CN104164518A - 一种直接检测a+b型流感病毒的实时荧光rt-pcr方法 - Google Patents

一种直接检测a+b型流感病毒的实时荧光rt-pcr方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种直接检测A型、B型流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，所述试剂盒包含有RT-PCR反应液，RT-PCR反应液为具有流感病毒裂解功能的RT-PCR反应液。在本发明中采用具有A型和B型流感病毒裂解活性的RT-PCR反应液进行扩增，反应液直接将A型和B型流感病毒裂解之后使病毒RNA释放出来，那么便可以直接进行RT-PCR过程；因此可以不需要在扩增之前提取RNA样本后再进行PCR的过程大大缩减了时间，并且大大降低了病毒RNA的降解程度，大大提升诊断的准确性。

Description

一种直接检测A+B型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法
技术领域
本发明属于流感病毒定性检测技术领域，具体涉及一种直接检测A+B型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法和试剂盒。
背景技术
流感是由流感病毒引起的一种急性传染病。流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，为有囊膜的负链RNA病毒，其病毒基因组包括8个节段，为单链、负链RNA，分别编码至少10种以上的蛋白。流感病毒包括A、B和C三种类型，造成呼吸道感染最常见的是A和B两种流感病毒。其中，A型流感病毒又可以分为1-16种HA亚型和1-9种NA亚型；而引起感染的流感病毒的主要是A型中的H1(N1)、H3(N2)亚型和B型流感病毒。
而在现有在临床化验检测的过程中，比较通用的有传统方法和分子生物学方法两大类。其中，传统方法一般采用分离培养(如鸡胚培养和MDCK培养)后通过血凝实验、血凝抑制实验、中和实验、单放射扩散溶血技术等等进行类别确认。传统方法，因为大量培养之后进行宏观的实验确认，整体操作周期产长、特异性差等。而相对传统方法，分子生物学方法以实时PCR为基础实验过程对病毒核酸标样进行扩增，然后对扩增产物分析得出靶病毒的检测结果。实时PCR是利用不同的荧光物质来实现对扩增产物进行实时检测的目的。其中，实时PCR最常用的两种荧光探针是SYBR Green Ⅰ和Taqman探针。SYBRGreen Ⅰ是一种荧光染料型探针，它是在实时荧光PCR反应的过程中，插入DNA双链，来发射荧光信号，实现对整个反应过程的实时监测，其荧光信号的强度与DNA模板的增加量呈正相关。Taqman探针是在实时荧光PCR的反应过程中，通过与DNA模板荧光标记探针型可以采用不同荧光基团标记探针或者引物。
但是上述分子生物学方法中，首先第一个步骤是需要采用RNA试剂盒从待测的组织标样(如咽拭子)提取RNA样本，然后对RNA样本进行实时PCR。由于RNA提取的步骤繁多，且RNA本身不稳定易于降解，因此采用现有的实时荧光PCR的方法耗时长，且荧光信号结果的不利于准确分析。
发明内容
本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种不需要RNA提取便可以直接检测A+B型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法和试剂盒。
本发明的直接检测A型、B型流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，包含有RT-PCR反应液，其中所述RT-PCR反应液为具有流感病毒裂解功能的RT-PCR反应液。
在本发明中，RT-PCR中所采用的RT-PCR反应液具有流感病毒裂解活性；立意于A型和B型流感病毒的结构非常简单，由外层蛋白质组成的细胞膜、衣壳、以及包覆于内部核酸分子形成，而且在侵入病体后会复制和扩散的活化状态下，本身病毒结构中简单的结构会更加容易裂解释放核酸。因此在本发明中采用具有A型和B型流感病毒裂解活性的RT-PCR反应液进行扩增，那么便可以直接进行RT-PCR过程；相比现有的先提取RNA样本后再进行PCR的过程大大缩减了时间，并且大大降低了病毒RNA的降解程度，那么便可以大大提升检测的准确性。
本发明进一步还提出直接检测A型、B型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法，在方法实施过程中采用上述具有流感病毒裂解功能的RT-PCR反应液进行。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明实施例阳性对照中A、B型流感病毒双重荧光RT-PCR检测结果；
图2为本发明实施例临床样本A型流感病毒的荧光RT-PCR检测结果；
图3为本发明实施例临床样本B型流感病毒的荧光RT-PCR检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实例提供了一种直接检测A+B型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法，本发明的方法仍然基于实时荧光PCR的手段进行，但是相比现有荧光PCR的做法，直接采用RT-PCR步骤进行。
其中，在本发明的方法中，RT-PCR中所采用的RT-PCR反应液具有流感病毒裂解活性；这一技术手段的立意是基于本身A型和B型流感病毒非常简单的结构，由细胞膜、衣壳的外层结构、以及包覆于内部核酸分子形成，而且在侵入病体后会复制和扩散的活化状态下，本身病毒结构会更加容易裂解释放核酸。因此在本发明中采用具有A型和B型流感病毒裂解活性的RT-PCR反应液进行扩增，病毒被裂解之后将RNA释放出来，那么便可以直接进行RT-PCR过程。相比现有的先提取RNA样本后再进行PCR的过程大大缩减了时间，并且大大降低了病毒RNA的降解程度，那么便可以大大提升检测的准确性。本发明中采用美国VitaNavi Technology公司生产的产品号为VND780RTK的Direct S/P qRT-PCR TaqProbe Kits即可良好地实现该RT-PCR反应液病毒裂解。
其中在上述过程中，这一病毒裂解可以通过RT-PCR反应液中添加表面活性剂即可实现，这些表面活性剂成分具有较多的亲水基团和疏水基团，疏水基团非常容易与病毒表面结合，从而破坏进而使病毒裂解，比如十二烷基磺酸钠等等。
进一步在现有实时荧光PCR是先提取RNA后，经过反转录后再进行PCR过程，RNA样本一般提取后比较纯，因此在扩增的过程中引物和探针的识别和结合的特异性采用一般的引物和探针即可达到较好的效果；其中引物序列见下表1：(这一段不太合适，我们的引物和探针的重点是覆盖全面，即能够识别A、B型的所有亚型，而不是更优的结合性)
引物名称 引物序列(5’-3’) 序列表序号
A型流感病毒上游引物 GACCRATCCTGTCACCTCTGAC SEQ.ID.No.1
A型流感病毒下游引物 GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG SEQ.ID.No.2
B型流感病毒上游引物 TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG SEQ.ID.No.3
B型流感病毒下游引物 CGGTGCTCTTGACCAAATTGG SEQ.ID.No.4
荧光探针设计序列见下表2：
探针名称 探针序列(5’-3’) 序列表序号
A型流感病毒基因探针 TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG SEQ.ID.No.5
B型流感病毒基因探针 CACCGCAGTTTCAGCTGCTCGAATTGG SEQ.ID.No.6
并且，A型流感病毒基因探针和B型流感病毒基因探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。本发明的上述A型流感病毒基因探针和B型流感病毒基因探针设计基于A型流感病毒的多种亚型之间存在的保守序列进行设计。可以实现针对所有A型和B型流感病毒，在扩增过程可以涵盖了所有亚型，防止了漏检的问题，大大降低了结果偏差，提升了检测的准确性。当然，在上述实施方式中，A型流感病毒的荧光探针和B型流感病毒的荧光探针所标记的荧光基团的类型可以为不相同的荧光基团进行，那么在最终检测时信号不会相互产生干扰，更加利于结果分析。
采用本发明的上述探针、引物即可直接进行RT-PCR，由于本身待测样品直接为病患的咽拭子、痰液等，那么在RT-PCR过程中需要控制体系的浓度和量比，使扩增的S曲线更急平滑。该体系中2×S/P qRT-PCR TaqProbe mix，S/PqRT-PCR Pols(来自于Direct S/P qRT-PCR TaqProbe Kits试剂盒)的RT-PCR反应液的成分中本身包含有较多能够破坏病毒外部结构的基团结构，满足本发明直接通过RT-PCR实现扩增的要求。
并且，在本发明上述体系下进行RT-PCR扩增，其过程为：
(1)55℃ 30min
(2)95℃ 5min
(3)94℃ 30s
(4)60℃ 1min；其中(3)(4)步骤作为循环重复40次。
在上述循环结束后，在60℃时分别检测A型流感病毒基因探针和B型流感病毒基因探针所标记的荧光信号。
其中，本发明中在上述实施过程中，一般处于同时检测的需要所以同时添加有A型流感病毒和B型流感病毒的引物和探针；而针对某些只需进行但一种A型流感病毒或者B型流感病毒的单一检测时，那么在体系中可以只加入需要对应待测流感病的引物和探针。
采用本发明的上述的RT-PCR方法，可以实现对临床咽拭子样本的A、B型流感病毒靶片段的直接双重检测，在方法步骤中省去了繁琐的RNA抽提步骤，相比于传统实时荧光RT-PCR，大大缩短了时间，防止了RNA的降解；并且针对这一中情形，通过特定的引物和探针可以实现更加准确的定性、尤其是定量检测分析。
当然可以理解的是，本发明的实时RT-PCR的过程中与现有PCR方法类似的是，在方法进行的过程中，还可以提供阳性对照，阳性对照可以采用连有A流感病毒基因片段的大肠杆菌和连有B流感病毒基因片段的大肠杆菌。大肠杆菌作为比较通用的基因片段载体，具有合适的酶切位点；当然在实施中阳性对照也可以采用其他的载体，并不限于大肠杆菌。扩增中在阳性对照存在的情形下，可以更加利于结果的进一步准确对比分析。
为了使本发明的试剂盒产品和测量方法更加的利于理解，并且使采用本发明试剂盒产品和检测方法的优点更加明确，以下通过多个实施例进行举例说明：
实施例1
本实施例中采用的样本：
(1)对照：连有流感A基因片段的大肠杆菌、连有B基因片段的大肠杆菌。
(2)深圳市疾控中心提供的45人份疑似感染A型流感病毒和45人份疑似感染有B型流感病毒的患者咽拭子样本。
利用VitaNavi Direct One-Step S/P Qrt-pcr TaqProbe Kits(No Reference Dye)在ABI7500构建双重荧光RT-PCR体系，通过RT-PCR扩增体系中各个组分的终浓度：
其中，A型流感病毒基因探针荧光标记后为：
5’FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-ECLIPSE-3’；
B型流感病毒基因探针荧光标记后为：
5’HEX-CACCGCAGTTTCAGCTGCTCGAATTGG-ECLIPSE-3’；
根据上述的反应体系和反应条件中用阳性对照来进行RT-PCR扩增，其过程为：55℃-30min；95℃-5min；然后进行下述40个循环94℃-30s、60℃-1min。
在上述循环过程中，分别将荧光信号为FAM和HEX，检测A型流感病毒基因探针和B型流感病毒基因探针所标记的荧光信号，其检测结果参见图1所示。图1中A型流感病毒在17个循环处开始检测到荧光信号，B型流感病毒在19个循环处开始检测到荧光信号，两条反应曲线都较平滑，且荧光信号接近，初步说明该构建体系达到理想的预期。
进一步按照上述的反应体系和反应条件，分别取45份疑似患有A型和B型流感病毒呼吸道感染疾病的样本进行临床检测，检测结果如图2、图3所示。
根据图2和图3，在45份疑似感染有A型和B型流感病毒感染的患者样本中，分别检测出20个A型流感病毒阳性样本，23个B型流感病毒阳性样本。20个A型流感阳性样本的Ct值在19-33范围内，曲线较平滑，荧光值大小相对理想，如图2。23个B型流感阳性样本的Ct值在20-33范围内，曲线较平滑，荧光值大小总体上较理想，如图3。
本发明在上述实施例的基础上，进一步还提出一种直接检测A+B型流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒。其中在试剂盒中包含上述A型和B型流感病毒扩增引物、探针。当然，如果在实际使用中，出于仅仅只检测其中一种流感病毒的目的，也可以在试剂盒中只包含其中所需待测的对应类型流感病毒的引物和探针。并且在试剂盒中包含有RT-PCR反应液，那么对应本发明上述直接进行RT-PCR的方法，该RT-PCR反应液具有A型和B型流感病毒裂解能力。那么该功能的实现，可以通过在现有反应液的缓冲液中添加表面活性剂等，或者是直接采用本身具有这一类功能的缓冲液。当然在RT-PCR反应液中需要包含有逆转录酶、DNA聚合酶、以及核苷酸原料等等。由于针对本发明中直接进行RT-PCR的特点，其中该逆转录酶优选无RNaseH活性(RNaseH-)的逆转录酶，可以进一步避免RNA的降解。采用本发明的上述试剂盒，不需先进行RNA提取的步骤，实施中便可以直接进行RT-PCR。
当然，为了更加进一步方便检测，在试剂盒中也可以包含上述阳性对照的，即连有流感A基因片段的大肠杆菌、连有B基因片段的大肠杆菌。基于本发明试剂盒的主要目的，可以采集病患的离体组织(比如咽拭子、痰液、或者患处的组织细胞)进行的检测，然后间接地辅助疾病的分析和参考。当然，出于本发明的试剂盒所能实现的功能，所检测的待测标样也可以拓展到类似的食品检疫等领域；只要是功能和目的相同，均可以采用本发明的试剂盒和检测方法进行实施，并不仅仅限定于辅助疾病检测的目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种直接检测A型、B型流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，所述试剂盒包含有RT-PCR反应液，其特征在于，所述RT-PCR反应液为具有A型、B型流感病毒裂解功能的RT-PCR反应液。
2.如权利要求1所述的直接检测A型、B型流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液为包含有表面活性剂的RT-PCR反应液。
3.如权利要求1或2所述的直接检测A型、B型流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含有扩增A型流感病毒的上游引物、下游引物，以及A型流感病毒荧光探针；
所述A型流感病毒上游引物具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列；
所述A型流感病毒下游引物具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列；
所述A型流感病毒荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.5的碱基序列，且所述A型流感病毒荧光探针的5’端标记有荧光报告基团、3’端标记有荧光淬灭基团。
4.如权利要求1或2所述的直接检测A型、B型流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含有扩增B型流感病毒的上游引物、下游引物，以及B型流感病毒荧光探针；
所述B型流感病毒上游引物具有序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列；
所述B型流感病毒下游引物具有序列表SEQ.ID.No.4的碱基序列；
所述B型流感病毒荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.6的碱基序列，且所述B型流感病毒荧光探针的5’端标记有荧光报告基团、3’端标记有荧光淬灭基团。
5.如权利要求1或2所述的直接检测A型、B型流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括有阳性对照，所述阳性对照为连有A型流感病毒基因片段的载体、和/或连有B型流感病毒基因片段的载体。
6.一种直接检测A型、B型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法，其特征在于，在RT-PCR过程中的RT-PCR反应液为具有流感病毒裂解功能的RT-PCR反应液。
7.如权利要求6所述的直接检测A型、B型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法，其特征在于，RT-PCR过程中采用扩增所述A型流感病毒上游引物为具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，下游引物为具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列；
以及，RT-PCR过程中采用A型流感病毒荧光探针为具有序列表SEQ.ID.No.5的碱基序列，且所述A型流感病毒荧光探针的5’端标记有荧光报告基团、3’端标记有荧光淬灭基团。
8.如权利要求6所述的直接检测A型、B型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法，其特征在于，RT-PCR过程中采用扩增B型流感病毒的上游引物为具有序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列，下游引物为具有序列表SEQ.ID.No.4的碱基序列；
以及，RT-PCR过程中采用B型流感病毒荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.6的碱基序列，且所述B型流感病毒荧光探针的5’端标记有荧光报告基团、3’端标记有荧光淬灭基团。
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