CN113186354B

CN113186354B - 用于检测临床样本中gi.1型诺如病毒的试剂盒及专用引物

Info

Publication number: CN113186354B
Application number: CN202110589863.7A
Authority: CN
Inventors: 朱宝利; 毛梦雨; 律娜; 张瑞芬
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2041-05-28
Also published as: CN113186354A

Abstract

本发明公开了用于检测临床样本中GI.1型诺如病毒的试剂盒及专用引物。本发明提供了引物对Ⅱ。本发明还提供了引物组合，由引物对Ⅰ和引物对Ⅱ组成。本发明还提供了引物对Ⅰ。引物对Ⅱ由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。引物对Ⅰ由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。本发明可用于直接检测粪便中的GI.1型诺如病毒，可以极大地缩短检测的时间，减少检测的费用。本发明应用前景广阔，为检测样本诺如病毒分型信息提供了新的思路。

Description

用于检测临床样本中GI.1型诺如病毒的试剂盒及专用引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于检测临床样本中GI.1型诺如病毒的试剂盒及专用引物。

背景技术

诺如病毒(norovirus)属于杯状病毒科，是一类单正链RNA病毒，基因组大小为7.5-7.7k，直径约为27-37nm，无囊膜。诺如病毒的基因组包含3个开放阅读框(openreading frame，ORF)，ORF1编码包含RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)在内的非结构多聚蛋白，ORF2编码主要衣壳蛋白(VP1)，ORF3编码次要衣壳蛋白(VP2)。根据诺如病毒主要衣壳蛋白VP1的氨基酸同源性的不同，将其划分为10个基因型(GI-GX)，引起人类感染的主要是GI和GII型。不同的基因型又可以进一步划分为不同的亚型，其中GI型划分为9个亚型(GI.1-GI.9)，GII型划分为27个亚型(GII.1-GII.27)。

诺如病毒是一种传染性极强的消化道病毒，随着多个国家轮状病毒疫苗计划免疫的逐步推广，诺如病毒已经取代轮状病毒，成为引起急性肠胃炎的主要病原体，对食品安全和公共卫生造成了很大的威胁。诺如病毒主要经粪-口途径传播，可通过食物、水、呕吐物形成的气溶胶及环境污染等引发疫情，容易在幼儿园、中小学、养老院、酒店及轮船等人口聚集且空间相对封闭的环境爆发流行。诺如病毒引起的临床症状主要表现为恶心、呕吐、发热、腹痛和腹泻等。诺如病毒可以感染各个年龄阶段的人群，其所引起的感染是一种自限性疾病，但在免疫低下的人群、老年人和儿童可以引起严重的并发症。

到目前为止，由于没有有效的方式成功培养诺如病毒，分子水平上的检测是临床上检测诺如病毒的主要方法。不同基因分型的诺如病毒传播方式有所不同，及时得到诺如病毒的分型信息，可以帮助推断传播途径，有助于疫情的调查。目前，获得诺如病毒亚型分型信息主要基于诺如病毒全基因组的获得，耗时长并且费用高，并且市场上没有可以直接获得诺如病毒亚型分型信息的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测临床样本中GI.1型诺如病毒的试剂盒及专用引物。

本发明提供了引物对Ⅱ，由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。所述引物对Ⅱ中，两种引物的摩尔配比为1:1。

本发明还提供了引物组合，由引物对Ⅰ和引物对Ⅱ组成；

引物对Ⅰ由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；

引物对Ⅱ由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。

所述引物对Ⅰ中，两种引物的摩尔配比为1:1。

所述引物对Ⅱ中，两种引物的摩尔配比为1:1。

本发明还提供了引物对Ⅰ，由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。所述引物对Ⅰ中，两种引物的摩尔配比为1:1。

本发明还保护所述引物对Ⅱ或所述引物组合或所述引物对Ⅰ在制备试剂盒中的应用。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物对Ⅱ或所述引物组合或所述引物对Ⅰ。

具体的，所述试剂盒还包括：DreamTaq Green PCR Master Mix(2X)。

具体的，所述试剂盒还包括：KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)。

以上任一所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：

(a)鉴定或辅助鉴定GI.1型诺如病毒；

(b)从诺如病毒中鉴别GI.1型诺如病毒；

(c)鉴定临床样本中是否含有GI.1型诺如病毒；

(d)筛查GI.1型诺如病毒感染者。

本发明还保护所述引物对Ⅱ或所述引物组合或所述引物对Ⅰ或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定GI.1型诺如病毒中的应用。

本发明还保护所述引物对Ⅱ或所述引物组合或所述引物对Ⅰ或所述试剂盒在从诺如病毒中鉴别GI.1型诺如病毒中的应用。

本发明还保护所述引物对Ⅱ或所述引物组合或所述引物对Ⅰ或所述试剂盒在鉴定临床样本中是否含有GI.1型诺如病毒中的应用。

本发明还保护所述引物对Ⅱ或所述引物组合或所述引物对Ⅰ或所述试剂盒在筛查GI.1型诺如病毒感染者中的应用。

引物对Ⅱ的应用中，如果采用引物对Ⅱ进行PCR扩增显示特异扩增产物(209bp)或者采用引物对Ⅱ进行qPCR扩增显示扩增曲线且Ct值为阈值以下，即判断为GI.1型诺如病毒阳性。

引物组合的应用中，引物对Ⅱ和引物对Ⅰ中的至少一个引物对满足如下条件，即判断为GI.1型诺如病毒阳性：如果采用引物对进行PCR扩增显示特异扩增产物或者采用引物对Ⅱ进行qPCR扩增显示扩增曲线且Ct值为阈值以下，即判断为GI.1型诺如病毒阳性。

引物对Ⅰ的应用中，如果采用引物对Ⅰ进行PCR扩增显示特异扩增产物(116bp)或者采用引物对Ⅰ进行qPCR扩增显示扩增曲线且Ct值为阈值以下，即判断为GI.1型诺如病毒阳性。

所述阈值具体可为30。

本发明提供了一种高效、快速、准确地检测GI.1型诺如病毒的方法以及试剂盒。通过本发明提供的方法或试剂盒，可以快速、及时地获得临床样本中诺如病毒的分型信息，时间短且准确性高，可以帮助推断传播途径，有助于疫情的调查。本发明可用于直接检测粪便中的GI.1型诺如病毒，可以极大地缩短检测的时间，减少检测的费用。本发明应用前景广阔，为检测样本诺如病毒分型信息提供了新的思路。

附图说明

图1为实施例2中的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为实施例3中的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为实施例3中的测序图。

图4为实施例4中的qPCR扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、GI.1型诺如病毒检测专用引物的获得

经过大量序列分析设计多种引物，分别通过预实验验证引物性能，最终得到用于鉴定GI.1型诺如病毒的性能最佳的引物对。

引物对Ⅰ如下(靶序列为116bp)：

上游引物F1(序列1)：5’-TTGTAGTTGCAGGGCGAGTT-3’；

下游引物R1(序列2)：5’-CAATGGCAGATTTGGGAGTG-3’。

引物对Ⅱ如下(靶序列为209bp)：

上游引物F2(序列3)：5’-GACCTGCCCTAGTCCTGATT-3’；

下游引物R2(序列4)：5’-CCAAACGACCGTCCAAAGTA-3’。

分别人工合成各条引物。

实施例2、应用引物对检测阳性质粒

一、制备阳性质粒

阳性质粒Ⅰ为环形质粒，如序列表的序列5所示。

阳性质粒Ⅱ为环形质粒，如序列表的序列6所示。

二、应用引物对检测阳性质粒

1、将阳性质粒Ⅰ用双蒸水进行稀释，得到模板溶液Ⅰ；模板溶液Ⅰ中，阳性质粒Ⅰ的浓度为4.105×10⁸/μL。将阳性质粒Ⅱ用双蒸水进行稀释，得到模板溶液Ⅱ；模板溶液Ⅱ中，阳性质粒Ⅱ的浓度为3.94×10⁸copies/μL。

2、取模板溶液，进行PCR扩增，然后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。

PCR扩增的反应体系(25μL)：DreamTaq Green PCR Master Mix(2X)12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板溶液0.5μL，灭菌水10μL。上游引物在体系中的工作浓度为0.4μM，下游引物在体系中的工作浓度为0.4μM。

模板溶液Ⅰ采用引物对Ⅰ。模板溶液Ⅱ采用引物对Ⅱ。

设置用双蒸水代替模板溶液的阴性对照。

PCR扩增的反应条件：95℃预变性3min；95℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环；72℃延伸7min。

电泳条件：120V，40min。

琼脂糖凝胶电泳见图1。图1中：M对应100bp Marker；1对应模板溶液Ⅰ；2对应模板溶液Ⅱ，NTC为阴性对照。

三、检出限

1、将阳性质粒Ⅰ用双蒸水进行梯度稀释，得到模板溶液Ⅰ。将阳性质粒Ⅱ用双蒸水进行梯度稀释，得到模板溶液Ⅱ。

2、取模板溶液，进行qPCR扩增。

qPCR的反应体系(20μL)：KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)10μL，上下引物0.4μL，下游引物0.4μL，模板溶液1μL，无菌水7.8μL，ROX染料0.4μL。上游引物在体系中的工作浓度为0.2μM，下游引物在体系中的工作浓度为0.2μM。

模板溶液Ⅰ采用引物对Ⅰ。模板溶液Ⅱ采用引物对Ⅱ。

qPCR的反应程序：95℃预变性3min；95℃15s，55℃30s，40个循环；95℃15s；60℃1min；95℃30s；60℃15s。

Ct值≤30判断为阳性。

两个引物对的检出限均为4000copies/μL。

实施例3、粪便样本GI.1型诺如病毒的检测

人粪便样本：样本1-5为诺如病毒阳性的人粪便样本，来源于海淀医院肠道门诊；样本6-10为诺如病毒阴性的人粪便样本，来源于海淀医院肠道门诊。

一、制备模板溶液

取人粪便样本，采用试剂盒(QIAGEN RNeasyPowerMicrobiome Kit)提取总RNA，反转录得到cDNA。cDNA为溶液形式，即为模板溶液。

二、进行检测

取模板溶液，分别采用引物对Ⅰ或引物对Ⅱ进行PCR扩增，然后进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳。

PCR扩增的反应体系(25μL)：DreamTaq Green PCR Master Mix(2X)12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板溶液1μL，灭菌水9.5μL。上游引物在体系中的工作浓度为0.4μM，下游引物在体系中的工作浓度为0.4μM。

设置用双蒸水代替模板溶液的阴性对照(NTC)。

电泳条件：120V，40min。

电泳图见图2。图2中的a为引物对I的检测结果，图2中的b为引物对II的检测结果，泳道1-10依次对应样本1-10。样本1-样本10采用引物对I检测的结果均为阴性。样本5采用引物对II检测的结果为阳性，剩余9个样本采用引物对II检测的结果为阴性。因此判断，样本1-4和6-10为GI.1型诺如病毒阴性样本，样本5为GI.1型诺如病毒阳性样本。

三、结果验证

完成步骤二后，回收样本5采用引物对II进行扩增后的特异性PCR扩增产物，进行测序。测序结果见图3。测序结果表明，样本5确实为GI.1型诺如病毒阳性样本。

另外4个诺如病毒阳性样本得到的模板溶液，采用其他引物扩增并测序。其他引物扩增及测序结果表明，编号为1、2、3的样本为GI.6型，编号为4的样本为GI.7型。用于扩增GI.6型的引物：F：5'-GATGTYAATCAGTCAGTCCAGTT-3'；R：5'-TACCCCTAATCTTGCAYAGTTG-3'。用于扩增GI.7型的引物：F：5'-ATTGCTTCACTATGTGGACCCT-3'；R：5'-CATTGGTTGGGAGACTTTGG-3'。Y代表C或T。

实施例4、粪便样本GI.1型诺如病毒的qPCR检测

人粪便样本：样本A为诺如病毒阳性的人粪便样本，来源于海淀医院肠道门诊；样本B为诺如病毒阴性的人粪便样本，来源于海淀医院肠道门诊。

一、制备模板溶液

取粪便样本，采用试剂盒(QIAGEN RNeasyPowerMicrobiome Kit)提取总RNA，反转录得到cDNA。

cDNA为溶液形式，即为模板溶液。

二、进行检测

取模板溶液，采用引物对Ⅱ进行qPCR。

qPCR的反应体系(20μL)：KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)10μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，模板溶液1μL，无菌水7.8μL，ROX染料0.4μL。上游引物在体系中的工作浓度为0.2μM，下游引物在体系中的工作浓度为0.2μM。

设置用双蒸水代替模板溶液的阴性对照。

Ct值≤30判断为阳性。

结果见图4，A对应样本A，B对应样本B，C对应阴性对照。可以看出，设计的专一性引物能够通过qPCR的方式检测出诺如病毒，阳性样本Ct值为24。

结果表明，本发明所建立的PCR方法能够快速，准确地检测出样本中GI.1型诺如病毒，具有很好的应用前景。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 用于检测临床样本中GI.1型诺如病毒的试剂盒及专用引物

<130> GNCYX210664

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgtagttgc agggcgagtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caatggcaga tttgggagtg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacctgccct agtcctgatt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaaacgacc gtccaaagta 20

<210> 5

<211> 2222

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 60

gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 120

tgtaaaacga cggccagtcg aaccacgcaa tgcgtctcga tccgcagtgt cttgcgtctc 180

tttgtagttg cagggcgagt tatgacttgc cccagtcctg attttaattt cttgttttta 240

gtccctccta cggtggagca gaaaaccagg cccttcacac tcccaaatct gccattggag 300

acggagtcac tgccaaccga gacggtcata gctgtttcct gtgtgccgct tcctcgctca 360

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 420

taatacggtt acccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 480

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 540

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 600

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 660

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 720

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 780

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 840

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 900

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 960

gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 1020

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 1080

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 1140

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 1200

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 1260

atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 1320

tctgtctctt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 1380

gggagggctt accatctggc cccagtgctg caataatacc gcgggaccca cgctcaccgg 1440

ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 1500

caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 1560

cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccatcgctac aggcatcgtg gtatcacgct 1620

cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 1680

cccccatgtt gcgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 1740

agttggccgc cgtgttatca ctcatggtta tggcagcact acataattct cttactgtca 1800

tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 1860

agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 1920

atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 1980

ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 2040

cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 2100

caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 2160

attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 2220

ag 2222

<210> 6

<211> 2315

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 60

gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 120

tgtaaaacga cggccagtcg aaccacgcaa tgcgtctcga tccgcagtgt cttgcgtctc 180

tgacctgccc tagtcctgat tttaatttct tgtttttggt tccccccaca gtggagcaga 240

aaactaggcc tttcaccctt ccaaatttgc ctttgagctc tttgtccaac tcacgtgctc 300

ctcttccaat tggcagcatg ggcatttctc cagacaatgt tcagagtgta caattccaaa 360

atggtcggtg tactttggac ggtcgtttgg gagacggagt cactgccaac cgagacggtc 420

atagctgttt cctgtgtgcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 480

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttacccaca gaatcagggg 540

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 600

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 660

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 720

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 780

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 840

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 900

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 960

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 1020

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 1080

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 1140

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 1200

ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 1260

gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 1320

aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 1380

aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct ctttcgttca tccatagttg 1440

cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 1500

ctgcaataat accgcgggac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 1560

cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 1620

ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 1680

ttgccatcgc tacaggcatc gtggtatcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 1740

ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgcgcaaa aaagcggtta 1800

gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgccgtgtta tcactcatgg 1860

ttatggcagc actacataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 1920

ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 1980

gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 2040

ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 2100

cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 2160

ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 2220

aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 2280

gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttag 2315

Claims

1.引物对Ⅱ，由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。

2.引物组合，由引物对Ⅰ和引物对Ⅱ组成；

3.权利要求1所述引物对Ⅱ或权利要求2所述引物组合在制备试剂盒中的应用；

所述试剂盒的功能为如下（a）或（b）或（c）或（d）：

（a）鉴定或辅助鉴定GI.1型诺如病毒；

（b）从诺如病毒中鉴别GI.1型诺如病毒；

（c）鉴定临床样本中是否含有GI.1型诺如病毒；

（d）筛查GI.1型诺如病毒感染者。

4.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物对Ⅱ或权利要求2所述引物组合；

所述试剂盒的功能为如下（a）或（b）或（c）或（d）：

（a）鉴定或辅助鉴定GI.1型诺如病毒；

（b）从诺如病毒中鉴别GI.1型诺如病毒；

（c）鉴定临床样本中是否含有GI.1型诺如病毒；

（d）筛查GI.1型诺如病毒感染者。

5.权利要求1所述引物对Ⅱ或权利要求2所述引物组合或权利要求4所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定GI.1型诺如病毒中的应用；所述应用用于非疾病诊断与治疗。

6.权利要求1所述引物对Ⅱ或权利要求2所述引物组合或权利要求4所述试剂盒在从诺如病毒中鉴别GI.1型诺如病毒中的应用；所述应用用于非疾病诊断与治疗。