KR20230130155A - 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스를 이용한 병태의 치료 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 비-제한적인 예로, 골관절염 및 류마티스 관절염과 같은 병태들의 증상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 방법은 변형된 IL-1Ra 펩타이드를 발현하도록 개조된 벡터를 가진 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV)를 관절내 직접 주사하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 방법은 변형된 IL-1Ra 펩타이드를 치료학적 유효량으로 발현하여, 치료 중인 병태와 관련된 증상을 개선할 수 있다.

Description

재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스를 이용한 병태의 치료 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CONDITIONS USING RECOMBINANT SELF-COMPLEMENTARY ADENO-ASSOCIATED VIRUS}

교차 참조

본 출원은 2016년 8월 19일자 미국 가출원 번호 62/377,297에 대한 우선권을 주장하며, 이 미국 가출원은 원용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함된다.

서열목록에 대한 내용

출원인은 파일명 CALIM _16_02_PCT_Sequence_Listing_ST25.txt로 규칙 13ter.1(a)에 따라 제출되어 Annex C/ST.25 문서 파일 형태로 기록된 정보가 출원된 국제 출원의 일부를 형성하는 것과 동일함을 주장한다. 서열목록의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

발명의 기술 분야

본 발명은 유전자 테라피 및 유전자 테라피용 조성물, 특히 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (recombinant self-complementary adeno-associated virus, sc-rAAV) 및 sc-rAAV를 이용한 병태 또는 병태의 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

골관절염 (OA)은 미국인 2천7백만명이 앓고 있으며, 노년층의 주된 장애 요인이다. 또한, OA 환자는 사망 위험성이 더 높다. 건강 관리 시스템에 지출되는 OA 비용은 연간 천억 달러를 넘는 것으로 추정된다. 이러한 통계는, OA가 난치성이고, 특히 치료 저항성이 매우 높다는 점을 반영한다.

OA의 가장 초기 주된 증상은 통증이다. OA는 일반적으로 질병 진행의 후기에 나타나며, 이 시기에는 관절 연골의 소실, 연골 하 경화, 골증식체 (osteophyte) 형성 및 활액염 등의 발병된 관절에서 상당한 구조적인 변형이 존재한다. 슬관절에는 반월상 연골 손상 (meniscal damage)도 존재한다. 질환 진행을 정지 또는 역전시키는 골관절염에 대한 근본적 치료제 (disease-modifying osteoarthritis drug, DMOAD)가 없는 경우, 현재 치료법은 일시적인 처방에 불과하다. 현재 질환 진행에 개입하기 위한 효과적인 방법이 없어, 많은 환자들은 전체 관절 치환술이 필요한 시점까지 질환이 진행된다. 성공적인 시술시, 강도높은 재활과 더불어 상당히 값비싼 수술이 수반된다. 많은 사례들에서, 기능 부전된 인공 관절을 대체하기 위한 재치환술이 필요하다.

현행 표준 관리는, DMOAD가 없을 경우, 일시적인 처방이다. 2012년 미국 류마티스학회 (ACR) 및 2013년 미국 정형외과학회 (AAOS)의 최신 OA 치료 가이드라인에 반영된 바와 같이, 현재의 치료 방식은 3단계의 점진적 범주로 나뉘어진다. 비-약물 치료는 환자 교육 및 자력, 운동 프로그램 및 체중 감소와 같은 다양한 전략들을 포함한다. 약물 치료로는 아세트아미노펜, 비-스테로이드계 항염증제 (NSAID), 아편제의 사용, 및 글루코코르티코이드 또는 히알루론산의 관절내 주사가 있다. NSAID는 많은 환자들에서 일부 증상 완화를 보이지만, 상부 GI 출혈과 신장 부전을 유발하는데, 이는 OA 환자 다수가 노년층이라는 현 상황에서 특히 염려가 된다. 글루코코르티코이드의 관절내 주사가 다수 사례들에서 빠른 증상 완화를 보이지만, 그 효과는 통상 불과 수주 지속될 뿐이다. 글루코코르티코이드의 반복 주사는, 감염의 염려 및 지속적인 고 용량의 글루코코르티코이드가 관절 연골을 손상시킨다는 증거로 인해, 부적절하며, 금기시된다. 히알루론산 관절내 주사의 효과 (윤활액 보충 요법)는 논쟁의 여지가 있다: ACR은 이런 점에서 이 주사를 권고하지 않으며, AAOS는 더 이상 이를 권고하지 않는다. 간엽 줄기 세포 (MSC) 및 혈소판-풍부 혈장과 같은 자가 혈액 제제의 관절내 주사가 점점 인기를 끌고 있지만, FDA로부터 OA 용도로 허가받지 못했다. 국제 골관절염 연구회 및 유럽 류마티스 연맹의 무릎 OA에 대한 최신 권고안은 ACR 및 AAOS의 권고안과 크게 다르지 않다. 다양한 기관들의 권고안은 OA 치료 옵션 부족과 신뢰할 수 있는 효과적인 약리학적 개입이 전혀 없다는 것을 부각시켜준다. 치료 반응이 일부 있더라도, 징후와 증상만 해결하는 것일 뿐 질병의 진행을 해결하는 것은 아니다. 치료가 OA 증상과 진행을 제어하지 못한다면, 외과적인 개입이 처방될 수 있다.

관절경 세척 (arthroscopic lavage) 및 괴사조직제거술 (debridement)이 증상을 완화하기 위해 널리 사용되고 있지만, 그 효과가 위약 보다 높지 않다는 증거들로 인해 사용이 줄어들고 있다. 무릎 관절내 힘을 재조정하기 위해 때때로 절골술이 수행되는데, 이로써 무손상 연골 영역까지 하중이 가해진다. 이 방법은 하중을 견디는 새로운 관절 연골이 침식되어 증상이 재발할 때까지 몇년간 증상 완화를 제공해줄 수 있다. 일반적으로, 절골술은 인공 슬관절을 외과적으로 이식할 때까지 시간을 벌기 위한 지연 전략으로 검토된다. 많은 환자들이 전체 관절 치환이 필요한 상태까지 진행되며, 미국에서는 연간 700,000개가 넘는 인공 슬관절이 외과적으로 이식되고 있다.

IL-1은 연골의 연골분해와 연골 세포에 의한 매트릭스 합성 억제를 둘다 매개하는 강력한 매개인자이다. 요컨대, 이들 2가지 프로세스는 연골 파괴성이 매우 높다. 또한, IL-1은 연골형성을 저해하는 한편 동시에, 골증식체의 형성과 연골 하 경화를 설명하는데 도움이 될 수 있는 골형성 분화의 특정 측면들을 촉진하는 것으로 입증된 바 있다. 역설적으로, IL-1은 파골세포 활성도 촉진한다. IL-1은 골형성과 골분해를 모두 자극함으로써, OA시 연골 하 영역에서 나타나는 바와 같이 골 턴오버를 강화할 것이다. 최종적으로, IL-1은 OA에서 관찰되는 염증 변화를 촉발하기에 유리한 입장이다. 이의 발열 작용은 공지되어 있으며, 토끼 슬관절내 IL-1의 극소량 발현은 중증의 활액막염을 야기하기에 충분하다.

OA를 앓고 있는 인간 관절로부터 복구된 연골의 연구에서, 연골 세포에 의한 IL-1 생산이 자가분비 방식으로 고도로 증가되어 유지되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이 세포는 IL-1Ra를 생산하지 않았다. 이는 OA에서 생리학적 주요 저해제가 없을 경우 IL-1에 의한 연골 세포의 자가분비 및 주변분비 활성화가 강화됨을 시사한다. OA에서 IL-1에 대한 연골 세포의 증가된 반응성은 또한 OA 연골 세포 상에서 신호전달 수용체인 1형 IL-1 수용체의 발현 증가에 의해서도 확인되었다. 연골 세포에 의한 국소 IL-1 생산 및 소비는 윤활액 내 IL-1의 농도가 심지어 OA에서도 감소되는 경향을 보이는 이유를 설명하는데 도움이 될 수 있다. 또한, 유전자 분석에서 IL-1Ra (IL1RN)를 코딩하는 인간 유전자에서 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)과, 특정 타입의 OA의 발병 및 중증도와 상관관계가 있는 조절 인자들이 동정되었다.

표적 약물 전달이 관절 질환의 관절내 치료에 주요 문제이다. 임의의 크기의 분자 뿐만 아니라 입자들이 림프관, 활액막하 모세관 또는 이 둘다를 통해 관절에서 빠르게 제거된다. 이로 인해 관절내 anti-OA 약물의 지속적인 치료학적 용량을 달성하기가 어렵다. 이를 해결하기 위해, 소형 분자는 전신 방식으로 전달할 수 있지만, 활액막하 모세관의 유창내피 (fenestrated endothelium)를 통과하는데 있어 크기-의존적인 제한으로 인해, 이런 방식으로 단백질을 전달하기는 어렵다. 또한, 전신 전달은 비-표적 부위를 고 용량의 치료제에 노출시켜, 원치 않은 부작용을 유발한다. 전형적으로 수 시간의 반감기를 가진, 관절로부터의 단백질의 빠른 배출은, 관절내 전달을 잠재적으로 소용없게 한다. 예를 들어, 재조합 IL-1Ra (Kineret, Amgen Biologicals)는 RA의 증상을 치료하기 위한 시도로 매일 피하 주사에 의해 전달된다. 그러나, 이러한 매일 전달은 주사 간격 사이의 기간 동안 IL-1Ra를 치료학적 혈청 수준으로 유지시키지 못한다 (Evans et al., 1996, Human Gene Therapy, 7:1261-1290; Evans et al., 2005, PNAS 102 (24): 8698-8703). 몇몇 실험들에서는 OA를 치료하기 위해 IL-1Ra를 도입하기 위한 생체외 유전자 전달법을 사용하였다. 그러나, 이러한 방식들은 번거러우며, 장기간 유전자 발현을 제공할 수 없는 것으로 확인되었다 (Frisbie et al., 2002, Gene Therapy 9(1): 12-20). 또한, 몇몇 실험들은 골관절염을 치료하기 위해 IL-1alpha 및 IL-1beta를 표적으로 하는 이중 가변성 도메인-면역글로불린 (DVD-Ig) (예, ABT-981)을 사용하는 것에 대해 기술하고 있다 (Kamath et al., 2011, Osteoarthritis and Cartilage 19S1:S64; Wang et al., 2015, Osteoarthritis and Cartilage 23:A398-399; Wang et al., 2014, Osteoarthritis and Cartilage 22:S462-S463; Lacy et al., 2015, mAbs 7(3):605-619; Wu et al., 2009, mAbs 1(4):339-347; Wang et al., 2014, Scientific Abstracts SAT0448 pg. 756; Goss et al., 2014, Scientific Abstracts SAT0447 pg. 755-756; US 2015/0050238; Wang et al., 2014 ACR/ARHP Annual Meeting Abstract Number 2237; Wang et al., 2015 ACR/ARHP Annual Meeting Abstract Number 318). 그러나, 이들 펩타이드는, 비교적 짧은 반감기로 인해, 전신 투여를 반복적으로 실시하여야 한다 (예, 2주 마다 4회 또는 4주 마다 3회, 예를 들어, 피하 주사 또는 정맥내 주입 (Wang et al., 2015, Osteoarthritis and Cartilage 23:A398-399; Wang et al., 2014, Osteoarthritis and cartilage 22:S462-S463; Evans et al., 2005, PNAS 102 (24): 8698-8703).

본 발명은 치료학적 유전자 생산물 (예, IL-1Ra)을 지속적인 방식으로 대상 위치, 예를 들어, 관절에 전달하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 비-제한적인 예로, 골관절염 및 류마티스 관절염과 같은 병태의 증상을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개체 (예, 인간)에게 치료학적 유전자 생산물 (예, IL-1Ra)을 치료학적 유효량으로 제공하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 방법 및 조성물은 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV)를 특징으로 할 수 있으며, sc-rAAV는 조작된 캡시드와 이 캡시드 안에 패키징된 벡터 (예, sc-rAAV 벡터)를 포함한다. 벡터는 프로모터 (예, 구성적인 프로모터)에 작동가능하게 연결된 전이유전자 (예, 대상 단백질, 예를 들어, 치료학적 유전자 생산물, 예컨대, IL-1Ra 또는 이의 코돈 변형된 버전을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)룰 포함할 수 있다. 치료학적 유전자 생산물은 대상 위치에, 예를 들어, 관절에 전달될 수 있다. 예를 들어, 골관절염을 치료하기 위해, sc-rAAV를 관절내 직접 주사를 통해 관절내 세포 (예, 연골 세포, 활막 세포 등) 내에 도입할 수 있다. 본 발명은 전술한 병태 또는 대상 위치 (예, 관절)로 제한되지 않는다.

Goodrich et al. (Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2013, 2:e70)은 일반적으로 scAAV-전달된 IL-1Ra를 이용한 골관절염의 치료 방법을 개시하였음에 주목한다. 그러나, Goodrich 등은 임의의 특정 IL-1Ra 서열, 예를 들어, 본 발명에 따른 IL-1Ra 서열을 특이적으로 동정하지 않거나 또는 동정할 수 없다. 특히, 유전자 테라피 분야는 대상 단백질에 대한 임의의 구체적인 유전자 서열이 효율적으로 발현될 것임을 추정할 수 없는 예측불가한 영역이다. 또한, 유전자 테라피는 인간과 비교해 동물 모델에서 효능을 예측할 수 없으며, 예를 들어, 특정 방법이 동물 모델에서 효과적이라고 인간에서 효과적일 것으로 추정할 순 없다.

본 발명은 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV)에 관한 것이다. 일부 구현예에서, sc-rAAV는 조작된 AAV 캡시드와 이 캡시드 안에 패키징된 벡터를 포함하며, 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 변형된 IL-1Ra 유전자를 포함하며, 변형된 IL-1Ra 유전자는 서열번호 2와 95% 이상 동일하다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CMV 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 캡시드는 혈청형 AAV2의 적어도 일부 및 혈청형 AAV6의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 캡시드는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11의 적어도 일부, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 SV40 및 보바인 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 SV40 스플라이스 도너 (SD) 및 스플라이스 억셉터 (SA) 부위들을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 sc-rAAV2.5Hu-IL-1Ra를 포함한다. 일부 구현예에서, sc-rAAV는 조성물의 일부이다.

일부 구현예에서, sc-rAAV는 조작된 AAV 캡시드와 이 캡시드 안에 패키징된 벡터를 포함하며, 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 변형된 IL-1Ra 유전자를 포함하며, 변형된 IL-1Ra 유전자는 서열번호 6에 따른 IL-1Ra 단백질을 코딩한다.

본 발명은 인터루킨-1 수용체 작용제 (IL-1Ra) 펩타이드를 치료학적 유효량으로 필요한 인간 (예, 골관절염 또는 류마티스 관절염으로 진단되거나 또는 위험성이 있는 인간)에게 제공하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이 방법은 본 발명에 따른 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV)를 포함하는 조성물을 대상 위치에 도입 (예, 관절내 주사를 통해)하는 것을 포함한다. sc-rAAV는 벡터를 대상 위치의 세포에 형질도입하며, 변형된 IL-1Ra 유전자가 발현되어 치료학적 유효량의 IL-1Ra 펩타이드를 인간에게 제공한다.

또한, 본 발명은 인간에서 골관절염 또는 류마티스 관절염의 증상을 개선하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 본 발명에 따른 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV)를 포함하는 조성물을 대상 위치에 도입 (예, 관절내 직접 주사를 통해)하는 것을 포함한다. sc-rAAV는 벡터를 대상 위치의 세포에 형질도입하며, 변형된 IL-1Ra 유전자가 발현되어 골관절염 또는 류마티스 관절염과 관련된 증상을 개선시키는데 효과적인 양의 IL-1Ra 펩타이드를 인간에게 제공한다.

또한, 본 발명은 필요한 인간 (예, 골관절염 또는 류마티스 관절염으로 진단되거나 또는 발병 위험성이 있는 인간)에서 연골을 복구하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이 방법은 본 발명에 따른 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV)를 포함하는 조성물을 연골 위치에 도입 (예, 관절내 직접 주사를 통해)하는 것을 포함한다. sc-rAAV는 벡터를 연골 위치의 세포에 형질도입하며, 변형된 IL-1Ra 유전자가 발현되어 연골을 복구하는데 효과적인 IL-1Ra 펩타이드를 인간에게 제공한다.

또한, 본 발명은 염증 부위에 인터루킨-1 수용체 작용제 (IL-1Ra) 펩타이드를 제공하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이 방법은 본 발명에 따른 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV)를 포함하는 조성물을 염증 위치에 도입 (예, 관절내 주사를 통해)하는 것을 포함한다. sc-rAAV는 벡터를 염증 위치의 세포에 형질도입하며, 변형된 IL-1Ra 유전자가 발현되어 염증을 줄이는데 효과적인 치료학적 유효량의 IL-1Ra 펩타이드를 염증 위치 내 세포에 제공한다.

일부 구현예에서, 대상 위치는 인간의 관절, 활막, 활막하, 관절낭, 힘줄, 인대, 연골 또는 관절주위 근육이다. 일부 구현예에서, 세포는 연골 세포, 활막 세포 또는 이들의 조합이다.

일부 구현예에서, 본 방법은 이 방법을 최초 수행한 후의 소정의 경과 시점에 2차로 수행된다. 일부 구현예에서, 소정의 경과 시점은 3달 이상 경과 시점이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제2 테라피 (예, 글루코코르티코이드, 히알루로난, 혈소판-풍부 혈장, 재조합 인간 IL-1Ra 또는 이들의 조합)를 본 조성물과 조합하여 대상 위치에 공동-도입하는 것을 더 포함한다.

또한, 본 발명은 IL-1Ra 펩타이드를 연골 세포 또는 활막 세포에 전달하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이 방법은 연골 세포 또는 활막 세포를 본 발명에 따른 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV), 예컨대, 혈청형 2의 적어도 일부와 혈청형 6의 적어도 일부를 포함하는 조작된 아데노-부속 바이러스 (AAV) 캡시드 및 캡시드 안에 패키징된 벡터와 접촉시키는 것을 포함하며, 벡터는 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된 변형된 IL-1Ra 유전자를 포함하며, 변형된 IL-1Ra 유전자는 서열번호 2와 95% 이상 동일하다. sc-rAAV는 벡터를 연골 세포 또는 활막 세포에 형질도입하며, 변형된 IL-1Ra 유전자가 발현되어 IL-1Ra 펩타이드를 연골 세포 또는 활막 세포에 제공한다.

전술한 방법 및 조성물 (예, 필요한 인간에게 치료학적 유효량의 인터루킨-1 수용체 작용제 (IL-1Ra) 펩타이드를 제공하는 방법, 인간에서 골관절염 또는 류마티스 관절염의 증상을 개선하는 방법, 연골 세포 또는 활막 세포에 IL-1Ra 펩타이드를 전달하는 방법, 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV)를 포함하는 조성물, CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된 변형된 IL-1Ra 유전자를 포함하는 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV) 벡터, 필요한 개에서 연골을 복구하는 방법, 염증 부위에 인터루킨-1 수용체 작용제 (IL-1Ra) 펩타이드를 제공하는 방법 등)에서, 변형된 IL-1Ra 유전자는 서열번호 2와 95% 이상 동일할 수 있으며, 서열번호 6에 따른 IL-1Ra를 코딩한다.

본원에 기술된 임의의 특징 또는 특징들의 조합은, 맥락, 본 명세서 및 당해 기술 분야의 당업자의 지식으로부터 자명한 바와 같이, 임의의 이러한 조합에 포함된 특징들이 상호 모순되지 않은 한 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명의 추가적인 이점 및 측면들은 후술한 상세 설명 및 청구항에서 명확하게 기술된다.

도 1은 CMV 프로모터의 통제 하에 인간 IL-1Ra 단백질을 코딩하는 변형된 cDNA를 포함하는 플라스미드 sc-rAAV2.5Hu-IL-1Ra를 도시한 것이다. 유전자 인서트는 또한 SV40 및 보바인 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 서열 뿐만 아니라 SV40 스플라이스 도너 (SD) 및 스플라이스 억셉터 (SA) 부위를 포함한다. 인버티드 말단 리피트 (TR) 사이 영역은 서열분석에 의해 검증되었다.

용어

달리 설명되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 단수형 ("a," "an," 및 "the")은 명확하게 그렇지 않은 것으로 명시되지 않은 한 복수의 지칭을 포괄한다. 마찬가지로, 용어 "또는"은 문맥상 명확하게 그렇지 않은 것으로 명시되지 않은 한 "및"을 포괄하는 것으로 의도된다. "포함하는"은 "함유하는"을 의미한다. 그래서, "A 또는 B를 포함하는"은 "A를 함유하는" 또는 "B를 함유하는" 또는 "A 및 B를 함유하는"을 의미한다.

본원의 구현예들을 실시 및/또는 검사하는데 적합한 방법 및 재료들을 아래에 기술한다. 이러한 방법 및 재료들은 단순 예이며, 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 기술된 내용과 비슷하거나 또는 등가인 그외 방법 및 재료들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명이 속하는 당해 기술 분야에 잘 알려진 통상적인 방법들은, 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (and Supplements to 2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; 및 Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 등의 다양한 일반적이고 보다 구체적인 문헌들에 기술되어 있으며, 이들 문헌의 내용들은 원용에 의해 그 전체 내용이 본원에 포함된다.

본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다.

본원에 언급된 방법 및 재료와 유사하거나 또는 등가인 방법 및 재료들을 사용해 본원에 기술된 기술들을 실시 또는 검사할 수 있지만, 이하 적합한 방법 및 재료를 기술한다. 재료, 방법 및 예들은 예시적인 것일 뿐 제한하고자 하는 것은 아니다.

본원에 대한 다양한 구현예들을 쉽게 검토하기 위해, 특정 용어들에 대한 설명을 아래에 제공한다.

아데노-부속 바이러스 (AAV), 재조합 AAV (rAAV), 및 재조합 자기-상보적인 AAV (sc-rAAV): AAV는 파르보비리대 과의 소형 바이러스 (20 nm)이다. AAV는 질환을 유발하는 것으로 알려져 있지 않다. AAV는 최근 낮은 면역원성, 비-분열 세포에 대한 효과적인 형질도입력 및 다양한 세포 및 조직 타입들에 대한 감염력을 가진 것으로 입증된 등의 다양한 이유로 유전자 테라피에 사용되어 왔다. 재조합 AAV (rAAV)는 천연적인 바이러스 코딩 서열을 함유하지 않는다. 재조합 AAV DNA는 약 4600개의 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 분자로서 바이러스 캡시드 안에 패키징된다. 세포의 바이러스 감염 후, 세포의 분자 기구가 DNA 단일 가닥을 이중 가닥 형태로 변환한다. 오직 이중 가닥 DNA 형태만, 함유된 유전자 또는 유전자들을 RNA로 전사하는 세포의 단백질에, 사용가능하다. 자기-상보성 AAV (sc-rAAV)는 분자내 이중 가닥 DNA 주형을 형성할 수 있는 조작된 rAAV 형태이다. 즉, 감염되면, sc-rAAV의 상보성 가닥 1/2 2개가 조합되어, 즉각적인 복제 및 합성 준비가 된 하나의 이중 가닥 DNA를 형성할 것이다.

발현: 핵산 서열의 단백질 번역. 단백질이 발현되어 세포내에 유지될 수 있으며, 세포 표면 막의 구성 성분이 되거나 또는 세포외 기질 또는 매질 내로 방출될 수 있다.

작동가능하게 연결됨: 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적인 관계로 배치되면, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.

약제학적으로 허용가능한 비히클: 약제학적으로 허용가능한 담체 (비히클), 예컨대, 용액은, 비-제한적으로 통상적인 비히클일 수 있다. 예를 들어, E. W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975) 및 D. B. Troy, ed. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore MD and Philadelphia, PA, 21^st Edition (2006)에서는 하나 이상의 치료학적 화합물 또는 분자를 약제학적으로 전달하는데 적합한 조성물 및 제형들을 기술하고 있다. 일반적으로, 담체의 특성은 사용되는 구체적인 투여 방식에 따라 결정될 것이다. 투여되는 약학적 조성물은, 생물학적으로 중성인 담체 외에도, 습윤제 또는 유화제, 보존제 및 pH 완충제 등, 예를 들어, 소듐 아세테이트 또는 소르비탄 모노라우레이트와 같은 무-독성의 보조 물질을 최소량으로 포함할 수 있다.

병태의 예방, 치료, 관리 또는 개선: 질환 "예방"은 병태의 전체 발병을 저해하는 것을 의미할 수 있다. "치료"는 발병 개시 후 질환 또는 병리학적 병태의 징후 또는 증상을 개선시키는 치료학적 개입을 지칭할 수 있다. "관리"는 질환 또는 병태의 징후 또는 증상이 악화되지 않게 하는 치료학적 개입을 지칭할 수 있다. "개선"은 질환 또는 병태의 징후 또는 증상의 수적 또는 중증도 완화를 지칭할 수 있다.

서열 동일성: 2개 이상의 핵산 서열 간의 동일성 (또는 유사성)은 서열들 간의 동일성 또는 유사성 관점으로 표시된다. 서열 동일성은 동일성 %로 측정할 수 있으며; %가 높을수록 서열 동일성이 높다. 서열 유사성은 (보존적인 아미노산 치환을 고려한) 유사성 %로 측정할 수 있으며; %가 높을수록 서열 유사성이 높다. 비교하기 위한 서열 정렬 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘들이 개시되어 있다: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; 및 Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990은 서열 정렬 방법 및 상동성 계산과 관련된 상세한 사항들을 제시한다. NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)는, 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 함께 사용하도록, 국립 생물공학센터 (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894) 등의 몇몇 소스로부터, 그리고 인터넷 상에서 이용할 수 있다. 추가적인 정보는 NCBI 웹사이트에서 확인할 수 있다. BLASTN을 이용해 핵산 서열을 비교할 수 있으며, BLASTP를 이용해 아미노산 서열을 비교할 수 있다. 2개의 비교 서열들이 상동성을 공유한다면, 지정된 출력 파일은 정렬된 서열로서 상동성 영역을 나타낼 것이다. 2개의 비교 서열이 상동성을 공유하지 않는다면, 지정된 출력 파일은 정렬된 서열을 나타내지 않을 것이다. BLAST-유사 정렬 도구 (BLAT)를 사용해 또한 핵산 서열을 비교할 수 있다 (Kent, Genome Res. 12:656-664, 2002). BLAT는, 켄트 인포메틱스 (Santa Cruz, CA) 등의 몇몇 소스로부터, 그리고 인터넷 (genome.ucsc.edu) 상에서 이용가능하다. 정렬한 후, 양쪽 서열에 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 개수를 카운팅함으로써, 매칭되는 수를 측정한다. 서열 동일성 %는, 매칭되는 개수를 동정된 서열에 나타낸 서열의 길이로 또는 연결된 (articulated) 길이 (동정된 서열에 나타낸 서열에서 연결된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 100개)로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여, 계산한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 1554개를 가진 테스트 서열과 정렬하였을 때, 매칭되는 개수가 1166개인 핵산 서열은, 테스트 서열과의 동일성은 75.0%이다 (1166÷1554*100=75.0). 서열 동일성 % 값은 소수점 첫번째 자리에서 반올림된다.

치료학적 유효량: 물질로 치료 중인 개체에서 바람직한 효과를 달성하기에 충분한 지정된 물질의 함량. 이러한 물질은 IL-1Ra를 포함할 수 있다. 예를 들어, IL-1Ra의 치료학적 유효량은 골관절염 또는 류마티스 관절염의 증상을 예방, 치료 또는 개선하기에 충분한 양일 수 있다. 개체를 예방, 개선 및/또는 치료하는데 유용한 물질의 치료학적 유효량은 치료 중인 개체, 질병의 타입과 중증도 및 치료학적 조성물의 투여 수단에 따라 결정될 것이다.

형질도입: 형질도입된 세포는 분자 생물 기법에 의해 핵산 분자가 도입된 세포이다. 본원에서, 용어 형질도입은 핵산 분자를 세포에 도입시킬 수 있는 모든 기법, 예를 들어, 바이러스 또는 바이러스 벡터를 이용한 형질감염, 플라스미드 벡터의 형질전환 및 전기천공, 리포펙션 및 입자 총 가속화 (particle gun acceleration)에 의한 네이키드 DNA의 도입을 망라한다. 이러한 세포는 때때로 형질전환된 세포로 지칭된다.

벡터: 핵산 분자를 숙주 세포에 도입하여, 형질전환된 숙주 세포의 생산. 벡터는 복제 오리진 등의 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열이 결핍될 수 있다. 또한, 벡터는 대상 유전자, 하나 이상의 선택적인 마커 유전자, 그외 당해 기술 분야에 공지된 유전자 요소 또는 임의의 그외 적절한 인서트를 포함할 수 있다.

본 발명에 대한 상세한 설명

본 발명은 대상 위치, 예를 들어 관절에 지속적인 방식으로 치료학적 유전자 생산물 (예, IL-1Ra)을 전달하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 비-제한적인 예로, 골관절염 또는 류마티스 관절염과 같은 병태의 증상을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 치료학적 유효량의 치료학적 유전자 생산물 (예, IL-1Ra)을 개체 (예, 인간)에게 제공하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 방법 및 조성물은, 조작된 캡시드와 캡시드 안에 패키징된 벡터 (sc-rAAV 벡터)를 포함하는, 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV)를 특징으로 할 수 있다. 벡터는 프로모터 (예, 구성적인 프로모터)에 작동가능하게 연결된 전이유전자 (예, 대상 단백질, 예를 들어 치료학적 유전자 생산물, 예를 들어, IL-1Ra 또는 이의 변형된 버전을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)를 포함할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (sc-rAAV) 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다. sc-rAAV 벡터에 대한 비-제한적인 예는 아래 표 1의 서열번호 1에 나타낸다. 서열번호 1의 sc-rAAV 벡터는 변형된 IL-1Ra 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 보바인 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 SV40 스플라이스 도너 (SD) 부위와 스플라이스 억셉터 (SA) 부위를 포함한다. sc-rAAV 벡터는 서열번호 1로 제한되지 않는다.

sc-rAAV 벡터는 대상 펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 2와 90% 이상 동일하다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 2와 92% 이상 동일하다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 2와 94% 이상 동일하다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 2와 95% 이상 동일하다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 2와 96% 이상 동일하다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 2와 97% 이상 동일하다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 2와 98% 이상 동일하다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 2와 99% 이상 동일하다. 이들 핵산 서열에 대한 비-제한적인 예들은 아래 표 1에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 3은 서열번호 2와 약 98% 동일한 변형된 인간 IL-1Ra의 서열이고; 서열번호 4는 서열번호 2와 약 99% 동일한 변형된 인간 IL-1Ra의 서열이다 (표 1에서 진한 글자는 서열번호 2 대비 뉴클레오티드 치환을 표시하며, 코돈은 밑줄 표시됨).

표 1

일부 구현예에서, IL-1Ra 인서트에 의해 코딩된 IL-1Ra 펩타이드는 IL-1Ra를 포함한다 (하기 표 2에서 서열번호 6 참조).

표 2

전이유전자 (예, 대상 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 포함한다. 본 발명은 CMV 프로모터로 한정되지 않으며, 임의의 적절한 프로모터 또는 다양한 프로모터들의 일부를 특징으로 할 수 있다. 프로모터의 예로는 CMV 프로모터, 하이브리드 CMV 프로모터, CAG 프로모터, 인간 β-액틴 프로모터, 하이브리드 β-액틴 프로모터, EF1 프로모터, U1a 프로모터, U1b 프로모터, Tet-유도성 프로모터, VP16-LexA 프로모터, 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, 인간 연장 인자-1alpha 프로모터, 시미안 바이러스 40 (SV40) 프로모터, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 프로모터 등이 있다.

일부 구현예에서, 프로모터는 하이브리드 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 표 3은 IL-1β/IL-6 하이드리드 프로모터를 나타낸다 (또한, van de Loo et al., 2004, Gene Therapy 11:581-590을 참조함). 또한, 본 발명은 표 3에 나타낸 하이브리드 프로모터로 제한되지 않는다.

표 3

일부 구현예에서, sc-rAAV 벡터는 캡시드 안에 패키징된다. 일부 구현예에서, 캡시드는 AAV 혈청형 1 (AAV1), AAV 혈청형 2, (AAV2), AAV 혈청형 3, (AAV3), AAV 혈청형 4, (AAV4), AAV 혈청형 5, (AAV5), AAV 혈청형 6, (AAV6)의 적어도 일부, 이들의 유도체 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 캡시드는 AAV 혈청형 2의 적어도 일부 및 AAV 혈청형 6의 적어도 일부, 예컨대, AAV2.5를 포함한다.

조성물, 예를 들어, sc-rAAV를 포함하는 조성물은 대상 위치 (예, 인간)의 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 골관절염의 증상을 치료하는 일부 구현예에서, 조성물은 관절내 직접 주사를 통해 관절 내 세포 (예, 연골 세포, 활막 세포, 예컨대, 타입 A, 타입 B 등)에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 인간의 관절, 활막, 활막하, 관절낭, 힘줄, 인대, 연골 또는 관절주위 근육으로 투여된다. 본 발명은 전술한 병태 (예, 골관절염), 투여 수단 (예, 관절내 주사), 대상 위치 (예, 관절) 또는 세포 타입 (예, 연골 세포, 활막 세포)로 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 형질도입될 수 있는 다른 세포 타입으로는 간엽 줄기 세포를 포함할 수 있다.

sc-rAAV는 벡터를 세포에 형질도입하며, 변형된 IL-1Ra 펩타이드가 발현된다. 일부 구현예에서, IL-1Ra 펩타이드를 발현하여, 골관절염 또는 류마티스 관절염과 같은 다양한 병태들과 관련된 증상을 개선시키는데 효과적인 변형된 IL-1Ra 펩타이드를 치료학적 유효량으로 인간에 제공한다.

일부 구현예에서, 조성물 (예, sc-rAAV)의 도입은 1회로 수행된다. 일부 구현예에서, 조성물 (예, sc-rAAV)의 도입은 2회 수행되며, 예를 들어, 1차 수행한 후 후속적으로 2차 수행된다. 일부 구현예에서, 조성물의 도입은 3회 이상, 예를 들어, 3회, 4회, 5회 등으로 수행된다. 조성물의 2번째 도입은, 본 방법을 최소 수행한 이후 소정의 경과 시점에, 예를 들어, 3개월 후, 4개월 후, 5개월 후, 6개월 후, 7개월 후, 8개월 후, 9개월 후, 10개월 후, 11개월 후, 1년 후 또는 1년 이상 등의 시점에 수행할 수 있다.

조성물은 임의의 적절한 약학적 조성물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 완충화된 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충화된 조성물은 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 소르비톨, 예컨대, 5% 소르비톨을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 염, 예를 들어, NaCl을 더 포함한다. 염의 농도는 임의의 적절한 농도, 예를 들어, NaCl 350 mM, 350 mM 초과, 350 mM 미만 등일 수 있다.

일부 구현예에서, 조성물 (예, sc-rAAV)은 제2 테라피와 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 제2 테라피는 OA 또는 RA 치료 또는 병태의 증상을 치료하기 위한 임의의 적절한 다른 테라피를 포함한다. OA의 제2 테라피에 대한 비-제한적인 예로는 글루코코르티코이드, 히알루로난 (점성 보충 요법), 혈소판-풍부 혈장, 및 재조합 인간 IL-1Ra (Anakinra; Kineret®) 등이 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, sc-rAAV는 글루코코르티코이드 또는 혈소판-풍부 혈장과 공동-투여된다.

다음과 같은 미국 특허들에 대한 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다: US2008/0187576, US2009/0104155, KR2012041139, JP2015518816, WO2013151672, WO2008088895, US8529885, US7037492, US20070128177, US6491907, US8999948, US20150218586, US7892824, US20130295614, JP2002538770, JP2010516252, KR2002027450, KR2003028080, US6482634, US20090105148, US20120232130, US20140234255, US5756283, US6083716, WO2002038782, WO2007039699, WO2012047093, WO2014170470, WO2015018860, WO2015044292, WO2015158749, US7452696, US6943153, US6429001, WO2015031392, WO2004092211.

실시예 1

실시예 1은 본 발명의 (IL-1Ra를 코딩하는) sc-rAAV의 투여를 기술한다. 본 발명은 실시예 1의 내용으로 한정되지 않는다. 본 발명의 sc-rAAV의 투여를 조사하는 임상 실험에 환자 5명이 등록한다. 환자는 다음과 같다: (1) 오른쪽 무릎에 골관절염을 앓고 있는 65세 남성; (2) 좌측 무릎에 골관절염을 앓고 있는 59세 남성; (3) 좌측 무릎에 골관절염을 앓고 있는 58세 여성; (4) 우측 무릎에 골관절염을 앓고 있는 51세 남성; 및 (5) 우측 무릎에 골관절염을 알고 있는 48세 남성. 각 환자에 무릎 당 바이러스 유전자 1 x 10¹²개로 sc-rAAV를 관절내 주사를 통해 투여한다. IL-1Ra가 연골 세포 및 활막 세포에서 발현된다. 1번 환자는 2주 이내에 OA-관련 증상들이 개선된다. 2번 환자는 1주 이내에 OA-관련 증상들이 개선된다. 3번 환자는 5주 이내에 OA-관련 증상들이 개선된다. 4번 환자는 1주 이내에 OA-관련 증상들이 개선된다. 6주째, 5번 환자는 OA-관련 증상의 개선을 나타내지 않는다.

실시예 2

실시예 2는 본 발명의 (IL-1Ra를 코딩하는) sc-rAAV의 1차 투여 및 소정의 기간 경과 후 본 발명의 동일한 sc-rAA의 2차 투여를 기술한다. 본 발명은 실시예 2의 내용으로 제한되지 않는다. 55세 남성은 우측 무릎에 골관절염을 앓고 있다. 주치의는 본 발명의 (IL-1Ra를 코딩하는) sc-rAAV 벡터를 관절내 1회 주사한다. 환자의 증상은 2주 이내에 없어진다. 6개월 후, 주치의는 본 발명의 (IL-1Ra를 코딩하는) 동일한 sc-rAAV 벡터를 2차 (1회) 관절내 주사를 수행한다. 환자의 증상은 2차 주사한 후 6개월 간 여전히 나타나지 않는다.

실시예 3

실시예 3은 본 발명의 (IL-1Ra를 코딩하는) sc-rAAV의 1차 투여 및 소정의 기간 경과 후 제1 sc-rAAV와는 다른 본 발명의 (IL-1Ra를 코딩하는) sc-rAA의 2차 투여를 기술한다. 본 발명은 실시예 3의 내용으로 제한되지 않는다. 49세 여성이 우측 발목에 골관절염을 앓고 있다. 주치의는 본 발명의 (IL-1Ra를 코딩하는) sc-rAAV 벡터를 관절내 1회 주사한다. 환자의 증상은 5개월 이내에 개선되지만, 없어지진 않는다. 6개월 후, 주치의는 본 발명의 (IL-1Ra를 코딩하는) 다른 2차 (1회) 관절내 주사를 수행한다. 환자의 증상은 2차 주사한 후 6개월 경과시 사라진다.

실시예 4

실시예 4는 본 발명의 (IL-1Ra를 코딩하는) sc-rAAV와 제2 테라피의 공동-투여를 기술한다. 본 발명은 실시예 4의 내용으로 한정되지 않는다. 68세 남성은 좌측 무릎에 골관절염을 앓고 있다. 주치의는 본 발명의 (IL-1Ra를 코딩하는) sc-rAAV와 혈소판-풍부 혈장의 1회 관절내 주사를 수행한다. 환자의 증상이 2개월 이내에 없어진다.

당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 기술된 내용과 더불어, 전술한 내용에 대한 본 발명의 다양한 변형들이 자명할 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 청구항 범위에 포함되는 것으로 의도된다. 본 출원에 인용된 각각의 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 구현예들이 제시 및 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 첨부된 청구항의 범위를 벗어나지 않는 한에서 본 발명에 대한 변형을 가할 수 있음을 쉽게 인지할 것이다. 청구항들에 언급된 참조 번호들은 예시적이며, 특허청에서 쉽게 검토할 수 있기 위한 목적일 뿐이며, 어떠한 방식으로도 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 출원에 제시된 도면들은 각도, 치수의 비율 등을 비롯하여 일정한 비례로 작성된다. 일부 구현예에서, 도면은 예에 불과하며, 청구항은 도면의 치수로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, "포함하는"이라는 표현을 이용해 본원에 기술된 본 발명의 내용은 "로 구성되는"으로 기술될 수 있는 구현예들을 포함하며, 이와 같이 "로 구성되는"이라는 표현을 사용해 본 발명의 하나 이상의 구현예를 청구하기 위한 기술 요건이 충족된다.

첨부된 청구항에 언급된 임의의 참조 번호들은 본 특허 출원에 대한 심사 용이성의 목적일 뿐, 예시적이며, 어떠한 방식으로도 청구항의 범위를 도면에 기재된 대응되는 참조 번호를 가진 구체적인 특징으로 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

SEQUENCE LISTING <110> CALIMMUNE, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CONDITIONS USING RECOMBINANT SELF-COMPLEMENTARY ADENO-ASSOCIATED VIRUS <130> CALIM 16.02 PCT <150> 62/377,297 <151> 2016-08-19 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5718 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Hu-IL-1Ra plasmid containing entire viral sequence with modified human IL1Ra insert and the SacII / NotI restriction sites. <400> 1 cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 60 tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 120 tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 180 gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 240 aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 300 ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 360 gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 420 ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 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gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt 2220 gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 2280 cgcatcagga attccaacat ccaataaatc atacaggcaa ggcaaagaat tagcaaaatt 2340 aagcaataaa gcctcagagc ataaagctaa atcggttgta ccaaaaacat tatgaccctg 2400 taatactttt gcgggagaag cctttatttc aacgcaagga taaaaatttt tagaaccctc 2460 atatatttta aatgcaatgc ctgagtaatg tgtaggtaaa gattcaaacg ggtgagaaag 2520 gccggagaca gtcaaatcac catcaatatg atattcaacc gttctagctg ataaattcat 2580 gccggagagg gtagctattt ttgagaggtc tctacaaagg ctatcaggtc attgcctgag 2640 agtctggagc aaacaagaga atcgatgaac ggtaatcgta aaactagcat gtcaatcata 2700 tgtaccccgg ttgataatca gaaaagcccc aaaaacagga agattgtata agcaaatatt 2760 taaattgtaa acgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca 2820 ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag 2880 atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc 2940 aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc 3000 taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc 3060 ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa 3120 gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc 3180 acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtact atggttgctt tgacgagcac 3240 gtataacgtg ctttcctcgt tagaatcaga gcgggagcta aacaggaggc cgattaaagg 3300 gattttagac aggaacggta cgccagaatc ctgagaagtg tttttataat cagtgaggcc 3360 accgagtaaa agagtctgtc catcacgcaa attaaccgtt gtcgcaatac ttctttgatt 3420 agtaataaca tcacttgcct gagtagaaga actcaaacta tcggccttgc tggtaatatc 3480 cagaacaata ttaccgccag ccattgcaac aggaaaaacg ctcatggaaa tacctacatt 3540 ttgacgctca atcgtctgga attccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg 3600 cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcgc gctcgctcgc tcactgaggc 3660 cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag tgagcgagcg 3720 agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tccttgtagt taatgattaa 3780 cccgccatgc tacttatcta cgtagccatg ctcgatctga attcggtacc cgttacataa 3840 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 3900 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 3960 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 4020 cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 4080 tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 4140 cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 4200 ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 4260 aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 4320 gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc 4380 tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccggactct agaggatccg 4440 gtactcgagg aactgaaaaa ccagaaagtt aactggtaag tttagtcttt ttgtctttta 4500 tttcaggtcc cggatccggt ggtggtgcaa atcaaagaac tgctcctcag tggatgttgc 4560 ctttacttct aggcctgtac ggaagtgtta cttctgctct aaaagctgcg gaattgtacc 4620 cgcgggccac catggaaatc tgcagaggcc tgcggagcca cctgattacc ctgctgctgt 4680 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Artificial Sequence <220> <223> Modified human IL-1Ra insert (98% identical to SEQ ID NO: 2; <400> 3 atggaaatct gcagaggact gcggagccac ctaattaccc tactcctttt cctgttccac 60 agcgagacaa tctgccggcc cagcggccgg aagtccagca agatgcaggc tttccggatc 120 tgggacgtga accagaaaac cttctacctc cggaacaacc agctggtggc gggatacctc 180 cagggcccca acgtgaacct agaagagaag atcgacgtgg tgcccatcga gccccacgcc 240 ctgtttctgg gcatccacgg cggcaagatg tgcctgagct gcgtgaagtc cggcgacgag 300 acaagactgc agctggaagc cgtgaacatc accgacctga gcgagaaccg gaagcaggac 360 aagagattcg ccttcatcag aagcgacagc ggccccacca ccagctttga gagcgccgcc 420 tgccccggct ggttcctgtg tacagccatg gaagccgacc agcccgtgtc cctgacaaac 480 atgcccgacg agggcgtgat ggtcaccaag ttctattttc aagaagatga gtaataa 537 <210> 4 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified human IL-1Ra insert (99% identical to SEQ ID NO: 2; <400> 4 atggagatct gcagaggcct gcggagccat ctgattaccc tactgctttt cctgttccat 60 agcgagacaa tctgccggcc cagcggccgg aagtccagca aaatgcaggc cttccggatc 120 tgggacgtga accagaaaac cttctacctg cggaacaacc agctggtggc cggatacctg 180 cagggcccca acgtgaacct ggaagagaag atcgacgtgg tgcccatcga gccccacgcc 240 ctgtttctgg gcatccacgg cggcaagatg tgcctgagct gcgtgaagtc cggcgacgag 300 acaagactgc agctggaagc cgtgaacatc accgacctga gcgagaaccg gaagcaggac 360 aagagattcg ccttcatcag aagcgacagc ggccccacca ccagctttga gagcgccgcc 420 tgccccggct ggttcctgtg tacagccatg gaagccgacc agcccgtgtc cctgacaaac 480 atgcccgacg agggcgtgat ggtcaccaag ttctattttc aagaagatga gtaataa 537 <210> 5 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified human IL-1Ra insert (95% identical to SEQ ID NO: 2; <400> 5 atggagatct gcagaggact gcggagccac ctaattaccc tactcctttt cctgttccat 60 agcgagacaa tctgccggcc cagcggccgg aagtccagca aaatgcaggc tttccggatc 120 tgggatgtga accagaagac cttctacctc cggaacaacc agctggtggc gggatacctc 180 cagggcccca acgtgaacct agaagagaag atcgacgtgg tgcccatcga gccccacgcc 240 ctgtttctgg gcatccatgg cggcaagatg tgtctgagtt gcgtgaagtc aggcgacgag 300 acaagactgc agctggaagc cgtgaacatc accgacctga gcgaaaaccg gaagcaggac 360 aagagattcg ccttcatcag aagcgacagc ggccccacca ctagctttga gagcgcagcc 420 tgccccggct ggttcctgtg tacagccatg gaggccgacc agcccgtgtc cctgacaaac 480 atgcctgacg aaggcgtgat ggtcaccaag ttctactttc aagaagatga ataataa 537 <210> 6 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Ile Cys Arg Gly Leu Arg Ser His Leu Ile Thr Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Leu Phe His Ser Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser 20 25 30 Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe 35 40 45 Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn 50 55 60 Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala 65 70 75 80 Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys 85 90 95 Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp 100 105 110 Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser 115 120 125 Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp 130 135 140 Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn 145 150 155 160 Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp 165 170 175 Glu <210> 7 <211> 1165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta/ IL-6 hybrid promoter <400> 7 atccaagagg gagaagaagc ccattggaga tgatgccata aaggaagtgg aagcgatatg 60 ataaaaatca tagtgcccat tcccaaataa tcccagaagc agaagggaaa ggagagaaat 120 atccacaaag acaggtgtgg gtacacacaa catttttcat actttaagat cccagaggac 180 tcatggaaat gatacaagaa aatgactcat aagaacaaat attaggaagc cagtgccaag 240 aatgagatgg gaaattgggg aaaatgttgg gggcagattg cttagttctg ttctaagcaa 300 gagggtgaac aaggaaggaa cagctcacta caaagaacag acatcactgc atgtacacac 360 aataatataa gaactaaccc atgattattt tgcttgtctt cttgttcaaa atgattgaag 420 accaatgaga tgagatcaac cttgataact ggctggcttc ggcatgatta gacacaagat 480 ggtatcaggg cacttgctgc tttgaataat gtcagtctcc tgtcttggaa gaatgacctg 540 acagggtaaa gaggaacttg cagctgagaa aggctttagt gactcaagag ctgaataatt 600 ccccaaaagc tggagcatcc tggcatttcc agctccccat ctctgcttgt tccacttcct 660 tggggctaca tcaccatcta catcatcatc actcttccac tccctccctt agtgccaact 720 atgtttatag cgagatattt tctgctcatt ggggatcgga aggaagtgct gtggcctgag 780 cggtctcctt gggaagacag gatctgatac atacgttgca caacctattt gacataagag 840 gtttcacttc ctgagatgga tgggatggta gcagatttgg gtccaggtta cagggccagg 900 atgagacatg gcagaactgt ggagactgtt acgtcagggg gcattgcccc atggctccaa 960 aatttccctc gagcctctgg ccccaccctc accctccaac aaagatttat caaatgtggg 1020 attttcccat gagtctcaat attagagtct caacccccaa taaatatagg actggagatg 1080 tctgaggctc attctgccct cgagcccacc gggaacgaaa gagaagctct atctcccctc 1140 caggagccca gctatgaact ccttc 1165

Claims (1)

1. 인터루킨-1 수용체 작용제 (IL-1Ra) 펩타이드를 치료학적 유효량으로 필요한 인간에게 제공하여 인간을 치료하는 방법으로서,
   재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스 (recombinant self-complementary adeno-associated virus, sc-rAAV)를 포함하는 조성물을 대상 위치 (location of interest)에 도입하는 단계를 포함하며,
   상기 sc-rAAV가,
   a. 조작된 AAV 캡시드; 및
   b. 상기 캡시드 안에 패키징된 벡터를 포함하며,
   상기 벡터가 프로모터에 작동가능하게 연결된 변형된 IL-1Ra 유전자를 포함하고, 상기 변형된 IL-1Ra 유전자는 서열번호 2와 95% 이상 동일하며;
   상기 sc-rAAV는 벡터를 대상 위치의 세포에 형질도입하며, 상기 변형된 IL-1Ra 유전자가 발현되어 상기 인간에게 치료학적 유효량의 상기 IL-1Ra 펩타이드를 제공하는, 방법.