CN107858455B

CN107858455B - 一种快速鉴别ndv疫苗株与强毒株的pcr-hrm引物及方法

Info

Publication number: CN107858455B
Application number: CN201711302649.9A
Authority: CN
Inventors: 陈梅丽; 饶丹; 朱余军; 丛锋; 黄韧; 郭鹏举
Original assignee: Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Current assignee: Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2037-12-11
Also published as: CN107858455A

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR‑HRM引物及方法，PCR‑HRM引物的核苷酸序列如文中所示；鉴别方法包括:RNA提取、反转录、PCR扩增和HRM分析等过程。本发明设计方法特异性好、重复性强、可以准确、快速、高通量地运用于NDV特定疫苗的筛查。

Description

一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM引物及方法

技术领域

本发明涉及病毒序列检测技术领域，更具体地说是涉及一种快速鉴别新城疫病毒疫苗株与强毒株的PCR-HRM引物及方法。

背景技术

新城疫(Newcastle diseases,ND)又叫“亚洲鸡瘟”，俗称“鸡瘟”，是由副粘病毒科副粘病毒属的新城疫病毒引起鸡的一种高度接触性、急性、热性、败血性传染病，主要特征是呼吸困难、下痢、神经机能紊乱、黏膜和浆膜出血。该病发病急、致死率高，对养禽业的发展构成严重的威胁。根据致病力的不同，通常又分为强毒株、中等毒力株和弱毒株。

现有技术中，对新城疫病毒疫苗株的检测和研究数不胜数。上个世纪30年代，Haddow等通过减弱新城疫病毒毒力的研究，研制了中发型活疫苗，目前在一些地方仍然使用；后来研发的毒力更加温和的HitchnerB1和LaSota毒株目前是使用最为普遍的疫苗类型。由于疫苗株的免疫接种的广泛性，且免疫接种后一段时期仍可以排毒，造成疫苗的使用效果不尽人意，而且，NDV疫苗株和强毒株的核苷酸序列没有明显差异，有效鉴别两种病毒株的方法至今未见报道。

因此，如何提供一种快速鉴别NDV疫苗株和强毒株的引物及方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种快速鉴别NDV疫苗株和强毒株的PCR-HRM引物及方法，有利于快速区分NDV疫苗株和强毒株。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM引物，所述PCR-HRM引物的核苷酸序列如下所示：

P1：GGGAAATATGTAATATACAAGCG；或其核苷酸互补序列；

P2：GGTACAAGAAGTGAGATGTCCCTA；或其核苷酸互补序列。

发明人通过反复筛选，设计成以上引物对，以P1为上游引物，同时为限制性引物，P2为下游引物，引物P1和P2包含NDV疫苗株和强毒株的特异基因位点，对其他病原菌无扩增性，进行不对称扩增。有利于临床上对疫苗株的特异性筛查。

一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM探针，其特征在于，所述PCR-HRM探针的核苷酸序列如下所示：

Probe1：ACATGCCCAGATGAGCAAGACTACCAGAT。

探针Probe1与目的基因的一段碱基区间序列一样，这样PCR扩增出的序列就可以与探针杂交。

可选的，所述PCR-HRM探针3’端以修饰物进行修饰和封闭。修饰物包括氨基修饰的C6、反向dT或C3spacer，优选C3spacer，其可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用。C3spacer主要用于模仿核糖的和羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。-Spacer C3用于引进一个间臂从而阻止外切酶和聚合酶发挥作用。

一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM试剂盒，所述试剂盒包含上述所述的PCR-HRM引物和PCR-HRM探针。

以试剂盒将引物对和探针按照2：1的体积封装，在扩增之前有利于试剂的集体加入，避免了多次操作造成的误差。

一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的方法，包括以下步骤：

1)从待测样品中提取病毒的RNA，得到RNA样品；

2)向提取出的RNA样品中加入反转录酶，将RNA反转录成cDNA；

3)向步骤2)所得cDNA中加入上述引物对P1/P2、探针Probe1和饱和荧光染料，在特定条件下进行PCR扩增反应，得到扩增产物；

4)对步骤3)所得扩增产物进行HRM分析，确定待测样品。分析过程为：以疫苗株不同拷贝为模板的PCR产物熔解曲线探针Tm值为对照，若扩增产物的Tm值在70.00±0.72℃，主峰Tm值在86.62±3.18℃，则判定待测样品为类似疫苗株；若探针峰Tm值在59.60±0.39℃，主峰Tm值在87.50±0.80℃，则判定待测样品为类似F48E9强毒株。

可选的，所述步骤3)中PCR扩增反应体系如下：

可选的，所述步骤3)中PCR扩增反应程序如下：

98℃ 变性10s

55℃ 退火30s

72℃ 延伸20s

50个循环

本发明的有益效果是：本发明结合PCR与高分辨率熔解技术，筛选疫苗株和强毒株的特异碱基位点，通过加入3’端封闭的寡核苷酸链，依据靶位点的序列匹配度的差异使得熔解曲线探针峰出现熔解温度的差异来达到区分的目的。发明人通过反复筛选，最后找到一个疫苗株与强毒株有差异的特异基因位点，通过不对称PCR扩增来获得与探针结合的过剩链，通过HRM分析仪获得熔解曲线，荧光值的导数值来分析熔解曲线的探针峰。

其次，PCR结合HRM操作简单，全程只需3h，极大地缩短了分析时间，所需探针为寡核苷酸3’端C3封闭，其合成价格低廉，荧光饱和染料廉价易得，试验方法特异性好、重复性好、可以准确、快速、高通量地运用于NDV特定疫苗株的筛查，为快速临床诊断提供依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为NDV疫苗株与其它临床样品HRM峰型化熔解曲线；

图2附图为NDV疫苗株与其它株的PCR-HRM引物特异性凝胶电泳图；

图3附图为NDV疫苗株与其它株的PCR-HRM引物灵敏度试验HRM峰型化熔解曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1PCR-HRM以引物设计

发明人通过反复筛选，选出特异性强的引物及探针，其核苷酸序列如下所示：

P1:GGGAAATATGTAATATACAAGCG，或其核苷酸互补序列；

P2:GGTACAAGAAGTGAGATGTCCCTA，或其核苷酸互补序列；

Probe 1:ACATGCCCAGATGAGCAAGACTACCAGAT

探针Probe 1的一端利用修饰物进行修饰和封闭，修饰物包括氨基修饰的C6、反向dT、C3间臂(C3spacer)。本发明中所用的修饰物为C3spacer，C3封闭的探针廉价且合成技术成熟，荧光饱和染料种类选择多且用量少，有利于本发明技术的推广。

其中，P1/P2引物扩增片段的长度为250bp，可以高效扩增NDV毒株，这一段序列包含了NDV疫苗株与强毒株有差异的特异基因位点；Probe 1是P1/P2扩增区域的一段靶序列，通过不对称PCR扩增来获得与探针结合的链，然后进一步通过HRM分析仪获得熔解曲线，荧光值的导数值来分析熔解曲线的探针峰。

实施例2PCR-HRM分析

1)从样品中提取病毒RNA：

LaSota株为广东省实验动物监测所保藏菌株；Mukteswar和F48E9为广东省农科院馈赠毒株。

将以上三种样品分别在组织匀浆器中冰上充分匀浆化处理，反复冻融3次，10000rpm/min离心5min，取上清，过滤除菌备用。组织上清或血清采用天根Trizol试剂(天根生化)说明书进行RNA抽提。

2)以提取的RNA为模板，进行反转录成cDNA

3)以P1和P2为上下游引物，Probe1为封闭探针，在加有饱和荧光染料下的进行PCR扩增，其预扩增反应体系为：

扩增反应程序为：

98℃ 变性10s

55℃ 退火30s

72℃ 延伸20s

50个循环。

Lasota株的扩增产物序列为SEQ ID No.4：

GGGAAATATGTAATATACAAGCGATACAATGACACATGCCCAGATGAGCAAGACTACCAGATTCGAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGACGGTTTGGTGGGAAACGCATACAGCAGGCTATCTTATCTATCAAGGTGTCAACATCCTTAGGCGAAGACCCGGTACTGACTGTACCGCCCAACACAGTCACACTCATGGGGGCCGAAGGCAGAATTCTCACAGTAGGGACATCTCACTTCTTGTACC

Mukteswar株的扩增产物序列为SEQ ID No.5:

GGGAAATATGTAATATACAAGCGGTACAATGACACATGCCCAGATGAGCAAGACTACCAGATTCGGATGGCTAAGTCTTCATATAAGCCTGGGCGGTTTGGTGGGAAACGCGTACAGCAGGCCATCCTATCCATCAAGGTATCAACATCCTTGGGTGAGGACCCGGTGCTGACTGTACCGCCCAACACAATCACACTTATGGGGGCCGAAGGCAGAGTTCTCACAGTAGGGACATCTCACTTCTTGTACC

F48E9株的扩增产物序列为SEQ ID No.6：

GGGAAATATGTAATATACAAGCGATACAATGACACATGCCCGGATGAGCAAGATTACCAGATTCGGATGGCTAAGTCATCGTATAAGCCTGGGCGGTTTGGTGGAAAACGCGTACAGCAGGCCATCCTATCCATCAAGGTGTCAACATCCTTGGGTGAGGACCCGGTGTTGACTGTACCGCCTAATACGGTCGCACTCATGGGGGCCGAAGGCAGAGTTCTCACAGTAGGGACATCTCACTTCTTGTACC

HRM升温步骤为92℃1min，40℃2min；50℃-90℃，升温速率为0.5℃/步。HRM实验结果用Rotor-Gene QTM软件进行分析。

结果见附图1，3个标准品的不对称PCR扩增产物均有清晰的熔解曲线，其中疫苗株LaSota的熔解曲线探针峰Tm值为70.53±0.24℃，主熔解峰(PCR产物熔解峰)Tm值为86.25±0℃；疫苗株Mukteswar的PCR产物探针峰Tm值为70.41±0.12℃，主熔解峰Tm值为86.62±0.52℃；NDV的经典强毒株F48E9的探针峰Tm值为59.56±0.09℃，主熔解峰Tm值为87.5±0.05℃。在99％置信区间内，LaSota和Mukteswar株的熔解曲线探针峰Tm值为在70.53±0.72℃，主峰Tm值在86.62±3.18℃，F48E9株探针峰Tm值在59.60±0.39℃，主峰Tm值在87.50±0.80℃。

由于饱和荧光染料能结合到双链DNA上，荧光信号被放大，当熔解温度升高时，染料分子逐渐从双链DNA上脱落下来，仪器收集荧光信号减弱的全过程，从而汇集成熔解曲线，而由于探针序列与疫苗株的碱基序列匹配、与强毒株若干碱基不匹配，所以当探针与强毒株结合时，探针的解链温度会下降，因而强毒株探针峰Tm值比疫苗株低。因此，疫苗株(Lasota和Mukteswar)与强毒株(F48E9)PCR产物的熔解曲线通过探针峰Tm的差别来进行区分。

实施例3PCR-HRM方法特异性试验

选择本实验室保藏的毒株：禽源性病毒禽流感病毒(AIV)、鸡传染性支气管病毒(IBV)、鸡传染性喉气管病毒(ILTV)、鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)核酸进行PCR-HRM实验，选用P1/P2引物，结果见附图2。

附图2中，泳道1-5为AIV、IBV、ILTV、MG和MS，凝胶电泳显示未扩出目的条带，6为阴性空白对照，泳道7-8分别为NDV阳性参照疫苗株Lasota株和强毒株F48E9，有清晰目的片段与DL2000DNA Marker对应的250bp左右的条带，说明本发明的引物只能特异性扩增NDV疫苗株和强毒株，对其它病毒基因无法进行扩增。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例4敏感性试验

为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准阳性样品，为之后的临床样品检测提供HRM阳性对照，本发明需优先制备NDV LaSota株，强毒株F48E9质粒标准品。

取Lasota株和F48E9强毒株扩增片段构建的质粒标准品用Easy dilution(Takara公司)做10倍系列稀释，其中Lasota株为广东省实验动物监测所实验室保藏，F48E9强毒株为广东省农科院馈赠。得到1×10¹～1×10⁸copies/μL系列标准模板。以P1和P2为上下游引物，Probe1为封闭探针，在加有饱和荧光染料下的进行PCR扩增，其预扩增反应体系为：

扩增程序为：

98℃ 变性10s，

55℃ 退火30s，

72℃ 延伸20s

50个循环。

结果见附图3，附图3中，灵敏度均能达到10个拷贝，说明本方法的检测灵敏度高，可做为分子检测同时鉴别的方法。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 广东省实验动物检测所

<120> 一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM引物及方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

gggaaatatg taatatacaa gcg 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

ggtacaagaa gtgagatgtc ccta 24

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

acatgcccag atgagcaaga ctaccagat 29

<210> 4

<211> 250

<212> DNA

<213> Arificial

<400> 4

gggaaatatg taatatacaa gcgatacaat gacacatgcc cagatgagca agactaccag 60

attcgaatgg ccaagtcttc gtataagcct ggacggtttg gtgggaaacg catacagcag 120

gctatcttat ctatcaaggt gtcaacatcc ttaggcgaag acccggtact gactgtaccg 180

cccaacacag tcacactcat gggggccgaa ggcagaattc tcacagtagg gacatctcac 240

ttcttgtacc 250

<210> 5

<211> 250

<212> DNA

<213> Arificial

<400> 5

gggaaatatg taatatacaa gcggtacaat gacacatgcc cagatgagca agactaccag 60

attcggatgg ctaagtcttc atataagcct gggcggtttg gtgggaaacg cgtacagcag 120

gccatcctat ccatcaaggt atcaacatcc ttgggtgagg acccggtgct gactgtaccg 180

cccaacacaa tcacacttat gggggccgaa ggcagagttc tcacagtagg gacatctcac 240

ttcttgtacc 250

<210> 6

<211> 250

<212> DNA

<213> Arificial

<400> 6

gggaaatatg taatatacaa gcgatacaat gacacatgcc cggatgagca agattaccag 60

attcggatgg ctaagtcatc gtataagcct gggcggtttg gtggaaaacg cgtacagcag 120

gccatcctat ccatcaaggt gtcaacatcc ttgggtgagg acccggtgtt gactgtaccg 180

cctaatacgg tcgcactcat gggggccgaa ggcagagttc tcacagtagg gacatctcac 240

ttcttgtacc 250

Claims

1.一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM引物，其特征在于，所述PCR-HRM上游引物P1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述PCR-HRM下游引物P2的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

2.一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM探针，其特征在于，所述PCR-HRM探针Probe1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求2所述的一种快速鉴别NDV疫苗株和强毒株的PCR-HRM探针，其特征在于，所述PCR-HRM探针3’端以修饰物进行修饰和封闭。

4.一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含上述权利要求1的引物及权利要求2或3中的探针。