CN111187861B - 一种对海产品诺如病毒gii.4的检测方法 - Google Patents

一种对海产品诺如病毒gii.4的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对海产品诺如病毒GII.4的检测方法，涉及生物检测技术领域，其技术方案要点是：将RT‑LAMP反应产物加入到经Fe3+淬灭后的氧化钒量子点溶液中，第一次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化；然后加入硫酸镁溶液，观察混合液中的是否有白色沉淀产生以及第二次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化；若观察结果满足以下标准条件中的任意两种及以上，则判断待检测样品含有诺如病毒，标准条件如下：第一次观察荧光强度变大；混合液中的有白色沉淀产生；第二次观察荧光强度相对于第一次观察荧光强度变小。本发明能有效提高对海产品中诺如病毒检测的准确性和可靠性，并使得诺如病毒检测过程操作更为简单、成本降低。

Description

一种对海产品诺如病毒GII.4的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体地说，它涉及一种对海产品诺如病毒GII.4的检测方法。
背景技术
诺如病毒(Norovirus,NV)是一种线性单链的正链RNA杯状病毒，病毒粒子在27-35nm之间，基因组大小为7400-7700nt左右。诺如病毒含有3个开放阅读框(open readingframe,ORF)，ORF1编码一个大的多聚蛋白，随后被病毒NS6蛋白切割成6种非结构蛋白；而ORF2和ORF3分别编码病毒结构蛋白，与病毒核衣壳相关。诺如病毒可分6个基因组(GI-GVI)，引起人类病毒性急性胃肠炎的主要为GI、GII和GIV，其中GII.4与病毒爆发联系最为紧密。
诺如病毒可以在室温下长时间存活，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，因此全年均有流行。诺如病毒可以通过人与人传播、食物传播和饮水传播等。诺如病毒感染后发病快，通常在24-48h感染者就出现腹泻、呕吐、恶心等症状。因此，诺如病毒对人类的生活和健康危害性极大，为此开展食品中诺如病毒的检测具有十分重要的现实意义。
环介导等温扩增法(LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。
然而，环介导等温扩增法的灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，假阳性问题比较严重，常需要结合实时浊度仪进行实时检测才能保证环介导等温扩增法检测的准确性，其使用限制较大。因此，研究设计一种简单的、准确的检测海产品中诺如病毒技术是我们目前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种对海产品诺如病毒GII.4的检测方法，有效避免光背景以及气溶胶污染对检测结果的影响，提高了对海产品中诺如病毒检测的准确性和可靠性；同时，此方法即不需要实时荧光检测(RT-PCR)所需的昂贵仪器，也不需要LAMP中的实时浊度仪，使得诺如病毒检测过程操作更为简单、成本降低。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种对海产品诺如病毒GII.4的检测方法，包括以下步骤：
S1：选取海产品作为待检测样品，并进行RNA提取；
S2：采用RT-LAMP技术对RNA提取物进行恒温扩增，得到RT-LAMP反应产物；
S3：将RT-LAMP反应产物加入到经Fe3+淬灭后的氧化钒量子点溶液中，第一次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化；
S4：将硫酸镁溶液加入到RT-LAMP反应产物与氧化钒量子点溶液的混合液中，观察混合液中的是否有白色沉淀产生以及第二次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化；
S5：若观察结果满足以下标准条件中的任意两种及以上，则判断RT-LAMP反应产物含有焦磷酸根离子，RNA提取物在S2中完成特异性扩增，待检测样品含有诺如病毒，标准条件如下：
a.第一次观察荧光强度变大；
b.混合液中的有白色沉淀产生；
c.第二次观察荧光强度相对于第一次观察荧光强度变小。
优选的，在步骤S1中，所述待检测样品的RNA提取具体方法为：
选取海产品样品，洗净外表污物；将海产品样品置于0.1-0.2mol/L的生理盐水中排污20-30min后取出，余下液体为待处理液；对待处理液离心处理，并取上清液进行RNA提取。
优选的，在步骤S2中，所述RNA提取物进行恒温扩增的具体方法为：
将10-20μL的RNA提取物加入到100μL的RT-LAMP扩增反应液中，加入40-50U/uL的AMV反转录酶以及5-8μL的链置换DNA聚合酶，在63-65℃范围内的等温条件下恒温扩增30-60min，得到RT-LAMP反应产物；
所述RT-LAMP扩增反应液包括：反应缓冲液、1.0-1.6mmol/L的dNTP、0.8-1.6μmol/L正向内引物、0.8-1.6μmol/L反向内引物、0.2-0.4μmol/L正向外引物、0.2-0.4μmol/L反向外引物、1.0-1.5mol/L的甜菜碱；
其中，所述反应缓冲液含有200mM的pH为8.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、80mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸钾和1％曲拉通X-100。
优选的，所述引物组具体为：
正向内引物：ACGACCCTCTCCCCCTTGTACCCTTACAGGAGACCAGCGT；
反向内引物：TCCAAGATGCCCTCAGATTGCACTGTCACAGTTCAGGGTGAG；
正向外引物：GCTAAGAGAATCGCAGCCTC；
反向外引物：CGCTGTCAAAGACCTTTCCT。
优选的，在步骤S3中，所述氧化钒量子点溶液具体为：氧化钒量子点含量为15-25mM、体积为10-20μL的溶液。
优选的，在步骤S4中，所述硫酸镁溶液具体为：硫酸镁含量为25-30mM、体积为10-20μL的溶液。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：采用RT-LAMP方法对RNA提取物进行扩增后得到RT-LAMP反应产物，先后加入氧化钒量子点溶液和硫酸镁溶液，然后观察荧光强度变化以及溶液浑浊度变化，能有效避免受光背景影响以及气溶胶污染影响而导致检测结果不准确的情况发生，提高了对海产品中诺如病毒检测的准确性；同时，此方法即不需要实时荧光检测(RT-PCR)所需的昂贵仪器，也不需要RT-LAMP中的实时浊度仪，使得检测过程操作简单、成本低，利于室外现场检测，为食源性疾病的快速诊断提供了基础条件。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
选取海洋中贝类作为海产品样品，分为A、B、C、D四组，每一组中均包括四份样品。其中A、B、C组中均为经过RT-PCR检测确认的携带诺如病毒的样品，D组中为经过RT-PCR检测确认的未携带诺如病毒的样品。
实施例1
一种对海产品诺如病毒GII.4的检测方法，包括以下步骤：
S1：选取A组作为待检测样品，并进行RNA提取。
选取海产品样品，洗净外表污物。将海产品样品置于0.1mol/L的生理盐水中排污30min后取出，余下液体为待处理液。对待处理液离心处理，并取上清液进行RNA提取。
S2：采用RT-LAMP技术对RNA提取物进行恒温扩增，得到RT-LAMP反应产物。
将10μL的RNA提取物加入到100μL的RT-LAMP扩增反应液中，加入50U/uL的AMV反转录酶以及8μL的链置换DNA聚合酶，在63℃范围内的等温条件下恒温扩增60min，得到RT-LAMP反应产物。
RT-LAMP扩增反应液包括：反应缓冲液、1.0mmol/L的dNTP、1.6μmol/L正向内引物、0.8μmol/L反向内引物、0.4μmol/L正向外引物、0.2μmol/L反向外引物、1.5mol/L的甜菜碱。
其中，反应缓冲液含有200mM的pH为8.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、80mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸钾和1％曲拉通X-100。
引物组具体为：
正向内引物：ACGACCCTCTCCCCCTTGTACCCTTACAGGAGACCAGCGT；
反向内引物：TCCAAGATGCCCTCAGATTGCACTGTCACAGTTCAGGGTGAG；
正向外引物：GCTAAGAGAATCGCAGCCTC；
反向外引物：CGCTGTCAAAGACCTTTCCT。
S3：将RT-LAMP反应产物加入到经Fe3+淬灭后的氧化钒量子点溶液中，第一次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化。氧化钒量子点溶液具体为：氧化钒量子点含量为15mM、体积为20μL的溶液。
S4：将硫酸镁溶液加入到RT-LAMP反应产物与氧化钒量子点溶液的混合液中，观察混合液中的是否有白色沉淀产生以及第二次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化。硫酸镁溶液具体为：硫酸镁含量为25mM、体积为20μL的溶液。
S5：若观察结果满足以下标准条件中的任意两种及以上，则判断RT-LAMP反应产物含有焦磷酸根离子，RNA提取物在S2中完成特异性扩增，待检测样品含有诺如病毒，标准条件如下：
a.第一次观察荧光强度变大；
b.混合液中的有白色沉淀产生；
c.第二次观察荧光强度相对于第一次观察荧光强度变小。
通过实施例1提供的检测方法分别对A组中的四份样品进行检测，其检测结果如表1所示：
表1 A组检测结果
Figure BDA0002393086060000061
Figure BDA0002393086060000071
检测结果分析：通过实施例1提供的检测方法，对A组中四份待检测样本检测的准确度为100％。
实施例2
一种对海产品诺如病毒GII.4的检测方法，包括以下步骤：
S1：选取B组作为待检测样品，并进行RNA提取。
选取海产品样品，洗净外表污物。将海产品样品置于0.2mol/L的生理盐水中排污20min后取出，余下液体为待处理液。对待处理液离心处理，并取上清液进行RNA提取。
S2：采用RT-LAMP技术对RNA提取物进行恒温扩增，得到RT-LAMP反应产物。
将20μL的RNA提取物加入到100μL的RT-LAMP扩增反应液中，加入40U/uL的AMV反转录酶以及5μL的链置换DNA聚合酶，在65℃范围内的等温条件下恒温扩增30min，得到RT-LAMP反应产物。
RT-LAMP扩增反应液包括：反应缓冲液、1.6mmol/L的dNTP、0.8μmol/L正向内引物、1.6μmol/L反向内引物、0.2μmol/L正向外引物、0.4μmol/L反向外引物、1.0mol/L的甜菜碱。
其中，反应缓冲液含有200mM的pH为8.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、80mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸钾和1％曲拉通X-100。
引物组具体为：
正向内引物：ACGACCCTCTCCCCCTTGTACCCTTACAGGAGACCAGCGT；
反向内引物：TCCAAGATGCCCTCAGATTGCACTGTCACAGTTCAGGGTGAG；
正向外引物：GCTAAGAGAATCGCAGCCTC；
反向外引物：CGCTGTCAAAGACCTTTCCT。
S3：将RT-LAMP反应产物加入到经Fe3+淬灭后的氧化钒量子点溶液中，第一次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化。氧化钒量子点溶液具体为：氧化钒量子点含量为25mM、体积为10μL的溶液。
S4：将硫酸镁溶液加入到RT-LAMP反应产物与氧化钒量子点溶液的混合液中，观察混合液中的是否有白色沉淀产生以及第二次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化。硫酸镁溶液具体为：硫酸镁含量为30mM、体积为10μL的溶液。
S5：若观察结果满足以下标准条件中的任意两种及以上，则判断RT-LAMP反应产物含有焦磷酸根离子，RNA提取物在S2中完成特异性扩增，待检测样品含有诺如病毒，标准条件如下：
a.第一次观察荧光强度变大；
b.混合液中的有白色沉淀产生；
c.第二次观察荧光强度相对于第一次观察荧光强度变小。
通过实施例2提供的检测方法分别对B组中的四份样品进行检测，其检测结果如表2所示：
表2 B组检测结果
Figure BDA0002393086060000091
检测结果分析：通过实施例2提供的检测方法，对B组中四份待检测样本检测的准确度为100％。
实施例3
一种对海产品诺如病毒GII.4的检测方法，包括以下步骤：
S1：选取C组作为待检测样品，并进行RNA提取。
选取海产品样品，洗净外表污物。将海产品样品置于0.2mol/L的生理盐水中排污30min后取出，余下液体为待处理液。对待处理液离心处理，并取上清液进行RNA提取。
S2：采用RT-LAMP技术对RNA提取物进行恒温扩增，得到RT-LAMP反应产物。
将20μL的RNA提取物加入到100μL的RT-LAMP扩增反应液中，加入50U/uL的AMV反转录酶以及8μL的链置换DNA聚合酶，在65℃范围内的等温条件下恒温扩增60min，得到RT-LAMP反应产物。
RT-LAMP扩增反应液包括：反应缓冲液、1.6mmol/L的dNTP、1.6μmol/L正向内引物、1.6μmol/L反向内引物、0.4μmol/L正向外引物、0.4μmol/L反向外引物、1.5mol/L的甜菜碱。
其中，反应缓冲液含有200mM的pH为8.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、80mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸钾和1％曲拉通X-100。
引物组具体为：
正向内引物：ACGACCCTCTCCCCCTTGTACCCTTACAGGAGACCAGCGT；
反向内引物：TCCAAGATGCCCTCAGATTGCACTGTCACAGTTCAGGGTGAG；
正向外引物：GCTAAGAGAATCGCAGCCTC；
反向外引物：CGCTGTCAAAGACCTTTCCT。
S3：将RT-LAMP反应产物加入到经Fe3+淬灭后的氧化钒量子点溶液中，第一次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化。氧化钒量子点溶液具体为：氧化钒量子点含量为25mM、体积为20μL的溶液。
S4：将硫酸镁溶液加入到RT-LAMP反应产物与氧化钒量子点溶液的混合液中，观察混合液中的是否有白色沉淀产生以及第二次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化。硫酸镁溶液具体为：硫酸镁含量为30mM、体积为20μL的溶液。
S5：若观察结果满足以下标准条件中的任意两种及以上，则判断RT-LAMP反应产物含有焦磷酸根离子，RNA提取物在S2中完成特异性扩增，待检测样品含有诺如病毒，标准条件如下：
a.第一次观察荧光强度变大；
b.混合液中的有白色沉淀产生；
c.第二次观察荧光强度相对于第一次观察荧光强度变小。
通过实施例3提供的检测方法分别对C组中的四份样品进行检测，其检测结果如表3所示：
表3 C组检测结果
Figure BDA0002393086060000111
检测结果分析：通过实施例3提供的检测方法，对C组中四份待检测样本检测的准确度为100％。
实施例4
一种对海产品诺如病毒GII.4的检测方法，包括以下步骤：
S1：选取D组作为待检测样品，并进行RNA提取。
选取海产品样品，洗净外表污物。将海产品样品置于0.2mol/L的生理盐水中排污30min后取出，余下液体为待处理液。对待处理液离心处理，并取上清液进行RNA提取。
S2：采用RT-LAMP技术对RNA提取物进行恒温扩增，得到RT-LAMP反应产物。
将20μL的RNA提取物加入到100μL的RT-LAMP扩增反应液中，加入40U/uL的AMV反转录酶以及8μL的链置换DNA聚合酶，在65℃范围内的等温条件下恒温扩增60min，得到RT-LAMP反应产物。
RT-LAMP扩增反应液包括：反应缓冲液、1.6mmol/L的dNTP、1.6μmol/L正向内引物、1.6μmol/L反向内引物、0.4μmol/L正向外引物、0.4μmol/L反向外引物、1.5mol/L的甜菜碱。
其中，反应缓冲液含有200mM的pH为8.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、80mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸钾和1％曲拉通X-100。
引物组具体为：
正向内引物：ACGACCCTCTCCCCCTTGTACCCTTACAGGAGACCAGCGT；
反向内引物：TCCAAGATGCCCTCAGATTGCACTGTCACAGTTCAGGGTGAG；
正向外引物：GCTAAGAGAATCGCAGCCTC；
反向外引物：CGCTGTCAAAGACCTTTCCT。
S3：将RT-LAMP反应产物加入到经Fe3+淬灭后的氧化钒量子点溶液中，第一次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化。氧化钒量子点溶液具体为：氧化钒量子点含量为25mM、体积为20μL的溶液。
S4：将硫酸镁溶液加入到RT-LAMP反应产物与氧化钒量子点溶液的混合液中，观察混合液中的是否有白色沉淀产生以及第二次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化。硫酸镁溶液具体为：硫酸镁含量为30mM、体积为20μL的溶液。
S5：若观察结果满足以下标准条件中的任意两种及以上，则判断RT-LAMP反应产物含有焦磷酸根离子，RNA提取物在S2中完成特异性扩增，待检测样品含有诺如病毒，标准条件如下：
a.第一次观察荧光强度变大；
b.混合液中的有白色沉淀产生；
c.第二次观察荧光强度相对于第一次观察荧光强度变小。
通过实施例4提供的检测方法分别对D组中的四份样品进行检测，其检测结果如表4所示：
表4 D组检测结果
Figure BDA0002393086060000131
检测结果分析：通过实施例4提供的检测方法，对D组中四份待检测样本检测的准确度为100％。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (4)

1.一种海产品诺如病毒GII.4的检测方法，其特征是，包括以下步骤：
S1：选取海产品作为待检测样品，并进行RNA提取；
S2：采用RT-LAMP技术对RNA提取物进行恒温扩增，得到RT-LAMP反应产物；
S3：将RT-LAMP反应产物加入到经Fe3+淬灭后的氧化钒量子点溶液中，第一次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化；
S4：将硫酸镁溶液加入到RT-LAMP反应产物与氧化钒量子点溶液的混合液中，观察混合液中是否有白色沉淀产生以及第二次观察氧化钒量子点溶液的荧光强度变化；
S5：若观察结果满足以下标准条件中的任意两种及以上，则判断RT-LAMP反应产物含有焦磷酸根离子，RNA提取物在S2中完成特异性扩增，待检测样品含有诺如病毒，标准条件如下：
a.第一次观察荧光强度变大；
b.混合液中有白色沉淀产生；
c.第二次观察荧光强度相对于第一次观察荧光强度变小；
其中，RNA提取物进行恒温扩增中的RT-LAMP扩增反应液包括：
正向内引物：ACGACCCTCTCCCCCTTGTACCCTTACAGGAGACCAGCGT；
反向内引物：TCCAAGATGCCCTCAGATTGCACTGTCACAGTTCAGGGTGAG；
正向外引物：GCTAAGAGAATCGCAGCCTC；
反向外引物：CGCTGTCAAAGACCTTTCCT。
2.根据权利要求1所述的一种海产品诺如病毒GII.4的检测方法，其特征是，在步骤S1中，所述待检测样品的RNA提取具体方法为：
选取海产品样品，洗净外表污物；将海产品样品置于0.1-0.2mol/L的生理盐水中排污20-30min后取出，余下液体为待处理液；对待处理液离心处理，并取上清液进行RNA提取。
3.根据权利要求1所述的一种海产品诺如病毒GII.4的检测方法，其特征是，在步骤S2中，所述RNA提取物进行恒温扩增的具体方法为：
将10-20μL的RNA提取物加入到100μL的RT-LAMP扩增反应液中，加入40-50U/μL的AMV反转录酶以及5-8μL的链置换DNA聚合酶，在63-65℃范围内的等温条件下恒温扩增30-60min，得到RT-LAMP反应产物；
所述RT-LAMP扩增反应液包括：反应缓冲液、1.0-1.6mmol/L的dNTP、0.8-1.6μmol/L正向内引物、0.8-1.6μmol/L反向内引物、0.2-0.4μmol/L正向外引物、0.2-0.4μmol/L反向外引物、1.0-1.5mol/L的甜菜碱；
其中，所述反应缓冲液含有200mM的pH为8.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、80mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸钾和1％曲拉通X-100。
4.根据权利要求1所述的一种海产品诺如病毒GII.4的检测方法，其特征是，在步骤S3中，所述氧化钒量子点溶液具体为：氧化钒量子点含量为15-25mM、体积为10-20μL的溶液。
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