CN103917663A - 病毒和细菌病原体的直接扩增和检测 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了用于鉴定来自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，其使用没有提取核酸步骤的直接扩增，但保留测定提取核酸的方法的基本上相同的特异性和灵敏性。还提供了容许在没有核酸提取步骤的情况下直接扩增样品的试剂混合物。

Description

病毒和细菌病原体的直接扩增和检测
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年7月6日提交的美国申请流水号61/505,055和2011年10月27日提交的美国申请流水号61/552,405在35U.S.C.§119(e)下的权益。每篇在先申请的公开内容视为本申请公开内容的一部分并通过提述并入本申请的公开内容。
发明领域
本发明涉及使用直接扩增的针对病毒和细菌病原体核酸的诊断和检测方法。
发明背景
以下对本发明背景的论述仅为帮助读者理解本发明而提供，且不承认描述或构成本发明的现有技术。
通常使用多种方法中的任一种来完成对病毒的临床检测。例如，可从生物学样品(例如鼻咽抽吸物、喉拭样、血液流体、粪材料等)分离病毒颗粒或核酸。可通过血清学进行回顾诊断。在此方法中最广泛使用补体结合测试(CFT)，尽管可使用血凝抑制(HAI)和酶免疫测定法(EIA)来给出类型特异性诊断。对于更迅速的诊断，可实施抗原检测或RNA检测。抗原检测可通过IFT或EIA进行，然而，为了实现最高水平的灵敏性和特异性，使用通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)的RNA检测。然而，后者是昂贵的且技术要求较高的。
类似地，可使用多种方法，包括革兰氏染色、培养、微阵列和聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR完成细菌检测。与病毒如流感(其具有由RNA构成的基因组且因此需要转录步骤来创建靶cDNA以用于传统的或实时的PCR)的检测不同，细菌检测可使用标准PCR方案完成。然而，即使在没有额外的RT步骤时，PCR或实时PCR也是费时且昂贵的诊断方法，如下文描述的。
RT-PCR是一种用于扩增和量化靶核酸的实验室技术。该规程依照聚合酶链式反应的一般原理，不过在RT-PCR中使用酶逆转录酶将RNA链首先逆转录成它的DNA互补物(cDNA)，并使用传统PCR或实时PCR扩增所得cDNA。根据使用的逆转录酶的特性，逆转录(RT)步骤可与PCR在相同管中(一步PCR)或在分开的管中(两步PCR)使用介于约40℃和50℃之间的温度实施。然后，将dsDNA于约95℃变性，从而使两条链分开且引物能在较低的温度再次结合并开始新的扩增反应。DNA从引物延伸使用热稳定性Taq DNA聚合酶进行，通常于约72℃。实时RT-PCR提供一种可以使用荧光报告分子随着扩增进展显现扩增子的方法。
鉴于与从生物学样品制备和处理病毒和细菌核酸用于检测、诊断和/或定量有关的高度复杂性，在寻求快速诊断的情况下，存在对牵涉更少的步骤、更少的技术要求和更短的持续时间的方法的需要。
发明概述
本发明基于允许在没有核酸提取步骤的情况中直接扩增样品的试剂混合物的发现。
在一个方面，本发明提供一种用于鉴定从人获得的生物学样品中来自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括：(a)在如下的条件下使所述样品与DNA聚合酶和缓冲液接触，所述条件适合于在不从所述样品提取所述靶核酸的情况中从所述样品扩增所述靶核酸；(b)将来自步骤(a)的所述样品热循环，从而使得所述靶核酸在存在时得到扩增；并(c)检测存在时从步骤(b)生成的扩增的靶核酸，其中在扩增前不提取样品核酸。
在另一个方面，本发明提供一种用于鉴定从人获得的生物学样品中来自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括：(a)在如下的条件下使所述样品与DNA聚合酶和缓冲液接触，所述条件适合于在不从所述样品提取所述靶核酸的情况中从所述样品扩增所述靶核酸；(b)将来自步骤(a)的所述样品热循环，从而使得所述靶核酸在存在时得到扩增；并(c)检测存在时从步骤(b)生成的扩增的靶核酸；其中在扩增前不从样品提取样品中的核酸，且其中所述缓冲液包含至少一种选自下组的组分：KCl、牛血清清蛋白和表面活性剂。
在一些实施方案中，在步骤(a)前不稀释样品核酸。在别的实施方案中，可以在步骤(b)前加热所述样品，或者在又一些实施方案中，在步骤(a)前加热所述样品。可以在步骤(b)前将所述样品于至少约70℃的温度加热至少约2分钟。
在别的实施方案中，所述缓冲液可以包含氯化钾(KCl)，且在一些实施方案中，KCl可以以约5mM至约50mM的浓度存在。所述缓冲液还可以包含GoTaqTMFlexi缓冲液，其在步骤(b)期间可以以1倍至5倍浓度存在。所述缓冲液还可以包含牛血清清蛋白。所述缓冲液可以包含表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂是阳离子型表面活性剂。在又一些实施方案中，DNA聚合酶是Taq聚合酶。靶核酸可以是DNA，或在一些实施方案中是RNA。当样品是RNA时，可以将其进一步与逆转录酶接触。所述样品可以同时与DNA聚合酶和逆转录酶接触。
在别的实施方案中，所述样品选自下组：血液、血清、血浆、脑脊髓液、口腔流体和粪。在一些实施方案中，所述样品是全血。在一些实施方案中，所述样品从颊区(buccal region)获得。在又一些实施方案中，所述微生物可以是病毒，或可以选自下组：流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和肠道病毒。在一些实施方案中，所述微生物还可以是细菌，如在别的实施方案中是艰难梭菌(C.difficile)。
如本文中使用的，术语“RNA”指与如DNA中找到的糖脱氧核糖形成对比包含糖核糖的核酸分子。如本文中使用的，RNA指所有种类或RNA，包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、以及具有调节功能的小RNA种类。“小RNA种类”具有特定的意义，并且指在细菌中具有持家或调节作用的非翻译RNA。“小RNA种类”不是rRNA或tRNA。
如本文中使用的，术语“靶核酸”指诊断特定病毒或细菌(包括例如病原体病毒或细菌)的任何核酸分子或片段。靶核酸可以是源自靶物种的DNA或RNA分子。
如本文中使用的，术语“热循环”指使用实验室装置，利用升高的和降低的温度的预编程循环用引物延伸反应来扩增核酸区段的任何技术。热循环的例子包括但不限于PCR、实时PCR和RT-PCR。
如本文中使用的，术语“逆转录酶聚合酶链式反应”或“RT-PCR”指用于合成和扩增DNA分子(其序列为RNA序列的拷贝)的任何技术。RT-PCR可用于检测RNA种类(如在基因表达的定量分析中)，以及用于生成RNA的DNA拷贝，用于克隆、cDNA文库构建、探针合成和原位杂交中的信号放大。
如本文中使用的，术语“试剂混合物”指具有实施逆转录聚合酶链式反应或实时聚合酶链式反应需要的所有要素的组合物，包含但不限于分别对诊断用靶RNA或DNA序列具有特异性的引物，和聚合酶。
如本文中使用的，“引物”指合成或天然存在的寡核苷酸，其在置于由聚合酶催化互补链合成的条件下时能够充当沿模板链进行核酸合成或复制的启动点。在逆转录的背景内，引物由核酸构成且在RNA模板上引发。在PCR的背景内，引物由核酸构成且在DNA模板上引发。
如本文中使用的，术语“DNA聚合酶”指帮助催化脱氧核糖核苷酸聚合成DNA链的任何酶。DNA聚合酶作用为向新形成链的3’端添加游离核苷酸，导致新链在5’-3’方向上的延长。
如本文中使用的，“裂解”意指促进接近或释放细胞RNA或DNA的对细胞壁或病毒颗粒的扰动或改变。裂解的必然要求既不是细胞壁的完全破坏也不是破裂。
如本文中使用的，术语“循环阈值”或“Ct”指热循环期间由于产物形成所致的荧光升高达到显著且可检测的高于背景信号的水平的循环。
如本文中使用的，术语“直接扩增”指在没有在先的纯化、提取或浓缩的情况中从样品扩增靶核酸的核酸扩增反应。它是对PCR反应中靶物浓度的相对量度。除了靶物浓度以外，还有许多因素影响Ct的绝对值。然而，改变与Ct计算有关的荧光测量的来自反应混合物或仪器的伪像(artifact)将导致对Ct值的模板不依赖性改变。
如本文中使用的，术语“提取”指从样品中存在的其它(非核酸)材料取出核酸所采用的任何行为。这类行为包括但不限于机械或化学裂解、添加去污剂或蛋白酶、或沉淀及除去非核酸如蛋白质。
如本文中使用的，术语“干扰性物质”或“干扰物”指样品中不是靶核酸的任何物质。这类干扰性物质包括合成的和生物学的物质。这类合成物质包括化学药品和药品。这类生物学物质包括血液、尿液、蛋白质和其它生物分子。
附图简述
图1(A)是描绘H1N1测定法结果的线图，其中具有FastStart缓冲液的样品依照FastStart方案进行直接扩增；(B)是描绘H1N1测定法结果的线图，其中具有GoTaq缓冲液的样品依照GoTaq方案进行直接扩增。
图2(A)和(B)是描绘两种样品贮存缓冲液的效果的线图：使用FastStart方案比较通用运输介质(universal transport medium)(UTM)(A)和1倍Tris-EDTA(“TE”)(B)。
图3(A)是描绘H1N1测定法结果的线图，其中具有FastStart缓冲液的样品在核酸提取后依照FastStart方案进行扩增；(B)是描绘H1N1测定法结果的线图，其中在没有任何在先的核酸提取或纯化的情况下，具有FastStart缓冲液的样品依照FastStart方案进行直接扩增。
图4(A)和(B)是表明用于使用甲型流感阳性样品直接扩增的GoTaq化学和循环条件的效率的线图。
图5是描绘与没有KCl的直接扩增测定法相比有添加的KCl的直接扩增测定法的灵敏性的线图。
图6是描绘与没有表面活性剂的直接扩增测定法相比有添加的表面活性剂的直接扩增测定法的灵敏性的线图。
图7是描绘与没有预热的直接扩增测定法相比有预热的直接扩增测定法的灵敏性的线图。
图8是描绘来自单一血液样品的扩增图的线图，所述单一血液样品在不同管中暴露于不同抗凝血剂(肝素、EDTA、柠檬酸盐)。
图9是描绘直接扩增测定法检测来自颊拭样的样品的能力的线图。
发明详述
本发明涉及使用PCR方法检测人病原体的诊断方法，所述病原体包括例如呼吸道病毒如甲型和乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)、肠道病毒、单纯疱疹病毒1和2(分别为HSV-1和HSV-2)、水痘带状疱疹病毒(VZV)；以及(病原性)细菌如艰难梭菌，所述PCR方法不牵涉在PCR前分离病毒/细菌(即靶)核酸的提取或纯化步骤，并且提供与使用特定提取或纯化方案的类似测定法基本上相等(或更好)的灵敏性。
更具体地，本方法牵涉向PCR混合物添加表面活性剂以裂解细胞或病毒体、组合的某些规程步骤以增加靶核酸的利用度。然后，在逆转录酶步骤前将样品加热至约50℃，而且这协助病毒裂解和RNA酶的灭活。在RT步骤后，实施PCR反应。对于细菌或DNA病毒靶物，不需要逆转录酶。
以约10-40%患者样品与60-90%试剂混合物，且最佳地，20-30%患者样品与70-80%试剂混合物的比率将患者样品添加至试剂混合物。试剂混合物包含源自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的聚合酶(例如GoTaq FlexiDNA聚合酶TM;Promega)和包含离子型去污剂的扩增缓冲液(例如GoTaq Flexi PCRBufferTM;Promega)。将可以以10倍缓冲液提供的扩增缓冲液稀释至约5倍、约2.5倍或约1倍浓度来使用。试剂混合物还包含KCl(仅对于病毒样品)和MgCl2，以及dNTP。在本发明涵盖的一种配方中，RT-PCR试剂混合物含有：0.5μL5X GoTaq FlexiTMPCR缓冲液、0.25μL25mM MgCl2、0.05μL10mMdNTP、0.20μL5U/μL Go Taq FlexiDNATM聚合酶和0.5μL10mM KCl。可以在RT步骤前或后加热患者样品，然后进行PCR。
本发明的试剂混合物允许从样品直接扩增核酸，而不需要在扩增前进行核酸提取或纯化。不希望受任何理论束缚，认为在需要时裂解经由加热和表面活性剂作用的组合发生。此外，认为发明的试剂混合物中和通常存在于RT-PCR反应中的扩增抑制剂，从而消除稀释标本的需要；一种在其它直接扩增方法学中使用的标准技术。相对较高的盐浓度可通过提高寡核苷酸结合效率来促成性能。然而，试剂混合物随靶核酸类型而变化。
在一个实施方案中，用于病毒RNA检测的试剂混合物最少包含逆转录酶、高浓度的正向和反向引物(最佳为蝎状(scorpion)引物)、MgCl2、氯化钾、dNTP、5倍GoTaq FlexiTMPCR缓冲液(Promega；目录号M891A或M890A)或其等同物、和水生栖热菌衍生的聚合酶如5U/μl Taq聚合酶(例如GoTaqFlexiDNA聚合酶TM;Promega目录号M8295)。为了改进性能，还可以添加RNAsin。另外，用于脊髓液或粪样品中病原体检测的试剂混合物还含有BSA。
用于细菌检测的试剂混合物应最少包含高浓度的正向和反向引物(最佳为蝎状引物)、MgCl2、BSA、dNTP、5倍GoTaq FlexiTMPCR缓冲液(Promega；目录号M891A或M890A)或其等同物、和水生栖热菌衍生的聚合酶如5U/μlTaq聚合酶(例如GoTaq FlexiDNA聚合酶TM；Promega目录号M8295)。为了改进性能，还可以添加RNAsin。
在一个实施方案中，测定法包括无模板对照(NTC)、阳性对照和DNA内部对照(IC)。测定法可基于对照的Ct值评估。在一个例子中，在用于检测艰难梭菌的测定法中，如果NTC的Ct值是0且IC为≤40，那么对照有效。在另一个例子中，在用于检测艰难梭菌的测定法中，如果阳性对照的Ct值是0，那么该测定法被视为无效。在另一个例子中，在用于检测艰难梭菌的测定法中，如果连同有效的NTC，艰难梭菌的Ct值≤40但≠0，那么该测定法运行被视为有效且可接受的。在另一个例子中，在用于检测艰难梭菌的测定法中，如果艰难梭菌的Ct值=0，且IC的Ct值≤40但≠0，那么艰难梭菌被视为未检出的。在另一个例子中，在用于检测艰难梭菌的测定法中，如果艰难梭菌的Ct值=0，且IC的Ct值=0，那么该测定法被视为无效。
病毒颗粒的来源
从样品中获得用于检测测定法的病毒核酸可以经由收集液体样品、提取固体或半固体样品、拭抹表面或其它技术进行。如果存在的浓度适宜地提供用于RT-PCR反应的靶RNA，那么可直接测定病毒RNA。或者，可通过如离心、经由免疫吸附或其它相互作用结合表面、或过滤等方法来浓缩病毒体。
细菌细胞的来源
从样品中获得用于检测测定法的细菌细胞可以经由收集液体样品、提取固体或半固体样品、拭抹表面或其它技术进行。如果存在的浓度适宜地提供用于RT-PCR反应的靶RNA，那么可直接测定细菌细胞。或者，可通过如离心、经由免疫吸附或其它相互作用结合表面、或过滤等方法来浓缩细菌细胞。另外，细菌细胞数可通过在浓缩或直接测定法前在培养板上或在液体培养基中培养细胞来增加。
本发明背景内合适的典型细菌是革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，包括但不限于利斯特氏菌属(Listeria)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、螺杆菌属(Helicobacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弯曲杆菌属(Camplobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、志贺氏菌属(Shigella)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、博德特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、和假单胞菌属(Pseudomonas)。
靶核酸
可作为靶核酸测定的RNA类型包括rRNA、mRNA、转运-RNA(tRNA)或其它RNA多核苷酸。rRNA的种类包括5S、16S和23S多核苷酸，其可含有一组相关细菌特征性的一种或多种子序列。特征性序列的检测能力是可变的，且依赖于要通过测定法检测的病毒或细菌的关联性水平。可使用其它RNA多核苷酸作为诊断性靶RNA，只要它们含有适当区分期望关联性水平的细菌的独特子序列。可从tRNA和mRNA种类以及从在细菌细胞中生成的、包含一种或多种特征性子序列的任何RNA鉴定出例子。引物可由本领域技术人员设计以引发拷贝DNA的合成，其在逆转录反应中使用靶RNA作为模板进行。本领域技术人员还将知晓如何设计引物对在PCR中使用拷贝DNA作为模板扩增靶RNA的独特子序列。本领域中公知，在PCR中同时使用的引物应具有类似的杂交解链温度。必须使得细菌细胞内的诊断用靶RNA对RT或RT-PCR反应组合物可接近。收集后，可将核酸样品直接加入反应组合物，其然后经历热循环。
尽管是任选存在的，但优选地从试剂混合物省略特定的裂解剂，因为没有它也获得自样品的病毒/细菌核酸的充分释放。一般地，裂解剂在与RT、RT-PCR、或PCR反应组合物接触前添加。裂解剂的使用是本领域技术人员公知的。裂解剂包括但不限于化学物、酶、物理剪切、渗透剂和高温。术语“裂解缓冲液”意指含有至少一种裂解剂的缓冲液。典型的酶促裂解剂包括但不限于溶菌酶、葡萄糖酶、酵母裂解酶(zymolose)、溶细胞酶(Iyticase)、蛋白酶K、蛋白酶E、和病毒内溶素(endolysin)和外溶素(exolysin)。病毒内溶素和外溶素来自噬菌体或原噬菌体细菌及这些的组合。典型的病毒内溶素包括但不限于来自利斯特氏菌噬菌体(A118和PLYI18)的内溶素、来自噬菌体PM2的内溶素、来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)噬菌体PBSX的内溶素、来自乳杆菌(Lactobacillus)原噬菌体Lj928、Lj965和噬菌体15Phiadh的内溶素、来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)噬菌体Cp-I的内溶素(Cpl-I)、和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)噬菌体B30的双功能肽聚糖溶素。这最后两种具有不同的细菌菌株特异性。还涵盖两组分，也就是holin-内溶素，即沃氏葡萄球菌(Staphylococcus wameri)M噬菌体varphiWMY的细胞20裂解基因holWMY和IysWMY。还涵盖这些的内溶素组合。对于病毒裂解的论述，特别参见Loessner,M J等(1995)Applied Environmental Microbiology I61:1150-1152。
代替使用内溶素，在RT步骤前或后用加热处理有助于本方法中的裂解。在从约25℃至低于约100℃的温度范围中，且优选地约50℃和75℃的样品温育可改进细菌RNA作为RT或RT-PCR的模板的可接近性。根据温育温度，此热预处理可达范围为约1分钟至约60分钟的时间段，典型为1至20分钟的处理。热处理可包括在不同温度多次温育。热处理可在存在或缺乏如下文描述的RNA酶抑制剂的情况下进行。特别可用的处理是在RNA酶抑制剂存在下在约50℃达约5至20分钟。
可向病毒体或细菌细胞添加至少一种RNA酶抑制剂。通常，抑制剂及其浓度选择为使得不干扰任何引物指导的扩增过程和组分。RNA酶抑制剂是本领域技术人员已知的且包括化学物如异硫氰酸胍和二乙基-焦碳酸酯、蛋白质抑制剂如Superaseln(Ambion)、RNA酶Block(Stratagene)、人胎盘核糖核酸酶抑制剂和猪肝RNA酶抑制剂(Takara Mirus Bio)、抗核酸酶抗体如抗RNA酶(Novagen)和核糖核酸酶Inhib III(PanVera)，以及试剂如RNAlater(Ambion)和RNA保护细菌试剂(Qiagen)。
测定方法
在本方法中，通过单独逆转录或者优选地通过逆转录和聚合酶链式反应来测试诊断性靶RNA的存在。当一起使用时，逆转录和聚合酶链式反应可以在两个步骤中序贯实施，或在一个步骤中一起实施(其中将所有反应组合物添加到样品中)。将样品在逆转录反应组合物中温育允许从靶RNA合成DNA拷贝。试剂混合物包含与靶RNA杂交以引发拷贝DNA合成的引物。另外，试剂混合物包含dNTP、MgC12、KCl(仅在病毒样品中)、逆转录酶和逆转录酶缓冲液(仅在病毒样品中)，且对于粪样品，还包含BSA(仅在细菌样品中)。如果期望从超过一种靶RNA制备DNA拷贝，那么可纳入超过一种引物。然而，不使用RNA酶抑制剂。然后，可将逆转录反应的产物转移至另一个测定管，其中依照本领域中公知的方案实施PCR。PCR组合物通常包含一对引物，其启动从逆转录的模板合成期望的DNA区段。另外，PCR混合物通常包含dNTP、热稳定性DNA聚合酶如Taq聚合酶、和聚合酶缓冲液。如果期望合成多种DNA区段，那么可以纳入超过一对引物。还可以添加单一的新引物，其会作为引物对的第二引物与原始RT-PCR引物一起扩增DNA区段。可用于病毒样品的其它逆转录酶包括但不限于HIV逆转录酶(Ambion)、Transcriptor逆转录酶(Roche)、Thermoscript逆转录酶(Invitrogen)。可以使用的其它DNA聚合酶包括但不限于Pfu、Vent和Sequitherm DNA聚合酶(EPICENTRE)。
不管RT-PCR是以两步还是一步实施，都先运行RT步骤，RT步骤通常由在介于约37℃和约70℃之间的温度的单一温度温育组成。对于不同Rt酶和不同引物，不同温度是适宜的，如本领域技术人员已知的。随后的PCR反应通常包括在约94℃至约96℃达约6至约15分钟的起始温育。该步骤用于使cDNA变性，且还用于激活热激活的酶Taq聚合酶。然后，这继之以对cDNA靶物的多个扩增循环。在每个循环期间进行3种操作：靶物变性、引物退火和引物延伸。靶物变性通常在超过约90℃进行。引物退火温度由在反应中使用的特定引物的解链温度规定，而引物延伸根据使用的热稳定性聚合酶在范围为约60℃至约72℃的温度实施。当在同一温度实施引物退火和延伸时，这就是两温度PCR，相比之下其中3个步骤中每一个在不同温度进行的是三温度PCR。在完成扩增阶段后，通常加入最终延伸时间以确保合成完整扩增产物。
靶核酸还包括DNA，包括例如源自细菌物种和DNA病毒的DNA。适于评估的病毒DNA包括直接从病毒壳体获得的DNA以及整合到宿主基因组中的DNA。
RT和RT-PCR产物的检测
用于直接检测RT反应的cDNA产物的方法是本领域技术人员公知的，且利用掺入或附接于cDNA产物的标记物。可使用的信号生成标记物是本领域中公知的且包括例如荧光模块、化学发光模块、颗粒、酶、放射性标签、或光发射模块或分子。荧光模块尤其可用，特别是能够附接核酸并发出荧光信号的荧光染料。多种染料是本领域中已知的，如荧光素、Texas Red和罗丹明。尤其可用的是单反应性染料Cy3和Cy5，两者均为商品化的(例如，购自Amersham Pharmacia Biotech,Arlington Heights,Ill.)。一种更灵敏的特异性检测经标记DNA的方式是将产物对固定化于基质(如尼龙膜或玻璃载玻片)中的靶DNA序列杂交。然后，可用具有适当过滤的激光扫描器扫描杂交后的信号以检测使用的特定染料。这是本领域中，特别是在DNA微阵列技术中公知的。标记物可在RT反应中的cDNA合成中掺入其中，或者可在其合成后将其附接于cDNA产物。例如，RT反应可用经标记的引物实施。一种类型的经标记引物具有附接的颗粒，该颗粒具有大量的信号生成分子。使用经标记核苷酸(如用染料标记的UTP和/或CTP)的逆转录将标记物掺入到转录的核酸中。或者，可利用合成后偶联反应来检测cDNA产物。将标记物附接于核酸是本领域技术人员公知的，且可通过例如使用例如经标记RNA的末端标记，或通过用激酶处理核酸，随后附接将样品核酸连接至标记物(例如荧光团)的核酸接头来完成。在另一种标记方法中，通过偶联体外转录反应来扩增来自RT反应的DNA产物。例如，将T7启动子区掺入用于RT反应的引物中。然后，可以使用T7体外转录试剂盒来生成大量的RNA以增加检测灵敏性。T7体外转录试剂盒可购自Ambion(2130Woodward,Austin,Tex.)或其他商业来源。
RT-PCR检测
用于RT-PCR产物检测的方法包括凝胶电泳分开和溴化乙啶染色，或检测产物中掺入的荧光标记物或放射性标记物。还可以使用在检测扩增产物前不需要分开步骤的方法。这些方法通常称为实时PCR或同质性检测。大多数实时方法通过监测热循环期间的荧光变化来检测扩增产物形成。这些方法包括但不限于：双重标记探针(Applied Biosystems,Foster City,Calif.94404)、分子信标(Molecular Beacons)(Tyagi S and Kramer FR(1996)NatBiotechnoI14:303-308)和绿色染料(Molecular Probes,Inc Eugene,Oreg.97402-0469)。这些相同同质性方法中的一些也可用于扩增产物的端点检测。此类方法的例子是绿色染料解离曲线分析。在解离曲线分析中，温度中的最后缓慢爬升(一般约60℃至90℃)与荧光监测组合能检测解链点并由此检测扩增产物的存在(Ririe等(1997)Anal.Biochem.245:154-60)。
测定灵敏性
直接扩增测定法的灵敏性可通过向测定法中使用的缓冲液添加一种或多种提高灵敏性的组分来提高。这类组分包括但不限于KCl、表面活性剂和清蛋白。在一些实施方案中，清蛋白是牛血清清蛋白。在一些实施方案中，表面活性剂是阳离子型表面活性剂。直接扩增测定法的灵敏性还可通过向测定法提供额外加热(如在添加试剂前预热样品)来提高。在一些实施方案中，可通过组合提高灵敏性的组分和额外加热来提高灵敏性。
实施例
通过提述以下实施例将更容易地理解如此一般性描述的本方法，所述实施例通过例示提供且不意图限制本方法和试剂盒。
实施例1：通用主混合物(Master Mix)
除非另外记载，以下列比例制备2.5倍通用主混合物(UMM)。下表提供了适于制备15ml UMM的试剂体积，然而，可根据需要制备任何适宜体积。
GoTaq Flexi BufferTM及等同物含有离子型去污剂且缺少镁。
实施例2：KCl对直接扩增呼吸道病毒核酸的影响
如下制备含有乙型流感病毒的设计拭样标本，即连同内部对照核酸向病毒运输介质样品添加培养的乙型流感病毒(“Flu B”)(五大湖(Great Lakes)株)。使用实施例1的通用主混合物在存在和缺乏25mM KCl的情况下测定Flu B和对照核酸的Ct值，所述通用主混合物从UMM省去KCl，并进一步含有1或2μl逆转录酶(Improm II逆转录酶，Promega目录号A3800)。在158和39.5的TCID50/ml估测Flu B病毒的模板拷贝的连续稀释物。如下运行RT-PCR反应：
阶段1：75℃达3分(一次)
阶段2：47℃达10分(一次)
阶段3：97℃达2分(一次)
阶段4：102℃达1秒，接着在60℃达20秒，用于数据收集(重复45次)
Ct测定的阈值为50,000。Flu B和内部对照探针的荧光团分别为JOE和Q670。所有测定均一式两份运行且将结果取平均值。
表1和2中的结果证明了KCl的存在增强了针对低病毒浓度的血清中呼吸道病毒(Flu B)的直接RT-PCR扩增测定法的灵敏性。这些结果还指示KCl的存在降低或消除在通过RT-PCR分析前从血清浓缩和/或纯化病毒的必要性。
实施例3：从临床样品直接扩增呼吸道病毒核酸
评估各种临床样品(颊拭样和脑脊液)中HSV-1和/或HSV-2的存在。使用来自实施例1的通用MM，具有对MgCl2和KCl的所述修改。
颊拭样RT-PCR扩增主混合物为：
组分 浓度
2.5倍通用MM 1倍
蝎状正向引物 600nM
反向引物 600nM
MgCl2 5mM
氯化钾 40mM
CSF RT-PCR扩增主混合物为：
组分 浓度
2.5倍通用MM 1倍
蝎状正向引物 600nm
反向引物 600nm
MgCl2 2.5mM
100倍BSA(10mg/ml) 0.1-0.5mg/ml
氯化钾 40mM
使用直接RT-PCR扩增方案和使用初始核酸提取方案的RT-PCR扩增方案两者来分析临床样品。使用Roche MagNA Pure LC仪，和相应的总核酸分离试剂盒(Total Nucleic Acid Isolation Kit)来提取核酸。总共提取200μl样品，且在50μl中洗脱核酸。
对于每种测定法，将10μl样品添加至40μl本实施例中描述的主混合物。
如下运行RT-PCR反应：
阶段1：75℃达3分(一次)
阶段2：47℃达10分(一次)
阶段3：97℃达2分(一次)
阶段4：102℃达1秒，接着在60℃达10秒，用于数据收集(重复50次)
结果如下：
这些数据证明了对于经HSV感染的颊或CSF样品，相对于在分析前实施核酸提取和浓缩的RT-PCR方案，上文描述的直接扩增方法在多重RT-PCR扩增测定法中提供相当的结果。
实施例4：RNA酶抑制剂对直接核酸扩增测定法的影响
将对照病毒掺入病毒运输介质中以创造合成样品，用于使用上文描述的直接扩增RT-PCR测定法分析。对于每种测定法，在存在或缺少1μl RNA酶抑制剂(“RNAsin”)(Promega目录号N261B)的情况下，将10μl样品添加至40μl实施例1中描述的UMM中。如下运行RT-PCR反应：
阶段1：50℃达10分(一次)
阶段2：97℃达2分(一次)
阶段3：102℃达1秒，接着在58℃达20秒用于数据收集(重复50次).
在缺乏RNAsin的情况下，不能测定Ct，表明病毒RNA在RT前就降解。在存在RNAsin情况下的平均Ct为来自一式两份运行的测定法的32.5。这些结果证明RNAsin的存在改进直接RT-PCR扩增方法的灵敏性。
实施例5：样品预热对直接核酸扩增测定法的影响
用约5,000个病毒拷贝/ml的甲型流感、乙型流感和RSV病毒的组合(用于形成“FABR”合成样品)或仅用乙型流感病毒(10-4)掺入病毒运输介质。使用实施例1的通用主混合物通过直接扩增来评估这些样品，所述通用主混合物具有添加的1μl Improm II逆转录酶和0.25μl RNAsin。加入MS2噬菌体作为内部对照。将实验样品在75℃预热3分钟，并对于每种测定法将10μl样品添加至40μl通用主混合物。如下运行RT-PCR反应：
阶段1：50℃达10分(一次)
阶段2：97℃达2分(一次)
阶段3：102℃达1秒，接着在58℃达20秒，用于数据收集(重复50次)
结果如下：
接着，用HSV-1病毒(TCID50/ml=2.14)和对照病毒掺入对照脑脊液样品，并在缺乏RNAsin的情况中在有和没有样品预热的情况下对其评估。通过对样品同时评估HSV-2核酸的存在来确认HSV-1检测方法学的特异性。HSV-2在任何样品中均未检出。结果如下：
这些结果证明了在直接RT-PCR扩增和评估前短暂地预热样品在大多数情况(即，至少对于FluB、RSV和HSV-1)下增强了病毒检测的灵敏性且不会负面影响对其它病毒(即FluA)的灵敏性。此外，样品预热降低或消除了对纳入RNA酶抑制剂的需要。
实施例6A：使用BSA的粪样品方案
使用标准临床方法学从患者获得人粪样品。对于运输和短期贮存，将样品维持在2-25℃，并在使用前经受不超过一个冷冻/融化周期。对于评估，将植绒拭子(flocked swab)浸入彻底混合的粪标本中并通过将拭子向标本容器一侧按压来除去多余的粪。然后，将拭样在1ml Tris-EDTA (TE)缓冲液中涡旋振荡并弃去。将样品在97℃加热10分钟。然后，使用实施例1的UMM将样品以1:4稀释(即将2μl样品添加至8μl UMM)，所述UMM具有下文记载的UMM修改。任选地，可以将含阳性内部对照核酸的2μl溶液加入8μl UMM，其含有4μl UMM，以及0.35mg/ml BSA、各600 nM正向和反向引物、各300nM内部对照引物和0.5μl内部对照DNA)。将艰难梭菌靶引物用FAM荧光团标记，而将内部对照靶物用Quasar670荧光团标记。热循环开始于在97℃的初始变性步骤达2分钟，接着是40个在97℃达10秒和60℃达30秒的循环。实时PCR实施40个循环，并使用特异于靶核酸的荧光标记探针来测定扩增曲线，所述靶核酸在本实验中为艰难梭菌TCD-B基因。
组分 浓度
2.5倍通用MM 1倍
蝎状正向引物 600nM
反向引物 600nM
MgCl2 5mM
100倍BSA(10mg/ml) 0.35mg/ml
实施例6B：没有BSA的粪样品方案
为了确定添加BSA是否可能降低起因于粪材料的检测抑制，依照用于测试含BSA的样品的方案使用艰难梭菌DNA作为靶物在存在或缺乏BSA的情况下实施RT-PCR测定法。依照实施例6A中显示的配方来制备粪样品，尽管BSA阴性样品省去100倍BSA。将MagnaPure系统(Roche)用于核酸纯化。如上文描述的那样实施PCR反应，其中将BSA阴性PCR配制剂在孔1-20中分配，而将BSA阳性PCR配制剂在孔21-40中分配。
显示于表6的结果指示，BSA添加降低对来自粪样品的革兰氏阳性厌氧性细菌核酸检测的抑制。
表6：
实施例7：直接RT-PCR扩增为缓冲液依赖性的
使用直接扩增来评估甲型流感的样品和内部对照以确定如实施例1中限定的通用主混合物中使用的酶在其促成直接检测测定的能力中是否是独特的。使用杂合引物浓度，其由600nM甲型流感蝎状/引物(针对基质(matrix)基因)、500nM猪H1蝎状/引物(针对血凝素基因)和特异于MS2噬菌体的150nM装甲RNA内部对照(IC)蝎状引物组成。反应混合物使用如下浓度的两种不同酶和缓冲液系统制备：Flexi以及其伴随的5倍PCR缓冲液(Promega；目录号M891A或M890A)作为通用MM的组分，和FastStart高保真性(HighFidelity)以及其伴随的10倍缓冲液(Roche)作为RNA MM的组分：
样品由掺入病毒运输介质中的流感病毒组成。总共将2μl标本添加至8μl上文列出的每种反应混合物。在不进行预提取的情况中直接扩增每份样品。
然后实施热循环，并使用特异于靶核酸的荧光标记探针来测定扩增曲线。将InfA M基因探针、H1N1特异性HA基因探针和IC探针分别用FAM、CFR610和Q670标记。然后，将两种循环方案用于RT-PCR(ICy/通用96孔盘；3M)。将GoTaq和FastStart测定法首先用GoTaq循环实施，然后两者均用FastStart循环实施。FastStart方案如下：
阶段1：47℃达15分(一次)
阶段2：97℃达10分(一次)
阶段3：97℃达15秒，接着在60℃达30秒(重复40次)
GoTaq循环方案如下：
阶段1：47℃达10分(一次)
阶段2：97℃达2分(一次)
阶段3：97℃达5秒，接着在58℃达30秒(重复40次)
结果显示于图1(A)和(B)，其代表在使用FastStart循环方案的FastStart缓冲液运行的情况中，和在使用GoTaq循环方案的GoTaq缓冲液运行中的样品。使用FastStart循环条件和缓冲系统未观察到扩增，而使用GoTaq循环条件和缓冲系统观察到有力的扩增。
还比较样品贮存缓冲液的效果。具体地，使用FastStart方案比较来自贮存于通用运输介质(UTM)或1倍Tris-EDTA(“TE”)中样品的H1N1核酸扩增。如图2显示的，在UTM样品中未观察到显著扩增，而TE样品得到有力的扩增曲线。
研究了核酸提取对FastStart化学和循环条件的影响。如图3中显示的，确认了FastStart方案不能直接从临床样品扩增H1N1核酸(图3B)。然而，对于其中在扩增反应前提取核酸的样品观察到有力扩增(图3A)。这些结果证明了并非所有的RT-PCR扩增条件均可应用于直接扩增/检测系统，而且GoTaq化学尤其适用于此测定形式。
使用甲型流感阳性患者样品(包括2009年流行性H1N1阳性样品)确认用于直接扩增的GoTaq化学和循环条件的效率。使用下列参数实施扩增：
循环条件
阶段1：47℃达10分(一次)
阶段2：97℃达2分(一次)
阶段3：97℃达5秒，接着在58℃达30秒(重复40次)
显示于图4A的结果来自含有非流行性甲型流感病毒的样品，且FAM靶物的扩增指示甲型流感而非流行性H1N1甲型流感的检出。图4B显示流行性H1N1样品的扩增，且证明了甲型流感靶物以及H1N1特异性靶物的扩增。
实施例8：通过直接核酸扩增测定法检测Flu A、Flu B和RSV并与使用核酸提取的方法比较
使用直接核酸扩增测定法扩增来自临床标本(拭样)和对照样品的核酸，并将结果与使用涉及核酸提取的方法得到的扩增结果比较。扩增引物的序列显示于下表。
将临床标本和对照样品在65℃至70℃加热5分钟。如下准备反应混合物：
反应混合物
反应组分 体积(μL)
2.5倍主混合物 4.0
逆转录酶 0.5
RNA酶抑制剂 0.2
50倍flu A引物对 0.2
50倍flu B引物对 0.2
50倍RSV引物对 0.2
50倍内部对照引物对 0.2
内部对照RNA(经过加热的) 0.5
无核酸酶的水 2.0
反应混合物 8.0
标本(经过加热的) 2.0
总反应体积 10.0
然后使用下列循环参数实施热循环。
循环参数
步骤 时间(sec) 温度(℃) 重复
cDNA合成 600 47 1
起始加热 120 97 1
变性 5 97 40
退火/延伸 30 58
将使用直接核酸扩增测定法的扩增结果与使用涉及核酸提取的方法获得的扩增结果相比较，如下文显示的。
测试的临床标本(拭样)
先前的结果 标本数目
Flu A阳性 35
Flu B阳性 91
RSV阳性 47
阴性 19
总计 193
使用直接核酸扩增测定法获得的结果与使用涉及核酸提取的方法获得的结果之间有100%一致性，如上文显示的。
实施例9：通过直接核酸扩增测定法检测HSV-1、HSV-2和VZV并与使用核酸提取的方法比较
使用直接核酸扩增测定法扩增来自临床标本以及设计样品的核酸，并将结果与使用涉及核酸提取的方法的扩增结果比较。如下准备反应混合物：
反应混合物
反应组分 体积(μL)
2.5倍主混合物 4.0
25倍HSV1引物对 0.4
25倍HSV2引物对 0.4
50倍VZV引物对 0.2
50倍内部对照引物对 0.2
内部对照DNA 0.2
无核酸酶的水 0.6
反应混合物 6.0
样品 4.0
总反应体积 10.0
扩增引物的序列显示于下表。
序列
使用下列循环参数实施热循环。
循环参数
将使用直接核酸扩增测定法的扩增结果与使用涉及核酸提取的方法获得的扩增结果相比较，如下文显示的。
VZV
使用涉及核酸提取的扩增方法，32份标本(13份拭样、2份玻璃体液、17份CSF)中共有32份被检测为VZV阳性，而通过直接扩增方法，32份标本中有31份检测为阳性。测试为阴性的CSF样品在核酸酶抑制剂的情况下测试时检测为Ct37.1。
HSV-1和HSV-2
临床标本(拭样)：
使用涉及核酸提取的扩增方法检测为阳性的两份HSV-1样品在使用直接扩增方法时也测试为阳性。类似地，使用涉及核酸提取的扩增方法检测为阳性的两份HSV-2样品在使用直接扩增方法时也测试为阳性。
设计样品：
对于HSV-1和HSV-2，在直接扩增对扩增前核酸提取中使用设计样品的检测结果在下文显示。
HSV-2
*TCID50：50%组织培养感染剂量
HSV-1
*TCID50：50%组织培养感染剂量
如此，使用直接扩增方法和使用核酸提取的方法的结果对于检测HSV-1和HSV-2是相当的。
实施例10：通过直接核酸扩增测定法检测肠道病毒并与使用核酸提取的方法比较
使用直接核酸扩增测定法扩增来自样品的核酸，并将结果与使用涉及核酸提取的方法的扩增结果比较。如下准备反应混合物：
反应混合物
反应组分 体积(μL)
2.5倍主混合物 4.0
逆转录酶 0.5
RNA酶抑制剂 0.1
50倍肠道病毒引物对 0.2
50倍内部对照引物对 0.2
内部对照RNA 0.1
反应混合物 5.0
样品 5.0
总反应体积 10.0
扩增引物的序列显示于下表。
序列
使用下列循环参数实施热循环。
循环参数
将使用直接核酸扩增测定法的扩增结果与使用涉及核酸提取的方法获得的扩增结果相比较，如下文显示的。
根据直接扩增方法测试，通过涉及核酸提取的扩增方法测试为阴性的32份样品也呈阴性。根据直接扩增方法测试，通过涉及核酸提取的扩增方法测试为阳性的16份样品也呈阳性。
在直接扩增对扩增前核酸提取中使用设计样品的检测结果在下文显示。
TCID50：50%组织培养感染剂量
如此，使用直接扩增方法和使用核酸提取的方法的结果对于检测肠道病毒是相当的。
实施例11：通过直接核酸扩增测定法检测艰难梭菌并与使用核酸提取的方法比较
使用直接核酸扩增测定法扩增来自样品的核酸，并将结果与使用涉及核酸提取的方法的扩增结果比较。
从不同个体获得粪标本。将植绒拭子浸入粪标本中。除去过量的粪标本。将拭样置于1ml TE缓冲液中，涡旋振荡并弃去拭子。将样品在加热块中在97℃加热10分钟。
如下准备PCR主混合物：
PCR混合物
组分 浓度
2.5倍通用MM 1倍
蝎状正向引物 600nM
反向引物 600nM
MgCl2 5mM
100倍BSA(10mg/ml) 0.35mg/ml
将2微升加热的样品添加到8微升主混合物，并使用以下循环参数实施PCR：
步骤 循环 温度(℃) 时间
1 1 97 2分
2 40 97 10秒
60 30秒
引物靶向艰难梭菌的毒素B区。扩增引物和扩增子的序列在下文显示。
艰难梭菌蝎状引物:
5’d BHQ-1-AGGCAGCTCACCATCAATAATAACTGAACCAGTTGCTGCC-T(FAM)-间隔区18-GGTTAGATTTAGATGAAAAGAGATATTATTTTA3’
艰难梭菌反向引物:
5’d ACTAATCACTAATTGAGCTGTATCAGGA3’
艰难梭菌扩增子：
Ggttagatttagatgaaaagagatattattttacagatgaatatattgcagcaactggttcagttattattgatggtgaggagtattattttgatcctgatacagctcaattagtgattagt
在495nm处检测来自艰难梭菌蝎状引物的荧光信号，并在644nm处检测来自内部对照的信号。
将使用直接核酸扩增测定法的扩增结果与使用涉及核酸提取的扩增方法获得的结果相比较，如下文显示的。
如此，99%的通过涉及核酸提取的扩增方法鉴定为阳性的样品通过直接扩增测定法也鉴定为阳性，且91%的通过涉及核酸提取的扩增方法鉴定为阴性的样品通过直接扩增测定法也鉴定为阴性。
使用由掺有艰难梭菌细菌储液的粪-TE缓冲液基质中的设计样品组成的组来测定检测限(LoD)。该组包含阴性(未掺入的基质)和近似LoD(在测试的较早阶段中获得)左右的不同浓度的样品。将来自三种(3)不同制备物和在每个水平上的PCR运行(8份重复/运行)的二十四份(24)重复的结果(阳性/阴性)用Probit分析来分析以测定能以95%概率准确检测的最低浓度。检测限为0.04cfu/反应。
测定法的再现性
使用掺有艰难梭菌细菌储液的粪-TE缓冲液基质中的设计样品来实施再现性研究。该组包括阴性(未掺入的基质)、低阳性(约2至4倍LOD)和中等阳性(约8至10倍LOD)样品。再现性研究使用两个整合的循环仪实施5天(不连续日)。每天，在每个仪器上实施2次运行。每个运行包含每组成员和阳性对照(PC)的4次重复和无模板对照(NTC)的一次重复。在整合的循环仪的每个运行中，所述组和PC用四个重复测定，而NTC以一式一份测定。使用一批直接扩增测定法以每仪器每天2次运行在5天(不连续日)的时段内运行该组。最少有2个仪器，每个仪器至少1名操作员。结果再现性的汇总在下文显示。
在存在潜在干扰性物质情况下测定法的性能
在潜在干扰性物质的情况下评估此测定法的性能，所述潜在干扰性物质可以以在下表中指示的浓度存在于粪样品中。最初测试各4个重复的总共21种潜在干扰性物质和5个重复的基线(阳性)样品。在初始运行期间，除了两种干扰样品外全部在所有4次重复中测试为“阳性”。对于两种干扰性物质(万古霉素和碱式水杨酸铋)，在重复/确认运行后，所有5次重复均为“阳性”的。未观察到干扰。
交叉反应性
实施针对各种可能的交叉反应物的分析特异性。总共测试47份潜在的交叉反应物生物体。仅轮状病毒生物体在所有3个重复的初始测试中测试呈“阴性”。对“轮状病毒”的5次重复的确认性运行也测试为“阴性”。未观察到交叉反应性。
实施例12：通过直接核酸扩增测定法检测A组链球菌并与使用核酸提取的方法比较
使用直接核酸扩增测定法扩增来自样品的核酸，并将结果与使用涉及核酸提取的方法的扩增结果比较。
在直接扩增测定法中使用拭样样品。如下准备PCR主混合物：
PCR混合物
组分 浓度
2.5倍通用MM 1倍
蝎状正向引物 600nM
反向引物 600nM
MgCl2 2.5mM
氯化钾 40mM
将2μl来自拭样样品的运输介质添加到8μl PCR主混合物，并使用以下循环参数实施PCR：
扩增引物和扩增子的序列在下文显示。
A组链球菌蝎状引物：
5’d BHQ-1-AGCGGCACTCCAAAAATCAGCAGCTATCAAAGCAGGTGTGCCGC-T(FAM)-间隔区18-AAGCTTAATATCTTCTGCGCTTCGT3’
A组链球菌反向引物：
5’d TAACCCAGTATTTGCCGATCAA3’
A组链球菌扩增子：
taacccagtatttgccgatcaaaactttgctcgtaacgaaaaagaagcaaaagatagcgctatcacatttatccaaaaatcagcagctatcaaagcaggtgcacgaagcgcagaagatattaagctt
将使用直接核酸扩增测定法的扩增结果与使用涉及核酸提取的扩增方法获得的结果相比较，如下文显示的。
如此，93.8%的通过涉及核酸提取的扩增方法鉴定为阳性的样品通过直接扩增测定法也鉴定为阳性，且99%的通过涉及核酸提取的扩增方法鉴定为阴性的样品通过直接扩增测定法也鉴定为阴性。
实施例13：在干扰性物质的存在下通过直接核酸扩增测定法检测Flu A、FluB和RSV
使用实施例8的实验方案，利用直接核酸扩增测定法在存在下表所列各种干扰性物质的情况下扩增来自临床标本的核酸：
对于每种潜在的干扰性物质，一式两份进行直接扩增测定法。将Q670荧光标记物用于内部对照，PC代表阳性对照，而NEG代表阴性对照。
下表呈现了在潜在干扰性物质的存在下检测Flu A病毒的Ct结果。
下表呈现了在潜在干扰性物质的存在下检测Flu B病毒的Ct结果。
下表呈现了在潜在干扰性物质的存在下检测RSV病毒的Ct结果。
*在2个重复中的1个中检测出假阳性FAM信号。
基于阴性对照在FAM、JOE或CFR610通道中缺少有效扩增信号且在Q670通道中Ct<40，结果验证为是准确的。还有，PC反应在FAM、JOE和CFR610通道中给出Ct<40。
用于检测Flu A、Flu B和RSV的直接扩增测定法的结果证明了相比于没有任何干扰性物质的对照样品，对于任一种测试病毒用任一种干扰物在Ct值中没有显著变化。因此，直接扩增测定法在检测这些病毒的低阳性样品时不受潜在干扰性物质影响。
实施例14：在干扰性物质的存在下通过直接核酸扩增测定法检测HSV-1和HSV-2
使用实施例3的实验方案，利用直接核酸扩增测定法在存在下表所列各种干扰性物质的情况下扩增阴性拭样基质上和合成脑脊液中的核酸：
全血潜在干扰性物质(干扰物ID：1)以10%测试，其比纯化的血红蛋白在临床上更相关。还有，血红蛋白潜在干扰性物质(干扰物ID：9)在5.0-1.25mg/mL的更高浓度测试，但HSV-1和HSV-2的检测在这些浓度受到抑制。
对每种潜在的干扰性物质一式三份地进行直接扩增测定法。将Q670荧光标记物用于内部对照，PC代表阳性对照，而NEG代表阴性对照。
下表呈现了在潜在干扰性物质的存在下检测阴性拭样基质上HSV-1病毒的Ct结果。
对女性尿液(干扰物ID：2)的流体检查失败，如由无一样品的荧光值比对照更高指示的，尽管在女性尿液样品中检测到HSV-1。K-Y牌胶冻剂(干扰物ID：5)相比于对照样品产生更早的Ct值，即使将相同的HSV-1水平用于所有潜在干扰物质测试。重新测试女性尿液和K-Y胶冻剂潜在干扰物，而且其对于两种样品可再现地产生更早的Ct。
下表呈现了在潜在干扰性物质的存在下检测阴性拭样基质上HSV-2病毒的Ct结果。
与上文对HSV-1描述的女性尿液样品有关的流体检查问题也适用于HSV-2。
下表呈现了在潜在干扰性物质的存在下检测合成脑脊液中HSV-1病毒的Ct结果。
干扰物ID HSV-2(FAM) HSV-1(CFR610) IC(Q670)
对照 0 34.4 31.9
对照 0 33.5 32.2
对照 0 32.5 32.2
对照 0 34.0 32.3
1 0 35.0 32.4
1 0 33.3 31.7
1 0 32.9 31.9
3 0 34.2 31.7
3 0 34.4 31.2
3 0 33.6 31.7
4 0 35.0 32.1
4 0 36.4 31.4
4 0 36.7 31.5
6 0 35.5 32.2
6 0 33.5 31.4
6 0 34.3 32.5
7 0 33.9 33.1
7 0 36.1 32.6
7 0 33.8 32.9
8 0 34.4 31.7
8 0 33.4 31.6
8 0 32.1 31.3
9 0 34.1 31.7
9 0 32.6 31.4
9 0 32.4 32.0
PC(第1天) 31.0 31.2 31.0
NEG(第1天) 0 0 31.1
PC(第2天) 30.5 31.2 31.0
NEG(第2天) 0 0 31.1
下表呈现了在潜在干扰性物质的存在下检测合成脑脊液中HSV-2病毒的Ct结果。
基于阴性对照在FAM或CFR610通道中缺少有效扩增信号且在Q670通道中Ct<40，结果验证为是准确的。还有，PC反应在FAM和CFR610通道中给出Ct<40。
用于检测HSV-1和HSV-2的直接扩增测定法的结果证明了对于任一种测试病毒用任一种干扰物在Ct值中没有显著变化。因此，直接扩增测定法在检测这些病毒的低阳性样品时不受潜在干扰性物质影响。
实施例15：提供改进性能的直接扩增测定法的组分
以下数据代表允许改进性能的直接扩增测定法的组分。在一个实施方案中，所有这些组分的组合提供允许实时PCR即使在存在已知抑制剂(例如，血和肝素)的情况中也有效的系统。
KCl的影响
向直接扩增测定法添加KCl(高达20-40mM)改进荧光信号且赋予反应以改进的灵敏性。图5中的数据证明了在存在和缺少KCl的情况中对MRSA的检测。尽管一些检测在没有KCl的情况中是有可能的，但KCl的存在改进了反应功效。图5中的数据在存在其它反应组分(如阳离子型表面活性剂)的情况下生成。
BSA的影响
将BSA以各种浓度添加至含有艰难梭菌的粪样品。在由下文3500ng/反应代表的更高浓度，从一些患者样品消除抑制。如可在下表(呈现Ct值)中看到的，在BSA的较低浓度5ng/反应，未检出艰难梭菌靶物且在3份样品中的2份中失去内部对照。具体地，用样品A检出内部对照。然而，相比于在更高浓度的样品，更低的Ct值证明延迟的扩增，而且是抑制特征性的(Ct值是生成充足信号以检测所讨论靶物的PCR循环)。
表面活性剂的影响
添加阳离子型表面活性剂改进荧光信号且赋予直接扩增测定法以改进的灵敏性。如图6中表明的(其中对Simplexa博德特氏菌(Bordetella)进行直接扩增测定法)，一些检测在未添加表面活性剂的情况中是有可能的。然而，当使用表面活性剂时，反应的功效得到改进，如由赋予改进的灵敏性的更高信号高度证明的。
额外加热的影响
一些测试的微生物需要额外的加热步骤来改进测定法功能。例如，在使用超出标准反应中提供的加热(例如预热)的额外加热时，对于Flu B观察到灵敏性改进，如图7中表明的。在Flu B情况中的改进在温度70℃看到。检测其它微生物(如艰难梭菌和A组链球菌)的测定法性能在温度95℃看到。加热样品以破坏抑制剂并裂解生物体必须与加热破坏试剂的潜力相平衡。在一些实施方案中，在添加试剂(例如，缓冲液)前实施加热样品。
系统的容许量
下文数据(百日咳/副百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis/parapertussis)PCR)显示直接扩增测定法可以在没有抑制的情况中容许高达30%运输介质(Copan UTM)。下文用直接检测方法学测试的所有样品均使用30%样品和70%直接扩增反应混合物。将来自直接检测的结果与在扩增前使用DNA提取和纯化的结果相比较。直接方法相比于使用患者标本的提取和纯化测试具有99%灵敏性和特异性。
直接检测阳性 直接检测阴性
提取方法阳性 43 3
提取方法阴性 3 409
先前的公开内容需要在向反应混合物添加标本之前进行显著稀释，因此限制了灵敏性。
实施例16：使用其它标本类型的直接扩增测定法
全血
使用全血来实施人遗传测试。全血可以以1:4稀释度或10μl反应体积中0.5μl使用。在任一情况下，血红素(其为已知的PCR抑制剂)不影响测定法。在使用直接扩增方法和使用参照方法(其利用在扩增和突变检测前的核酸提取)时测试因子V Leiden突变或因子II突变的存在时，实现完全一致性。
具有肝素的全血
图8中的数据显示来自收集到3个管中的单一血液样品的扩增图，每个管有不同的抗凝血剂(肝素、EDTA、柠檬酸盐)。如能看到的，扩增图显示所有样品均给出有效扩增，即使在将肝素(一种已知的PCR抑制剂)用作抗凝血剂时。
颊拭样
图9中的数据代表来自针对突变(检测因子V Leiden突变区)的2份人遗传DNA样品中每一份的4次重复，加上一个阴性对照。对于所有重复均看到有效扩增。通过拭抹内颊约10秒以确保使用整个拭子表面来收集样品。然后，将拭样置于500uL1倍TE缓冲液2uL中，其不进行提取直接加载到PCR样品中。
与先前公开的文献比较
先前公开的结果指示，为了有效检测必须将样品稀释。相比于这些出版物，例如Pandori等,BMC Infect.Dis.,6:104(2006)参考文献，前文数据证明了大10倍量的样品，这比公开的方法提供低10倍的检测限。
本文中提述或引用的论文、专利和专利申请、以及所有其它文档和电子可获得信息的内容均通过提述完整据此并入，其程度就像将每篇单独的出版物明确且个别指示为通过提述收录一样。申请人保留将来自这类论文、专利、专利申请或其它实体和电子文档的任何和所有材料和信息在物理上纳入本申请的权利。
本文中例示性描述的发明可适宜地在缺少任何一项或多项要素、一项或多项限制的情况下(未在本文中具体公开)实践。另外，本文中采用的术语和表述已经用作描述而非限制的术语，且在使用这类术语和表述中不意图排除任何显示和描述的特征的等同方案或其部分，而是认可在所要求保护的本发明范围内可进行各种修改。如此，应理解尽管本发明已由优选的实施方案和任选的特征具体公开，但本领域技术人员可寻求对本文中公开的其中实施的发明的修改和变更，且这类修改和变更被视为在本发明的范围内。
本文中已经广泛地且一般性地描述了本发明。落入一般公开内容内的每一种较窄的种类和亚类分组也形成这些发明的一部分。这包括具有从所述种类除去任何主题的条件或否定限制的发明的通用描述，不管要消除的材料是否是本文中具体叙述的。
其它实施方案在所附权利要求书中。另外，在按马库什组描述本发明的特征或方面的情况中，由此本领域技术人员会认可本发明也按马库什组的任何个别成员或成员亚组描述。

Claims (28)

1.一种用于鉴定从人获得的生物学样品中来自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括：
(a)在如下的条件下使所述样品与DNA聚合酶和缓冲液接触，所述条件适合于在不从所述样品提取所述靶核酸的情况中从所述样品扩增所述靶核酸；
(b)将来自步骤(a)的所述样品热循环，从而在存在的情况中使得所述靶核酸得到扩增；并
(c)在存在的情况中检测从步骤(b)生成的扩增的靶核酸，
其中在扩增前不从所述样品提取所述样品中的核酸。
2.权利要求1的方法，其中在步骤(a)前不稀释所述样品。
3.权利要求1的方法，其中在步骤(b)前加热所述样品。
4.权利要求3的方法，其中在步骤(a)前加热所述样品。
5.权利要求1的方法，其中在步骤(b)前将所述样品于至少约70℃的温度加热至少约2分钟。
6.权利要求1的方法，其中所述缓冲液包含氯化钾(KCl)。
7.权利要求6的方法，其中所述KCl以约5mM至约50mM的浓度存在。
8.权利要求1的方法，其中所述缓冲液包含GoTaqTMFlexi缓冲液。
9.权利要求8的方法，其中所述GoTaqTMFlexi缓冲液在步骤(b)期间以1倍-5倍浓度存在。
10.权利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶是Taq聚合酶。
11.权利要求1的方法，其中所述靶核酸是DNA。
12.权利要求1的方法，其中所述靶核酸是RNA。
13.权利要求12的方法，其中在扩增前还使所述样品与逆转录酶接触。
14.权利要求13的方法，其中使所述样品同时与所述DNA聚合酶和所述逆转录酶接触。
15.权利要求1的方法，其中所述样品选自下组：血液、血清、血浆、脑脊髓液、口腔流体和粪。
16.权利要求15的方法，其中所述血液是全血液。
17.权利要求1的方法，其中所述样品从颊区获得。
18.权利要求1的方法，其中所述微生物是病毒。
19.权利要求18的方法，其中所述病毒选自下组：流感病毒、呼吸道合胞病毒、水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒和肠道病毒。
20.权利要求1的方法，其中所述微生物是细菌。
21.权利要求20的方法，其中所述细菌是梭菌属(Clostridium)或链球菌属(Streptococcus)。
22.权利要求1的方法，其中所述缓冲剂还包含清蛋白。
23.权利要求22的方法，其中所述清蛋白是BSA。
24.权利要求1的方法，其中所述缓冲剂还包含表面活性剂。
25.权利要求24的方法，其中所述表面活性剂是阳离子型表面活性剂。
26.一种用于鉴定从人获得的生物学样品中来自微生物的靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括：
(a)在如下的条件下使所述样品与DNA聚合酶和缓冲剂接触，所述条件适合于在不从所述样品提取所述靶核酸的情况中从所述样品扩增所述靶核酸；
(b)将来自步骤(a)的所述样品热循环，从而在存在的情况中使得所述靶核酸得到扩增；并
(c)在存在的情况中检测从步骤(b)生成的扩增的靶核酸，
其中在扩增前不从所述样品提取所述样品中的核酸，
且其中所述缓冲剂包含至少一种选自下组的组分：KCl、牛血清清蛋白和表面活性剂。
27.权利要求26的方法，其中所述表面活性剂是阳离子型表面活性剂。
28.权利要求26的方法，其还包括在步骤(a)或步骤(b)前加热所述样品。
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