KR101614679B1 - 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주 - Google Patents
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101614679B1 KR101614679B1 KR1020160034730A KR20160034730A KR101614679B1 KR 101614679 B1 KR101614679 B1 KR 101614679B1 KR 1020160034730 A KR1020160034730 A KR 1020160034730A KR 20160034730 A KR20160034730 A KR 20160034730A KR 101614679 B1 KR101614679 B1 KR 101614679B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- respiratory syndrome
- virus
- vaccine
- syndrome virus
- mutant
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/12011—Astroviridae
- C12N2770/12034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
본 발명은 백신으로 사용할 수 있는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주에 관한 것이다. 본 발명의 키메릭 바이러스 변이주는 돼지에서 병원성이 낮고 안전성이 높다. 강독성 변이주의 비구조 단백질 및 국내 만연하는 변이주의 구조 단백질을 발현하여 넓은 방어범위를 가지며, 어주번트 없이 사독백신 단독으로만 사용하여도 높은 항체가를 얻을 수 있는 장점이 있다. 따라서 심각한 경제적 피해를 유발하는 양돈 질병인 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)를 효과적으로 방어하는데 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 백신으로 사용할 수 있는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주에 관한 것이다.
돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, 이하 PRRS)은 돼지 써코바이러스 감염증 및 구제역과 함께 국내 양돈산업에 가장 큰 피해를 주는 전염병에 해당한다. PRRS는 모돈에서 유산이나 조산, 사산의 번식장애 증상을 유발하며, 자돈 및 비육돈에서는 재채기, 발열, 등의 호흡기 증상을 유발한다. 일반적으로 바이러스에 이환된 이후 세균 등의 2차 감염에 의해 심한 호흡기 증상을 야기하지만, 만성적으로 감염된 경우에는 특징적인 임상 증상 없이 증체량 감소 및 폐사율의 증가가 나타나게 된다.
PRRS의 원인이 되는 병원체는 Arterivirus 속, Arteriviridae 과, Nidovirales 목에 속하는 PRRS 바이러스이다. PRRS 바이러스는 positive-sense single stranded RNA genome을 갖고 있으며, 크기는 약 15.4 kilobase이다. PRRS 바이러스의 genome은 9개의 ORF를 갖고 있다(Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993). 그중 비구조단백질(Non Structural Protein, NSP)을 코딩하는 ORF1a 및 ORF1b가 바이러스 지놈의 약 80%를 차지하고 있다(Bautista et al., 2002; Meulenberg et al., 1993; Snijder and Meulenberg, 1998, 2001). 글리코실화된 구조 단백질인 GP2, GP3, GP4, GP5와, 비글리코실화된 막(Membrane, M) 단백질, 뉴클레오캡시드 (N) 단백질은 나머지 20%를 차지하는 ORF에 의하여 코딩된다. minor 구조단백질인 GP2, GP3, GP4가 heterotrimer를 형성하여 바이러스가 숙주 세포 내로 침입할 때 작용하며, major 구조단백질인 GP5, M은 heterodimer를 형성하여 바이러스의 감염력을 높여주는 작용을 한다.
PRRS 바이러스는 RNA 바이러스의 특성상 변이가 심하여 바이러스 간에 차이가 많이 난다. PRRS 바이러스는 크게 북미형과 유럽형으로 나뉘는데, 북미형과 유럽형 간에는 최대 40%까지 유전자 차이가 존재하여 서로 교차 방어가 되지 않는 것으로 알려져 있다. 또한 같은 타입에 속하는 변이주 간에도 교차 방어가 되지 않는 경우가 많다 (Meng, X. J. et al., 2000). 이로 인해 각각에 대해 표준 변이주 기반의 백신은 제작되어 있지만 교차 방어능이 좋지 못하기 때문에 PRRS를 효과적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다. 이를 극복하기 위하여 안전성, 면역원성, 및 방어능을 효과적으로 갖춘 백신을 제작하기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있다(출원번호 제10-2011-7004020호, 발명의 명칭: 고병원성 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(HP PRRS)에 대한 백신).
본 발명은 백신으로 사용할 수 있는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주, 이를 포함하는 백신 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 키메릭 변이주의 DNA를 제공한다.
본 발명에서 상기 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 변이주는 K418로 명명되었다. 서열번호 1에서 1-12160 및 15467-19231은 PRRSV FL12(PRRSV NVSL 97-7895 변이주를 pBR322 벡터에 삽입한 감염성 클론) 서열이고, 12161-15466은 PRRSV LMY 서열에 해당한다.
본 발명은 상기 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 DNA를 전사한 RNA를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 키메릭 변이주의 DNA를 제공한다.
본 발명에서 상기 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 변이주는 K418DM으로 명명되었다. 서열번호 2에서 다른 부분은 서열번호 1과 동일하며, GP5 단백질을 코딩하는 영역인 13886-13888 및 13940-13942에 해당하는 부분에 돌연변이를 일으켜 탈글리코실화 되었다는 차이점이 있다.
본 발명은 상기 서열번호 2로 기재되는 염기서열 DNA를 전사한 RNA를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 키메릭 변이주의 DNA를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 수탁번호 KCCM11458P인 세포일 수 있다.
본 발명은 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 키메릭 변이주의 DNA를 포함하는 세포를 제공한다. 또한 상기 세포는 Escherichia coli DH5α 세포일 수 있다.
본 발명은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 키메릭 변이주의 DNA 또는 이로부터 전사된 RNA를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신을 제공한다.
상기 백신은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주번트(adjuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 바이러스는 불활화된 것일 수 있다.
본 발명은 상기 세포를 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 키메릭 변이주를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 세포를 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 유전자를 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 K418은 NVSL 97-7895의 ORF1 부위 및 LMY의 ORF2에서 ORF7을 포함한다.
본 발명은 PRRSV NVSL 97-7895 변이주의 ORF1 부위 및 PRRSV LMY 변이주의 ORF2 내지 ORF7을 조합하여 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 키메릭 변이주를 생산하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은
1) PRRSV NVSL 97-7895 변이주의 ORF1 부위 및 PRRSV LMY 변이주의 ORF2 내지 ORF7을 조합하는 단계; 및
2) 상기 조합된 염기서열에서 GP5를 코딩하는 유전자에 돌연변이를 유발하는 단계를 포함하는, 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 키메릭 변이주를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 키메릭 바이러스 변이주는 돼지에서 병원성이 낮고 안전성이 높다. 강독성 변이주의 비구조 단백질 및 국내 만연하는 변이주의 구조 단백질을 발현하여 넓은 방어범위를 가지며, 어주번트 없이 사독백신 단독으로만 사용하여도 높은 항체가를 얻을 수 있는 장점이 있다. 따라서 심각한 경제적 피해를 유발하는 양돈 질병인 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)를 효과적으로 방어하는데 이용할 수 있다.
도 1은 GP5 단백질에 의한 PRRS 바이러스의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 2는 PRRS 바이러스의 일반적인 지놈 배열(genomic arrangement)을 나타낸다.
도 3은 FL12 클론과 LMY 변이주의 일부를 각각 절단하고 연결하여 합성한 K418의 지놈 배열을 나타낸 모식도이다.
도 4는 K418로 형질감염된 MARC-145 세포에서 PRRSV의 뉴클레오캡시드 단백질(N 단백질)에 특이적인 항체를 이용하여 면역형광분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 FL12, LMY 및 K418의 multi step growth kinetics를 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 야외시험에서 K418DM에 의한 중화항체 생성 여부를 나타낸 도이다.
도 2는 PRRS 바이러스의 일반적인 지놈 배열(genomic arrangement)을 나타낸다.
도 3은 FL12 클론과 LMY 변이주의 일부를 각각 절단하고 연결하여 합성한 K418의 지놈 배열을 나타낸 모식도이다.
도 4는 K418로 형질감염된 MARC-145 세포에서 PRRSV의 뉴클레오캡시드 단백질(N 단백질)에 특이적인 항체를 이용하여 면역형광분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 FL12, LMY 및 K418의 multi step growth kinetics를 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 야외시험에서 K418DM에 의한 중화항체 생성 여부를 나타낸 도이다.
RNA는 쉽게 파괴되기 때문에 DNA로 바꾸어서 모든 작업을 수행한 후에 이로부터 RNA를 합성하여 세포를 형질감염시켰다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
이하에서 언급된 시약 및 용매는 특별한 언급이 없는 한 Sigma Aldrich 로부터 구입한 것이다.
실시예
1.
키메릭
바이러스의 제조
1-1.
키메릭
바이러스의 디자인
PRRS 키메릭 바이러스는 북미형의 분리주인 NVSL 97-7895의 ORF1 부위 및 국내에 가장 만연하는 변이주인 LMY의 ORF2에서 ORF7까지의 부위를 포함하도록 디자인하였다. NVSL 97-7895는 모돈에서 유사산을 야기시키는 강독주로 알려져 있으며 (Allende et al., 2000), LMY는 한국의 대표 변이주로 병원성이 강하지 않은 것으로 알려져 있다 (Cha SH et al., 2006).
PRRS 바이러스의 GP5 단백질은 분리주 별로 변이율이 가장 높은 단백질로써 바이러스의 중화능에 관여하는 중화 항체 에피토프를 포함하고 있어 중요한 역할을 하며, PRRS 바이러스의 계통을 분류하는 데에도 이용되고 있다. 각국의 분리주 및 백신주로 사용되고 있는 PRRS 바이러스의 GP5 단백질에 의한 계통수(phylogenetic tree)를 도 1에 나타내었다. 하단의 막대는 뉴클레오티드 위치마다 0.05개의 뉴클레오티드 치환이 있음을 의미한다. 도 1에서 NVSL 97-7895 및 LMY는 서로 85% 정도 유전적 관계가 있는 변이주인 것을 알 수 있다.
1-2.
NVSL
97-7895 변이주 및
LMY
변이주의 준비
미국 네브라스카 링컨 대학의 Dr. Fernando Osorio 및 Dr. Asit Pattnaik로부터, NVSL 97-7895 변이주의 모든 유전자가 삽입된 감염성 클론인 FL12의 cDNA 클론인 pFL12를 공급받아 사용하였다.
한국에 가장 만연한 변이주인 LMY 변이주를 농림수산검역검사본부로부터 분양받았고, LMY의 전체 구조 유전자를 포함하는 지놈 영역을 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 역전사 PCR로 증폭하였다.
1-3.
키메릭
바이러스 클론의 제작
도 2의 모식도와 같이, PRRS 바이러스는 총 8개의 ORF, 즉 ORF1a, ORF1b, 및 ORF2 내지 7을 포함하고 있다.
1-2에서 증폭한 LMY 변이주의 전체 구조 유전자를 포함하는 지놈 영역에서 ORF2부터 ORF7까지의 부위를 제한효소인 ECoRV 및 PacI를 사용하여 절단한 후, pFL12의 해당 부위와 치환하여 플라스미드를 제작하고 이를 K418로 명명하였다. K418의 모식도는 도 3에 나타내었다.
상기 K418 플라스미드에서 GP5를 코딩하는 지놈 영역에, GP5부분의 ectodomain에 존재하는 3개의 글리코실화 부위 중 2개 (33번, 51번 아미노산)를 위치지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 일으켜 다른 아미노산으로 치환함으로써 GP5의 N-글리코실화 부위를 제거하였다. GP5는 바이러스 중화능에 중요한 역할을 하는 부분인데, GP5의 탈글리코실화를 통해 중화항체 형성에 관여하는 에피토프를 노출시킴으로써 활발한 항체 생성을 유도할 수 있도록 한 것이다. 이렇게 제작된 변종 플라스미드를 K418DM으로 명명하였다. QIAprep Spin Midiprep kit (Qiagen, Korea)를 사용하여 전체 길이 변종 플라스미드를 추출, 준비하였다.
1-4.
키메릭
바이러스 RNA
전사물의
합성
1-3에서 준비한 K418 플라스미드 및 K418DM 플라스미드에 AclI를 처리하여 선형화시켰다. 이렇게 준비된 선형 DNA를 주형으로 하여 in vitro에서 mMESSAGEmMACHINE Ultra T7 kit (Ambion, Austin, TX)를 사용하여 각각의 RNA 전사물을 합성하였다.
1-5.
키메릭
바이러스 RNA의 형질감염(
transfection
)
PRRS 바이러스 수용성 세포주로 알려진 MARC-145 세포를 사용하여 키메릭 바이러스의 복제를 확인하고자 하였다. MARC-145 세포는 네브라스카-링컨 대학으로부터 분양받은 것을 사용하였다.
PRRSV에 감염되지 않은 naive MARC-145 세포로부터 세포 자체에 대한 RNA를 분리하였다. 이 RNA는 바이러스 RNA의 감염을 돕는 carrier의 역할을 수행한다. MARC-145 세포를 PBS 버퍼에 현탁하였다. 상기 naive MARC-145 세포 자체에 대한 RNA 약 5 ug과 K418 및 K418DM의 RNA 전사물 약 10 ug을 각각 4.0 mm 큐벳으로 상기 MARC-145 세포에 형질감염시켰다. 형질감염은 MARC-145 세포를 Gene Pulser Xcell (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 250V 및 975 uF에서 전기천공하여 수행하였다.
형질감염된 MARC-145 세포는 10% FBS 및 1.25% DMSO를 포함하는 DMEM 배지에 희석하고 6 웰 플레이트에 분주하였다.
형질감염 48시간 후에 PRRSV의 뉴클레오프로틴을 타겟으로 하는 SDOW17 항체를 이용하여 면역형광분석(immunofluorescence assay, IFA)를 통해 MARC-145 세포에서 K418 및 K418DM 바이러스가 증폭되고 있음을 확인했다(도 4).
1-6.
키메라
바이러스의 multi-step growth kinetics
96 웰 플레이트에 MARC-145 세포를 역가 측정 2일 전에 배양한 후 MARC-145 세포에 parental 바이러스인 FL12, LMY와 본 발명의 키메라 바이러스인 K418을 원액부터 10진 희석하여 각 웰에 감염시킨 후, 감염 12, 24, 48, 72, 96 시간 후에 배양 상청액을 수집하여 Reed and Muench 계산법으로 바이러스 역가를 측정함으로써 multi-step growth kinetics를 비교하였다(도 5). 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, K418은 FL12, LMY와 유사한 성장 패턴을 나타내어, K418에 가해진 유전자 조작이 바이러스 성장에 별로 영향을 주지 않았다는 것을 알 수 있었다. K418은 FL12, LMY와 유사한 최종 역가를 나타내었으나, 바이러스 성장이 약간 지연되었다.
1-7.
키메릭
바이러스를 이용한
사독백신의
제작
1-5에서 형질감염시킨 MARC-145 세포를 10일 동안 관찰하여 PRRS 바이러스 특이적인 세포변성효과(CPE)를 확인하였다. 계대된 상청액은 감염 5일차에 80%의 CPE를 생산하였고, 산출된 바이러스 역가는 106 TCID50/ml이었다.
상기 바이러스가 감염된 세포배양플라스크를 -70도 냉동고에 얼리고 상온에 녹이는 과정을 3번 반복한 후 원심분리하여 세포를 제거한 상층액을 회수하여 이로부터 K418 및 K418DM을 회수(rescue)하였다.
사독백신을 만들기 위해 하기의 과정에 따라 바이러스를 불활화시켰다.
상기 K418 및 K418DM에 1mM BEI(binary ethylenimine)를 각각 첨가하고 37℃에서 24시간 동안 방치함으로써 바이러스를 불활화시켰다. 그 후 BEI를 중화하기 위해 0.1mM Na-thiosulphate를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 방치하였다.
바이러스의 불활화 여부를 확인하기 위해 하기의 과정을 수행하였다. MARC-145 세포를 조직배양용 플라스크에 2일간 증식시킨 후 세포 배양액을 제거한 다음, 상기 불활화된 K418 및 K418DM을 접종하여 37℃에서 1시간 동안 감작시켰다. 그 후 새로운 배지를 더하여 배양했다. 배양한지 3일 후에 PRRSV의 뉴클레오프로틴을 타겟으로 하는 SDOW17 항체를 이용하여 면역형광분석으로 바이러스의 증폭 여부를 확인하였으며, 7일 후에 PRRS 바이러스 특이적인 세포변성효과 (CPE)가 나타나는지 여부를 관찰하였다.
면역형광분석 결과 바이러스의 증폭이 나타나지 않았고, CPE가 관찰되지 않았으므로 K418 및 K418DM이 성공적으로 불활화되었음을 확인하였다. 특히 CPE 관찰 시 PRRS 바이러스 특이적인 CPE 뿐만 아니라 기타 바이러스에 의한 CPE 및 다른 이유로 인한 세포변성효과가 나타나지 않았다.
실시예
2.
MLV
및
NVSL97
-7895와의
상동성
비교
상기 실시예 1에서 합성한 K418과, 국내에 시판되고 있는 생독 백신주인 베링거 인겔하임 사의 '인겔백 PRRS 생독백신(MLV)', K418의 parental virus이고 강독주인 NVSL97-7895 간의 관계를 알아보고자 하기의 과정을 수행하였다.
K418의 GP5 단백질에 해당하는 지놈 영역을 역전사 중합효소 PCR을 통해 증폭하였다. 이때 프라이머는 PRRSV의 ORF5에 대한 프라이머를 사용하였다. 하기 표 1은 본 발명의 K418의 GP5 단백질 유전자 염기서열을 나타낸다.
[표 1]
K418, MLV, 및 NVSL97-7895의 GP5 단백질 유전자 염기서열을 각각 비교 분석한 결과, MLV와 K418은 서로 약 94%의 상동성을 나타냄을 알 수 있었다. 또한 NVSL97-7895와 K418은 서로 약 89%의 상동성을 나타냄을 알 수 있었다. 상동성 비교 분석 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
실시예
3. 세포
계대
연구
실시예 1에서 제작한 K418 및 K418DM을 계대하였을 때 변형된 부위가 언제까지 연구되는지 확인하였다.
그 결과 K418DM에서 약 9번의 계대까지는 변형된 부위가 유지되나, 그 후에는 변형된 부위가 일관성있게 유지되지 않았다. 이는 바이러스가 원래의 상태로 돌아가려는 경향을 보이고, RNA 바이러스의 특성상 변이가 심하기 때문으로 생각된다. 따라서 계대할 때마다 변형된 부위가 유지되는지 여부를 확인할 필요가 있다.
현재 백신주로 사용한 바이러스는 MARC-145 세포에 접종하여 37℃에서 5일 배양한 후 2번 계대하였으며, 염기서열 분석을 통해 유전자를 확인한 후 -70℃에서 보관하였다.
실시예 4. 돼지에서의 병원성 확인
4주령의 PRRS 바이러스에 대한 항체가 음성인 돼지(경기도 포천의 PRRSV 감염력이 없는 농장에서 구입)에서 K418 및 K418DM 바이러스의 병원성을 조사하였다.
PRRS 바이러스에 대한 항체가 음성인 4주령의 자돈 12마리를 준비하여 8마리는 공격접종군으로, 4마리는 음성대조군으로 하였다. 공격접종군을 다시 4마리씩 2개 군으로 나누어, 1개 군에는 K418을, 1개 군에는 K418DM을 각각 104.5 TCID50/ml 씩 근육 주사하였다.
공격 접종 후 일주일간 임상증상을 관찰하였다.
또한 공격접종 후 기간별로 채혈하여 혈청을 분리한 후 MARC-145 세포에 접종하고, 2일 후에 면역형광분석을 실시하여 혈청 내 바이러스혈증(viremia)를 측정하였다.
그 결과, 공격접종군은 모두 발열 및 호흡기 증상을 동반한 임상증상이 나타났으나, 음성대조군에서는 임상증상이 나타나지 않았다. 또한 공격접종군의 혈청에서는 바이러스가 103~4TCID50/ml로 측정되었다. 공격접종군 내에서는 K418 접종군이 K418DM 접종군에 비해 임상증상 및 혈청 내 바이러스혈증이 더 높게 나타났다(표 3 참조).
[표 3]
실시예 5. 안전성 시험
5-1. 사독백신의 제작
실시예 4에서 병원성이 더 낮게 나타난 K418DM 바이러스를 사독백신주로 선정하고 백신주로서의 안전성을 평가하였다. 불활화가 확인된 K418DM 바이러스 107 TCID50/ml을 Montanide IMS1313과 70:30 (w/w) 의 비율로 혼합하여 사독 백신을 제작하였다. 이를 이용하여 마우스, 기니픽, 돼지에서의 안전성 시험을 수행하였다.
5-2. 마우스에서의 안전성 시험
체중 약 20g인 마우스 8마리의 복강에 5-1에서 제작한 사독 백신 0.5ml을 접종한 후 7일간 관찰했다. 시험 결과는 하기 표 4에 나타내었다. 백신 접종 후 7일간 이상 증상 없이 모두 생존하는 것을 확인하였다.
[표 4]
5-3. 기니픽에서의 안전성 시험
체중 약 300g의 기니픽 2마리에 5-1에서 제작한 사독 백신 2ml를 근육 접종하고, 동량을 다른 2마리에 복강 접종하여 7일간 관찰했다. 시험 결과는 하기 표 5에 나타내었다. 백신 접종 후 7일간 이상 증상 없이 모두 생존하는 것을 확인하였다.
[표 5]
5-4. 돼지에서의 안전성 시험
PRRS 바이러스 항체가 음성인 건강한 4주령 자돈 6마리에 5-1에서 제작한사독백신을 근육 접종하였다. 1~2시간 내에 과민반응이 없는 것을 확인하였으며, 시험 기간 동안 백신 주사 부위의 괴사, 발열 증상 및 호흡기 질환 증상의 부작용이 없었음을 확인하였다. 시험 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
[표 6]
실시예 6. 돼지에서의 면역원성 확인
K418DM의 최소면역원성을 시험하기 위해 항원량을 다양하게 하여 접종하고 생성된 항체의 역가를 측정하였다. 불활화가 확인된 K418DM 바이러스를 Montanide IMS1313과 70:30 (w/w) 또는 50:50 (w/w) 의 비율로 혼합하여 사독 백신을 제작하고 이를 사용하였다.
다양한 농도의 K418DM을 돼지에 투여하고 4주 후에 채혈하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 56℃, 30분간 비동화하여 배지로 2진 희석한 후, PRRS 바이러스 (200 TCID50/0.1ml)로 동량 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 MARC-145 세포에 접종하여 37℃에서 배양했다. 배양 3일 후에 methanol:acetone을 1:1의 비율로 혼합한 시약에 고정하고, ELISA kit (IDEXX)를 사용하여 N 단백질을 타겟으로 하는 항체로 면역형광염색을 수행하여 항체가를 측정했다.
그 결과, 107 TCID50/ml이상의 항원량에서 최소면역원성이 형성되는 것을 확인하였다. 혈청 내 항체는 백신 접종 2주 후부터 생성되기 시작하여 시간이 지날수록 상승하는 패턴을 보였으며, 108 TCID50/ml 이상의 항원량을 투여했을 경우에 접종 6주차에 가장 높은 일반항체가가 나타났다. 108 TCID50/ml의 항원량을 투여했을 경우에는 중화항체가는 8배 이상으로 농림수산검역검사본부의 검정기준(중화항체가 1:4 이상)에 부합하는 결과를 얻었다.
K418DM의 최소면역원성 실험 결과에 대해서는 하기 표 7에 나타내었다.
[표 7]
실시예 7. 야외 시험
K418DM의 임상 효능을 평가하기 위하여 총 3개의 양돈 농장을 선정하여 야외 시험을 진행하였다.
국내 양돈 농장을 PRRSV를 기준으로 크게 세 가지로 나누어보면, PRRSV가 감염되지 않은 농장, PRRSV 야외주가 상재하고 있지만 병변을 일으키고 있지는 않은 안정화된 농장, 그리고 과거 PRRSV 감염 이력이 있거나 현재 감염 상태이기 때문에 PRRSV 생독백신인 베링거 인겔하임 사의 '인겔백 PRRS 생독백신(MLV)'를 사용하는 농장으로 분류된다. 야외 시험을 하기 위해 각 분류별로 1개씩 농장을 선정하였다(이하 각각 A, B, C 농장이라 함). 각 농장별로 22마리의 4주령 자돈을 선발하여 18마리에 K418DM을 접종하고 이를 K418DM 접종군으로, 4마리에 아무런 처치를 하지 않고 음성대조군으로 하였다. 그 후 7주간 중화항체 생성여부에 대하여 분석하였다.
MARC-145 세포에 각 자돈에서 채혈한 혈청과 PRRS K418DM을 혼합하여 감염시킨 후 2일간 배양하였다. 그 후 FA 검사법으로 각 자돈에서 채혈한 혈청 내의 중화항체 존재 여부를 검사하였다. 이 때 사용한 항체는, 1차 항체로 PRRSV N 단백질에 특이적인 단일클론항체 (SDOW-17)을 사용하였고, 2차 항체로 항-마우스 IgG FITC 컨주게이션된 항체(Alexa488)를 사용하였다. 그 결과는 하기 표 8 및 도 6(a, A, b, B, c, C의 의미는 표 8과 동일)에 나타내었다. A농장에서는 중화항체 양성율이 약 38%였으며, B농장에서는 약 94%, C농장에서는 약 72%로 나타나, 농장 상황에 따라 K418DM의 효과가 큰 차이를 보이는 것을 확인하였다.
PRRSV가 감염되지 않은 A농장에서 항체 양성율이 비교적 낮게 나타난 것은 개체 차이에 따른 것으로 보이며, 접종군의 개체수를 늘린 후 진행한다면 통계적으로 더욱 정확한 결과를 얻을 수 있을 것으로 예상된다.
B농장은 대부분의 K418DM 접종군에서 높은 중화항체가를 확인하였다. B농장의 자돈들은 B농장에서 상재하고 있는 야외주 PRRSV에 대한 항체를 가지고 있을 것임에도 불구하고 K418DM에 의해 면역원성이 더욱 증가한 이유를 규명하기 위하여, 상기 야외주와 K418DM의 GP5 단백질 부분의 염기서열을 PCR로 증폭한 후 시퀀싱하였다. 그 결과, 야외주 PRRSV의 면역원성에 기여하는 바이러스 구조단백질인 GP5 단백질과 K418DM의 GP5 단백질 간에 약 96%의 높은 상동성이 존재함이 밝혀졌다. 이로부터 B농장의 K418DM 접종군에서 높은 중화항체가가 나타난 이유는 상동성 변이주에 대한 백신 효과 때문임을 알 수 있었다.
C농장에서도 K418DM 접종군에서 약 72%의 비교적 높은 중화항체가가 확인되었다. C농장에는 과거 감염되었거나 현재 감염되어 있는 야외주 PRRSV 또는 약독화된 생독백신주가 상재하고 있을 것이므로 C농장의 자돈들도 대부분 이에 대한 항체를 가지고 있을 것으로 예상되었다. K418DM에 의해 면역원성이 더욱 증가한 이유를 규명하기 위하여 C농장에서 접종하고 있는 PRRSV 생독백신의 GP5 단백질과 K418DM의 상동성을 비교한 결과, 약 91%의 상동성이 있음이 확인되었다. 이로부터 C농장의 K418DM 접종군에서 높은 중화항체가가 나타난 이유는 상동성 변이주에 대한 백신 효과 때문임을 알 수 있었다.
[표 8]
상기 야외시험 결과로부터, K418DM이 국내 대부분의 양돈 농장에서 PRRSV 사독백신으로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp
<120> Chimeric strain of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
Virus
<130> P13-095-REA-KKU-DA
<150> KR 10-2013-0124958
<151> 2013-10-19
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 19231
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRRS K418
<400> 1
atgacgtata ggtgttggct ctatgccatg acatttgtat tgtcaggagc tgcgaccatt 60
ggtacagccc aaaactagct gcacagaaaa cgcccttctg tgacagccct cttcagggga 120
gcttaggggt ctgtccctag caccttgctt ccggagttgc actgctttac ggtctctcca 180
accctttaac catgtctggg atacttgatc ggtgcacgtg cacccccaat gccagggtgt 240
ttatggcgga gggccaagtc tactgcacac gatgtctcag tgcacggtct ctccttcctc 300
tgaatctcca agttcctgag cttggagtgc tgggcctatt ttacaggccc gaagagccac 360
tccggtggac gttgccacgt gcattcccca ctgttgagtg ctcccccgcc ggggcctgct 420
ggctttctgc gatctttcca attgcacgaa tgaccagtgg aaacctgaac tttcaacaaa 480
gaatggtgcg ggtcgcagct gagatttaca gagccggcca gctcacccct gcagtcttga 540
aggctctaca agtttatgaa cggggttgcc gctggtaccc tatagtcgga cctgtccctg 600
gagtggccgt ttttgccaac tccctacatg tgagtgataa acctttcccg ggagcaactc 660
atgtgctaac caacctgcca ctcccgcaga ggcctaagcc tgaagacttt tgcccttttg 720
agtgtgctat ggctgacgtc tatgatattg gtcatggcgc cgtcatgtat gtggccaaag 780
ggaaagtctc ctgggcccct cgtggcgggg atgaggcgaa atttgaaact gtccctaggg 840
agttgaagtt gatcgcgaac caactccaca tctccttccc gccccaccac gcagtggaca 900
tgtctaagtt tgtgttcata gcccctggga gtggtgtctc tatgcgggtc gagtgcccac 960
acggctgtct ccccgctaat actgtccctg aaggtaactg ctggtggcgc ttgtttgact 1020
cgctcccact ggacgttcag aacaaagaaa ttcgccgtgc caaccaattc ggctatcaaa 1080
ccaagcatgg tgtcgctggc aagtacctac aacggaggct gcaagctaat ggtctccgag 1140
cagtgactga tacagatggg cctatcgttg tacagtactt ctctgttagg gagagctgga 1200
tccgccactt cagactggcg gaagagccta gcctccctgg gtttgaagac ctcctcagaa 1260
taagggtaga gcccaatacg tcgccattga gtgacaaggg tggaaaaatc ttccggtttg 1320
gcagtcacaa atggtacggt gctggaaaga gagcaaggaa agcacgctct ggtatgacca 1380
ccacagtcgc tcaccgcgcc ttgcccgctc gtgaaatcca gcaagccaaa aagcacgagg 1440
atgccggcgc tgataaggct gtgcatctca ggcactattc tccgcctgcc gacgggaact 1500
gtggttggca ctgcatttcc gccatcgcca accgaatggt gaattccaaa tttgaaacta 1560
ctcttcccga gagggtgaga ccttcggatg actgggctac tgacgaggac cttgtgaaca 1620
ccatccaaat tctcaagctc cctgcggcct tggacaggaa cggtgcttgt gttggcgcca 1680
aatacgtgct taagttggaa ggcgagcatt ggactgtctc tgtgaccctt gggatgtccc 1740
cttctttgct cccccttgaa tgtgttcagg gctgttgtga gcataagagc ggacttggtc 1800
ccccagatgc ggtcgaagtt ttcggatttg accctgcctg ccttgaccga ctggctgagg 1860
taatgcactt gcctagcagt gtcatcccag ctgctctggc cgaaatgtcc ggcgacccca 1920
actgtccggc ttccccggtc actactgtgt ggactgtttc acaattcttt gcccgccaca 1980
gaggaggaga gcaccctgat caggtgcgct taggaaaaat catcagcctt tgtcaagttg 2040
ttgaggaatg ctgttgccat cagaataaaa ccaaccgggc caccccggaa gaggttgcgg 2100
caaggattga tcagtacctc catggtgcaa caagtcttga agaatgcttg attaggcttg 2160
agagggtttg cccgccgagc gctgcggaca ccttctttga ttggaatgtt gtgctccctg 2220
gggttggggc ttcaactcag acaaccaaac agctccatgt caaccagtgc cgcgctctgg 2280
ttcctgtcgt gactcaagag cctttggaca aagactcagt ccctctgacc gccttctcgc 2340
tgtccaattg ctactatcct gcacaaggtg acgaggttcg tcaccgtgag aggctaaact 2400
ccgtactctc taagctggag ggggttgttc gtgaggaata tgggctcacg ccaactgaac 2460
ctggcccgcg acccgcacta ccgaacgggc tcgtcgaact taaagaccag atggaggagg 2520
atctgctgaa actagtcaac gcccaggcaa cttcagaaat gatggcctgg gcagccgagc 2580
aggttgatct gaaagcttgg gtcaaaaact acccacggtg gacaccgcca ccccctccac 2640
caagagttca gcctcgaaaa acaaagtctg tcaagagctt gccagggaac aaacctgtcc 2700
ccgctccacg caggaaggtc agatctgatt gtggcagccc gattttgatg ggcgacaatg 2760
ttcctgacgg tcgggaagat ttgactgttg gtggccccct tgatctttcg acaccatccg 2820
agccgatgac acctctgagt gagcctgcac ttatgcccgc gttgcaatat atttctaggc 2880
cagtgacatc tttgagtgtg ctggccccag ttcctgcacc gcgtagaact gtgtcccgac 2940
cggtgacgcc cttgagtgag ccaatttttg tgtctgcacc gcgacacaaa tttcagcagg 3000
tggaagaagc gaatctggcg gcaacaacgc tgacgcacca ggacgaacct ctagatttgt 3060
ctgcatcctc acagactgaa tatgaggctt ctcccctaac accactgcag aacatgggta 3120
ttctggaggt gggggggcaa gaagctgagg aagttctgag tgaaatctcg gatacactga 3180
atgacatcaa ccctgcacct gtgtcatcaa gcagctccct gtcaagtgtt aagatcacac 3240
gcccaaaaca ctctgctcaa gccatcattg actcgggcgg gccctgcagt gggcatctcc 3300
gaagggaaaa agaagcatgc ctcagcatca tgcgtgaggc ttgtgatgcg gctaagctta 3360
gtgaccctgc cacgcaggaa tggctttctc gcatgtggga tagggttgac atgctgactt 3420
ggcgcaacac gtctgcttac caggcgttcc gcatcttaga tggtaggttt gagtttctcc 3480
caaagatgat actcgagaca ccgccgccct acccgtgtgg gtttgtgatg ctgcctcaca 3540
cgcctgcacc ttccgtgggt gcagagagtg accttaccat tggttcagtc gccactgaag 3600
atgttccacg catcctcggg aaaatagaaa acgccggcga gatgcccaac caggggctct 3660
tgacatcctt cggggaagaa ccggtgtgcg accaacctgt caaggactcc tggatgtcgt 3720
cgcgggggtt tgacgagagc acaacggctc cgtccgctgg tacaggtggt gctgacttac 3780
ccaccgattt gccaccttca gatggtttgg atgcggacga gtgggggccg ttacggacgg 3840
taagaaagaa agctgaaagg ctcttcgacc aattgagccg tcaggttttt aacctcgtct 3900
cccatctccc tgttttcttc tcacacctct tcaaatctga cagtggttat tctccgggtg 3960
attggggttt tgcagctttt actttatttt gcctcttttt gtgttacagc tacccattct 4020
ttggttttgt tcccctcttg ggtgtttttt ctgggtcttc tcggcgtgtg cgcatggggg 4080
tttttggctg ttggttggct tttgctgttg gcctgttcaa gcctgtgtcc gacccagtcg 4140
gcactgcttg tgagtttgac tcgccagagt gtaggaacgt ccttcattct tttgagcttc 4200
tcaaaccttg ggaccctgtt cgcagccttg ttgtgggccc cgtcggtctc ggccttgcca 4260
ttcttggcag gttactgggc ggggcacgct acatctggca ttttttgctt aggcttggca 4320
ttgttgcaga ttgtatcttg gctggagctt atgtgctttc tcaaggtagg tgtaaaaagt 4380
gctggggatc ttgtgtaaga actgctccta atgaaatcgc cttcaacgtg ttccctttta 4440
cgcgtgcgac caggtcgtca ctcatcgacc tgtgcgatcg gttttgtgcg ccaaaaggca 4500
tggaccccat tttcctcgct actgggtggc gcgggtgctg gaccggccga agtcccattg 4560
agcaaccctc tgaaaaaccc atcgcgttcg cccagttgga tgaaaagagg attacggcta 4620
gaactgtggt cgctcagcct tatgatccta accaagccgt aaagtgcttg cgggtgttac 4680
aggcgggtgg ggcgatagtg gccgaggcag tcccaaaagt ggtcaaggtt tccgctattc 4740
cattccgagc tccctttttt cccaccggag tgaaggttga tcctgagtgc aggatcgtgg 4800
tcgaccccga cacttttact acagctctcc ggtctggtta ctccaccaca aacctcgtcc 4860
ttggtgtggg ggactttgcc caactgaatg gattaaaaat caggcaaatt tccaagccct 4920
cgggaggagg cccgcacctc attgctgccc tgcatgttgc ttgctcgatg gcgttgcaca 4980
tgcttgctgg agtttatgta actgcagtgg ggtcttgcgg taccggcacc aacgatccgt 5040
ggtgcactaa cccattcgcc gtccctggct acggacctgg ctccctctgc acgtccagat 5100
tgtgcatctc ccaacatggc cttaccctgc ccttgacagc acttgtggca ggattcggtc 5160
ttcaggaaat tgccctagtc gttttgattt tcgtttccat cggaggcatg gctcataggt 5220
tgagttgtaa ggctgatatg ctgtgcgtct tacttgcaat cgccagctat gtttgggtac 5280
cccttacctg gttgctctgt gtgtttcctt gctggttgcg ctggttctct ttgcaccctc 5340
tcaccattct atggttggtg tttttcttga tgtctgtaaa tatgccttcg ggaatcttaa 5400
ccgtggtgtt attggttgct ctttggcttc taggccgtta tactaatgtt gttggtcttg 5460
ttacccccta tgatattcat cattacacca atggcccccg cggtgttgcc gccttggcta 5520
ccgcaccaga tgggacttac ttggccgctg tccgccgcgc tgcgttgact ggccgcaccg 5580
tgctgtttac cccgtctcag cttgggtccc ttcttgaggg cgctttcaga actcgaaagc 5640
cctcactgaa caccgtcaat gtggtcgggt cctccatggg ctctggcgga gtgttcacta 5700
tcgatgggaa aattaagtgc gtgactgccg cacatgtcct tacgggtaat tcagctaggg 5760
tttccggggt cggcttcaat caaatgcttg actttgatgt aaaaggggac ttcgccatag 5820
ctgattgccc gaattggcaa ggggctgctc ctaagaccca attctgcgag gatggatgga 5880
ctggccgcgc ctattggctg acatcctctg gcgtcgaacc cggtgtcatt gggaatggat 5940
tcgccttctg cttcaccgcg tgcggcgatt ccgggtcccc agtgatcacc gaagccggtg 6000
agcttgtcgg cgttcacaca ggatcaaaca aacaaggagg aggcattgtt acgcgcccct 6060
ctggccagtt ttgcaatgtg gcacccatca agctgagcga attaagtgag ttctttgctg 6120
gacctaaggt cccgctcggt gatgtgaagg ttggcagcca cataattaaa gacatatgcg 6180
aggtaccttc agatctttgc gccttgcttg ctgccaaacc cgaactggaa ggaggcctct 6240
ccaccgtcca acttctgtgt gtgtttttcc tcctgtggag aatgatggga catgcctgga 6300
cgcccttggt tgctgttggg ttttttatct tgaatgaggt tctcccagct gtactggtcc 6360
ggagtgtttt ctcctttgga atgtttgtgc tatcttggct cacaccatgg tctgcgcaag 6420
ttctgatgat caggcttcta acagcagctc ttaacaggaa cagattgtca ctcgcctttt 6480
acagccttgg tgcagcgacc ggttttgtcg cagatctggc ggcaactcaa gggcacccgt 6540
tgcaggcagt aatgaattta agtacctatg ccttcctgcc tcggataatg gtcgtgacct 6600
caccagtccc agtgattgcg tgtggtgttg tgcacctcct tgccataatt ttgtacttgt 6660
ttaagtaccg ctgcctgcac aatgtccttg ttggcgatgg tgcgttctct gcggctttct 6720
tcttgcgata ctttgccgag gggaaattga gggaaggggt gtcgcaatcc tgcgggatga 6780
atcatgagtc gctgactggt gccctcgcta tgagacttaa tgacgaggac ttggattttc 6840
ttacgaaatg gactgatttt aagtgttttg tttctgcatc caacatgagg aatgcggcgg 6900
gccagttcat cgaggctgcc tatgctaaag cacttagaat tgaacttgcc cagttggtgc 6960
aggttgataa ggttcgaggt actttggcca aacttgaagc ttttgctgat accgtggcac 7020
cccaactctc gcccggtgac attgttgttg ctcttggcca tacgcctgtt ggcggtatct 7080
tcgacctaaa ggttggtagc accaagcata ccctccaagc cattgagacc agagttcttg 7140
ccgggtccaa aatgaccgtg gcgcgtgtcg ttgatccaac ccccacaccc ccacccgcac 7200
ccgtgcctat cccccttcca ccgaaagttc tggagaatgg tcccaacgcc tggggggatg 7260
aggatcgttt gaataagaag aagaggcgca ggatggaagc cgtcggcatc tttgttatgg 7320
gtggaaagaa atatcagaaa ttttgggaca agaactccgg tgatgtgttt tatgaggagg 7380
tccatgataa cacagacgcg tgggagtgcc tcagagttga caaccctgcc gactttgacc 7440
ctgagaaggg aactctgtgc gggcatacta ccattgaaga taagacttac agtgtctacg 7500
cctccccatc tggcaagaaa ttcctggtcc ccgtctaccc agagagcaaa aaaaaccaat 7560
gggaagctgc gaagctttcc gtggaacagg cccttggcat gatgaatgtc gacggtgaac 7620
tgacagccaa agaagtggag aaactgaaaa gaataattga caaactccag ggcctgacta 7680
aggagcagtg tttaaactgc tagccgccag cggcttgacc cgctgtggtc gcggcggctt 7740
ggttgttact gagacagcgg taaaaatagt caaatttcac aaccggacct tcaccctagg 7800
acctgtgaat ttaaaagtgg ccagtgaggt tgagctaaaa gacgcggtcg agcataacca 7860
acacccggtt gcaagaccgg ttgatggtgg tgttgtgctc ctgcgctccg cagttccttc 7920
gcttatagac gtcttaatct ccggcgctga tgcatctccc aagttactcg cccgccacgg 7980
gccgggaaac actgggatcg atggcacgct ttgggatttt gaggccgagg ccactaaaga 8040
ggaaattgca ctcagtgcgc aaataataca ggcttgtgac attaggcgcg gcgacgcacc 8100
tgaaattggt cttccttata agctgtaccc tgtcaggggc aaccctgagc gggtaaaagg 8160
agttttacag aatacaaggt ttggagacat accttataaa acccccagtg acactggaag 8220
cccagtgcac gcggctgcct gcctcacgcc caatgccact ccggtgactg atgggcgctc 8280
cgtcttggcc acgactatgc cctccggttt tgagttgtat gtaccgacca ttccagcgtc 8340
tgtccttgat tatcttgatt ctaggcctga ctgccccaaa cagttgacag agcacggctg 8400
tgaggacgcc gcattaagag acctctccaa gtatgacttg tccacccaag gctttgtttt 8460
acctggagtt cttcgccttg tgcgtaagta cctgtttgct catgtgggta agtgcccgcc 8520
cgttcatcgg ccttccactt accctgccaa gaattctatg gctggaataa atgggaacag 8580
gtttccaacc aaggacatcc agagcgtccc tgaaatcgac gttctgtgcg cacaggccgt 8640
gcgggaaaac tggcaaactg ttaccccttg taccctcaag aaacagtatt gtgggaagaa 8700
gaagactagg acaatactcg gcaccaataa cttcattgcg ctggcccacc gggcagcgtt 8760
gagtggtgtc acccagggct tcatgaaaaa ggcgtttaac tcgcccattg ccctcggtaa 8820
aaacaaattt aaagagcttc agactccggt cttaggcagg tgccttgaag ctgatcttgc 8880
atcctgcgat cgctccacac ctgcaattgt ccgctggttt gccgccaatc ttctttatga 8940
acttgcctgt gctgaagagc acctgccgtc gtacgtgttg aactgctgcc acgacctact 9000
ggtcacgcag tccggcgcag taactaagag aggtggcctg tcgtctggcg acccgatcac 9060
ttctgtgtcc aacaccattt acagcttggt gatatatgca caacacatgg tgctcagtta 9120
ctttaaaagt ggtcaccctc atggccttct gtttctacaa gaccagctga agtttgagga 9180
catgctcaag gttcaacccc tgatcgtcta ttcggacgac ctcgtactgt atgccgagtc 9240
tcccaccatg ccaaactacc actggtgggt tgaacatctg aacctgatgc tgggttttca 9300
gacggaccca aagaagacag ccataacaga ctcgccatca tttctaggct gtaggataat 9360
aaatggacgc cagctcgtcc ctaaccgtga caggattctc gcggccctcg cctaccatat 9420
gaaggcaagc aatgtctctg aatactacgc ctcggcggct gcgatactca tggacagctg 9480
tgcttgttta gagtatgatc ccgaatggtt tgaagagctt gtagttggga tagcgcagtg 9540
tgcccgcaag gacggctaca gttttcccgg cccgccgttc ttcttgtcca tgtgggaaaa 9600
actcagatcc aatcatgagg ggaagaagtc cagaatgtgc gggtactgcg gggccccggc 9660
tccgtacgcc actgcctgtg gcctcgacgt ctgtatttac cacacccact tccaccagca 9720
ttgtccagtc atcatctggt gtggccaccc ggctggttct ggttcttgta gtgagtgcaa 9780
acccccccta gggaaaggca caagccctct agatgaggtg ttggaacaag tcccgtataa 9840
gcctccacgg actgtaatca tgcatgtgga gcagggtctc acccctcttg acccaggcag 9900
ataccagact cgccgcggat tagtctccgt taggcgtggc attagaggaa atgaggttga 9960
tctaccagac ggtgattatg ctagcaccgc cctactccct acttgtaaag agattaacat 10020
ggtcgctgtc gcctctaatg tgttgcgcag caggttcatc atcggcccgc ctggtgctgg 10080
gaaaacatac tggctccttc aacaggtcca ggatggtgat gtcatttaca cgccaactca 10140
ccagaccatg ctcgacatga ttagggcttt ggggacgtgc cggttcaacg tcccagcagg 10200
tacgacgctg caattccctg ccccctcccg taccggccct tgggttcgca tcctagccgg 10260
cggttggtgt cctggcaaga attccttcct ggatgaagca gcgtattgta atcaccttga 10320
tgtcttgagg cttcttagca aaactaccct cacctgtctg ggagatttca aacaactcca 10380
cccagtgggt tttgattctc attgctatgt ttttgacatc atgcctcaga ctcaactgaa 10440
gaccatctgg agatttggac agaatatctg tgatgccatt cagccagatt acagggacaa 10500
acttgtatcc atggtcaaca caacccgtgt aacctacgtg gaaaaacctg tcaagtatgg 10560
gcaagtcctc accccttacc acagggaccg agaggacggc gccatcacaa ttgactccag 10620
tcaaggcgcc acatttgatg tggttacact gcatttgccc actaaagatt cactcaacag 10680
gcaaagagcc cttgttgcta ttaccagggc aagacatgct atctttgtgt atgacccaca 10740
caggcaactg cagagcatgt ttgatcttcc tgcgaaaggc acacccgtca acctcgctgt 10800
gcaccgtgac gagcagctga tcgtgctaga tagaaataac aaagaatgca cggttgctca 10860
ggctctaggc aatggggata aattcagggc cacagacaag cgcgttgtag attctctccg 10920
cgccatttgt gcagatctgg aagggtcgag ctccccgctc cccaaggtcg cacacaactt 10980
gggattttat ttctcgcctg atttgacaca gtttgctaaa ctcccggtag aacttgcacc 11040
ccactggccc gtggtgacaa cccagaacaa tgaaaagtgg ccagaccggt tggttgctag 11100
ccttcgcccc gtccataagt atagccgcgc gtgcatcggt gccggctaca tggtgggccc 11160
ctcagtgttt ctgggcaccc ctggggttgt gtcatactat ctcacaaaat ttgtcagggg 11220
cgaggctcaa atgcttccgg agacagtctt cagcaccggc cgaattgagg tagattgccg 11280
tgagtatctt gatgaccggg agcgagaaat tgctgagtcc ctcccccatg ctttcattgg 11340
cgacgtcaaa ggcactaccg ttggaggatg tcaccatgtc acctccaaat accttccgcg 11400
cttccttccc aaggaatcag tcgcggtagt cggggtttca agccccggga aagccgcaaa 11460
agcagtttgc acattaacag atgtgtatct cccagatctc gaagcttacc tccacccaga 11520
gacccagtcc aagtgctgga aaatgatgtt ggacttcaag gaagttcgac tgatggtctg 11580
gaaggacaag acggcctatt ttcaacttga aggccgccat ttcacctggt accagcttgc 11640
aagctatgcc tcgtacatcc gagttcctgt taactctacg gtgtatttgg acccctgcat 11700
gggccctgcc ctttgcaaca gaagagttgt cgggtccact cattggggag ctgacctcgc 11760
agtcacccct tatgattacg gtgccaaaat catcctgtct agtgcatacc atggtgaaat 11820
gccccctggg tacaaaatcc tggcgtgcgc ggagttctcg cttgacgatc cagtgaggta 11880
caaacacacc tgggggtttg aatcggatac agcgtatctg tacgagttca ccggaaacgg 11940
tgaggactgg gaggattaca atgatgcgtt tcgtgcgcgc cagaaaggga aaatttataa 12000
ggccactgcc accagcatga ggtttcattt tcccccgggc cctgtcattg aaccaacttt 12060
aggcctgaat tgaaatgaaa tggggtccat gcaaagcctc tttgacaaaa ttggccaact 12120
ttttgtggat gctttcacgg aatttttggt gtccattgtt gatatcatta tatttttggc 12180
cattttgttt ggcttcacca tcgccggttg gctggtggtc ttttgcatca gattggtttg 12240
ctccgcgata ctccgtgcgc gctctaccat tcactctgag caattacaga agatcctatg 12300
aggccttcct ctcccagtgt caagtggaca tccccgcttg gggaaccaaa catcccctag 12360
ggatgctttg gcaccacaag gtatcgaccc tgatcgatga aatggtgtcg cgtcgaatgt 12420
accgcatcat ggaaaaggca ggacaggctg cctggaaaca ggtggtgacc gaggccacgc 12480
tgtctcggat tagtagcttg gatgtggtag ctcattttca gcaccttgcc gccattgaag 12540
ccgagacctg taaatattta gcatcccggc tgcccatgct acacaacctg cgcttgacag 12600
ggtcaaatgt aaccatagtg tataatagta ctttgaatca ggtgtttgct gtttttccaa 12660
cccccggttc ccggccaaag cttcatgatt ttcagcaatg gttaatagct gtacattcct 12720
ccatattttc ctctgttgca gcttcttgta ctctttttgt tgtgctgtgg ttgcggattc 12780
caatgctacg tactgctttt ggtttccgct ggttaggggc aatttttctt tcgaactcac 12840
agtgaattac acggtgtgcc cgccttgcct cacccgacag gcggccgcag agatctacga 12900
acccggtagg tctctttggt gtaggatagg gcacgatcga tgtggggagg atgaccacga 12960
cgagttaggg ttcatggtac cacctggcct ctccaacgaa ggtcatttgg ccagtgttta 13020
cgcctggttg gcgttcttgt cctttagcta cacagcccag ttccaccctg aaatatttgg 13080
gatagggaat gtgagcagag tttatgttga catcaagcat caattcatct gcgctgttca 13140
tgacggacag aacaccacct tgcctcgcca cgacaacatc tcagctgtgt tccagaccta 13200
ttaccaacat caggtcgacg gcggcaattg gtttcaccta gaatggttgc gtcccttctt 13260
ttcctcttgg ttggttttga acgtctcttg gtttctcagg cgttcgcctg caagccatgt 13320
ttcagttcga gtctttcaga cattaagacc aacaccaccg cggcggcagg ctttgctatc 13380
ctccaggaca tcagctgtct taggcatggc aactcaacct ctgaggcgtt tcgcaagatt 13440
cctcaatgcc gcacggcgat agggacacca gtgtatatca ccatcacagc caatgtaaca 13500
gatgagaatt atttacattc ttctgacctt ctcatgctct ctgcttgcct tttctatgct 13560
tctgagatga gcgaaaaggg atttaaggtg gtatttggca atgtgtcagg catcgtggct 13620
gtgtgtgtca attttaccag ctacgtccaa cacgtcaagg agtctaccca gcgctcctta 13680
gtggtcaatc atgtacggct gctccatttc atgacacctg agaccatgag gtgggcgact 13740
gttttagcct gtctttttgc cattctgttg gccatttgaa tgtttaagta tgttggggag 13800
atgcttgacc gcgggctgtt gctcgcaatt gctttttttg tggtgtatcg tgccatcttg 13860
ttttgttgcg atcgtcagcg ccaacaacag cagcagctca aatttacagc tgatttacaa 13920
cttgacgcta tgtgagctga atggcacaga ttggctagct aacagatttg actgggcggt 13980
ggagtgtttt gttatttttc ctgtattgac tcacattgtc tcttatggtg ccctaaccac 14040
tagccacttc cttgacacag tcggtttggt cactgtgtct accgccggat ttgttcacgg 14100
gcggtatgtt ttgagtagca tttacgcggt ctgtgccctg gctgcgttga tttgcttcgt 14160
cattaggctt gcgaagaatt gcatgtcctg gcgctactca tgtaccagat ataccaactt 14220
tcttctagat accaagggca gactctaccg ttggcggtcg cctgtcatta tagagaaaag 14280
gggcaaagtt gaggtcgagg gtaaaaaaat cgacctcaaa agagttgtgc ttgatggttc 14340
cgcggcaacc cctgtaacca gagtttcggc ggagcaatgg ggtcatcctt agatgacttc 14400
tgccatgata gcacagcccc acaaaaggtg ctcttggcgt tttctatcac ctacacgcca 14460
gtgatgatat acgccctaaa ggtaagtcgc ggccgactgc tagggctttt gcaccttttg 14520
atcttcctga attgtgcttt caccttcggg tatatgacat tcatgcactt tcagagtaca 14580
aataaggtcg cgctcactat gggagcagta gtggcactcc tttggggggt gtactcagcc 14640
atagaaacct ggagattcat cacctccaga tgccgtttgt gcttgctagg ccgcaagtac 14700
attctggccc ctgcccacca cgttgaaagt gccgcaggct ttcatccgat tgcggcaaat 14760
gataaccacg catttgtcgt ccggcgtccc ggctctacta cggtcaacgg cacattggtg 14820
cccgggttga aaagcctcgt gttgggtggc agaaaagctg ttaaacaggg agtggtaaac 14880
cttgttaaat atgccaaata acaacggcaa gcagcagaag agaaagaagg gggatggcca 14940
gccagtcaat cagctgtgcc aaatgctggg caaaattatc gcccagcaaa accagtccag 15000
aggcaaggga ccgggaaaga aaaataagaa gaaaaacccc gagaagcccc atttccctct 15060
tgcggctgaa gatgatgtca gacatcactt tacccctagt gagcggcaat tgtgtctgtc 15120
gtcaatccag accgccttta atcaaggcgc tgggacctgc accctatcag attcagggag 15180
gataagttac actgtggagt ttagtttgcc tacgcatcat actgtgcgcc tgatccgtgt 15240
cacagcatca ccttcagcat gatgagctgg cattcttgtg gcatcccagt atttgaattg 15300
gaataatgcg tggtgaatgg cactgattga cattgtgcct tcaagtcacc tattcaatta 15360
gggcgaccgt gtgggggcaa gatttaattg gcgagaacca cacggccgaa attaaaaaaa 15420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaacgtt aattaacgat gcccttgaga 15480
gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt 15540
atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct ctgggtcatt 15600
ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct tgcggtattc 15660
ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa acgtttcggc 15720
gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt cttgctggcg 15780
ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc cggcggcatc 15840
gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca tcagggacag 15900
cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc gctgatcgtc 15960
acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat tgtaggcgcc 16020
gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg ggccacctcg 16080
acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga attggagcca 16140
atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac atatccatcg 16200
cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg tcctggccac 16260
gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg ggttgcctta 16320
ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc tgctgcaaaa 16380
cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg taaagtctgg 16440
aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca ggatgctgct 16500
ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga ccctgagtga 16560
tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa cgttccagta 16620
accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt ttcatcggta 16680
tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc aaacaggaaa 16740
aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac 16800
tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg 16860
atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 16920
tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 16980
gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta 17040
gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 17100
gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg 17160
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 17220
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 17280
gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 17340
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 17400
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 17460
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 17520
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 17580
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 17640
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 17700
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 17760
gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 17820
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 17880
tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 17940
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 18000
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 18060
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 18120
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 18180
cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 18240
gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 18300
cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 18360
ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc 18420
aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 18480
atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 18540
tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 18600
gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 18660
aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac 18720
acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 18780
ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 18840
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 18900
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 18960
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 19020
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 19080
aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 19140
gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attctcatgt ttgacagctt atcatcgata 19200
agcttcggac cgtaatacga ctcactatag g 19231
<210> 2
<211> 19231
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRRS K418DM
<400> 2
atgacgtata ggtgttggct ctatgccatg acatttgtat tgtcaggagc tgcgaccatt 60
ggtacagccc aaaactagct gcacagaaaa cgcccttctg tgacagccct cttcagggga 120
gcttaggggt ctgtccctag caccttgctt ccggagttgc actgctttac ggtctctcca 180
accctttaac catgtctggg atacttgatc ggtgcacgtg cacccccaat gccagggtgt 240
ttatggcgga gggccaagtc tactgcacac gatgtctcag tgcacggtct ctccttcctc 300
tgaatctcca agttcctgag cttggagtgc tgggcctatt ttacaggccc gaagagccac 360
tccggtggac gttgccacgt gcattcccca ctgttgagtg ctcccccgcc ggggcctgct 420
ggctttctgc gatctttcca attgcacgaa tgaccagtgg aaacctgaac tttcaacaaa 480
gaatggtgcg ggtcgcagct gagatttaca gagccggcca gctcacccct gcagtcttga 540
aggctctaca agtttatgaa cggggttgcc gctggtaccc tatagtcgga cctgtccctg 600
gagtggccgt ttttgccaac tccctacatg tgagtgataa acctttcccg ggagcaactc 660
atgtgctaac caacctgcca ctcccgcaga ggcctaagcc tgaagacttt tgcccttttg 720
agtgtgctat ggctgacgtc tatgatattg gtcatggcgc cgtcatgtat gtggccaaag 780
ggaaagtctc ctgggcccct cgtggcgggg atgaggcgaa atttgaaact gtccctaggg 840
agttgaagtt gatcgcgaac caactccaca tctccttccc gccccaccac gcagtggaca 900
tgtctaagtt tgtgttcata gcccctggga gtggtgtctc tatgcgggtc gagtgcccac 960
acggctgtct ccccgctaat actgtccctg aaggtaactg ctggtggcgc ttgtttgact 1020
cgctcccact ggacgttcag aacaaagaaa ttcgccgtgc caaccaattc ggctatcaaa 1080
ccaagcatgg tgtcgctggc aagtacctac aacggaggct gcaagctaat ggtctccgag 1140
cagtgactga tacagatggg cctatcgttg tacagtactt ctctgttagg gagagctgga 1200
tccgccactt cagactggcg gaagagccta gcctccctgg gtttgaagac ctcctcagaa 1260
taagggtaga gcccaatacg tcgccattga gtgacaaggg tggaaaaatc ttccggtttg 1320
gcagtcacaa atggtacggt gctggaaaga gagcaaggaa agcacgctct ggtatgacca 1380
ccacagtcgc tcaccgcgcc ttgcccgctc gtgaaatcca gcaagccaaa aagcacgagg 1440
atgccggcgc tgataaggct gtgcatctca ggcactattc tccgcctgcc gacgggaact 1500
gtggttggca ctgcatttcc gccatcgcca accgaatggt gaattccaaa tttgaaacta 1560
ctcttcccga gagggtgaga ccttcggatg actgggctac tgacgaggac cttgtgaaca 1620
ccatccaaat tctcaagctc cctgcggcct tggacaggaa cggtgcttgt gttggcgcca 1680
aatacgtgct taagttggaa ggcgagcatt ggactgtctc tgtgaccctt gggatgtccc 1740
cttctttgct cccccttgaa tgtgttcagg gctgttgtga gcataagagc ggacttggtc 1800
ccccagatgc ggtcgaagtt ttcggatttg accctgcctg ccttgaccga ctggctgagg 1860
taatgcactt gcctagcagt gtcatcccag ctgctctggc cgaaatgtcc ggcgacccca 1920
actgtccggc ttccccggtc actactgtgt ggactgtttc acaattcttt gcccgccaca 1980
gaggaggaga gcaccctgat caggtgcgct taggaaaaat catcagcctt tgtcaagttg 2040
ttgaggaatg ctgttgccat cagaataaaa ccaaccgggc caccccggaa gaggttgcgg 2100
caaggattga tcagtacctc catggtgcaa caagtcttga agaatgcttg attaggcttg 2160
agagggtttg cccgccgagc gctgcggaca ccttctttga ttggaatgtt gtgctccctg 2220
gggttggggc ttcaactcag acaaccaaac agctccatgt caaccagtgc cgcgctctgg 2280
ttcctgtcgt gactcaagag cctttggaca aagactcagt ccctctgacc gccttctcgc 2340
tgtccaattg ctactatcct gcacaaggtg acgaggttcg tcaccgtgag aggctaaact 2400
ccgtactctc taagctggag ggggttgttc gtgaggaata tgggctcacg ccaactgaac 2460
ctggcccgcg acccgcacta ccgaacgggc tcgtcgaact taaagaccag atggaggagg 2520
atctgctgaa actagtcaac gcccaggcaa cttcagaaat gatggcctgg gcagccgagc 2580
aggttgatct gaaagcttgg gtcaaaaact acccacggtg gacaccgcca ccccctccac 2640
caagagttca gcctcgaaaa acaaagtctg tcaagagctt gccagggaac aaacctgtcc 2700
ccgctccacg caggaaggtc agatctgatt gtggcagccc gattttgatg ggcgacaatg 2760
ttcctgacgg tcgggaagat ttgactgttg gtggccccct tgatctttcg acaccatccg 2820
agccgatgac acctctgagt gagcctgcac ttatgcccgc gttgcaatat atttctaggc 2880
cagtgacatc tttgagtgtg ctggccccag ttcctgcacc gcgtagaact gtgtcccgac 2940
cggtgacgcc cttgagtgag ccaatttttg tgtctgcacc gcgacacaaa tttcagcagg 3000
tggaagaagc gaatctggcg gcaacaacgc tgacgcacca ggacgaacct ctagatttgt 3060
ctgcatcctc acagactgaa tatgaggctt ctcccctaac accactgcag aacatgggta 3120
ttctggaggt gggggggcaa gaagctgagg aagttctgag tgaaatctcg gatacactga 3180
atgacatcaa ccctgcacct gtgtcatcaa gcagctccct gtcaagtgtt aagatcacac 3240
gcccaaaaca ctctgctcaa gccatcattg actcgggcgg gccctgcagt gggcatctcc 3300
gaagggaaaa agaagcatgc ctcagcatca tgcgtgaggc ttgtgatgcg gctaagctta 3360
gtgaccctgc cacgcaggaa tggctttctc gcatgtggga tagggttgac atgctgactt 3420
ggcgcaacac gtctgcttac caggcgttcc gcatcttaga tggtaggttt gagtttctcc 3480
caaagatgat actcgagaca ccgccgccct acccgtgtgg gtttgtgatg ctgcctcaca 3540
cgcctgcacc ttccgtgggt gcagagagtg accttaccat tggttcagtc gccactgaag 3600
atgttccacg catcctcggg aaaatagaaa acgccggcga gatgcccaac caggggctct 3660
tgacatcctt cggggaagaa ccggtgtgcg accaacctgt caaggactcc tggatgtcgt 3720
cgcgggggtt tgacgagagc acaacggctc cgtccgctgg tacaggtggt gctgacttac 3780
ccaccgattt gccaccttca gatggtttgg atgcggacga gtgggggccg ttacggacgg 3840
taagaaagaa agctgaaagg ctcttcgacc aattgagccg tcaggttttt aacctcgtct 3900
cccatctccc tgttttcttc tcacacctct tcaaatctga cagtggttat tctccgggtg 3960
attggggttt tgcagctttt actttatttt gcctcttttt gtgttacagc tacccattct 4020
ttggttttgt tcccctcttg ggtgtttttt ctgggtcttc tcggcgtgtg cgcatggggg 4080
tttttggctg ttggttggct tttgctgttg gcctgttcaa gcctgtgtcc gacccagtcg 4140
gcactgcttg tgagtttgac tcgccagagt gtaggaacgt ccttcattct tttgagcttc 4200
tcaaaccttg ggaccctgtt cgcagccttg ttgtgggccc cgtcggtctc ggccttgcca 4260
ttcttggcag gttactgggc ggggcacgct acatctggca ttttttgctt aggcttggca 4320
ttgttgcaga ttgtatcttg gctggagctt atgtgctttc tcaaggtagg tgtaaaaagt 4380
gctggggatc ttgtgtaaga actgctccta atgaaatcgc cttcaacgtg ttccctttta 4440
cgcgtgcgac caggtcgtca ctcatcgacc tgtgcgatcg gttttgtgcg ccaaaaggca 4500
tggaccccat tttcctcgct actgggtggc gcgggtgctg gaccggccga agtcccattg 4560
agcaaccctc tgaaaaaccc atcgcgttcg cccagttgga tgaaaagagg attacggcta 4620
gaactgtggt cgctcagcct tatgatccta accaagccgt aaagtgcttg cgggtgttac 4680
aggcgggtgg ggcgatagtg gccgaggcag tcccaaaagt ggtcaaggtt tccgctattc 4740
cattccgagc tccctttttt cccaccggag tgaaggttga tcctgagtgc aggatcgtgg 4800
tcgaccccga cacttttact acagctctcc ggtctggtta ctccaccaca aacctcgtcc 4860
ttggtgtggg ggactttgcc caactgaatg gattaaaaat caggcaaatt tccaagccct 4920
cgggaggagg cccgcacctc attgctgccc tgcatgttgc ttgctcgatg gcgttgcaca 4980
tgcttgctgg agtttatgta actgcagtgg ggtcttgcgg taccggcacc aacgatccgt 5040
ggtgcactaa cccattcgcc gtccctggct acggacctgg ctccctctgc acgtccagat 5100
tgtgcatctc ccaacatggc cttaccctgc ccttgacagc acttgtggca ggattcggtc 5160
ttcaggaaat tgccctagtc gttttgattt tcgtttccat cggaggcatg gctcataggt 5220
tgagttgtaa ggctgatatg ctgtgcgtct tacttgcaat cgccagctat gtttgggtac 5280
cccttacctg gttgctctgt gtgtttcctt gctggttgcg ctggttctct ttgcaccctc 5340
tcaccattct atggttggtg tttttcttga tgtctgtaaa tatgccttcg ggaatcttaa 5400
ccgtggtgtt attggttgct ctttggcttc taggccgtta tactaatgtt gttggtcttg 5460
ttacccccta tgatattcat cattacacca atggcccccg cggtgttgcc gccttggcta 5520
ccgcaccaga tgggacttac ttggccgctg tccgccgcgc tgcgttgact ggccgcaccg 5580
tgctgtttac cccgtctcag cttgggtccc ttcttgaggg cgctttcaga actcgaaagc 5640
cctcactgaa caccgtcaat gtggtcgggt cctccatggg ctctggcgga gtgttcacta 5700
tcgatgggaa aattaagtgc gtgactgccg cacatgtcct tacgggtaat tcagctaggg 5760
tttccggggt cggcttcaat caaatgcttg actttgatgt aaaaggggac ttcgccatag 5820
ctgattgccc gaattggcaa ggggctgctc ctaagaccca attctgcgag gatggatgga 5880
ctggccgcgc ctattggctg acatcctctg gcgtcgaacc cggtgtcatt gggaatggat 5940
tcgccttctg cttcaccgcg tgcggcgatt ccgggtcccc agtgatcacc gaagccggtg 6000
agcttgtcgg cgttcacaca ggatcaaaca aacaaggagg aggcattgtt acgcgcccct 6060
ctggccagtt ttgcaatgtg gcacccatca agctgagcga attaagtgag ttctttgctg 6120
gacctaaggt cccgctcggt gatgtgaagg ttggcagcca cataattaaa gacatatgcg 6180
aggtaccttc agatctttgc gccttgcttg ctgccaaacc cgaactggaa ggaggcctct 6240
ccaccgtcca acttctgtgt gtgtttttcc tcctgtggag aatgatggga catgcctgga 6300
cgcccttggt tgctgttggg ttttttatct tgaatgaggt tctcccagct gtactggtcc 6360
ggagtgtttt ctcctttgga atgtttgtgc tatcttggct cacaccatgg tctgcgcaag 6420
ttctgatgat caggcttcta acagcagctc ttaacaggaa cagattgtca ctcgcctttt 6480
acagccttgg tgcagcgacc ggttttgtcg cagatctggc ggcaactcaa gggcacccgt 6540
tgcaggcagt aatgaattta agtacctatg ccttcctgcc tcggataatg gtcgtgacct 6600
caccagtccc agtgattgcg tgtggtgttg tgcacctcct tgccataatt ttgtacttgt 6660
ttaagtaccg ctgcctgcac aatgtccttg ttggcgatgg tgcgttctct gcggctttct 6720
tcttgcgata ctttgccgag gggaaattga gggaaggggt gtcgcaatcc tgcgggatga 6780
atcatgagtc gctgactggt gccctcgcta tgagacttaa tgacgaggac ttggattttc 6840
ttacgaaatg gactgatttt aagtgttttg tttctgcatc caacatgagg aatgcggcgg 6900
gccagttcat cgaggctgcc tatgctaaag cacttagaat tgaacttgcc cagttggtgc 6960
aggttgataa ggttcgaggt actttggcca aacttgaagc ttttgctgat accgtggcac 7020
cccaactctc gcccggtgac attgttgttg ctcttggcca tacgcctgtt ggcggtatct 7080
tcgacctaaa ggttggtagc accaagcata ccctccaagc cattgagacc agagttcttg 7140
ccgggtccaa aatgaccgtg gcgcgtgtcg ttgatccaac ccccacaccc ccacccgcac 7200
ccgtgcctat cccccttcca ccgaaagttc tggagaatgg tcccaacgcc tggggggatg 7260
aggatcgttt gaataagaag aagaggcgca ggatggaagc cgtcggcatc tttgttatgg 7320
gtggaaagaa atatcagaaa ttttgggaca agaactccgg tgatgtgttt tatgaggagg 7380
tccatgataa cacagacgcg tgggagtgcc tcagagttga caaccctgcc gactttgacc 7440
ctgagaaggg aactctgtgc gggcatacta ccattgaaga taagacttac agtgtctacg 7500
cctccccatc tggcaagaaa ttcctggtcc ccgtctaccc agagagcaaa aaaaaccaat 7560
gggaagctgc gaagctttcc gtggaacagg cccttggcat gatgaatgtc gacggtgaac 7620
tgacagccaa agaagtggag aaactgaaaa gaataattga caaactccag ggcctgacta 7680
aggagcagtg tttaaactgc tagccgccag cggcttgacc cgctgtggtc gcggcggctt 7740
ggttgttact gagacagcgg taaaaatagt caaatttcac aaccggacct tcaccctagg 7800
acctgtgaat ttaaaagtgg ccagtgaggt tgagctaaaa gacgcggtcg agcataacca 7860
acacccggtt gcaagaccgg ttgatggtgg tgttgtgctc ctgcgctccg cagttccttc 7920
gcttatagac gtcttaatct ccggcgctga tgcatctccc aagttactcg cccgccacgg 7980
gccgggaaac actgggatcg atggcacgct ttgggatttt gaggccgagg ccactaaaga 8040
ggaaattgca ctcagtgcgc aaataataca ggcttgtgac attaggcgcg gcgacgcacc 8100
tgaaattggt cttccttata agctgtaccc tgtcaggggc aaccctgagc gggtaaaagg 8160
agttttacag aatacaaggt ttggagacat accttataaa acccccagtg acactggaag 8220
cccagtgcac gcggctgcct gcctcacgcc caatgccact ccggtgactg atgggcgctc 8280
cgtcttggcc acgactatgc cctccggttt tgagttgtat gtaccgacca ttccagcgtc 8340
tgtccttgat tatcttgatt ctaggcctga ctgccccaaa cagttgacag agcacggctg 8400
tgaggacgcc gcattaagag acctctccaa gtatgacttg tccacccaag gctttgtttt 8460
acctggagtt cttcgccttg tgcgtaagta cctgtttgct catgtgggta agtgcccgcc 8520
cgttcatcgg ccttccactt accctgccaa gaattctatg gctggaataa atgggaacag 8580
gtttccaacc aaggacatcc agagcgtccc tgaaatcgac gttctgtgcg cacaggccgt 8640
gcgggaaaac tggcaaactg ttaccccttg taccctcaag aaacagtatt gtgggaagaa 8700
gaagactagg acaatactcg gcaccaataa cttcattgcg ctggcccacc gggcagcgtt 8760
gagtggtgtc acccagggct tcatgaaaaa ggcgtttaac tcgcccattg ccctcggtaa 8820
aaacaaattt aaagagcttc agactccggt cttaggcagg tgccttgaag ctgatcttgc 8880
atcctgcgat cgctccacac ctgcaattgt ccgctggttt gccgccaatc ttctttatga 8940
acttgcctgt gctgaagagc acctgccgtc gtacgtgttg aactgctgcc acgacctact 9000
ggtcacgcag tccggcgcag taactaagag aggtggcctg tcgtctggcg acccgatcac 9060
ttctgtgtcc aacaccattt acagcttggt gatatatgca caacacatgg tgctcagtta 9120
ctttaaaagt ggtcaccctc atggccttct gtttctacaa gaccagctga agtttgagga 9180
catgctcaag gttcaacccc tgatcgtcta ttcggacgac ctcgtactgt atgccgagtc 9240
tcccaccatg ccaaactacc actggtgggt tgaacatctg aacctgatgc tgggttttca 9300
gacggaccca aagaagacag ccataacaga ctcgccatca tttctaggct gtaggataat 9360
aaatggacgc cagctcgtcc ctaaccgtga caggattctc gcggccctcg cctaccatat 9420
gaaggcaagc aatgtctctg aatactacgc ctcggcggct gcgatactca tggacagctg 9480
tgcttgttta gagtatgatc ccgaatggtt tgaagagctt gtagttggga tagcgcagtg 9540
tgcccgcaag gacggctaca gttttcccgg cccgccgttc ttcttgtcca tgtgggaaaa 9600
actcagatcc aatcatgagg ggaagaagtc cagaatgtgc gggtactgcg gggccccggc 9660
tccgtacgcc actgcctgtg gcctcgacgt ctgtatttac cacacccact tccaccagca 9720
ttgtccagtc atcatctggt gtggccaccc ggctggttct ggttcttgta gtgagtgcaa 9780
acccccccta gggaaaggca caagccctct agatgaggtg ttggaacaag tcccgtataa 9840
gcctccacgg actgtaatca tgcatgtgga gcagggtctc acccctcttg acccaggcag 9900
ataccagact cgccgcggat tagtctccgt taggcgtggc attagaggaa atgaggttga 9960
tctaccagac ggtgattatg ctagcaccgc cctactccct acttgtaaag agattaacat 10020
ggtcgctgtc gcctctaatg tgttgcgcag caggttcatc atcggcccgc ctggtgctgg 10080
gaaaacatac tggctccttc aacaggtcca ggatggtgat gtcatttaca cgccaactca 10140
ccagaccatg ctcgacatga ttagggcttt ggggacgtgc cggttcaacg tcccagcagg 10200
tacgacgctg caattccctg ccccctcccg taccggccct tgggttcgca tcctagccgg 10260
cggttggtgt cctggcaaga attccttcct ggatgaagca gcgtattgta atcaccttga 10320
tgtcttgagg cttcttagca aaactaccct cacctgtctg ggagatttca aacaactcca 10380
cccagtgggt tttgattctc attgctatgt ttttgacatc atgcctcaga ctcaactgaa 10440
gaccatctgg agatttggac agaatatctg tgatgccatt cagccagatt acagggacaa 10500
acttgtatcc atggtcaaca caacccgtgt aacctacgtg gaaaaacctg tcaagtatgg 10560
gcaagtcctc accccttacc acagggaccg agaggacggc gccatcacaa ttgactccag 10620
tcaaggcgcc acatttgatg tggttacact gcatttgccc actaaagatt cactcaacag 10680
gcaaagagcc cttgttgcta ttaccagggc aagacatgct atctttgtgt atgacccaca 10740
caggcaactg cagagcatgt ttgatcttcc tgcgaaaggc acacccgtca acctcgctgt 10800
gcaccgtgac gagcagctga tcgtgctaga tagaaataac aaagaatgca cggttgctca 10860
ggctctaggc aatggggata aattcagggc cacagacaag cgcgttgtag attctctccg 10920
cgccatttgt gcagatctgg aagggtcgag ctccccgctc cccaaggtcg cacacaactt 10980
gggattttat ttctcgcctg atttgacaca gtttgctaaa ctcccggtag aacttgcacc 11040
ccactggccc gtggtgacaa cccagaacaa tgaaaagtgg ccagaccggt tggttgctag 11100
ccttcgcccc gtccataagt atagccgcgc gtgcatcggt gccggctaca tggtgggccc 11160
ctcagtgttt ctgggcaccc ctggggttgt gtcatactat ctcacaaaat ttgtcagggg 11220
cgaggctcaa atgcttccgg agacagtctt cagcaccggc cgaattgagg tagattgccg 11280
tgagtatctt gatgaccggg agcgagaaat tgctgagtcc ctcccccatg ctttcattgg 11340
cgacgtcaaa ggcactaccg ttggaggatg tcaccatgtc acctccaaat accttccgcg 11400
cttccttccc aaggaatcag tcgcggtagt cggggtttca agccccggga aagccgcaaa 11460
agcagtttgc acattaacag atgtgtatct cccagatctc gaagcttacc tccacccaga 11520
gacccagtcc aagtgctgga aaatgatgtt ggacttcaag gaagttcgac tgatggtctg 11580
gaaggacaag acggcctatt ttcaacttga aggccgccat ttcacctggt accagcttgc 11640
aagctatgcc tcgtacatcc gagttcctgt taactctacg gtgtatttgg acccctgcat 11700
gggccctgcc ctttgcaaca gaagagttgt cgggtccact cattggggag ctgacctcgc 11760
agtcacccct tatgattacg gtgccaaaat catcctgtct agtgcatacc atggtgaaat 11820
gccccctggg tacaaaatcc tggcgtgcgc ggagttctcg cttgacgatc cagtgaggta 11880
caaacacacc tgggggtttg aatcggatac agcgtatctg tacgagttca ccggaaacgg 11940
tgaggactgg gaggattaca atgatgcgtt tcgtgcgcgc cagaaaggga aaatttataa 12000
ggccactgcc accagcatga ggtttcattt tcccccgggc cctgtcattg aaccaacttt 12060
aggcctgaat tgaaatgaaa tggggtccat gcaaagcctc tttgacaaaa ttggccaact 12120
ttttgtggat gctttcacgg aatttttggt gtccattgtt gatatcatta tatttttggc 12180
cattttgttt ggcttcacca tcgccggttg gctggtggtc ttttgcatca gattggtttg 12240
ctccgcgata ctccgtgcgc gctctaccat tcactctgag caattacaga agatcctatg 12300
aggccttcct ctcccagtgt caagtggaca tccccgcttg gggaaccaaa catcccctag 12360
ggatgctttg gcaccacaag gtatcgaccc tgatcgatga aatggtgtcg cgtcgaatgt 12420
accgcatcat ggaaaaggca ggacaggctg cctggaaaca ggtggtgacc gaggccacgc 12480
tgtctcggat tagtagcttg gatgtggtag ctcattttca gcaccttgcc gccattgaag 12540
ccgagacctg taaatattta gcatcccggc tgcccatgct acacaacctg cgcttgacag 12600
ggtcaaatgt aaccatagtg tataatagta ctttgaatca ggtgtttgct gtttttccaa 12660
cccccggttc ccggccaaag cttcatgatt ttcagcaatg gttaatagct gtacattcct 12720
ccatattttc ctctgttgca gcttcttgta ctctttttgt tgtgctgtgg ttgcggattc 12780
caatgctacg tactgctttt ggtttccgct ggttaggggc aatttttctt tcgaactcac 12840
agtgaattac acggtgtgcc cgccttgcct cacccgacag gcggccgcag agatctacga 12900
acccggtagg tctctttggt gtaggatagg gcacgatcga tgtggggagg atgaccacga 12960
cgagttaggg ttcatggtac cacctggcct ctccaacgaa ggtcatttgg ccagtgttta 13020
cgcctggttg gcgttcttgt cctttagcta cacagcccag ttccaccctg aaatatttgg 13080
gatagggaat gtgagcagag tttatgttga catcaagcat caattcatct gcgctgttca 13140
tgacggacag aacaccacct tgcctcgcca cgacaacatc tcagctgtgt tccagaccta 13200
ttaccaacat caggtcgacg gcggcaattg gtttcaccta gaatggttgc gtcccttctt 13260
ttcctcttgg ttggttttga acgtctcttg gtttctcagg cgttcgcctg caagccatgt 13320
ttcagttcga gtctttcaga cattaagacc aacaccaccg cggcggcagg ctttgctatc 13380
ctccaggaca tcagctgtct taggcatggc aactcaacct ctgaggcgtt tcgcaagatt 13440
cctcaatgcc gcacggcgat agggacacca gtgtatatca ccatcacagc caatgtaaca 13500
gatgagaatt atttacattc ttctgacctt ctcatgctct ctgcttgcct tttctatgct 13560
tctgagatga gcgaaaaggg atttaaggtg gtatttggca atgtgtcagg catcgtggct 13620
gtgtgtgtca attttaccag ctacgtccaa cacgtcaagg agtctaccca gcgctcctta 13680
gtggtcaatc atgtacggct gctccatttc atgacacctg agaccatgag gtgggcgact 13740
gttttagcct gtctttttgc cattctgttg gccatttgaa tgtttaagta tgttggggaa 13800
atgcttgacc gcgggctgtt gctcgcaatt gctttttttg tggtgtatcg tgccgtcttg 13860
ttttgttgcg atcgtcagcg ccaacgctag cagcagctca aatttacagc tgatttacaa 13920
cttgacgcta tgtgagctgg caggcacaga ttggctagct aacagatttg actgggcggt 13980
ggagtgtttt gttatttttc ctgtattgac tcacattgtc tcttatggtg ccctaaccac 14040
tagccacttc cttgacacag tcggtttggt cactgtgtct accgccggat ttgttcacgg 14100
gcggtatgtt ttgagtagca tttacgcggt ctgtgccctg gctgcgttga tttgcttcgt 14160
cattaggctt gcgaagaatt gcatgtcctg gcgctactca tgtaccagat ataccaactt 14220
tcttctagat accaagggca gactctaccg ttggcggtcg cctgtcatta tagagaaaag 14280
gggcaaagtt gaggtcgagg gtcaactaat cgaccccaaa agagttgtgc ttgatggttc 14340
cccggcaacc cctgtaacca gagtttcagc ggaacaatgg ggtcatcctt agatgacttc 14400
tgccatgata gcacagcccc acaaaaggtg ctcttggcgt tttctatcac ctacacgcca 14460
gtgatgatat acgccctaaa ggtaagtcgc ggccgactgc tagggctttt gcaccttttg 14520
atcttcctga attgtgcttt caccttcggg tatatgacat tcatgcactt tcagagtaca 14580
aataaggtcg cgctcactat gggagcagta gtggcactcc tttggggggt gtactcagcc 14640
atagaaacct ggagattcat cacctccaga tgccgtttgt gcttgctagg ccgcaagtac 14700
attctggccc ctgcccacca cgttgaaagt gccgcaggct ttcatccgat tgcggcaaat 14760
gataaccacg catttgtcgt ccggcgtccc ggctctacta cggtcaacgg cacattggtg 14820
cccgggttga aaagcctcgt gttgggtggc agaaaagctg ttaaacaggg agtggtaaac 14880
cttgttaaat atgccaaata acaacggcaa gcagcagaag agaaagaagg gggatggcca 14940
gccagtcaat cagctgtgcc aaatgctggg caaaattatc gcccagcaaa accagtccag 15000
aggcaaggga ccgggaaaga aaaataagaa gaaaaacccc gagaagcccc atttccctct 15060
tgcggctgaa gatgatgtca gacatcactt tacccctagt gagcggcaat tgtgtctgtc 15120
gtcaatccag accgccttta atcaaggcgc tgggacctgc accctatcag attcagggag 15180
gataagttac actgtggagt ttagtttgcc tacgcatcat actgtgcgcc tgatccgtgt 15240
cacagcatca ccttcagcat gatgagctgg cattcttgtg gcatcccagt atttgaattg 15300
gaataatgcg tggtgaatgg cactgattga cattgtgcct tcaagtcacc tattcaatta 15360
gggcgaccgt gtgggggcaa gatttaattg gcgagaacca cacggccgaa attaaaaaaa 15420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaacgtt aattaacgat gcccttgaga 15480
gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt 15540
atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct ctgggtcatt 15600
ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct tgcggtattc 15660
ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa acgtttcggc 15720
gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt cttgctggcg 15780
ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc cggcggcatc 15840
gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca tcagggacag 15900
cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc gctgatcgtc 15960
acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat tgtaggcgcc 16020
gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg ggccacctcg 16080
acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga attggagcca 16140
atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac atatccatcg 16200
cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg tcctggccac 16260
gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg ggttgcctta 16320
ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc tgctgcaaaa 16380
cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg taaagtctgg 16440
aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca ggatgctgct 16500
ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga ccctgagtga 16560
tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa cgttccagta 16620
accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt ttcatcggta 16680
tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc aaacaggaaa 16740
aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac 16800
tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg 16860
atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 16920
tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 16980
gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta 17040
gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 17100
gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg 17160
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 17220
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 17280
gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 17340
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 17400
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 17460
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 17520
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 17580
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 17640
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 17700
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 17760
gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 17820
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 17880
tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 17940
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 18000
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 18060
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 18120
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 18180
cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 18240
gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 18300
cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 18360
ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc 18420
aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 18480
atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 18540
tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 18600
gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 18660
aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac 18720
acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 18780
ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 18840
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 18900
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 18960
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 19020
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 19080
aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 19140
gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attctcatgt ttgacagctt atcatcgata 19200
agcttcggac cgtaatacga ctcactatag g 19231
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LMY forward primer
<400> 3
gtggatgctt tcacggagtt c 21
<210> 4
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LMY reverse primer
<400> 4
cacacttaat taacgttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttaa 60
tttcggccgt gtggttc 77
<210> 5
<211> 603
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRRS K418 GP5
<400> 5
atgttgggga gatgcttgac cgcgggctgt tgctcgcaat tgcttttttt gtggtgtatc 60
gtgccatctt gttttgttgc gatcgtcagc gccaacaaca gcagcagctc aaatttacag 120
ctgatttaca acttgacgct atgtgagctg aatggcacag attggctagc taacagattt 180
gactgggcgg tggagtgttt tgttattttt cctgtattga ctcacattgt ctcttatggt 240
gccctaacca ctagccactt ccttgacaca gtcggtttgg tcactgtgtc taccgccgga 300
tttgttcacg ggcggtatgt tttgagtagc atttacgcgg tctgtgccct ggctgcgttg 360
atttgcttcg tcattaggct tgcgaagaat tgcatgtcct ggcgctactc atgtaccaga 420
tataccaact ttcttctaga taccaagggc agactctacc gttggcggtc gcctgtcatt 480
atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgag ggtaaaaaaa tcgacctcaa aagagttgtg 540
cttgatggtt ccgcggcaac ccctgtaacc agagtttcgg cggagcaatg gggtcatcct 600
tag 603
Claims (11)
- 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 키메릭 변이주의 DNA로서, 상기 서열번호 2의 1-12160번째 염기 및 15467-19231번째 염기는 PRRSV FL12에서 유래한 것이고, 12161-15466번째 염기는 LMY 변이주에서 유래한 것이고, 13886-13888번째 염기 및 13940-13942번째 염기에서 탈글리코실화 돌연변이가 일어난 DNA.
- 제1항의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 키메릭 변이주의 DNA를 전사한 RNA.
- 제1항의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 키메릭 변이주의 DNA를 포함하는 세포.
- 제3항에 있어서, 상기 세포는 Escherichia coli DH5α 세포인 세포.
- 제1항의 DNA 또는 제2항의 RNA를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신.
- 제5항에 있어서, 상기 백신은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주번트(adjuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신.
- 제5항에 있어서, 상기 DNA 또는 RNA는 불활화된 것인 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 백신.
- 제3항 또는 제4항의 세포를 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 키메릭 변이주의 생산방법.
- 제3항 또는 제4항의 세포를 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신을 생산하는 방법.
- 제1항의 DNA 또는 제2항의 RNA를 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 백신을 생산하는 방법.
- 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 키메릭 변이주의 불활화된 DNA를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 사독백신.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20130124958 | 2013-10-19 | ||
KR1020130124958 | 2013-10-19 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020140020008A Division KR20150045873A (ko) | 2013-10-19 | 2014-02-21 | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20160036552A KR20160036552A (ko) | 2016-04-04 |
KR101614679B1 true KR101614679B1 (ko) | 2016-04-21 |
Family
ID=52828275
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020140020008A KR20150045873A (ko) | 2013-10-19 | 2014-02-21 | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주 |
KR1020160034730A KR101614679B1 (ko) | 2013-10-19 | 2016-03-23 | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020140020008A KR20150045873A (ko) | 2013-10-19 | 2014-02-21 | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
KR (2) | KR20150045873A (ko) |
WO (1) | WO2015056850A1 (ko) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20200037570A (ko) * | 2018-10-01 | 2020-04-09 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102335864B1 (ko) * | 2018-12-27 | 2021-12-06 | 주식회사 바이오포아 | 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스 및 이를 이용한 백신 |
WO2020138761A1 (ko) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | 주식회사 바이오포아 | 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 키메라 바이러스 및 이를 이용한 백신 |
CN110904055B (zh) * | 2019-11-15 | 2023-10-13 | 华南农业大学 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株prrsv-sp及其制备方法与应用 |
WO2023128051A1 (ko) * | 2021-12-30 | 2023-07-06 | 주식회사 바이오포아 | 돼지생식기호흡기증후군바이러스 유래 펩타이드를 발현하는 키메라 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7666585B2 (en) * | 2007-06-15 | 2010-02-23 | Protatek International, Inc. | Construction of chimera PRRSV, compositions and vaccine preparations |
KR20120131533A (ko) * | 2011-05-25 | 2012-12-05 | 건국대학교 산학협력단 | 면역원성이 증강된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 제작과 그 이용 |
KR101245029B1 (ko) * | 2012-01-18 | 2013-03-18 | 서울대학교산학협력단 | 한국형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 예방 백신 조성물 |
-
2014
- 2014-02-21 KR KR1020140020008A patent/KR20150045873A/ko active Application Filing
- 2014-02-28 WO PCT/KR2014/001700 patent/WO2015056850A1/ko active Application Filing
-
2016
- 2016-03-23 KR KR1020160034730A patent/KR101614679B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
제21회 기초의학 학술대회 초록집 (2013.04.) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20200037570A (ko) * | 2018-10-01 | 2020-04-09 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주 |
KR102148259B1 (ko) | 2018-10-01 | 2020-09-03 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20150045873A (ko) | 2015-04-29 |
WO2015056850A1 (ko) | 2015-04-23 |
KR20160036552A (ko) | 2016-04-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101614679B1 (ko) | 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 키메릭 변이주 | |
CN101528941B (zh) | 在犬细胞中表达负义病毒rna的方法和组合物 | |
TW200932259A (en) | Genetically modified attenuated vesicular stomatitis virus, compositions and methods of use thereof | |
CN107604004A (zh) | 用于痘苗病毒天坛株tk基因的示踪打靶质粒及其制备方法 | |
CN101228267B (zh) | 生产冠状病毒的细胞系 | |
CN112225822B (zh) | 高扩增、存续能力和杀瘤作用的CAR-iNKT及应用 | |
CN102002509B (zh) | 一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用 | |
CN110944656A (zh) | 编码人类fkrp蛋白的新型多核苷酸 | |
CN108753807B (zh) | 一种重组嵌合抗原受体基因及其应用 | |
KR101756338B1 (ko) | L-시스테인 생산용 변이미생물 및 이를 이용한 l-시스테인의 제조방법 | |
CN111239386A (zh) | 一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用 | |
CN114032217A (zh) | 基于dna载体和复制型痘苗病毒载体的新冠病毒复合型疫苗 | |
KR101123641B1 (ko) | 검출 물질에 특이적으로 반응할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법 및 상기 제조 방법으로제조된 박테리오파아지를 미량 검출물을 검출하는데 활용하는 방법 및 상기 박테리오파아지를 이용한 질량 분석장치 | |
CN113046369B (zh) | 一种新型冠状病毒的mRNA疫苗 | |
CN109251897A (zh) | 一种猪圆环病毒3型毒株及其制备方法和应用 | |
KR102402604B1 (ko) | 신규 세린 프로테아제 변이체 | |
CN110607267B (zh) | 一种绵羊李斯特菌平衡致死系统、构建方法及应用 | |
CN101880652A (zh) | 表达猪干扰素(α、β或γ)的重组新城疫弱毒疫苗株 | |
KR102454110B1 (ko) | ppGpp 생합성 관련 유전자 발현의 저해물질 탐색용 재조합 플라스미드 및 돌연변이 균주 | |
CN111206024B (zh) | 一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用 | |
CN114921394A (zh) | 一种重组绵羊李斯特菌及其使用方法 | |
CN111560392B (zh) | miRNA表达载体及其应用 | |
CN110115770B (zh) | 一种防治丙型病毒性肝炎的新靶点及其CRISPR-Cas9靶向系统与应用 | |
CN101220374A (zh) | 鸡痘病毒双基因表达载体(pg7.5n) | |
KR20220169517A (ko) | 흰 반점 증후군 바이러스 외피 단백질을 발현하는 형질전환 미세조류를 유효성분으로 포함하는 흰 반점 증후군의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물 및 이의 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A107 | Divisional application of patent | ||
A201 | Request for examination | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190401 Year of fee payment: 4 |