CN111424117A

CN111424117A - 一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光rt-raa检测试剂盒

Info

Publication number: CN111424117A
Application number: CN202010329573.4A
Authority: CN
Inventors: 李世波; 付永锋; 王秋景; 程训佳; 周晶雨; 戚婉君; 朱立君; 张浙恩
Original assignee: Zhoushan hospital; Fudan University
Current assignee: Zhoushan hospital; Fudan University
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2020-07-17

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，公开了一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT‑RAA检测试剂盒，包括：上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物，序列如SEQ ID NO:2所示；探针，序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的试剂盒具有98.39%的正确率，特异度达98.95%，每反应检测灵敏度在95%的概率下达到241copies/反应，可实现在39℃等温条件下25分钟内完成新型布尼亚病毒的检测，具有操作简便、快速、灵敏、适用于现场快速检测的特点。

Description

一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT- RAA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测体系。

背景技术

发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是一种由新型布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTSV)感染引起的严重的传染性疾病，临床表现主要有发热、血小板减少、白细胞减少、胃肠道症状和肝功能异常，病死率高达6.4-30％。SFTSV属于布尼亚病毒科(Banyangvirus)，白蛉病毒属(Phenuiviridae)，可感染人、动物和蜱等多种宿主，目前认为长角牛蜱是主要的传播载体。我国的流行地区主要为东部、中部省份的山地、丘陵地区。自2009年SFTSV在我国被首次分离鉴定后，我国的 SFTS病例数逐年上升，在韩国、日本、美国等全世界多个国家也相继有病例被报道。近年多项研究发现SFTS可通过密切接触或气溶胶进行人间传播。因此，SFTS已成为一个严重的公共卫生问题。

现阶段对SFTSV的实验室检测方法主要病毒分离鉴定、血清抗体检测和病毒核酸检测。

病毒分离鉴定：需要采集早期SFTS患者急性期血清标本，体外接种Vero E6细胞，通过显微镜或分子生物学手段对接种效果进行确认。分离得到SFTSV是诊断SFTS最有力的病原学证据，但相关实验操作须专业技术人员在III级生物安全实验室进行，且耗时1-2周，不适用于临床实验室检测和现场快速检测。

血清抗体检测：通过血清中和试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者血清中的新型布尼亚病毒IgM、IgG抗体。血清中和试验耗时较长，且成本较高，不常用于临床实验室检测。ELISA检测抗体的敏感度较高，操作较为简便、快速。但是对新型布尼亚病毒IgM抗体的研究发现部分患者急性期IgM抗体可呈阴性，恢复期转阳；而对IgG抗体的检测需要患者急性期、恢复期双份血清标本，不适用于现场快速检测。

病毒核酸检测：目前已有多种检测患者血清中SFTSV RNA的方法，临床常用的包括逆转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)等方法，均具有高灵敏度和特异度。基于PCR的检测通常需要精密昂贵的仪器和专业检测人员来避免污染对检测结果的影响；RT-LAMP敏感性很高，但需要4-6条引物，增加了引物设计的难度和复杂性，且存在一定的假阳性率，影响其作为现场诊断技术的应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测试剂盒，具有98.39％的正确率，特异度达98.95％，每反应检测灵敏度在95％的概率下达到241copies/反应，可实现在39℃等温条件下25分钟内完成新型布尼亚病毒的检测，具有操作简便、快速、灵敏、适用于现场快速检测的特点。

本发明的具体技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测特异性引物，包括：

上游引物，序列如SEQ ID NO：1所示：

ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；

下游引物，序列如SEQ ID NO：2所示：CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC。

第二方面，本发明提供了一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测探针，序列如SEQ ID NO：3所示：

AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer][dT-BHQ1]AGGGACCCAA TCTCAA-[C3 Spacer]；

其中，dT-FAM为连接FAM荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer为四氢呋喃残基，dT-BHQ1 为连接BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，C3 Spacer为3‘端间臂。

第三方面，本发明提供了一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测试剂盒，包括：

上游引物，序列如SEQ ID NO：1所示：

ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；

下游引物，序列如SEQ ID NO：2所示：CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC；

探针，序列如SEQ ID NO：3所示：

AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer][dT-BHQ 1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3 Spacer]；其中，dT-FAM为连接FAM荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer为四氢呋喃残基，dT-BHQ1为连接BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，C3 Spacer为3‘端间臂。

根据GenBank中收录的新型布尼亚病毒参考序列(收录号NC_043452.1，NC_043451.1，NC_043450.1)，使用CD-Search(www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)筛选保守区域，并将筛选所得高度保守序列，与GenBank中收录的新型布尼亚病毒序列运用BLAST对该序列的同源性进行验证，根据该高度保守序列进行实时荧光RT-RAA检测引物、探针的设计及筛选。本发明团队通过经验总结发现RAA技术对于引物设计的要求与常规PCR有所不同，要求寡核苷酸引物长度在30-35核苷酸(nt)之间；序列中避免回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；5’端前3-5nt避免重复鸟嘌呤核苷酸(G)序列；目标片段长度小于500碱基对；引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；通过试验优化筛选出最佳引物对。

此外，实时荧光RT-RAA技术还需要一条寡核苷酸探针。探针设计要求序列不与特异性引物识别位点重叠；长度为46-52nt；序列中避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。还要求对探针的四个位点进行修饰：将距离5’端＞30nt处的核苷酸替换为一个四氢呋喃(THF)，作为核酸外切酶的识别位点，THF距离3’端＞15nt；对THF位点上游的一个胸腺嘧啶核苷酸(T)标记荧光基团，THF位点下游的一个T标记淬灭基闭，两个基团的间距为2-4nt；并对探针3’端进行间臂修饰以阻断聚合酶的DNA链合成。

根据以上引物和探针设计要求，以筛选所得L片段高度保守序列作为目标基因片段进行上、下游引物及探针设计，各设计序列如下：

上游引物：

RAA-S1：5′-ATAAGATCAATCATGATTTCACGTTTTCTGGC-3′；SEQ ID NO：4

RAA-S2：5′-ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG-3′；SEQ ID NO：1

RAA-S3：5′-GGTTGATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTAT-3′；SEQ ID NO：5

下游引物：

RAA-AS1：5′-AACTCCTCCTGACGACACTACAATAACCCC-3′；SEQ ID NO：6

RAA-AS2：5′-CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC-3′；SEQ ID NO：2

RAA-AS3：5′-ACAGAACTCCTCCTGACGACACTACAATAAC-3′；SEQ ID NO：7

探针：

RAA-P1：5′-AGCGTATAAGATCAATCATGATTTCACGTTT[dT-FAM]

[dSpacer][dT-BHQ1]GGCCTGTCAAAGA-[C3 Spacer]-3′；SEQ ID NO：8

RAA-P2：5′-AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer]

[dT-BHQ1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3 Spacer]-3′；SEQ ID NO：3；

引物委托Invitrogen(上海)公司合成，探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

首先以RAA-AS3为下游引物，与3条上游引物和2条探针分别组合，进行RT-RAA 检测，通过比较不同组合的阈值时间和荧光强度，筛选出阈值时间段较短，荧光强度较高的组合RAA-S1/AS3/P2和RAA-S2/AS3/P2。

再以RAA-S1、RAA-S2为上游引物，RAA-P2为探针，与3条下游引物分别组合，进行RT-RAA检测，筛选出阈值时间段最短，荧光强度最高的组合RAA-S2/AS2/P2。经过对扩增产物进行测序核对序列，确定最佳引物、探针组合为RAA-S2/AS2/P2，扩增产物长度为 128bp，具体如下：

进一步对新型布尼亚病毒RT-RAA检测引物、探针浓度筛选，使用的引物、探针组合具体如下：

上游引物：5′-ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG-3′；SEQ ID NO：1

下游引物：5′-CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC-3′；SEQ ID NO：2

探针：RAA-P2：5′-AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer]

[dT-BHQ1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3 Spacer]-3′；SEQ ID NO：3；其中，dT-FAM为连接FAM荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer为四氢呋喃残基，dT-BHQ1为连接BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，C3 Spacer为3‘端间臂。

配置不同浓度的引物、探针，如表1所示：

	浓度1(μ mol/L)	浓度2(μ mol/L)	浓度3(μ mol/L)
				上游引物	5	10	15
下游引物	5	10	15
				探针	0.5	1	2

配置20μL反应体系，每个反应体系中加入0.84μL不同浓度的上游引物，0.84μL不同浓度的下游引物和1.2μL不同浓度的探针，进行RT-RAA检测，阈值时间段长短和荧光强度高低，筛选出阈值时间段最短，荧光强度最高的引物、探针浓度组合：上游引物最优浓度：10μmol/L， 0.84μL；下游引物最优浓度：10μmol/L，0.84μL；探针最优浓度：0.5μmol/L，1.2μL。

进一步地，试剂盒还包括：

反应缓冲液，购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号：F00R01；

无RNA酶的水；

冻干酶粉，购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号：F00R01；

RNA模板；

醋酸镁溶液，购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号：F00R01。

作为优选，以总体积为20μL计，试剂盒中各组分的含量如下：

上游引物0.75-1μL，8-12μ mol/L；

下游引物0.75-1μL，8-12μ mol/L；

探针1-1.4μL，0.4-0.6μ mol/L；

反应缓冲液8-12μL；

无RNA酶的水1.12-5.12μL；

酶粉0.3-0.5个反应单元；

RNA模板1-5μL；

醋酸镁溶液0.8-1.2μL，260-300mmol/L。最优选地，以总体积为20μL计，试剂盒中各组分的含量如下：

上游引物0.84μL，10μ mol/L；

下游引物0.84μL，10μ mol/L；

探针1.2μL，0.5μ mol/L；

反应缓冲液10μL；

无RNA酶的水5.12μL；

酶粉0.4个反应单元；

RNA模板1μL；

醋酸镁溶液1μL，280mmol/L。第四方面，本发明提供了一种前述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将试剂盒中的组分配制混合后置于反应管中，将所述反应管置于7500Real-Time PCR荧光检测仪中，37-41℃反应20-30min，于激发波长488nm，发射波长520nm的FAM通道每28-32s采集1次荧光值；反应结束后，记录检测样本的阈值时间，即样本荧光值超过荧光阈值所需的时间。

作为优选，所述荧光阈值为根据阴性对照-无RNA酶的水的荧光强度均值及其3倍标准差确定。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：具有98.39％的正确率，特异度达98.95％，每反应检测灵敏度在95％的概率下达到241copies/反应，可实现在39℃等温条件下25分钟内完成新型布尼亚病毒的检测，具有操作简便、快速、灵敏、适用于现场快速检测的特点。

附图说明

图1引物探针筛选过程中荧光强度对比图；

图2为实时荧光RT-RAA检测SFTSV的分析灵敏度和特异度；

图3为实时荧光RT-RAA及RT-qPCR检测结果的Bland-Altman分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

新型布尼亚病毒

Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus SFTSV

副流感病毒

parainfluenza virus PIV

人类疱疹病毒

human herpesvirus HHV

重组酶介导的等温核酸扩增反应

Recombinase-aided amplification RAA

逆转录重组酶介导的等温核酸扩增反应

reverse-transcription RAA RT-RAA

逆转录PCR RT-PCR

实时荧光定量PCR RT-qPCR

检测限

limit of detection LOD

一致性界限

limit of agreement LoA

总实施例

第一方面，一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测特异性引物，包括：

上游引物，序列如SEQ ID NO：1所示：

ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；

第二方面，一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测探针，序列如SEQ ID NO：3所示：

第三方面，一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测试剂盒，以总体积为20μL计，包括：

上游引物0.75-1μL，8-12μ mol/L，序列如SEQ ID NO：1所示：

ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；

下游引物0.75-1μL，8-12μ mol/L，序列如SEQ ID NO：2所示：

CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC；

探针1-1.4μL，0.4-0.6μ mol/L，序列如SEQ ID NO：3所示：

AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM]

[dSpacer][dT-BHQ1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3 Spacer]；其中，dT-FAM为连接FAM荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer为四氢呋喃残基，dT-BHQ1为连接BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，C3 Spacer为3‘端间臂。

反应缓冲液8-12μL；

无RNA酶的水1.12-5.12μL；

酶粉0.3-0.5个反应单元；

RNA模板1-5μL；

醋酸镁溶液0.8-1.2μL，260-300mmol/L。

最优选地，以总体积为20μL计，试剂盒中各组分的含量如下：

上游引物0.84μL，10μ mol/L；

下游引物0.84μL，10μ mol/L；

探针1.2μL，0.5μ mol/L；

反应缓冲液10μL；

无RNA酶的水5.12μL；

酶粉0.4个反应单元；

RNA模板1μL；

醋酸镁溶液1μL，280mmol/L。

第四方面，一种前述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将试剂盒中的组分配制混合后置于反应管中，将所述反应管置于7500Real-Time PCR荧光检测仪中，37-41℃反应25-35min，于激发波长488nm，发射波长520nm的FAM通道每28-32s采集1次荧光值；反应结束后，记录检测样本的阈值时间，即样本荧光值超过荧光阈值所需的时间。

实施例1

材料与方法

1.1标本来源

于2011年1月至2014年12月自舟山医院收集发热伴血小板减少综合征疑似病例血浆标本 120份，分离血清，-80℃保存备用。经巢式PCR检测，其中26例为发热伴血小板减少综合征确诊病例。疑似病例及确诊病例的诊断均依据《发热伴血小板减少综合征防治指南》(2010 版)所述标准。本研究获得了舟山医院伦理委员会的批准[(2016)伦审第(28)号]。

用于分析特异性评价的15种非新型布尼亚病毒感染患者临床标本均来自复旦大学和舟山医院，标本提取得病毒包括副流感病毒1型(parainfluenza virus-1，PIV-1)，PIV-2，麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒，冠状病毒，呼吸道合胞病毒，轮状病毒，腺病毒，人类疱疹病毒1型(human herpesvirus-1，HHV-1)，HHV-2，HHV-3，HHV-5，HHV-6及登革病毒。

1.2核酸提取

取患者血清标本200μL，按照QIAamp Viral RNAMini Kit试剂盒(Qiagen，德国)说明书提取病毒RNA，-20℃保存备用。

1.3引物及探针设计

使用NCBI的CD-Search工具对SFTSV基因组高度保守序列进行检索，选择L片段为待扩增的靶序列。设计实时荧光逆转录重组酶介导的等温核酸扩增反应(RT-RAA)的上游和下游引物及探针。根据L片段的靶序列，设计逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的上、下游引物。将所有引物及探针提交NCBI数据库进行BLAST分析检测其特异性。引物由上海Invitrogen公司合成，探针由上海生工生物工程有限公司合成。

具体引物和探针的序列见表1。

表1引物和探针序列

注：dT-FAM为连接FAM荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer为四氢呋喃残基，dT-BHQ1为连接BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，C3 Spacer为3‘端间臂。

1.4质粒标准品的制备

使用RT-PCR上下游引物(见表1)，以一例确诊病例血清提取RNA为模板(GenBank收录号： KR017845.1)，按照PrimeScript^TM RT-PCR kit试剂盒(TaKaRa，日本)说明书，对L片段中长度为569bp的靶序列进行扩增。RT-PCR扩增产物TA克隆入pMD19-T载体(TaKaRa，日本)，重组质粒转化入大肠埃希菌培养并提取质粒。经酶切线性化和测序验证后，按照生产商说明书使用T7 RNA聚合酶(Thermo Scientific^TM，上海，中国)合成RNA标准品。使用ND-2000c分光光度计(NanoDrop，美国)检测标准品浓度，计算拷贝数，并经梯度稀释得到浓度分别为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10拷贝/μL的标准品，用于进行灵敏度评价。

实时荧光RT-RAA检测反应体系的建立

按照RT-RAAexo kit试剂盒(江苏奇天基因生物公司，中国)说明书配制反应体系，总反应体系为20μL，引物及探针序列见表1。配制反应混合物45μL，包括25μL反应缓冲液，2.1μL上游(10μ mol/L)，2.1μL下游引物(10μ mol/L)，1.2μL探针(1μ mol/L)，14.6μL无RNA 酶的水(RNase free dH₂O)，混匀后加至RT-RAA反应单元冻干酶粉中，使酶融化，充分混匀，将含酶的反应混合物分装至反应管。配制总反应体系20μL，包括18μL含酶的反应混合物， 1μLRNA模板，1μL醋酸镁溶液(280mmol/L)。将醋酸镁溶液加至反应管盖上，合盖后通过离心使醋酸镁溶液加入反应体系，开始反应。轻柔混匀并瞬时离心后，立即将反应管置于7500Real-Time PCR荧光检测仪(Applied Biosystems，加拿大)中，39℃反应30min，于FAM通道(激发波长488nm，发射波长520nm)每30s采集1次荧光值。反应结束后，记录检测样本的阈值时间，即样本荧光值超过荧光阈值所需的时间。荧光阈值根据阴性对照(RNase freedH₂O)荧光强度均值及其3倍标准差确定。

RT-qPCR检测

将RT-qPCR用作临床标本检测评价时的对照检测方法。使用表1中上、下游引物，按照SuperScript^TMIII One-Step RT-PCR System with Platinum^TM Taq DNA Polymerase试剂盒 (Invitrogen，中国)说明书配制总反应体系12.5μL，置于7500Real-Time PCR荧光检测仪 (Applied Biosystems，加拿大)中进行反应，反应条件：逆转录50℃ 15min；预变性95℃2min； 95℃ 15s、56℃ 30s、68℃ 30s，45个循环。反应完成后，记录检测样本的Ct值。

分析灵敏度及特异度评价

使用10⁶～10拷贝/μL共6个浓度梯度的SFTSV标准品进行实时荧光RT-RAA检测，每个浓度梯度进行2次三复孔检测。通过对各浓度标准品的阈值时间和标准品拷贝数进行半对数回归分析，并通过进行probit回归分析计算其95％检测限(limit of detection，LOD)，评价该检测方法的灵敏度。以前述15种非新型布尼亚病毒的核酸为模板进行实时荧光RT-RAA检测，评价该检测方法的特异度。

1.8临床标本检测

采用实时荧光RT-RAA和RT-qPCR的方法对120例发热伴血小板减少综合征疑似病例的血清标本进行同时检测。对两种方法定性及定量检测结果进行一致性分析，评价实时荧光RT-RAA 的临床检测能力。

结果

2.1实时荧光RT-RAA检测反应体系的优化

在不同反应温度、引物及探针组合和浓度条线下进行实时荧光RT-RAA反应，对扩增产物荧光扩增曲线进行比较。结果显示使用表1中所示引物及探针组合，引物浓度为10μ mol/L，探针浓度为0.5μ mol/L，反应温度为39℃时，实时荧光RT-RAA反应扩增效率最高(图1)。

2.2分析灵敏度及特异度评价

对10⁶～10拷贝/μL共6个浓度梯度的SFTSV标准品进行实时荧光RT-RAA检测，结果显示除10拷贝/μL标准品，其余各浓度标准品均可在9.5min内达到荧光阈值，高浓度标准品最快可在1.85min即产生高强度荧光值(图2，A)。半对数回归分析显示模板浓度和阈值时间存在良好的相关性，R²＝0.967(图2，B)。通过比较标准曲线，可见样品模板浓度相同时，实时荧光RT-RAA获得阳性结果所需的阈值时间较RT-qPCR平均缩短10min。根据多次实时荧光RT-RAA检测结果的probit回归分析，计算其95％置信度的检测限为241拷贝/μL(图 2，C)。以一系列非SFTSV病原核酸为模板进行实时荧光RT-RAA检测，均未观察到非特异性扩增(图2，D)。

2.3临床标本检测

用实时荧光RT-RAA方法对120例发热伴血小板减少综合征疑似病例血清标本进行检测，95 例RT-qPCR检测阳性的SFTS患者中，94例RT-RAA检测呈阳性。25例RT-qPCR检测阳性的SFTS患者中，24例RT-RAA检测呈阴性。(表2)。与RT-qPCR相比，实时荧光RT-RAA 检测正确性为98.39％，灵敏度为96.00％(95％CI：80.46％-99.79％)，特异度为98.95％(95％ CI：94.28％-99.95％)。一致性分析显示，实时荧光RT-RAA与RT-qPCR的检测结果一致性良好(kappa＝0.9495，P＜0.001)，仅2例与实时荧光RT-RAA检测结果不一致。

表2 SFTS患者标本实时荧光RT-RAA及RT-qPCR检测结果

利用Bland-Altman分析对实时荧光RT-RAA与RT-qPCR定量检测结果的一致性进行分析，如图3所示，两种方法的一致性良好，21例定量检测结果位于95％一致性界限内。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 舟山医院复旦大学

<120> 一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测试剂盒

<130> 2020

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atcacaatcc agctctctga agcgtataag 30

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

catgttggac agaactcctc ctgacgacac tac 33

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

aggcagcata caggacaaag atagaaaaga gggacccaat ctcaa 45

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ataagatcaa tcatgatttc acgttttctg gc 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ggttgatcac aatccagctc tctgaagcgt at 32

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

aactcctcct gacgacacta caataacccc 30

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

acagaactcc tcctgacgac actacaataa c 31

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

agcgtataag atcaatcatg atttcacgtt tggcctgtca aaga 44

<210> 9

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

aggcagcata caggacaaag atagaaaagt atagggaccc aatctcaagg cgtgttgata 60

tcatggagaa cccgagggtc ttctttgggg ttattgtagt gtcgtcagga ggagttctgt 120

ccaacatg 128

Claims

1.一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测特异性引物，其特征在于包括：

上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示：

ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；

下游引物，序列如SEQ ID NO:2所示：CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC。

2.一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测探针，其特征在于，序列如SEQ ID NO:3所示：AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer][dT-BHQ1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3 Spacer]；

其中，dT-FAM为连接FAM荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer为四氢呋喃残基，dT-BHQ1为连接BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，C3 Spacer为3‘端间臂。

3.一种用于新型布尼亚病毒核酸现场快速检测的实时荧光RT-RAA检测试剂盒，其特征在于包括：

上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示：

ATCACAATCCAGCTCTCTGAAGCGTATAAG；

下游引物，序列如SEQ ID NO:2所示：CATGTTGGACAGAACTCCTCCTGACGACACTAC；

探针，序列如SEQ ID NO:3所示：

AGGCAGCATACAGGACAAAGATAGAAAAG[dT-FAM][dSpacer][dT-BHQ1]AGGGACCCAATCTCAA-[C3 Spacer]；其中，dT-FAM为连接FAM荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，dSpacer为四氢呋喃残基，dT-BHQ1为连接BHQ1荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸，C3 Spacer为3‘端间臂。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括：

无RNA酶的水；

酶粉；

RNA模板；

醋酸镁溶液。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，以总体积为20μL计，试剂盒中各组分的含量如下：

上游引物0.75-1μL，8-12μmol/L；

下游引物0.75-1μL，8-12μmol/L；

探针1-1.4μL，0.4-0.6μmol/L；

反应缓冲液8-12 μL；

无RNA酶的水1.12-5.12 μL；

酶粉0.3-0.5个反应单元；

RNA模板1-5μL；

醋酸镁溶液0.8-1.2μL，260-300mmol/L。

6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述酶粉由UvsX重组酶、单链DNA结合蛋白和扩增酶组成。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，以总体积为20μL计，试剂盒中各组分的含量如下：

上游引物0.84μL，10μmol/L；

下游引物0.84μL，10μmol/L；

探针1.2μL，0.5μmol/L；

反应缓冲液10μL；

无RNA酶的水4.12μL；

酶粉0.4个反应单元；

RNA模板2μL；

醋酸镁溶液1μL，280mmol/L。

8.一种如权利要求3-7之一所述试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：将试剂盒中的组分配制混合后置于反应管中，将所述反应管置于7500 Real-Time PCR荧光检测仪中，37-41℃反应20-30min，于激发波长488nm，发射波长520nm的FAM通道每28-32s采集1次荧光值；反应结束后，记录检测样本的阈值时间，即样本荧光值超过荧光阈值所需的时间。

9.如权利要求8的使用方法，其特征在于，所述荧光阈值为根据阴性对照-无RNA酶的水的荧光强度均值及其3倍标准差确定。