CN112725543A

CN112725543A - 人源诺如病毒gii.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法

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Publication number: CN112725543A
Application number: CN202110240204.2A
Authority: CN
Inventors: 薛亮; 秦智伟; 吴清平; 高珺珊; 蔡伟程; 张菊梅; 蔡淑珍; 李滢; 陈谋通; 曾海燕; 吴诗
Original assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2041-03-04
Also published as: CN112725543B

Abstract

本发明公开了人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法。其包括正向引物、反向引物和探针；所述的正向引物选自RF1或RF2；反向引物选自RR1‑RR4中的任一条。本发明靶向针对诺如病毒主要流行型GII.4基因型，10分钟即可完成检测，检测限可达到每个反应2.67×10¹copies，对GI型诺如病毒、星状病毒、札幌病毒、轮状病毒、肠病毒、腺病毒，以及GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.8、GII.17等其他型别诺如病毒均无扩增信号；本发明应用实际临床样本检测，结果显示与荧光定量RT‑PCR的契合度达到了88.90％。本发明建立的检测方法灵敏度高、特异性好、周期短，适用于现场实时检测，可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求的领域。

Description

人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于微生物安全检测技术领域，具体涉及人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)最新统计，发达国家每年约30％的人口患食源性疾病，发展中国家情况更加严重；全球每年约有6亿食源性疾病病例，死亡人数高达42万，其中诺如病毒是造成全球急性胃肠炎的最常见食源性病原，每年对人群造成巨大健康威胁与社会经济损失。诺如病毒能够感染各年龄段人群，并且没有明显的季节性，一年四季均可感染，婴幼儿、老人更是发病的高危人群。

诺如病毒在世界范围内流行甚广，2020年2月美国路易斯安那州一所赌场诺如病毒爆发导致至少200人感染，我国也是诺如病毒流行的主要国家之一，在多数省市被发现是引起急性胃肠炎的主要病原之一，对公共卫生安全造成极大的隐患。广东地区是我国的诺如病毒主要流行地区，早在2013年广州大学城暴发数百人诺如病毒感染，最近一次为2020年2月广东梅州暴发大规模诺如病毒感染，发病近400例。自2014年以来，诺如病毒已上升为首位散发性腹泻病原，年感染率超过20％。因此，我国加强食源性诺如病毒防控研究已迫在眉睫。

诺如病毒属杯状病毒科、正义单链RNA病毒，基因组大约7.5～7.7kb，包括3个开放阅读框，分别编码非结构蛋白前体、衣壳蛋白VP1和次衣壳蛋白VP2，是最常见的导致病毒性腹泻的主要病原之一。据报道，其最低感染剂量仅为18颗病毒粒子。诺如病毒因其致病剂量低、抗复杂基质能力强、传播途径多样化和丰富的遗传多样性导致其在防控上有一定难度。有研究表明，GII型诺如病毒是引起诺如病毒暴发的主要基因型，其中GII.4是流行中占主导地位，且食堂和餐厅是引起聚集性感染的主要场所。目前，基于诺如病毒的难培养性，即使有相关报道提到了诺如病毒的斑马鱼复制系统，但还没有出现稳定的人源诺如病毒感染模型，仍没有针对诺如病毒开发出有效的疫苗与抗毒药物。因此需要迫切地开发诺如病毒快速检测方法，新型快速、灵敏、特异检测技术的不断发展，是提升我国诺如病毒防控能力的基础，具有重要意义。

目前诺如病毒检测的主流方法仍聚焦于分子检测方法，聚合酶链式反应(PCR)是目前检测各种食源性病毒、致病菌的金标准和主要手段，但PCR技术存在耗时长、设备要求高、并且需要经验丰富的检测人员，在资源匮乏地区的现场检测中受到了极大限制。重组酶介导恒温扩增(RAA)是一种新型的核酸等温扩增技术，与PCR技术不同的是，RAA反应依赖于酶的作用，而非大幅度的温度变化，能够在常温下(39℃左右)20min内完成反应，具有操作简单、反应速度快、特异性高等特点。因此，RAA相对于PCR技术更具有POCT的潜力。

因此，有必要挖掘诺如病毒主要流行基因型的特征性核酸识别靶点，以及建立一种高效、快速检测诺如病毒的检测方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组。

本发明的人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组，其包括正向引物、反向引物和探针；

所述的正向引物为RF1或RF2；

所述的反向引物选自RR1-RR4中的任一条；

所述的探针为ROP；

RF1：5’-ATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAG-3’；其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

RF2：5’-CAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAG-3’；其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

RR1：5’-TCAGATGGGTTGGCGTCACTCGACGCCATCTTC-3’；其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

RR2：5’-GACCCATCAGATGGGTTGGCGTCACTCGACGCC-3’；其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

RR3：5’-TTGGCTGTGGACCCATCAGATGGGTTGGCGTC-3’；其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

RR4：5’-ACGAGGTTGGCTGTGGACCCATCAGATGGGTTGGC-3’；其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；

ROP：5’-TCAGACCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAAFHQGGCTCCCAGTTTTGT-3’。

优选，所述的正向引物为RF1、反向引物为RR4。

本发明的第二个目的是提供一种人源诺如病毒GII.4型的鉴别试剂盒，其包括上述人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组。

本发明的第三个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的人源诺如病毒GII.4型的检测方法，包括以下步骤：

以上述人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组作为扩增引物，以待测样品的cRNA作为模板，采用RT-RAA进行扩增反应，观察扩增曲线是否起峰，如有起峰则证明待测样品中含有GII.4型诺如病毒；如果没有起峰则证明待测样品中不含GII.4型诺如病毒。

优选，所述的RT-RAA扩增体系为：在冻干酶基础反应单元中加入25μL缓冲液VI，正向引物2.1μL，反向引物2.1μL，探针0.6μL，逆转录酶1μL(50U)，RNase Inhibitor 1μL，纯化水13.2μL，充分混匀，将充分混匀后的溶液作为基础反应液，每18μL作为新的反应单元，加入模板1μL，混匀，最后在管壁上加入1μL醋酸镁，离心将醋酸镁甩入反应单元。

优选，所述的RT-RAA扩增程序为：39℃恒温反应。

本发明靶向针对诺如病毒主要流行型GII.4基因型，10分钟即可完成检测，检测限可达到每个反应2.67×10¹copies，对GI型诺如病毒、星状病毒、札幌病毒、轮状病毒、肠病毒、腺病毒，以及GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.8、GII.17等其他型别诺如病毒均无扩增信号；本发明应用实际临床样本检测，结果显示与荧光定量RT-PCR的契合度达到了88.90％。本发明提供了可适用于重组酶介导恒温扩增检测的人源诺如病毒GII.4基因型特征性核酸识鉴别引物，建立的检测方法灵敏度高、特异性好、周期短，适用于现场实时检测，可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求的领域。

附图说明：

图1：GII.4型诺如病毒特征性核酸识别靶点的分布情况；

图2：GII.4型诺如病毒RT-RAA检测方法引物组筛选结果；

图3：GII.4型诺如病毒RT-RAA检测方法特异性评价结果；

图4：GII.4型诺如病毒RT-RAA检测方法灵敏度评价结果。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：GII.4型诺如病毒特征性核酸识别靶点的挖掘

通过发明人对我国华南地区诺如病毒流行监测中积累的序列，以及结合部分公共数据，进行生物信息学分析与靶点挖掘工作。在2013至2018年间，发明人共收集腹泻样本1175份，从中获得诺如病毒及其序列140份，其中GII.4型序列占93份。同时结合公共数据库序列，共筛选出216株代表性毒株序列，其中包含5株GII.1、20株GII.2、20株GII.3、55株GII.4、7株GII.5、20株GII.6、8株II.7、1株GII.8、2株GII.10、20株GII.12、6株GII.13、5株GII.14、1株GII.16、20株GII.17、1株GII.20、2株GII.21、3株GII.22、15株GII.24、5株GII.25；在此基础上，通过序列比对筛选获得GII.4型诺如病毒特征性核酸识别位点(图1)

实施例2：GII.4型诺如病毒的快速检测方法

(1)引物设计

根据实施例1中的所述序列设计特异性RT-RAA扩增引物探针组(包括正向引物和反向引物)，引物探针组序列如下表1。

表1用于GII.4型诺如病毒RAA的引物与探针列表

*For probe modifications:F＝dT-FAM；H＝THF；Q＝dT-BHQ1.Probe has 3′C3-spacer for blocking extension.

检测诺如病毒的方法，步骤如下：

S1 cRNA模板制备：采用含有扩增模板的cRNA作为待检模板；

S2 RT-RAA检测体系：

在冻干酶基础反应单元中加入25μL缓冲液VI，正向引物2.1μL，反向引物2.1μL，探针0.6μL，逆转录酶1μL(50U)，RNase Inhibitor 1μL，纯化水13.2μL，非剧烈充分混匀。将充分混匀后的溶液作为基础反应液，每18μL分装至八连管中作为新的反应单元，加入对应模板1μL，混匀，最后在管盖(管壁)上加入1μL醋酸镁(200mmol/L)，通过离心将醋酸镁甩入反应单元，RT-RAA扩增程序为：39℃恒温反应；通过荧光定量PCR仪，每30s采集一次荧光。

正向引物为：RF1或RF2，反向引物是：RR1-4中的任一条，探针是ROP。

S3：观察扩增曲线是否起峰(实验组荧光响应值高于空白对照组)，如有起峰则证明对应样品中含有GII.4型诺如病毒；如果没有起峰则证明样品中不含目标物质。

选择GII.4型诺如病毒，按照High Pure Viral RNAKit(Magen)制造商说明提取RNA，以其作为模板，各引物组经RT-RAA扩增后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，由图2A可得，引物组RF1-RR3与RF1-RR4(反应体系中未加探针)为RT-RAA最佳引物组合；由图2B可得，反应体系中加入ROP探针后，RF1-RR4-ROP的组合扩增效果最优。

实施例3 RT-RAA检测方法的特异性评价结果

选择GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、星状病毒、札幌病毒、轮状病毒、肠病毒、腺病毒进行特异性评价(病毒临床样本由实验室提供)，按照High Pure Viral RNAKit(Magen)制造商说明提取RNA，将RNA作为模板对所建立方法进行特异性评价；

选择GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.8、GII.17型诺如病毒进行型内特异性评价(病毒临床样本由实验室提供)，按照High Pure Viral RNAKit(Magen)制造商说明提取RNA，将RNA作为模板对所建立方法进行特异性评价。

参照实施例2的方法进行检测，引物和探针为：RF1、RR4、ROP。

结果如图3所示，由图3可得，常见食源性病毒中只有GII.4型诺如病毒显示出特异性起峰，其他食源性病毒毒株均无特异性起峰(图3A)；在常见的GII型诺如病毒中仍只有GII.4型诺如病毒显示出特异性起峰，其余GII型诺如病毒均无特异性起峰(图3B)，说明本方法具有良好的特异性。

实施例4：RT-RAA检测方法的灵敏度评价结果

将已测定浓度GII.4型诺如病毒的cRNA标准品用Nuclease-free Water进行十倍梯度稀释(2.67×10⁷copies/tube—2.67×100copies/tube，n＝8)，将梯度稀释后的cRNA分别作为模板进行RT-RAA反应，以评价其灵敏度，具体检测方法参照实施例2，引物和探针为：RF1、RR4、ROP。

结果如图4所示，由图4可得，本发明的方法的检测限为2.67×10¹copies/tube。

实施例5：新方法在实际检测中的应用评价

(1)从哨点医院获得急性腹泻患者的临床粪便样本38份，提取RNA后按照本发明方法(检测方法参照实施例2，引物和探针为：RF1、RR4、ROP)进行检测。

(2)通过荧光定量Real-time RT-PCR进行对比检测。在此过程中，采用cRNA质控品，观测两种检测方法的检测效率。

结果如表2，总共38份粪便样本中，RT-RAA方法检出16份GII.4型诺如病毒阳性样本；RT-qPCR方法检出18份GII型诺如病毒阳性样本，与荧光定量RT-PCR的契合度达到了88.90％。

表2诺如病毒RT-RAA检测方法与金标准RT-qPCR检测方法在临床样本检测中的应用

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心），广东环凯生物科技有限公司

<120> 人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atttttacgt gcccagacaa gagccaatgt tcag 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

caagagccaa tgttcagatg gatgagattc tcag 34

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

tcagatgggt tggcgtcact cgacgccatc ttc 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

gacccatcag atgggttggc gtcactcgac gcc 33

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ttggctgtgg acccatcaga tgggttggcg tc 32

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

acgaggttgg ctgtggaccc atcagatggg ttggc 35

Claims

1.人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组，其特征在于，包括正向引物、反向引物和探针；

所述的正向引物为RF1或RF2；

所述的反向引物选自RR1-RR4中的任一条；

所述的探针为ROP；

RF1：5’-ATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAG-3’；

RF2：5’-CAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAG-3’；

RR1：5’-TCAGATGGGTTGGCGTCACTCGACGCCATCTTC-3’；

RR2：5’-GACCCATCAGATGGGTTGGCGTCACTCGACGCC-3’；

RR3：5’-TTGGCTGTGGACCCATCAGATGGGTTGGCGTC-3’；

RR4：5’-ACGAGGTTGGCTGTGGACCCATCAGATGGGTTGGC-3’；

ROP：5’-TCAGACCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAAFHQGGCTCCCAGTTTTGT-3’。

2.根据权利要求1所述的人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组，其特征在于，所述的正向引物为RF1、反向引物为RR4。

3.一种人源诺如病毒GII.4型的鉴别试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组。

4.一种非疾病的诊断和治疗目的的人源诺如病毒GII.4型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

以权利要求1或2所述的人源诺如病毒GII.4型的特征性核酸鉴别引物组作为扩增引物，以待测样品的cRNA作为模板，采用RT-RAA进行扩增反应，观察扩增曲线是否起峰，如有起峰则证明待测样品中含有GII.4型诺如病毒；如果没有起峰则证明待测样品中不含GII.4型诺如病毒。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的RT-RAA扩增体系为：在冻干酶基础反应单元中加入25μL缓冲液VI，正向引物2.1μL，反向引物2.1μL，探针0.6μL，逆转录酶1μL(50U)，RNaseInhibitor1μL，纯化水13.2μL，充分混匀，将充分混匀后的溶液作为基础反应液，每18μL作为新的反应单元，加入模板1μL，混匀，最后在管壁上加入1μL醋酸镁，离心将醋酸镁甩入反应单元。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的RT-RAA扩增程序为：39℃恒温反应。