CN115725785A - 一种快速高效的荧光rt-raa检测rva的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速高效的荧光RT‑RAA检测RVA的方法，属于生物检测技术领域。本发明提供了一种RT‑RAA荧光法检测RVA的引物，所述引物包括如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.5所示的引物，本发明还提供了一种RT‑RAA荧光法检测RVA的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的引物，该引物可利用RT‑RAA荧光检测方法快速高效的检测样品中的RVA，且灵敏度高，重复性好。

Description

一种快速高效的荧光RT-RAA检测RVA的方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种快速高效的荧光RT-RAA检测RVA的方法。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus,RVs)是一种导致腹泻的重要肠道病原体之一，是一种人畜共患病毒，主要引起仔猪呕吐、腹泻、脱水，造成仔猪生长缓慢，严重引起死亡。在过去的研究中发现，轮状病毒可感染多种宿主，包括人、牛、猪、马、狗和猫等动物，并发现其可跨越物种障碍进行种间传播。

自1969年首次在细胞培养中分离到RVA以来，A型轮状病毒已在美洲、非洲、欧洲、亚洲和澳大利亚州被发现。我国自1981年首次爆发RVA疫情以来，A型轮状病毒对我国养猪业造成了巨大损失。为了便于临床诊断和流行病学研究，需要建立一种快速有效的RVA检测方法。目前用于A型轮状病毒的临床检测方法主要包括酶联免疫吸附试验、RT-PCR、RT-qPCR和LAMP等。但由于这些方法存在耗时、复杂、成本高等问题，并且需要经验丰富的技术人员。

重组酶辅助扩增技术(Recombinase aided amplification,RAA)是近年新兴的一种核酸检测技术，该方法通过加入重组酶和结合蛋白，使得核酸扩增能在39℃条件下快速进行，一般在15-30min即可判定结果，RAA已被广泛应用于病原体的快速检测，但是目前没有使用RAA检测RVA的报道。

发明内容

本申请的目的之一在于提供一种RT-RAA荧光法检测RVA的引物，所述引物包括如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的引物。

本发明的目的之二在于提供一种RT-RAA荧光法检测RVA的探针，所述探针包括如SEQ ID NO.7所示序列的探针，或在SEQ ID NO.7所示序列基础上经修饰的探针。

优选地，所述修饰包括：第29位核苷酸T上标记FAM荧光基团6-羧基荧光素(I6FAMDT)、第31位核苷酸T上标记荧光淬灭基团BHQ1(IBHQ1DT)，第29位核苷酸T和32位核苷酸T中间用四氢呋喃(THF)dSpacer修饰(序列IDSP所示)，第46位核苷酸用C3-spacer修饰。

本发明的目的之三在于提供一种RT-RAA荧光法检测RVA的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的引物，和/或上述探针。

优选地，所述试剂盒还包括RT-RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液，所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG10000。

优选地，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。

更优选地，所述阳性质控品为含有RVA的特异性基因序列，所述阴性质控品为不含RVA特异性序列的RT-RAA扩增体系。

本发明的目的之四在于提供上述引物或试剂盒在体外检测样品中是否存在RVA的应用，所述应用为非诊断目的的。

优选地，所述引物在反应体系中的终浓度为0.42mM，所述探针在反应体系中的终浓度为0.12mM。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的引物可利用RT-RAA荧光检测快速高效的检测样品中的RVA，该方法灵敏度高，重复性好。

附图说明

图1为实施例1中RT-PCR结果图，其中M为DL2000 Marker，1-9为引物组合，10为阴性对照。

图2为实施例1中引物筛选结果图，其中①-⑨为引物组合，⑩为试剂盒阳性对照。

图3为实施例1中RT-RAA特异性试验结果图，其中1-7依次为RVA、PRRSV、JEV、APPV、SVV、CSFV、GETV病毒RNA，8为无核酸水。

图4为实施例1中RT-RAA灵敏度试验结果图，其中使用RVA质粒转录本为标准品，1-7依次为1×10⁵-1×10^-1拷贝/反应，8为无核酸水。

具体实施方式

实施例1

1.毒株和样品

Porcine rotavirus-A(PoRVA)毒株由四川农业大学分子生物技术中心分离鉴定(相关文献：杨文宇，朱玲，周远成，郭万柱，徐志文.猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律[J].中国兽医学报,2014,34(02):192-198.)。110份临床样品采集自2021年7月-2022年1月四川地区发生腹泻的猪小肠内容物、粪便等组织。

2.引物和探针设计

从GenBank上下载不同地区的A型轮状病毒的结构基因VP6基因序列(保守区域基因同源性在99.0％-100％)，使用DNAMan软件分析保守区域并设计一对RT-PCR引物以及三对RT-RAA的引物和探针(表1)。

表1引物和探针序列

上述表1中的RT-RAA-P为探针，该探针是在以下序列上进行修饰而获得的：CCGGCATTAAATTTAAGAGAATTAACTT/T/G/T/AATTCATCTGATTTA(SEQ ID NO.7)；

具体的是在其第29位核苷酸T上标记FAM荧光基团6-羧基荧光素(I6FAMDT)、第31位核苷酸T上标记荧光淬灭基团BHQ1(IBHQ1DT)，第29位核苷酸T和32位核苷酸T中间用四氢呋喃(THF)dSpacer修饰(序列IDSP所示)，第46位核苷酸(3’末端核苷酸)用C3-spacer修饰。

VP6基因序列如SEQ ID NO.10所示：

SEQ ID NO.10：

GGCTTTAAAACGAAGTCTTCGACATGGAGGTTCTGTACTCATTGTCAAAAACTTTGAAAGATGCTAGAGACAAAATTGTTGAAGGTACATTGTACTCAAATGTGAGTGACTTAATTCAGCAATTTAATCAAATGGTAGTTACTATGAATGGAAATGACTTTCAAACGGGAGGGATTGGAAATTTGCCAATTAAAAACTGGACTTTTGATTTTGGATTACTGGGTACTACTTTGCTTAATTTAAATGCAAATTATGTTGAAAATGCTAAAACTACCATTGAATACTTTATTGATTTTATAGATAATGTATGTATGGATGAAATAGCCAGAGAATCACAACGAAATGGGATAGCTCCACAATCTGAAGCATTAAGGAAATTGTCCGGCATTAAATTTAAGAGAATTAACTTTGATAATTCATCTGATTACATTGAGAATTGGAATTTACAAAACAGACGACAACGTACCGGATTTGTGTTTCATAAACCTAATATACTTCCATATTCAGCATCATTTACTCTGAATAGATCACAGCCAGCGCATGATAATTTGATGGGGACGATGTGGATTAATGCCGGATCAGAAATTCAAGTAGCTGGGTTTGATTATTCGTGCGCTTTTAATGCACCAGCAAATATTCAGCAGTTTGAACATGTTGTGCCGTTAAGACGTGCTCTCACAACAGCTACAATCACTCTATTACCAGACGCTGAAAGATTCAGCTTTCCGAGAGTTATCAACTCAGCTGATGGTACTACTACATGGTATTTTAATCCAGTTATTCTAAGACCGAGCAATGTGGAAGTTGAATTTCTATTGAACGGACAAATAATTAACACATATCAAGCACGATTTGGAACTATCATAGCCAGGAATTTTGATACTATCCGTTTGTCATTTCAGTTAGTACGACCACCAAATATGACACCAGCAGTTGCGAATCTATTTCCGCAAGCACCGCCATTCATATTTCATGCTACTGTCGGACTTACATTACGAATTGAATCTGCAGTTTGTGAATCTGTGCTTGCGGACGCTTCTGAAACTTTATTGGCAAATGTAACGGCAGTTCGTCAGGAATATGCTATACCAGTAGGACCAGTATTTCCACCAGGTATGAATTGGACAGAGCTGATTACCAATTATTCACCTTCAAGAGAAGATAACTTGCAACGTGTTTTCACAGTAGCCTCTATCAGAAGCATGCTGATTAAGTGAGGACCAGGCTAACTACCTGGTATCCGATCTTAACCAATATGTAACTATGTCAAGTCACTCAGACTCTACAAGTAAGGGTGTGATTTCATACTCGCTACGTAGAGTAACTGTCTGAATGATGTAGTGAGAGGATGTGACC。

3.RNA提取

使用RNA提取试剂盒提取病毒和样品的RNA，并放置于-80℃保存。

4.标准品制备

使用RT-PCR引物对RVA病毒进行扩增，将扩增产物胶回收后与pMD19-T载体进行连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞培养后提取质粒并测定浓度。构建的质粒经测序验证，纯化分装后于-80℃保存。

5.RT-RAA体系和引物筛选

荧光RT-RAA使用荧光型RT-RAA核酸扩增试剂盒，包括逆转录和DNA扩增的酶。RT-RAA反应体系总体积为50μL(表2)。体系配置好后立即转移到预热为39℃的荧光定量PCR仪中，将变性温度、退火温度、延伸温度都设定为39℃，每个循环为1min，设定30个循环。以无核酸酶水做阴性对照。

将RT-RAA的三条正向引物和三条反向引物组合为9对引物，1-9依次为F1/R1，F1/R2，F1/R3，F2/R1，F2/R2，F2/R3，F3/R1，F3/R2，F3/R3。使用组合引物进行普通RT-PCR检测，将扩增条带进行胶回收后与pMD19-T克隆载体连接，将连接产物送生工进行测序，比对测序结果是否是RVA序列。使用组合的9对引物对RVA病毒RNA进行检测，反应温度为39℃，反应时间为30min，通过荧光值和起峰时间对引物进行筛选。

表2RT-RAA反应体系

试剂	浓度	体积/μL
			Buffer	-	25
正向引物	10μM	2.1
			反向引物	10μM	2.1
探针	10μM	0.6
			ddH<sub>2</sub>O	-	15.2
模板	-	2
			启动剂	-	3

上表1中的Buffer为20mM Tris-HCL,10mM(NH₄)₂SO₄，15mM KCl,2mM MgSO₄，0.1％Tween-20，pH 8.8。

上表1中的启动剂为280mM的乙酸镁。

6.RT-RAA灵敏度和特异性试验

采用1×10^-1-8×10⁵拷贝/反应的梯度稀释质粒转录本来评估该方法的灵敏度。使用从样本中提取的PRRSV、JEV、APPV、SVV、CSFV、GETV，对该方法的特异性进行检验。

7.临床样品检测

对采集的110份临床样品进行荧光RT-RAA检测，并与高等人建立的GETV SYBRGreen Ⅰ RT-qPCR进行平行对比。SYBR Green Ⅰ RT-qPCR体系和反应程序见表4。

表4RT-qPCR反映体系和反应程序

8.引物筛选结果

9对引物均可通过RT-PCR扩增RVA(图1)，扩增产物经测序鉴定为RVA序列。在9对引物中，RT-RAA-F2和RT-RAA-R2的反应体系中荧光值最大，起峰早(图2)。以RT-RAA-F2和RT-RAA-R2的组合为RT-RAA的引物进行后续试验。

9.RT-RAA特异性和灵敏度试验结果

只有RVA产生荧光信号，其他病毒和无核酸酶水均未发出荧光信号(图3)。

使用1×10^-1-1×10⁵拷贝/反应的梯度稀释质粒转录本评价方法的敏感性，各稀释度测定8次以评估该方法的重复性(表3)。该方法的最低检测极限为5拷贝/反应,模板浓度越高，荧光值越大，起峰时间越早(图4)。

表3重复性试验结果

10.临床样品检测结果

在110份临床样品中，RT-RAA检测出9份阳性样品，实时RT-qPCR检测出9份阳性样品。两种检测方法的符合率为100％(表4)。

表4

组织	样品数	SYBRGreenⅠRT-qPCR阳性数	RT-RAA阳性数
				小肠内容物	23	2	2
粪便	87	7	7

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种RT-RAA荧光法检测RVA的引物，其特征在于，所述引物包括如SEQ ID NO.2和SEQID NO.5所示的引物。

2.一种RT-RAA荧光法检测RVA的探针，其特征在于，所述探针包括如SEQ ID NO.7所示序列的探针，或在SEQ ID NO.7所示序列基础上经修饰的探针。

3.根据权利要求2所述的RT-RAA荧光法检测RVA的探针，其特征在于，所述修饰包括：第29位核苷酸T上标记FAM荧光基团6-羧基荧光素、第31位核苷酸T上标记荧光淬灭基团BHQ1，第29位核苷酸T和32位核苷酸T中间用四氢呋喃(THF)dSpacer修饰，第46位核苷酸用C3-spacer修饰。

4.一种RT-RAA荧光法检测RVA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物，和/或权利要求2或3所述的探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液，所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG10000。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有RVA的特异性基因序列，所述阴性质控品为不含RVA特异性序列的RT-RAA扩增体系。

8.权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的探针或权利要求4或5或7所述的试剂盒在体外检测样品中是否存在RVA的应用，所述应用为非诊断目的。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述引物在反应体系中的终浓度为0.42mM，所述探针在反应体系中的终浓度为0.12mM。

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