CN111417397A

CN111417397A - Mir101或mir128在治疗发作性疾病中的用途

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Publication number: CN111417397A
Application number: CN201880076488.2A
Authority: CN
Inventors: 马修·杜林
Original assignee: Ovid Therapeutics Inc
Current assignee: Ovid Therapeutics Inc
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2020-07-14
Also published as: US20210095292A1; US20190169619A1; WO2019113266A1; US10870855B2; KR20200119782A; EP3703820A1; MX2020005952A; IL274838A; MX2021011598A; US11761006B2; EP3703820A4; CA3084985A1; JP2021505619A; AU2018378622A1

Abstract

提供了治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，所述方法包括向患者递送有效量的增加患者脑细胞中的微小RNA‑101分子的水平的组合物。提供了治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，所述方法包括向患者递送有效量的增加患者脑细胞中的微小RNA‑128分子的水平的组合物。提供了治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，所述方法包括向患者施用编码微小RNA‑101、pri‑miR101或pre‑miR101的载体。提供了治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，所述方法包括向患者施用编码微小RNA‑128、pri‑miR128或pre‑miR128的载体。在实施方案中，微小RNA‑101和/或微小RNA‑128的水平增加引起发作性疾病的一种或更多种症状的改善。

Description

MIR101或MIR128在治疗发作性疾病中的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年12月6日提交的美国临时申请第62/595,255号的权益和优先权，其被通过引用以其整体并入。

技术领域

使用微小RNA MIR101或MIR128治疗发作性疾病(seizure disorder)。

背景

发作性疾病通常涉及脑中的异常神经细胞活动，引起可能表现为一段时间的异常行为、异常感知、惊厥、意识减弱并且有时丧失意识的发作。发作可以是能够影响脑的许多不同疾病的症状。癫痫(epilepsy)是特征为复发性发作的发作性疾病。参见，例如，Blume等,Epilepsia.2001；42:1212-1218。癫痫发作(epileptic seizure)通常以脑中的异常放电为标志，并且通常表现为意识改变或减弱、不自主运动或惊厥的突然短暂发作。

发作可以被分类为局灶性发作(也被称为部分性发作)和全面性发作。局灶性发作仅影响脑的一侧，而全面性发作影响脑的两侧。特定类型的局灶性发作包括单纯局灶性发作、复杂局灶性发作和继发的全面性发作。单纯局灶性发作可以被限制或集中于特定的叶(例如，颞叶、额叶、顶叶或枕叶)。比起单纯局灶性发作，复杂局灶性发作通常影响一个半球的更大部分，但通常起源于颞叶或额叶。当局灶性发作从一侧(半球)扩散至脑的两侧时，该发作被称为继发的全面性发作。特定类型的全面性发作包括失神(也被称为癫痫小发作(petit mal seizure))、强直性发作、失张力性发作、肌阵挛性发作、强直性阵挛性发作(也被称为癫痫大发作(grand mal seizure))和阵挛性发作。

发作性疾病的实例包括癫痫、具有全面性强直-阵挛性发作的癫痫、具有肌阵挛性失神的癫痫、额叶癫痫、颞叶癫痫、Landau-Kleffner综合征、Rasmussen综合征、Dravet综合征、Doose综合征、CDKL5紊乱、婴儿痉挛(West综合征)、青少年肌阵挛性癫痫(JME)、疫苗相关脑病、顽固性儿童癫痫(ICE)、Lennox-Gastaut综合征(LGS)、Rett综合征、Ohtahara综合征、CDKL5紊乱、儿童失神性癫痫、特发性震颤、急性反复性发作、良性罗兰多癫痫(benignrolandic epilepsy)、癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态、超难治性癫痫持续状态(SRSE)、PCDH19小儿癫痫、局灶性皮质发育不良以及增加的发作活动或突破性发作(也被称为连续性或丛集性发作)。发作性疾病可能与1型钠通道蛋白α亚基(Scn1a)相关的疾病相关。

所有类型的脑肿瘤都可能与发作性疾病相关。某些肿瘤与更大的发作频率相关。例如，神经节胶质瘤(ganglioglioma)是可以发生在脊髓和/或颞叶中的生长缓慢的良性肿瘤。神经节胶质瘤包括赘生性胶质细胞和神经节细胞，这些细胞是无序的、细胞易变且非浸润的。神经节胶质瘤通常与发作相关。胶质瘤是从脑中的胶质细胞发展而来的脑肿瘤。胶质瘤被分为四个等级(I、II、III和IV)，并且治疗和预后取决于肿瘤等级。低等级胶质瘤起源于两种不同类型的脑细胞：星形胶质细胞和少突胶质细胞。低等级胶质瘤被分类为2级肿瘤，使其成为生长最慢的胶质瘤类型。具有低等级胶质瘤的60％和85％之间的人可能经历发作。高等级胶质瘤(3级或4级)是通常表现出差的预后的快速增长的胶质瘤。3级胶质瘤包括间变性星形细胞瘤、间变性少突胶质细胞瘤、间变性少突星形细胞瘤和间变性室管膜瘤。胶质母细胞瘤是4级胶质瘤。发作发生在多于一半的具有III级胶质瘤的患者和约四分之一的具有IV级胶质瘤的患者中。脑膜瘤是从脑膜(围绕脑和脊髓的膜)产生的肿瘤。尽管脑膜瘤实际上不位于脑中，但脑膜瘤可能压迫或挤压邻近的脑、神经和血管。脑膜瘤是形成于头部的最常见肿瘤类型。大多数脑膜瘤增长缓慢。发作与脑膜瘤相关。

局灶性皮质发育不良是皮质发育的一种畸形，其是小儿群体中的医学上顽固性癫痫的常见原因并且是成人中的医学上顽固性发作的常见病因学。局灶性皮质发育不良(FCD)已经被分类为三种类型和进一步的亚型。I型通常与颞叶畸形相关—表现为异常皮质片层化(cortical lamination)，该异常皮质片层化是神经元的异常径向迁移和成熟的结果(Ia型FCD)，或是具有未成熟神经元的皮质的经典6层切向组成被破坏的结果(Ib型FCD)，或是径向和切向皮质片层化两种结构异常的结果(Ic型FCD)。II型通常见于额叶畸形—由被破坏的皮质片层化和特定细胞学异常引起，IIa型-形态异常的神经元(没有气球细胞)和IIb型-形态异常的神经元和气球细胞。III型—与不同的皮质去片层化(dislamination)和细胞学异常相关的畸形，主要损伤在同一区域/叶内。IIIa型—在颞叶中，皮质分层伴海马萎缩，IIIb型—邻近胶质肿瘤或神经胶质元肿瘤(DNET、神经节胶质瘤)，IIIc型—邻近血管畸形部位(如血管瘤、动静脉畸形、毛细血管扩张等)，IIId型—在早年获得(创伤、缺血或围产期出血、传染病或炎性疾病)。参见，Kabat和Krol,Pol J Radiol,2012,77(2)35-43。FCD可能涉及脑的任何部分，可能在大小和位置上不同，并且可能是多灶性的。发作是FCD的主要症状，有时与智力迟钝相关，特别是与早年发作起病相关。症状可以出现在任何年龄，主要在童年时期，但也可以发生在成人中。与FCD相关的发作可能是药物耐受的。

血管瘤大多数是良性的、局灶性畸形，其类似于其源组织中的赘生物。它们包括通常见于该部位的组织成分，但以无序方式增长。血管瘤可以起源于脑中。结节性硬化症(TSC)是一种特征为错构瘤在多种器官中生长的遗传性发作性疾病。具有这种疾病的患者可能表现出由脑中的多种损伤引起的癫痫和认知问题的高发生率。TSC损伤(皮质结节)通常包含形态异常的神经元、明亮的嗜酸性巨细胞和白质改变。与TSC相关的发作可能是顽固的。灰结节错构瘤(也称为下丘脑错构瘤)是一种良性肿瘤，其中神经元和神经胶质的无序集合聚集在下丘脑的灰结节处。症状包括痴笑发作(gelastic seizure)，一种特征为一阵不自主发笑伴间歇性易怒和情绪低落的疾病。

用于治疗发作性疾病的药物可以被称为抗癫痫药物(“AED”)。复发性发作的治疗主要集中在使用至少一种AED，在单一治疗失败的情况下，可能辅助使用第二种或甚至第三种剂。参见，Tolman和Faulkner,Ther Clin Risk Manag.2011；7:367–375。然而，约30％-40％的癫痫患者在仅用一种AED的情况下得不到对发作的足够控制并且需要使用辅助剂。同上。尽管多种AED的剂量合理，但该组的子集仍具有规律性且持续的发作活动。这些发作被认为难以治疗。同上。因此，仍然需要用于治疗发作性疾病的改进的和/或另外的疗法。

微小RNA(miRNA)是短的(20-24nt)非编码RNA，其通过影响mRNA的稳定性和翻译二者参与多细胞生物体中的基因表达的转录后调控。miRNA由RNA聚合酶II转录为编码蛋白质或非编码蛋白质的加帽(capped)且多腺苷酸化的初级转录物(pri-miRNA)的一部分。pri-miRNA被加工成称为前体(pre-miRNA)的～70nt发夹结构。pre-miRNA被从核转运至细胞质，在细胞质中被RISC装载复合物加工成～22bp的双链RNA。成熟miRNA被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，该复合物通过与靶RNA的不完全碱基配对来识别靶mRNA并且最通常造成靶mRNA的翻译抑制或靶mRNA的去稳定。

微小RNA101(也称为MIR101、miR101、miR-101或miRNA-101)已经被鉴定为与抑制癌细胞系中EZH2的表达和功能相关。参见，Varambally等,Science 2008,322:1695-1699。人类中存在两种miR-101同种型：miR-101-1和miR-101-2，而小鼠中存在miR-101a和miR-101b。参见，Huang等,Journal of Biological Chemistry,2017,292,16420-16439。除了miR-101b具有一个碱基差异外，所有的miR-101亚型具有相同的成熟序列。同上。人类miR101的成熟序列是UACAGUACUGUGAUAACUGAA[SEQ ID NO:1]。Lippi等,Neuron 2016,92(6),1337-1351指出，miR-101平行地调控多种出生后发育程序以约束成年啮齿动物的兴奋性活动。Lippi等根据小鼠海马的RNA测序鉴定出miR-101a和miR-101b在出生后第12天高度表达。Lippi等提出，生命早期的瞬时miR-101抑制产生了成体中的超兴奋网络。尽管miR-101抑制导致了类似于自发性发作样事件的自发高频突发放电的出现，但Lippi等得出该网络没有表现出全部的癫痫表型的结论。

微小RNA128(也称为MIR128、miR-128或miR-128)分别由小鼠1号和9号染色体或人类2号和3号染色体上的两个不同的基因miR-128-1和miR-128-2编码。Tan等Science 2013,342(6163):1254-1258。微小RNA128-2(也称为mIR128-2或miR128-2)是成年小鼠和人类脑中最丰富且最高度富集的miRNA之一。同上。miR128的成熟序列是GGGGGCCGAUACACUGUACGAGA[SEQ ID NO:2]。在小鼠中，种系miR-128-2缺乏引起前脑中miR-128表达降低80％，而miR-128-1基因的清除仅消除20％的miR-128。同上。Tan等确定，在小鼠中，出生后神经元中miR-128表达的降低引起增加的运动活动和致命性癫痫。miR-128的过表达减弱了神经元应答性，抑制了运动活动，并且减轻了与小鼠中的帕金森样疾病和发作相关的运动异常。同上。

血脑屏障(BBB)阻止血流中的许多化合物进入脑部的组织和流体。BBB由脑特异性内皮细胞形成，并且由神经血管单元的细胞支持以限制极性分子或大分子诸如蛋白质和肽进出脑间质。然而，BBB也阻止许多治疗化合物进入脑，这可以干扰对脑状况和疾病的有效治疗。

一种帮助治疗性药物透过BBB转运的方法包括向BBB递送超声波能量，该超声波能量使BBB“开放”并且干扰BBB阻止治疗剂转运到脑中的能力。参见，例如，美国专利第5,752,515号，其涉及图像指导的超声波递送化合物透过BBB。在一方面，由超声波在中枢神经系统(CNS)的组织和/或流体中诱导的变化借助于加热或空化(cavitation)。这样的加热或空化可能存在缺点，因为它可能引起对组织的损伤并且潜在地降解为获得治疗益处而递送的化合物。超声波还引起有机化合物的降解。参见，例如，Bremner等,Current OrganicChemistry,15(2):168-177(2011)(“Bremner等”)。根据Bremner等，当用超声波照射水性溶液时，水中的H-O键被均裂裂解以形成羟基自由基和氢原子。该过程是空化的结果，藉此在内爆的泡内产生非常高的温度和压力。同上。因此，使用超声波试图打开BBB以引起或增加治疗化合物向脑的递送可能使它们被降解并干扰或阻止治疗性治疗。

概述

提供了一种治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，该方法包括向患者递送有效量的增加患者脑细胞中的微小RNA-101分子的水平的组合物。提供了一种治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，该方法包括向患者递送有效量的增加患者脑细胞中的微小RNA-128分子的水平的组合物。提供了一种治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，该方法包括向患者施用编码微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101的载体。提供了一种治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，该方法包括向患者施用编码微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128的载体。在实施方案中，微小RNA-101或微小RNA-128的水平增加引起发作性疾病的一种或更多种症状的改善。

在实施方案中，编码微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101的载体在具有发作性疾病的患者中引起微小RNA-101水平的增加，并且与发作性疾病的症状减轻相关。在实施方案中，编码微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128的载体在具有发作性疾病的患者中引起微小RNA-128水平增加，并且与发作性疾病的症状减轻相关。

在实施方案中，包括编码微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101的核酸的载体包括可操作地连接至编码微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101的核酸的启动子。在实施方案中，所述载体包括土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。在实施方案中，所述载体包括牛生长激素多腺苷酸化序列(BGHpA)。在实施方案中，所述载体包括荧光报告物盒。在实施方案中，所述载体是腺病毒相关病毒。在实施方案中，所述载体是慢病毒。在实施方案中，包括编码微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128的核酸的载体包括可操作地连接至编码微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128的核酸的启动子。在实施方案中，编码微小RNA-128的核酸是微小RNA-128-2。在实施方案中，所述载体包括土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。在实施方案中，所述载体包括牛生长激素多腺苷酸化序列(BGHpA)。在实施方案中，所述载体包括荧光报告物盒。在实施方案中，所述载体是腺病毒相关病毒。在实施方案中，所述载体是慢病毒。在实施方案中，所述载体是pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA。在实施方案中，所述载体是pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA。

在实施方案中，载体被递送至患者的脑中的靶位置。在实施方案中，靶位置是额叶、颞叶、枕叶或顶叶。在实施方案中，载体的施用途径是口服、含服、舌下、直肠、局部、鼻内、阴道或肠胃外。在实施方案中，载体被直接施用至靶位置。

在实施方案中，发作性疾病的特征是局灶性发作。在实施方案中，发作性疾病是局灶性皮质发育不良。在实施方案中，发作性疾病是癫痫、具有全面性强直-阵挛性发作的癫痫、具有肌阵挛性失神的癫痫、额叶癫痫、颞叶癫痫、枕叶癫痫、顶叶癫痫、Landau-Kleffner综合征、Rasmussen综合征、Dravet综合征、Doose综合征、CDKL5紊乱、婴儿痉挛(West综合征)、青少年肌阵挛性癫痫(JME)、疫苗相关脑病、顽固性儿童期癫痫(ICE)、Lennox-Gastaut综合征(LGS)、Rett综合征、Ohtahara综合征、CDKL5紊乱、儿童期失神性癫痫、特发性震颤、急性反复性发作、良性罗兰多癫痫、癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态、超难治性癫痫持续状态(SRSE)、PCDH19小儿癫痫、脑肿瘤诱导的发作、错构瘤诱导的发作、药物戒断诱导的发作、酒精戒断诱导的发作、增加的发作活动增加或突破性发作。

在实施方案中，超声波被应用于患者脑中的靶位置以在靶位置处增强患者的血脑屏障的透性，其中微小RNA-101或微小RNA-128被递送至靶位置。

附图简述

图1是pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA的质粒图谱。

图2A、2B、2C和2D描绘了pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA的核苷酸序列[SEQ IDNO:3]。

图3是pCMV-MIR101-1的质粒图谱。

图4是pAM/CBA-pl-WPRE-BGHpA的质粒图谱。

图5是pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA的质粒图谱。

图6A、6B、6C和6D描绘了pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA的核苷酸序列[SEQ IDNO:4]。

图7是pCMV-MIR128-2的质粒图谱。

图8描绘了AAVRec3的氨基酸序列[SEQ ID NO:5]。

详细描述

本文描述了用于治疗发作性疾病的方法和组合物，其包括向具有发作性疾病的患者施用微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101。本文还描述了用于治疗发作性疾病的方法和组合物，其包括向具有发作性疾病的患者施用微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128。在实施方案中，提供了编码微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101的载体。在实施方案中，编码微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101的载体被施用至具有发作性疾病的患者，其中患者表现出发作性疾病的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，提供了编码微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128的载体。在实施方案中，编码微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128的载体被施用至具有发作性疾病的患者，其中患者表现出发作性疾病的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，超声波被应用于患者的脑中的靶位置以在靶位置处增强患者的血脑屏障的透性，其中微小RNA-101或微小RNA-128被递送至靶位置。

微小RNA-101、pri-miR101、pre-miR101、微小RNA-128、pri-miR128和/或pre-miR128在本文统称为微小RNA(microRNA或microRNAs)。向患者施用微小RNA-101、pri-miR101、pre-miR101、微小RNA-128、pri-miR128和/或pre-miR128，在本文统称为微小RNA治疗。微小RNA治疗增加细胞中对应的活性微小RNA分子的水平。该增加可以通过直接向细胞提供微小RNA来产生，或可以通过间接向细胞提供微小RNA(诸如通过载体)来产生。微小RNA可以包括RNA或DNA分子，该RNA或DNA分子还包括另外的序列。患者脑细胞中对应的活性微小RNA分子的水平的增加与发作性疾病的一种或更多种症状的改善相关。

一种或更多种pri-miRNA可以被用于本文描述的组合物和方法中。可以使用任何合适形式的pri-mRNA。一种或更多种pri-mRNA可以在细胞内被加工并且起作用以获得miRNA的功能，例如，被转化为一种或更多种pre-miRNA并且然后转化为成熟形式。可选地，miRNA最初可以是miRNA前体。在实施方案中，组合物和方法包括pre-miRNA，其被称为Dicer的双链核酸内切酶，III型RNA酶裂解，得到大小约20-25个核苷酸的不完全miRNA:miRNA*双链体。这种双链体包含成熟miRNA链及其相对的互补miRNA*链。一种或更多种pre-miRNA可以被用在本文描述的组合物和方法中。pre-miRNA可以起作用以获得miRNA的功能。可以使用任何合适形式的pre-miRNA。还预期了本文描述的组合物和方法的miRNA可以是成熟miRNA。

微小RNA可以以非表达载体或表达载体形式递送至细胞。表达载体和载体在本文可互换地使用。在实施方案中，微小RNA可在用于随后步骤之前被分离或纯化。微小RNA可在引入细胞之前被分离或纯化。“引入”细胞包括已知的转染、转导、感染方法以及用于将表达载体或异源核酸引入细胞中的其他方法。模板核酸或扩增引物可以在被转录或扩增之前被分离或纯化。分离或纯化可以通过本领域技术人员已知的许多关于核酸的方法来进行。微小RNA的递送可以通过若干形式进行，诸如通过将化学修饰的RNA部分或通过将未修饰的RNA部分封装在病毒或非病毒递送容器中。非表达载体递送方式包括可被靶向到脑细胞的纳米颗粒、微米颗粒、脂质体、聚合物、微球等。微小RNA还可以作为基于质粒或微型载体的表达系统被递送，其中然后它可以在细胞中被RNAi机器表达和加工以形成成熟的微小RNA。

用于miRNA表达的核酸构建体可以以重组方式产生。本文提供了这样的表达载体。表达载体是一种载体核酸，可以将核酸序列插入其中以便被引入细胞中，核酸序列可以在细胞中复制。表达载体包括质粒、粘粒、重组病毒，诸如腺病毒相关病毒(AAV)、腺病毒、逆转录病毒、痘病毒和本领域中其他已知的病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如，YAC)。本领域普通技术人员完全有能力通过标准重组技术构建表达载体。在实施方案中，具有微小RNA的表达载体被递送至患者的细胞。核酸分子以它们可被摄取和有益地表达的形式被递送至患者的细胞，使得可以达到治疗有效水平。

本领域技术人员已知的任何合适的表达载体可以被用于将本文的一种或更多种微小RNA递送至脑中的靶位置。在这样的递送后，靶位置中的神经元被一种或更多种微小RNA转染，从而增加患者脑中一种或更多种这些微小RNA的水平。转导病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺病毒相关病毒)载体特别由于它们的高感染效率和稳定整合与表达可以被用于体细胞基因疗法。

在实施方案中，表达载体可以是稳定整合型载体或稳定的非整合型载体。合适载体的实例是慢病毒和腺病毒相关病毒(AAV)。慢病毒是逆转录病毒的子类。慢病毒可以整合到非分裂细胞诸如神经元的基因组中。慢病毒的特征是高效感染、转基因的长期稳定表达和低免疫原性。在实施方案中，慢病毒载体可以被用于将一种或更多种微小RNA递送至脑。

AAV是一种已知感染许多细胞类型的缺陷型细小病毒并且对人类是非致病的。AAV可以感染正在分裂的细胞和未分裂的细胞二者。在实施方案中，AAV载体在本文可以被用于将一种或更多种微小RNA递送至脑。任何已知的腺病毒相关病毒(AAV)可以被用于本文中，例如，AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9和AAVRec3可以关联神经元使用。通过假分型，即，将来自不同病毒血清型的衣壳和基因组混合，已经开发出另外的合适的AAV血清型。因此，例如，AAV2/7指含有包装在来自血清型7的衣壳中的血清型2的基因组的病毒。其他实例是AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9等。杂合体AAV衣壳血清型rec1、rec2、rec3和rec4通过将衣壳序列的片段改组而产生，所述衣壳序列的片段在所有三种非人类灵长类动物AAV血清型cy5、rh20和rh39中与AAV8匹配。参见，Charbel等,PLoS One.2013Apr 9；8(4):e60361。术语rec3AAV和AAVRec3可以在本文可互换地使用。图8中描绘了AAVRec3的氨基酸序列。自身互补的腺病毒相关病毒(scAAV)也可以被用作载体。AAV包装DNA的一条单链并且需要第二链合成的过程，而scAAV包装退火在一起而形成双链DNA的两条链。通过跳过第二链合成，scAAV允许在细胞中快速表达。

本领域普通技术人员可以使用已知技术构建合适的载体。可以选择或构建合适的载体，所述载体除了包含一种或更多种微小RNA之外，还包含适当的调控序列，包括启动子序列、终止子片段、多腺苷酸化序列、标志物基因和其他适当的序列。本领域技术人员熟悉适当的调控序列，包括启动子序列、终止子片段、多腺苷酸化序列、标志物基因和其他合适的序列。

本文的表达载体包括可操作地连接至编码序列或ORF的适当序列，以促进其在靶向的宿主细胞中的表达。“可操作地连接的”序列包括表达控制序列诸如与编码序列相邻的启动子，以及以反式起作用或在远端起作用以控制期望产物的表达的表达控制序列二者。

通常地，载体包括启动子以促进一种或更多种微小RNA在靶细胞内的表达。启动子可以选自可以驱动选择的转基因在脑中的表达的许多组成型或诱导型启动子。组成型启动子的实例包括CMV立即早期增强子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子-外显子1-内含子1元件、RSVLTR启动子/增强子、SV40启动子、CMV启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。

特异性可以排他地通过受体的区域性和细胞类型特异性表达例如使用组织或区域特异性启动子来达到。病毒基因启动子元件可以帮助决定表达一种或更多种微小RNA的细胞的类型。一些启动子是非特异性的(例如，CAG，一种合成启动子)，而其他的是神经元特异性的。CAG启动子是一种强合成启动子，可以被用于驱动高水平的表达。CAG启动子由1)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，2)启动子，鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子，和3)兔β-珠蛋白基因的剪接受体组成。在实施方案中，启动子是CAG启动子。神经元特异性启动子包括(例如，突触蛋白；hSyn)，或偏好特定神经元类型，例如强啡肽、脑髓苷，偏好星形胶质细胞的GFAP(胶质细胞原纤维酸性蛋白)或偏好皮质谷氨酸能细胞但也可以靶向皮质下GABA能细胞的CaMKIIa。在实施方案中，启动子是CaMKIIa(αCaM激酶II基因)启动子，其可以驱动前脑中的表达。其他神经元细胞类型特异性启动子包括NSE启动子、酪氨酸羟化酶启动子、髓鞘碱性蛋白启动子、胶质细胞原纤维酸性蛋白启动子和神经丝基因(重、中、轻)启动子。

表达控制序列也可以包括适当的转录起始、终止和增强子序列；有效的RNA加工信号，诸如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强核酸或蛋白质稳定性的序列；以及当期望时，增强产物加工和/或分泌的序列。许多不同的表达控制序列，包括天然的和非天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的表达控制序列，在本领域中是已知的并且可以根据期望的表达类型在本文使用。

除了启动子之外，用于真核细胞的表达控制序列通常包括增强子，诸如从免疫球蛋白基因、SV40、CMV等获得的增强子以及可以包括剪接供体和受体位点的多腺苷酸化序列。多腺苷酸化序列通常插入编码序列的3’端以及3’ITR序列的5’端。可以被用于本文的载体中的polyA信号的说明性实例包括polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA或AGTAAA)、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-珠蛋白polyA序列(rβgpA)或本领域已知的另一种合适的异源性或内源性polyA序列。

在本文中有用的调控序列还可以包含内含子，诸如位于启动子/增强子序列和编码序列之间的内含子。一种有用的内含子序列从SV40获得并且被称为SV40 T内含子序列。另一种包括土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)。WPRE是当被转录时产生增强表达的三级结构的DNA序列。

本文的载体可以包含报告物基因，例如编码荧光团的那些。荧光团是通常在特定频率激发后可以再发光的荧光化合物。它们可以被用作可以附接至例如蛋白质以允许该蛋白质被定位的标记物或标志物。许多合适的荧光团是本领域中已知的。它们可以根据它们发射的颜色例如，蓝色、蓝绿色(cyan)、绿色、黄色、橙色、红色等来分类。例如，mCherry、mRasberry、mTomato和mRuby是红色荧光团蛋白；citrine、venus和EYFP是黄色荧光蛋白。绿色荧光蛋白(GFP)是通常使用的荧光团。

在实施方案中，表达载体是pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA。图1中描绘了pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA的质粒图谱。图2A-2D中示出了核酸序列[SEQ ID NO:3]。表I注释了pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA。

表I

为了构建pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA，将来自从OriGene Technologies,Inc.,9620Medical Center Dr.,Suite 200,Rockville,MD 20850商购获得的pCMV-MIR101-1质粒的EcoRI-EcoRV片段(772bp)(SC400013)插入到用EcoRI+EcoRV切割的pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA载体中。图3中描绘了pCMV-MIR101-1的质粒图谱。图4中描绘了pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA的质粒图谱。

在实施方案中，表达载体是pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA。图5中描绘了pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA的质粒图谱。图6A-6D中示出了核酸序列[SEQ ID NO:4]。表II注释了pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA。

表II

为了构建pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA，将来自从OriGeneTechnologies,Inc.,9620Medical Center Dr.,Suite 200,Rockville,MD 20850商购获得的pCMV-MIR128-2质粒的EcoRI-EcoRV片段(755bp)(SC400112)插入到用EcoRI+EcoRV切割的pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA载体中。图7中描绘了pCMV-MIR128-2的质粒图谱。图4中描绘了pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA的质粒图谱。

本文描述的微小RNA，无论通过表达载体或通过非表达载体方式递送，被用于治疗发作性疾病。发作性疾病，包括涉及复杂部分性发作例如颞叶癫痫(TLE)的那些，颞叶癫痫(TLE)可能是最难治的癫痫形式之一。在某些情况下，一个颞叶可以被界定为发作起源的部位(癫痫发生源区域)，并且可以按照本文的方法靶向包括前海马的内侧颞叶。发作性疾病可以由兴奋与抑制的失衡引起。兴奋的拮抗作用和抑制的增强可以提供发作性疾病的至少一种症状的改善。

发作性疾病的实例包括癫痫、具有全面性强直-阵挛性发作的癫痫、具有肌阵挛性失神的癫痫、额叶癫痫、颞叶癫痫、Landau-Kleffner综合征、Rasmussen综合征、Dravet综合征、Doose综合征、CDKL5紊乱、婴儿痉挛(West综合征)、青少年肌阵挛性癫痫(JME)、疫苗相关脑病、顽固性儿童期癫痫(ICE)、Lennox-Gastaut综合征(LGS)、Rett综合征、Ohtahara综合征、CDKL5紊乱、儿童期失神性癫痫、特发性震颤、急性反复性发作、良性罗兰多癫痫、癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态、超难治性癫痫持续状态(SRSE)、PCDH19小儿癫痫、药物戒断诱导的发作、酒精戒断诱导的发作、增加的发作活动或突破性发作(也被称为连续性或丛集性发作)。在实施方案中，发作性疾病与1型钠通道蛋白α亚基(Scn1a)相关的紊乱相关。在实施方案中，发作性疾病的特征是局灶性发作。在实施方案中，发作性疾病是局灶性皮质发育不良。在实施方案中，FCD是I型FCD。在实施方案中，FCD是Ia型FCD。在实施方案中，FCD是Ib型FCD。在实施方案中，FCD是Ic型FCD。在实施方案中，FCD是II型FCD。在实施方案中，FCD是IIa型FCD。在实施方案中，FCD是IIb型FCD。在实施方案中，FCD是III型FCD。在实施方案中，FCD是IIIa型FCD。在实施方案中，FCD是IIIb型FCD。在实施方案中，FCD是IIIc型FCD。在实施方案中，发作性疾病与脑肿瘤相关，即脑肿瘤诱导的发作，所述脑肿瘤诸如神经节胶质瘤、低等级和高等级的胶质瘤，包括间变性星形细胞瘤、间变性少突胶质细胞瘤、间变性少突星形细胞瘤和间变性室管膜瘤、胶质母细胞瘤或脑膜瘤。在实施方案中，发作性疾病与脑错构瘤相关，即错构瘤诱导的发作，诸如结节性硬化症(TSC)或灰结节错构瘤。

在实施方案中，发作性疾病是癫痫持续状态(SE)。SE的特征是癫痫发作大于5分钟，或在5分钟时间段内多于一次发作，在发作之间人没有恢复正常。如果治疗延迟，SE可以是能够导致死亡的危险状况。SE可以是惊厥性的，伴有规律模式的手臂和腿的收缩和伸展；或可以是非惊厥性的，由于发作活动导致伴有相对长持续时间的人意识水平的变化但没有大幅度的肢体弯曲和伸展。惊厥性SE(CSE)可以进一步分为(a)强直-阵挛性SE，(b)强直性SE，(c)阵挛性SE和(d)肌阵挛性SE。非惊厥性SE(NCSE)的特征是精神状态异常、无应答性、眼运动异常、持续的电图性发作和对抗惊厥剂的可能应答。

发作性疾病的症状可以包括但不限于包括以下的发作：共济失调、步态障碍、言语障碍、发声、认知功能受损、异常运动活动、临床发作、亚临床发作、张力减退、张力亢进、流口水、口部行为、先兆、重复性运动、发笑和异常感知。在实施方案中，所提供的方法和组合物可以减轻或预防一种或更多种不同类型的发作。通常，发作可以包括重复性动作、异常感知及其组合。发作可以被分类为局灶性发作(也被称为部分性发作)和全面性发作。局灶性发作仅影响脑的一侧，而全面性发作影响脑的两侧。特定类型的局灶性发作包括单纯局灶性发作、复杂局灶性发作和继发的全面性发作。单纯局灶性发作可以被限制或集中于特定的叶(例如，颞叶、额叶、顶叶或枕叶)。比起单纯局灶性发作，复杂局灶性发作通常影响一个半球的更大部分，但通常起源于颞叶或额叶。当局灶性发作从一侧(半球)扩散至脑的两侧时，发作被称为继发的全面性发作。特定类型的全面性发作包括失神(也被称为癫痫小发作)、强直性发作、失张力性发作、肌阵挛性发作、强直性阵挛性发作(也被称为癫痫大发作)和阵挛性发作。本文的治疗方法可以包括提供一种或更多种前述症状的改善。

在已经确定与患者中发作性疾病相关的异常电脉冲的位置或疑似位置后，可以实施根据本公开内容的靶向的治疗。确定脑中异常电活动的位置的方法是本领域熟知的。尽管脑中表现出异常电的任何区域可被靶向用于本文的治疗，但已知与发作性疾病相关并且可以接受靶向性治疗的脑区域包括但不限于颞叶、额叶、枕叶和顶叶。例如，颞叶可能是局部癫痫发作的常见部位。在某些情况下，从颞叶中开始的发作可以延伸至脑的其他部分。在实施方案中，可以被靶向用于治疗的颞叶的特定区域包括边缘系统的结构，诸如海马、听觉-前庭皮质、内侧颞叶和杏仁核。在实施方案中，也可以靶向枕叶的特定区域，例如初级视觉皮层。在实施方案中，可以靶向顶叶的特定区域，例如横向(lateral)中央后回。在实施方案中，可以靶向初级体感皮层的位置。在实施方案中，可以靶向额叶的特定区域，例如运动皮层、嗅觉-味觉皮层。在实施方案中，可以靶向已经被鉴定为表现出异常电活动的脑的大量区域。在某些情况下，发作性疾病的表现可以从脑的某些区域内开始并且扩散至其他区域。例如，发作性疾病的表现可以从海马或其周围结构内开始。在实施方案中，可以靶向被确定为异常电活动的起源的部位的区域。

用于将物质直接施用至脑内的靶位置的方法是熟知的。例如，可以在颅骨中钻孔，例如Burr孔，并且可以使用适当尺寸的针将载体或非载体媒介物递送至靶位置。在实施方案中，可以去除颅骨的一部分以暴露靶位置处或附近的硬脑膜(dura matter)(开颅术)，并且可以将载体或非载体媒介物直接施用至靶位置。在实施方案中，使用立体定位坐标、微量吸管和自动化泵颅内注射载体或非载体媒介物，用于将载体或非载体媒介物精确递送至期望的区域而对周围组织的损伤最小。在实施方案中，微型泵可以被用于将包含含有一种或更多种微小RNA的载体或非载体媒介物的药物组合物递送至脑中的靶区域。组合物可以立即递送或在延长的时间段内，例如在1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟或更多分钟内递送。在将载体递送至脑中的靶位置后，可以允许经过足够量的时间来允许一种或更多种微小RNA在靶位置处表达。

在实施方案中，本文的载体或非载体递送媒介物可以全身施用。全身递送包括口服、含服、舌下、直肠、局部、鼻内、阴道和胃肠外施用模式。肠胃外施用模式的实例包括静脉内、腹膜内、肌肉内和皮下施用模式。在实施方案中，载体或非载体递送媒介物将循环直到它们接触脑中的一个或更多个靶位置时，在所述靶位置它们递送一种或更多种微小RNA或引起一种或更多种微小RNA表达并且起作用以例如帮助网络形成和/或调节神经元信号传导网络。

一种或更多种微小RNA以有效针对患者中的发作性疾病的量使用。活性成分的剂量取决于患者的年龄、体重和个体状况、个体药代动力学数据和施用方式。在人类个体具有约70kg的体重的情况下，微小RNA施用的每日剂量可以是从0.01mg/kg体重至100mg/kg体重，例如，从0.1mg/kg体重至50mg/kg体重，从1mg/kg至20mg/kg体重，以单次剂量或以若干次剂量施用。一种或更多种微小RNA可以单独使用或与其他AED药物组合使用。

在实施方案中，具有超声波的治疗被用于通过破坏血脑屏障来增强一种或更多种微小RNA向脑中靶位置的递送。本文使用聚焦超声波能量破坏BBB，而不会不利地影响载体、非载体递送媒介物、一种或更多种微小RNA和/或脑组织本身。考虑到由超声波能量对有机化合物和组织的潜在损伤，这可能被认为是令人惊讶的。本文使用超声波能量可以增加载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA递送至脑中靶位置的速度，降低可能与将载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA递送至脑中的靶位置相关的副作用，降低剂量而同时将载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA集中在靶位置处，并且可以允许载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA的量在靶位置处受控释放。

根据本公开内容，在实施方案中，超声波能量帮助和/或推动携带一种或更多种微小RNA的载体渗透至脑中的靶位置。在实施方案中，超声波能量被用于使血脑屏障能够透过本文的载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA。因此，在实施方案中，在施用载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA之前，可将超声波能量应用于靶位置。在实施方案中，本文的载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA可以在施用超声波能量的同时施用至脑中的靶区域。在实施方案中，本文的载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA可以在施用超声波能量之前施用至脑中的靶区域。

如先前提及的，本文的载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA可以全身施用。以这种方式，在血流中循环的载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA通过被超声波能量破坏的BBB的一部分被递送至脑中的靶位置。在实施方案中，本文的载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA可以在靶位置的超声波能量治疗之后全身施用，并且载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA透过被破坏的BBB以变为位于靶位置处。在实施方案中，本文的载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA可以被直接施用至脑中的靶位置。在实施方案中，本文的载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA可以在靶位置的超声波能量治疗之后直接施用至脑中的靶位置以变为位于靶位置处。在实施方案中，本文的载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA可以无需超声波治疗而被直接施用至脑中的靶位置。

在实施方案中，可以通过去除颅骨的一部分(开颅术)以暴露靶位置处或附近的硬脑膜并将超声波能量递送至暴露的硬脑膜处或下方而将超声波能量施用至靶区域。在实施方案中，超声波能量可以通过颅骨被施用至靶位置，消除了与将超声波能量递送至靶位置相关的手术的需要。用于通过颅骨递送超声波能量的方法是本领域中已知的。参见，例如，美国专利第5,752,515号和US公布第2009/0005711号，二者在此被通过引用以其整体分别并入。还参见，Hynynen等,NeuroImage 24(2005)12-120。

在实施方案中，超声波能量可以以范围从约20kHz至约5MHz的频率应用至脑中的靶位置，并且声处理持续时间范围从100纳秒至1分钟。在实施方案中，超声波能量可以以范围从约20kHz至约10Mhz的频率、范围从约100纳秒至约30分钟的声处理持续时间、用连续波或突发模式操作(burst mode operation)应用至脑中的靶位置，其中突发模式重复从约0.01Hz至约1MHz变化。在实施方案中，超声波能量可以以范围从约200kHz至约10MHz的频率应用至脑中的靶位置，并且声处理持续时间范围从约100毫秒至约30分钟。在实施方案中，超声波能量可以以范围从约250kHz至约10MHz的频率应用至脑中的靶位置，并且声处理持续时间范围从约0.10微秒至约30分钟。在实施方案中，超声波能量可以以约1.525MHz的频率应用至脑中的靶位置。在实施方案中，超声波能量可以以约0.69MHz的频率应用至脑中的靶位置。在实施方案中，由超声波能量产生的压幅可以是约0.5MPa至约2.7MPa。在实施方案中，由超声波能量产生的压幅可以是约0.8MPa至约1MPa。在实施方案中，超声波能量在尺寸符合待向其递送本文的载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA的组织和/或流体的体积的焦点区域处(例如从约0.1mm³至约5cm³)被递送至脑中靶位置。

在实施方案中，通过在将超声波能量应用至靶位置之前、期间或之后将造影剂引入到患者中，允许造影剂有足够的时间透过BBB并且确定造影剂是否存在于靶位置处，来确定靶位置及其入径(access)。造影剂是熟知的并且包括例如基于碘的化合物、基于钡的化合物和基于镧系元素的化合物。基于碘的剂包括，例如碘海醇(iohexol)、碘普罗胺(iopromide)、碘克沙醇(iodixanol)、碘美醇(iosimenol)、碘克沙酸盐(ioxaglate)、碘酞酸盐(iothalamate)和碘帕醇(iopamidol)。基于钡的化合物包括硫酸钡。基于镧系元素的化合物包括，例如，基于钆的螯合物诸如钆弗塞胺(gadoversetamide)、钆喷酸二甲葡胺(gadopentetate dimeglumine)、钆布醇(gadobutrol)、钆贝酸二甲葡胺(gadobenatedimeglumine)、钆特酸葡甲胺(gadoterate meglumine)和钆塞酸二钠(gadoxetatedisodium)。检测方式包括二维X-射线照相术、X-射线计算机断层摄影术和磁共振成像，这些是可以被用于确定靶位置中造影剂的存在或不存在的熟知的技术。

根据本公开内容，在施用至患者后，微小RNA治疗持续多于1小时提供发作性疾病的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，在施用至患者后，微小RNA治疗持续多于2小时提供疾病的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，在施用至患者后微小RNA治疗持续多于3小时提供疾病的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，在施用至患者后，微小RNA治疗持续多于4小时提供疾病的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，在施用至患者后，微小RNA治疗持续多于6小时提供疾病的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，在施用至患者后，微小RNA治疗持续多于8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时提供疾病的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，根据本公开内容，，提供施用至患者后持续12小时的至少一种症状的改善。在实施方案中，微小RNA治疗提供了患者的次日功能的改善。例如，微小RNA可以在施用后并且从睡眠中醒来后持续多于约例如2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时提供疾病的一种或更多种症状的改善。

在实施方案中，本文提供了治疗发作性疾病的方法，所述方法包括在检测到即将发作的警告信号后，向有相应需要的患者施用一种或更多种微小RNA以及减少或预防发作活动。

在实施方案中，本文描述的方法有效降低、延迟或预防发作性疾病的一种或更多种其他临床症状。例如，可将在脑的靶位置具有微小RNA治疗(其递送任选地被超声波能量增强)的患者中的针对特定症状、药理学或生理学指示物的作用与未治疗的患者或患者在治疗之前的状况进行比较。在实施方案中，在治疗之前测量患者中的该症状、药理学和/或生理学指示物，并且再在治疗开始之后测量一次或更多次。在实施方案中，对照是基于测量不具有待治疗的疾病或状况的一个或更多个患者(例如，健康患者)中的症状、药理学或生理学指示物确定的参考水平或平均值。在实施方案中，将治疗之前脑组织中miR-101和/或miR-128的量与治疗之后脑组织中miR-101和/或miR-128的量进行比较。在实施方案中，将治疗的效果与本领域技术人员视界范围内的常规治疗比较。

本文对发作性疾病(例如，顽固性局灶性发作、局灶性皮质发育不良、急性反复性发作、癫痫持续状态等)的有效治疗可以通过在一段时间后与基线相比显示出症状的频率或严重程度的降低(例如，多于10％、20％、30％、40％或50％)来确立。例如，在2个月的双盲时间段期间，在1个月的基线时间段之后，具有微小RNA治疗的患者可以被随机分配安慰剂作为标准疗法的附加疗法。主要结果测量值可以包括对微小RNA和对安慰剂的应答者百分比，其被定义为在双盲时间段的第二个月期间经历了与基线相比症状的至少10％至50％减少。

在实施方案中，可对含有载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA的药物组合物提供常规释放或改良释放谱。药物组合物可以使用药学上可接受的“载体”来制备，所述“载体”包括被认为安全且有效的材料。所述“载体”包括存在于药物制剂中的除活性物质或成分以外的所有组分。活性物质的实例包括一种或更多种微小RNA、包含一种或更多种微小RNA的表达载体和AED。术语“载体”包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填料和包衣组合物。本领域技术人员熟悉这样的药物载体和使用这样的载体配制药物组合物的方法。

在实施方案中，包含载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA的药物组合物适合肠胃外施用，包括例如肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)或鞘内(i.t.)。肠胃外组合物必须是无菌的，用于通过注射、输注或植入身体中施用，并且可以被包装于单剂量或多剂量容器中。在实施方案中，用于胃肠外施用至患者的液体药物组合物包括活性物质，例如载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA，其量为上文描述的任一个对应的量。在实施方案中，用于肠胃外施用的药物组合物被配制成总体积约例如0.1ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml、1.25ml、1.5ml、1.75ml、2ml、2.25ml、2.5ml、2.75ml、3ml、3.25ml、3.5ml、3.75ml、4ml、4.25ml、4.5ml、4.75ml、5ml、10ml、20ml、25ml、50ml、100ml、200ml、250ml或500ml。在实施方案中，含有表达载体的药物组合物的体积为微升量。例如，可以注射0.1微升至10微升或更多微升。例如，0.1微升、0.2微升、0.3微升、0.4微升、0.5微升、0.6微升、0.7微升、0.8微升、0.9微升、1.0微升、1.25微升、1.5微升、1.75微升、2.0微升、2.25微升、2.5微升、2.75微升、3.0微升、3.25微升、3.5微升、3.75微升、4.0微升、4.25微升、4.5微升、4.75微升、5.0微升、5.25微升、5.5微升、5.75微升、6.0微升、6.25微升、6.5微升、6.75微升、7.0微升、8.25微升、8.5微升、8.75微升、9.0微升、9.25微升、9.5微升、9.75微升或10微升。在实施方案中，组合物被包含在微量移液管、袋、玻璃小瓶、塑料小瓶或瓶中。

在实施方案中，用于肠胃外施用的药物组合物包括上文描述的对应的量。在实施方案中，用于肠胃外施用的药物组合物包括约0.0001mg至约500mg活性物质，例如载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA。在实施方案中，用于胃肠外施用至患者的药物组合物包括活性物质，例如载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA，其对应的浓度为约0.001mg/ml至约500mg/ml。在实施方案中，用于胃肠外施用的药物组合物包括处于以下对应浓度的活性物质：例如，约0.005mg/ml至约50mg/ml、约0.01mg/ml至约50mg/ml、约0.1mg/ml至约10mg/ml、约0.05mg/ml至约25mg/ml、约0.05mg/ml至约10mg/ml、约0.05mg/ml至约5mg/ml、或约0.05mg/ml至约1mg/ml。在实施方案中，用于胃肠外施用的药物组合物包括处于以下对应浓度的活性物质：例如，约0.05mg/ml至约15mg/ml、约0.5mg/ml至约10mg/ml、约0.25mg/ml至约5mg/ml、约0.5mg/ml至约7mg/ml、约1mg/ml至约10mg/ml、约5mg/ml至约10mg/ml或约5mg/ml至约15mg/ml。

在实施方案中，提供了用于肠胃外施用的药物组合物，其中药物组合物稳定至少6个月。在实施方案中，用于胃肠外施用的药物组合物表现出活性成分在例如至少3个月或6个月内减少不多于约5％。在实施方案中，载体或非载体媒介物的量降解不多于约，例如，2.5％、1％、0.5％或0.1％。在实施方案中，在至少六个月内降解少于约例如，5％、2.5％、1％、0.5％、0.25％、0.1％。

在实施方案中，提供了用于肠胃外施用的药物组合物，其中药物组合物保持可溶。在实施方案中，提供了稳定的、可溶的、局部部位相容的和/或可即用的(ready-to-use)的用于胃肠外施用的药物组合物。在实施方案中，本文的药物组合物是可即用的，用于直接施用至有相应需要的患者。

本文提供的用于肠胃外施用的药物组合物可以包括一种或更多种赋形剂，例如溶剂、溶解度增强剂、悬浮剂、缓冲剂、等渗剂、稳定剂或抗微生物防腐剂。当使用时，肠胃外组合物的赋形剂将不会不利地影响组合物中使用的载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA的稳定性、生物可利用度、安全性和/或效力。因此，提供了其中剂型的任何组分之间不存在不相容性的肠胃外组合物。

在实施方案中，包括载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA的肠胃外组合物包括稳定量的至少一种赋形剂。例如，赋形剂可以选自由缓冲剂、增溶剂、张度剂、抗氧化剂、螯合剂、抗微生物剂和防腐剂组成的组。本领域技术人员将理解，赋形剂可以具有多于一种功能并且被分类为一个或更多个指定的组。

在实施方案中，药物组合物包括载体、非载体递送媒介物和/或一种或更多种微小RNA以及赋形剂，并且其中赋形剂以少于约，例如，10％、5％、2.5％、1％、或0.5％的重量百分比(w/v)存在。在实施方案中，赋形剂以约，例如，1.0％至10％、10％至25％、15％至35％、0.5％至5％、0.001％至1％、0.01％至1％、0.1％至1％或0.5％至1％之间的重量百分比存在。在实施方案中，赋形剂以约，例如，0.001％至1％、0.01％至1％、1.0％至5％、10％至15％或1％至15％之间的重量百分比存在。

在实施方案中，肠胃外组合物可以根据需要施用，例如每天一次、两次、三次、四次、五次、六次或更多次，或者根据患者的需要连续施用。

在实施方案中，提供了活性成分的肠胃外组合物，其中组合物的pH在约4.0至约8.0之间。在实施方案中，组合物的pH在例如约5.0至约8.0、约6.0至约8.0、约6.5至约8.0之间。在实施方案中，组合物的pH在例如，约6.5至约7.5、约7.0至约7.8、约7.2至约7.8、或约7.3至约7.6之间。在实施方案中，水性溶液的pH是，例如，约6.8、约7.0、约7.2、约7.4、约7.6、约7.7、约7.8、约8.0、约8.2、约8.4或约8.6。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本文的公开内容所属领域的技术人员通常理解的相同含义。

如本文使用的，术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分地取决于该值如何被测量或确定，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在3个或多于3个标准偏差内。可选地，“约”可以意指给定值的上至20％、上至10％、上至5％和/或上至1％的范围。可选地，特别地关于生物系统或过程，该术语可以意指在值的数量级内，优选地在值的5倍内，并且更优选地在值的2倍内。

“改善”是指对发作性疾病诸如局灶性癫痫、难治性局灶性癫痫、局灶性皮质发育不良、癫痫、具有全面性强直-阵挛性发作的癫痫、具有肌阵挛性失神的癫痫、额叶癫痫、颞叶癫痫、Landau-Kleffner综合征、Rasmussen综合征、Dravet综合征、Doose综合征、CDKL5紊乱、婴儿痉挛(West综合征)、青少年肌阵挛性癫痫(JME)、疫苗相关脑病、顽固性儿童期癫痫(ICE)、Lennox-Gastaut综合征(LGS)、Rett综合征、Ohtahara综合征、CDKL5紊乱、儿童期失神性癫痫、特发性震颤、急性反复性发作、良性罗兰多癫痫、癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态、超难治性癫痫持续状态(SRSE)、PCDH19小儿癫痫、脑肿瘤诱导的发作、错构瘤诱导的发作、药物戒断诱导的发作、酒精戒断诱导的发作、增加的发作活动或突破性发作(也被称为连续性或从集性发作)的治疗，所述治疗的测量涉及前述疾病的至少一种症状。

“次日功能的改善”或“其中存在次日功能的改善”是指从整夜睡眠时间醒来后的改善，其中将微小RNA疗法施用至患者的有益效果适用于本文的综合征或疾病的至少一种症状，并且可由患者主观地或由观察者客观地在一段时间内，例如醒来后2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时等辨别到。

“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”可以指以下：可能罹患或易患一种疾病或状况但尚未经历或显示该疾病或状况的临床或亚临床症状的患者中该疾病或状况的临床症状的减轻或延迟出现。在某些实施方案中，“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”可以指在可能罹患或易患该疾病或状况但尚未经历或显示该疾病或状况的临床或亚临床症状的患者中防止该疾病或状况的临床症状的出现。“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”还指抑制该疾病或状况，例如，迟滞或减轻其发展或其至少一种临床或亚临床症状。“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”还指缓解该疾病或状况，例如，引起该疾病或状况或其至少一种临床或亚临床症状的消退。对待治疗的患者的益处可以是统计学上显著的、数学上显著的或至少是患者或和/或医师可感知的。尽管如此，预防性(prophylactic)(预防性(preventive))治疗和治疗性(therapeutic)(治愈性(curative))治疗是本文的公开内容的两种不同的实施方案。

“药学上可接受的”是指“通常被认为是安全的”的分子实体和组合物，例如，当被施用至人类时是生理上可容忍的并且通常不产生过敏或类似的不良反应诸如胃部不适等的分子实体和组合物。在实施方案中，该术语是指由联邦或州政府的管理机构作为经历上市之前审查并且被FDA批准的根据联邦食品、药物和化妆品法案第204(s)和409节的GRAS清单或类似清单批准的、被美国药典或另一种公认的药典批准用于在动物并且更特别地用于在人类中使用的分子实体和组合物。

“有效量”或“治疗有效量”可以意指足以减轻所治疗的综合征、紊乱、疾病或状况的一种或更多种症状或者以其他方式提供期望的药理学和/或生理学作用的剂量。“有效量”或“治疗有效量”可以在本文可互换地使用。

“与…共施用”、“与…组合施用”、“…的组合”或“与…一起施用”可以可互换地使用并且意指在疗程中施用两种或更多种剂。剂可以在相同的时间一起施用，或以间隔开的时间间隔分开施用。剂可以以单一剂型或以分开的剂型施用。

“有相应需要的患者”可以包括已经被诊断为具有诸如以下的发作性疾病的个体，例如哺乳动物诸如人类、犬、猫、猪、啮齿动物等：癫痫、具有全面性强直-阵挛性发作的癫痫、具有肌阵挛性失神的癫痫、局灶性癫痫、顽固性局灶性癫痫、局灶性皮质发育不良、额叶癫痫、颞叶癫痫、Landau-Kleffner综合征、Rasmussen综合征、Dravet综合征、Doose综合征、CDKL5紊乱、婴儿痉挛(West综合征)、青少年肌阵挛性癫痫(JME)、疫苗相关脑病、顽固性儿童期癫痫(ICE)、Lennox-Gastaut综合征(LGS)、Rett综合征、Ohtahara综合征、CDKL5紊乱、儿童期失神性癫痫、特发性震颤、急性反复性发作、良性罗兰多癫痫、癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态、超难治性癫痫持续状态(SRSE)、PCDH19小儿癫痫、脑肿瘤诱导的发作、错构瘤诱导的发作、药物戒断诱导的发作、酒精戒断诱导的发作、增加的发作活动增加或突破性发作(也被称为连续性或丛集性发作)。发作性疾病可能与1型钠通道蛋白α亚基(Scn1a)相关的紊乱相关。这些方法可以向任何个体提供，包括，例如，其中患者是新生儿、婴儿、儿科患者(6个月至12岁)、青少年患者(年龄为12-18岁)或成人(18岁以上)。患者包括哺乳动物。

“前药”是指以无活性(或显著较少活性)形式被施用至患者的药理学物质(药物)。在施用后，前药在身体中(体内)被代谢为具有期望的药理学活性的化合物。

“类似物”和“衍生物”可以可互换地使用，并且是指具有与母体化合物相同的核但可以在键级、一个或更多个原子和/或原子团的不存在或存在及其组合方面与母体化合物有差异的化合物。对映异构体是衍生物的实例。衍生物可以例如，在核上存在的一个或更多个取代基方面与母体化合物不同，所述取代基可以包括一个或更多个原子、官能团或亚结构。通常，可以至少在理论上设想衍生物经由化学和/或物理过程从母体化合物形成。

如本文使用的，术语“药学上可接受的盐”是指本文定义的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸式盐或其碱式盐来修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于无机碱的无毒性碱加成盐。合适的无机碱诸如碱金属和碱土金属的碱包括金属阳离子诸如钠、钾、镁、钙等的碱。药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从母体化合物合成。

实施例

本文提供的实施例仅为了增充本文的公开内容而被包括，并且不应该在任何方面被认为是限制性的。

实施例I

将如下文描述的Hu-pri-miR序列克隆到AAV pAM质粒骨架中。每个质粒将通过测序和限制性消化来验证。

1.pAM-CBA-hu-pri-miR128-2-WPRE-bGH

2.pAM-CBA-hu-pri-miR101-WPRE-bGH

3.pAM-CBA-sc-hu-pri-miR128-2-GFP-WPRE-bGH

表达GFP报告物的质粒有助于对miR在输注到小鼠脑中之后的表达的体内扩散进行分析。

上文的质粒1-3和pAM-空质粒将被包装到AAVRec3载体中(～300μLAAV载体；>1×10¹²vg/mL)并且使用标准碘克沙醇纯化方法纯化。AAV载体储备物纯度将通过标准SDS-PAGE和考马斯染色方法确定。AAV载体滴度将通过定量RT-PCR确定。

研究1：AAV载体剂量的优化

将AAV miR-128-2-GFP和AAV miR128-2载体以两种载体剂量注射到小鼠脑中(对于每种载体和2种剂量，n＝4只动物)(包括在该事件中的只有miR128-2的载体存在与GFP协同的毒性作用)。在载体输注后4周取脑，以便使用标准化的实验室方法分析转基因表达(针对GFP)和扩散以及任何毒性证据(GFAP、Cd11b、NeuN IHC、Fluorojade)。

研究2：AAV载体剂量的优化

将AAV miR-101-1-GFP和AAV miR101-1载体以两种载体剂量注射到小鼠脑中(对于每种载体和2种剂量，n＝4只动物)(包括在该事件中的只有miR101-1的载体存在与GFP协同的毒性作用)。将在载体输注后4周取脑，以便使用标准化的实验室方法分析转基因表达(针对GFP)和扩散以及任何毒性证据(GFAP、Cd11b、NeuN IHC、Fluorojade)。

研究3：

将产生以下治疗组。在载体输注后3-4周取脑用于分析。

治疗组：

AAV-miR128-2

AAV-miR101

AAV-miR128-2/miR101

动物组大小：n＝8/载体。

分析：

毒性-NeuN IHC、Fluorojade染色

通过RT-qPCR/数字液滴PCR确定对靶基因表达的影响。如果针对这些靶的抗体是可得的，尽可能进行蛋白质印迹和/或IHC方法。

miR-128-2靶

οslc6a1(EAAT3)、TARPP、Pea15a、ERK1/2活化–纹状体样品。

miR-101靶

οNKCC1、Ank2、Kif1a(突触前)、Abca1、Ndrg2(胶质细胞)、xCT、PMCA2

实施例2

在小鼠发作性模型中前瞻性评估微小RNA治疗的效力

在第一天，将50只小鼠在异氟醚麻醉下向海马中注射红藻氨酸(KA,200ng/nl)。在第21天，将AAVRec3-pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA(4.66E+13基因组拷贝/ml)注射到硬化的海马中(500nl)。在25只IHKA对照小鼠中注射AAVRec3-pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA对照载体。同时，将双极记录电极植入海马中。在第25天、第27天、第30天、第32天和第35天，选择小鼠用于评价。检查约20％至25％的动物(5只至6只小鼠/组)。连续记录EEG，并且记录的信号将被进一步处理以对发作数目定量。对小鼠进行评价以确定哪些剂量提供延长的发作抑制而无副作用。终点是至少8小时的发作抑制。

实施例3

在小鼠发作性模型中前瞻性评估微小RNA治疗的效力

在第一天，将50只小鼠在异氟醚麻醉下向海马中注射红藻氨酸(KA,200ng/nl)。在第21天，将AAVRec3-pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA(4.66E+13基因组拷贝/ml)注射到硬化的海马中(500nl)。在25只IHKA对照小鼠中注射AAVRec3-pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA对照载体。同时，将双极记录电极植入海马中。在第25天、第27天、第30天、第32天和第35天，选择小鼠用于评价。将检查约20％至25％的动物(5只至6只小鼠/组)。连续记录EEG，并且记录的信号将被进一步处理以对发作数目定量。对小鼠进行评价以确定哪些剂量提供延长的发作抑制而无副作用。终点是至少8小时的发作抑制。

实施例4

在小鼠发作性模型中前瞻性评估超声波增强的微小RNA治疗的效力

在第一天，将50只小鼠在2％异氟醚麻醉下向海马中注射红藻氨酸(KA,200ng/nl)。在第21天，将AAVRec3-pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA(4.66E+13基因组拷贝/ml)注射到硬化的海马中(500nl)。在25只IHKA对照小鼠中注射AAVRec3-pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA对照载体。

在AAVRec3-pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA施用之前，将超声波能量应用至具有修饰的受体的海马位点附近的BBB。使用2％异氟烷麻醉每只小鼠，并且俯卧放置，用包括小鼠头部固定器、耳杆(ear bar)和气体麻醉面罩的立体定位装置固定其头部。使用电动修剪器和脱毛膏去除小鼠毛发。将底部用薄的、透声的和透光的塑料包装密封的脱气的充水容器放置在小鼠头部上方。还使用超声波偶联凝胶消除任何残余的阻抗不匹配。

超声波将由单元件球形区段聚焦超声波换能器(中心频率：1.525MHz，焦深：90mm，半径：30mm，可从例如Riverside Research Institute,New York,N.Y.,USA获得)产生。使脉冲-回波诊断换能器(中心频率：7.5MHz，焦距：60mm)对准通过聚焦超声波换能器的中心圆孔(半径11.2mm)，使得两个换能器的焦点完全重叠。将填充有脱气且经蒸馏的水的锥体安装在换能器系统上，水由透声的聚氨酯膜盖子控制在锥体中。将换能器系统附接至计算机控制的三维定位系统(例如，可从Velmex Inc.,Lachine,QC,CAN获得)。将聚焦超声波换能器连接至匹配电路，并且由计算机控制的函数发生器和50-dB功率放大器驱动。脉冲-回波换能器将由与个人计算机中的数字化仪相连的脉冲发生器-接收器系统驱动。

将聚焦超声波换能器浸没在脱气的充水容器中，其波束轴垂直于颅骨的表面。使用例如网格定位法使换能器的焦点定位在小鼠脑内。对齐换能器的波束轴，使得焦点置于颅骨顶骨的顶部下方3mm处。以这种放置，聚焦超声波束的焦点将与左海马和左大脑后动脉(PCA)重叠。右海马将不被靶向并且可以用作对照。

将25μl由微泡组成的超声波造影剂团(平均直径：3.0-4.5μm，浓度：5.0-8.0×10⁸个泡/ml)在声处理之前1-4分钟注入尾静脉中。然后将脉冲聚焦超声波(脉冲速率：10Hz，脉冲持续时间：20ms，占空比：20％)以0.64Mpa的峰峰值(peak-to-peak)、以由30s声处理组成的二次猝发系列(a series of two bursts)应用在单个位置(即海马)。在每次猝发之间，允许30-s的间隔，用于使脉冲之间的任何残余热量消散。聚焦超声波声处理程序可以在每个小鼠的脑中进行一次或更多次。

在BBB开放之后，将双极记录电极植入海马中。对小鼠进行评价以确定哪些剂量提供延长的发作抑制而无副作用。终点是至少8小时的发作抑制。

实施例5

在第一天，对50只小鼠在2％异氟醚麻醉下向海马中注射红藻氨酸(KA,200ng/nl)。在第21天，将AAVRec3-pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA(4.66E+13基因组拷贝/ml)注射到硬化的海马中(500nl)。在25只IHKA对照小鼠中注射AAVRec3-pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA对照载体。

在AAVRec3-pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA施用之前，将超声波能量应用至具有修饰的受体的海马位点附近的BBB。使用2％异氟烷麻醉每只小鼠，并且俯卧放置，用包括小鼠头部固定器、耳杆和气体麻醉面罩的立体定位装置固定其头部。使用电动修剪器和脱毛膏去除小鼠毛发。将底部用薄的、透声的和透光的塑料包装密封的脱气的充水容器放置在小鼠头部的上方。还使用超声波偶联凝胶消除任何剩余的阻抗不匹配。

超声波将由单元件球形区段聚焦超声波换能器(中心频率：1.525MHz，焦深：90mm，半径：30mm，例如可从Riverside Research Institute,New York,N.Y.,USA获得)产生。使脉冲-回波诊断换能器(中心频率：7.5MHz，焦距：60mm)对准通过聚焦超声波换能器的中心圆孔(半径11.2mm)，使得两个换能器的焦点完全重叠。将填充有脱气且经蒸馏的水的锥体安装在换能器系统上，水由透声的聚氨酯膜盖子控制在锥体中。将换能器系统附接至计算机控制的三维定位系统(例如，可从Velmex Inc.,Lachine,QC,CAN获得)。聚焦超声波换能器将连接至匹配电路，并且由计算机控制的函数发生器和50-dB功率放大器驱动。脉冲-回波换能器将由与个人计算机中的数字化仪相连的脉冲发生器-接收器系统驱动。

将25μl由微泡组成的超声波造影剂团(平均直径：3.0-4.5μm，浓度：5.0-8.0×10⁸个泡/ml)在声处理之前1-4分钟注入尾静脉中。然后将脉冲聚焦超声波(脉冲速率：10Hz，脉冲持续时间：20ms，占空比：20％)以0.64Mpa的峰峰值、以由30s声处理组成的二次猝发系列应用在单个位置(即海马)。在每次猝发之间，允许30-s的间隔，用于脉冲之间的任何残余热量消散。聚焦超声波声处理程序可以在每个小鼠的脑中进行一次或更多次。

在BBB开放之后，将双极记录电极植入海马中。对小鼠进行评价以确定哪些剂量提供延长的发作抑制而无副作用。终点是至少8小时的癫痫抑制。

实施例6

在第一天，对50只小鼠在2％异氟醚麻醉下向海马中注射红藻氨酸(KA,200ng/nl)。在第21天，将AAV 9-pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA(4.66E+13个基因组拷贝/ml)注射到硬化的海马中(500nl)。在25只IHKA对照小鼠中注射AAV 9-pAM_CBA-pl-WPRE-BGHpA对照载体。连续记录EEG，并且记录的信号将被进一步处理以对发作数目定量。

在AAV 9-pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA施用之前，将超声波能量应用至具有修饰的受体的海马位点附近的BBB。使用2％异氟烷麻醉每只小鼠，并且俯卧放置，用包括小鼠头部固定器、耳杆和气体麻醉面罩的立体定位装置固定其头部。使用电动修剪器和脱毛膏去除小鼠毛发。将底部用薄的、透声的和透光的塑料包装密封的脱气的充水容器放置在小鼠头部上方。还使用超声波偶联凝胶消除任何残余的阻抗不匹配。

超声波将由单元件球形区段聚焦超声波换能器(中心频率：1.525MHz，焦深：90mm，半径：30mm，例如可从Riverside Research Institute,New York,N.Y.,USA获得)产生。使脉冲-回波诊断换能器(中心频率：7.5MHz，焦距：60mm)对准通过聚焦超声波换能器的中心圆孔(半径11.2mm)，使得两个换能器的焦点完全重叠。将填充有脱气且经蒸馏的水的锥体安装在换能器系统上，水由透声的聚氨酯膜盖子控制在锥体中。将换能器系统附接至计算机控制的三维定位系统(例如，可从Velmex Inc.,Lachine,QC,CAN获得)。将聚焦超声波换能器连接至匹配电路，并且由计算机控制的函数发生器和50-dB功率放大器驱动。脉冲-回波换能器将由与个人计算机中的数字化仪相连的脉冲发生器-接收器系统驱动。

将聚焦超声波换能器浸没在脱气充水容器中，其波束轴垂直于颅骨的表面。使用例如网格定位法使换能器的焦点定位在小鼠脑内。对齐换能器的波束轴，使得焦点被放置在颅骨顶骨的顶部下方3mm处。以这种放置，聚焦超声波束的焦点将与左海马和左大脑后动脉(PCA)重叠。右海马将不被靶向并且可以用作对照。

将25μl由微泡组成的超声波造影剂团(平均直径：3.0-4.5μm，浓度：5.0-8.0×10⁸个泡/ml)在声处理之前1-4分钟注入尾静脉中。然后将脉冲聚焦超声波(脉冲速率：10Hz，脉冲持续时间：20ms，占空比：20％)将以0.64Mpa的峰峰值、以由30s声处理组成的二次猝发系列应用在单个位置(即海马)。在每次猝发之间，允许30-s的间隔，用于使脉冲之间的任何残余热量消散。聚焦超声波声处理程序可以在每个小鼠脑中进行一次或更多次。

在BBB开放之后，将双极记录电极植入海马中。施用MRI造影剂，例如钆。造影剂用于确定BBB是否已经通过聚焦超声波处理而开放。通过使用9.4T系统使用TI加权和T2加权的MRI扫描来观察该剂。将小鼠放置在附接了3.8-cm直径的正交线圈(birdcage coil)的塑料管中并且垂直插入磁体中。在声处理后约15分钟但在MRI造影剂注射前，获得T1加权自旋-回波MRI扫描(TR/TE：246.1ms/10ms；BW：50,505.1Hz；矩阵大小：256乘以256；FOV：1.92乘以1.92cm；切片厚度：0.6mm:NEX：10,15和45)。在完成第一次扫描后，经由导管腹膜内施用0.5mL的MRI造影剂钆以描绘BBB开放。腹膜内注射允许MRI造影剂被缓慢摄取到血流中。在注射MRI造影剂之后，对每只小鼠获取一系列六次交替的T1加权的和T2加权的快速自旋-回波图像扫描(TR/TE：4000ms/9.2ms；具有迟豫增强的快速采集：16；FOV：1.92乘以1.92cm；矩阵大小：256乘以256；切片的数目：10；切片厚度：0.6mm；切片间隙：0.1mm；NEX：10、15和45)。

对小鼠进行评价以确定哪些剂量提供延长的发作抑制而无副作用。终点是至少8小时的发作抑制。

应当理解，本文提供的实施例和实施方案是示例性的实施例和实施方案。本领域技术人员将想到对这些实施例和实施方案的符合本文的公开内容的范围的各种修改。这样的修改意图被权利要求书所覆盖。

序列表

<110> 奥维德医疗公司

马修·杜林

<120> MIR101或MIR128在治疗发作性疾病中的用途

<130> 2262-51

<150> US 62/595,255

<151> 2017-12-06

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<223> 人类miR101的成熟序列

<400> 1

uacaguacug ugauaacuga a 21

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<223> miR128的成熟序列

<400> 2

gggggccgau acacuguacg aga 23

<210> 3

<211> 6141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体：pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA

<400> 3

tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60

tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120

actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180

tctaggtacc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 240

tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 300

tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 360

attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 420

tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc 480

ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg 540

gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg 600

gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt 660

ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag 720

tcgctgcgcg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 780

ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 840

gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 900

ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg 960

gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc 1020

ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc 1080

aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattggatcc actcgagtgg 1140

agctcgcgac tagtcgattc gaattcgtcg actggatcca gtaccgagga gatctgcgcc 1200

gcgatcgctg ctggaagctt actgcatatt tgatgtatta gagtgaaaac ctaatcatgc 1260

agttgttcat cctcattaat atggataagt catgtgttca tctttcattc taatttaatt 1320

caactgggcc ttttaatatt tcagcctcac cacttgctgg gctctgatcc ttctttttct 1380

tctgcctcct cacgtctcca accagaaggt gatcttttag tccttcactt catggggagc 1440

cttcagagag agtaatgcag ccaccagaaa ggatgccgtt gaccgacaca gtgactgaca 1500

ggctgccctg gctcagttat cacagtgctg atgctgtcta ttctaaaggt acagtactgt 1560

gataactgaa ggatggcagc catcttacct tccatcagag gagcctcacc gtacccagga 1620

agaaagaagg tgaaagagga atgtgaaaca ggtggctggg acccagaaac cctcttaccc 1680

tgcacctctg tcatacttct cccggggcat agggagagtt attctgcttc tctttgcctt 1740

gttttgtaac atggggtagt tgttggtgca gccatgttgt gctgagtgaa catatattaa 1800

gatctttgga acctttagga gactgaaaat aggtaagtat gaattagtat ttctggaatg 1860

gtattcagag aacttcgacg cgtacgcggc cgctcgagca gaaactcatc tcagaagagg 1920

atctggcagc aaatgatatc aagcttatcg ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg 1980

aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt 2040

taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata 2100

aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg 2160

tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc 2220

tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct 2280

gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt 2340

cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg 2400

ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc 2460

tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct 2520

ccctttgggc cgcctccccg catcgatacc gtcgactcgc tgatcagcct cgactgtgcc 2580

ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 2640

tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag 2700

gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga 2760

caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag 2820

ctggggctcg actagagcat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta atcattaact 2880

acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg 2940

aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg 3000

agcgagcgcg cagagctttt tgcaaaagcc taggcctcca aaaaagcctc ctcactactt 3060

ctggaatagc tcagaggccg aggcggcctc ggcctctgca taaataaaaa aaattagtca 3120

gccatggggc ggagaatggg cggaactggg cggagttagg ggcgggatgg gcggagttag 3180

gggcgggact atggttgctg actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg 3240

ggagcctggg gactttccac acctggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact 3300

tctgcctgct ggggagcctg gggactttcc acaccctaac tgacacacat tccacagctg 3360

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 3420

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 3480

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 3540

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 3600

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 3660

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 3720

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 3780

ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 3840

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 3900

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 3960

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 4020

ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 4080

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 4140

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 4200

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 4260

ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 4320

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 4380

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 4440

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 4500

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 4560

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 4620

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 4680

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 4740

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 4800

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 4860

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 4920

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 4980

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 5040

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 5100

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 5160

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 5220

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 5280

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 5340

cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 5400

aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc 5460

ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc 5520

gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt 5580

gtactgagag tgcaccattc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc 5640

cagtagtagg ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat 5700

ggcgcccaac agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct 5760

catgagcccg aagtggcgag cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc 5820

agcaaccgca cctgtggcgc cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatctg 5880

gctagcgatg accctgctga ttggttcgct gaccatttcc gggtgcggga cggcgttacc 5940

agaaactcag aaggttcgtc caaccaaacc gactctgacg gcagtttacg agagagatga 6000

tagggtctgc ttcagtaagc cagatgctac acaattaggc ttgtacatat tgtcgttaga 6060

acgcggctac aattaataca taaccttatg tatcatacac atacgattta ggtgacacta 6120

tagaatacac ggaattaatt c 6141

<210> 4

<211> 6124

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体：pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA

<400> 4

tagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60

tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120

actaggggtt ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc 180

tctaggtacc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 240

tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 300

tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 360

attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 420

tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc 480

ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg 540

gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg 600

gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt 660

ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag 720

tcgctgcgcg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 780

ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 840

gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 900

ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg 960

gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc 1020

ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc 1080

aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattggatcc actcgagtgg 1140

agctcgcgac tagtcgattc gaattcgtcg actggatcca gtaccgagga gatctgcgcc 1200

gcgatcgcgt ctccataaat tattttttga tccttcttct gttaaagcag aaagtcaacc 1260

atgtccgtac ctttctagtt cataccttct tttaattttt tttttctttt caatttgaag 1320

agagtgcttc ctctgttctt aaggctaggg aaccaaatta ggttgtttca atatcgtgct 1380

aaaagatact gcctttagaa gaaggctatt gacaatccag cgtgtctcgg tggaactctg 1440

actccatggt tcactttcat gatggccaca tgcctcctgc ccagagcccg gcagccactg 1500

tgcagtggga aggggggccg atacactgta cgagagtgag tagcaggtct cacagtgaac 1560

cggtctcttt ccctactgtg tcacactcct aatggaatgc cgttatccaa agagcagcac 1620

gaacccgaca gggctgagtg gcttgtgcta gggagaggtt tgtgtcattc ctgctgacca 1680

aactgcagga aaaactgcta attgtcatgc tgaagactgc ctgacgggga gactctgcct 1740

tctgtaagta ggtcatgtaa agagcacgtg ctccttgctg ctactcatag atgcctgctc 1800

cgtgatctga tttctgcact gaatctatgt tatgcatatg gaatgtatac agatacatgt 1860

acgcgtacgc ggccgctcga gcagaaactc atctcagaag aggatctggc agcaaatgat 1920

atcaagctta tcgataatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt 1980

cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat 2040

gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct 2100

ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct 2160

gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc 2220

gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg 2280

acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa atcatcgtcc 2340

tttccttggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac 2400

gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg 2460

cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc 2520

ccgcatcgat accgtcgact cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 2580

ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 2640

tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 2700

ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 2760

gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagctggggc tcgactagag 2820

catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg 2880

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 2940

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagct 3000

ttttgcaaaa gcctaggcct ccaaaaaagc ctcctcacta cttctggaat agctcagagg 3060

ccgaggcggc ctcggcctct gcataaataa aaaaaattag tcagccatgg ggcggagaat 3120

gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt taggggcggg actatggttg 3180

ctgactaatt gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct ggggactttc 3240

cacacctggt tgctgactaa ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc 3300

ctggggactt tccacaccct aactgacaca cattccacag ctgcattaat gaatcggcca 3360

acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 3420

gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 3480

gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 3540

ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 3600

cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 3660

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 3720

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 3780

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 3840

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 3900

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 3960

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 4020

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 4080

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 4140

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 4200

tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 4260

cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 4320

aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 4380

atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 4440

cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 4500

tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 4560

atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 4620

taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 4680

tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 4740

gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 4800

cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 4860

cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 4920

gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 4980

aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 5040

accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 5100

ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 5160

gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 5220

aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 5280

taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 5340

cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc 5400

gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc 5460

ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg 5520

cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca 5580

ttcgacgctc tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca gcccagtagt aggttgaggc 5640

cgttgagcac cgccgccgca aggaatggtg catgcaagga gatggcgccc aacagtcccc 5700

cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagtggc 5760

gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg 5820

cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg cgtagaggat ctggctagcg atgaccctgc 5880

tgattggttc gctgaccatt tccgggtgcg ggacggcgtt accagaaact cagaaggttc 5940

gtccaaccaa accgactctg acggcagttt acgagagaga tgatagggtc tgcttcagta 6000

agccagatgc tacacaatta ggcttgtaca tattgtcgtt agaacgcggc tacaattaat 6060

acataacctt atgtatcata cacatacgat ttaggtgaca ctatagaata cacggaatta 6120

attc 6124

<210> 5

<211> 738

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAVRec3氨基酸序列

<400> 5

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Gly Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Arg Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp

260 265 270

Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr

405 410 415

Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Gln Gly Thr Gln Gln Leu Leu

450 455 460

Phe Ser Gln Ala Gly Pro Ala Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser

485 490 495

Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr

515 520 525

His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Arg Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Thr Asn Thr Gly

580 585 590

Pro Ile Val Gly Asn Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

Claims

1.一种用于治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用包括编码微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101的核酸的载体，其中所述核酸被可操作地连接至启动子，其中所述发作性疾病的一种或更多种症状被改善。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述施用后，微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101在所述患者中的表达与所述发作性疾病的症状减轻相关。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述启动子选自由CAG启动子、CMV启动子、人类突触蛋白1基因启动子(hSyn)、强啡肽启动子、脑髓苷启动子和CaMKII启动子组成的组。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述启动子是CAG启动子。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体包括土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体包括牛生长激素多腺苷酸化序列(BGHpA)。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体包括荧光报告物盒。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体是腺病毒相关病毒(AAV)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述腺病毒相关病毒是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVRec3。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体是慢病毒。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体被递送至所述患者的脑中的靶位置。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶位置是额叶、颞叶、枕叶或顶叶。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述载体经由选自由口服、含服、舌下、直肠、局部、鼻内、阴道和肠胃外组成的组的途径施用。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述载体被直接施用至所述靶位置。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体是pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA。

16.根据权利要求1所述的治疗发作性疾病的方法，其中所述发作性疾病选自由以下组成的组：癫痫、具有全面性强直-阵挛性发作的癫痫、具有肌阵挛性失神的癫痫、额叶癫痫、颞叶癫痫、枕叶癫痫、顶叶癫痫、Landau-Kleffner综合征、Rasmussen综合征、Dravet综合征、Doose综合征、CDKL5紊乱、婴儿痉挛(West综合征)、青少年肌阵挛性癫痫(JME)、疫苗相关脑病、顽固性儿童期癫痫(ICE)、Lennox-Gastaut综合征(LGS)、Rett综合征、Ohtahara综合征、CDKL5紊乱、儿童期失神性癫痫、特发性震颤、急性反复性发作、良性罗兰多癫痫、癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态、超难治性癫痫持续状态(SRSE)、PCDH19小儿癫痫、脑肿瘤诱导的发作、错构瘤诱导的发作、药物戒断诱导的发作、酒精戒断诱导的发作、增加的发作活动和突破性发作。

17.根据权利要求1所述的治疗发作性疾病的方法，其中所述发作性疾病的特征是局灶性发作。

18.根据权利要求1所述的治疗发作性疾病的方法，其中所述发作性疾病是局灶性皮质发育不良。

19.根据权利要求1所述的治疗发作性疾病的方法，其中所述方法提供了选自由以下组成的组的至少一种症状的改善：共济失调、步态障碍、言语障碍、发声、认知功能受损、异常运动活动、临床发作、亚临床发作、张力减退、张力亢进、流口水、口部行为、先兆、惊厥、重复性运动、异常感知、发作的频率和发作的严重程度。

20.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将超声波应用于所述患者的脑中的靶位置以在所述靶位置处增强所述患者的血脑屏障的透性，其中所述载体被递送至所述靶位置。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述超声波通过颅骨施用。

22.根据权利要求20所述的方法，所述方法还包括使脑的硬脑膜暴露，以及将所述超声波递送至暴露的硬脑膜处或暴露的硬脑膜下方。

23.根据权利要求20所述的方法，其中在施用所述载体之前，将所述超声波施用至所述患者的脑中的所述靶位置。

24.根据权利要求20所述的方法，其中所述载体在应用所述超声波之前施用。

25.一种治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的增加所述患者的脑中的微小RNA-101分子的水平的药物组合物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述组合物包括微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述组合物包括载体，所述载体包括编码微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101的核酸。

28.根据权利要求27所述的方法，其中在所述施用后，微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101在所述患者中的表达与所述发作性疾病的症状减轻相关。

29.根据权利要求27所述的方法，其中编码微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101的所述核酸被可操作地连接至启动子。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述启动子选自由CAG启动子、CMV启动子、人类突触蛋白1基因启动子(hSyn)、强啡肽启动子、脑髓苷启动子和CaMKII启动子组成的组。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述载体包括土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

32.根据权利要求27所述的方法，其中所述载体包括荧光报告物盒。

33.根据权利要求27所述的方法，其中所述载体是腺病毒相关病毒(AAV)。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述腺病毒相关病毒是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVRec3。

35.根据权利要求27所述的方法，其中所述载体是慢病毒。

36.根据权利要求27所述的方法，其中所述载体是pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA。

37.根据权利要求27所述的方法，其中所述载体被递送至所述患者的脑中的靶位置。

38.根据权利要求38所述的方法，其中所述靶位置是额叶、颞叶、枕叶或顶叶。

39.根据权利要求27所述的方法，其中所述载体经由选自由口服、含服、舌下、直肠、局部、鼻内、阴道和肠胃外组成的组的途径施用。

40.根据权利要求37所述的方法，其中所述载体被直接施用至所述靶位置。

41.根据权利要求25所述的方法，其中所述发作性疾病选自由以下组成的组：癫痫、具有全面性强直-阵挛性发作的癫痫、具有肌阵挛性失神的癫痫、额叶癫痫、颞叶癫痫、枕叶癫痫、顶叶癫痫、Landau-Kleffner综合征、Rasmussen综合征、Dravet综合征、Doose综合征、CDKL5紊乱、婴儿痉挛(West综合征)、青少年肌阵挛性癫痫(JME)、疫苗相关脑病、顽固性儿童期癫痫(ICE)、Lennox-Gastaut综合征(LGS)、Rett综合征、Ohtahara综合征、CDKL5紊乱、儿童期失神性癫痫、特发性震颤、急性反复性发作、良性罗兰多癫痫、癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态、超难治性癫痫持续状态(SRSE)、PCDH19小儿癫痫、脑肿瘤诱导的发作、错构瘤诱导的发作、药物戒断诱导的发作、酒精戒断诱导的发作、增加的发作活动和突破性发作。

42.根据权利要求25所述的方法，其中所述发作性疾病的特征是局灶性发作。

43.根据权利要求25所述的方法，其中所述发作性疾病是局灶性皮质发育不良。

44.根据权利要求25所述的方法，其中所述方法提供了选自由以下组成的组的至少一种症状的改善：共济失调、步态障碍、言语障碍、发声、不自主发笑、认知功能受损、异常运动活动、临床发作、亚临床发作、张力减退、张力亢进、流口水、口部行为、先兆、惊厥、重复性运动、异常感知、发作的频率和发作的严重程度。

45.根据权利要求25所述的方法，所述方法还包括将超声波应用于所述患者的脑中的靶位置以在所述靶位置处增强所述患者的血脑屏障的透性，其中所述载体被递送至所述靶位置。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述超声波通过颅骨施用。

47.根据权利要求45所述的方法，所述方法还包括使所述脑的硬脑膜暴露，以及将所述超声波递送至暴露的硬脑膜处或暴露的硬脑膜下方。

48.根据权利要求45所述的方法，其中在施用所述载体之前，将所述超声波施用至所述患者的脑中的所述靶位置。

49.根据权利要求45所述的方法，其中所述载体在应用所述超声波之前施用。

50.根据权利要求25所述的方法，其中所述组合物包括载体，所述载体为非病毒载体。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述非病毒载体是脂质体介导的递送载体。

52.一种载体，所述载体包括编码微小RNA-101、pri-miR101或pre-miR101的核酸，所述核酸在CAG启动子、土拨鼠转录后调控元件(WPRE)和牛生长激素多腺苷酸化序列(BGHpA)的调控控制下。

53.一种用于治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用包括编码微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128的核酸的载体，其中所述核酸被可操作地连接至启动子，其中所述发作性疾病的一种或更多种症状被改善。

54.根据权利要求53所述的方法，其中在所述施用后，微小RNA-128在所述患者中的表达与所述发作性疾病的症状减轻相关。

55.根据权利要求53所述的方法，其中所述启动子选自由CAG启动子、CMV启动子、人类突触蛋白1基因启动子(hSyn)、强啡肽启动子、脑髓苷启动子和CaMKII启动子组成的组。

56.根据权利要求53所述的方法，其中所述启动子是CAG启动子。

57.根据权利要求53所述的方法，其中所述载体包括土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

58.根据权利要求53所述的方法，其中所述载体包括牛生长激素多腺苷酸化序列(BGHpA)。

59.根据权利要求53所述的方法，其中所述载体包括荧光报告物盒。

60.根据权利要求53所述的方法，其中所述载体是腺病毒相关病毒(AAV)。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述腺病毒相关病毒是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVRec3。

62.根据权利要求53所述的方法，其中所述载体是慢病毒。

63.根据权利要求53所述的方法，其中所述载体被递送至所述患者的脑中的靶位置。

64.根据权利要求53所述的方法，其中所述靶位置是额叶、颞叶、枕叶或顶叶。

65.根据权利要求63所述的方法，其中所述载体经由选自由口服、含服、舌下、直肠、局部、鼻内、阴道和肠胃外组成的组的途径施用。

66.根据权利要求63所述的方法，其中所述载体被直接施用至所述靶位置。

67.根据权利要求53所述的方法，其中所述miR128由miRNA128-2编码。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述载体是pAM/CBA-miR128-2-WPRE-BGHpA。

69.根据权利要求53所述的治疗发作性疾病的方法，其中所述发作性疾病选自由以下组成的组：癫痫、具有全面性强直-阵挛性发作的癫痫、具有肌阵挛性失神的癫痫、额叶癫痫、颞叶癫痫、枕叶癫痫、顶叶癫痫、Landau-Kleffner综合征、Rasmussen综合征、Dravet综合征、Doose综合征、CDKL5紊乱、婴儿痉挛(West综合征)、青少年肌阵挛性癫痫(JME)、疫苗相关脑病、顽固性儿童期癫痫(ICE)、Lennox-Gastaut综合征(LGS)、Rett综合征、Ohtahara综合征、CDKL5紊乱、儿童期失神性癫痫、特发性震颤、急性反复性发作、良性罗兰多癫痫、癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态、超难治性癫痫持续状态(SRSE)、PCDH19小儿癫痫、脑肿瘤诱导的发作、错构瘤诱导的发作、药物戒断诱导的发作、酒精戒断诱导的发作、增加的发作活动和突破性发作。

70.根据权利要求53所述的治疗发作性疾病的方法，其中所述发作性疾病的特征是局灶性发作。

71.根据权利要求53所述的治疗发作性疾病的方法，其中所述发作性疾病是局灶性皮质发育不良。

72.根据权利要求53所述的治疗发作性疾病的方法，其中所述方法提供了选自由以下组成的组的至少一种症状的改善：共济失调、步态障碍、言语障碍、发声、不自主发笑、认知功能受损、异常运动活动、临床发作、亚临床发作、张力减退、张力亢进、流口水、口部行为、先兆、惊厥、重复性运动、异常感知、发作的频率和发作的严重程度。

73.根据权利要求53所述的方法，所述方法还包括将超声波应用于所述患者的脑中的靶位置以在所述靶位置处增强所述患者的血脑屏障的透性，其中所述载体被递送至所述靶位置。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述超声波通过颅骨施用。

75.根据权利要求73所述的方法，所述方法还包括使所述脑的硬脑膜暴露，以及将所述超声波递送至暴露的硬脑膜处或暴露的硬脑膜下方。

76.根据权利要求73所述的方法，其中在施用所述载体之前，将所述超声波施用至所述患者的脑中的所述靶位置。

77.根据权利要求73所述的方法，其中所述载体在应用所述超声波之前施用。

78.一种治疗有相应需要的患者中的发作性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的增加所述患者脑细胞中的微小RNA-128分子的水平的药物组合物。

79.根据权利要求78所述的方法，其中所述组合物包括微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128。

80.根据权利要求78所述的方法，其中所述组合物包括载体，所述载体包括编码微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128的核酸。

81.根据权利要求80所述的方法，其中在所述施用后，微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128在所述患者中的表达与所述发作性疾病的症状减轻相关。

82.根据权利要求80所述的方法，其中编码微小RNA-128的核酸是miR-128-2。

83.根据权利要求80所述的方法，其中编码微小RNA-128的核酸被可操作地连接至启动子。

84.根据权利要求80所述的方法，其中所述启动子选自由CAG启动子、CMV启动子、人类突触蛋白1基因启动子(hSyn)、强啡肽启动子、脑髓苷启动子和CaMKII启动子组成的组。

85.根据权利要求80所述的方法，其中所述载体包括土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。

86.根据权利要求80所述的方法，其中所述载体包括荧光报告物盒。

87.根据权利要求80所述的方法，其中所述载体是腺病毒相关病毒(AAV)。

88.根据权利要求87所述的方法，其中所述腺病毒相关病毒是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVRec3。

89.根据权利要求80所述的方法，其中所述载体是慢病毒。

90.根据权利要求80所述的方法，其中所述载体是pAM/CBA-miR101-1-WPRE-BGHpA。

91.根据权利要求80所述的方法，其中所述载体被递送至所述患者的脑中的靶位置。

92.根据权利要求91所述的方法，其中所述靶位置是额叶、颞叶、枕叶或顶叶。

93.根据权利要求91所述的方法，其中所述载体经由选自由口服、含服、舌下、直肠、局部、鼻内、阴道和肠胃外组成的组的途径施用。

94.根据权利要求91所述的方法，其中所述载体被直接施用至所述靶位置。

95.根据权利要求78所述的方法，其中所述发作性疾病选自由以下组成的组：癫痫、具有全面性强直-阵挛性发作的癫痫、具有肌阵挛性失神的癫痫、额叶癫痫、颞叶癫痫、枕叶癫痫、顶叶癫痫、Landau-Kleffner综合征、Rasmussen综合征、Dravet综合征、Doose综合征、CDKL5紊乱、婴儿痉挛(West综合征)、青少年肌阵挛性癫痫(JME)、疫苗相关脑病、顽固性儿童期癫痫(ICE)、Lennox-Gastaut综合征(LGS)、Rett综合征、Ohtahara综合征、CDKL5紊乱、儿童期失神性癫痫、特发性震颤、急性反复性发作、良性罗兰多癫痫、癫痫持续状态、难治性癫痫持续状态、超难治性癫痫持续状态(SRSE)、PCDH19儿科癫痫、脑肿瘤诱导的发作、错构瘤诱导的发作、药物戒断诱导的发作、酒精戒断诱导的发作、增加的发作活动和突破性发作。

96.根据权利要求78所述的方法，其中所述发作性疾病的特征是局灶性发作。

97.根据权利要求78所述的方法，其中所述发作性疾病是局灶性皮质发育不良。

98.根据权利要求78所述的方法，其中所述方法提供了选自由以下组成的组的至少一种症状的改善：共济失调、步态障碍、言语障碍、发声、不自主发笑、认知功能受损、异常运动活动、临床发作、亚临床发作、张力减退、张力亢进、流口水、口部行为、先兆、惊厥、重复性运动、异常感知、发作的频率和发作的严重程度。

99.根据权利要求78所述的方法，所述方法还包括将超声波应用于所述患者的脑中的靶位置以在所述靶位置处增强所述患者的血脑屏障的透性，其中所述载体被递送至所述靶位置。

100.根据权利要求99所述的方法，其中所述超声波通过颅骨施用。

101.根据权利要求99所述的方法，所述方法还包括使所述脑的硬脑膜暴露，并且将所述超声波递送至暴露的硬脑膜处或暴露的硬脑膜下方。

102.根据权利要求99所述的方法，其中在施用所述载体之前，将所述超声波施用至所述患者的脑中的所述靶位置。

103.根据权利要求99所述的方法，其中所述载体在应用所述超声波之前施用。

104.根据权利要求78所述的方法，其中所述组合物包括载体，所述载体为非病毒载体。

105.根据权利要求104所述的方法，其中所述非病毒载体是脂质体介导的递送载体。

106.一种载体，所述载体包括编码微小RNA-128、pri-miR128或pre-miR128的核酸，所述核酸在CAG启动子、土拨鼠转录后调控元件(WPRE)和牛生长激素多腺苷酸化序列(BGHpA)的调控控制下。

107.根据权利要求102所述的方法，其中微小RNA-128由微小RNA-128-2编码。