其他诺如病毒基因群中不存在的序列的那些。对诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的检测有助于区分含有诺如病毒基因群I(GI)的样品与可能含有另一致病诺如病毒基因群(例如，诺如病毒基因群II(GII))的样品。诺如病毒基因群I(GI)的适宜标记物是诺如病毒GI.2的基因序列(参见，例如基因库(GenBank)登录号FJ515294)并且显示于下文中。
(SEQ ID NO:1)
使用本文所公开的方法生成的诺如病毒基因群I(GI)扩增子的核酸序列加双下划线，并且表示为SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，靶核酸对应于SEQ ID NO:1的核苷酸5288-5374(即SEQ IDNO:2)或其片段。用于扩增和检测诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列的实例性引物和经标记探针序列包括：
诺如病毒基因群II(GII)的适宜标记物是诺如病毒Hu/休斯顿(Houston)/TCH186/2002/US的基因序列，以基因库登录号EU 310927提供并且显示于下文中。
(SEQ ID NO:3)
使用本文所公开的方法生成的诺如病毒基因群II(GII)扩增子的核酸序列加下划线，并且表示为SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中，靶核酸对应于SEQ ID NO:3的核苷酸5013-5100(即SEQ IDNO:4)或其片段。用于扩增和检测诺如病毒基因群II(GII)靶核酸序列的实例性引物和经标记探针序列包括：
本文中公开的诺如病毒基因群I(GI)和基因群II(GII)探针序列和对照探针序列可偶联至BHQ-1或BHQ-2淬灭剂部分。另外，本技术的诺如病毒基因群I(GI)和基因群II(GII)探针序列和对照探针序列可以可检测方式用本文所公开的任何荧光团标记。
因此，使用所公开方法对诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)进行定性检测和区分可利用用于在具有集成循环仪系统的直接扩增盘上扩增和检测诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸序列的引物对、经标记探针和实时RT-PCR。使用这种方法，通过荧光标记探针在同一反应中对靶核酸进行特异性扩增和同时检测。与诺如病毒基因群I(GI)靶核酸或其互补体特异性地杂交的探针可包含CFR610标记，并且与诺如病毒基因群II(GII)靶核酸或其互补体特异性地杂交的探针可包含FAM标记。与对照靶核酸或其互补体特异性地杂交的探针可包含Q670荧光团。
因此，在一个方面中，本公开文本提供用于检测粪便样品中至少一种诺如病毒基因群的存在的方法，该方法包括：(a)使粪便样品与以下各项接触：(i)扩增诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的第一引物对，该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；和(ii)扩增诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的第二引物对，该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸，以在如下条件下产生反应-样品混合物：其中在不从粪便样品提取靶核酸的情况下，进行粪便样品中诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸(如果存在)的扩增；(b)使反应-样品混合物经历实时RT-PCR条件，在该条件下粪便样品中存在的每一靶核酸经扩增以产生荧光信号；(c)检测步骤(b)中产生的每一经扩增靶核酸生成的荧光信号；和(d)通过评估每一靶核酸的荧光信号来检测粪便样品中至少一种诺如病毒基因群的存在，其中检测到诺如病毒基因群I(GI)靶核酸指示粪便样品中存在诺如病毒基因群I(GI)；并且检测到诺如病毒基因群II(GII)靶核酸指示粪便样品中存在诺如病毒基因群II(GII)；并且其中在扩增前不对粪便样品进行提取或纯化步骤。实时RT-PCR扩增可在与集成热循环仪协作的直接扩增盘中进行。在一些实施方案中，诺如病毒基因群I(GI)包含选自下组的一个或多个基因型，该组由以下各项组成：GI.1、GI.2、GI.3、GI.4、GI.5、GI.6、GI.7、GI.8、GI.9、GI.10和GI.14。在某些实施方案中，诺如病毒基因群II(GII)包含选自下组的一个或多个基因型，该组由以下各项组成：GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.5、GII.6、GII.7、GII.8、GII.9、GII.10、GII.11、GII.12、GII.13、GII.14、GII.15、GII.16、GII.17、GII.18、GII.19、GII.20、GII.21、GII.22和GII.23。在一些实施方案中，粪便样品包含未成形粪便、成形粪便或储存于液体Amies培养基中的直肠拭子。
对诺如病毒感染的治疗
诺如病毒基因组是7.5-8.0kb，具有5’VPg蛋白帽、3'多腺苷酸化尾和三个开放式阅读框(ORF)。ORF1编码非结构性多聚蛋白，而ORF2和ORF3分别编码主要结构蛋白VP1和次要结构蛋白VP2。多聚蛋白在五个裂解位点裂解，产生六种蛋白质：p48(NS1/2)、解旋酶(NS3-NTPase)、p22(NS4)、VPg(NS5)、蛋白酶(NS6pro)和RNA依赖性RNA聚合酶(NS7pol)。所有诺如病毒蛋白都可为潜在抗病毒靶。多种病毒在受感染宿主内和受感染宿主之间展示高遗传异质性。评价患者内病毒遗传多样性对于设计有效疫苗必不可少，并且对于抗病毒疗法的成功必不可少。
本文中公开用于测定患有急性胃肠炎的患者是否将受益于用单独的或与靶向诺如病毒基因群I(GI)的治疗剂组合的抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂治疗的方法。
抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂的例子包括GII.4/VA387源P颗粒疫苗(Kocher J等人，J Virol.88(17):9728–9743(2014))、GII.4源病毒样颗粒(VLP)疫苗(Souza M等人，Vaccine 25(50):8448–8459(2007)；Debbink K等人，J Virol.88(13):7256–7266(2014))、具有铝胶佐剂的源自共有GII.4序列和诺沃克病毒的VLP(Parra GI等人，Vaccine 30(24):3580–3586(2012))、和源自GII.4人类诺如病毒VP1和轮状病毒VP6抗原的VLP(Blazevic V等人，Vaccine 29(45):8126–8133(2011))。
可抑制诸如诺如病毒基因群I(GI)等多个诺如病毒基因群的治疗剂的例子包括但不限于血清组织血型抗原(HBGA)阻断抗体、利巴韦林、法匹拉韦、2'-C-甲基胞苷、舒拉明相关化合物、IFNα、β或γ、诺如病毒3CL蛋白酶的二肽基抑制剂(Kankanamalage等人，J MedChem.58(7):3144–3155(2015)；Takahashi等人，Virus Res.178(2):437–444(2013))、吡哆醛-5'-磷酸-6-(2'-萘基偶氮-6'-硝基-4',8'-二磺酸)四钠盐(PPNDS)、人类诺如病毒RNA依赖性RNA聚合酶的萘-磺酸盐抑制剂(Tarantino等人，Antiviral Res.2014；102:23–28)、萘二磺酸盐(NAF2)、非核苷抑制剂、GI.1加GII.4共有VLP二价疫苗(Treanor JJ等人，JInfect Dis.210(11):1763–1771(2014))和小分子去泛素化酶抑制剂(Gonzalez-Hernandez MJ等人，PLoS ONE 9(4):e94491(2014))。
在一个方面中，本公开文本提供选择患有急性胃肠炎的患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂治疗的方法，该方法包括：(a)使从该患者获得的粪便样品与以下各项接触：(i)扩增诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的第一引物对，该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；和(ii)扩增诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的第二引物对，该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸，以在如下条件下产生反应-样品混合物：其中在不从粪便样品提取靶核酸的情况下，进行粪便样品中诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸(如果存在)的扩增；(b)使反应-样品混合物经历实时RT-PCR条件，在该条件下粪便样品中存在的每一靶核酸经扩增以产生荧光信号；(c)检测步骤(b)中产生的每一经扩增靶核酸生成的荧光信号；和(d)如果检测到诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的荧光信号，则选择该患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂治疗，其中在扩增前不对粪便样品进行提取或纯化步骤。在一些实施方案中，实时RT-PCR扩增是在与集成热循环仪协作的直接扩增盘中进行。
在一些实施方案中，抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂是选自下组的一种或多种药剂，该组由以下各项组成：GII.4/VA387源P颗粒疫苗(Kocher J等人，J Virol.88(17):9728–9743(2014))、GII.4源病毒样颗粒(VLP)疫苗(Souza M等人，Vaccine 25(50):8448–8459(2007)；Debbink K等人，J Virol.88(13):7256–7266(2014))、具有铝胶佐剂的源自共有GII.4序列和诺沃克病毒的VLP(Parra GI等人，Vaccine 30(24):3580–3586(2012))、和源自GII.4人类诺如病毒VP1和轮状病毒VP6抗原的VLP(Blazevic V等人，Vaccine 29(45):8126–8133(2011))。
在一个方面中，本公开文本提供选择患有急性胃肠炎的患者以供用抑制诺如病毒基因群I(GI)的治疗剂治疗的方法，该方法包括：(a)使从该患者获得的粪便样品与以下各项接触：(i)扩增诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的第一引物对，该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；和(ii)扩增诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的第二引物对，该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸，以在如下条件下产生反应-样品混合物：其中在不从粪便样品提取靶核酸的情况下，进行粪便样品中诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸(如果存在)的扩增；(b)使反应-样品混合物经历实时RT-PCR条件，在该条件下粪便样品中存在的每一靶核酸经扩增以产生荧光信号；(c)检测步骤(b)中产生的每一经扩增靶核酸生成的荧光信号；和(d)如果检测到诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的荧光信号，则选择该患者以供用抑制诺如病毒基因群I(GI)的治疗剂治疗，其中在扩增前不对粪便样品进行提取或纯化步骤。在一些实施方案中，实时RT-PCR扩增是在与集成热循环仪协作的直接扩增盘中进行。
在该方法的一些实施方案中，抑制诺如病毒基因群I(GI)的治疗剂是选自下组的一种或多种药剂，该组由以下各项组成：血清组织血型抗原(HBGA)阻断抗体、利巴韦林、法匹拉韦、2'-C-甲基胞苷、舒拉明相关化合物、IFNα、β或γ、诺如病毒3CL蛋白酶的二肽基抑制剂(Kankanamalage等人，J Med Chem.58(7):3144–3155(2015)；Takahashi等人，VirusRes.178(2):437–444(2013))、吡哆醛-5'-磷酸-6-(2'-萘基偶氮-6'-硝基-4',8'-二磺酸)四钠盐(PPNDS)、人类诺如病毒RNA依赖性RNA聚合酶的萘-磺酸盐抑制剂(Tarantino等人，Antiviral Res.2014；102:23–28)、萘二磺酸盐(NAF2)、非核苷抑制剂、GI.1加GII.4共有VLP二价疫苗(Treanor JJ等人，J Infect Dis.210(11):1763–1771(2014))和小分子去泛素化酶抑制剂(Gonzalez-Hernandez MJ等人，PLoS ONE 9(4):e94491(2014))。
在另一方面中，本公开文本提供选择患有急性胃肠炎的患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂和抑制诺如病毒基因群I(GI)的另一治疗剂治疗的方法，该方法包括：(a)使从该患者获得的粪便样品与以下各项接触：(i)扩增诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的第一引物对，该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；和(ii)扩增诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的第二引物对，该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸，以在如下条件下产生反应-样品混合物：其中在不从粪便样品提取靶核酸的情况下，进行粪便样品中诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸(如果存在)的扩增；(b)使反应-样品混合物经历实时RT-PCR条件，在该条件下粪便样品中存在的每一靶核酸经扩增以产生荧光信号；(c)检测步骤(b)中产生的每一经扩增靶核酸生成的荧光信号；和(d)如果检测到(i)诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的荧光信号和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的荧光信号，则选择该患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂和抑制诺如病毒基因群I(GI)的另一治疗剂治疗，其中在扩增前不对粪便样品进行提取或纯化步骤。
在该方法的一些实施方案中，抑制诺如病毒基因群I(GI)的另一治疗剂是选自下组的一种或多种药剂，该组由以下各项组成：血清组织血型抗原(HBGA)阻断抗体、利巴韦林、法匹拉韦、2'-C-甲基胞苷、舒拉明相关化合物、IFNα、β或γ、诺如病毒3CL蛋白酶的二肽基抑制剂(Kankanamalage等人，J Med Chem.58(7):3144–3155(2015)；Takahashi等人，Virus Res.178(2):437–444(2013))、吡哆醛-5'-磷酸-6-(2'-萘基偶氮-6'-硝基-4',8'-二磺酸)四钠盐(PPNDS)、人类诺如病毒RNA依赖性RNA聚合酶的萘-磺酸盐抑制剂(Tarantino等人，Antiviral Res.2014；102:23–28)、萘二磺酸盐(NAF2)、非核苷抑制剂、GI.1加GII.4共有VLP二价疫苗(Treanor JJ等人，J Infect Dis.210(11):1763–1771(2014))和小分子去泛素化酶抑制剂(Gonzalez-Hernandez MJ等人，PLoS ONE 9(4):e94491(2014))。
在该方法的一些实施方案中，诺如病毒3CL蛋白酶的二肽基抑制剂是选自下组的一种或多种化合物，该组由以下各项组成：GC376、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸2-氯苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸3-氯苄基酯、((S)-1-环己基-2-氧代-2-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)乙基)氨基甲酸3-氯苄基酯、((S)-4-甲基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)戊烷-2-基)氨基甲酸3-氯苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸4-氯苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸2-氟苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸3-氟苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸3-溴苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸3-碘苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸2-甲氧基苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸3-甲氧基苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸3-氰基苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸3-((叔丁氧基羰基)氨基)苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸3-硝基苄基酯、((S)-4-甲基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)戊烷-2-基)氨基甲酸苄基酯、((S)-3-环己基-1-氧代-1-(((S)-1-氧代-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)丙烷-2-基)氨基甲酸苄基酯、((2S)-3-环己基-1-(((2S)-1-(二乙氧基磷酰基)-1-羟基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸2-氯苄基酯、((2S)-3-环己基-1-(((2S)-1-(二乙氧基磷酰基)-1-羟基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸3-氯苄基酯、((2S)-3-环己基-1-(((2S)-1-(二乙氧基磷酰基)-1-羟基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸2-氟苄基酯、((2S)-3-环己基-1-(((2S)-1-(二乙氧基磷酰基)-1-羟基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸3-溴苄基酯、(2S)-2-((S)-2-((((2-氯苄基)氧基)羰基)氨基)-3-环己基丙酰胺基)-1-羟基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-1-磺酸钠、(2S)-2-((S)-2-((((3-氯苄基)氧基)羰基)氨基)-3-环己基丙酰胺基)-1-羟基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-1-磺酸钠、(2S)-2-((S)-2-((((3-溴苄基)氧基)羰基)氨基)-3-环己基丙酰胺基)-1-羟基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-1-磺酸钠、(2S)-2-((S)-3-环己基-2-((((3-碘苄基)氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-1-羟基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-1-磺酸钠、(2S)-2-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-4-甲基戊酰胺基)-1-羟基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-1-磺酸钠、(2S)-2-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-环己基丙酰胺基)-1-羟基-3-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丙烷-1-磺酸钠、((S)-3-环己基-1-(((S)-4-(环丙基氨基)-3,4-二氧代-1-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丁烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸3-氯苄基酯、((S)-1-(((S)-4-(环丙基氨基)-3,4-二氧代-1-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丁烷-2-基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸3-氯苄基酯、((S)-3-环己基-1-(((S)-4-(环丙基氨基)-3,4-二氧代-1-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丁烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸3-氟苄基酯、((S)-3-环己基-1-(((S)-4-(环丙基氨基)-3,4-二氧代-1-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丁烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸3-溴苄基酯和((S)-1-(((S)-4-(环丙基氨基)-3,4-二氧代-1-((S)-2-氧代吡咯烷-3-基)丁烷-2-基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸苄基酯。
在该方法的一些实施方案中，舒拉明相关化合物是选自下组的一种或多种化合物，该组由以下各项组成：4-(4-甲基-3-硝基苄酰胺基)萘-1,5-二磺酸二钠盐、4-(3-氨基-4-甲基苄酰胺基)萘-1,5-二磺酸二钠盐、4-[4-甲基-3-(3-硝基苄酰胺基)苄酰胺基]萘-1,5-二磺酸二钠盐、4-[3-(3-氨基苄酰胺基)-4-甲基苄酰胺基]萘-1,5-二磺酸二钠盐和4-4'-(羰基双[亚氨基-3,1-亚苯基羰基亚氨基(4-甲基-3,1-亚苯基)羰基亚氨基])双-1,5-萘二磺酸四钠盐。
在该方法的某些实施方案中，非核苷抑制剂选自下组,该组由以下各项组成:NIC02、NIC04、NIC10和NIC 12(参见Eltahla等人，Antimicrob Agents Chemother.58(6):3115–3123(2014))。
在该方法的一些实施方案中，其中抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂是选自下组的一种或多种药剂，该组由以下各项组成：GII.4/VA387源P颗粒疫苗(Kocher J等人，JVirol.88(17):9728–9743(2014))、GII.4源病毒样颗粒(VLP)疫苗(Souza M等人，Vaccine25(50):8448–8459(2007)；Debbink K等人，J Virol.88(13):7256–7266(2014))、具有铝胶佐剂的源自共有GII.4序列和诺沃克病毒的VLP(Parra GI等人，Vaccine 30(24):3580–3586(2012))、和源自GII.4人类诺如病毒VP1和轮状病毒VP6抗原的VLP(Blazevic V等人，Vaccine 29(45):8126–8133(2011))。
试剂盒
本公开文本还提供用于检测对应于致病诺如病毒基因群(例如，GI和GII)的靶核酸序列的试剂盒。在一些实施方案中，诺如病毒基因群I(GI)包含选自下组的基因型，该组由以下各项组成：GI.1、GI.2、GI.3、GI.4、GI.5、GI.6、GI.7、GI.8、GI.9、GI.10和GI.14。在某些实施方案中，诺如病毒基因群II(GII)包含选自下组的基因型，该组由以下各项组成：GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.5、GII.6、GII.7、GII.8、GII.9、GII.10、GII.11、GII.12、GII.13、GII.14、GII.15、GII.16、GII.17、GII.18、GII.19、GII.20、GII.21、GII.22和GII.23。
本技术的试剂盒包含至少两种寡核苷酸，其可用作引物或引物-探针用于扩增对应于诺如病毒基因群(例如，GI和GII)的一个或多个靶核酸序列，以测定生物样品中致病诺如病毒基因群(例如，GI和GII)的存在。
在一些实施方案中，本技术的试剂盒包含单一引物对，其与对应于选自由GI和GII组成的组的诺如病毒基因群的靶核酸特异性地杂交。在其他实施方案中，本技术的试剂盒包含多个引物对，其包含与对应于诺如病毒基因群I(GI)的靶核酸特异性地杂交的第一引物对，以及与对应于诺如病毒基因群II(GII)的靶核酸特异性地杂交的第二引物对。
在上文任一实施方案中，对应于诺如病毒基因群I(GI)的靶核酸包含与SEQ IDNO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸序列；并且对应于诺如病毒基因群II(GII)的靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸序列。
在一些实施方案中，试剂盒包含第一引物对能够与对应于诺如病毒基因群I(GI)的靶核酸特异性地杂交的第一引物对，该对应于诺如病毒基因群I(GI)的靶核酸包含与SEQID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸。另外或可替代地，试剂盒包含能够与对应于诺如病毒基因群II(GII)的靶核酸特异性地杂交的第二引物对，该对应于诺如病毒基因群II(GII)的靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸。
在一些实施方案中，试剂盒包含选自以下的一个或多个引物对：5'dCGYTGGATGCGITTYCATGA 3'(SEQ ID NO:5)和5'd TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC 3'(SEQ IDNO:6)(GI引物对)；以及5'd TGTTYAGGTGGATGAGRTTCTCIGA 3'(SEQ ID NO:9)和5'dTCGACGCCATCTTCATTCACA 3'(SEQ ID NO:10)(GII引物对)。另外或可替代地，试剂盒包含由以下各项组成的内部对照引物对：包含5'd CTCGTCGACAATGGCGGAA 3'(SEQ ID NO:13)的第三正向引物和包含5'd TTCAGCGACCCCGTTAGC 3'(SEQ ID NO:14)的第三反向引物。
另外或可替代地，在一些实施方案中，试剂盒提供单一核酸探针，该探针与对应于选自由GI和GII组成的组的诺如病毒基因群的靶核酸特异性地杂交。在其他实施方案中，本技术的试剂盒包含多个核酸探针，该探针包含至少一个与对应于诺如病毒基因群I(GI)的靶核酸特异性地杂交的核酸探针，该对应于诺如病毒基因群I(GI)的靶核酸包含与SEQ IDNO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；和/或至少一个与对应于诺如病毒基因群II(GII)的靶核酸特异性地杂交的核酸探针，该对应于诺如病毒基因群II(GII)的靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸。
在一些实施方案中，试剂盒包含与对应于诺如病毒基因群I(GI)的靶核酸的区段特异性地杂交的第一核酸探针，该对应于诺如病毒基因群I(GI)的靶核酸包含与SEQ IDNO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸，并且该第一核酸探针经荧光团以可检测方式标记。
另外或可替代地，在一些实施方案中，试剂盒包含与对应于诺如病毒基因群I(GI)的靶核酸的区段特异性地杂交的第二核酸探针，该对应于诺如病毒基因群I(GI)的靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸，并且该第二核酸探针经荧光团以可检测方式标记。在某些实施方案中，试剂盒还包含与对应于诺如病毒基因群II(GII)的靶核酸的区段特异性地杂交的第三核酸探针，该对应于诺如病毒基因群II(GII)的靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸，并且该第三核酸探针经荧光团以可检测方式标记。
在一些实施方案中，试剂盒包含选自以下各项的一个或多个核酸探针：5'dTGGACAGGAGAYCGCIATCTCYTGCCCGA 3'(SEQ ID NO:7)或其互补体(GI探针)；5'dTGGACAGGAGATCGCAATCTACTGCCTGA 3'(SEQ ID NO:8)或其互补体(GI探针)；和5'dACGTGGGAGGGCGATCGCAATCT 3'(SEQ ID NO:11)或其互补体(GII探针)。另外或可替代地，试剂盒包含内部对照核酸探针，该内部对照核酸探针包含序列5'dGCTTGGGGCGACAGTCACGTCGC 3'(SEQ ID NO:15)或其互补体。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有浓度为750nM或更低的至少一种靶特异性核酸探针的液体培养基。使用所述试剂盒，以所需量提供探针以根据本技术进行可靠的多重检测反应。在一些实施方案中，靶特异性核酸探针以可检测方式经标记。
在一些实施方案中，试剂盒还包含缓冲液、具有聚合酶活性的酶、具有聚合酶活性且缺少5'→3'外切核酸酶活性或5'→3'和3'→5'两种外切核酸酶活性的酶、酶辅因子(例如镁或锰)、盐、链延长核苷酸(例如脱氧核苷三磷酸(dNTP)、经修饰dNTP、核酸酶抗性dNTP或经标记dNTP)，以上各项为实施测定或反应(例如对应于诺如病毒基因群(例如，GI和GII)的靶核酸序列的扩增和/或检测)所必需。
在一个实施方案中，本技术的试剂盒还包含阳性对照核酸序列和阴性对照核酸序列，以在实验运行期间确保测定的完整性。试剂盒可进一步含有用于比较粪便样品与参考核酸样品(例如，具有诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)中一个或多个的已知拷贝数的样品)中的诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)的一个或多个的拷贝数的工具。试剂盒还可包含使用说明、自动化分析用软件、容器、包装(计划用于商业销售的包装)等。
试剂盒可以还包含以下各项中的一个或多个：洗涤缓冲液和/或试剂、杂交缓冲液和/或试剂、标记缓冲液和/或试剂和检测工具。缓冲液和/或试剂通常针对试剂盒要用于的特定扩增/检测技术加以优化。试剂盒中还可包括使用这些缓冲液和试剂进行程序中的不同步骤的方案。
试剂盒另外可包含测定定义扫描卡和/或在测定中使用寡核苷酸的说明书，例如打印说明书或电子说明书。在一些实施方案中，试剂盒包含扩增反应混合物或扩增主混合物。试剂盒中包括的试剂可含于一个或多个容器中，例如小瓶。
扩增主混合物中可包括对DNA内部对照的扩增和检测具有特异性的引物、探针和/或引物-探针作为靶引物对，以监控潜在PCR抑制。靶和内部对照的扩增和检测所需的试剂可配置为全合一(all-in-one)扩增主混合物，其可作为单一反应等分部分提供于试剂盒中。
实施例
实施例1：使用SIMPLEXATM直接实时RT-PCR检测诺如病毒基因群
实时RT-PCR扩增和检测：将原始成形和未成形粪便样本悬浮于样品缓冲液中。对于直接扩增盘(Focus Diagnostics，Inc.，Cypress，加利福尼亚州，美国)上的每个反应，将50μL或mg的每种未经处理的粪便样品悬浮于2mL样品缓冲液中(或类似比例，即，25μL或mg于1mL样品缓冲液中)。随后，在不进行单独的前端样本制备步骤的情况下，将50μL的每种粪便-样品缓冲液混合物加载至样品端口中。将50μL诺如病毒直接反应混合物加载至反应端口中，其中反应混合物由以下各项组成：PCR缓冲液、DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、BSA、dNTP、氯化镁、氯化钾、由SEQ ID NO：5、6、9和10组成的引物(每种引物具有750nM的浓度)、由SEQ ID NO：7、8和11组成的探针(每种探针具有750nM的浓度)，以及内部对照肠杆菌MS2噬菌体RNA和对该对照MS2噬菌体(SEQ ID NO：13-15)具有特异性的引物对和探针(每种对照引物和对照探针具有187.5nM的浓度)。在组合反应混合物与样品时，GI和GII引物和探针各自于反应孔中的浓度为600nM，并且对照引物和探针各自于反应孔中的浓度为150nM(或分别为上述起始值的80％)。
由SEQ ID NO：7、8、11和15组成的探针分别经CFR610、CFR610、FAM和Q670标记。所有测试都是使用集成循环仪仪器(Focus Diagnostics，Cypress，加利福尼亚州)来进行。PCR循环条件包括以下步骤：
数据采集和分析是用集成循环仪工作室软件来进行。测定中包括掺有诺如病毒的阳性对照和阴性对照。在约90分钟内生成结果。
检测极限(LoD)：进行检测极限(LoD)研究以测定分析灵敏度。在检测极限(LoD)研究中使用诺如病毒基因型GI.1和GII.4(ZeptoMetrix,Buffalo，纽约)。每一病毒原液的LoD是指在汇集的人类成形阴性粪便基质(从10个临床样本汇集)中或在汇集的人类未成形阴性粪便基质(从10个临床样本汇集)中观察到诺如病毒的≥95％检测的最低浓度。
分析反应性：通过测序对先前使用实时RT-PCR测试的一组20个去识别化临床粪便样本(Focus Diagnostics：参考实验室)进行基因分型。20个样本代表5种来自GI的不同基因型(GI.2、GI.3、GI.6、GI.7和GI.8)和9种来自GII的不同基因型(GII.2、GII.3、GII.4、GII.5、GII.6、GII.7、GII.10、GII.13和GII.14)。所有20个样本都使用SIMPLEXATM诺如病毒直接测定来评估。还评价从外部供货商购买的对照样本。
表1：成形粪便中GI.1和GII.4基因型的LoD
表2：未成形粪便中GI.1和GII.4基因型的LoD
结果.LoD研究显示，SimplexaTM诺如病毒直接测定在成形粪便中以4.10x104TCID50/mL检测诺如病毒GI(GI.1基因型)并以1.23x 104TCID50/mL检测诺如病毒GII(GII.4基因型)(表1)。在未成形粪便中，诺如病毒GI(GI.1基因型)LoD和诺如病毒GII(GII.4基因型)LoD分别为4.10x 104和6.15x 103TCID50/mL(表2)。SimplexaTM诺如病毒直接测定能检测来自GI基因群的基因型GI.2、GI.3、GI.6、GI.7和GI.8。已在LoD研究中测试基因型GI.1。该测定还检测来自GII基因群的基因型GII.2、GII.3、GII.4(Sydney)、GII.5、GII.6、GII.7、GII.10、GII.13和GII.14。所有其他基因型都不能用于评估。
这些结果显示，SimplexaTM诺如病毒直接测定无需单独的核酸提取步骤即能直接检测并区分原始成形和未成形粪便样本中的诺如病毒GI和GII基因群。
实施例2：诺如病毒SIMPLEXATM直接实时RT-PCR结果与常规实时RT-PCR的比较
使用SimplexaTM诺如病毒直接测定评估先前使用常规实时RT-PCR测试的144个去识别化临床粪便样本(47个GI阳性、43个GII阳性和54个诺如病毒阴性，来自FocusDiagnostics：参考实验室)的诺如病毒。将SimplexaTM诺如病毒直接测定的结果与先前实时RT-PCR结果作比较，以测定阳性和阴性符合率。常规实时RT-PCR在进行实时RT-PCR的扩增步骤之前采用单独的核酸提取步骤。
表3：粪便样本的诺如病毒GI一致性
a 5个样本先前使用常规实时RT-PCR测试并且随后使用SimplexaTM诺如病毒直接测定来测试。使用CDC诺如病毒Taqman测定与Roche's MagNa Pure提取系统的组合，5个样本中有4个在CDC测定中测试为阴性。
表4：粪便样本的诺如病毒GII一致性
结果.使用144个去识别化临床样本，与常规实时RT-PCR结果的阳性和阴性符合率百分比对于诺如病毒GI为>89％(42/47)，且对于临床粪便样本为100％(97/97)(表3)。与常规实时RT-PCR结果的阳性和阴性符合率百分比对于诺如病毒GII为100％(43/43)，且对于临床粪便样本为100％(101/101)(表4)。这些结果显示，SimplexaTM诺如病毒直接测定无需单独的核酸提取步骤即能直接检测并区分原始成形和未成形粪便样本中的诺如病毒GI和GII基因群，并且表现与使用采用核酸提取的常规实时RT-PCR观察到的表现相当。
实施例3：内源和外源干扰物对诺如病毒多重测定的灵敏度的影响
评价潜在的内源和外源干扰物质对诺如病毒多重测定的灵敏度的影响。
干扰组人为设计为具有3倍LoD浓度的GI.1或GII.4。将每种物质掺入诺如病毒GI.1或GII.4人为样品中并使用SimplexaTM诺如病毒直接分析测试。每种干扰物的浓度列于表5-6中。使用汇集的成形阴性粪便基质或汇集的未成形阴性粪便基质创建该组。
表5：在人类粪便基质中测试的外源干扰物
表6：在人类粪便基质中测试的内源干扰物
结果.使用任一所测试外源干扰物(列于表5中)和内源干扰物(列于表6中)，在成形和未成形粪便基质二者中未检测到干扰。
实施例4：诺如病毒多重测定的交叉反应性。
使用细菌、真菌、寄生虫和病毒的多样化组来实施交叉反应星研究。将约106CFU/mL细菌、106CFU/mL真菌、106个细胞/mL寄生虫或105TCID50/mL病毒稀释至阴性成形和未成形人类粪便基质中,并且对每一测试样品进行诺如病毒多重测定。表7提供所测试不同病原体的完整列表。阳性交叉反应性的截止Ct值为42个循环。
表7：在原始成形和未成形粪便基质中测试的交叉反应性病原体
结果.使用表7中所列的任何病原体未检测到交叉反应性。
上述实施例显示，本技术的诺如病毒多重测定能快速检测并区分成形和未成形粪便样本二者中的诺如病毒GI和GII基因群，并且在进行实时RT-PCR之前不需要从粪便样本提取病毒核酸。
实施例5：检测液体Amies运送培养基中来自模拟直肠拭子的诺如病毒
这个实施例评估在使用液体Amies中的模拟直肠拭子作为样品输入时，本技术的诺如病毒多重测定检测诺如病毒的能力。
使用不同病毒载量的澄清诺如病毒GII.4 Sydney制备液体Amies培养基中的人为粪便样品。在制剂A中，将25mg汇集粪便基质添加至1mL Amies培养基中。制备总计4个样品。将澄清GII病毒掺入4个样品中以生成1000X、100X、10X和1X病毒载量样品。制剂B是使用相同方式来制备，但粪便量增加至50mg，并且病毒载量加倍以反映所用粪便量的增加。结果提供于下文中：
*在靶为阳性时，有效结果不需要内部对照信号。
在不进行本技术的诺如病毒多重测定中的稀释的情况下，横跨所有病毒载量，在液体Amies运行中的模拟直肠拭子人为粪便样品中直接检测到诺如病毒GII.4。
等效内容
本技术并非受限于本申请中描述的具体实施方案，计划将该实施方案作为本技术的个别方面的一对一说明。如本领域技术人员所明了，可在不背离本技术的精神和范围的情况下，对本技术进行多种修改和改变。本领域技术人员根据前述说明将明了，除了本文中列举的方法和装置以外，在本技术范围内的功能上等效的方法和装置。所述修改和改变旨在落于本技术的范围内。应理解，本技术不受限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，本技术当然是可变的。还应理解，本文中所用术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不意图具有限制性。
术语“包含”、“包括”、“含有”等应以可扩展且无限制的方式来理解。另外，本文采用的术语和表达已经被用作说明的术语并且没有限制性，并且并非旨在使用此类术语以及表达而将本发明示出或描述的特征的任何等效物或其一部分排除在外，但是将认识到的是提出要求保护的公开文本的范围之内的不同修改是有可能的。
另外，当本公开文本的特征或方面是按马库什组(Markush group)来描述时，本领域技术人员将意识到，本公开文本也由此是按马库什组的任何个别成员或成员子组来描述。
如本领域技术人员可理解，出于任一和所有目的，特别在提供书面说明方面，本文中公开的所有范围还涵盖任一和所有可能的子范围以及其子范围的组合。任何所列范围都可容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文中论述的每个范围可容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员可理解，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等言辞都包括所述数字并且涉及随后可分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员可理解，范围包括每一个别成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。
本文所提到或引用的所有专利、专利申请、待决申请和公开案都是通过引用全文结合在此，包括所有图形和表格，结合至其与本说明书的明确教示一致的程度。

Claims (56)

1.一种用于检测粪便样品中至少一种诺如病毒基因群的存在的方法，该方法包括：
使该粪便样品与以下各项接触：
i.扩增诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的第一引物对，该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；和
ii.扩增诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的第二引物对，该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；
以在如下条件下产生反应-样品混合物：其中如果该粪便样品中存在诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸，那么在不从该粪便样品提取该靶核酸的情况下进行该诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的实时RT-PCR扩增。
2.权利要求1的方法，其还包括：
(a)使该反应-样品混合物经历实时RT-PCR条件，在该条件下该粪便样品中存在的每一靶核酸经扩增以产生荧光信号；
(b)检测步骤(a)中产生的每一经扩增靶核酸生成的荧光信号；并且
(c)通过评估每一靶核酸的荧光信号来检测该粪便样品中至少一种诺如病毒基因群的存在，其中检测到该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸指示该粪便样品中存在诺如病毒基因群I(GI)；并且检测到该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸指示该粪便样品中存在诺如病毒基因群II(GII)；其中在扩增前不对该粪便样品进行提取或纯化步骤。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中该第一引物对由包含5'dCGYTGGATGCGITTYCATGA 3'(SEQ ID NO:5)的第一正向引物和包含5'dTCCTTAGACGCCATCATCATTTAC 3'(SEQ ID NO:6)的第一反向引物组成。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中该第二引物对由包含5'dTGTTYAGGTGGATGAGRTTCTCIGA 3'(SEQ ID NO:9)的第二正向引物和包含5'dTCGACGCCATCTTCATTCACA 3'(SEQ ID NO:10)的第二反向引物组成。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中诺如病毒基因群I(GI)包含选自下组的一个或多个基因型，该组由以下各项组成：GI.1、GI.2、GI.3、GI.4、GI.5、GI.6、GI.7、GI.8、GI.9、GI.10和GI.14，并且诺如病毒基因群II(GII)包含选自下组的一个或多个基因型，该组由以下各项组成：GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.5、GII.6、GII.7、GII.8、GII.9、GII.10、GII.11、GII.12、GII.13、GII.14、GII.15、GII.16、GII.17、GII.18、GII.19、GII.20、GII.21、GII.22和GII.23。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其还包括使该粪便样品与第一核酸探针接触，该第一核酸探针能够与SEQ ID NO:2或其互补体的该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中该第一核酸探针经可检测方式标记并且包含5'dTGGACAGGAGAYCGCIATCTCYTGCCCGA 3'(SEQ ID NO:7)或其互补体。
7.权利要求6的方法，其中该第一核酸探针经CFR610荧光团以可检测方式标记。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其还包括使该粪便样品与第二核酸探针接触，该第二核酸探针能够与SEQ ID NO:2或其互补体的该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中该第二核酸探针经可检测方式标记并且包含5'dTGGACAGGAGATCGCAATCTACTGCCTGA 3'(SEQ ID NO:8)或其互补体。
9.权利要求8的方法，其中该第二核酸探针经CFR610荧光团以可检测方式标记。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其还包括使该粪便样品与第三核酸探针接触，该第三核酸探针能够与SEQ ID NO:4或其互补体的该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中该第三核酸探针经可检测方式标记并且包含5'dACGTGGGAGGGCGATCGCAATCT 3'(SEQ ID NO:11)或其互补体。
11.权利要求10的方法，其中该第三核酸探针经FAM荧光团以可检测方式标记。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其还包括使该粪便样品与第三引物对接触，该第三引物对扩增SEQ ID NO:12或其互补体的对照靶核酸。
13.权利要求12的方法，其中该第三引物对由包含5'd CTCGTCGACAATGGCGGAA 3'(SEQID NO:13)的第三正向引物和包含5'd TTCAGCGACCCCGTTAGC 3'(SEQ ID NO:14)的第三反向引物组成。
14.权利要求12或13的方法，其还包括使该粪便样品与第四核酸探针接触，该第四核酸探针与该对照靶核酸或其互补体的区段特异性地杂交，其中该第四核酸探针经可检测方式标记并且包含5'd GCTTGGGGCGACAGTCACGTCGC 3'(SEQ ID NO:15)或其互补体。
15.权利要求14的方法，其中该第四核酸探针经Q670荧光团以可检测方式标记。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中实时RT-PCR扩增是在与集成热循环仪协作的直接扩增盘中进行。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中该粪便样品包含未成形粪便、成形粪便或储存于液体Amies培养基中的直肠拭子。
18.一种用于检测生物样品中至少一种致病诺如病毒基因群的存在的试剂盒，该试剂盒包含：
(a)扩增SEQ ID NO:2或其互补体的诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的第一引物对；和
(b)扩增SEQ ID NO:4或其互补体的诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的第二引物对。
19.权利要求18的试剂盒，其还包含扩增SEQ ID NO:12或其互补体的对照靶核酸的第三引物对。
20.权利要求18或19的试剂盒，其中该第一引物对能够与诺如病毒基因群I(GI)靶核酸特异性地杂交，该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸。
21.权利要求18-20中任一项的试剂盒，其中该第二引物对能够与诺如病毒基因群II(GII)靶核酸特异性地杂交，该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸。
22.权利要求18-21中任一项的试剂盒，其中该第一引物对由包含5'dCGYTGGATGCGITTYCATGA 3'(SEQ ID NO:5)的第一正向引物和包含5'dTCCTTAGACGCCATCATCATTTAC 3'(SEQ ID NO:6)的第一反向引物组成。
23.权利要求18-22中任一项的试剂盒，其中该第二引物对由包含5'dTGTTYAGGTGGATGAGRTTCTCIGA 3'(SEQ ID NO:9)的第二正向引物和包含5'dTCGACGCCATCTTCATTCACA 3'(SEQ ID NO:10)的第二反向引物组成。
24.权利要求19-23中任一项的试剂盒，其中该第三引物对由包含5'dCTCGTCGACAATGGCGGAA 3'(SEQ ID NO:13)的第三正向引物和包含5'dTTCAGCGACCCCGTTAGC 3'(SEQ ID NO:14)的第三反向引物组成。
25.权利要求18-24中任一项的试剂盒，其中该试剂盒还包含第一核酸探针，该第一核酸探针能够与SEQ ID NO:2或其互补体的该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中该第一核酸探针以可检测方式经标记。
26.权利要求25的试剂盒，其中该第一核酸探针包含5'dTGGACAGGAGAYCGCIATCTCYTGCCCGA 3'(SEQ ID NO:7)或其互补体。
27.权利要求26的试剂盒，其中该第一核酸探针经CFR610荧光团以可检测方式标记。
28.权利要求18-27中任一项的试剂盒，其中该试剂盒还包含第二核酸探针，该第二核酸探针能够与SEQ ID NO:2或其互补体的该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中该第二核酸探针以可检测方式经标记。
29.权利要求28的试剂盒，其中该第二核酸探针包含5'dTGGACAGGAGATCGCAATCTACTGCCTGA 3'(SEQ ID NO:8)或其互补体。
30.权利要求29的试剂盒，其中该第二核酸探针经CFR610荧光团以可检测方式标记。
31.权利要求18-30中任一项的试剂盒，其中该试剂盒还包含第三核酸探针，该第三核酸探针能够与SEQ ID NO:4或其互补体的该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中该第三核酸探针以可检测方式经标记。
32.权利要求31的试剂盒，其中该第三核酸探针包含5'd ACGTGGGAGGGCGATCGCAATCT3'(SEQ ID NO:11)或其互补体。
33.权利要求32的试剂盒，其中该第三核酸探针经FAM荧光团以可检测方式标记。
34.权利要求18-33中任一项的试剂盒，其还包含第四核酸探针，该第四核酸探针与SEQID NO:12或其互补体的该对照靶核酸的区段特异性地杂交，其中该第四核酸探针经可检测方式标记并且包含5'd GCTTGGGGCGACAGTCACGTCGC 3'(SEQ ID NO:15)或其互补体。
35.一种选择患有急性胃肠炎的患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂治疗的方法，该方法包括：
使从该患者获得的粪便样品与以下各项接触：
(i)扩增诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的第一引物对，该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；和
(ii)扩增诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的第二引物对，该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；
以在如下条件下产生反应-样品混合物：其中如果该粪便样品中存在诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸，那么在不从该粪便样品提取该靶核酸的情况下进行该诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的实时RT-PCR扩增。
36.权利要求35的方法，其还包括：
(a)使该反应-样品混合物经历实时RT-PCR条件，在该条件下该粪便样品中存在的每一靶核酸经扩增以产生荧光信号；
(b)检测步骤(a)中产生的每一经扩增靶核酸生成的荧光信号；并且
(c)如果检测到该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的荧光信号，则选择该患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂治疗，其中在扩增前不对该粪便样品进行提取或纯化步骤。
37.权利要求35或权利要求36的方法，其中该第一引物对由包含5'dCGYTGGATGCGITTYCATGA 3'(SEQ ID NO:5)的第一正向引物和包含5'dTCCTTAGACGCCATCATCATTTAC 3'(SEQ ID NO:6)的第一反向引物组成。
38.权利要求35-37中任一项的方法，其中该第二引物对由包含5'dTGTTYAGGTGGATGAGRTTCTCIGA 3'(SEQ ID NO:9)的第二正向引物和包含5'dTCGACGCCATCTTCATTCACA 3'(SEQ ID NO:10)的第二反向引物组成。
39.权利要求35-38中任一项的方法，其中诺如病毒基因群II(GII)包含选自下组的一个或多个基因型，该组由以下各项组成：GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.5、GII.6、GII.7、GII.8、GII.9、GII.10、GII.11、GII.12、GII.13、GII.14、GII.15、GII.16、GII.17、GII.18、GII.19、GII.20、GII.21、GII.22和GII.23。
40.权利要求35-39中任一项的方法，其还包括使该粪便样品与第一核酸探针接触，该第一核酸探针能够与SEQ ID NO:2或其互补体的该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中该第一核酸探针经可检测方式标记并且包含5'dTGGACAGGAGAYCGCIATCTCYTGCCCGA 3'(SEQ ID NO:7)或其互补体。
41.权利要求40的方法，其中该第一核酸探针经CFR610荧光团以可检测方式标记。
42.权利要求35-41中任一项的方法，其还包括使该粪便样品与第二核酸探针接触，该第二核酸探针能够与SEQ ID NO:2或其互补体的该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中该第二核酸探针经可检测方式标记并且包含5'dTGGACAGGAGATCGCAATCTACTGCCTGA 3'(SEQ ID NO:8)或其互补体。
43.权利要求42的方法，其中该第二核酸探针经CFR610荧光团以可检测方式标记。
44.权利要求35-43中任一项的方法，其还包括使该粪便样品与第三核酸探针接触，该第三核酸探针能够与SEQ ID NO:4或其互补体的该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸序列的区段特异性地杂交，其中该第三核酸探针经可检测方式标记并且包含5'dACGTGGGAGGGCGATCGCAATCT 3'(SEQ ID NO:11)或其互补体。
45.权利要求44的方法，其中该第三核酸探针经FAM荧光团以可检测方式标记。
46.权利要求35-45中任一项的方法，其还包括使该粪便样品与第三引物对接触，该第三引物对扩增SEQ ID NO:12或其互补体的对照靶核酸。
47.权利要求46的方法，其中该第三引物对由包含5'd CTCGTCGACAATGGCGGAA 3'(SEQID NO:13)的第三正向引物和包含5'd TTCAGCGACCCCGTTAGC 3'(SEQ ID NO:14)的第三反向引物组成。
48.权利要求46或47的方法，其还包括使该粪便样品与第四核酸探针接触，该第四核酸探针与该对照靶核酸或其互补体的区段特异性地杂交，其中该第四核酸探针经可检测方式标记并且包含5'd GCTTGGGGCGACAGTCACGTCGC 3'(SEQ ID NO:15)或其互补体。
49.权利要求48的方法，其中该第四核酸探针经Q670荧光团以可检测方式标记。
50.权利要求35-49中任一项的方法，其中实时RT-PCR扩增是在与集成热循环仪协作的直接扩增盘中进行。
51.权利要求35-50中任一项的方法，其中该粪便样品包含未成形粪便、成形粪便或储存于液体Amies培养基中的直肠拭子。
52.权利要求35-51中任一项的方法，其中抑制诺如病毒基因群II(GII)的该治疗剂是选自下组的一种或多种药剂，该组由以下各项组成：GII.4/VA387源P颗粒疫苗、GII.4源病毒样颗粒(VLP)疫苗、具有铝胶佐剂的源自共有GII.4序列和诺沃克病毒的VLP、以及源自GII.4人类诺如病毒VP1和轮状病毒VP6抗原的VLP。
53.一种选择患有急性胃肠炎的患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂和抑制诺如病毒基因群I(GI)的另一治疗剂治疗的方法，该方法包括：
使从该患者获得的粪便样品与以下各项接触：
(i)扩增诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的第一引物对，该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸包含与SEQ ID NO:2或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸；和
(ii)扩增诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的第二引物对，该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸包含与SEQ ID NO:4或其互补体至少80％-95％一致的核苷酸，
以在如下条件下产生反应-样品混合物：其中如果该粪便样品中存在诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸，那么在不从该粪便样品提取该靶核酸的情况下进行该诺如病毒基因群I(GI)和诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的实时RT-PCR扩增。
54.权利要求53的方法，其还包括：
(a)使该反应-样品混合物经历实时RT-PCR条件，在该条件下该粪便样品中存在的每一靶核酸经扩增以产生荧光信号；
(b)检测步骤(a)中产生的每一经扩增靶核酸生成的荧光信号；并且
(c)如果检测到(i)该诺如病毒基因群I(GI)靶核酸的荧光信号和该诺如病毒基因群II(GII)靶核酸的荧光信号，则选择该患者以供用抑制诺如病毒基因群II(GII)的治疗剂和抑制诺如病毒基因群I(GI)的另一治疗剂治疗，
其中在扩增前不对该粪便样品进行提取或纯化步骤。
55.权利要求53或权利要求54的方法，其中抑制诺如病毒基因群II(GII)的该治疗剂是选自下组的一种或多种药剂，该组由以下各项组成：GII.4/VA387源P颗粒疫苗、GII.4源病毒样颗粒(VLP)疫苗、具有铝胶佐剂的源自共有GII.4序列和诺沃克病毒的VLP、以及源自GII.4人类诺如病毒VP1和轮状病毒VP6抗原的VLP。
56.权利要求53-55中任一项的方法，其中该抑制诺如病毒基因群I(GI)的另一治疗剂是选自下组的一种或多种药剂，该组由以下各项组成：血清组织血型抗原(HBGA)阻断抗体、利巴韦林、法匹拉韦、2'-C-甲基胞苷、舒拉明相关化合物、IFNα、β或γ、诺如病毒3CL蛋白酶的二肽基抑制剂、吡哆醛-5'-磷酸-6-(2'-萘基偶氮-6'-硝基-4',8'-二磺酸)四钠盐(PPNDS)、萘二磺酸盐(NAF2)、非核苷抑制剂、GI.1加GII.4共有VLP二价疫苗和小分子去泛素化酶抑制剂。
CN201780046821.0A 2016-06-03 2017-06-02 检测诺如病毒的方法 Pending CN110073005A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662345331P 2016-06-03 2016-06-03
US62/345,331 2016-06-03
PCT/US2017/035686 WO2017210558A1 (en) 2016-06-03 2017-06-02 Methods for detecting norovirus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110073005A true CN110073005A (zh) 2019-07-30

Family

ID=60477891

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780046821.0A Pending CN110073005A (zh) 2016-06-03 2017-06-02 检测诺如病毒的方法

Country Status (7)

Country Link
US (3) US10793924B2 (zh)
EP (1) EP3464647A4 (zh)
CN (1) CN110073005A (zh)
BR (1) BR112018074853A2 (zh)
CA (1) CA3025675A1 (zh)
MX (2) MX2018014922A (zh)
WO (1) WO2017210558A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592284A (zh) * 2019-10-12 2019-12-20 福建谷科生物科技有限公司 一种快速检测诺如病毒的试剂盒
CN110791589A (zh) * 2019-10-18 2020-02-14 张家口健垣科技有限公司 一种用于rna恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针、试剂盒及检测方法
CN111019908A (zh) * 2019-12-13 2020-04-17 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理方法及试剂盒
CN111187861A (zh) * 2020-02-26 2020-05-22 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种对海产品诺如病毒gii.4的检测方法
CN112725543A (zh) * 2021-03-04 2021-04-30 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 人源诺如病毒gii.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法
CN114317814A (zh) * 2021-08-12 2022-04-12 中国科学院微生物研究所 用于检测临床样本中gi.7型诺如病毒的试剂盒及专用引物

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7433217B2 (ja) * 2018-05-02 2024-02-19 タカラバイオ株式会社 Ｒｎａウイルスの処理方法
CN109265542B (zh) * 2018-09-27 2021-06-15 国药中生生物技术研究院有限公司 特异性结合诺如病毒gii.4基因型vp1蛋白或vlp的抗体及其制备方法和应用
CN110343783B (zh) * 2019-07-08 2020-04-28 广东省公共卫生研究院 基于高通量测序的诺如病毒测序引物、试剂盒及检测方法
WO2022165220A1 (en) * 2021-01-29 2022-08-04 Kansas State University Research Foundation Conformationally-constrained inhibitors of 3c or 3c-like proteases
CN113025758A (zh) * 2021-04-07 2021-06-25 拱北海关技术中心 用于检测水产品gi型诺如病毒的引物、探针及试剂盒
CN116042928B (zh) * 2023-02-22 2024-01-02 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于扩增和检测消化道病毒核酸序列的引物组

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103131798A (zh) * 2013-02-25 2013-06-05 湖北朗德医疗科技有限公司 一种诺如病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其应用
CN103917663A (zh) * 2011-07-06 2014-07-09 探索诊断投资公司 病毒和细菌病原体的直接扩增和检测

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677124A (en) * 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
JP4437525B2 (ja) * 2000-09-29 2010-03-24 株式会社ビー・エム・エル ノーウォーク様ウイルス（ｇｉ）の検出方法
US6630300B2 (en) * 2000-11-21 2003-10-07 Tosoh Corporation Oligonucleotides and method for characterizing and detecting Genogroup II type small round structured virus
US20060110724A1 (en) * 2004-11-19 2006-05-25 Burkhardt William Iii Quantitative real-time assay for noroviruses and enteroviruses with built in quality control standard
JP5852883B2 (ja) * 2008-08-08 2016-02-03 タケダ ワクチン，インコーポレイテッド 交差反応性の増強のための複合カプシドアミノ酸配列を含むウイルス様粒子
CN105177185A (zh) 2015-10-10 2015-12-23 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 果蔬中甲型肝炎病毒和诺如病毒检测质控试剂盒和检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103917663A (zh) * 2011-07-06 2014-07-09 探索诊断投资公司 病毒和细菌病原体的直接扩增和检测
CN103131798A (zh) * 2013-02-25 2013-06-05 湖北朗德医疗科技有限公司 一种诺如病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTIAN BEURET: "Simultaneous detection of enteric viruses by multiplex real-time RT-PCR", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592284A (zh) * 2019-10-12 2019-12-20 福建谷科生物科技有限公司 一种快速检测诺如病毒的试剂盒
CN110791589A (zh) * 2019-10-18 2020-02-14 张家口健垣科技有限公司 一种用于rna恒温扩增检测诺如病毒的引物和探针、试剂盒及检测方法
CN111019908A (zh) * 2019-12-13 2020-04-17 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种从牡蛎中高效提取诺如病毒的样本高通量前处理方法及试剂盒
CN111187861A (zh) * 2020-02-26 2020-05-22 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种对海产品诺如病毒gii.4的检测方法
CN111187861B (zh) * 2020-02-26 2023-05-23 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种对海产品诺如病毒gii.4的检测方法
CN112725543A (zh) * 2021-03-04 2021-04-30 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 人源诺如病毒gii.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法
CN112725543B (zh) * 2021-03-04 2022-05-10 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 人源诺如病毒gii.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法
CN114317814A (zh) * 2021-08-12 2022-04-12 中国科学院微生物研究所 用于检测临床样本中gi.7型诺如病毒的试剂盒及专用引物

Also Published As

Publication number Publication date
US20190211408A1 (en) 2019-07-11
CA3025675A1 (en) 2017-12-07
EP3464647A4 (en) 2020-01-01
US11555223B2 (en) 2023-01-17
MX2018014922A (es) 2019-08-29
US10793924B2 (en) 2020-10-06
WO2017210558A1 (en) 2017-12-07
US20210095352A1 (en) 2021-04-01
MX2022014633A (es) 2023-01-11
US20230279513A1 (en) 2023-09-07
BR112018074853A2 (pt) 2019-04-02
EP3464647A1 (en) 2019-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110073005A (zh) 检测诺如病毒的方法
US11499199B2 (en) Bordetella detection assay
US11155886B2 (en) Compositions and methods for detection of zika virus
EP3442984B1 (en) Methods for detecting bordetella
JP2018007694A (ja) ターゲット核酸検出のための二重プローブアッセイ
KR102128651B1 (ko) 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 뎅기 바이러스 혈청형 검출세트 및 검출방법
KR20120020067A (ko) 헤파티티스 ｃ 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 헤파티티스 ｃ 바이러스의 검출 방법
PT1560929E (pt) Polinucleótidos para a amplificação e detecção de chlamydia trachomatis e neisseria gonorrhoeae
CN106471135B (zh) 肠道病毒和双埃柯病毒的分子检测
CN109983138A (zh) 用于检测bk病毒的组合物和方法
US20210164022A1 (en) Assay for detection of pathogenic leptospira strains
KR101953574B1 (ko) 이중 표지된 프로브 및 형광 융해 곡선 분석을 이용한 오징어 종 판별 방법
JP6999645B2 (ja) 核酸の増幅及び検出／定量の効率を改良するためのヘルパーオリゴヌクレオチド
Capote et al. Using RT-PCR for plant RNA virus detection.
BR112016025052B1 (pt) Método para determinar a presença ou ausência de um enterovírus e/ou um parechovírus em uma amostra, composição, sonda de iniciador, e, kit
WO2009035954A1 (en) Methods for detecting listeria monocytogenes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination