ES2802878T3 - Un sistema de administración y expresión de terapia génica adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores - Google Patents

Abstract

Un sistema de administración y expresión de la terapia génica que comprende al menos un vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica el proteoglicano 4 (PRG4), o un fragmento biológicamente activo del mismo, que tiene actividad condroprotectora, repeticiones terminales invertidas adenovirales izquierda y derecha (L ITR y R ITR), secuencias señal de ensamblaje adenoviral y secuencias de ácido nucleico rellenas no codificantes y no virales, en las que la expresión PRG4 en el al menos un vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores se controla mediante un promotor constitutivo ubicuo.

Description

DESCRIPCIÓN

Un sistema de administración y expresión de terapia génica adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a sistemas de administración y expresión de terapia génica que comprenden al menos un vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica el proteoglicano 4 (PRG4) o un fragmento biológicamente activo del mismo. La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que contiene dicha secuencia de ácido nucleico que codifica el proteoglicano 4 (PRG4), o un homólogo del mismo de cualquier otra especie, o un fragmento biológicamente activo del mismo. La invención también se refiere al uso del nuevo sistema de administración y expresión de terapia génica de acuerdo con la invención para su uso en la prevención y / o el tratamiento del síndrome de camptodactilia - artropatía - coxa vara - pericarditis (CACP), o un trastorno musculoesquelético tal como un trastorno articular o una enfermedad articular.

Descripción de la técnica anterior

Las afecciones musculoesqueléticas son las afecciones crónicas más comunes, afectando a casi un tercio de la población humana. Las afecciones musculoesqueléticas se definen como afecciones que implican a los huesos, músculos y sus uniones, tales como las articulaciones, los tendones y los ligamentos. Consisten en una variedad de enfermedades diferentes que causan dolor o molestias en los huesos, articulaciones, tendones, ligamentos, músculos o estructuras circundantes. Los trastornos musculoesqueléticos varían desde dolor de espalda hasta artritis reumatoide y gota, e incluyen diferentes tipos de artritis, tendinitis y dolor musculoesquelético. Además, las enfermedades o trastornos musculoesqueléticos incluyen, entre otros, artropatías, todo tipo de artritis, incluidos los trastornos relacionados con la artritis, osteoartritis, artritis reumatoide, gota y seudogota, artritis séptica, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Still, síndrome de Reiter o tendinopatías que incluyen tendinitis, tendinosis, tenosinovitis; trastornos sinoviales que incluyen la sinovitis; bolsas sinoviales incluyendo bursitis; trastornos musculoesqueléticos équidos, incluyendo esparaván óseo, síndrome de navicular, y callos.

Además, existen trastornos hereditarios como el síndrome CAPC (el síndrome de camptodactilia - artropatía - coxa vara - pericarditis) que tienen su origen en un gen PRG4 no funcional. El trastorno produce hiperplasia sinoviocitaria y osteoartritis de inicio temprano, las principales características patológicas del síndrome CAPC.

La osteoartritis (OA) es una enfermedad degenerativa de las articulaciones relacionada con la edad o postraumática que se caracteriza por la pérdida de cartílago articular, la proliferación de condrocitos y la diferenciación hipertrófica, la remodelación ósea subcondral, inflamaciones y, finalmente, la formación de osteofitos (K. Johnson et al., A Stem Cell-Based Approach to Cartilage Repair. Science (Nueva York, NY) 336, 717 (10 de junio de 2012). Se encuentra entre las principales causas de discapacidad crónica (Matthews, G.L. y Hunter, D.J. (2011). Emerging drugs for osteoarthritis. Expert Opin. Emerging Drugs 1-13.). Sorprendentemente, dado que el impacto de la OA, se han desarrollado relativamente pocos modelos genéticos de ratones para proporcionar información sobre los posibles mecanismos de protección que pueden modificar el desarrollo de la osteoartritis. Hasta la fecha, la mayoría han sido modelos genéticos de pérdida de función de enzimas degradantes del cartílago como ADAMTS5 y MMP13 (F. Echtermeyer et al., Syndecan-4 regulates ADAMTS-5 activation and cartilage breakdown in osteoarthritis. Nature Medicine, 1 (30 de marzo de 2102); T. Saito et al., Transcriptional regulation of endochondral ossification by HIF-2a during skeletal growth and osteoarthritis development. Nature Medicine 16, 678 (23 de junio de 2010); R. M. Borzí et al., Matrix metalloproteinase 13 loss associated with impaired extracellular matrix remodeling disrupts chondrocyte differentiation by concerted effects on multiple regulatory factors. Arthritis & Rheumatism 62, 2370 (May 13, 2010); J. D. Kay et al., Intra-articular gene delivery and expression of interleukin-1Ra mediated by selfcomplementary adeno-associated virus. The journal of gene medicine 11, 605 (julio de 2009)). Los ratones con mutación de pérdida de la función en Hif2a también están protegidos del desarrollo de la osteoartritis, lo que destaca la importancia de la vía de la hipoxia en la homeostasis del cartílago. Desafortunadamente, a pesar de una inversión significativa, el desarrollo de inhibidores de tales vías no ha demostrado ser efectivo en el entorno clínico.

Curiosamente, las mutaciones de pérdida de función en el proteoglicano 4 (PRG4) en seres humanos causan el síndrome de camptodactilia - artropatía - coxa vara - pericarditis (J. Marcelino et al., CACP, encoding a secreted proteoglycan, is mutated in camptodactyly-arthropathy-coxa vara-pericarditis syndrome. Nature genetics 23, 319 (noviembre de 1999), que se caracteriza por la osteoartritis de inicio temprano. Además, la eliminación genética de PRG4 en ratones también da como resultado el desarrollo temprano de la osteoartritis (D. K. Rhee et al., The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J Clin Invest 115, 622 (marzo de 2005); J. M. Coles et al., Loss of cartilage structure, stiffness, and frictional properties in mice lacking PRG4. Arthritis & Rheumatism 62, 1666 (01 de julio de 2010).

PRG4 también se conoce como lubricina o proteína de zona superficial o precursor del factor estimulante de megacariocitos. Es un componente de la matriz extracelular del cartílago y del líquido sinovial (D. K. Rhee et al., The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J Clin Invest 115, 622 (marzo de 2005)). PRG4 está presente en el líquido sinovial y en la superficie (capa superficial) del cartílago articular y, por lo tanto, juega un papel importante en la lubricación articular y la homeostasis sinovial. A diferencia de los objetivos anteriores de la osteoartritis, es una proteína secretada producida por los condrocitos de la zona superficial del cartílago articular y por las células del revestimiento sinovial en los mamíferos (D. K. Rhee et al., The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J Clin Invest 115, 622 (marzo de 2005)). El gen PRG4 codifica la glucoproteína de aproximadamente 345 kDa. PRG4 proporciona líquido sinovial con la capacidad de disipar la energía de la tensión bajo carga y se ha publicado que su proteína recombinante ejerce efectos condroprotectores durante la progresión de la OA en ratas (GD Jay, JR Torres, ML Warman, MC Laderer, KS Breuer, The role of lubricin in the mechanical behavior of synovial fluid. Proc Natl Acad Sci USA 104, 6194 (10 de abril de 2007); C. R. Flannery et al., Prevention of cartilage degeneration in a rat model of osteoarthritis by intraarticular treatment with recombinant lubricin. Arthritis & Rheumatism 60, 840 (abril de 2009)).

Sin embargo, los efectos biológicos a largo plazo de la sobreexpresión de PRG4 y el mecanismo molecular de sus posibles beneficios terapéuticos todavía no se conocen bien.

El documento US 6.743.774 A describe un enfoque de terapia génica que administra a un mamífero un ácido nucleico que codifica un polipéptido lubricante terapéutico, tal como un fragmento lubricante del precursor del factor estimulante de megacariocitos por vectores estándar y / o sistemas de administración génica. Los sistemas de administración de genes descritos incluyen liposomas, sistemas de administración mediados por receptor, ADN desnudo, vectores virales tales como el virus herpes, retro virus, adenovirus y virus asociados a adeno. El documento US 7.893.029 A describe polinucleótidos para uso en terapia génica que codifica lubricina recombinante.

Aunque algunos enfoques sugieren la terapia génica para tratar o prevenir trastornos de las articulaciones, como la osteoartritis, actualmente no hay tratamientos curativos disponibles. El tratamiento médico está dirigido principalmente a aliviar los síntomas usando analgésicos en lugar de establecer el cartílago desgastado. Un tratamiento analgésico generalmente involucra esteroides y medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), que han demostrado cierta eficacia en el tratamiento de la osteoartritis durante algunas décadas. Sin embargo, si bien estos medicamentos pueden suprimir la inflamación de las articulaciones, se sabe que muchos de ellos tienen efectos deteriorantes en el cartílago, lo que empeora aún más el proceso subyacente del desarrollo de la osteoartritis. El ácido hialurónico, que restaura la viscoelasticidad y la lubricación de las articulaciones, también se ha utilizado ampliamente. Además, los glucosaminoglucanos polisulfatos inyectados en la articulación o por vía intramuscular, así como la glucosamina y el sulfato de condroitina administrados por vía oral se han utilizado en el tratamiento de la osteoartritis, sin embargo, la eficacia no se ha demostrado en grandes ensayos aleatorios. Por lo tanto, las terapias utilizadas actualmente tienen una eficacia limitada en el tratamiento de trastornos de las articulaciones, como la osteoartritis, y su éxito a menudo depende de la gravedad del caso. Además, estos medicamentos deben administrarse con frecuencia; a veces en combinación entre sí. Sin embargo, las inyecciones frecuentes de fármacos en la articulación son complicadas, conllevan el riesgo de contraer infecciones, causan estrés al paciente y son caras. De ello se deduce que existe una necesidad médica clara pero aún no satisfecha de desarrollar tratamientos más eficaces y estables, y que, al mismo tiempo, también sean rentables a largo plazo.

Se ha discutido el papel de PRG4 en los trastornos articulares. Además, durante la osteoartritis, la interleucina-1 (Il-1) funciona como mediador central de la inflamación (Daheshia, M. y YAO, J.Q. (2008). The Interleukin 1p Pathway in the Pathogenesis of Osteoarthritis. J Rheumatol 35, 2306.). Además, la Il-1 inhibe fuertemente la síntesis de la matriz del cartílago y puede desencadenar la descomposición de la matriz (Evans, C.H., Gouze, J.N., Gouze, E., Robbins, P.D. y Ghivizzani, S.C. (2004)). Osteoarthritis gene therapy. Gene Ther 11, 379-389). Para neutralizar el efecto de la II-1 sobre la inflamación sinovial, el tratamiento con antagonistas del receptor de interleucina-1 (Il-1 Ra) constituye un concepto prometedor en la terapia de la osteoartritis (Evans, CH, Gouze, JN, Gouze, E., Robbins, PD, y Ghivizzani, SC (2004). Osteoarthritis gene therapy. Gene Ther 11, 379-389.; Caron JP et al. Chondroprotective effect of intraarticular injections of interleukin-1 receptor antagonist in experimental osteoarthritis. Suppression of collagenase-1 expression. Arthritis Rheum 1996; 39: 1535-1544)). A nivel del ácido nucleico, II-1 Ra se conserva bastante entre las especies de mamíferos. Por ejemplo, las secuencias de ADNc de Il-1 Ra humana (número de entrada: NM_173842) comparten un 82% de homología con la variante murina (número de entrada: NM_031167), 84% con la variante equina (número de entrada: NM_001082525), 84% con la variante canina (número de entrada: NM_001003096), 84% con la variante lapina (número de entrada: NM_001082770) y 82% con la variante bovina (número de entrada: NM_174357).

El documento US 2004/072741 A1 describe un polipéptido lubricante de PRG4, que se usa en vectores estándar o sistemas de administración de genes. Se sugiere un tratamiento de la osteoartritis utilizando el fragmento lubricante de PRG4. Sin embargo, la lubricación se basa principalmente en un modo de acción físico y no farmacológico y, por lo tanto, se relaciona con una protección física mediada por lubricación y un tratamiento sintomático y no con una modificación farmacológica de la enfermedad.

El documento WO 02/082908 A1 describe vectores lentivirales como un sistema ventajoso de administración de genes para el tratamiento o la prevención de la artritis. Para lograr la expresión génica a largo plazo, se requiere una integración genómica en las células articulares diana. Sin embargo, la interacción genómica se asocia con el riesgo de mutagénesis insercional y eventos adversos retardados, como el cáncer. Este grave riesgo de seguridad es particularmente crítico si el sistema de administración de genes se va a utilizar en una gran población de pacientes que padecen una enfermedad que no pone en peligro la vida, como los trastornos articulares, incluida la osteoartritis.

Aunque se conocen enfoques de terapia génica que utilizan varios vectores de terapia génica, existe la necesidad de un sistema de administración y expresión de terapia génica que permita la administración específica de una cantidad terapéutica de un agente activo a su diana. Además, el agente activo exhibirá sus efectos terapéuticos durante un período de tiempo prolongado. Los virus adenoasociados (AAV) se encuentran entre los vectores de terapia génica más utilizados y han demostrado una transducción eficiente y una expresión transgénica a largo plazo en muchos tejidos. Los AAV también se han utilizado en enfoques de terapia génica para articulaciones. Sin embargo, la eficiencia de transducción de AAV en las articulaciones nunca se ha comparado directamente con la eficiencia de la transducción de otros vectores de terapia génica viral como los adenovirus, incluidos los vectores adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores.

Los adenovirus dependientes de linfocitos T colaboradores (HDAd), también conocidos como adenovirus dependientes de linfocitos T coadyuvantes o de alta capacidad, son la última generación de vectores adenovirales (Mitani, K., Graham, FL, Caskey, C^t & Kochanek, S. Rescue, propagation, and partial purification of a helper virusdependent adenovirus vector. Proc Natl Acad Sci USA 92, 3854-3858 (1995); Parks, R.J. et al. A Helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci USA 93, 13565-13570 (1996); Parks, R.J. Improvements in adenoviral vector technology: overcoming barriers for gene therapy. Clin. Genet. 58, 1-11 (2000)). Estos vectores carecen de todas las secuencias virales y pueden mediar la expresión génica a largo plazo en diversos tejidos (por ejemplo, 7 años en el hígado) en contraste con los adenovirus de primera generación más inmunogénicos (Brunetti-Pierri, N., Ng, T., lannitti, D., Cioffi, W., Stapleton, G., Law, M., Breinholt, J., Palmer, D., Grove, N., Rice, K., et al. ( 2013). Transgene Expression up to 7 Years in Nonhuman Primates Following Hepatic Transduction with Helper-Dependent Adenoviral Vectors. Hum Gene Ther 24, 761-765.).

Sumario de la Invención

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un sistema mejorado de administración y expresión que permita la expresión a largo plazo de proteoglicano 4 biológicamente activo (PRG4) para su uso en la prevención y / o el tratamiento de trastornos dependientes de PRG4 tales como el síndrome camptodactilia -artropatía-coxa vara-pericarditis (CACP) y trastornos en los que la sobreexpresión de PRG4 es beneficiosa, como los trastornos musculoesqueléticos, en particular los trastornos articulares. La solución para el problema es proporcionada por un sistema de administración y expresión de terapia génica que comprende las características técnicas según la reivindicación 1. Las realizaciones preferidas de la invención son objeto de las reivindicaciones dependientes. El sistema de administración y expresión de terapia génica de acuerdo con la presente invención comprende al menos un vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica el proteoglicano 4 (PRG4), o un fragmento biológicamente activo del mismo, que tiene repeticiones terminales invertidas adenovirales izquierda y derecha con actividad condoprotectora (L ITR y R ITR), secuencias de señal de empaquetamiento adenoviral y secuencias de ácido nucleico de relleno no virales y no codificantes. Cualquier repetición terminal invertida adenoviral izquierda o derecha conocida (L ITR y R ITR), secuencias de señal de empaquetamiento adenoviral y secuencias de ácido nucleico de relleno no virales y no codificantes pueden usarse para la producción del vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores (Parks, RJ , Chen, L, Anton, M., Sankar, U., Rudnicki, MA y Graham, FL (1996). A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci USA 93, 13565-13570; Palmer, D. y Ng, P. (2003). Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther 8, 846-852).

Los resultados y los datos mostrados en este documento se basan en construcciones adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores (HDAd) que usan en una primera realización secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos que codifican proteoglicano 4 (PRG4).

Para la expresión a largo plazo de PRG4 en el tejido afectado, por ejemplo en articulaciones o tejidos osteoartríticos, el al menos vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores de la invención se controla mediante un promotor constitutivo ubicuo. Los promotores adecuados incluyen, entre otros, un promotor alfa del factor de alargamiento 1 (EF1 alfa), promotor de citomegalovirus (CMV), promotor de beta-actina, promotor temprano del virus simio 40 (SV40), promotor de ubiquitina c, promotor de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK) y otros promotores constitutivos ubicuos adecuados para HDAd.

En una realización preferida, el vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que comprende el proteoglicano 4 (PRG4) comprende una secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO 1 (HDAd humana) o la SEQ ID NO 2 (HDAd murino). Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de ADNc del gen PRG4 o un fragmento del mismo. El HDAd de la invención puede variar en sus elementos no codificantes, así como en la longitud de su inserto de codificación. Por lo tanto, también se pueden utilizar tamaños de vector más pequeños o mayores del vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores de la invención para el propósito de la presente invención con el fin de lograr los efectos biológicos deseados.

En una realización preferida, el vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de homología de secuencia con una secuencia del vector que comprende una secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, o un fragmento biológicamente eficaz del mismo, en donde el vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores tiene actividad condroprotectora.

Una homología de secuencia de al menos 50% con una secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 2 puede ser suficiente para generar una expresión a largo plazo de PRG4 en los sitios diana mientras la proteína PRG4 expresada sea biológicamente activa.

En una realización, el vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el proteoglicano 4 (PRG4). Se prefiere la expresión de PRG4 humano o mamífero. La secuencia de ácido nucleico insertada en el HDAd puede ser cualquiera, que muestra una identidad de secuencia u homología de secuencia con una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4. Con fines de aclaración, puede ser suficiente que solo una parte de la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4, o una versión extendida sea suficiente para la generación del vector y su actividad biológica. La actividad biológica se puede medir investigando la condroprotección.

Además, la presente invención también comprende mutantes, variantes y homólogos que contienen reemplazos de ácido nucleico dentro de la secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico del proteoglicano 4 (PRG4) y que tiene actividad condroprotectora. En particular, la invención comprende un homólogo de PRG4 de cualquier otra especie animal que tenga homología de secuencia con una secuencia establecida en SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 4 y que tenga actividad condroprotectora. Por ejemplo, un homólogo que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica el proteoglicano 4 (PRG4) comprende preferiblemente una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos una homología de secuencia del 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con un conjunto de secuencias de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO 3, o SEQ ID NO 4, o un fragmento biológicamente eficaz del mismo.

El proteoglicano 4 (PRG4) que tiene actividad condroprotectora, usado en la construcción del vector de la presente invención, también puede describirse por su secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, el proteoglicano 4 (PRG4) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO 5 o SEQ ID NO 6, o un fragmento biológicamente activo del mismo, o un homólogo del mismo de cualquier otra especie. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos que codifica el proteoglicano 4 (PRG4) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una homología de secuencia del 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO 5, o SEQ ID NO 6, o un fragmento biológicamente activo del mismo, o un homólogo del mismo de cualquier otra especie.

Los inventores muestran en este documento que un vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que contiene la secuencia de ADNc de proteoglicano 4 murino o humano (PRG4) bajo el control de un promotor constitutivo ubicuo da como resultado una sobreexpresión de PRG4 en las articulaciones, lo que da como resultado la protección de los ratones contra la osteoartritis. Dado que la sobreexpresión de PRG4 puede ser beneficiosa en muchas otras enfermedades, el vector dependiente de linfocitos T colaboradores de la invención puede usarse para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y / o la prevención de una variedad de enfermedades musculoesqueléticas y enfermedades dependientes de PRG4. En particular, los trastornos musculoesqueléticos, que se benefician de la sobreexpresión de PRG4, se caracterizarían como aquellos trastornos en los que las altas concentraciones de PRG4 confieren un efecto terapéutico o preventivo. Las enfermedades o trastornos dependientes de PRG4 se caracterizarían porque la expresión de PRG4 natural es limitada o inhibida, o porque los niveles de proteína o ARN de PRG4 intracelular o extracelular se reducen significativamente.

Los inventores compararon la eficiencia de la transducción articular de los vectores adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores con diferentes serotipos de AAV que otros habían publicado que eran útiles en los enfoques de terapia génica conjunta. Sorprendentemente, los inventores descubrieron que los vectores adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores mostraban una transducción superior en comparación con todos los serotipos de AAV probados, lo que dio como resultado la transducción de sinoviocitos y condrocitos. Los inventores mostraron además que los vectores adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores permitían una expresión transgénica que persistía durante un período prolongado, por lo que la necesidad de administraciones repetidas del medicamento a un objeto que padece una enfermedad en la que la sobreexpresión de PRG4 puede ser beneficiosa se reduciría en gran medida. En un modelo de osteoartritis en ratones, los inventores demostraron que el tratamiento de las articulaciones osteoartríticas con HDAd-PRG4 da como resultado puntuaciones histológicas de osteoartritis más bajas, lo que indica que PRG4 exhibe su efecto biológico al proteger al sujeto de la osteoartritis postraumática. La protección contra la osteoartritis con HDAd-PRG4 se demostró utilizando dos esquemas diferentes. En el primer esquema, los ratones fueron inyectados con HDAd-PRG4 antes de que se indujera la osteoartritis. Los resultados de este experimento muestran que HDAd-PRG4 puede usarse en la prevención de la osteoartritis. En el segundo esquema, se indujo osteoartritis antes de inyectar HDAd-PRG4. Los resultados de este experimento demuestran que HDAd-PRG4 puede usarse en el tratamiento de la osteoartritis (preexistente). En apoyo de los efectos biológicos de PRG4 en las articulaciones, los experimentos con ratones transgénicos Prg4 revelaron una protección de los sujetos contra el desarrollo de la osteoartritis sin otros fenotipos óseos.

Por lo tanto, la sobreexpresión de PRG4 bajo el control de un promotor constitutivo ubicuo adecuado en un HDAd permite la prevención y / o el tratamiento de una variedad de enfermedades musculoesqueléticas como las artropatías, todos los tipos de artritis, incluidos los trastornos relacionados con la artritis, la osteoartritis, la artritis reumatoide, gota y seudogota, artritis séptica, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Still, síndrome de Reiter o tendinopatías que incluyen tendinitis, tendinosis, tenosinovitis; trastornos sinoviales que incluyen sinovitis; trastornos de la bolsa incluyendo bursitis; trastornos musculoesqueléticos équidos, incluyendo esparaván óseo, síndrome de navicular, y callos.

Sorprendentemente, los inventores descubrieron además que una expresión combinada de PRG4 inducida por HDAd-PRG4 e inhibidores de mediadores destructivos inflamatorios y de cartílago produce efectos terapéuticos y protectores beneficiosos. En particular, una combinación de la expresión de PRG4 y expresión del antagonista del receptor de interleucina-1 (Il-1 Ra) dio como resultado una mayor eficacia en el tratamiento y / o la prevención de trastornos musculoesqueléticos.

Por lo tanto, en una realización preferida, el vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica inhibidores de mediadores destructivos inflamatorios y de cartílago tales como citocinas que incluyen Il-1, TNFa, II-6, II-7, II-8, Il-11, Il-15, Il-17, Il-18, 11-21, factor inhibidor de leucemia (LIF), oncostatina M; metaloproteasas de matriz que incluyen MMP-1,3,9,13; agrecanasas que incluyen ADAMTS-1, 4,5; receptores tipo toll (TLR) como TLR2, TLR4; y el factor nuclear 'potenciador de la cadena ligera kappa' de células B activadas (NF-^k B).

En una realización preferida, el inhibidor del mediador destructivo inflamatorio y del cartílago es el antagonista del receptor de interleucina-1 (Il-1 Ra). Una combinación de la sobreexpresión de PRG4 y Il-1 Ra es beneficiosa para el tratamiento y / o la prevención de las enfermedades mencionadas en este documento. En una primera realización, la secuencia de ADNc del antagonista del receptor de interleucina-1 puede estar contenida en el mismo vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que contiene la secuencia de ADNc que codifica el proteoglucano 4 (PRG4). En una realización más, la secuencia de ADNc del antagonista del receptor de interleucina-1 puede estar contenida en un segundo vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores, que solo contenga la secuencia de ADNc que codifica Il-1 Ra. El sistema de administración y expresión de la invención, por lo tanto, puede comprender un segundo o más vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique inhibidores de mediadores destructivos inflamatorios y del cartílago tales como el antagonista del receptor de interleucina-1 (Il-1 Ra).

En una realización preferida, el ADNc del inhibidor del mediador destructivo inflamatorio y del cartílago (p. Ej. Il1 -Ra cDNA) insertado en HDAd es controlado por un promotor inducible por inflamación. Los promotores preferidos incluyen, entre otros, promotores seleccionados del grupo que consiste en el promotor NF-^k B, promotor de interleucina 6 (II-6), promotor de interleucina-1 (Il-1), promotor del factor de necrosis tumoral (TNF), promotor de la ciclooxigenasa 2 (COX-2), promotor del factor del complemento 3 (C3), promotor amiloide A3 del suero (SAA3), promotor de la proteína inflamatoria de macrófagos-1a (MIP-1 a) o los constructos híbridos de lo anterior. Se prefiere el uso del promotor NF-^{k B} en HDAd con el propósito de una expresión dependiente de la inflamación de Il-1 Ra en los sitios diana.

En una realización preferida, el vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que contiene el antagonista del receptor de interleucina-1 (Il-1 Ra) comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de homología de secuencia con una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 7 (Il-1 Ra humana), o SEQ ID NO 8 (murina Il-1 Ra), SEQ ID NO 9 (equina Il-1 Ra), o un fragmento biológicamente eficaz de la misma.

En una realización más, la secuencia de ácido nucleico que codifica el antagonista del receptor de interleucina-1 (Il-1 Ra) comprende una secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID N° 10 (ll-1 Ra humana), o SEQ ID N° 11 (Il-1 Ra murina), o la SEQ ID N° 12 (Il-1 Ra equina), o un fragmento biológicamente activo de la misma, o un homólogo de la misma de cualquier otra especie.

En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos que codifica el antagonista del receptor de interleucina-1 (Il-1 Ra) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID N° 13 (Ra Il-1 humana), o la SEQ ID N° 14 (Il-1 Ra murina), o SEQ ID N° 15 (Il-1 Ra equina), o un fragmento biológicamente activo de la misma, o un homólogo de la misma de cualquier otra especie.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica el proteoglicano 4 (PRG4), o un fragmento biológicamente activo del mismo. Las realizaciones preferidas de la composición farmacéutica comprenden vectores adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores o una combinación de diferentes vectores adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores que comprenden las características que se describieron anteriormente con más detalle. El sistema de administración y expresión de terapia génica según la presente invención es adecuado para la preparación de un medicamento para su uso en la prevención y / o el tratamiento de una variedad de enfermedades dependientes de PRG4. En una primera realización, el sistema de administración y expresión de terapia génica se usa en el tratamiento y / o la prevención del síndrome de camptodactilia - artropatía - coxa vara - pericarditis (CACP). Los vectores adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores de la invención pueden usarse además en la prevención y / o el tratamiento de un trastorno musculoesquelético, en particular la prevención y / o el tratamiento de un trastorno o enfermedad articular. Ejemplos de tales enfermedades son las artropatías, todos los tipos de artritis, incluidos los trastornos relacionados con la artritis, osteoartritis, artritis reumatoide, gota y seudogota, artritis séptica, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Still, síndrome de Reiter o tendinopatías, incluyendo tendinitis, tendinosis, tenosinovitis; trastornos sinoviales que incluyen sinovitis; trastornos de la bolsa incluyendo bursitis; trastornos musculoesqueléticos équidos, incluyendo esparaván óseo, síndrome de navicular, y callos.

Los siguientes ejemplos muestran los usos terapéuticos beneficiosos del sistema de administración y expresión de terapia génica de acuerdo con la presente invención. En particular, se demostrará que la expresión intraarticular del proteoglicano 4 (PRG4) en ratones protege contra el desarrollo de la osteoartritis (OA). Los datos están respaldados por la expresión de PRG4 a largo plazo bajo el promotor de colágeno tipo II (Col2a1) en ratones transgénicos. En consecuencia, la expresión a largo plazo de PRG4 no afecta negativamente el desarrollo esquelético, pero protege contra el desarrollo de signos de osteoartritis relacionada con la edad.

El efecto protector también se muestra en un modelo de osteoartritis postraumática creada por transección de ligamento cruzado (CLT). Además, la inyección intraarticular del virus adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores (HDAd) que expresa PRG4 protege contra el desarrollo de osteoartritis postraumática cuando se administra antes o después de la lesión. Los perfiles de expresión génica del cartílago articular de ratón y los estudios de células in vitro muestran que la expresión de PRG4 inhibe los programas transcripcionales que promueven el catabolismo e hipertrofia del cartílago a través de la regulación positiva del factor 3 alfa inducible por hipoxia. Los análisis de los conjuntos de datos de osteoartritis humana disponibles son consistentes con las predicciones de este modelo. Por lo tanto, los datos proporcionan información sobre los mecanismos para el desarrollo de la osteoartritis y ofrecen un enfoque condroprotector potencial para su tratamiento.

Además, la inyección de vectores adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores que expresan PRG4 (HDAd-PRG4) y Il-1Ra (HDAd-ll1-Ra) en combinación en las articulaciones de ratones sin modificar después de la transección de ligamentos cruzados exhibió efectos protectores contra la osteoartritis. La coinyección de HDAd-PRG4 y HDAd-Il-1Ra a la misma dosis da como resultado un mayor grado de conservación del cartílago en comparación con las inyecciones de un solo vector.

Como tal, PRG4 en una sola aplicación o en combinación con Il-1 Ra es una diana novedosa en la condroprotección usando los vectores adenovirales dependientes de la invención.

Ejemplos

Resultados

PRG4 previene el desarrollo de cambios de osteoartritis relacionados con la edad

Para investigar el efecto a largo plazo de la sobreexpresión de Prg4, los inventores generaron ratones transgénicos que expresaban Prg4 bajo el promotor de colágeno tipo II específico de cartílago (Col2a1) (Fig. 5A). Los ratones transgénicos PRG4 expresaban Prg4 ectópicamente en el cartílago de la placa de crecimiento y sobrexpresaban Prg4 en el cartílago articular durante todo el desarrollo y la edad adulta (Fig. 5B-D). Macroscópicamente, los inventores no detectaron diferencias en el crecimiento o el desarrollo esquelético en ratones transgénicos Prg4 cuando se evaluaban con respecto al peso (Fig. 5E). Microscópicamente, los marcadores de proliferación o apoptosis de condrocitos se mantuvieron iguales en ratones Prg4 frente a ratones sin modificar según se evaluaba mediante tinción con BrdU (p = n.s. en la zona de proliferación y en reposo de los condrocitos P1) (Fig. 5F) y tinción de TUNEL (sin señales positivas en condrocitos P1) (Fig. 5G), respectivamente. Estos datos sugirieron que la sobreexpresión ectópica de Prg4 en el cartílago no afectaba significativamente a los condrocitos ni a la homeostasis esquelética.

Los inventores buscaron determinar si la sobreexpresión de Prg4, en particular en condrocitos, protegía a los ratones de padecer cambios osteoartríticos relacionados con la edad. Se han realizado relativamente pocos estudios para evaluar el desarrollo de la osteoartritis relacionada con la edad en modelos animales (M. Silbermann, E. Livne, Age-related degenerative changes in the mouse mandibular joint. Journal of Anatomy 129, 507 (octubre de 1979). Además, se ha demostrado que ninguna ganancia del modelo de función es protectora contra la osteoartritis relacionada con la edad. En una cohorte de envejecimiento, según lo evaluado por la escala de clasificación histológica de la Osteoarthritis Research Society International (OARSI) (S. S. Glasson, M. G. Chambers, W. B. van den Berg, C. B. Little, The

OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and cartilage/OARSI, Osteoarthritis Research Society 18, S17 (01 de octubre de 2010), los inventores observaron que los ratones FVB / N sin modificar desarrollaban cambios consistentes con osteoartritis moderada a los 10 meses de edad, con un grado medio de OARSI de 3,5. Sin embargo, los ratones transgénicos PRG4 a la misma edad exhibieron un grado medio de OARSI de 2 (p <0,05), lo que sugirió signos menos graves de osteoartritis (Fig. 1A). A continuación, los inventores evaluaron las diferencias moleculares, en particular en condrocitos, entre los ratones PRG4 y los sin modificar. Como el colágeno tipo X (Col10a1) y la metaloproteinasa de matriz 13 (Mmp13) son marcadores de hipertrofia y degradación del cartílago, respectivamente, el aumento de la expresión de Mmp13 y Col10a1 por encima de las marcas de tendencia son características de la osteoartritis (T. Saito et al., Transcriptional regulation of endocondral ossification by HIF-2a during skeletal growth and osteoarthritis development. Nature Medicine 16, 678 (23 de junio de 2010). Los inventores detectaron, de forma alentadora, una mayor expresión de Col10a1 y Mmp13 en ratones sin modificar con envejecimiento, mientras que los ratones transgénicos Prg4 no mostraron ningún aumento cualitativo en ninguno de los marcadores en la región no calcificada del cartílago articular (Fig. 1 b). Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de Prg4 tenía un efecto protector contra la osteoartritis en los niveles molecular e histológico.

Una desventaja de los puntos finales histológicos convencionales es la falta de cuantificación tridimensional, así como el sesgo de verificación basado en la elección de las secciones. Por lo tanto, los inventores aplicaron un enfoque para cuantificar las propiedades del cartílago (p. ej., el volumen, área de superficie, área ósea cubierta por cartílago) basado en reconstrucciones tridimensionales de datos de imágenes de gTC de contraste de fase (M. Ruan et al., Quantitative imaging of murine osteoarthritic cartilage by phase contrast micro-computed tomography. Arthritis Rheum, (2012)). Usando esta técnica de imagen, los inventores descubrieron que los ratones sin modificar mostraban una disminución en el volumen del cartílago articular, así como en el área ósea cubierta por el cartílago (Fig. 1C,D). Por el contrario, los ratones transgénicos Prg4 mostraron la preservación de los volúmenes de cartílago articular y el área de superficie (p <0,01) (Fig. 1C,D). Por lo tanto, en comparación con los ratones sin modificar después de la transección, los ratones transgénicos Prg4 no tenían ninguna de las propiedades histológicas, moleculares y de imagen características de la osteoartritis. Estos datos sugirieron que la sobreexpresión de PRG4 puede tener efectos protectores en el contexto de los cambios de tipo osteoartrítico relacionados con la edad.

PRG4 previene el desarrollo de la osteoartritis postraumática

Para probar si la sobreexpresión de PRG4 protegía a los ratones del desarrollo de una osteoartritis postraumática más agresiva, los inventores aplicaron el modelo de transección del ligamento cruzado de rodilla desarrollado recientemente en el laboratorio de los inventores, tanto a ratones transgénicos sin modificar como a Prg4 (M. Ruan et al., Quantitative imaging of murine osteoarthritic cartilage by phase contrast micro-computed tomography. Arthritis Rheum, (2012). Los inventores eligieron este enfoque porque las roturas del ligamento cruzado anterior son una causa común de la artritis postraumática en humanos. Según lo evaluado por la escala de clasificación histológica OARSI, los ratones sin modificar desarrollaron osteoartritis moderada y grave uno y dos meses después de la transección, respectivamente (Fig. 2A) (M. Ruan et al., Quantitative imaging of murine osteoarthritic cartilage by phase contrast micro-computed tomography. Arthritis Rheum, (2012). Los ratones transgénicos Prg4 mostraron un puntaje OARSI de menor grado en comparación con los ratones sin modificar uno y dos meses después de la transección (Fig. 2A). Curiosamente, un mes después de la transección, el grado de cartílago OARSI de ratones transgénicos Prg4 no fue significativamente diferente de los ratones sin modificar después de una cirugía simulada (Fig. 2A), apoyando además que la expresión de PRG4 tenía un efecto protector contra la osteoartritis. Además, los inventores detectaron una mayor expresión de Col10a1 y Mmp13 en el cartílago articular no calcificado de ratones transfectados sin modificar, pero no en ratones transgénicos Prg4 transectados o ratones sin modificar después de una cirugía simulada (Fig. 2B).

A continuación, los inventores evaluaron el volumen del cartílago y el área ósea cubierta por el cartílago después de la transección quirúrgica utilizando microCT de contraste de fase (M. Ruan et al., Quantitative imaging of murine osteoarthritic cartilage by phase contrast micro-computed tomography. Arthritis Rheum, (2012)). Después de la transección, los ratones sin modificar mostraron una disminución tanto en el volumen de cartílago como en el área ósea cubierta por cartílago (p <0,01). Por el contrario, los ratones transgénicos Prg4 mostraron volúmenes de cartílago articular y áreas similares a los ratones sin modificar después de una cirugía simulada (Fig. 2C,D). Por lo tanto, en comparación con los ratones sin modificar después de la transección, los ratones transgénicos Prg4 no tuvieron ninguna de las propiedades histológicas, moleculares o de imagen características de la osteoartritis.

El dolor y la disfunción motora también son características de la osteoartritis y son causas típicas de la discapacidad crónica (M. B. Goldring, S. R. Goldring, Osteoarthritis. Journal of Cellular Physiology 213, 626 (2007)). También sirven como puntos finales clínicos importantes para los ensayos de intervención. Por lo tanto, los inventores aplicaron pruebas de comportamiento de roedores, es decir, el análisis rotarod y de la placa caliente, para evaluar la posible disfunción motora y / o sensorial en ratones transgénicos sin modificar vs. Prg4 después de la inducción de la osteoartritis. Los ratones sin modificar transeccionados quirúrgicamente mostraron una disminución del tiempo en el rotorod (p <0,05) y un mayor tiempo en la placa caliente (p <0,05), mientras que los ratones transgénicos Prg4 con y sin transección fueron indistinguibles de los ratones sin modificar después de una cirugía simulada (p = n.s.) (Fig. 2E, F). Esto sugirió que los ratones transgénicos Prg4 después de la transección tenían menos discapacidades motoras o sensoriales en comparación con los ratones sin modificar, lo que respalda que PRG4 previno el deterioro funcional en la osteoartritis postraumática.

La transferencia de genes con HDAd-PRG4 trata eficazmente la osteoartritis

Para traducir la expresión localizada de PRG4 en un enfoque terapéutico, los inventores probaron si la transferencia de genes a la articulación podía mediar la expresión a largo plazo y la condroprotección en la osteoartritis. Dado que el suministro de proteína recombinante a menudo está limitado terapéuticamente por su corta vida media, los inventores optaron por utilizar un enfoque de transferencia génica viral. Los vectores virales más estudiados para la transferencia de genes relacionados con el tratamiento de la osteoartritis son el virus adenoasociado (AAV) y el adenovirus. Se ha demostrado que ambos transducen condrocitos in vitro en cultivos primarios de condrocitos y órganos de cartílago e in vivo en articulaciones de rodillas de conejo y rata (JD Kay et al., Intra-articular gene delivery and expression of interleukin-1 Ra mediated by self-complementary adeno-associated virus. The journal of gene medicine 11, 605 (julio de 2009); Y. Arai et al., Gene delivery to human chondrocytes by an adeno associated virus vector. Journal of Rheumatol 27, 979 (abril de 2000); J. Gouze, Adenovirus-mediated gene transfer of glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase antagonizes the effects of interleukin-1 p on rat chondrocytes. Osteoarthritis and Cartilage 12, 217 (abril de 2004). Sin embargo, no se ha realizado ninguna comparación directa entre los dos virus. Después de la inyección de GFP que expresa adenovirus dependiente de linfocitos T colaboradores y AAV de los serotipos 2; 2,5 y 6 en las articulaciones de la rodilla del ratón (109 partículas virales por articulación en 5 ul), se observó que el adenovirus dependiente de linfocitos T colaboradores muestra una mayor eficiencia de la transducción a las 2 semanas después de la inyección (Fig. 3A).

Mientras que los vectores de adenovirus de primera generación (FGV) pueden mediar la transducción de tejidos altamente eficiente, la respuesta inmune a las proteínas virales limita la expresión transgénica. Estudios previos realizados por los inventores y otros mostraron que los vectores adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores (HDAd) desprovistos de genes de codificación viral podrían superar este problema (D. J. Palmer, D. J. P. D. P. Ng, Helper-dependent adenoviral vectors for gene therapy. Human gene therapy, 16, 1 (2005)). Por ejemplo, una sola inyección de HDAd puede mediar la expresión transgénica a largo plazo en modelos animales pequeños y grandes durante más de 7 años en el hígado (N. Brunetti-Pierri, P. Ng, Helper-dependent adenoviral vectors for liverdirected gene therapy. Hum Mol Genet 20, R7 (13 de junio de 2011). Por lo tanto, los inventores probaron si HDAd podía mediar la expresión a largo plazo de luciferasa en la articulación del ratón en comparación con los FGV. De hecho, los inventores descubrieron que después de una única inyección intraarticular, HDAds mediaba la expresión de luciferasa en las articulaciones de la rodilla del ratón durante más de un año, mientras que la expresión de luciferasa mediada por FGV se perdía al mes (Fig. 3B). Para evaluar la respuesta a la dosis y la distribución celular de la transducción, los inventores evaluaron las articulaciones de la rodilla del ratón inyectadas con 109 vs. 108 partículas virales HDAd que expresan beta-galactosidasa. Estas dosis fueron al menos 10 y 100 veces más bajas que la dosis sistémica máxima tolerada en seres humanos (K. Relph, K. Harrington, H. Pandha, Recent developments and current status of gene therapy using viral vectors in the United Kingdom. BMJ (Clinical research ed.) 329, 839 (09 de octubre de 2004)). A la dosis más alta, HDAd transdujo condrocitos y sinoviocitos de capa superficial, mientras que solo se transdujeron sinoviocitos a la dosis más baja (Fig. 3C). Por lo tanto, los inventores demostraron que HDAd era capaz de transducir eficientemente sinoviocitos y condrocitos manteniendo la expresión transgénica durante al menos un año.

Para comparar los efectos de la expresión de PRG4 de los condrocitos de capa superficial vs. los sinoviocitos, los inventores trataron los ratones a ambas dosis con HDAd que expresaba PRG4 (Fig. 6A-C) 48 horas antes de la transección quirúrgica del ligamento cruzado. Los inventores descubrieron que tanto la dosis baja (expresión mediadora solo en sinoviocitos) como la dosis alta (expresión mediadora tanto en sinoviocitos como en condrocitos de zona superficial) con el vector HDAd-PRG4 protegían las articulaciones del desarrollo de la osteoartritis (Fig. 3D-G). Dado que la aplicación clínica de PRG4 para la osteoartritis probablemente se administraba después de una lesión, los inventores probaron la eficacia de la inyección de HDAd-PRG4 dos semanas después de la inducción de la osteoartritis. En este contexto, la inyección de la dosis más baja de HDAd-PRG4 era suficiente para preservar los volúmenes de cartílago y prevenir la degradación del cartílago según lo evaluado por gCT, mientras que la inyección de dosis más altas mostró efectos protectores tanto por la clasificación OARSI histológica como por la evaluación gOT. Es importante destacar que estos datos sugirieron que la expresión ectópica de los sinoviocitos era suficiente para lograr un cierto grado de condroprotección actuando de manera no autónoma celular (Fig. 3H-K).

PRG4 inhibe los programas transcripcionales de hipertrofia de condrocitos y factores inducibles hipóxicos en el cartílago

Los posibles mecanismos de los efectos protectores de PRG4 solo se han descifrado parcialmente. Si bien los estudios anteriores han demostrado que PRG4 alivia el estrés mecánico en las articulaciones al cambiar la dinámica del líquido sinovial y proporcionar lubricación límite (G. D. Jay, J. R. Torres, M. L. Warman, M. C. Laderer, K. S. Breuer, The role of lubricin in the mechanical behavior of synovial fluid. Proc Natl Acad Sci USA 104, 6194 (10 de abril de 2007), los inventores investigaron si PRG4 podía afectar directamente el metabolismo del cartílago y a la homeostasis. Para evaluar los efectos moleculares de PRG4 en los condrocitos, los inventores realizaron un perfil transcripcional en los condrocitos de capa superficial obtenidos por captura con láser en ratones recién nacidos sin modificar vs. Prg4 transgénicos (Fig. 4A y Fig. 7A). Los genes que estaban regulados al alza o reprimidos en más de 1,5 veces (Conjunto de datos 1) fueron analizados por Ingenuity Pathway Analysis para identificar programas transcripcionales que se verían afectados por la expresión de Prg4 (Conjunto de datos 2). Curiosamente, los factores de transcripción que mediaban la hipertrofia de condrocitos y la diferenciación terminal (p. ej. Mef2c, Runx2 y Atf4) mostraban una disminución de la actividad con la sobreexpresión de PRG4 (KS Lee et al., Runx2 Is a Common Target of Transforming Growth Factor beta 1 and Bone Morphogenetic Protein 2, and Cooperation between Runx2 and Smad5 Induces Osteoblast-Specific Gene Expression in the Pluripotent Mesenchymal Precursor Cell Line C2C12. Molecular and Cell Biology 20, 8783 (1 de diciembre de 2000); X. Yang et al., ATF4 is a substrate of RSK2 and an essential regulator of osteoblast biology; implication for Coffin-Lowry Syndrome. Cell 117, 387 (30 de mayo de 2004); M. A. Arnold et al., MEF2C Transcription Factor Controls Chondrocyte Hypertrophy and Bone Development. Developmental Cell 12, 377 (abril de 2007)). Además, los inventores también notaron una baja regulación de Smad7, un inhibidor de la vía de señalización de TGFbeta (A. Nakao et al., Identification of Smad7, a TGFbeta-inducible antagonist of TGFbeta signalling. Nature 389, 631 (09 de octubre de 1997)). La señalización de TGFbeta regula negativamente la diferenciación terminal de condrocitos y, por lo tanto, PRG4 nuevamente suprimiría la hipertrofia por sus acciones en Smad7 (X. Yang et al., TGFbeta/Smad3 signals repress chondrocyte hypertrophic differentiation and are required for maintaining articular cartilage. The Journal of Cell Biology 153, 35 (2 de mayo de 2001)). Finalmente, la unidad alfa del factor 1 inducible por hipoxia (Hiflalpha), un factor de transcripción esencial inducido en respuesta a la hipoxia, también tuvo una menor actividad (Fig. 4B), mientras que Hif3alpha, por un regulador negativo postraduccional de Hif1 alfa y Hiflalpha, estaba sobrerregulado (Y. Makino et al., Inhibitory PAS domain protein is a negative regulator of hypoxia-inducible gene expression. Nature 414, 550 (29 de noviembre de 2001). (Fig. 4A y Fig. 7B).

Los inventores plantearon la hipótesis de que PRG4 podía sobrerregular de Hif3alpha en condiciones hipóxicas para inhibir la renovación del cartílago. Este efecto estaría mediado por la desregulación de las actividades transcripcionales de Hif1 alfa y Hif2alpha. Para probar esta hipótesis, los inventores midieron la expresión de Hif3alpha y los genes diana Hif generados con posterioridad relevantes para la progresión de la osteoartritis en condiciones hipóxicas en células C3H10T1 / 2 (estroma mesenquimatoso). Después de la inyección de HDAd-PRG4, Hif3alpha fue transcripcionalmente sobrerregulado mientras que Vegf, Col101a1 y Mmp13, todos marcadores de la hipertrofia, fueron todos desregulados en comparación con el vector vacío (Fig. 4C) (T. Saito et al., Transcriptional regulation of endocondral ossification by HIF-2a during skeletal growth and osteoarthritis development. Nature Medicine 16, 678 (23 de junio de 2010). A continuación, los inventores evaluaron si la eliminación de Hif3alpha suprimía los efectos causados por la sobreexpresión de PRG4. Dado que la expresión de Hif3alpha es baja en las células C3H10T1 / 2, los inventores probaron su expresión en líneas celulares condrogénicas alternativas. Curiosamente, en comparación con las condiciones normóxicas, todas las líneas celulares analizadas mostraron una mayor expresión de PRG4 en condiciones hipóxicas (Fig. 4D y Fig. 7C). De acuerdo con esto, el análisis de Genomatix identificó un elemento de respuesta a la hipoxia en la región promotora de PRG4. Los inventores descubrieron que Hif3alpha se expresaba altamente en células del sarcoma de Ewing TC71 y aumentaba aún más con la sobrerregulación de PRG4 en condiciones hipóxicas (Fig. 4D). Como predijo el análisis transcriptómico previo de los inventores, la eliminación de Hif3alpha en las células TC71 conducía a una desregulación de los genes diana Hif1 alfa y Hif2alpha frente a la sobrerregulación de PRG4 (Fig. 4E). Los hallazgos de los inventores sugirieron que la proteína secretada PRG4 podía modificar el equilibrio de los programas anabólicos y catabólicos en el contexto de la patogénesis de la osteoartritis.

Para investigar si la vía de señalización descubierta en el ratón se conservaba en seres humanos, los inventores realizaron un análisis in silico en el perfil de expresión génica realizado en muestras de pacientes con osteoartritis humana disponibles en la base de datos GEO (S. Koelling et al., Migratory Chondrogenic Progenitor Cells from Repair Tissue during the Later Stages of Human Osteoarthritis. Stem Cell 4, 324 (03 de mayo de 2009); T. Dehne, C. Karlsson, J. Ringe, M. Sittinger, A. Lindahl, Chondrogenic differentiation potential of osteoarthritic chondrocytes and their possible use in matrix-associated autologous chondrocyte transplantation. Arthritis Research & Therapy 11, R133 (2009)). Los inventores descubrieron que el PRG4 y el efector generado posteriormente propuesto, HIF3alpha, estaban sobrerregulados en las células progenitoras de condrocitos en pacientes con OA más de 2,6 veces (p <0,05) y 1,5 veces (p <0,01), respectivamente. En un conjunto de disposiciones independientes que compara condrocitos cultivados tridimensionales de donantes con osteoartritis y sanos, los inventores observaron una tendencia similar: PRG4 se incrementaba en 1,4 veces (p <0,05) y HIF3alfa se incrementaba en 1,3 veces (p <0,05). En el contexto del desarrollo de la osteoartritis, PRG4 y HIF3alpha pueden estar sobrerregulados ambos como respuesta de reparación. Por el contrario, con la sobreexpresión sostenida de PRG4 en los modelos terapéuticos de los inventores, esta respuesta normal en seres humanos puede ser insuficiente para prevenir la progresión de la enfermedad.

Estos datos juntos mostraban que, bajo las condiciones hipóxicas del cartílago, la sobreexpresión de PRG4 puede prevenir la progresión de la osteoartritis no solo al ejercer efectos biomecánicos en el líquido sinovial y la interfaz del cartílago, sino también al regular las redes transcripcionales que especifican la hipertrofia y el catabolismo de los condrocitos. La renovación del cartílago mediada por Hif1 alfa y Hif2alpha fue inhibida por la sobrerregulación de Hif3alpha. Como la degradación del cartílago y la hipertrofia son dos propiedades de la progresión de la osteoartritis, no es sorprendente que PRG4 tenga efectos condroprotectores tanto en la osteoartritis relacionada con la edad como después de la lesión (Fig. 4F).

La terapia génica para la osteoartritis se puede mejorar mediante la transferencia combinada de genes de PRG 4 y II-1Ra

Los inventores buscaron evaluar si el efecto beneficioso de la sobreexpresión de PRG4 en las articulaciones de la osteoartritis puede mejorarse aún más combinándolo con la expresión mediada por terapia génica de Il-1Ra. Il-1Ra bloquea los efectos de Il-1 beta, que es uno de los principales impulsores de la inflamación y el catabolismo del cartílago en la osteoartritis. En función de las diferentes vías en las que PRG4 y Il-1 Ra ejercen sus efectos, una combinación de ambos podría dar como resultado una inhibición optimizada tanto de la ruptura del cartílago como de la inflamación.

Los ratones tenían artrosis inducida y se les inyectaron vectores de terapia génica dos semanas después. HDAd-PRG4, HDAd-IM Ra y la combinación de ambos dieron como resultado puntuaciones de histología de osteoartritis significativamente más bajas en comparación con el vector de control HDAd-GFP y el grupo sin tratamiento (Fig. 8A). El área superficial del cartílago fue significativamente mayor en el HDAd-PRG4, HDAd-II-1Ra y el grupo de combinación en comparación con HDAd-GFP (Fig. 8B). Además, el volumen del cartílago fue significativamente mayor en el HDAd-PRG4, HDAd-ll-1Ra y el grupo de combinación en comparación con HDAd-GFP (Fig. 8C). La combinación de HDAd-PRG y HDAd-ll-1 Ra dio como resultado un volumen de cartílago significativamente mayor en comparación con el tratamiento con un solo vector. La terapia combinada también dio como resultado un promedio menor del puntaje de osteoartritis y un mayor área promedio de superficie del cartílago; sin embargo, la diferencia en estos parámetros no alcanzó una cierta significación estadística, aunque hubo una tendencia a la significación.

Discusión

La invención muestra, mediante el uso de ratones transgénicos que expresan proteoglicano 4 (PRG4) y la transferencia intraarticular de genes del virus adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores (HDAd), que PRG4 protege contra el desarrollo de la osteoartritis postraumática y la relacionada con la edad, sin efectos adversos significativos en el desarrollo del cartílago. El tratamiento de terapia génica con HDAd-PRG4 fue efectivo cuando se inyectó antes y después del inicio de la osteoartritis, lo que sugiere que el tratamiento es preventivo y terapéutico. El efecto beneficioso puede mejorarse aún más combinando PRG4 con la terapia antiinflamatoria del gen Il-1 Ra. Los efectos protectores se demuestran a niveles moleculares, histológicos y funcionales. Los inventores muestran además que la sobreexpresión de PRG4 inhibe los programas transcripcionales que promueven el catabolismo e hipertrofia del cartílago, en parte, a través de la sobrerregulación de Hif3alpha. También se observan cambios concordantes de la expresión de PRG4 y HIF3alpha en el perfil de expresión génica en muestras de pacientes con osteoartritis humana.

La mayoría de los modelos genéticos reportados hasta la fecha muestran una cierta protección contra la osteoartritis usando criterios de valoración histológicos un mes después de la desestabilización quirúrgica del menisco médico (DMM) para inducir una osteoartritis condilar leve y única postraumática. Además, los estudios sobre la osteoartritis se han centrado principalmente en la pérdida de la función de mutaciones de genes en el desarrollo óseo como Adamts5, Mmp13, Hif2alpha y Syndecan4 (F. Echtermeyer et al., Syndecan-4 regulates ADAMTS-5 activation and cartilage breakdown in osteoarthritis. Nature Medicine, 1 (30 de marzo de 2 02); T. Saito et al., Transcriptional regulation of endochondral ossification by HIF-2a during skeletal growth and osteoarthritis development. Nature Medicine 16, 678 (23 de junio de 2010); S. S. Glasson et al., Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature 434, 644 (31 de abril de 2005); C. B. Little et al., Matrix metalloproteinase 13-deficient mice are resistant to osteoarthritic cartilage erosion but not chondrocyte hypertrophy or osteophyte development. Arthritis & Rheumatism 60, 3723 (diciembre de 2009)). En contraste con estos estudios, los inventores han mostrado un modelo genético de ganancia de función con una proteína secretada PRG4 que protege contra el desarrollo de la osteoartritis al menos 2 meses después de la transección de los ligamentos cruzados. Este modelo imita una lesión común en seres humanos y conduce a la osteoartritis en ambas estructuras condilares de la rodilla. El establecimiento de un modelo de ganancia de función utilizando una proteína secretada producida endógenamente puede facilitar la traducción clínica en comparación con los enfoques anteriores dirigidos a la inhibición de enzimas de matriz específicas y / o factores de transcripción intracelulares. Además, la demostración de un efecto beneficioso sobre los cambios de cartílago relacionados con la edad respalda otros estudios basados en este enfoque, más allá del modelo de lesión.

Los mecanismos establecidos, que protegen a los animales del desarrollo de la osteoartritis, dependen principalmente de la inhibición de las enzimas catabólicas del cartílago. ADAMTS5 fue la primera diana que se descubrió a través de experimentos genéticos in vivo (S. S. Glasson et al., Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature 434, 644 (31 de abril de 2005). La pérdida de Syndecan 4, de manera similar, funciona a través de la inhibición de ADAMTS5 (F. Echtermeyer et al., Syndecan-4 regulates ADAMTS-5 activation and cartilage breakdown in osteoarthritis. Nature Medicine, 1 (30 de marzo de 2102)). Recientemente, el descubrimiento de los efectos protectores de la pérdida de función de Hif2alpha en la OA amplía este enfoque ya que Hif2alpha regula transcripcionalmente la expresión de enzimas catabólicas que incluyen varias MMP y ADAMTS (T. Saito et al., Transcriptional regulation of endochondral ossification by HIF-2a during skeletal growth and osteoarthritis development. Nature Medicine 16, 678 (23 de junio de 2010). Sin embargo, reconocer las vías anabólicas, incluido el crecimiento celular, la diferenciación y la síntesis de la matriz es igualmente importante en la osteoartritis, ya que la proliferación de condrocitos, la metaplasia y la síntesis anormal de la matriz han sido observadas durante mucho tiempo en la progresión de la osteoartritis (K. P. Pritzker et al., Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage 14, 13 (enero de 2006)). Se requiere una interacción entre las vías anabólicas y catabólicas del cartílago para mantener la homeostasis y su desequilibrio conduce a la progresión de la osteoartritis. Una terapia que pueda afectar a ambos programas sería potencialmente más efectiva.

La inflamación de bajo grado se observa comúnmente en las articulaciones osteoartríticas (Felson DT. 2006. Clinical practice. Osteoarthritis of the knee. N Engl J Med 354: 841-848.). Además de mantener y amplificar la inflamación, los mediadores inflamatorios clave en la osteoartritis, como Il-1 beta, también desencadenan la expresión de las enzimas que degradan el cartílago, como las colagenasas y las agrecanasas (Daheshia, M. y YAO, J.Q. (2008). The Interleukin 1p Pathway in the Pathogenesis of Osteoarthritis. J Rheumatol 35, 2306.). Por lo tanto, parece importante inhibir tanto el catabolismo del cartílago como la inflamación de las articulaciones para lograr un tratamiento eficaz de la osteoartritis. En esta línea, los inventores muestran en este documento que un tratamiento de terapia génica que combina vectores adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores que expresan PRG4 y el antiinflamatorio Il-1Ra parece mejorar aún más el tratamiento de la osteoartritis respecto a la terapia génica con PRG4 solo.

Materiales y métodos

Generación de ratones transgénicos. Los ratones FVB / N se compraron en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Esta cepa es la cepa base común para las líneas de ratones transgénicos. Todos los estudios se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Baylor College of Medicine (IACUC). Todos los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos en menos de cinco por jaula. Los ratones tenían libre acceso a alimento y agua. Se generaron ratones transgénicos por microinyección pronuclear. Los fundadores fueron cruzados durante al menos 3 generaciones para eliminar múltiples inserciones. Se probaron diferentes líneas al principio para descartar el efecto de posición. Los cebadores de genotipado fueron diseñados para detectar el elemento WPRE en el casete transgénico: F: TCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCC, R: CGACAACACCACGGAATTGTCAGT. Para evitar los efectos de la posible pérdida ósea posmenopáusica, todos los ratones utilizados en la evaluación de OA fueron machos.

Cirugía de transección del ligamento cruzado (CLT). La cirugía CLT y el simulacro se realizaron como se describió anteriormente en ratones FVB / N machos de 8 semanas de edad y ratones transgénicos PRG4 (M. Ruan et al., Quantitative imaging of murine osteoarthritic cartilage by phase contrast micro-computed tomography. Arthritis Rheum, (2012). Los investigadores desconocían el genotipo de los ratones cuando se realizó la cirugía.

Histología e inmunohistoquímica. Los ratones se sacrificaron y las muestras se fijaron con paraformaldehído al 4% (Sigma-Aldrich) durante la noche a 4°C en un agitador. Las muestras de ratones mayores de 4 días se descalcificaron en EDTA al 14% durante 5 días a 4°C en un agitador. Las muestras de ratones menores de 3 días no fueron descalcificadas. La inclusión de parafina se realizó como se describió previamente. Las muestras se cortaron en secciones de 6gm. Las muestras se tiñeron con safranina O y verde rápido usando protocolos estándar. Las muestras fueron puntuadas por dos patólogos independientes enmascarados para el procedimiento y los genotipos. La inmunohistoquímica se realizó con anticuerpos primarios: anti-PRG4 (Abcam, ab 28484), anti-MMP13 (Millipore, MAB 13424), anti-ColX (generosa donación del Dr. Greg Lunstrum, Hospital Shriners para Niños, Portland, OR) y anticuerpo secundario: conjugados de polímero HRP de un frasco gotero (Invitrogen). La tinción con BrdU se realizó usando Alexa Fluor 594 anti-BrdU (A21304, Invitrogen). Histomark trueblue (KPL) se utilizó como reactivo en desarrollo. La tinción de TUNEL se realizó utilizando la detección de apoptosis in situ de peroxidasa ApopTag Plus (Millipore Kit S7101) siguiendo el protocolo del fabricante. Todas las tinciones en el mismo experimento se realizaron al mismo tiempo. El observador que cuantificó la tinción de BrdU y TUNEL desconocía el genotipo de los ratones.

Tinción de beta-galactosidasa. La tinción se realizó en muestras embebidas en compuesto de temperatura de corte óptima después de la fijación y descalcificación. Las muestras se cortaron en secciones 6 gm y se tiñeron con X-gal (X428IC Gold biotechnology) durante la noche y nuclear fast red (N3020 Sigma) como contratinción.

Análisis de rotarod. Los ratones se colocaron en un rotor rotativo acelerado (UGO Basile, Varese, Italia). La duración hasta el primer fracaso para permanecer encima de la barra se marcó como el primer tiempo de recorrido. Para descartar diferencias en las habilidades de aprendizaje entre los dos grupos de ratones, cada grupo se evaluó en tres ensayos al día durante 2 días consecutivos (ensayos 1 a 6) antes de la cirugía. Los ratones fueron asignados al azar en diferentes grupos. Se realizaron otros 6 ensayos usando las mismas condiciones en los diferentes puntos de tiempo después de la cirugía. Los ratones recibieron un intervalo de descanso entre ensayos de 30 minutos. Cada ensayo tuvo un tiempo máximo de 5 minutos. El observador desconocía al genotipo y el procedimiento de los ratones.

Análisis de placa caliente. Los ratones se colocaron en la placa caliente a 55°C (Columbus Instruments, Columbus, OH). El período de latencia para la respuesta de las extremidades posteriores (por ejemplo, sacudidas, saltos o lamidas) se registró como tiempo de respuesta antes en diferentes momentos después de la cirugía. El observador desconocía el genotipo y el procedimiento de los ratones.

Barrido pTC de contraste de fase. Las muestras se prepararon como se describió anteriormente y se escanearon con Xradia pXOT a un voltaje de fuente = 40kV, potencia de fuente = 8W, distancia del detector de la muestra = 75 mm, distancia de fuente de la muestra = 100 mm, número de imagen tomada = 500 y tiempo de exposición para cada imagen = 30 (M. Ruan et al., Quantitative imaging of murine osteoarthritic cartilage by phase contrast micro-computed tomography. Arthritis Rheum, (2012)). La resolución del escaneo es de 4 pm. Después del escaneo, se asignó un número aleatorio a cada muestra para garantizar una evaluación a ciego durante el procesamiento de la imagen.

Reconstrucción y análisis de datos pOT. La reconstrucción de los datos se realizó utilizando el software Xradia y se transformó en archivos dicom. La reconstrucción implica la corrección del endurecimiento del haz (constante = 0,3) y la corrección de los efectos de desplazamiento central causados por la diferencia entre el centro de rotación de la muestra y el centro del detector. Las muestras se analizaron utilizando el software TriBON (RATOC, Tokio, Japón). Los observadores desconocían el procedimiento y el número de muestra (M. Ruan et al., Quantitative imaging of murine osteoarthritic cartilage by phase contrast micro-computed tomography. Arthritis Rheum, (2012)).

Inyección intraarticular. Los ratones se anestesiaron con isoflurano al 3%. Se afeitó el área de la articulación. Los HDAds se diluyeron en PBS estéril en 5 pl y se inyectaron con jeringas CASTIGHT de 25 pl (1702 Hamilton Company) y agujas de calibre 33 (7803-05 Hamilton Company).

Ensayo de luciferasa. Los ratones fueron inyectados con 2 mg de D-luciferina (L9504 SIGMA) diluido en 100 pl de PBS por ratón (25 gramos) intraperitoneal. Los ratones se anestesiaron con isoflurano al 3%. Las imágenes fueron tomadas por el sistema de imagen óptica in vivo Xenogen MS. La cuantificación se realizó mediante Living Imaging 4.2 utilizando la configuración predeterminada. La imagen se recogió durante 10 minutos después de la inyección y se normalizó para controlar ratones sin inyección de luciferasa.

Microdisección de captura con láser y purificación de ARN. Las extremidades posteriores de los compañeros de camada P1 se recogieron y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Luego, las muestras fueron incrustadas en un compuesto de temperatura de corte óptima. Se generaron secciones congeladas de 10 pm en portaobjetos de membrana de naftalato de polietileno (PEN). Los condrocitos de la capa superficial se capturaron usando tapas HS Capsure LCM de Applied Biosciences Acturus Systems. El ARN se purificó luego mediante el kit de aislamiento de ARN Picopure.

Micromatrices de ratón y análisis. Se realizaron micromatrices utilizando Mouse WG-6 v2.0 Expression BeadChip (lllumina). Los datos se procesaron utilizando el paquete lumi dentro del paquete estadístico R. Se realizó la transformación de estabilización de varianza (VST), seguida de la normalización cuantil de los valores de expresión resultantes. La expresión diferencial se calculó usando el paquete de limma dentro de R. El mapa de calor se generó usando el cambio de pliegue normalizado. Las listas resultantes fueron anotadas y revisadas para los candidatos.

Análisis de expresión génica humana. GEO archiva GSE10575 titulado "Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis" (PMID: 19341622) y GSE16464, titulado "Chondrogenic differentiation potential of osteoarthritis chondrocytes and their use in autologous chondrocyte transplantation" (PMID: 19723327) se descargaron y analizaron utilizando el GE02R basado en la web, utilizando la configuración predeterminada, disponible a través del sitio GEO. En el archivo GSE10575, se compararon tres matrices de células progenitoras condrogénicas de hombres con osteoartritis con dos matrices de control del mismo tipo celular. Se excluyeron las muestras femeninas porque las muestras de control eran machos (mostrado por el nivel de expresión Xist). En el archivo GSE 16464, se compararon condrocitos cultivados en 3D de donantes normales y condrocitos cultivados en 3D de donantes de OA. Ambos archivos utilizaron la plataforma de matriz Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0.

Cultivo celular, transfección e infección. Las células C3H10T1 / 2 se mantuvieron en DMEM con FBS al 10%; Las células TC71 se mantuvieron en RPMI 1640 con FBS al 10%; Las células ATDC5 se mantuvieron en una mezcla DME / F-12 1: 1 suplementada con FBS al 10%. Las células se colocaron en placas el día anterior a la transfección / infección para que alcanzaran el 70% de confluencia al día siguiente. Lipofectamine 2000 se utilizó como reactivo de transfección siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante. Se usó ARNsi de Dharmacon en la diana en el ensayo de eliminación. Los HDAds se generaron como se describió previamente (M. Suzuki et al., Large-scale production of high-quality helper-dependent adenoviral vectors using adherent cells in all factories. Human gene therapy 21, 120 (febrero de 2010)). HDAd-PRG4 lleva el gen murino PRG4 controlado por el promotor constitutivo EF1. HDAd-ll-1 Ra lleva el gen murino Il-1 Ra controlado por un promotor NF-^{k B} inducible por inflamación. Para infectar las células, los HDAds se diluyeron a 5000 vp / célula y se añadieron en medio sin suero con un volumen mínimo que cubría las células después de la aspiración. Dos horas más tarde, se aspiraron los medios que contenían virus y se añadieron nuevamente los medios de cultivo. Para los experimentos de hipoxia, las células se transfirieron a la cámara de hipoxia con 1% de oxígeno.

Purificación de ARN y PCR cuantitativa. Las células se lisaron con reactivos Trizol (Invitrogen) y el ARN se purificó siguiendo el protocolo del fabricante. Para eliminar la contaminación del ADN, las muestras se trataron con DNasel recombinante sin RNasa (Roche). La PCR de transcripción inversa se realizó mediante la primera cadena de superscript III (18080-051 Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se utilizaron en la PCR cuantitativa mezcla madre de PCR Taqman Universal (Applied biosciences) y PerfeCTa SYBR Green SuperMix (Quanta Biosciences). Los cebadores usados en PCR cuantitativa se enumeran de la siguiente manera:

PRG4 de ratón: F: ACTTCAGCTAAAGAGACACGGAGT, R: GTTCAGGTGGTTCCTTGGTTGTAGTAA; Sox9: F: AAGCCACACGTCAAGCGACC, R: GTGCTGCTGATGCCGTAACT;

Col2a1: F: GCTCATCCAGGGCTCCAATGATGTAG, R: CGGGAGGTCTTCTGTGATCGGTA;

Gapdh: F: GCAAGAGAGGCCCTATCCCAA R: CTCCCTAGGCCCCTCCTGTTATT;

Veg F: TGGACTTGTGTTGGGAGGAGGATG, R: GCCTCTTCTTCCACCACCGTGTC;

Mmp13: F: GCAATCTTTCTTTGGCTTAGAGGT, R: GGTGTTTTGGGATGCTTAGGGT;

Col10a1: F: AAAGCTTACCCAGCAGTAGG, R: ACGTACTCAGAGGAGTAGAG;

GAPDH: F: ATACCAGGAAATGAGCTTGACAAA, R: TGAAGGTCGGAGTCAACGGA;

VEGF: F: GATCGGTGACAGTCACTAGCTTATCT, R: TACACACAAATACAAGTTGCCA;

MMP13: F: TGCCCTTCTTCACACAGACACTAACGAAA, R: GGCCACATCTACTATTCTTACCACTGCTC COL10A1. F: GCCCACTACCCAAGACCAAGAC; R: GACCCCTCTCACCTGGACGAC;

HIF3A: F: GGCTGTTCCGCCTACGAGTA, R: AGCAAGGTGGATGCTCTTG;

PRG4: Hs00981633_m1 (Applied Biosciences); Hif3a de ratón: Mm00469375_m1 (Applied Biosciences).

Estadísticas. La significación estadística que compara dos grupos con datos paramétricos se evaluó mediante la prueba t de Student. El análisis estadístico que compara múltiples grupos con datos paramétricos se realizó mediante ANOVA de una vía seguido por el post hoc de Tukey. El análisis estadístico que compara diferentes genotipos con diferentes procedimientos se realizó mediante ANOVA de dos vías seguido por el post hoc de Tukey. La normalidad se probó mediante la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Los grados histológicos se compararon mediante la prueba de rango de Wilcox. Todos los análisis fueron realizados por el software SPSS o Sigma Plot. Un valor de P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Figuras

Figura 1. Los ratones transgénicos Prg4 están protegidos del desarrollo de osteoartritis relacionada con la edad. A, Comparación de las articulaciones de rodilla de ratones sin modificar de 10 meses y ratones transgénicos Prg4 por grado OARSI (*P <0,05, n = 7, prueba de rango de Wilcox). B, tinción con safranina O e inmunohistoquímica (anticuerpo usado a la izquierda) de ratones transgénicos sin modificar (Wt) y Prg4 de 10 meses de edad. Las flechas negras indican cambios de osteoartritis en el cartílago articular tibial proximal en la sección sagital. Barra de escala, 100 pm. C, imagen representativa de la reconstrucción del cartílago articular en ratones transgénicos Prg4 sin modificar de 10 meses de edad con cartílago femoral en azul y cartílago tibial en amarillo. La flecha roja indica pérdida de cartílago. Barra de escala, 500 pm. D, Cuantificación del volumen del cartílago articular y el área de la superficie del hueso cubierto por el cartílago en las articulaciones de la rodilla del ratón por contraste de fase pOT (*P <0,01, n = 5, prueba t). Las barras de error indican s.e.m.

Figura 2. Los ratones transgénicos Prg4 están protegidos del desarrollo de la osteoartritis postraumática. A, Comparación de ratones transgénicos Prg4 y articulaciones de rodilla de ratones sin modificar por grado OARSI (* P <0,05, n = 8, ANOVA). B, tinción con safranina O e inmunohistoquímica (anticuerpo usado en la lista arriba de cada columna) de simulacro sin modificar (Wt simulacro), sin modificar con transección (Wt Sx) y ratones transgénicos Prg4 con transección (Prg4 Sx). Las flechas negras indican áreas con cambios de osteoartritis en secciones sagitales a través de la rodilla. Barra de escala, 100 pm. C, Imágenes representativas de la reconstrucción de articulaciones de rodilla con contraste de fase pOT con cartílago femoral en azul y cartílago tibial en amarillo. La flecha roja indica pérdida de cartílago. Barra de escala, 500 pm. D, Cuantificación del volumen del cartílago articular y del área de la superficie del hueso cubierto por el cartílago en las articulaciones del ratón por contraste de fase pOT (* P <0,01, ** P<0,05, N.S. = no significativo, n = 5-6, ANOVA). E, Tiempo promedio que los ratones permanecieron en la varilla giratoria 2 meses después de la transección del ligamento cruzado en el análisis de rotarod (* P <0,05, n = 15, ANOVA). F, Tiempo de respuesta de los ratones después de la colocación en una plataforma de 55°C en análisis de placa caliente (* P <0,05, n = 10, ANOVA). Las barras de error indican s.e.m.

Figura 3: PRG4 administrado por vectores adenovirales dependientes de linfocitos T colaboradores (HDAd) protege a los ratones del desarrollo de la osteoartritis. A, imagen representativa que compara la inyección intraarticular de HDAd y diferentes serotipos de AAV. Los vectores (109 partículas virales) que expresaban GFP cada uno se inyectaron intraarticularmente en la articulación de la rodilla. Los paneles inferiores son imágenes ampliadas de las áreas en cuadro en los paneles superiores. Verde: GFP, azul: DAPI, C: cartílago, S: sinovio. Barra de escala, 100 |jm. B, Comparación de la expresión de luciferasa después de la inyección intraarticular del vector adenoviral de primera generación (FGV) y del vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores (HDAd) (n = 6) en la articulación de la rodilla. C, Imagen representativa de los patrones de expresión de inyecciones intraarticulares de diferentes dosis de HDAD que codifica D-galactosidasa. Las imágenes inferiores son áreas ampliadas del cuadro negro en las imágenes superiores de secciones sagitales a través de la articulación de la rodilla. C: cartílago; S: sinovial. Barra de escala, 100 pm. D-G, Esquema de experimento que compara el efecto preventivo de inyección de HDAd-PRG4 y evaluación por grado OARSI y volumen de cartílago (D). Antes de la transección, los ratones sin modificar fueron inyectados con HDAd-PRG4 intraarticularmente a 109 vp / articulación (Sx PRG4 H) o 108 vp / articulación (Sx PRG4 L). La simulación, la transección sin tratamiento (Sx) y la inyección de virus sin transgen antes de la transección (Sx Vector) sirvieron como controles. El grado de osteoartritis se presenta por grado OARSI (E), volumen de cartílago (F) y área de superficie del cartílago (G) (*P <0,05, n = 8-10 en clasificación OARSI, n = 5-6 en análisis de volumen de cartílago, ANOVA). H-K, Esquema de experimento que compara el efecto protector de la inyección de HDAd-PRG4 y evaluación por grado OARSI y volumen de cartílago (H). Dos semanas después de la transección, a los ratones sin modificar se les inyectó HDAd-PRG4 por vía intraarticular a 109 vp / articulación (Sx PRG4 H) o 108 vp / articulación (Sx PRG4 L). Simulado, la inyección sin ningún tratamiento (Sx) y con HDAd-GFP (Sx GFP) sirvieron como controles. El grado de OA se presenta por grado OARSI (I), volumen de cartílago (J) y área de superficie del cartílago (K) (* P <0,05, n = 8-10 en clasificación OARSI, n = 5-6 en análisis de volumen de cartílago, ANOVA ). Las barras de error indican s.e.m.

Figura 4: PRG4 retrasa la osteoartritis al inhibir el catabolismo del cartílago y la hipertrofia terminal. A, análisis de mapa de calor de micromatrices que compara el cartílago de la zona superficial de ratones transgénicos sin modificar y Prg4. Se representan los genes con cambios de expresión mayores de 1,5 veces y valores p menores de 0,05. B, Cambios en la actividad del factor de transcripción pronosticados por Ingenuity Pathway Analysis. Se predijo que todos los factores de transcripción mostrados en este documento serían suprimidos por Ingenuity Pathway Analysis. El eje X indica el número de genes / grupos de genes controlados por cada vía de transcripción en la lista de genes presentada. C, Cambios en la expresión génica (Prg4, Hif3a, Vegf, Col10a1 y Mmp13) en células C3H10T1 / 2 bajo hipoxia (1% de oxígeno durante 8 horas). Las células se tratan de forma simulada, se infectan con HDAd vacío (vector) o con HDAd-PRG4 (PRG4) (*P <0,05, n = 3, ANOVA). D, Cambios en la expresión de PRG4 y Hif3alpha bajo normoxia e hipoxia en células de sarcoma de Ewing TC71 (*P <0,05, n = 3, prueba t). E, Cambios en la expresión génica después de la eliminación de Hif3alpha por siRNA (*P <0,05, n = 3, ANOVA). F, Modelo propuesto de la función PRG4 en la prevención del desarrollo de la osteoartritis. Las barras de error indican s.e.m.

Figura 5: la sobreexpresión de PRG4 bajo el promotor Col2al no afecta negativamente al desarrollo de los ratones. A, Figura esquemática de la construcción de ratones transgénicos Prg4. B, niveles de expresión de cartílago de costilla de PRG4, Sox9 y Col2al en recién nacidos (P1) PRG4 ratones transgénicos y sin modificar (*P <0,05, n = 7-8, prueba t de Student). C, Comparación de la sección de cabeza femoral teñida con anticuerpo anti-PRG4 en ratones recién nacidos transgénicos sin modificar y Prg4. Barras de escala, 100 pm. D, Comparación de articulaciones de rodilla teñidas con anticuerpo anti-PRG4 en ratones Prg4 transgénicos y sin modificar de 3 meses de edad. Las áreas en cuadro a la izquierda (área articular, placa de crecimiento femoral distal y placa de crecimiento tibial proximal) se agrandan a la derecha. Barras de escala, 100 pm. E, Peso de ratones Prg4 de alta expresión, baja expresión y sin modificar (P <0,05, n = 10-11). F, Imagen representativa de tinción con BrdU (rojo) y DAPI (azul) en extremidades posteriores P3 transgénicas sin modificar y Prg4. Las señales de tinción se cuantificaron mediante la imagen J (P <0,05, n = 7). Barras de escala, 100 pm. G, imagen representativa de TUNEL (marrón) y tinción con verde de metilo en extremidades posteriores P3 transgénicas sin modificar y Prg4. No hubo señales positivas visibles en el cartílago, pero estaban presentes en la dermis y la piel suprayacentes. Barra de escala, 100 pm. Las barras de error indican s.e.m.

Figura 6: Generación y caracterización de HDAd-PRG4. A, la banda HDAd-PRG4 es visible en el último paso de la ultracentrifugación de cloruro de cesio. El virus purificado es la banda blanca en el tubo. B, determinación por PCR de la expresión de PRG4 de células HEK293 infectadas con HDAd-PRG4 (PRG4), HDAd-GFP (GFP) y tratamiento simulado (células). Gapdh se usa como control de carga. C, Inmunofluorescencia de células HEK293 infectadas con HDAd-PRG4 (PRG4, rojo) y HDAd-GFP (GFP, verde). Se usó DAPI (azul) como contratinción.

Figura 7: Perfiles de expresión génica de condrocitos sin modificar vs. Prg4 transgénicos de capa superficial. A, Microdisección de captura con láser de condrocitos de capa superficial. De izquierda a derecha: tejido antes de la captura, tejido capturado en la tapa HS y tejido restante en el portaobjetos. Barra de escala, 100 pm. B. Evaluación de la expresión de Hif3a en condrocitos de la capa superficial sin modificar vs. ratones Prg4 (*Py0,05, n = 3, prueba t). C. Evaluación de la expresión de P^rG4 en células ATDC5 y C3H10T1 / 2 en condiciones normoxicas e hipóxicas (*P <0,05, n = 3, prueba t). Las barras de error indican s.e.m.

Figura 8: A, los ratones se trataron con HDAd-PRG4 (P^rG4), HDAd-ll-1Ra (Il1Ra) y terapia combinada (PRG4 ll1 Ra) de acuerdo con el esquema que se muestra en la Figura 3H. Los tres grupos mostraron significativamente una puntuación histológica más baja en comparación con ningún tratamiento y tratamiento con placebo, lo que sugiere que se dan efectos terapéuticos para HDAd-PRG4 y HDAd-ll-1Ra. La terapia combinada mostró una tendencia a ser más efectiva. (ANOVA, N = 8-10, *p <0,05); B, C, los ratones se trataron con HDAd-PRG4 (PRG4), HDAd-Il-1Ra (Il1 Ra) y la terapia combinada de acuerdo con el esquema que se muestra en la Figura 3H. El área superficial del cartílago (B) y el volumen del cartílago (C) fueron cuantificados. Los tres grupos mostraron un volumen de cartílago y un área de superficie significativamente más altos en comparación con ningún tratamiento y con el tratamiento con placebo, lo que sugiere efectos terapéuticos de HDAd-PRG4 y HDAd-IHRa. Las rodillas bajo terapia combinada tenían un volumen de cartílago y un área de superficie más conservados. (ANOVA, N = 5, *p <0,05)

Conjunto de datos 1: Lista de genes que muestran un cambio de más de 1,5 veces en el análisis de micromatrices

Conjunto de datos 2: Lista de factores de transcripción pronosticados por Ingenuity Pathway Analysis para ser activados o inhibidos. El puntaje z positivo sugiere activación y el puntaje z negativo.

Índice del Listado de Secuencia: SEQ ID NO 1 HDAd-huPRG4 SEQ ID NO 2 HDAd-muPRG4 SEQ ID NO 3 huPRG4

SEQ ID NO 4 muPRG4

SEQ ID NO 5 proteína huPRG4 SEQ ID NO 6 proteína muPRG4 SEQ ID NO 7 HDAd-huIL1 Ra SEQ ID NO 8 HDAd-mull1 Ra SEQ ID NO 9 HDAd-eqIl1 Ra SEQ ID NO 10 hull1 Ra

SEQ ID NO 11 mull1 Ra

SEQ ID NO 12 eqll1 Ra

SEQ ID NO 13 proteína hull1 Ra SEQ ID NO 14 proteína mull1 Ra SEQ ID NO 15 proteína eqll1 Ra hu = humano; mu=murino; eq=equino

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema de administración y expresión de la terapia génica que comprende al menos un vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica el proteoglicano 4 (PRG4), o un fragmento biológicamente activo del mismo, que tiene actividad condroprotectora, repeticiones terminales invertidas adenovirales izquierda y derecha (L ITR y R ITR), secuencias señal de ensamblaje adenoviral y secuencias de ácido nucleico rellenas no codificantes y no virales, en las que la expresión PRG4 en el al menos un vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores se controla mediante un promotor constitutivo ubicuo.

2. El sistema de administración y expresión de la terapia génica según la reivindicación 1, en el que el promotor constitutivo ubicuo se selecciona del grupo que consiste en el promotor alfa del factor de alargamiento 1 (EF1 alfa), promotor del citomegalovirus (CMV), promotor de beta-actina, promotor temprano del virus simiano 40 (SV40), promotor de ubiquitina c, promotor de glicerilaldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK).

3. El sistema de administración y expresión de la terapia génica según la reivindicación 1 o 2, en el que el vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica el proteoglicano 4 (PRG4) comprende una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 1, o SEQ ID NO 2, o un fragmento biológicamente activo de la misma, o una secuencia de ácido nucleico que tenga al menos un 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de homología de secuencia con una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 1, o SEQ ID NO 2, o un fragmento biológicamente activo de la misma, en la que el vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica PRG4, que comprende un fragmento biológicamente activo de SEQ ID NO 1, o SEQ ID NO 2, o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de homología de secuencia con una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 1, o SEQ ID NO 2, o un fragmento biológicamente activo de la misma, media la actividad condoprotectora.

4. El sistema de administración y expresión de la terapia génica según la reivindicación 1 o 2, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el proteoglicano 4 (PRG4) comprende una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 3, o SEQ ID NO 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma, o un homólogo de la misma de cualquier otra especie, o una secuencia de ácido nucleico que tenga al menos un 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de homología de secuencia con una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 3, o SEQ ID NO 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma, en la que el PRG4 codificado por el fragmento biológicamente activo de SEQ ID NO 3, o SEQ ID NO 4, o una secuencia de ácido nucleico que tenga al menos el 50%, 60%, 70%, 80 % o 90% de una homología de secuencia con una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 3, o SEQ ID NO 4, o un fragmento biológicamente activo de la misma, tiene actividad condoprotectora.

5. El sistema de administración y expresión de la terapia génica según la reivindicación 1 o 2, en la que la secuencia de aminoácidos del proteoglicano 4 (PRG4) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 5, o SEQ ID NO 6, o un fragmento biológicamente activo de la misma, o un homólogo de la misma de cualquier otra especie, o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos el 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 5, o SEQ ID NO 6, o un fragmento biológicamente activo de la misma, en el que la secuencia de aminoácidos de PRG4, que comprende un fragmento biológicamente activo del aminoácido SeQ ID NO 5, o SEQ ID NO 6, o tiene al menos el 50 %, 60%, 70%, 80% o 90% de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO 5, o SEQ ID NO 6, o un fragmento biológicamente activo de la misma, tiene actividad condoprotectora.

6. El sistema de administración y expresión de la terapia génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el vector adenoviral dependiente del linfocitos T colaboradores comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica los inhibidores de los mediadores inflamatorios y destructivos del cartílago seleccionados del grupo formado por citoquinas, incluyendo II-1, TNFa, II-6, II-7 II-8, II-11, II-15, II-17, II-18, II-21, factor inhibidor de la leucemia (LIF), oncostatina M; metaloproteasas de matriz incluyendo MMP-1,3,9,13; agrecanasas incluyendo ADAMTS-1,4,5; receptores tipo toll (TLR) incluyendo TLR2, TLR4; y el factor nuclear 'potenciador-de-cada-ligerakappa' de las células B activadas (NF-^k B).

7. El sistema de administración y expresión de la terapia génica según la reivindicación 6, en el que el vector adenoviral dependiente del linfocitos T colaboradores comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica el antagonista del receptor de interleucina-1 (II-1 Ra).

8. El sistema de administración y expresión de la terapia génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el sistema de administración y expresión comprende un segundo vector adenoviral dependiente del linfocitos T colaboradores que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica los inhibidores de los mediadores inflamatorios y destructivos del cartílago seleccionados del grupo formado por citoquinas, incluido II-1, TNFa, II-6, II-7 II-8, II-11, II-15, II-17, II-18, II-21, factor inhibidor de la leucemia (LIF), oncostatina M; metaloproteasas de matriz incluyendo MMP-1,3,9,13; agrecanasas incluyendo ADAMTS-1,4,5; receptores tipo toll (TLR) incluyendo TLR2, TLR4; y el factor nuclear 'potenciador-de-cada-ligera-kappa' de las células B activadas (NF-^k B).

9. El sistema de administración y expresión de la terapia génica según la reivindicación 8, en el que el sistema de administración y expresión comprende un segundo vector adenoviral dependiente del linfocitos T colaboradores que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el antagonista del receptor de interleucina-1 (II-1 Ra).

10. El sistema de administración y expresión de la terapia génica según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que la expresión del inhibidor de los mediadores inflamatorios y destructivos del cartílago está controlada por un promotor inducible por inflamación seleccionado del grupo formado por el promotor NF-^k B, el promotor de interleucina 6 (II-6), el promotor de interleucina-1 (II-1), el promotor del factor de necrosis tumoral (TNF), el promotor de la ciclooxigenasa 2 (COX-2), el promotor del factor de complemento 3 (C3), el promotor de amiloide sérico A3 (SAA3), el promotor de la proteína 1a inflamatoria de macrófagos (1) (MIP-1a), o construcciones híbridas de los anteriores.

11. El sistema de administración y expresión de la terapia génica según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que el vector adenoviral dependiente de linfocitos T cooperadores, que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el antagonista del receptor de interleucina-1 (II-1 Ra), comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de homología de secuencia con una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 7, o SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, o un fragmento biológicamente activo de la misma, en el que el vector adenoviral dependiente del linfocitos T colaboradores que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica II-1 Ra, que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de homología de secuencia con una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 7, o SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, o un fragmento biológicamente activo de la misma, tiene actividad II1 -Ra de inhibir mediadores inflamatorios y destructivos de cartílago.

12. El sistema de administración y expresión de terapia génica según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el antagonista del receptor de interleucina-1 (II-1 Ra) comprende una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 10, o SEQ ID NO 11, o SEQ ID No 12, o un fragmento biológicamente activo de la misma, o en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el antagonista del receptor de interleucina-1 (II-1 Ra) comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de homología de secuencia con una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 10, o SEQ ID NO 11, o SEQ ID NO 12, o un fragmento biológicamente activo de la misma, en el que el II-1 Ra codificado por el fragmento biológicamente activo de SEQ ID NO 10, o SEQ ID NO 11, o SEQ ID NO 12, o la secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de homología de secuencia con una secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO 10, o SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, o su fragmento biológicamente activo, media la actividad II1 -Ra de inhibir los mediadores inflamatorios y destructivos del cartílago.

13. El sistema de administración y expresión de la terapia génica según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en el que la secuencia de aminoácidos del antagonista del receptor de interleucina-1 (II-1 Ra) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, o un fragmento biológicamente activo de la misma, que tiene actividad de Il-1 Ra de inhibición de mediadores inflamatorios y destructivos del cartílago.

14. Una composición farmacéutica, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un vector adenoviral dependiente de linfocitos T colaboradores, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Un sistema de administración y expresión de terapia génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en la prevención y/o el tratamiento del síndrome de camptodactilia - artropatía - coxa vara - pericarditis (CACP), o un trastorno musculoesquelético, o un trastorno o enfermedad articular.

16. El sistema de administración y expresión de terapia génica para su uso según la reivindicación 15, en el que la enfermedad o el trastorno se seleccionan del grupo formado por artropatías, todos los tipos de artritis, incluyendo trastornos relacionados con la artritis, osteoartritis, artritis reumatoide, gota y pseudo-gota, artritis séptica, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Still, síndrome de Reiter, o tendinopatías incluyendo tendinitis, tendinosis, tenosinovitis; trastornos sinoviales incluyendo sinovitis; trastornos de la bolsa incluyendo bursitis; trastornos musculoesqueléticos equinos incluyendo esparaván óseo, síndrome de navicular, y callos.