CN103374631A - 鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的rt-pcr法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用多重引物组合鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法，其包括如下步骤：样本总RNA的提取→反转录得到样本cDNA→使用多重引物扩增目标片段→凝胶电泳分析、结果判定。该法适用于对鸡新城疫病毒常用疫苗株和主要流行野毒株进行快速鉴别检测，具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点，在实现对NDV与其他病毒的鉴别的同时鉴别出毒株基因型的归属。该方法的建立对鸡新城疫病毒的分子变异机制以及分子流行病学分析均有十分重要的意义。

Description

鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法

技术领域

本发明涉及RT-PCR检测技术，具体地说，涉及鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，NDV)是目前严重危害养禽养殖业的主要传染病之一，其病原为新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)。根据国际病毒分类委员会(International CommitteeonTaxonomy of Viruses，ICTV)关于病毒的最新分类报告，NDV归属于副黏病毒科、副黏病毒亚科的禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)。虽然目前NDV只有一个血清型，却具有明显的基因多样性，根据F基因序列分析至少可以划分为10个基因型。系统的分子流行病学调查结果显示基因VII型是当前世界范围内最主要的流行毒株，近期亚洲、欧洲、非洲、中东以及南美洲的ND爆发大多与该基因型毒株有关。目前常用的NDV疫苗株是LaSota株，属于基因II型毒株，与基因VII型流行毒株存在较大的差别。

传统的新城疫病毒实验室检测方法为病毒分离鉴定，需要将临床可疑病料处理后接种合适的载体(如鸡胚、鸡胚成纤维细胞等)进行病毒分离，通过血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验对分离到的可疑病毒进行鉴定，一般还要通过最小致死量致死鸡胚的平均时间(MDT)测定，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)的测定和6周龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)测定确定分离病毒的毒力强弱，因此相对比较费时费力。

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特异性基因片段的技术，在疾病的检测方面有着广阔的应用前景，近年已越来越多的被广泛应用。利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)能够选择性地将鸡新城疫病毒基因组的一个特异性短片段放大10万倍以上，极大地增强了检测的敏感性。但我国对新城疫的控制主要是利用疫苗进行免疫防控，利用常规RT-PCR不能够区分NDV疫苗株和野毒株，给临床诊断带来一定的困难。

系统研究显示，目前我国流行的NDV主要流行株(基因VII型)与常用疫苗株(基因II型)存在明显基因差异。国内基因VII型野毒株F和HN基因核苷酸同源率均在93％以上，但与LaSota疫苗株的同源率均仅80％左右。这种基因差异为建立RT-PCR方法鉴别常用疫苗株与主要流行野毒株提供了可能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测手段的不足，提供一种采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对鸡新城疫病毒疫苗株和流行株感染进行快速鉴别检测的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法，包括以下步骤：

1)临床样品经预处理后，提取样本总RNA。

2)反转录(RT)得到样本cDNA。

3)以样本cDNA为模板，使用以下引物组合进行PCR扩增。

上游引物P1：5’-GTCGTGCTCAGTGATGTG-3’；

上游引物P2：5’-GCTCCGCCTACTCCGTCAG-3’；

下游引物P3：5’-TTGTTACCTCAATGTGCC-3’；以及

下游引物P4：5’-GCAGGAACTTGACTATGA-3’。

4)分析PCR扩增产物，结果判定。即对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中能否扩增出各目的条带。如果无目的条带则为鸡新城疫病毒检测阴性；如果扩增出通用目的条带(646bp)和基因II型目的条带(339bp)则为基因II型鸡新城疫病毒检测阳性；如果扩增通用目的条带(646bp)和基因VII型目的条带(452bp)则为基因VII型鸡新城疫病毒检测阳性；如果同时扩增出通用目的条带、基因II型和基因VII型目的条带则为基因II型和基因VII型鸡新城疫病毒检测阳性；如果仅扩增出通用条带则为非基因II型和基因VII型的新城疫病毒检测阳性。

本发明参照GenBank上登录的鸡新城疫病毒基因组的高度保守区段以及基因II型和基因VII型鸡新城疫病毒(GenBank登录号为AF077761、DQ486859、NC_001541及DQ659677)基因组的基因型内高度保守而与其他基因型间均高度差异的区段设计4条检测引物序列：引物P1、引物P2、引物P3和引物P4。引物P1与P4组合可扩增646bp的鸡新城疫病毒通用目的基因片段，引物P1与P3组合可扩增452bp的基因VII型毒株目的基因片段，引物P2与P4组合可扩增339bp的基因II型毒株目的基因片段，适用于对鸡新城疫病毒常用疫苗株(基因II型)和主要流行株(基因VII型)进行快速鉴别检测。

前述检测方法中，步骤2)中反转录生成cDNA的方法为：

在0.2ml离心管内加入下列成分：

RNA溶液                      6μl

500μg/ml随机引物            1μl

轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min；

然后向上述离心管中加入下列成分：

轻轻混匀，将上述反应体系置于37℃1h，95℃5min，得到样本cDNA。

前述检测方法中，步骤3)中PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：95℃5min；94℃45s，53.5℃45s，71℃60s，共30个循环；71℃10min。

进一步优化条件可研制成RT-PCR检测试剂盒，提高检测标准性。具体地，所述试剂盒包括上述鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的引物组合：引物P1、引物P2、引物P3和引物P4。优选地，所述试剂盒还包括随机引物(即人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物)、反应缓冲液、dNTPs、Rnase抑制剂、反转录酶、PCR Taq mix、DEPC处理水中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括阳性标准模板。

由于扩增的目的序列片段位于鸡新城疫病毒基因组的高度保守区段或基因II型和基因VII型鸡新城疫病毒内高度保守而与其他基因型间均高度差异的区段，且最长的核苷酸序列只有646bp，因而该法敏感性好，简便易行，该法对鸡新城疫病毒均有较好检出(通用性)，并且能够区分国内常用疫苗株(基因II型)和主要流行株(基因VII型)。该法对其它常见禽病病原，如禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒以及鸡痘病毒的检测结果皆为阴性，没有交叉反应，表明该法亦具有良好的特异性。另外，本发明的方法还具有高效率、低成本的特点，在实现对NDV与其他病毒的鉴别的同时可鉴别出毒株基因型的归属。该方法的建立对鸡新城疫病毒的分子变异机制以及分子流行病学分析均有十分重要的意义。

附图说明

图1为鸡新城疫病毒常用疫苗株LaSota与主要流行株GM的RT-PCR检测结果；其中，M：DNA Marker；1和2：鸡新城疫流行野毒株(GM，基因VII型)与常用疫苗株(LaSota，基因II型)混合样品；3和4：鸡新城疫病毒常用疫苗株LaSota；5和6：鸡新城疫病毒流行野毒株GM。

图2为采用本发明的方法对NDV基因II型疫苗株和部分基因VII型国内分离株的检测结果；其中，M：DNA Marker；A中1～4：鸡新城疫病毒基因VII型国内分离株；B中5～7：鸡新城疫病毒基因II型疫苗株和国内分离株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1设计用于鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的引物组合

根据GenBank上登录的鸡新城疫病毒基因组的高度保守区段以及基因II型和基因VII型鸡新城疫病毒(GenBank登录号为AF077761、DQ486859、NC_001541及DQ659677)基因组的基因型内高度保守而与其他基因型间均高度差异的区段设计以下4条引物序列：

上游引物P1：5’-GTCGTGCTCAGTGATGTG-3’；

上游引物P2：5’-GCTCCGCCTACTCCGTCAG-3’；

下游引物P3：5’-TTGTTACCTCAATGTGCC-3’；以及

下游引物P4：5’-GCAGGAACTTGACTATGA-3’。

实施例2鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法

1 临床样品的处理

1.1实验试剂和主要仪器

主要试剂：灭菌生理盐水。

主要仪器：4℃台式离心机；涡旋振荡器；研磨器。

1.2实验步骤

(1)组织样品处理：取1mg脏器组织样品加入1ml灭菌生理盐水并用研磨器进行研磨混悬，组织悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测。

(2)棉拭子样品的处理：将气管或泄殖腔拭子样品加入1ml灭菌生理盐水涡旋振荡器混悬后，同上离心取上清用于检测。

2 样本总RNA的提取

2.1实验试剂和主要仪器

主要试剂：Trizol试剂；DEPC处理水；Rnase-free的离心管与Tips；新的氯仿、异丙醇和乙醇，DEPC水配制的75％乙醇。

主要仪器：4℃台式离心机。

2.2实验步骤

(1)取待检样品悬液250μl，加入750μl Trizol，颠倒混匀15s至液体变粘稠，冰浴15min；

(2)加入200μl氯仿，颠倒混匀15s，冰浴15min；

(3)混合液以12000rpm，4℃离心15min分为两相；

(4)取上层水相加入另一离心管内，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后15-30℃静置10min；

(5)13500rpm，4℃离心15min，沉淀RNA；

(6)小心尽弃上清，用DEPC水配制的75％乙醇1ml轻轻漂洗沉淀；

(7)将RNA沉淀置超净台内风干，约10min；

(8)用DEPC水处理的灭菌水9μl溶解沉淀，并加入1μl核酸酶抑制剂(Rnasin50U/μl)；

(9)提取的RNA样品直接用于反转录或分装后-80℃保存备用。

3 逆转录生成cDNA

3.1实验试剂和主要仪器

主要试剂：反转录酶(Reverse Transcriptase)200U/μl；核酸酶抑制剂(Rnase Inhibitor)50U/μl；5倍体积的反应缓冲液(5×ReactionBuffer)；dNTP混合物2.5mM；随机引物(Random Primer，即人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物)500μg/ml；DEPC处理水。

主要仪器：PCR扩增仪；恒温水浴锅。

3.2实验步骤

(1)在0.2ml离心管内加入下列成分：

RNA溶液                  6μl

随机引物                 1μl

轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min。

轻轻混匀，进行如下反应，37℃1h，95℃5min，得到样本cDNA。

4 目的片段的PCR扩增

4.1实验试剂和主要仪器

主要试剂：cDNA溶液；2×Taq mix；实施例1中设计的特异性引物P1、P2、P3和P4。

主要仪器：PCR扩增仪；电泳仪；α凝胶成像仪。

4.2实验步骤

在0.2ml离心管中加入下列成分：

轻轻混匀后，进行如下反应：95℃预变性5min，94℃45s，53.5℃45s，71℃60s，进行30个循环，循环结束71℃延伸10min。

PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备2％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Goldview^TM。按照比例将5μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)，电泳时间为40-60分钟，进行电泳，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照，结果如图1所示。

利用此方法对鸡新城疫病毒各种流行株及疫苗株毒株样品及疫苗株和流行毒株混合样品进行检测，结果均有符合预期的检出，表明本方法具有良好的敏感性和通用性，结果如图2所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的引物组合，其特征在于，其包括：

上游引物P1：5’-GTCGTGCTCAGTGATGTG-3’；

上游引物P2：5’-GCTCCGCCTACTCCGTCAG-3’；

下游引物P3：5’-TTGTTACCTCAATGTGCC-3’；以及

下游引物P4：5’-GCAGGAACTTGACTATGA-3’。

2.含有权利要求1所述引物组合的用于鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括随机引物、反应缓冲液、dNTPs、Rnase抑制剂、反转录酶、PCR Taqmix、DEPC处理水中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准模板。

5.鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法，其特征在于，包括以下步骤：

1)样本总RNA的提取；

2)反转录得到样本cDNA；

3)以样本cDNA为模板，使用权利要求1的引物组合进行PCR扩增；

4)分析PCR扩增产物，结果判定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：95℃5min；94℃45s，53.5℃45s，71℃60s，共30个循环；71℃10min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中反转录生成cDNA的方法为：

在0.2ml离心管内加入下列成分：

RNA溶液                    6μl

500μg/ml随机引物          1μl

轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min；

然后向上述离心管中加入下列成分：

混匀，将上述反应体系置于37℃1h，95℃5min，得到样本cDNA。

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