WO2024162323A1 - 血液由来試料の処理方法 - Google Patents

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WO2024162323A1
WO2024162323A1 PCT/JP2024/002802 JP2024002802W WO2024162323A1 WO 2024162323 A1 WO2024162323 A1 WO 2024162323A1 JP 2024002802 W JP2024002802 W JP 2024002802W WO 2024162323 A1 WO2024162323 A1 WO 2024162323A1
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nucleic acid
blood
target nucleic
sample
protease
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PCT/JP2024/002802
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健浩 國保
達也 西
有一 名倉
美和 秋友
潤 田上
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国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
タカラバイオ株式会社
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    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for processing a blood-derived sample, a method for detecting nucleic acid in a blood sample, and a kit.
  • Detecting nucleic acids contained in biological samples is important in fields such as clinical diagnostic medicine, biology, agriculture, and livestock farming.
  • target nucleic acids in human samples are amplified and detected using PCR or other methods to check for the presence of viruses (DNA viruses, RNA viruses) and/or identify the type of virus.
  • viruses DNA viruses, RNA viruses
  • amplification and detection inhibition may occur if nucleic acid amplification is performed without purifying the nucleic acid from the biological sample. Therefore, when detecting a target virus in a biological sample, a method is adopted in which the nucleic acid is first purified from the sample using a column or the like, and then the sample is subjected to a nucleic acid amplification reaction.
  • a real-time PCR method capable of measuring the amount of amplified nucleic acid in the reaction solution over time has been developed and is already in widespread use.
  • This method uses an intercalator dye or a fluorescently labeled probe to spectrophotometrically measure fluorescence, which is an indicator of the amount of amplified product.
  • blood contains components that interfere with the measurement of fluorescence (Non-Patent Document 1). Therefore, in order to carry out real-time PCR using blood-derived samples, it is generally necessary to go through a process such as nucleic acid purification, and although kits for purifying nucleic acid from blood are commercially available, the operation is complicated.
  • the method of purifying nucleic acid from a biological sample using a nucleic acid-binding carrier or the like and then subjecting it to a nucleic acid amplification reaction is cumbersome and unsuitable for processing multiple samples, and there is a risk that operators may become infected with the virus until the virus is inactivated, so the sample must be handled at a containment level appropriate for the virus. In other words, there are problems with high costs and risks.
  • the object of the present invention is to provide a method for detecting nucleic acid in a biological sample that is inexpensive, simple, and highly sensitive, while reducing the risk of infection for operators.
  • the inventors have surprisingly found that by preparing a mixture containing a blood-derived sample and a protein-degrading enzyme (protease), and then undergoing the steps of heating and solid-liquid separation, it is possible to obtain a highly transparent liquid phase from which most of the pigments present in the sample have been removed. Furthermore, they have found that efficient amplification and highly sensitive optical detection of target nucleic acids are possible from this liquid phase, and have thus completed the present invention.
  • a protein-degrading enzyme protea protein-degrading enzyme
  • the present invention relates to [1] (1) mixing a blood-derived sample with a protease; (2) heat-treating the mixture of step (1); and (3) recovering a liquid phase from the heat-treated product of step (2) by solid-liquid separation.
  • a method for reducing pigment components in a blood-derived sample comprising: [2] The method according to [1], wherein the blood-derived sample is whole blood, serum or plasma. [3] The method according to [1] or [2], wherein the protease is proteinase K. [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the heat treatment is carried out at a temperature of 89° C. or higher.
  • [5] (1) mixing a blood-derived sample with a protease; (2) heat treating the mixture of step (1); (3) collecting a liquid phase from the heat-treated product of step (2) by solid-liquid separation; and (4) detecting the target nucleic acid in the liquid phase obtained in step (3).
  • a method for detecting a target nucleic acid in a blood-derived sample comprising: [6] The method according to [5], wherein the blood-derived sample is whole blood, serum or plasma. [7] The method according to [5] or [6], wherein the protease is proteinase K. [8] The method according to any one of [5] to [7], wherein the heat treatment is carried out at a temperature of 89° C. or higher.
  • the step of detecting the target nucleic acid comprises optically detecting an amplified product obtained by amplifying the target nucleic acid by a nucleic acid amplification method.
  • the nucleic acid amplification method is a PCR method.
  • the target nucleic acid is a nucleic acid derived from a virus or a microorganism.
  • the target nucleic acid detection reagent is a reagent for optically detecting an amplified product obtained by a nucleic acid amplification method.
  • the target nucleic acid detection reagent is a reagent for a PCR method.
  • the protease is proteinase K.
  • the present invention provides a method for detecting nucleic acid in a blood-derived sample that allows for highly sensitive detection with safe and simple operations.
  • 1 shows the relationship between the heat treatment temperature of a mixture of a blood-derived sample and protease and the absorbance (415 nm) of the mixture supernatant after heat treatment. 1 shows the relationship between the rate of temperature rise during heat treatment of a mixture of a blood-derived sample and protease and the absorbance (415 nm) of the mixture supernatant after heat treatment.
  • the method of the present invention for reducing pigment components in a blood-derived sample comprises the steps of treating the sample, including mixing a blood-derived sample with a protease, heating the resulting mixture, and subjecting the heated mixture to solid-liquid separation to collect a liquid phase.
  • the blood-derived sample includes various samples derived from the blood of an organism.
  • the sample may be a sample itself taken from a living organism, such as whole blood, serum, plasma, blood cells, etc., or a derivative thereof, such as a dilution, suspension, or dissolution solution of the sample.
  • whole blood, serum, or plasma is used as the sample, the method of the present invention is particularly suitable for processing hemolyzed blood (whole blood), as well as serum and plasma prepared therefrom.
  • the source of the sample may be mammals (humans, livestock, wild animals, pets, laboratory animals, etc.), birds (poultry, wild birds, etc.), and other vertebrates.
  • the blood-derived sample may be treated with an anticoagulant.
  • the anticoagulant may be, but is not limited to, a known anticoagulant such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or heparin.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • processing steps of the present invention can also be applied to samples derived from sources other than blood, such as bodily fluids other than blood (urine, feces, saliva, nasal mucus), tissues, tissue treatments (homogenates prepared from tissues or organs, etc.), various samples collected from living organisms (oral scrapings, throat swabs, nasal swabs, nasopharyngeal swabs, nasal aspirates, sputum, bronchial lavage, alveolar lavage, rectal swabs, etc.), environmental water (seawater, river water, lake water, sewage, domestic wastewater, industrial wastewater, etc.), and suspensions of samples obtained by wiping with a swab or the like from floors, walls, workbenches, sinks, various instruments and fixtures, etc. in food manufacturing equipment, laboratory equipment, medical equipment, kitchens, toilets, etc.
  • the present invention is a processing method that is particularly effective for blood-derived samples and other samples that are thought to contain a large amount
  • the method of mixing the blood-derived sample with the protease there is no particular limitation on the method of mixing the blood-derived sample with the protease, and methods used in normal biochemical experiments can be used, such as pipetting, mixing by inversion, stirring with a vortex mixer, or other methods that can mix the blood-derived sample with the protease.
  • Mixing is preferably performed at room temperature or a temperature lower than room temperature.
  • This mixture may be prepared by mixing the blood-derived sample with the protease, or the blood-derived sample may be directly mixed with a solution containing the protease that has been prepared in advance.
  • the amount of blood-derived sample contained in the mixture of blood-derived sample and protease and it may be adjusted taking into account the amount of the solution containing the protease, etc. For example, it is sufficient that at least 1/3 of the mixture is blood-derived sample.
  • the protease is not particularly limited.
  • serine protease acid protease (aspartic acid protease, glutamic acid protease), alkaline protease, semi-alkaline protease, metal protease, cysteine protease, etc. may be used alone or in combination.
  • the protease may also be an endopeptidase.
  • Endopeptidases suitable for the present invention include serine proteases such as proteinase K, trypsin, chymotrypsin, subtilisin, actinase, pronase, etc., and metal proteases such as thermolysin. Furthermore, mutants of these enzymes can also be used suitably.
  • the amount of protease to be mixed with the blood-derived sample may be appropriately determined depending on the type and effect of the protease.
  • the final concentration range of proteinase K or a variant thereof in the mixture is preferably in the range of 1 U/ml to 150 U/ml, more preferably 3 U/ml to 120 U/ml, and particularly preferably 3 U/ml to 100 U/ml.
  • the activity of proteinase K is defined as 1 U, the amount of enzyme that liberates Folin-positive amino acids equivalent to 1.0 ⁇ mol of tyrosine per minute at 37°C and pH 7.5 using denatured bovine hemoglobin as a substrate.
  • the mixture of the blood-derived sample and protease thus obtained can be subjected to the next step of heat treatment as is, although this is not a limitation of the present invention.
  • the mixture is subjected to heat treatment in the container used for its preparation.
  • the mixture may also be left to stand for a certain period of time, for example up to about 20 minutes, preferably up to about 15 minutes, before being subjected to heat treatment. During this time, the mixture is kept at room temperature or a temperature lower than room temperature.
  • the heat treatment temperature of the mixture is about 80°C or higher, and is not limited to, for example, 83°C or higher, preferably 85°C or higher, more preferably 89°C or higher, even more preferably 92°C or higher, even more preferably 95°C or higher, and even more preferably 98°C or higher.
  • the heat treatment is carried out at a temperature of 120°C or lower, usually up to 100°C, and is not limited to, for example, 10 seconds or higher, preferably 20 seconds or higher, and even more preferably 30 seconds or higher, and is 10 minutes or less, preferably 8 minutes or less, and even more preferably 5 minutes or less.
  • the heating rate (°C/sec) when the mixture reaches the treatment temperature is, for example, 0.5°C/sec or higher, preferably 0.7°C/sec or higher, more preferably 1.2°C/sec or higher, and even more preferably 1.8°C/sec or higher.
  • a device capable of setting the heating rate such as a thermal cycler, may be appropriately used.
  • the above-mentioned heating rate can be achieved by, for example, bringing the container containing the mixture into close contact with the container holder of the device, or inserting the container of the mixture after the device has reached the processing temperature or a temperature higher than the processing temperature.
  • Such heating treatment inactivates the protease in the mixture, so that when a sample treated by the method of the present invention is subjected to a nucleic acid amplification reaction, the protease does not affect the amplification reaction.
  • the mixture that has been subjected to the heat treatment is subjected to solid-liquid separation (floating separation, sedimentation separation, filtration, etc.), and the liquid phase separated from the solids is collected.
  • solid-liquid separation method in the present invention preferably sedimentation separation, more preferably centrifugation is used. This centrifugation only needs to be able to separate the supernatant from the precipitate, and sufficient conditions may be selected.
  • the centrifugal force during centrifugation may be, for example, 500 x g or more, preferably 1,000 x g or more, more preferably 1,500 x g or more, and even more preferably 2,000 x g or more and 10,000 x g or less.
  • the separation time during centrifugation may be appropriately set to a time suitable for separating the supernatant depending on the centrifugal force applied. For example, at 2,000 ⁇ g, the time is 20 seconds or more, preferably 30 seconds or more, more preferably 90 seconds or more, and even more preferably 120 seconds or more. In this way, since the present invention can separate the supernatant and the precipitate in a short time, a centrifuge without a cooling function can be used.
  • the heat-treated mixture may be passed through a filter or column to collect solids and obtain a liquid phase (filtrate).
  • a filter or column to collect solids and obtain a liquid phase (filtrate).
  • a sample from which blood-derived pigment components have been reduced or removed can be obtained by mixing a blood-derived sample with a protease, heating the resulting mixture, and then subjecting the heat-treated product to solid-liquid separation to collect the liquid phase.
  • the pigment components interfere with the detection of fluorescence during the nucleic acid amplification reaction when the nucleic acid in the sample is amplified.
  • the method of the present invention is also expected to reduce or remove substances that inhibit nucleic acid synthesis and insoluble matter in the sample. Therefore, the method of the present invention for reducing pigment components in a blood-derived sample is useful as a sample pretreatment method, for example, for the detection or amplification of a target nucleic acid.
  • the method for detecting a target nucleic acid of the present invention is a method for detecting a nucleic acid present in a blood-derived sample in which the pigment components have been reduced, obtained by the method of 1.
  • the target nucleic acid detected by the method of the present invention is not particularly limited, and may be a nucleic acid possessed by the organism from which the sample was collected, or may be a nucleic acid of another organism, such as a microorganism or virus, possessed by the organism.
  • the target nucleic acid may be either DNA or RNA.
  • Microorganisms include, for example, normal flora of living organisms, as well as microorganisms that infect living organisms, such as protozoa, fungi, bacteria, and viruses.
  • protozoa include malaria parasites, entamoeba histolytica, giardia, cryptosporidium, toxoplasma, and trypanosoma.
  • fungi include Candida fungi, Aspergillus fungi, Cryptococcus fungi, Mucor fungi, and Pneumocystis fungi.
  • Bacteria include both gram-positive and gram-negative bacteria.
  • Examples of gram-positive bacteria include Bacillus, Staphylococcus, Listeria, Clostridium, Streptococcus, and Mycobacterium bacteria.
  • Examples of gram-negative bacteria include Escherichia, Salmonella, Vibrio, Cronobacter, Legionella, and Pseudomonas bacteria.
  • Viruses that can be detected by the method of the present invention include, but are not limited to, both those with RNA or DNA genomes. Examples include double-stranded RNA viruses (dsRNA), single-stranded positive-strand RNA viruses (+ strand type), single-stranded negative-strand RNA viruses (- strand type), double-stranded DNA viruses (dsDNA), single-stranded positive-strand DNA viruses (+ strand type), and single-stranded negative-strand DNA viruses (- strand type).
  • dsRNA double-stranded RNA viruses
  • dsRNA viruses single-stranded positive-strand RNA viruses (+ strand type
  • single-stranded negative-strand RNA viruses dsDNA
  • dsDNA double-stranded positive-strand DNA viruses
  • viruses that can be detected by the method of the present invention include, but are not limited to, viruses that infect humans [influenza virus, human immunodeficiency virus, human T-cell leukemia virus, human parvovirus B19, coronavirus, hepatitis virus (A type, B type, C type, etc.), Ebola virus, rabies virus, norovirus, etc.].
  • Viruses that infect non-human animals are also suitable targets for detection, and examples of such viruses include bovine leukemia virus (also known as bovine infectious lymphoma virus) belonging to the Retroviridae family, African swine fever virus (ASFV) belonging to the Asfarviridae family, classic swine fever virus (CSFV) belonging to the Flaviviridae family, and foot-and-mouth disease virus belonging to the Picornaviridae family.
  • bovine leukemia virus also known as bovine infectious lymphoma virus
  • ASFV African swine fever virus
  • CSFV classic swine fever virus
  • foot-and-mouth disease virus belonging to the Picornaviridae family.
  • nucleic acid amplification methods include the PCR method (Polymerase Chain Reaction), the LAMP method (Loop-Mediated Lothermal Amplification), the WGA method (Whole Genome Amplification), the MDA method (Multiple Displacement Amplification), the SDA method (Strand Displacement Amplification), and the NEAR method (Nicing Endonuclease Amplification Reaction).
  • amplification methods include the Helicase-Dependent Amplification (HDA) method, the Recombinase Polymerase Amplification (RPA) method, the Strand-Invasion Based Amplification (SIBA) method, the Nucleic Acid Sequences Based Amplification (NASBA) method, and the Transcription Mediated Amplification (TMA) method, any of which can be used in the present invention.
  • HDA Helicase-Dependent Amplification
  • RPA Recombinase Polymerase Amplification
  • SIBA Strand-Invasion Based Amplification
  • NASBA Nucleic Acid Sequences Based Amplification
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • Amplified nucleic acids can also be detected and quantified in real time using the intercalator method, the TaqMan method, the Scorpion method, the cycling probe method, the molecular beacon method, electrochemical DNA detection methods, and the like.
  • These nucleic acid amplification methods and real-time detection methods have been explained in numerous reviews and are well known to those skilled in the art. Furthermore, since many kits for these amplification and detection methods are commercially available, such kits can be used in the detection method of the present invention.
  • PCR is a nucleic acid detection technique that uses a temperature cycler to treat a reaction solution whose main components are one or more primer pairs, a heat-resistant polypeptide with DNA polymerase activity, and dNTPs, and is widely used.
  • Many enzymes and kits for performing PCR are commercially available, and these can also be used in the method of the present invention.
  • a polypeptide having reverse transcription activity that synthesizes cDNA from RNA and a polypeptide having DNA-dependent DNA polymerase (DNA polymerase) that amplifies DNA fragments derived from the cDNA
  • reverse transcriptase is not necessary when RNA is not detected.
  • the reverse transcriptase and DNA polymerase may each be separate polypeptides, or may be a single polypeptide that combines both activities.
  • reverse transcriptase examples include HIV reverse transcriptase, AMV reverse transcriptase, M-MLV reverse transcriptase, C therm. polymerase, and polymerase derived from Thermus thermophilus (Tth polymerase), as well as PrimeScript (trademark) RTase, SuperScript (trademark) RTase, ReverTra Ace (registered trademark) RTase, SMARTScript (trademark) RTase, Quantiscript RTase, ProtoScript RTase, etc.
  • PrimeScript trademark
  • SuperScript trademark
  • ReverTra Ace registered trademark
  • SMARTScript trademark
  • Quantiscript RTase Quantiscript RTase
  • ProtoScript RTase etc.
  • DNA polymerase any of DNA polymerases belonging to family A (Pol I type), DNA polymerases belonging to family B ( ⁇ type), and a mixture of the above two types of polymerases can be preferably used.
  • a heat-resistant DNA polymerase is preferably used.
  • the DNA polymerase is not particularly limited, but examples that can be used include DNA polymerase derived from thermophilic eubacteria Thermus aquaticus (Taq DNA polymerase), DNA polymerase derived from Thermus thermophilus (Tth DNA polymerase), etc., DNA polymerase derived from thermophilic archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain (KOD DNA polymerase), and DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus (Pfu DNA polymerase), etc.
  • the ⁇ -type DNA polymerase is not particularly limited, but commercially available polymerases such as PrimeSTAR DNA polymerase (manufactured by Takara Bio), Tks Gflex DNA polymerase (manufactured by Takara Bio), Pfu DNA polymerase, or KOD DNA polymerase (manufactured by Toyobo) can be used. Furthermore, it may be a single polypeptide having reverse transcription activity and DNA polymerase activity, such as Tth polymerase.
  • the reverse transcriptase and DNA polymerase, or the DNA polymerase having reverse transcription activity may be natural or mutant, so long as they are compatible with the method of the present invention. Examples include reverse transcriptase mutants with improved heat resistance and DNA polymerase mutants with improved reaction rate.
  • the reverse transcriptase and DNA polymerase, or the DNA polymerase having reverse transcription activity may be a hot-start enzyme in which antibodies to these enzymes are combined to prevent non-specific amplification before the reaction.
  • an elongation factor such as PCNA or various substances known to improve the efficiency of nucleic acid amplification reactions, such as surfactants, bovine serum albumin, acidic polymers, and amphoteric amino acids, may also be combined.
  • the primer pair used in the nucleic acid amplification method of the present invention is not particularly limited in its sequence, so long as it is designed to amplify any region contained in the target nucleic acid.
  • a primer for cDNA synthesis may be prepared separately, and one of the primers in the amplification primer pair may be used for the reverse transcription reaction.
  • reaction temperature reaction temperature, reaction time, number of thermal cycles, etc.
  • reaction time reaction time
  • number of thermal cycles etc.
  • reaction conditions should be set taking into consideration the base sequence and chain length of the primers used, the chain length of the DNA fragments to be amplified, etc.
  • DNA fragments amplified using a PCR reaction solution containing dUTP contain uracil, but if this amplified DNA fragment is mixed with other reaction solutions before the reaction is performed (reaction solutions containing dUTP and heat-labile UNG), the mixed DNA can be decomposed and lose its function as a template by keeping the reaction solution at a temperature at which UNG acts before the reaction begins. Since UNG is inactivated by the subsequent PCR temperature cycle, decomposition of the DNA that has incorporated U does not occur during amplification. In the detection method of the present invention, cross-contamination can also be prevented by using a reaction solution containing dUTP and heat-labile UNG.
  • the nucleic acid amplification reaction solution used in the detection method of the present invention contains reverse transcriptase and DNA polymerase, or DNA polymerase with reverse transcription activity, and is a solution with a composition that allows these enzymes to exert their activities.
  • the reaction solution contains a buffer component for maintaining an optimal pH, a divalent metal salt (magnesium salt, manganese salt, etc.), and dNTPs, and may further contain neutral salts, surfactants, and other components.
  • This reaction solution may contain a primer pair for amplifying a specific region on the target nucleic acid to be detected, a detection nucleic acid probe (e.g., a quenching probe (Q probe), Taqman (registered trademark) probe), etc.
  • a detection nucleic acid probe e.g., a quenching probe (Q probe), Taqman (registered trademark) probe
  • it may contain an intercalator dye (e.g., SYBR (registered trademark) Green, TB Green (registered trademark)) instead of the detection nucleic acid probe. It may also contain other reagents used in nucleic acid amplification reactions.
  • the nucleic acid amplification reaction may be a multiplex detection in which an internal standard nucleic acid having a sequence different from the target nucleic acid is combined with a primer pair for detecting the internal standard nucleic acid and a detection nucleic acid probe for the purpose of confirming reaction inhibition, etc.
  • the detection method of the present invention is characterized in that a blood-derived sample in which components that inhibit nucleic acid amplification or components that are not suitable for optical detection means have been reduced or removed is subjected to a nucleic acid amplification reaction. Therefore, the detection method of the present invention is suitable for real-time PCR and real-time RT-PCR that use means for optically detecting the amplified product, such as the intercalator method, TaqMan method, Scorpion method, cycling probe method, and molecular beacon method.
  • two or more target nucleic acids can be simultaneously amplified and detected in one reaction solution.
  • a primer pair is prepared for each of the multiple target nucleic acids, and a reaction solution containing these primer pairs is used to amplify DNA fragments derived from each target nucleic acid.
  • different regions on the same gene may be used as target nucleic acids, or different genes, for example, genes of multiple microorganisms that may be present in a sample, may be used as targets.
  • the amplified fragments can be detected by a method in which the chain length specific to each target nucleic acid is confirmed by electrophoresis or melting curve analysis, or by a method in which a different labeled probe is used for each target nucleic acid.
  • the probes for each target nucleic acid may be labeled separately or may be labeled the same. That is, multiple wavelength detection may be performed depending on the purpose of detection, or one wavelength detection may be performed.
  • the labeled probe may be a combination of fluorescent labels based on the FRET method or the non-FRET method, or a combination of a fluorescent label and a quenching label. Examples of the fluorescent label include FAM, CY5, ROX, and HEX.
  • the quenching label Eclipse (registered trademark) and BHQ (registered trademark) labels, which are called dark quenchers, can be suitably used.
  • the multiple target nucleic acids may include both RNA and DNA.
  • a reaction solution containing a primer for synthesizing DNA complementary to the target RNA and amplifying its fragment a primer for amplifying DNA from a target DNA, which is a target nucleic acid different from the RNA, and a reverse transcriptase and a DNA polymerase or a DNA polymerase having reverse transcription activity, the target RNA and the target DNA in the sample can be detected simultaneously.
  • swine fever virus single-stranded RNA virus
  • African swine fever virus double-stranded DNA virus
  • a nucleic acid amplification reaction solution for detecting multiple target nucleic acids contains appropriately designed primers/probes so that each target nucleic acid can be amplified specifically and sensitively under the same reaction conditions. It is also necessary to set appropriate reaction conditions so that amplification occurs from all target nucleic acids, if they are present in the sample.
  • the reaction conditions can be determined by referring to well-known conditions for PCR and RT-PCR. In this case, the temperature, incubation time and number of cycles can be adjusted appropriately depending on the target sequence and the chain length of the primers and probes.
  • the detection method of the present invention is useful for detecting infectious microorganisms, such as viruses, that may be present in a blood sample.
  • the present invention is useful for detecting, but is not limited to, human immunodeficiency virus, human T-cell leukemia virus, human parvovirus B19, hepatitis virus (types A, B, C, etc.), Ebola virus, bovine leukemia virus, African swine fever virus, swine fever virus, foot and mouth disease virus, etc.
  • the detection method of the present invention is characterized by using a blood-derived sample in which substances that inhibit nucleic acid amplification reactions or substances that interfere with optical detection of the amplified products have been reduced or removed.
  • a blood-derived sample in which substances that inhibit nucleic acid amplification reactions or substances that interfere with optical detection of the amplified products have been reduced or removed.
  • This allows a larger amount of template to be brought into the reverse transcription reaction and nucleic acid amplification reaction, thereby increasing the detection sensitivity of the target nucleic acid in the sample.
  • the kit may contain buffer components, divalent metal salts, dNTPs, neutral salts, etc. necessary for preparing a nucleic acid amplification reaction solution.
  • the target nucleic acid detection reagent may also be a reagent for optically detecting an amplified product obtained by a nucleic acid amplification method.
  • the kit of the present invention also includes a kit containing a primer or probe used for amplifying and detecting a target nucleic acid as the target nucleic acid detection reagent.
  • a primer or probe used for amplifying and detecting a target nucleic acid as the target nucleic acid detection reagent.
  • Methods for designing primers for nucleic acid amplification based on the base sequence of a target nucleic acid are well known to those skilled in the art, and a sequence that provides the desired specificity and amplification efficiency of nucleic acid amplification can be selected using, for example, primer design software.
  • the detection probe can also be designed in a similar manner to the primer. By adding an appropriate fluorescent substance or quencher, the probe can be processed into a probe that can be used as, for example, a TaqMan (registered trademark) probe, a Q probe, or a molecular beacon.
  • kits containing an intercalator instead of a probe is also one aspect of the kit of the present invention.
  • the kit of the present invention may contain a primer pair for amplifying an internal standard nucleic acid and a detection nucleic acid probe, or a reference nucleic acid, a primer pair for amplifying a reference nucleic acid, and a probe for detecting a reference nucleic acid, in order to confirm that non-detection of the target nucleic acid is not due to inhibition of reverse transcription and/or amplification reaction.
  • kits of the present invention may be stored in separate containers and configured to perform pretreatment of the blood-derived sample (reduction of pigment components) and preparation of a nucleic acid amplification reaction solution when used.
  • a kit is provided that contains all of the components necessary for a nucleic acid amplification reaction other than the sample, and includes a premixed nucleic acid amplification reagent that can prepare a reaction solution simply by mixing with a sample that has been appropriately treated by the method of the present invention, and a reagent for pretreatment of the sample.
  • Example 1 Removal of pigment components from blood-derived samples 10 ⁇ l of either proteinase K solution (350 U/ml, the same concentration solution was used in the following examples) or 2% sodium dodecyl sulfate solution was placed in a 0.2 ml microcentrifuge tube, and 40 ⁇ l of porcine whole blood containing EDTA as an anticoagulant (hereinafter referred to as EDTA blood) was added thereto and mixed by pipetting. The tube was inserted into a thermal cycler (Thermal Cycler Dice® Real Time System III, Takara Bio Inc., TP950), and the mixture was heated at 95° C. for 5 minutes, and then centrifuged at 10,000 ⁇ g for 2 minutes.
  • a thermal cycler Thermal Cycler Dice® Real Time System III, Takara Bio Inc., TP950
  • Example 2 Amount of Proteinase K Added to Blood-Derived Samples and Centrifugation Conditions After Heat Treatment Proteinase K solution (hereinafter also referred to as "ProK”) and whole blood (porcine EDTA blood) in the amounts shown in Table 1 were placed in a microcentrifuge tube, mixed by pipetting, and heated at 95°C for 5 minutes in a thermal cycler (TP950). After heating, the tube was placed in a tabletop centrifuge (Chibitan: Merck Millipore) and centrifuged at 2,000 x g for 10 seconds, 20 seconds, 60 seconds, or 120 seconds.
  • ProK Proteinase K solution
  • TP950 thermal cycler
  • Example 3 Effects of the present invention on various blood-derived samples 5 ⁇ l of proteinase K solution or distilled water was placed in a microcentrifuge tube, and 45 ⁇ l of porcine serum, porcine EDTA blood, or porcine whole blood to which heparin was added as an anticoagulant (hereinafter, heparinized blood) was added and mixed by pipetting. The tube was then heated at 95° C. for 5 minutes in a thermal cycler (TP950) and centrifuged at 2,000 ⁇ g for 2 minutes. For comparison, tubes containing only 50 ⁇ l of porcine serum, porcine EDTA blood, or porcine heparinized blood were also similarly subjected to heat treatment and centrifugation. The state of the mixture in the tube after centrifugation was observed visually, etc. The results are shown in Table 2.
  • thermolysin solution (20 mg/ml) or 5 ⁇ l of pronase solution (20 mg/ml) was added to 45 ⁇ l of porcine heparin blood, mixed, and similarly subjected to heat treatment and centrifugation. As a result, it was confirmed that a clear supernatant and precipitate were formed when these proteases were used.
  • the method of the present invention was found to be applicable to serum, EDTA blood, and heparinized blood.
  • Example 4 Temperature conditions of heat treatment in the method of the present invention 45 ⁇ l of porcine heparin blood was added to 5 ⁇ l of proteinase K solution in a microcentrifuge tube and mixed by pipetting. The tube was then heated at various temperatures (80°C, 83°C, 86°C, 89°C, 92°C, 95°C, 98°C, and 99.9°C) for 3 minutes, then centrifuged at 2,000 ⁇ g for 2 minutes, and the supernatant was collected.
  • various temperatures 80°C, 83°C, 86°C, 89°C, 92°C, 95°C, 98°C, and 99.9°C
  • the heat treatment was performed by raising the temperature of a thermal cycler (manufactured by Takara Bio, Inc., TP950) in which the tube was set from 25°C to each temperature at an average rate of 4.3°C/sec, and holding the set temperature for 3 minutes after reaching the set temperature.
  • a thermal cycler manufactured by Takara Bio, Inc., TP950
  • the tube was set from 25°C to each temperature at an average rate of 4.3°C/sec, and holding the set temperature for 3 minutes after reaching the set temperature.
  • the supernatant obtained by heat treatment at a temperature lower than 83°C was turbid.
  • the one treated at 83°C was slightly viscous, and the one treated at 80°C was clearly viscous.
  • the absorption spectra of the supernatants obtained after treatment at each temperature were measured at 200 to 800 nm using a NanoDrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, path length 0.1 mm). Distilled water was used as a control for the measurements. All supernatants had maximum absorption at approximately 415 nm, and it was shown that the higher the treatment temperature, the lower the absorbance, regardless of wavelength. The relationship between the absorbance at 415 nm and treatment temperature for each supernatant is shown in Figure 1.
  • Example 5 Conditions for heat treatment in the method of the present invention 45 ⁇ l of porcine heparin blood was added to 5 ⁇ l of proteinase K solution in a microcentrifuge tube and mixed by pipetting. The tube was then placed in a thermal cycler (TP950) at 25°C and heated to 98°C at various heating rates (average rate over 25°C to 98°C) shown in Table 3, and then held for 3 minutes. In addition, the tube was inserted into a heat block at 98°C and held for 3 minutes. After heating, the tube was centrifuged at 2,000 ⁇ g for 2 minutes to collect the supernatant. The state of the collected supernatant is shown in Table 3.
  • TP950 thermal cycler
  • Example 6 Effect of removing pigments by the method of the present invention 5 ⁇ l of distilled water or 5 ⁇ l of proteinase K solution was placed in a microcentrifuge tube, and 45 ⁇ l of porcine heparinized blood was added and mixed by pipetting. Next, for the mixture with proteinase K solution, the tube was heated in a heat block at 98° C. for 3 minutes, and then centrifuged at 2,000 ⁇ g for 2 minutes to collect the supernatant. Note that the mixture with distilled water was not heated because it coagulated when heated (see Table 2), making it impossible to perform the measurements shown below. The absorbance at 415 nm of the collected supernatant and the mixture of whole blood and distilled water were measured in the same manner as in Example 5. Note that the above test was performed on three different types of porcine heparinized blood.
  • Example 7 Detection method and storage stability of nucleic acid Proteinase K solution and porcine EDTA blood or porcine serum were added to a microcentrifuge tube in various mixing ratios shown in Table 5, and mixed by pipetting. 50 ⁇ l of the resulting mixture was heated at 95°C for 3 minutes, and then centrifuged at 2,000 x g for 2 minutes to collect the supernatant. 2 ⁇ l of RNA solution [200-fold diluted novel coronavirus positive control (RNA) (Takara Bio, RC351A)] was added to 18 ⁇ l of this supernatant, or 18 ⁇ l of saline as a control, and allowed to stand at room temperature for 5 or 70 minutes. RNA in these samples was then detected by quantitative reverse transcription (RT)-PCR.
  • RNA novel coronavirus positive control
  • Quantitative RT-PCR was performed as follows. A total of 30 ⁇ l of reaction solution was prepared using the reaction solution contained in the Takara SARS-CoV-2 & Flu Direct PCR Detection Kit (manufactured by Takara Bio, RD011), primer and probe solutions, sterile water, and 2 ⁇ l of the positive control-containing sample described above. Using a thermal cycler (TP950), 45 cycles of reaction were performed, with one cycle consisting of 52°C for 5 minutes, 95°C for 10 seconds, followed by 95°C for 5 seconds and 60°C for 30 seconds, and novel coronavirus RNA was detected by monitoring the fluorescence of Cy5 during the reaction. The reaction was performed in duplicate.
  • TP950 thermal cycler
  • ⁇ Ct indicates the delay in the Ct value of the sample left standing for 70 minutes compared to the Ct value of the sample left standing for 5 minutes.
  • Example 8 Detection of Nucleic Acid in Human Whole Blood Samples Three lots of commercially available human whole blood were used, and the same procedure as in Example 7 was carried out to obtain a supernatant. 9 ⁇ l of this supernatant, or 9 ⁇ l of physiological saline as a control, was mixed with 1 ⁇ l of DNA solution (Positive Control Mix (7)-2) included in Virus Test Kit (HIV, HTLV, HCV, HBV, ParvoB19) Ver. 2 (manufactured by Takara Bio Inc., RR273A) to prepare a sample, of which 2 ⁇ l was subjected to RT-PCR as described below.
  • RT-PCR was carried out as follows. A total of 25 ⁇ l of reaction solution was prepared using the above kit components and 2 ⁇ l of sample. However, HIV1 pol Primer/Probe Mix-2 was used as the primer and probe. Using a thermal cycler (TP950), the reaction was carried out for 45 cycles, with one cycle consisting of 42°C for 5 minutes, 95°C for 30 seconds, followed by 95°C for 5 seconds and 56°C for 30 seconds, and the fluorescence of FAM was monitored during the reaction. The reaction was carried out in duplicate.
  • TP950 thermal cycler
  • Example 9 Detection of virus in blood using the target nucleic acid detection method of the present invention 4 ⁇ l of NATtrol SARS-Related coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Stock, which is a non-infectious virus particle for research, was added to 36 ⁇ l of physiological saline or porcine EDTA blood to prepare a virus-containing sample. 40 ⁇ l of this virus-containing sample was added to 10 ⁇ l of proteinase K solution in a microcentrifuge tube, mixed by pipetting, and heated at 95°C for 5 minutes in a thermal cycler (TP950). The mixture was then centrifuged at 2,000 x g for 2 minutes to collect the supernatant.
  • SARS-CoV-2 NATtrol SARS-Related coronavirus 2
  • ⁇ Ct indicates the delay in the Ct value in EDTA blood relative to the Ct value (average) in saline. Viral RNA was detected in both saline and EDTA blood. Furthermore, there was no significant difference in the Ct values between the two. In other words, when pretreatment is performed using the blood sample treatment method of the present invention, there is no reaction inhibition or detection interference due to substances derived from the blood sample, demonstrating that highly reliable detection of viruses in blood is possible.
  • Example 10 Target Nucleic Acid Detection Method of the Present Invention Using Multiplex RT-PCR of ASF virus/CSF virus.
  • whole blood samples from pigs previously infected with CSF virus Japanese 2018 isolate
  • whole blood was collected every day for six days from the second to seventh days.
  • the pigs were observed for fever and symptoms at the time of blood collection.
  • whole blood samples that had been refrigerated for one day after blood collection were used.
  • reaction solution A total of 25 ⁇ l of reaction solution was prepared using 2 ⁇ l of this supernatant, the reaction solution, primer and probe solution, and sterile water contained in the CSFV/ASFV Direct RT-qPCR Mix & Primer/Probe (with ROX Reference Dye) kit (Takara Bio, RC212A), and viral RNA was detected using the method described in the kit's instructions (quantitative RT-PCR, 7500Fast (ABI)). The reaction was performed in series.
  • Example 11 Evaluation of the present invention using whole blood from boars experimentally infected with ASF
  • Two virus-inoculated boars (#1, #2) that had been inoculated intramuscularly with the Armenian isolate of ASF virus (Armenia/07) and two virus-uninoculated boars (#3, #4) were prepared and raised in the same section (hereinafter referred to as virus-inoculated boars and cohabiting boars, respectively).
  • Whole blood was collected from the virus-inoculated boars before and 2-4 days after inoculation, and from the cohabiting boars before and 7-13 days after cohabitation with the virus-inoculated boars, and frozen and stored at -80°C to prepare samples.
  • boars were observed for fever and symptoms when blood was collected.
  • whole blood samples were collected from the virus-inoculated wild boar (#1) and the cohabiting wild boar (#3) before virus inoculation and before cohabitation, and after virus inoculation and after cohabitation, and then frozen. The collected whole blood samples were thawed and used as whole blood samples.
  • reaction solution A total of 25 ⁇ l of reaction solution was prepared using 2 ⁇ l of this supernatant, the reaction solution, primer/probe solution, and sterile water contained in the CSFV/ASFV Direct RT-qPCR Mix & Primer/Probe (with ROX Reference Dye) kit (Takara Bio, RC212A), and viral DNA was detected using the method described in the kit's instructions (quantitative RT-PCR, 7500Fast (ABI)). The reaction was performed in a single strip.
  • ASF DNA was detected in both the virus-inoculated wild boar (#1) and the cohabiting wild boar (#3). It was shown that when pretreatment was performed using the method of the present invention, the virus can be detected without any problems from whole blood after freezing and thawing. Furthermore, since the virus can be detected before fever and other symptoms are observed, it was shown to be effective in early viral infection countermeasures.
  • detection and amplification inhibitors such as pigment components in blood-derived samples are reduced or removed, making it possible to detect nucleic acids derived from viruses, etc. contained in blood-derived samples without the need to isolate the nucleic acids, which can make a significant contribution to the field of clinical diagnosis.

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Abstract

本発明によれば、（１）血液由来試料とプロテアーゼを混合する工程、（２）工程（１）の混合物を熱処理する工程、および（３）固液分離により工程（２）の熱処理物から液相を採取する工程、を包含する、血液由来試料中の色素成分の低減方法等が提供される。

Description

血液由来試料の処理方法
　本発明は、血液由来試料の処理方法、血液試料中の核酸の検出方法並びにキットに関する。
　生体由来試料に含まれる核酸を検出することは臨床診断医学、生物学、農業、畜産などの分野において重要である。例えば、医療分野ではヒト由来試料中の標的核酸をＰＣＲ等で増幅して検出し、ウイルス（ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス）の存在を調べる、および／またはウイルスの種類を特定することが行われている。しかし、生体由来試料中には核酸のほかに様々な生体由来物質が含まれているため、生体由来試料から核酸を精製することなく核酸増幅を実行すると増幅阻害や検出阻害が生じる場合がある。そこで、生体試料中の目的のウイルスを検出する際に、例えば、まずカラム等を用いて試料から核酸精製した後に、核酸増幅反応に供する方法が採用されている。
　一方、簡便に核酸の検出を行うために、生体由来物質による増幅阻害を抑止するための核酸含有試料の処理方法や、反応液に増幅効率を改善する添加剤を用いる方法が報告されている。例えば、ウイルスにタンパク質分解酵素を作用させたのち、ＲＴ－Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行って検出する方法が報告されている（特許文献１）。また、ウイルスからの核酸抽出において、生体試料に還元剤、多糖類分解酵素、タンパク質分解酵素、界面活性剤等を作用させて、ＲＴ－ＰＣＲを行って検出する方法が報告されている（特許文献２、３）。
　標的とする核酸を迅速に検出するため、反応液中の増幅核酸量を経時的に測定することが可能なリアルタイムＰＣＲ法が開発されており、すでに広く普及している。この方法ではインターカレーター色素や蛍光標識されたプローブを使用し、増幅産物量の指標となる蛍光を分光光学的に測定するものである。しかしながら、血液中には蛍光の測定を妨害する成分が存在していることが知られている（非特許文献１）。よって、血液由来試料を用いてリアルタイムＰＣＲ法を実施するためには、核酸精製等の工程を経ることが一般的に必須であり、血液から核酸を精製するためのキットも市販されているが、操作が煩雑である。
特開平０６－０４６９００号公報 特開２０１８－０００１２４号公報 ＷＯ２０２１／２２１１０９
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１８）、４１０、２５６９－２５８３
　核酸結合担体等を用いて生体試料より核酸を精製した後に、核酸増幅反応に供する方法は、煩雑であり多検体処理に向かないとともに、ウイルスが失活するまでの間、操作従事者が当該ウイルスに感染する危険性があり、そのためウイルスに適合する封じ込めレベルで試料を取り扱わなければならない。即ち、コスト及びリスクが高いという問題があった。また、血液試料中の核酸の検出においては、核酸の精製を行わない場合、あるいは簡易精製で得られた核酸を試料とする場合には、血液中の成分が検出結果に影響を及ぼすことも少なくない。本発明の目的は、操作従事者の感染リスクを下げつつ、コスト高にならず、簡便な操作で高感度検出可能な生体試料中の核酸検出方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、血液由来試料と、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）を含む混合物を調製し、加熱および固液分離する工程を経ることにより、驚くべきことに、前記試料中に存在する大半の色素が除去された透明度の高い液相を取得できることを見出した。さらに、当該液相から標的核酸の効率的な増幅および高感度な光学的検出が可能であることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、
［１］　（１）血液由来試料とプロテアーゼを混合する工程、
（２）工程（１）の混合物を熱処理する工程、および
（３）固液分離により工程（２）の熱処理物から液相を採取する工程、
を包含する、血液由来試料中の色素成分の低減方法。
［２］　血液由来試料が全血、血清または血漿である［１］の方法。
［３］　プロテアーゼがプロテイナーゼＫである［１］または［２］に記載の方法。
［４］　熱処理が８９℃以上の温度で実施される［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］　（１）血液由来試料とプロテアーゼを混合する工程、
（２）工程（１）の混合物を熱処理する工程、
（３）固液分離により工程（２）の熱処理物から液相を採取する工程、および
（４）工程（３）で得られた液相中の標的核酸を検出する工程、
を包含する、血液由来試料中の標的核酸の検出方法。
［６］　血液由来試料が全血、血清または血漿である［５］の方法。
［７］　プロテアーゼがプロテイナーゼＫである［５］または［６］に記載の方法。
［８］　熱処理が８９℃以上の温度で実施される［５］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］　標的核酸を検出する工程が、標的核酸を核酸増幅法で増幅して得られる増幅物を光学的に検出することを含む、［５］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］　核酸増幅法がＰＣＲ法である［９］記載の方法。
［１１］　標的核酸がウイルスまたは微生物に由来する核酸である［５］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］　［５］～［１１］のいずれかに記載の方法に使用するための標的核酸検出キットであって、プロテアーゼおよび標的核酸検出試薬を含有するキット。
［１３］　標的核酸検出試薬が、核酸増幅法で得られる増幅物を光学的に検出する試薬である［１２］記載のキット。
［１４］　標的核酸検出試薬がＰＣＲ法のための試薬である［１２］記載のキット。
［１５］　プロテアーゼがプロテイナーゼＫである［１２］～［１４］のいずれかに記載のキット。
　核酸抽出及び精製に要する特殊な機器、有機溶媒等の試薬、抽出及び精製に長時間を必要とすることのない血液試料の簡便な処理により、操作従事者のリスクを減らしながら核酸増幅に適した試料を調製できる。この試料を用いて核酸増幅することにより目的の核酸を再現性よく検出できる。したがって、本発明によれば、安全かつ簡便な操作で高感度検出が可能な、血液由来試料中の核酸を検出する方法が提供される。
血液由来試料とプロテアーゼの混合物の熱処理温度と、熱処理後の混合物上清の吸光度（４１５ｎｍ）との関係を示す。 血液由来試料とプロテアーゼの混合物の熱処理昇温速度と、熱処理後の混合物上清の吸光度（４１５ｎｍ）との関係を示す。
　以下、詳細に説明する。
　１．本発明の血液由来試料中の色素成分の低減方法
　本発明の血液由来試料中の色素成分の低減方法は、血液由来試料とプロテアーゼを混合すること、得られた混合物を加熱すること、および該加熱された混合物を固液分離に付して液相を採取することを含む、前記試料の処理工程を包含する。
　前記血液由来試料としては、生物の血液に由来する各種の試料が包含される。当該試料は、生体より採取された試料そのもの、例えば全血、血清、血漿、血液細胞等の他、その派生物、例えば前記試料の希釈液、懸濁液、溶解液等であってもよい。全血、血清、血漿を試料とする場合、特に溶血した血液（全血）、ならびにこれより調製された血清、血漿の処理に本発明の方法は好適である。また、前記の試料の起源としては、哺乳動物（ヒト、家畜、野生動物、愛玩動物、実験動物等）、鳥類（家禽、野生の鳥類等）、その他の脊椎動物が挙げられる。血液由来試料は、抗凝固剤で処理されていてもよい。該抗凝固剤としては、限定するものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリンなど、既知のものが使用できる。
　なお、本発明の前記処理工程を血液以外に由来する試料、例えば血液以外の体液（尿、糞便、唾液、鼻汁）、組織、組織処理物（組織または臓器から調製されたホモジネート等）、生体から採取された各種試料（口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液等）、環境水（海水、河川水、湖沼水、下水、家庭排水、産業排水等）、ならびに食品製造設備、実験設備、医療設備、厨房やトイレなどの床、壁、作業台、シンク、各種の器具・備品等よりスワブなどによる拭取り操作で得られた採取物の懸濁液等、について適用することも妨げられない。本発明は、特に核酸検出の阻害物が多く含まれると考えられている血液由来試料やその他の試料に対して有効な処理方法である。
　前記の血液由来試料と、プロテアーゼとの混合方法に特に限定はなく、通常の生化学実験における手法を利用することが出来る、例えば、ピペッティング、転倒混和、ボルテックスミキサーによる攪拌など、血液由来試料とプロテアーゼを混和できる方法を用いればよい。混合は、好ましくは、室温又は室温より低温で行う。この混合物は、血液由来試料とプロテアーゼを混合して調製してもよく、又はあらかじめ調製されたプロテアーゼを含む溶液に血液由来試料を直接混合してもよい。血液由来試料とプロテアーゼの混合物中に含まれる血液由来試料の量には限定はなく、プロテアーゼを含む溶液の量などを考慮して調整すればよい。例えば、混合物の１／３以上が血液由来試料であればよい。
　前記プロテアーゼには特に限定はない。例えば、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ（アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ）、アルカリプロテアーゼ、セミアルカリプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、システインプロテアーゼ等を単独あるいは、組み合わせて使用してもよい。前記プロテアーゼはまた、エンドペプチダーゼであってもよい。本発明に好適なエンドペプチダーゼとしては、セリンプロテアーゼであるプロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、サブチリシン、アクチナーゼ、プロナーゼ等や、金属プロテアーゼであるサーモリシン等が挙げられる。さらに、これらの酵素の変異体も好適に使用できる。本発明においては、血液由来試料と混合するプロテアーゼの量は、その種類や効果に応じて適宜決定すればよい。例えば、プロテアーゼとしてプロテイナーゼＫ又はその変異体を用いる場合、プロテイナーゼＫ又はその変異体の、混合物における最終濃度の範囲は、好ましくは１Ｕ／ｍｌ～１５０Ｕ／ｍｌの範囲、さらに好ましくは３Ｕ／ｍｌ～１２０Ｕ／ｍｌ、特に好ましくは３Ｕ／ｍｌ～１００Ｕ／ｍｌで使用することができる。
　本明細書においてプロテイナーゼＫの活性は、変性ウシヘモグロビンを基質として、３７℃、ｐＨ７．５で１分間に１．０μｍｏｌのチロシンに相当するＦｏｌｉｎ陽性アミノ酸を遊離する酵素量を１Ｕと定義する。
　かくして得られた血液由来試料とプロテアーゼとの混合物は、特に本発明を限定するものではないが、そのまま次の工程である加熱処理に供することができる。好ましくは、混合物はその調製に使用された容器のまま加熱処理に供される。また、混合物は加熱処理に供する前に一定時間、例えば２０分程度まで、好ましくは１５分程度まで放置されていてもよい。前記の放置の間、混合物は室温もしくは室温より低い温度に保持される。
　前記混合物の加熱処理温度は、約８０℃以上であり、限定するものではないが、例えば８３℃以上、好ましくは８５℃以上、より好ましくは８９℃以上、さらに好ましくは９２℃以上、さらにより好ましくは９５℃以上、またさらに好ましくは９８℃以上である。加熱処理は、特に本発明を限定するものではないが、１２０℃以下の温度、通常は１００℃までの温度で実施される。加熱処理の時間としては、例えば１０秒以上、好ましくは２０秒以上、さらに好ましくは３０秒以上であり、１０分以内、好ましくは８分以内、さらに好ましくは５分以内である。例えば、本発明を限定するものではないが、混合物を緩慢に加熱して前記の処理温度に到達させることは望ましくなく、混合物は好ましくは急速加熱される。混合物を処理温度に到達させる際の昇温速度（℃／秒）は、例えば、０．５℃／秒以上、好ましくは、０．７℃／秒以上、より好ましくは、１．２℃／秒以上、さらに好ましくは、１．８℃／秒以上である。前記の昇温速度を達成させるためにはサーマルサイクラーなどの昇温速度を設定できる装置を適宜利用すればよい。なお、ヒートブロックや恒温槽など昇温速度を調節できない装置で混合物を加温する場合は、上記の昇温速度を達成するために、混合物の入った容器を装置の容器保持具に対して密着させる、あるいは装置が処理温度またはそれを超える温度に達した後に混合物の容器を挿入する、等の工夫によって前記の昇温速度での加熱が可能となる。このような加熱処理により、混合物中のプロテアーゼは失活するため、本発明の方法で処理された試料を核酸増幅反応に供した場合に、プロテアーゼが増幅反応に影響を与えることはない。
　次いで、加熱処理を施した混合物は固液分離（浮上分離、沈降分離、ろ過等）に供され、固形物と分離された液相が採取される。本発明における固液分離法として、好ましくは沈降分離、より好ましくは遠心分離が用いられる。この遠心分離は、上清を沈殿物と分けることが出来ればよいのであって、それに十分な条件を選択すればよい。特に発明を限定するものではないが、遠心分離時の遠心力として、例えば、５００×ｇ以上、好ましくは１，０００×ｇ以上、より好ましくは１，５００×ｇ以上、さらに好ましいのは２，０００×ｇ以上、かつ、１０，０００×ｇ以下が挙げられるが、堅固な沈殿が形成されるよう、より高い遠心力、例えば１０，０００×ｇ以上の遠心力を付加して遠心分離を行っても差し支えない。また、遠心分離の際の分離時間は、付加する遠心力に応じて上清の分取に適した時間を適宜設定すればよい。例えば、２，０００×ｇであれば２０秒以上、好ましくは３０秒以上、より好ましくは、９０秒以上、さらに好ましくは１２０秒以上が挙げられる。このように、本発明では短時間で上清と沈殿を分離できることから、冷却機能を備えていない遠心分離機も使用することができる。また、遠心分離操作の替わりに、加熱処理を施した混合物をフィルターやカラムに通して固形物を捕集し、液相（ろ液）を得てもよい。このような操作は、特に多数の検体、血液由来試料以外の試料の処理に有用である。
　以上のとおり、血液由来試料とプロテアーゼを混合し、得られた混合物を加熱し、次いで該加熱処理物を固液分離に供して液相を採取することにより、血液由来の色素成分が低減もしくは除去された試料を得ることができる。該色素成分は、試料中の核酸を増幅させる場合に核酸増幅反応時の蛍光の検出を妨害する。さらに、本発明の方法は、試料中の核酸合成を阻害する物質や不溶物の低減または除去も期待できる。したがって、本発明の血液由来試料中の色素成分の低減方法は、例えば標的核酸の検出または増幅のための、試料の前処理方法として有用である。
　２．本発明の標的核酸の検出方法
　本発明の標的核酸の検出方法は、前記１．の方法により得られた色素成分が低減された血液由来試料中に存在する核酸を検出する方法である。本発明の方法により検出される標的核酸には特に限定はないが、試料が採取された生物が有している核酸であってもよく、当該生物が保持している他の生物、例えば微生物やウイルスの核酸であってもよい。また、標的とする核酸はＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでも構わない。
　微生物としては、例えば生物の常在菌の他、生物に感染している微生物、例えば原虫、真菌、細菌、ウイルス等が例示される。原虫としてはマラリア原虫、赤痢アメーバ、ジアルジア、クリプトスポリジウム、トキソプラズマ、トリパノソーマ等が例示される。真菌としてはカンジダ属真菌、アスペルギルス属真菌、クリプトコッカス属真菌、ムコール属真菌、ニューモシスチス属真菌等が例示される。細菌にはグラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。グラム陽性菌としては、バチルス属細菌、スタフィロコッカス属細菌、リステリア属細菌、クロストリジウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌、マイコバクテリウム属細菌等が挙げられる。また、グラム陰性菌としては、エシェリヒア属細菌、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、クロノバクター属細菌、レジオネラ属細菌、シュードモナス属細菌等が挙げられる。
　本発明の方法で検出されるウイルスとしては、ＲＮＡまたはＤＮＡをゲノムとするものの両方が挙げられ、限定されない。例えば、二本鎖ＲＮＡウイルス（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス（＋鎖型）、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス（－鎖型）、二本鎖ＤＮＡウイルス（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖プラス鎖ＤＮＡウイルス（＋鎖型）、一本鎖マイナス鎖ＤＮＡウイルス（－鎖型）、が例示される。特に限定はされないが、本発明の方法により検出されるウイルスとしては、例えばヒトに感染するウイルス［インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９、コロナウイルス、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、等）、エボラウイルス、狂犬病ウイルス、ノロウイルス等］が例示される。非ヒト動物に感染するウイルスも好適な検出対象であり、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する牛白血病ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ；牛伝染性リンパ腫ウイルスとも呼ばれる）、アスファウイルス科（Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ）に属するアフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ　ｓｗｉｎｅ　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）に属する豚熱ウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｓｗｉｎｅ　ｆｅｖｅｒ，ＣＳＦＶ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）に属する口蹄疫ウイルス等が挙げられる。
　本発明において標的核酸の検出は、好適には核酸増幅法により実施される。公知の核酸増幅法としては、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｌｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＷＧＡ法（Ｗｈｏｌｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＭＤＡ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＥＡＲ法（Ｎｉｃｉｎｇ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＨＤＡ法（Ｈｅｌｉｃａｓｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＰＡ法（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＩＢＡ法（Ｓｔｒａｎｄ－Ｉｎｖａｓｉｏｎ　Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｉｔｏｎ）、ＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等、が例示されるが、それらのいずれもが本発明に使用することができる。増幅物の検出は、増幅反応後の反応液をゲル電気泳動法など通常の分析方法に供して増幅核酸の量及び塩基長を分析することにより実施できる。また、インターカレーター法、ＴａｑＭａｎ法、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ法、Ｃｙｃｌｉｎｇ　ｐｒｏｂｅ法、モレキュラー・ビーコン法、電気化学的ＤＮＡ検出方法等によりリアルタイムに増幅核酸を検出・定量することもできる。これらの核酸増幅法やリアルタイム検出法は数多くの総説により解説されており、当業者に周知である。さらに、これらの増幅法や検出法のためのキットも多数市販されていることから、当該キットを本発明の検出方法に使用することが可能である。
　以下、ＰＣＲ法により標的核酸を検出する本発明の方法について説明する。ＰＣＲ法は１以上のプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する耐熱性のポリペプチド、ｄＮＴＰｓを主な構成要素とする反応液を温度サイクル装置で処理する核酸検出技術であり、広く普及している。ＰＣＲを実施するための酵素類やキットが多数市販されているが、それらを本発明の方法に使用することもできる。
　本発明の方法においてＰＣＲで標的核酸を検出する場合は、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写活性を有するポリペプチド（逆転写酵素）と、前記ｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を増幅するための、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有するポリペプチド(ＤＮＡポリメラーゼ)を使用することができる。なお、ＲＮＡの検出が行われない場合には逆転写酵素は不要である。前記の逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼは、それぞれ別のポリペプチドであってもよく、又は両活性を併せ持つ単一のポリペプチドであってもよい。
　前記逆転写酵素としては、例えば、ＨＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｃ　ｔｈｅｒｍ．ポリメラーゼ、及びThermus thermophilus由来のポリメラーゼ（Ｔｔｈポリメラーゼ）、さらに例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴａｓｅ、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（登録商標）ＲＴａｓｅ、ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ　（商標）ＲＴａｓｅ、Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ　ＲＴａｓｅ、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ　ＲＴａｓｅ等が例示される。
　ＤＮＡポリメラーゼとしては、ファミリーＡ（ＰｏｌＩ型）に属するＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ（α型）に属するＤＮＡポリメラーゼ、前記２種のポリメラーゼの混合物、のいずれもが好適に使用できる。好適には耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが使用される。前記ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されるものではないが、例えば好熱性真正細菌由来のThermus aquaticus由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ）、Thermus thermophilus由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ）等や、好熱性古細菌由来のThermococcus kodakaraensis　ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ）、Pyrococcus furiosus由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ）等を用いることができる。特定の実施形態では、正確性に優れたα型ＤＮＡポリメラーゼ（又はファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ）を用いることが好ましい。α型ＤＮＡポリメラーゼとしては特に限定はされないが、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ又はＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）のような市販のポリメラーゼを使用することができる。さらに逆転写活性とＤＮＡポリメラーゼ活性を有する単一のポリペプチドであってもよく、例えばＴｔｈポリメラーゼが例示される。
　上記逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼ、又は逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に適合するものであれば天然型であっても変異体であってもよい。例えば、耐熱性を高めた逆転写酵素変異体や反応速度が向上したＤＮＡポリメラーゼ変異体等が例示される。
　本発明の検出方法において、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼ、又は逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、反応前の非特異的増幅を防止するためにこれら酵素の抗体を組み合わせたホットスタート酵素であってもよい。さらにＰＣＮＡなどの伸長因子や核酸増幅反応の効率を向上させることが知られている各種の物質、例えば界面活性剤、ウシ血清アルブミン、酸性高分子物質、両性アミノ酸等を組み合わせてもよい。
　本発明の方法において核酸増幅法に使用されるプライマー対は、標的核酸に含まれる任意の領域を増幅できるように設計されているものであれば、その配列には特に限定はない。ＲＮＡを標的とする場合は、別途ｃＤＮＡ合成用のプライマーを準備してもよく、増幅用プライマー対の一方のプライマーを逆転写反応に使用してもよい。
　逆転写反応ならびに核酸増幅反応の条件（反応温度、反応時間、熱サイクルの回数等）は適宜設定すればよい。例えば、市販のＰＣＲキット、ＲＴ－ＰＣＲキットを使用する場合はこれら製品に推奨されている条件や、それを変更した条件で反応を実施することができる。使用するプライマーの塩基配列や鎖長、増幅されるＤＮＡ断片の鎖長等を考慮して反応条件を設定すべきことは、当業者には周知である。
　並行して複数のＰＣＲ試験を実施する場合、反応後に生成した増幅ＤＮＡ断片が反応前の他の反応液へ混入すると誤った試験結果を生み出す。このような反応液の汚染を防止する方法が知られている。鎖中にウラシル（Ｕ）が取り込まれているＤＮＡにウラシル－Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を作用させると、このＤＮＡはウラシルの位置で切断される。ｄＵＴＰを含有するＰＣＲ反応液を用いて増幅されたＤＮＡ断片はウラシルを含有するが、この増幅ＤＮＡ断片が反応実施前の他の反応液（ｄＵＴＰと易熱性ＵＮＧを含有する反応液）に混入した場合には、反応開始前に反応液をＵＮＧの作用する温度に保温することで、混入ＤＮＡを分解して鋳型としての機能を失わせることができる。続いて行われるＰＣＲの温度サイクルでＵＮＧは失活するため、増幅時にはＵを取り込んだＤＮＡの分解は起こらない。本発明の検出方法においても、ｄＵＴＰと易熱性のＵＮＧを含む反応液を使用して相互汚染を防ぐことができる。
　本発明の検出方法に使用される核酸増幅反応液は、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼ、又は逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含み、これらの酵素がその活性を発揮しうる組成の溶液である。ＲＴ－ＰＣＲ法により核酸増幅を実施する場合、当該反応液には最適なｐＨを保つための緩衝成分、二価金属塩（マグネシウム塩、マンガン塩等）、ｄＮＴＰが含まれるが、さらに中性塩、界面活性剤やその他の成分を含有させてもよい。この反応液は、検出しようとする標的核酸上の特定の領域を増幅するためのプライマー対や検出用核酸プローブ（例えば消光プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　Ｐｒｏｂｅ；Ｑプローブ）、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ）等を含んでいてもよい。あるいは、検出用核酸プローブの代わりにインターカレーター色素（例えばＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ、ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標））等を含んでいてもよい。さらに核酸増幅反応に使用されるその他の試薬を含んでいてもよい。さらに核酸増幅反応は、反応阻害確認などの目的で、標的核酸とは異なる配列を有する内部標準核酸、当該内部標準核酸を検出するためのプライマー対と検出用核酸プローブを組み合わせたマルチプレックス検出であってもよい。
　本発明の検出方法は、核酸増幅を阻害する成分や光学的な検出手段に適さない成分が低減または除去された血液由来試料を核酸増幅反応に供することを特徴とする。したがって、本発明の検出方法は、増幅産物を光学的に検出する手段、例えばインターカレーター法、ＴａｑＭａｎ法、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ法、Ｃｙｃｌｉｎｇ　ｐｒｏｂｅ法、モレキュラー・ビーコン法等を利用するリアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲに好適である。
　また、本発明の検出方法において、ひとつの反応液で２以上の標的核酸を同時に増幅し、検出することができる。複数の標的核酸のそれぞれについてプライマー対を作製してこれらを含有する反応液を使用することにより、各標的核酸に由来するＤＮＡ断片を増幅することができる。例えば、同じ遺伝子上の異なる領域をそれぞれ標的核酸としてもよく、異なる遺伝子、例えば試料中に存在する可能性のある複数の微生物の遺伝子を標的としてもよい。増幅断片は、各標的核酸に固有の鎖長を電気泳動や融解曲線分析によって確認する方法や、標的核酸ごとに異なる標識プローブを用いる方法により検出することができる。この場合、各標的核酸に対するプローブは別個の標識を付されていてもよく、もしくは同一の標識を付されていてもよい。即ち、検出する目的によって複数波長検出にしてもよく、１波長検出であってもよい。当該標識プローブは、ＦＲＥＴ法、非ＦＲＥＴ法に基づく蛍光標識の組み合わせ、あるいは、蛍光標識と消光標識の組み合わせであってもよい。前記蛍光標識としては、ＦＡＭ、ＣＹ５、ＲＯＸあるいはＨＥＸ等が例示される。前記消光標識としては、ダーククエンチャーと呼ばれるエクリプス（登録商標）やＢＨＱ（登録商標）系の標識が好適に使用できる。
　前記の複数の標的核酸はＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んでいてもよい。反応液に、標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡ合成とその断片の増幅のためのプライマー、前記ＲＮＡと異なる標的核酸である標的ＤＮＡからのＤＮＡ増幅のためのプライマーと、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を使用することにより、試料中の標的ＲＮＡと標的ＤＮＡとを同時に検出することができる。前記１．の方法により色素成分が低減された血液由来試料を使用した場合、本発明を特に限定するものではないが、例えばブタ血液試料中の豚熱ウイルス（一本鎖ＲＮＡウイルス）、アフリカ豚熱ウイルス（二本鎖ＤＮＡウイルス）を同時に検出することができる。この際、それぞれのウイルスの検出に使用されるプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば、それぞれのウイルスを区別して検出することが出来る。またウイルスを区別する必要がない場合は、両プローブを同じ蛍光色素で標識しておいてもよい。
　複数の標的核酸を検出するための核酸増幅反応液は、同じ反応条件で各標的核酸を特異的かつ感度よく増幅できるように、適切に設計されたプライマー／プローブを含有する。また、試料中に存在する場合にはすべての標的核酸からの増幅が起こるように適切な反応条件を設定することも必要である。当該反応条件は、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲとして周知の条件を参照して決定することができる。この際、温度、保温時間やサイクル数は標的とする配列、プライマーやプローブの鎖長に応じて適宜調整すればよい。
　本発明の検出方法は、血液試料中に存在する可能性のある感染性微生物、例えばウイルスの検出に有用である。本発明は、特に限定するものではないが、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、等）、エボラウイルス、牛白血病ウイルス、アフリカ豚熱ウイルス、豚熱ウイルス、口蹄疫ウイルス等の検出に有用である。
　本発明の検出方法は、核酸増幅反応を阻害する物質や増幅産物の光学的検出の支障となる物質が低減または除去された血液由来試料を使用することを特徴とする。そのため、逆転写反応及び核酸増幅反応に持ち込む鋳型量を多くすることができ、試料中の標的核酸の検出感度を高くすることができる。例えば反応容量５０μｌあたり、全血量に換算して１２μｌ相当以下、好ましくは６μｌ相当以下の試料（本発明の方法で処理された血液由来試料）の持ち込みを可能とする。
　３．本発明の標的核酸検出キット
　本発明のキットは、前記の、本発明の標的核酸検出方法に使用するためのキットであり、前記１．の血液由来試料中の色素成分の低減方法に使用されるプロテアーゼを含むことを特徴とする。本発明のキットはさらに、標的核酸検出試薬を含む。標的核酸検出試薬は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼなど、核酸増幅法（例えばＰＣＲ法）のための試薬であってもよい。さらに、キットは、核酸増幅反応液の調製に必要な緩衝成分、二価金属塩、ｄＮＴＰ、中性塩等を含有していてもよい。標的核酸検出試薬はまた、核酸増幅法で得られる増幅物を光学的に検出するための試薬であってもよい。
　上記標的核酸検出試薬として、標的核酸の増幅および検出に使用されるプライマーやプローブを含むキットも本発明のキットに包含される。標的核酸の塩基配列をもとに核酸増幅用プライマーを設計する方法は当業者によく知られており、例えばプライマー設計ソフトを使用して、望ましい核酸増幅の特異性や増幅効率が得られる配列を選定することができる。検出用プローブもプライマーと同様の方法で設計することができる。プローブは、適切な蛍光物質や消光物質を付加することにより、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブやＱプローブ、モレキュラー・ビーコンとして使用可能なプローブに加工される。プローブに代えてインターカレーターを含むキットも本発明のキットの一態様である。本発明のキットは、標的核酸の不検出が逆転写および／または増幅反応の阻害によるものではないことを確認するための、内部標準核酸増幅用のプライマー対と検出用核酸プローブ、あるいは参照核酸、参照核酸増幅用のプライマー対と参照核酸検出用のプローブ、を含んでいてもよい。
　本発明のキットに含まれる各種のコンポーネントは、それぞれ別の容器に収納され、用時に血液由来試料の前処理（色素成分の低減）、核酸増幅反応液の調製を実施するように構成されていてもよい。また、別の態様としては、試料以外の、核酸増幅反応に必要な成分のすべてを含み、本発明の方法により適切に処理された試料と混合するだけで反応液を調製できるプレミックス形態の核酸増幅試薬と、試料の前処理用の試薬とを含むキットが提供される。
　以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：血液由来試料からの色素成分除去
　１０μｌのプロテイナーゼＫ溶液（３５０Ｕ／ｍｌ、以降の実施例においても同濃度の溶液を使用した）又は２％ドデシル硫酸ナトリウム溶液のいずれかを、０．２ｍｌ容量のマイクロ遠心チューブに入れ、ここに抗凝固剤としてＥＤＴＡが添加されたブタ全血（以下、ＥＤＴＡ血）４０μｌを添加してピペッティングで混合した。チューブをサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＩＩＩ　タカラバイオ社製、ＴＰ９５０）に挿入して、混合物を９５℃で５分加熱した後に、１０,０００×ｇで２分間の遠心分離を行った。遠心後のチューブ中の混合物の状態を目視等により観察したところ、プロテイナーゼＫを添加した全血では透明な液体の上清（上清液）が形成されているのに対し、ドデシル硫酸ナトリウムを添加したものでは全体的に凝固しており、沈殿と分離した上清は見られなかった。
実施例２：血液由来試料におけるプロテイナーゼＫの添加量および熱処理後の遠心分離条件
　表１に記載した量のプロテイナーゼＫ溶液（以後、「ＰｒｏＫ」ともいう）と全血（ブタＥＤＴＡ血）をマイクロ遠心チューブに入れてピペッティングで混合し、サーマルサイクラー（ＴＰ９５０）で９５℃、５分間加熱した。加熱後のチューブを卓上遠心機（チビタン：メルクミリポア社製）にセットし、２,０００×ｇで１０秒、２０秒、６０秒または１２０秒間遠心分離した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　遠心後のチューブ中の混合物の状態を目視等により観察した。プロテイナーゼＫの混合比に関わらず、すべてのチューブで沈殿と分離した上清が形成されていた。遠心時間１０秒では上清に濁りが認められ、２０秒では軽減されたものの濁りは残っていた。６０秒および１２０秒の遠心ではほぼ濁りのない上清が得られているが、１２０秒の方がより透明であった。
実施例３：種々の血液由来試料における本発明の効果
　プロテイナーゼＫ溶液または蒸留水５μｌをマイクロ遠心チューブに入れ、ブタ血清、ブタＥＤＴＡ血、または抗凝固剤としてヘパリンが添加されたブタ全血（以下、ヘパリン血）それぞれ４５μｌを添加してピペッティングにより混合した。次いでチューブをサーマルサイクラー（ＴＰ９５０）で９５℃、５分加熱した後に２,０００×ｇで２分遠心分離した。比較のため、ブタ血清、ブタＥＤＴＡ血、またはブタヘパリン血それぞれ５０μｌのみを入れたチューブも同様に加熱処理と遠心分離を行った。遠心後のチューブ中の混合物の状態を目視等により観察した。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、ブタヘパリン血４５μｌに、サーモリシン溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）５μｌまたはプロナーゼ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）５μｌを添加、混合して同様に熱処理と遠心分離を行った。その結果、これらのプロテアーゼを使用した場合も透明な上清と沈殿とが形成されることが確認された。
　本発明の方法は、血清、ＥＤＴＡ血、ヘパリン血のすべてに適用可能であることが分かった。
実施例４：本発明の方法における熱処理の温度条件
　マイクロ遠心チューブに入れたプロテイナーゼＫ溶液５μｌに、ブタヘパリン血４５μｌを添加してピペッティングにより混合した。次いでチューブを種々の温度（８０℃、８３℃、８６℃、８９℃、９２℃、９５℃、９８℃および９９．９℃）で３分間加熱した後に、２,０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を採取した。加熱処理は、チューブをセットしたサーマルサイクラー（タカラバイオ社製、ＴＰ９５０）の温度を２５℃から平均４．３℃／秒で各温度に昇温させ、設定温度到達後、３分間保持することにより実施した。採取された上清を観察したところ、８３℃より低い温度での熱処理で得られた上清には濁りがあった。また８３℃で処理したものは若干の粘性があり、８０℃で処理したものは明らかな粘性があった。
　各温度の処理で得られた上清それぞれの２００～８００ｎｍの吸収スペクトルをＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（サーモフィッシャー社製　光路長０．１ｍｍ）で測定した。測定の対照には蒸留水を用いた。すべての上清は約４１５ｎｍ付近に極大吸収があり、また、波長に関わらず、処理温度が高いほど吸光度が低くなることが示された。各上清の４１５ｎｍにおける吸光度と処理温度との関係を図１に示す。
　図１から明らかなように、熱処理の温度と吸光度はおおよそ指数的な減衰関係にあり、加熱温度が高いほどより透明な上清が得られること、加熱温度が低いほど上清に残る色素成分が増加し、また粘性が高くなることが明らかとなった。
実施例５：本発明の方法における熱処理の条件
　マイクロ遠心チューブに入れたプロテイナーゼＫ溶液５μｌにブタヘパリン血４５μｌを添加し、ピペッティングにより混合した。次いでチューブを２５℃のサーマルサイクラー（ＴＰ９５０）にセットし、表３に示される種々の昇温速度（２５℃～９８℃にわたっての平均速度）で９８℃まで加熱し、その後３分間保持した。また、９８℃のヒートブロックにチューブを挿入し、３分間保持する加熱も実施した。加熱終了後のチューブを２,０００×ｇで２分間遠心して上清を採取した。採取された上清の状態を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次いで、サーマルサイクラーを使用した加熱処理で得られた上清それぞれの４１５ｎｍにおける吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計で測定した。測定の対照には蒸留水を用いた。各上清の４１５ｎｍにおける吸光度と昇温速度との関係を図２に示す。
　図２から明らかなように、熱処理の昇温速度と上清の吸光度はおおよそ指数的な減衰関係にあり、昇温速度が０．５℃／秒を下回ると色素成分の除去の程度が著しく低下した。また、ヒートブロックを使用した場合は４．３℃／秒で温度を上昇させたものよりも４１５ｎｍにおける吸光度が低い（より透明度の高い）上清が得られた。
実施例６：本発明の方法による色素の除去効果
　蒸留水５μｌまたはプロテイナーゼＫ溶液５μｌをマイクロ遠心チューブに入れ、ブタヘパリン血４５μｌを添加してピペッティングにより混合した。次いでプロテイナーゼＫ溶液との混合物に関して、チューブを９８℃のヒートブロックで３分加熱した後、チューブを２,０００×ｇで２分間遠心して上清を採取した。なお、蒸留水との混合物は、加熱処理すると凝固し（表２参照）、次に示す測定ができないため加熱処理は行わなかった。採取された上清、および全血と蒸留水との混合物のそれぞれの４１５ｎｍにおける吸光度を実施例５と同様にして測定した。なお、以上の試験は異なる３種のブタヘパリン血について行った。
　結果を表４に示す。表４に示されるように、プロテイナーゼＫ溶液（ＰｒｏＫ）を添加して処理した群では、蒸留水添加群の３％以下まで吸光度が減少していた。このことから、本発明の方法により色素成分の９７％以上が除去されることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例７：核酸の検出方法および保存性
　表５に示す種々の混合比となるようマイクロ遠心チューブにプロテイナーゼＫ溶液とブタＥＤＴＡ血またはブタ血清を添加し、ピペッティングにより混合した。得られた混合物５０μｌを９５℃で３分間加熱し、その後に２,０００×ｇで２分間遠心分離して上清を採取した。この上清１８μｌ、または対照として生理食塩水１８μｌに、ＲＮＡ溶液［新型コロナウイルスポジティブコントロール（ＲＮＡ）（タカラバイオ社製、ＲＣ３５１Ａ）を２００倍希釈したもの］２μｌを添加して室温で５分間または７０分間静置した。次いでこれら試料中のＲＮＡを定量的逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲにより検出した。
　定量的ＲＴ－ＰＣＲは以下の操作により実施した。Ｔａｋａｒａ　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　＆　Ｆｌｕ　ダイレクトＰＣＲ検出キット（タカラバイオ社製、ＲＤ０１１）に含まれる反応液とプライマー・プローブ液、滅菌水、前記のポジティブコントロール含有試料２μｌを使用して、全量３０μｌの反応液を調製した。サーマルサイクラー（ＴＰ９５０）を使用し、５２℃、５分、９５℃、１０秒の後、９５℃、５秒、６０℃、３０秒を１サイクルとする４５サイクルの反応を行い、反応中のＣｙ５の蛍光をモニターすることにより新型コロナウイルスＲＮＡを検出した。反応は２連で実施した。
　結果を表５に示す。なお、表中のΔＣｔは５分静置試料のＣｔ値に対する７０分静置試料でのＣｔ値の遅れを示す。
　本試験ではすべての試料から添加されていたＲＮＡが検出された。増殖曲線から決定された各反応におけるＣｔ値（平均）に大きな差はなく、また、試験群と対照のＣｔ値、ΔＣｔ値にも有意な差は見られなかった。この結果より、本発明の方法で得られた処理試料では逆転写反応や定量的ＰＣＲの阻害が認められないこと、処理試料中のＲＮＡの分解もないこと、が示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例８：ヒト全血試料中の核酸の検出
　市販のヒト全血３ロットを使用し、実施例７と同じ操作を行って上清を得た。この上清９μｌ、または対照として生理食塩水９μｌに、Ｖｉｒｕｓ　Ｔｅｓｔ　Ｋｉｔ　（ＨＩＶ，　ＨＴＬＶ，　ＨＣＶ，　ＨＢＶ，　ＰａｒｖｏＢ１９）　Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製、ＲＲ２７３Ａ）に付属するＤＮＡ溶液（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｍｉｘ　（７）－２）１μｌを混合して試料を調製し、そのうち２μｌを以下に示すＲＴ－ＰＣＲに供した。
　ＲＴ－ＰＣＲは次の操作により実施した。前記のＫｉｔのコンポーネントおよび試料２μｌを使用して、全量２５μｌの反応液を調製した。ただし、プライマー・プローブはＨＩＶ１　ｐｏｌ　Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ　Ｍｉｘ－２を用いた。サーマルサイクラー（ＴＰ９５０）を使用し、４２℃、５分、９５℃、３０秒の後、９５℃、５秒、５６℃、３０秒を１サイクルとする４５サイクルの反応を行い、反応中のＦＡＭの蛍光をモニターした。反応は２連で実施した。
　その結果、まず、本発明の方法によって前処理することにより、ヒト全血からも透明な上清が得られ、また、標的ＤＮＡの増幅曲線から導かれるＣｔ値（平均）は生理食塩水で３０．４３であったのに対し、ヒト全血から採取された上清ではそれぞれ３０．４６、３０．２６、３０．２３であった。このように、ヒト全血試料でも本発明による色素の低減および核酸検出方法が有効であった。
実施例９：本発明の標的核酸検出方法を利用した血液中のウイルスの検出
　生理食塩水またはブタＥＤＴＡ血３６μｌに、研究用の非感染性ウイルス粒子であるＮＡＴｔｒｏｌ　ＳＡＲＳ－Ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）Ｓｔｏｃｋ　４μｌをそれぞれ添加してウイルス含有試料を調製した。マイクロ遠心チューブに入れた１０μｌのプロテイナーゼＫ溶液に、このウイルス含有試料４０μｌを添加し、ピペッティングにより混合し、サーマルサイクラー（ＴＰ９５０）で９５℃、５分の加熱処理を行った。その後に２,０００×ｇで２分遠心分離して上清を採取した。この上清２μｌ、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ダイレクトＰＣＲ検出キット（タカラバイオ社製、ＲＤ００１）に含まれる反応液、プライマー・プローブ液、滅菌水を使用し、前記キットの説明書に記載された方法（定量的ＲＴ－ＰＣＲ）でウイルスＲＮＡの検出を行った。反応は２連で実施した。
　結果を表６に示す。表中のΔＣｔは生理食塩水でのＣｔ値（平均）に対するＥＤＴＡ血でのＣｔ値の遅れを示す。生理食塩水、ＥＤＴＡ血の両方からウイルスＲＮＡが検出された。また、両者でのＣｔ値には大きな差はなかった。すなわち、本発明の血液試料の処理方法で前処理を行った場合には、血液試料に由来する物質による反応阻害や検出妨害はなく、信頼性の高い血中のウイルス検出が可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例１０：マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲを用いた本発明の標的核酸検出方法
　本発明の方法によって前処理した血液試料から、ＡＳＦウイルス／ＣＳＦウイルスのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲを用いてウイルス核酸を検出した。実験にはあらかじめＣＳＦウイルス（日本２０１８年分離株）を感染させて飼育した豚の全血試料を用いた。実験体となる豚にＣＳＦウイルスを接種後、２日目～７日目までの６日間、１日ごとに全血を採取した。また、血液採取時に豚の発熱・症状を観察した。以下の実験には血液採取後１日冷蔵保管した全血試料を使用した。
　０．２ｍｌの８連チューブに入れたプロテイナーゼＫ溶液５μｌに全血試料４５μｌを添加後、ボルテックスミキサーにより混合した。次いでこの８連チューブを、あらかじめ８９℃に加温されているＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）　ＰｒｏＦｌｅｘ（商標）　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）にセットし、９８℃まで加熱した。この間の温度上昇時間は１５秒であった。次いで９８℃で３分加熱した後、４０℃まで冷却してそのまま３０秒維持した。装置から８連チューブを取り出し、小型微量遠心機　ＭｕｌｔｉＳｐｉｎ（ＴＯＭＹ社製）で２分遠心して上清を採取した。この上清２μｌ、ならびにＣＳＦＶ／ＡＳＦＶ　Ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ　＆　Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ（ｗｉｔｈ　ＲＯＸ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｄｙｅ）キット（タカラバイオ社製、ＲＣ２１２Ａ）に含まれる反応液、プライマー・プローブ液、滅菌水を使用して総量２５μｌの反応液を調製し、前記キットの説明書に記載された方法（定量的ＲＴ－ＰＣＲ、７５００Ｆａｓｔ（ＡＢＩ社製））でウイルスＲＮＡの検出を行った。反応は１連で実施した。
　その結果を表７に示す。豚＃１、２ともにＡＳＦウイルスと交差反応することなく、ＣＳＦウイルスのＲＮＡ由来増幅物が検出された。したがって、本発明の方法によって血液由来試料の前処理を行った場合にはマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲが可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例１１：ＡＳＦ実験感染イノシシの全血を用いた本発明の評価
　あらかじめＡＳＦウイルス　アルメニア分離株（　Ａｒｍｅｎｉａ／０７）を筋肉内接種したウイルス接種イノシシ２頭（＃１、＃２）とウイルス未接種のイノシシ２頭（＃３、＃４）を用意して、同じ区画で飼育した（以下、それぞれ、ウイルス接種イノシシ及び同居イノシシと称す）。ウイルス接種イノシシについては、ウイルス接種前及び接種後２～４日の間、同居イノシシについては、ウイルス接種イノシシとの同居前及び同居後の７～１３日の間で全血を採取し、－８０℃で凍結保存し試料とした。また、血液採取時にイノシシの発熱・症状を観察した。以下の実験では、ウイルス接種イノシシ（＃１）及び同居イノシシ（＃３）について、ウイルス接種前及び同居前、並びにウイルス接種後及び同居後に採取して凍結してあった全血を融解し全血試料として使用した。
　０．２ｍｌの８連チューブに入れたプロテイナーゼＫ溶液５μｌに全血試料４５μｌを添加後、ボルテックスミキサーにより混合した。このチューブについて実施例１０と同様に加熱、冷却、ならびに遠心分離操作を行い、上清を採取した。この上清２μｌ、ならびにＣＳＦＶ／ＡＳＦＶ　Ｄｉｒｅｃｔ　ＲＴ－ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ　＆　Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ（ｗｉｔｈ　ＲＯＸ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｄｙｅ）キット（タカラバイオ社製、ＲＣ２１２Ａ）に含まれる反応液、プライマー・プローブ液、滅菌水を使用して総量２５μｌの反応液を調製し、前記キットの説明書に記載された方法（定量的ＲＴ－ＰＣＲ、７５００Ｆａｓｔ（ＡＢＩ社製））でウイルスＤＮＡの検出を行った。反応は１連で実施した。
　結果を表８に示す。ウイルス接種イノシシ（＃１）、同居イノシシ（＃３）ともにＡＳＦのＤＮＡが検出された。本発明の方法によって前処理を行った場合には、凍結融解後の全血からも問題なくウイルスを検出することが可能であることが示された。なお、発熱・症状が観察される前にウイルスを検出できることから、早期のウイルス感染対策に有効であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　本発明の方法を用いることで、血液由来試料中の色素成分等の検出・増幅阻害物質が低減又は除去されるので、核酸の単離を要することなく、血液由来試料中に含まれるウイルス等由来の核酸を検出することができるため、臨床診断の分野に大きく貢献できる。

Claims (15)

  1. 　（１）血液由来試料とプロテアーゼを混合する工程、
    　（２）工程（１）の混合物を熱処理する工程、および
    　（３）固液分離により工程（２）の熱処理物から液相を採取する工程、
    を包含する、血液由来試料中の色素成分の低減方法。
  2. 　血液由来試料が全血、血清または血漿である請求項１の方法。
  3. 　プロテアーゼがプロテイナーゼＫである請求項１または２に記載の方法。
  4. 　熱処理が８９℃以上の温度で実施される請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　（１）血液由来試料とプロテアーゼを混合する工程、
    　（２）工程（１）の混合物を熱処理する工程、
    　（３）固液分離により工程（２）の熱処理物から液相を採取する工程、および
    　（４）工程（３）で得られた液相中の標的核酸を検出する工程、
    を包含する、血液由来試料中の標的核酸の検出方法。
  6. 　血液由来試料が全血、血清または血漿である請求項５の方法。
  7. 　プロテアーゼがプロテイナーゼＫである請求項５または６に記載の方法。
  8. 　熱処理が８９℃以上の温度で実施される請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　標的核酸を検出する工程が、標的核酸を核酸増幅法で増幅して得られる増幅物を光学的に検出することを含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　核酸増幅法がＰＣＲ法である請求項９記載の方法。
  11. 　標的核酸がウイルスまたは微生物に由来する核酸である請求項５～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　請求項５～１１のいずれか１項に記載の方法に使用するための標的核酸検出キットであって、プロテアーゼおよび標的核酸検出試薬を含有するキット。
  13. 　標的核酸検出試薬が、核酸増幅法で得られる増幅物を光学的に検出する試薬である請求項１２記載のキット。
  14. 　標的核酸検出試薬がＰＣＲ法のための試薬である請求項１２記載のキット。
  15. 　プロテアーゼがプロテイナーゼＫである請求項１２～１４のいずれか１項に記載のキット。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102851277A (zh) * 2012-09-07 2013-01-02 重庆市畜牧科学院 一种简单快速的肉鸭粪样总dna提取方法
CN106148326A (zh) * 2016-07-27 2016-11-23 上海美吉生物医药科技有限公司 宏基因组dna的提取方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102851277A (zh) * 2012-09-07 2013-01-02 重庆市畜牧科学院 一种简单快速的肉鸭粪样总dna提取方法
CN106148326A (zh) * 2016-07-27 2016-11-23 上海美吉生物医药科技有限公司 宏基因组dna的提取方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NIU YANQIN, XIA SIJIAN, SU MINGYANG, DANG QUANJIN, KANG KANG, LI LI, GOU DEMING: "Direct S-Poly(T) Plus assay in quantification of microRNAs without RNA extraction and its implications in colorectal cancer biomarker studies", JOURNAL OF TRANSLATIONAL MEDICINE, BIOMED CENTRAL, vol. 17, no. 1, 1 December 2019 (2019-12-01), XP093197740, ISSN: 1479-5876, DOI: 10.1186/s12967-019-2061-6 *

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