KR102116378B1 - 척수성 근위축증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SMN을 발현하는 트랜스진(transgene)을 포함하는 자가-상보성 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 바이러스 입자를 이용하여 척수성 근위축증을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 한 양태에서, 바이러스 입자는 인간 대상체, 예를 들어, 소아 인간 대상체의 척주(spinal column) 또는 대수조(cisterna magna)에 투여된다. AAV9 캡시드를 포함하는 바이러스 입자가 고려된다.

Description

척수성 근위축증을 치료하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING SPINAL MUSCULAR ATROPHY}

본 발명은 척수성 근위축증을 치료하기 위한 AAV 벡터 및 AAV 벡터를 이용하는 방법에 관한 것이다.

척수성 근위축증(SMA)은 생존 운동 신경세포 1(SMN1) 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기되는 보통염색체 열성 신경근육 장애이다. 인코딩된 294개의 아미노산의 SMN 단백질에서 발생된 결핍은 광범위한 질병 특징 제시의 원인이 된다. 이들은 척수 내의 운동 신경세포의 변성으로부터 발생하는 진행성 근육 약화 및 위축증, 호흡 기능부전 및 조기 사망을 포함한다. 질병 중증도는 약 10 내지 20% 기능성 SMN의 생성을 유도하는 패럴로그(paralogue) 유전자인 SMN2의 능력에 의해 상기 보조 유전자의 카피수와 역으로 상관된다.

상기 질병의 근원적인 분자적 기초에 대한 현재의 이해를 기반으로 하여, 더 많은 질병에 걸리기 쉬운 세포에서 기능성 SMN의 수준을 증가시키는 것을 목적으로 하는 다수의 치료 전략이 고려되고 있다.

그러나, 상기 치료 전략의 개발에도 불구하고, 상기 개념의 임상적 효능으로의 성공적인 변환은 어려운 것으로 남아있다. 따라서, 인간 환자에서 척수성 근위축증을 치료하기 위한 추가 조성물 및 방법을 추가로 개발할 필요가 있다.
[배경기술이 개시된 선행기술문헌]
미국 특허공보 제5,328,470호 (공개일: 1994. 7. 12.)
미국 특허공보 제6,556,118호 (공개일: 2003. 5. 20.)
미국 특허공보 제6,596,535호 (공개일: 2003. 7. 22.)
미국 특허공보 제6,989,264호 (공개일: 2006. 1. 24.)
미국 특허공보 제6,995,006호 (공개일: 2006. 2. 7.)
미국 특허공보 제7,125,717호 (공개일: 2006. 10. 24.)
미국 특허공보 제7,765,583호 (공개일: 2010. 7. 27.)
미국 특허공보 제7,785,888호 (공개일: 2010. 8. 31.)
미국 특허공보 제7,790,154호 (공개일: 2010. 9. 7.)
미국 특허공보 제7,846,729호 (공개일: 2010. 12. 7.)
미국 특허공보 제8,093,054호 (공개일: 2012. 1. 10.)
미국 특허공보 제8,361,457호 (공개일: 2013. 1. 29.)
국제출원 공개공보 제WO 03/004660호 (공개일: 2003. 1. 16.)
국제출원 공개공보 제WO 2006/119341호 (공개일: 2006. 11. 9.)
국제출원 공개공보 제WO 2007/146046호 (공개일: 2007. 12. 21.)
국제출원 공개공보 제WO 2009/013290호 (공개일: 2009. 1. 29.)
국제출원 공개공보 제WO 2010/071832호 (공개일: 2010. 6. 24.)
국제출원 공개공보 제WO 2010/129021호 (공개일: 2010. 11. 11.)

일부 양태에서, 본 발명은 영장류의 척수 및/또는 대수조(cisterna magna)에 적어도 1 × 10¹²의 유전체 카피의 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함하는, 영장류에서 척수성 근위축증을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

일부 양태에서, 본 발명은 영장류의 척수 및/또는 대수조에 적어도 1 × 10¹²의 유전체 카피의 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함하는, 영장류에서 척수성 근위축증의 증상을 개선하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 척수성 근위축증의 증상은 근육 쇠약, 운동 이정표(motor milestone) 달성 불능, 착석 불능, 보행 불능, 마비, 호흡기 장애, 구기능 부전, 운동 신경세포 소실 및 신경근육 이음부 병리 중 하나 이상이다.

일부 양태에서, 본 발명은 영장류의 척수 및/또는 대수조에 적어도 1 × 10¹²의 유전체 카피의 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함하는, 영장류의 운동 신경세포 내에 영장류 SMN을 인코딩하는 이종성 트랜스진(transgene)을 전달하기 위한 방법을 제공한다.

상기 양태의 일부 구현예에서, 척수의 허리, 가슴 및 목 부위 내의 운동 신경세포의 적어도 10 내지 30%가 형질도입된다. 일부 구현예에서, 척수 전체에 걸친 운동 신경세포의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 100% 중 대략 어느 하나의 초과가 형질도입된다. 일부 구현예에서, SMN 야생형 수준의 적어도 30%가 척수 전체에 걸쳐 발생된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 영장류 SMN을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 AAV 바이러스 입자의 척수 및/또는 대수조로의 투여는 정상 개체에서의 SMN 발현 수준의 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 대략 어느 하나 이상의 발현을 초래한다.

상기 양태의 일부 구현예에서, rAAV는 척수로의 직접 주사, 수막강내 주사, 또는 수조내 주사를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV는 척수 또는 대수조의 하나 초과의 위치에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV는 척수의 하나 초과의 위치에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV는 척수의 허리 거미막밑(subarachnoid) 공간, 가슴 거미막밑 공간 및 목 거미막밑 공간 중 하나 이상에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV는 대수조에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV의 다수의 주사가 동시에 또는 순차적으로 주사된다. 일부 구현예에서, 순차적 주사는 서로 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간 또는 24시간 내이다.

상기 양태의 일부 구현예에서, 체중 ㎏ 당 적어도 3.5 × 10¹¹의 유전체 카피의 rAAV가 영장류에 투여된다. 추가 구현예에서, 체중 ㎏ 당 적어도 3.5 × 10¹²의 유전체 카피의 rAAV가 영장류에 투여된다. 일부 구현예에서, 체중 ㎏ 당 적어도 5 × 10¹²의 유전체 카피의 rAAV가 영장류에 투여된다. 추가 구현예에서, 체중 ㎏ 당 적어도 5 × 10¹³의 유전체 카피의 AAV가 영장류에 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 2.5 × 10¹²의 유전체 카피가 영장류에 투여된다. 다른 구현예에서, 적어도 1.25 × 10¹³의 유전체 카피가 영장류에 투여된다.

상기 양태의 일부 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, 또는 AAV12 혈청형 캡시드를 포함한다. 추가 구현예에서, rAAV 바이러스 입자는 AAV 혈청형 9 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자는 클레이드(Clade) A 내지 F로부터의 AAV 혈청형 캡시드를 포함한다.

상기 양태의 일부 구현예에서, 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, 또는 AAV12 혈청형 역방위 말단 반복(ITR)을 포함한다. 추가 구현예에서, 벡터는 AAV 혈청형 2 ITR을 포함한다. 다른 구현예에서, rAAV 바이러스 입자는 클레이드 A 내지 F로부터의 AAV 혈청형 캡시드를 포함한다. 추가 구현예에서, ITR 및 캡시드는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, ITR 및 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 본 발명의 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자는 AAV-9 캡시드를 포함하며, 벡터는 AAV2 ITR을 포함한다.

상기 양태의 일부 구현예에서, 벡터는 셀프-컴플리멘팅(self-complimenting) 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 SMN-1 트랜스진을 인코딩하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 및 SMN-1 트랜스진의 상보체를 인코딩하는 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 이의 길이 대부분 또는 전체를 따라 제2 폴리뉴클레오티드 서열과 사슬내 염기쌍을 형성할 수 있다. 추가 구현예에서, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 및 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되고, 상기 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열(terminal resolution sequence)의 돌연변이를 포함한다.

상기 양태의 일부 구현예에서, SMN-1 트랜스진은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 추가 구현예에서, 프로모터는 척수의 신경세포에서 SMN-1 트랜스진을 발현시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 프로모터는 척수의 운동 신경세포에서 SMN-1 트랜스진을 발현시킬 수 있다. 또 다른 추가 구현예에서, 프로모터는 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터 또는 닭 β-액틴 프로모터에 연결된 사이토메갈로바이러스 인핸서를 포함한다.

상기 양태의 일부 구현예에서, SMN-1 트랜스진은 인간 SMN-1 트랜스진이다. 추가 구현예에서, SMN은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, AAV 바이러스 입자는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 재조합 바이러스 유전체를 포함한다.

상기 양태의 일부 구현예에서, 영장류는 인간이다. 추가 구현예에서, 인간은 소아 대상체이다. 다른 구현예에서, 인간은 청년이다. 일부 구현예에서, 인간은 척수성 근위축증을 갖는다. 일부 구현예에서, 영장류는 내인성 SMN-1 유전자 내에 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 영장류는 내인성 SMN1 유전자의 부분적 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, 영장류는 내인성 SMN-1 유전자의 완전한 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, 영장류의 척수 또는 뇌에서의 돌연변이 SMN-1 유전자의 발현은 야생형 SMN-1 유전자를 갖는 영장류에서의 SMN-1의 발현에 비해 불충분하다.

상기 양태의 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자는 약학적 조성물 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.

본원에 기재된 다양한 구현예의 특성 중 하나, 일부, 또는 전체는 본 발명의 다른 구현예를 형성하기 위해 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에 제시되고 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 명백해질 것이며, 이들은 첨부된 청구항의 범위 내에 해당한다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적상 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.

도 1은 SMN 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)을 제시한다.
도 2는 hSMN1의 비-최적화된 핵산 서열(SEQ ID NO:2)을 제시한다.
도 3은 hSMN1의 최적화된 핵산 서열(SEQ ID NO:3)을 제시한다.
도 4는 hSMN1의 최적화된 핵산 서열(SEQ ID NO:4)을 제시한다.
도 5는 pscAAV-GUSB hSMN1의 플라스미드 맵을 제시한다.
도 6은 pscAAV-GUSB hSMN1에 대한 핵산 서열(SEQ ID NO:5)을 제시한다.
도 7은 pscAAV-minCBA hSMN1의 플라스미드 맵을 제시한다.
도 8은 pscAAV-minCBA hSMN1에 대한 핵산 서열(SEQ ID NO:6)을 제시한다.
도 9는 SMA 마우스에서의 SMN 수준 및 효능에 대한 바이러스 용량의 효과를 나타내는 일련의 그래프를 제시한다. a) 허리, 가슴, 및 목 부위로부터의 조직 균질액의 웨스턴 블롯 분석은 가장 높은 용량이 가장 큰 수준의 SMN을 생성하는 용량 반응을 나타내었다. b) 동결된 조직 절편에 대한 hSMN 및 운동 신경세포 마커인 ChAT의 공동-국소화 연구는 허리 및 가슴 분절에서의 운동 신경세포 형질도입의 효율의 결정을 가능케 하였다. 그러나, 목척수에서 인지된 용량과 관계 없는 낮은 수준의 hSMN은 상기 부위에서의 운동 신경세포 형질도입을 스코어링하는 것을 배제시켰다. c) 3개 모두의 척수 부위에 대한 반구 당 운동 신경세포(ChAT-양성)의 수. d) 사두, 늑간, 및 횡경막으로부터의 근섬유의 평균 단면적. 통계 *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
도 10은 SMA 마우스에서의 운동 신경세포의 scAAV9-hSMN1-매개 형질도입의 효율을 나타내는 일련의 면역조직화학 이미지를 제시한다. 허리 부위의 복측각 내의 세포의 부분집합이 SMN에 대해 양성으로 염색되었고(좌측 컬럼), 병합된 그림(우측 컬럼)에 의해 표시되는 바와 같이 ChAT에 대해 양성으로 또한 염색된 세포에서 공동 국소화되었다(중간 컬럼). A) 5e10 유전체 카피(gc)로 처리된 동물로부터의 절편, B) 1e10 gc 및 C) 1e9 gc. D) 미처리된 SMA 마우스는 검출가능한 수준의 SMN 면역-양성 세포를 함유하지 않았다. 축척 막대, 0.25 ㎜.
도 11은 SMA 마우스에서의 운동 기능 및 생존에 대한 바이러스 용량의 효과를 제시한다. 주사 후 14일(좌측 컬럼) 및 175일(우측 컬럼)에서의 A) 악력, B) 직립 반사, 및 C) 체중의 측정을 나타내는 그래프. D) 카플란-마이어 생존 곡선(Kaplan-Meier survival curve)은 각각 5e10 gc(n=20), 1e10 gc(n=23), 1e9 gc(n=16)의 scAAV9-hSMN1의 용량으로 처리된 SMA 마우스에 대한 153일(P<0.0001), 70일(P<0.0001), 및 18일(P>0.05)의 정중 생존을 나타내었다. 일치된 부피의 염수로 처리된 대조군 SMA 마우스(n=21)는 17일의 정중 생존을 초래하였다. 통계: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
도 12는 소아 농장 돼지로의 scAAV9-eGFP의 수막강내 전달을 제시한다. A) 염수 또는 scAAV9-eGFP를 이용한 처리 35일 후, 돼지 척수를 완전히 절개하고, 각각의 분절을 확인하였다. B) 염수 처리된 돼지로부터의 허리 분절 2(L2)의 분석은 GFP 발현이 없는 것을 나타내었다. C 및 D) 대조적으로, scAAV9-eGFP 처리된 돼지는 C) L2 및 D) 목 분절 8(C8)에 의해 예시되는 바와 같이 복측각 내에서 GFP의 강한 발현을 나타내었다. E 내지 G) ChAT를 이용한 이중 IHC 염색은 E) C8, F) 가슴 분절 8(T8), 및 G) L2에서 ChAT 신호와 함께 GFP의 공동 국소화를 나타내었다. H) 척수의 문미측 축(rostro-caudal axis)에 따른 이중 표지된 세포의 포괄적 분석은 상기 분절 중 많은 분절이 10 내지 30%의 운동 신경세포 형질도입을 갖는 것을 나타내었다. 축척 막대: 0.2 ㎜ (B 내지 D), 0.1 ㎜ (E 내지 G).
도 13은 소아 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)로의 scAAV9-eGFP의 수막강내 전달을 제시한다. a) 염수가 투여된 동물로부터의 동결 조직 절편의 분석은 검출가능한 GFP 염색을 발생시키지 않았다. 대조적으로, scAAV9-eGFP의 b) 대수조 및 허리 주사의 조합 또는 c) 대수조 단독 주사로 처리된 원숭이는 허리 분절 6의 복측각에서 강한 GFP 염색을 초래하였다. d) GFP 및 e) ChAT에 대한 이중 IHC는 L6의 복측각의 광범위한 세포체에서 신호의 강한 공동 국소화를 나타내었다. (g 내지 j) 대수조 및 허리 주사의 조합 또는 (k 내지 n) 대수조 단독 주사가 제공된 원숭이의 (g 및 k) 목 분절 6, (h 및 l) 가슴 분절 3, (i 및 m) 가슴 분절 1, 및 (j 및 n) 천골 분절 2에 의해 입증되는 바와 같이 척수의 복측각 전체에 걸쳐 강한 GFP 발현이 관찰되었다. o) 광범위 정량은 대수조 주사 단독에 의해 처리된 원숭이에서 15 내지 50%의 운동 신경세포 형질도입 효율을 나타내었다. p) 이 값은 대수조 및 허리 주사의 조합으로 처리된 동물에서 더 컸으며, 이는 25 내지 75%의 운동 신경세포 형질도입률을 나타내었다. 축척 막대: 0.5 ㎜ (a 내지 f), 0.1 ㎜ (h 내지 n).
도 14는 원숭이로의 scAAV9-eGFP의 수막강내 전달이 후근절 및 뇌의 형질도입을 초래하였음을 보여준다. (A 내지 C) 대수조 및 허리 주사의 조합 또는 (D 내지 F) 대수조 단독에 의해 처리된 동물로부터의 (A, D) 목의 후근절, (B, E) 가슴, 및 (C, F) 허리 분절이 제시된다. (G, H) 양성 GFP 면역-염색이 또한 특히 대뇌피질 및 소뇌에서 둘 모두의 처리 그룹의 뇌에서 관찰되었다. G 내지 I) (G) 조합 프로토콜에 의해 처리된 원숭이의 대뇌피질 및 (H) 대수조 단독에 의해 처리된 원숭이의 소뇌에서의 GFP 발현을 나타내는 대표적 샘플. I) 염수 처리된 원숭이는 GFP 발현에 대해 음성이었다. 축척 막대: 0.5 ㎜ (A 내지 F), 0.25 ㎜ (G 내지 I).

본 발명은 특히 대상체에서 척수성 근위축증을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 방법은 척수 및/또는 대수조로의 SMN을 인코딩하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터의 전달(예를 들어, 수막강내 전달)을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, AAV 벡터는 치료 트랜스진의 효과적인 발현을 위한 자가-상보성 벡터이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 근육 쇠약, 마비, 호흡기 장애, 운동 신경세포 소실 및 신경근육 이음부 병리를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 척수성 근위축증의 하나 이상의 증상을 개선한다.

I. 일반 기술

본원에 기재되거나 참조된 기술 및 절차는 당업자에 의한 통상적인 방법, 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6^th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)]에 기재된 널리 이용되는 방법을 이용하여 전반적으로 잘 이해되고 일반적으로 이용된다.

II. 정의

본원에서 사용되는 "벡터"는 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포로 전달되는 핵산을 포함하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스를 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 리보뉴클레오티드이거나 데옥시리보뉴클레오티드든 간에 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합 형태를 나타낸다. 따라서, 상기 용어는 단일-가닥, 이중-가닥 또는 다중-가닥의 DNA 또는 RNA, 유전체 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함하는 중합체, 또는 다른 천연이거나, 화학적 또는 생화학적으로 변형되거나, 비-천연이거나, 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드의 백본은 당 및 포스페이트 기(통상적으로 RNA 또는 DNA에서 발견될 수 있음), 또는 변형되거나 치환된 당 또는 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 백본은 합성 서브유닛의 중합체, 예를 들어, 포스포라미데이트를 포함할 수 있고, 따라서 이는 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포라미데이트(P-NH₂) 또는 혼합된 포스포라미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 또한, 적절한 조건하에서 상보적 가닥을 합성하고 상기 가닥을 어닐링시키거나, 적절한 프라이머와 함께 DNA 중합효소를 이용하여 새로이 상보적 가닥을 합성함으로써 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 생성물로부터 이중-가닥 폴리뉴클레오티드가 수득될 수 있다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용되며, 이는 최소 길이로 제한되지 않는다. 이러한 아미노산 잔기의 중합체는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있으며, 아미노산 잔기의 펩티드, 올리고펩티드, 이합체, 삼합체, 및 다합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 전장 단백질 및 이의 단편 둘 모두가 상기 정의에 포함된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변형, 예를 들어, 당화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적상, "폴리펩티드"는 단백질이 요망되는 활성을 유지하는 한 네이티브 서열에 대한 결실, 첨가, 및 치환(일반적으로 사실상 보존성 치환)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 나타낸다. 이들 변형은 부위-특이적 돌연변이유발을 통하는 바와 같이 계획적인 것일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류와 같이 우발적인 것일 수 있다.

"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종성 서열(즉, 바이러스 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터를 나타낸다. 재조합 AAV 벡터의 경우에서, 재조합 핵산은 적어도 1개, 바람직하게는 2개의 역방위 말단 반복 서열(ITR)과 측면을 접한다.

"재조합 AAV 벡터(rAAV 벡터)"는 적어도 1개, 바람직하게는 2개의 AAV 역방위 말단 반복 서열(ITR)과 측면을 접한 하나 이상의 이종성 서열(즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 나타낸다. 이러한 rAAV 벡터는 적합한 헬퍼 바이러스로 감염되고(또는 적합한 헬퍼 기능을 발현하고), AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포에 제공되는 경우 복제되고 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오티드 내(예를 들어, 염색체 또는 클로닝 또는 트랜스펙션에 사용되는 플라스미드와 같은 또 다른 벡터 내)로 통합되는 경우, rAAV 벡터는 AAV 패키징 기능 및 적합한 헬퍼 기능의 존재하에서 복제 및 캡시드화에 의해 "구제"될 수 있는 "프로-벡터(pro-vector)"로 언급될 수 있다. rAAV 벡터는 플라스미드, 선형 인공 염색체, 지질과의 복합체화, 리포솜 내의 캡슐화 및 가장 바람직하게는 바이러스 입자, 특히 AAV 입자 내의 캡시드화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다수의 형태 중 임의의 형태일 수 있다. rAAV 벡터는 AAV 바이러스 캡시드로 패키징되어 "재조합 아데노-관련 바이러스 입자(rAAV 입자)"를 생성할 수 있다.

"이종성"은 비교되거나, 도입되거나 통합되는 존재물의 나머지의 것과 유전형적으로 별개의 존재물로부터 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 상이한 세포 유형으로 도입된 폴리뉴클레오티드가 이종성 폴리뉴클레오티드이다(그리고, 발현되는 경우 이종성 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다). 유사하게, 바이러스 벡터로 통합되는 세포 서열(예를 들어, 유전자 또는 이의 일부)은 벡터와 관련하여 이종성 뉴클레오티드 서열이다.

용어 "트랜스진"은 세포로 도입되고, RNA로 전사될 수 있고, 임의로 적절한 조건하에서 번역되고/되거나 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 양태들에서, 이는 도입된 세포에 요망되는 특성을 제공하거나, 그렇지 않으면 요망되는 치료 또는 진단 결과를 초래한다. 또 다른 양태에서, 이는 RNA 간섭을 매개하는 분자, 예를 들어, siRNA로 전사될 수 있다.

바이러스 역가와 관련하여 사용되는 용어 "유전체 입자(gp)", "유전체 등가물" 또는 "유전체 카피"는 감염력 또는 기능성과 관계 없이 재조합 AAV DNA 유전체를 함유하는 비리온의 수를 나타낸다. 특정 벡터 제조물 내의 유전체 입자의 수는 본원에 실시예에 기재되거나, 예를 들어, 문헌[Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol . Ther., 6:272-278]에 기재된 바와 같은 절차에 의해 측정될 수 있다.

바이러스 역가와 관련하여 사용되는 용어 "감염 단위(iu)", "감염성 입자" 또는 "복제 단위"는, 예를 들어, 문헌[McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973]에 기재된 바와 같은 복제 센터 검정으로도 공지된 감염 센터 검정에 의해 측정되는 감염성 및 복제-적격 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 나타낸다.

바이러스 역가와 관련하여 사용되는 용어 "형질도입 단위(tu)"는 본원의 실시예에 기재되거나, 예를 들어, 문헌[Xiao et al. (1997) Exp . Neurobiol., 144:113-124] 또는 문헌[Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532](LFU 검정)에 기재된 것과 같은 기능성 검정으로 측정되는 기능성 트랜스진 생성물의 생성을 초래하는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 나타낸다.

"역방위 말단 반복" 또는 "ITR" 서열은 당 분야에서 널리 이해된 용어이며, 이는 반대 배향으로 존재하는 바이러스 유전체의 말단에서 발견되는 비교적 짧은 서열을 나타낸다.

당 분야에 널리 이해된 용어인 "AAV 역방위 말단 반복(ITR)" 서열은 네이티브 단일-가닥 AAV 유전체의 양 말단에 존재하는 약 145개의 뉴클레오티드 서열이다. ITR의 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오티드에 2개의 택일적 배향 중 어느 하나가 존재하여, 다양한 AAV 유전체 사이 및 단일 AAV 유전체의 2개의 말단 사이에 이종성이 발생할 수 있다. 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오티드는 또한 자가-상보성의 여러 더 짧은 영역(A, A', B, B', C, C' 및 D 영역으로 명명됨)을 함유하여, ITR의 상기 부분 내에서 사슬내 염기쌍이 형성되도록 한다.

"말단 분해 서열" 또는 "trs"는 바이러스 DNA 복제 동안 AAV rep 단백질에 의해 분해되는 AAV ITR의 D 영역 내의 서열이다. 돌연변이 말단 분해 서열은 AAV rep 단백질에 의해 잘 분해되지 않는다.

AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 AAV(결손 파르보바이러스임)가 숙주 세포에 의해 복제되고 패키징되는 것을 가능케 하는 바이러스를 나타낸다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스, 예를 들어, 우두를 포함하는 다수의 상기 헬퍼 바이러스가 확인되었다. 아데노바이러스는 다수의 상이한 하위그룹을 포함하나, 하위그룹 C의 아데노바이러스 타입 5(Ad5)가 가장 일반적으로 사용된다. 인간, 비-인간 포유동물 및 조류 기원의 다수의 아데노바이러스가 공지되어 있으며, ATCC와 같은 수탁기관으로부터 이용가능하다. ATCC와 같은 수탁기관으로부터 또한 이용가능한 헤르페스 패밀리의 바이러스는, 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 거짓광견병 바이러스(PRV)를 포함한다.

참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열과 관련된 "서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬시키고, 필요시 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 갭을 도입시키고, 서열 동열성의 부분으로서 임의의 보존성 치환을 고려하지 않은 후의 참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로 정의된다. 예를 들어, 아미노산 또는 핵산 서열 동일성 퍼센트를 결정하는 목적의 정렬은, 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 것과 같고 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 포함하는 공적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이용하여 당 분야의 기술 범위 내인 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, Pennsylvania)이다. 당업자는 정렬을 측정하기 위해 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원의 목적상, 제공된 아미노산 서열 B에 대하거나, 이와 비교하거나, 이와 대비한 제공된 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(대안적으로 제공된 아미노산 서열 B에 대하거나, 이와 비교하거나, 이와 대비한 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 이를 포함하는 제공된 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)는 100 ×분수 X/Y로 계산되며, 여기서 X는 A 및 B의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일하게 일치된 것으로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않은 것이 인지될 것이다. 본원의 목적상, 제공된 핵산 서열 D에 대하거나, 이와 비교하거나, 이와 대비한 제공된 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 %(대안적으로 제공된 핵산 서열 D에 대하거나, 이와 비교하거나, 이와 대비한 특정 핵산 서열 동일성 %를 갖거나 이를 포함하는 제공된 핵산 서열 C로 표현될 수 있음)는 100 ×분수 W/Z로 계산되며, 여기서 W는 C 및 D의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일하게 일치된 것으로 스코어링된 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D의 뉴클레오티드의 전체 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 %는 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 %와 동일하지 않은 것이 인지될 것이다.

"분리된" 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질) 또는 세포는 확인되고, 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리되고/되거나 회수된 것을 의미한다.

"유효량"은 임상 결과를 포함하는 유리하거나 요망되는 결과(예를 들어, 증상의 개선, 임상 종점의 달성 등)를 초래하기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 질병 상태와 관련하여, 유효량은 질병을 개선하거나, 안정화시키거나, 질병의 발생을 지연시키기에 충분한 양이다.

"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.

본원에서 사용되는 "치료"는 이롭거나 요망되는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 이롭거나 요망되는 임상 결과는 검출 가능하거나 검출 가능하지 않건 간에 증상의 경감, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(예를 들어, 악화되지 않는) 상태, 질병의 확산(예를 들어, 전이) 방지, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정(부분적 또는 전체적)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "치료"는 또한 치료가 제공되지 않는 경우의 예상 생존에 비해 연장된 생존을 의미할 수 있다.

본원에서 어떤 값 또는 파라미터에서 "약"에 대한 언급은 상기 값 또는 파리미터 자체에 대한 구현예를 포함한다(그리고 기재한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.

본원에서 사용되는 항목의 단수 형태는 달리 표시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 구 "rAAV 입자"는 하나 이상의 rAAV 입자를 포함한다.

본원에 기재된 본 발명의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하고/하거나", 이들로 "구성되고/되거나", 이들로 "필수적으로 구성하는" 것을 포함하는 것이 이해된다.

III. 척수성 근위축증을 치료하는 방법

일부 양태에서, 본 발명은 영장류의 척수 및/또는 대수조에 유효량의 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 rAAV 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함하는, 영장류에서 척수성 근위축증(SMA)을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 방법은 척수성 근위축증과 관련된 병리를 개선하기 위해 SMA를 갖는 인간, 예를 들어, 소아 대상체를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 AAV 혈청형 9 캡시드(AAV9 캡시드) 및 AAV2 역방위 말단 반복을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 바이러스 형질도입시 운동 신경세포에서의 트랜스진의 효과적인 발현을 위해 재조합 자가-상보성 벡터 유전체를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 1 × 10¹²의 유전체 카피가 영장류에 투여된다.

일부 양태에서, 본 발명은 영장류의 척수 및/또는 대수조에 유효량의 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 rAAV 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함하는, SMA의 증상을 개선하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, SMA의 증상은 근육 쇠약, 마비, 구기능 및 호흡기 장애, 운동 신경세포 소실 및 신경근육 이음부 병리를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 상기 방법은 SMA를 갖는 인간, 예를 들어, SMA를 갖는 소아 대상체에서 하나 이상의 증상을 개선하기 위해 이용될 수 있다. SMA의 증상의 개선은 개선된 운동 근육 활동 전위, 달성된 이정표(milestone), 감소된 환기 의존성, 증가된 삶의 질 및 수명에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 개선은 환기 및 기침 보조 기계(cough assistance machine), 또는 영양관의 사용에 대한 의존성 감소에 의해 측정될 수 있다. 개선은 또한 육안 운동 기능, 예를 들어, 도움 없이 앉음, 머리가누기 및 보행 능력에 의해 측정될 수 있다. 단독이거나 조합된 운동 단위수 측정(MUNE)의 증가, 복합 운동 활동 전위(CMAP)의 개선, 햄머스미스 기능 운동 스코어(Hammersmith functional motor score)(HFMS)의 증가, 폐 기능 시험(FVC)의 개선, 및 MRI 영상화를 이용한 육안 근육 생리기능의 개선이 치료 효능을 나타낸다. 이정표는 본 발명의 처리 전의 대상체와 관련하여, 또는 처리되지 않은 그룹 또는 과거 기록과 비교하여 측정될 수 있다.

본 발명의 일부 양태에서, 상기 방법 및 조성물은 SMA를 갖는 인간의 치료를 위해 사용된다. SMA는 SMN 단백질을 인코딩하는 SMN1 유전자 내의 돌연변이에 의해 야기될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 SMN1 유전자 및/또는 SMN 단백질 내에 돌연변이를 갖는 인간을 치료하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 운동 신경세포에서의 기능성 SMN의 발현은 SMA가 없는 인간의 운동 신경세포에서의 SMN의 발현에 비해 불충분하다. 일부 구현예에서, SMN의 발현은 뇌 및/또는 척수의 운동 신경세포에서 불충분하다.

대상체에서 SMN2의 발현과 관련된 질병 중증도와 관련하여 SMA의 3개 유형이 존재한다. 타입 I SMA는 조기 발생(6개월령 미만, 통상적으로 3세 미만에서 사망) 및 1 내지 2의 SMN2 카피수를 특징으로 한다. 타입 I SMA 대상체는 앉는 능력을 달성하지 못하고, 호흡 및 구기능 부전을 갖는다. 타입 II SMA 발생은 통상적으로 6 내지 18개월령 사이이고, 통상적으로 30 내지 40세 미만에서 사망한다. 타입 II SMA는 통상적으로 2 내지 3의 SMN2 카피수와 관련된다. 타입 II 대상체는 보행 능력을 달성하지 못하고, 결국 호흡기 장애로 사망한다. 타입 III SMA 발생은 통상적으로 18개월령 초과이고, 60세 초과에서 사망한다. 타입 III SMA는 3 내지 4의 SMN2 카피수와 관련된다. 타입 III 환자는 종종 10대까지 휠체어에 구속되며, 호흡기 장애를 갖지 않는다.

일부 구현예에서, 본 발명은 타입 I SMA를 갖는 인간을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 타입 II SMA를 갖는 인간을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 타입 III SMA를 갖는 인간을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 타입 I 또는 타입 II SMA를 갖는 인간을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 타입 II 또는 타입 III SMA를 갖는 인간을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 인간을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 인간은 1 내지 2, 2 내지 3 또는 3 내지 4의 smn2 카피수를 갖는다.

SMN2 mRNA는 NM_017411.3, NM_022875.2, NM_022876.2, 및 NM_022877.2로 구성된 군으로부터 선택된 NCBI RefSeq 번호에 의해 확인될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명은 SMA를 갖는 소아 인간 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 소아 인간 대상체는 2개월령, 3개월령, 4개월령, 5개월령, 6개월령, 7개월령, 8개월령, 9개월령, 10개월령, 11개월령, 12개월령, 13개월령, 14개월령, 15개월령, 16개월령, 17개월령, 18개월령, 1세, 2세, 3세, 4세, 5세, 6세, 7세, 8세, 9세, 10세, 11세, 12세, 13세, 14세, 15세, 16세, 17세, 18세 중 어느 하나 미만이다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 18세 초과이다.

일부 양태에서, 본 발명은 영장류의 척수 또는 대수조에 유효량의 영장류 SMN1 트랜스진을 인코딩하는 벡터를 포함하는 rAAV 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함하는, 영장류의 운동 신경세포 내에 영장류 SMN을 인코딩하는 이종성 트랜스진을 전달하기 위한 방법을 제공한다. 상기 투여는 운동 신경세포의 세포 환경으로 트랜스진 생성물을 전달하며, 여기서 SMN은 세포 및 주위 세포에 대한 이로운 효과를 매개한다. 일부 구현예에서, 운동 신경세포는 영장류의 척수 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 인간의 척수 내에 존재하는 운동 신경세포로 인간 SMN을 발현하는 트랜스진을 전달하기 위한 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 유효량의 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 rAAV 바이러스 입자의 척수 및/또는 대수조로의 투여는 척추동물 투여 섹션 부위의 운동 신경세포를 형질도입시킨다. 일부 구현예에서, 운동 신경세포의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 100% 중 대략 어느 하나의 초과가 형질도입된다. 일부 구현예에서, 척수 전체에 걸친(예를 들어, 허리, 가슴, 및 목 부위 전체에 걸친) 운동 신경세포의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 100% 중 대략 어느 하나의 초과가 형질도입된다. SMN을 발현하는 AAV에 의해 형질도입된 운동 신경세포를 확인하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 항-SMN 항체를 이용하여 SMN의 발현을 검출하기 위해 면역조직화학이 이용될 수 있고, 운동 신경세포는 항-콜린 아세틸 트랜스페라제(ChAT) 항체를 이용하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 운동 신경세포의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 100% 중 대략 어느 하나의 초과가 SMA의 동물 모델, 예를 들어, SMA의 마우스 모델, 또는 비인간 영장류에서 형질도입된다.

일부 구현예에서, 영장류의 척수 및/또는 대수조로의 유효량의 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 AAV 바이러스 입자의 투여 후의 운동 신경세포의 형질도입은 SMN의 발현을 초래하여 SMA를 갖는 영장류에게 이익을 제공한다. 예를 들어, 척수에서 야생형 수준의 20 내지 30%로 SMN 수준을 재구성시키는 것은 SMA의 마우스 모델에서 일부 수준의 치료 이익을 제공하기에 충분하다. 본 발명의 일부 구현예에서, 영장류 SMN을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 AAV 바이러스 입자의 척수 및/또는 대수조로의 투여는 정상 개체에서의 SMN 발현 수준의 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 중 대략 어느 하나 이상의 발현을 초래한다. SMN의 발현을 측정하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 항-SMN 항체를 이용한다. 예를 들어, SMN의 발현은 SMA의 마우스 모델에서 측정될 수 있다.

본 발명의 일부 구현예에서, 상기 방법은 SMA를 갖는 영장류, 예를 들어, 인간을 치료하기 위해 유효량의 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 AAV 바이러스 입자를 영장류의 척수 및/또는 대수조에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 척수 및/또는 대수조 내의 하나 이상의 수막강내 공간에 주사되어 운동 신경세포에서의 SMN의 발현을 가능케 한다. 일부 구현예에서, 조성물은 대수조에 주사된다. 일부 구현예에서, 조성물은 척수의 목, 가슴, 허리 또는 천골 부위 내의 하나 이상의 위치의 척주(spinal column)의 거미막밑 공간으로 주사된다. 일부 구현예에서, 조성물은 척수의 거미막밑 공간 내의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 초과의 위치 중 어느 하나로 주사된다. 일부 구현예에서, 조성물은 대수조 및 척수로 주사된다. 일부 구현예에서, 조성물은 대수조 및 척수의 거미막밑 공간 내의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 초과의 위치 중 어느 하나로 주사된다. 일부 구현예에서, 조성물은 당 분야에 공지된 수막강내 주사를 위해 카테터 또는 다른 장치를 이용하여 척수의 거미막밑 공간으로 주사된다.

일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자는 동시에 또는 순차적으로 하나 초과의 위치에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 다수의 주사는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 9시간, 12시간 또는 24시간 이하의 간격으로 주사된다.

인간 뇌 구조는 또 다른 포유동물의 뇌 내의 유사한 구조와 관련될 수 있다. 인간 및 설치류를 포함하는 대부분의 포유동물은 가쪽 및 내측 내후각피질 둘 모두의 가쪽 부분 내의 뉴런이 해마의 등쪽 부분 또는 중격 극으로 돌출되는 반면, 배쪽 해마로의 돌출은 주로 내후각피질의 내측 부분 내의 신경세포로부터 유래되는 유사한 외피 해마 돌출의 국소해부학적 조직을 나타낸다(Principles of Neural Science, 4th ed., eds Kandel et al., McGraw Hill, 1991; The Rat Nervous System, 2nd ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995). 또한, 내후각피질의 층 II 세포는 치아 이랑으로 돌출되고, 이들은 치아 이랑의 분자층의 외부 2/3에서 끝난다. 층 III 세포로부터의 축삭은 해마의 암몬각(cornu ammonis) 영역 CA1 및 CA3로 양측으로 돌출되고, 이는 라쿠노스층(stratum lacunose) 분자층에서 끝난다. 또한, 당업자는 인간 뇌 내의 구조를 확인하는 방법을 용이하게 알 것이며, 예를 들어, 문헌[The Human Brain: Surface, Three Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply, 2nd ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela, 1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai et al., Academic Press; 1997; and Co Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3 Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack et al., Thyme Medical Pub., 1988]을 참조하도록 한다. 마우스 뇌 내의 구조의 확인을 위해, 예를 들어, 문헌[The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates, 2nd ed., Academic Press, 2000]을 참조하도록 한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 AAV 바이러스 입자를 영장류의 척수 및/또는 대수조에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 바이러스 역가는 5 × 10¹², 6 × 10¹², 7 × 10¹², 8 × 10¹², 9 × 10¹², 10 × 10¹², 11 × 10¹², 15 × 10¹², 20 × 10¹², 25 × 10¹², 30 × 10¹², 또는 50 × 10¹²의 유전체 카피/㎖ 중 대략 어느 하나의 이상이다. 일부 구현예에서, 조성물의 바이러스 역가는 5 × 10¹² 내지 6 × 10¹², 6 × 10¹² 내지 7 × 10¹², 7 × 10¹² 내지 8 × 10¹², 8 × 10¹² 내지 9 × 10¹², 9 × 10¹² 내지 10 × 10¹², 10 × 10¹² 내지 11 × 10¹², 11 × 10¹² 내지 15 × 10¹², 15 × 10¹² 내지 20 × 10¹², 20 × 10¹² 내지 25 × 10¹², 25 × 10¹² 내지 30 ×10¹², 30 × 10¹² 내지 50 × 10¹², 또는 50 × 10¹² 내지 100 × 10¹²의 유전체 카피/㎖ 중 대략 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 조성물의 바이러스 역가는 5 × 10¹² 내지 10 × 10¹², 10 × 10¹² 내지 25 × 10¹², 또는 25 × 10¹² 내지 50 × 10¹²의 유전체 카피/㎖ 중 대략 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 조성물의 바이러스 역가는 5 × 10⁹, 6 × 10⁹, 7 × 10⁹, 8 × 10⁹, 9 × 10⁹, 10 × 10⁹, 11 × 10⁹, 15 × 10⁹, 20 × 10⁹, 25 ×10⁹, 30 × 10⁹, 또는 50 × 10⁹의 형질도입 단위/㎖ 중 대략 어느 하나의 이상이다. 일부 구현예에서, 조성물의 바이러스 역가는 5 × 10⁹ 내지 6 × 10⁹, 6 × 10⁹ 내지 7 ×10⁹, 7 × 10⁹ 내지 8 ×10⁹, 8 × 10⁹ 내지 9 × 10⁹, 9 ×10⁹ 내지 10 × 10⁹, 10 × 10⁹ 내지 11 ×10⁹, 11 × 10⁹ 내지 15 ×10⁹, 15 × 10⁹ 내지 20 × 10⁹, 20 × 10⁹ 내지 25 × 10⁹, 25 × 10⁹ 내지 30 × 10⁹, 30 × 10⁹ 내지 50 × 10⁹ 또는 50 × 10⁹ 내지 100 × 10⁹의 형질도입 단위/㎖ 중 대략 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 조성물의 바이러스 역가는 5 × 10⁹ 내지 10 × 10⁹, 10 × 10⁹ 내지 15 × 10⁹, 15 × 10⁹ 내지 25 × 10⁹, 또는 25 × 10⁹ 내지 50 × 10⁹의 형질도입 단위/㎖ 중 대략 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 조성물의 바이러스 역가는 약 5 × 10¹⁰, 6 × 10¹⁰, 7 × 10¹⁰, 8 × 10¹⁰, 9 × 10¹⁰, 10 × 10¹⁰, 11 × 10¹⁰, 15 × 10¹⁰, 20 × 10¹⁰, 25 × 10¹⁰, 30 × 10¹⁰, 40 × 10¹⁰, 또는 50 × 10¹⁰의 감염 단위/㎖ 중 어느 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 조성물의 바이러스 역가는 약 5 × 10¹⁰ 내지 6 × 10¹⁰, 6 × 10¹⁰ 내지 7 × 10¹⁰, 7 × 10¹⁰ 내지 8 × 10¹⁰, 8 × 10¹⁰ 내지 9 × 10¹⁰, 9 × 10¹⁰ 내지 10 × 10¹⁰, 10 × 10¹⁰ 내지 11 × 10¹⁰, 11 × 10¹⁰ 내지 15 × 10¹⁰, 15 × 10¹⁰ 내지 20 × 10¹⁰, 20 × 10¹⁰ 내지 25 × 10¹⁰, 25 × 10¹⁰ 내지 30 × 10¹⁰, 30 × 10¹⁰ 내지 40 × 10¹⁰, 40 × 10¹⁰ 내지 50 × 10¹⁰, 또는 50 × 10¹⁰ 내지 100 × 10¹⁰의 감염 담위/㎖ 중 어느 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 조성물의 바이러스 역가는 약 5 × 10¹⁰ 내지 10 × 10¹⁰, 10 × 10¹⁰ 내지 15 × 10¹⁰, 15 × 10¹⁰ 내지 25 × 10¹⁰, 또는 25 × 10¹⁰ 내지 50 × 10¹⁰의 감염 단위/㎖ 중 어느 하나 이상이다. 추가 구현예에서, 고역가 AAV 조성물의 투여는 SMA를 갖는 영장류, 예를 들어, 인간의 척수로의 직접 주사, 수막강내 주사, 및/또는 대수조로의 주사에 의해 달성된다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 영장류로의 유효량의 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 AAV 바이러스 입자를 영장류(예를 들어, 인간)의 척수 및/또는 대수조에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 영장류에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 1 × 10¹¹, 2 × 10¹¹, 3 × 10¹¹, 4 × 10¹¹, 5 ×10¹¹, 6 × 10¹¹, 7 × 10¹¹, 8 × 10¹¹, 9 × 10¹¹, 1 × 10¹², 2 × 10¹², 3 × 10¹², 4 × 10¹², 5 × 10¹², 6 × 10¹², 7.5 × 10¹², 또는 1 × 10¹³의 유전체 카피/체중 ㎏ 중 대략 어느 하나의 이상이다. 일부 구현예에서, 영장류에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 1 × 10¹¹ 내지 2 × 10¹¹, 2 × 10¹¹ 내지 3 × 10¹¹, 3 × 10¹¹ 내지 4 × 10¹¹, 4 × 10¹¹ 내지 5 × 10¹¹, 5 × 10¹¹ 내지 6 × 10¹¹, 6 × 10¹¹ 내지 7 × 10¹¹, 7 × 10¹¹ 내지 8 × 10¹¹, 8 × 10¹¹ 내지 9 × 10¹¹, 9 × 10¹¹ 내지 1 × 10¹², 1 × 10¹² 내지 2 × 10¹², 2 × 10¹² 내지 3 × 10¹², 3 × 10¹² 내지 4 × 10¹², 4 × 10¹² 내지 5 × 10¹², 또는 5 × 10¹² 내지 10 × 10¹²의 유전체 카피/체중 ㎏ 중 대략 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 영장류에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 1 × 10¹¹ 내지 5 × 10¹¹, 5 × 10¹¹ 내지 1 × 10¹², 또는 1 × 10¹² 내지 5 × 10¹²의 유전체 카피/체중 ㎏ 중 대략 어느 하나이다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 영장류로의 유효량의 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 AAV 바이러스 입자를 영장류(예를 들어, 인간)의 척수 및/또는 대수조에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 영장류에 투여되는 바이러스 입자의 전체량은 1 × 10¹², 2 × 10¹², 3 × 10¹², 4 × 10¹², 5 × 10¹², 6 × 10¹², 7 × 10¹², 8 × 10¹², 9 × 10¹², 1 × 10¹³, 2 × 10¹³, 3 × 10¹³, 4 × 10¹³, 5 × 10¹³, 6 × 10¹³, 7 × 10¹³, 8 × 10¹³, 9 × 10¹³, 1 × 10¹⁴의 유전체 카피 중 대략 어느 하나의 이상이다. 일부 구현예에서, 영장류에 투여되는 바이러스 입자의 전체량은 1 × 10¹² 내지 2 × 10¹², 2 × 10¹² 내지 3 × 10¹², 3 × 10¹² 내지 4 × 10¹², 4 × 10¹² 내지 5 × 10¹², 5 × 10¹² 내지 6 × 10¹², 6 × 10¹² 내지 7 × 10¹², 7 × 10¹² 내지 8 × 10¹², 8 × 10¹² 내지 9 × 10¹², 9 × 10¹² 내지 1 × 10¹³, 1 × 10¹³ 내지 2 × 10¹³, 2 × 10¹³ 내지 3 × 10¹³, 3 × 10¹³ 내지 4 × 10¹³, 4 ×10¹³ 내지 5 × 10¹³, 5 × 10¹³ 내지 6 × 10¹³, 6 × 10¹³ 내지 7 × 10¹³, 7 × 10¹³ 내지 8 × 10¹³, 8 × 10¹³ 내지 9 × 10¹³, 9 × 10¹³ 내지 1 × 10¹⁴의 유전체 카피 중 대략 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 영장류에 투여되는 바이러스 입자의 전체량은 1 × 10¹² 내지 5 × 10¹², 5 × 10¹² 내지 1 × 10¹³, 1 × 10¹³ 내지 5 × 10¹³, 또는 5 × 10¹³ 내지 1 × 10¹⁴의 유전체 카피 중 대략 어느 하나이다.

본 발명의 일부 구현예에서, 척주의 대수조 또는 거미막밑 공간으로 주사되는 조성물의 부피는 1 ㎕, 10 ㎕, 100 ㎕, 1 ㎖, 2 ㎖, 3 ㎖, 4 ㎖, 5 ㎖, 6 ㎖, 7 ㎖, 8 ㎖, 9 ㎖, 10 ㎖, 25 ㎖ 또는 50 ㎖, 또는 이들 사이의 임의의 양 중 대략 어느 하나의 초과이다.

본 발명의 일부 구현예에서, 바이러스 입자의 전체량은 하나 초과의 위치에 투여된다. 예를 들어, 3 × 10¹³ 유전체 카피의 전체량이 대수조로 1 × 10¹³ 유전체 카피, 가슴 거미막밑 공간으로 1 × 10¹³ 유전체 카피, 및 허리 거미막밑 공간으로 1 × 10¹³ 유전체 카피를 주사함으로써 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 주사 위치 사이에 균일하게 분배된다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는, 예를 들어, 대수조로 2 × 10¹³ 유전체 카피 및 허리 거미막밑 공간으로 1 × 10¹³ 유전체 카피와 같이 주사 부위 사이에 균일하게 분배되지 않는다.

본 발명의 조성물(예를 들어, 영장류 SMN을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 AAV 바이러스 입자)은 단독으로 또는 SMA를 치료하기 위한 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 순차적 투여 사이의 간격은 적어도 수분, 수시간, 또는 수일(또는, 대안적으로 그 미만)의 기간일 수 있다.

IV. 발현 작제물

생존 운동 신경세포( SMN ) 핵산 및 단백질

2개의 SMN 유전자인 SMN1 유전자 및 SMN2 유전자는 염색체 5q13 상에 존재한다. SMN2의 코딩 서열은 5개의 뉴클레오티드가 SMN1 서열과 상이하다. 핵산 서열에서 차이가 있으나, 아미노산 서열은 변경되지 않고 유지된다. 그러나, SMN2의 엑손 7에서의 시스테인(C)으로부터 티민(T)으로의 단일 뉴클레오티드 차이는 SMN2 전사물의 대안적 스플라이싱을 초래한다. SMN2 유전자는 인간에서만 발견되는 한편, SMN1 유전자는 인간뿐만 아니라 비-인간 영장류, 예를 들어, 침팬지에서 발견된다. 예를 들어, 문헌[Rochette et al., Human Genetics, 2001, 108(3):255-266]을 참조하도록 한다. SMN1 유전자는 척수의 운동 신경세포에 특히 풍부하나, SMN1 유전자 내의 동형접합 돌연변이 또는 결실로부터 발생하는 보통염색체 열성 장애인 척수성 근위축증(SMA)을 갖는 대상체에서 감소된 수준으로 발견되는 SMN 단백질을 인코딩한다. SMA에서의 SMN의 역할에 대한 개관을 위해 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Coovert et al, Hum Mol Genet, 1997, 6(8):1205-14 및 Fallini et al, Brain Res., 2012, 1462:81-92]을 참조하도록 한다.

본 발명은 SMN 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산(예를 들어, 트랜스진)을 제공하며, 상기 분리된 핵산은 본원에 기재된 임의의 AAV 바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 영장류, 예를 들어, 인간으로부터의 SMN 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산은 타르시이데(Tarsiidae) 과, 칼리트리키데(Callitrichidae) 과, 세비데(Cebidae) 과, 아오티데(Aotidae) 과, 피테시이데(Pitheciidae) 과, 아텔리데(Atelidae) 과, 세르코피테시데(Cercopithecidae) 과, 힐로바티데(Hylobatidae) 과, 및 호미니데(Hominidae) 과로 구성된 군으로부터 선택된 영장류 분류학으로부터의 SMN 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산은 호모 사피엔스(Homo sapien), 마카카 물라타(Macaca mulatta), 판 트로글로디테스(Pan troglodytes), 파피오 아누비스(Papio anubis), 노마스쿠스 류코게니스(Nomascus leucogenys), 폰고 아벨리이(Pongo abelii), 고릴라 고릴라(Gorilla gorilla), 사이미리 볼리비엔시스(Saimiri boliviensis), 및 판 파니스쿠스(Pan paniscus)로 구성된 군으로부터 선택된 영장류로부터의 SMN 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산은 NM_000344.3, NM_022874.2, NM_001260664.1, 및 NM_001131470.2로 구성된 군으로부터 선택된 NCBI 참조 서열(RefSeq) 번호에 의해 확인되는 SMN1 mRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산은 NP_000335.1, NP_075012.1, NP_001247593.1, XP_001156488.1, XP_001156435.1, XP_001156259.1, XP_001156201.1, XP_003266089.1, XP_003266087.1, XP_003266086.1, XP_003266090.1, NP_001124942.1, XP_004058779.1, XP_003925817.1, XP_003925818.1, XP_003925819.1, XP_003806815.1, XP_003806816.1, XP_003806817.1, 및 XP_003806818.1로 구성된 군으로부터 선택된 NCBI RefSeq 번호에 의해 확인되는 SMN 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산(예를 들어, 트랜스진)은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하는 SMN 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산(예를 들어, 트랜스진)은 SEQ ID NO:2 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다.

본원에 제공된 임의의 SMN 단백질의 아미노산 서열 변이체가 또한 고려된다. 일부 구현예에서, SMN 단백질의 아미노산 변이체는 SMN의 천연 발생 변이체이다. 일부 구현예에서, SMN 단백질의 생물학적 특성은 단백질을 인코딩하는 아미노산 서열을 변경시킴으로써 개선될 수 있다. SMN 단백질의 아미노산 서열 변이체는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로 적절한 변형을 도입시키거나, 펩티드 합성에 의해 변형을 도입시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들어, SMN 단백질의 아미노산 서열로부터의 결실, SMN 단백질의 아미노산 서열로의 삽입, 및/또는 SMN 단백질의 아미노산 서열 내의 치환을 포함한다. 단백질을 인코딩하는 핵산 내의 천연 돌연변이(예를 들어, 자연 선택)으로부터 발생하는 임의의 SMN 단백질의 아미노산 서열 변이체가 또한 본원에서 고려된다. 따라서, SMN 단백질의 변이체를 인코딩하는 분리된 핵산이 본원에 제공되며, 분리된 핵산은 본원에 기재된 임의의 AAV 바이러스 입자 내에 패키징(예를 들어, 트랜스진으로서 패키징)될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산은 본원에 기재된 임의의 SMN 단백질(예를 들어, 인간 SMN 단백질)의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 SMN 단백질 변이체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 분리된 핵산은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 SMN 단백질 변이체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, SMN을 인코딩하는 분리된 핵산은 운동 신경세포에서 이의 생물학적 기능을 유지하면서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 제공하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 생성된 SMN 단백질은 야생형 수준의 활성을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 생성된 SMN 단백질은 야생형 수준으로 발현된다.

SMN 단백질(예를 들어, SMN 단백질)을 인코딩하는 분리된 핵산 분자는 클로닝에 의해 수득될 수 있거나, 합성적으로 생성될 수 있거나, 이들의 임의의 조합에 의해 수득되거나 생성될 수 있다. 핵산은 삼중-가닥, 이중-가닥 또는 단일-가닥, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA의 적어도 하나의 가닥의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 공지된 코딩 가닥일 수 있거나, 이는 안티-센스 가닥으로도 언급되는 비-코딩 가닥일 수 있다. 분리된 핵산은 당업자에게 공지된 임의의 수의 클로닝 방법을 이용하여 생물학적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 분리된 핵산은 또한 공지된 방법에 의해 직접 화학 합성에 의해 제조될 수 있다. SMN 단백질을 인코딩하는 핵산은 SMN 단백질의 더 일찍 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태의 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발, 부위-특이적 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 천연 공급원 또는 제조물로부터의 분리를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012) 및 Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003)]을 참조하도록 한다.

일부 구현예에서, 트랜스진(예를 들어, SMN1 트랜스진)은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 예시적 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터 및 CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간-특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로메라아제(telomerase)(hTERT) 프로모터; 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG 프로모터; Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9) 및 연장 인자 1-알파 프로모터(EF1-알파) 프로모터(Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 및 Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 프로모터는 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터 또는 닭 β-액틴 프로모터에 연결된 사이토메갈로바이러스 인핸서를 포함한다. 프로모터는 항시성, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 트랜스진은 본원에 기재된 임의의 SMN 단백질(예를 들어, 영장류 SMN)을 인코딩하며, 이는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 트랜스진은 인간 SMN 단백질을 인코딩하며, 이는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 트랜스진은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 SMN 단백질을 인코딩하며, 이는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 트랜스진은 SEQ ID NO:2 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하며, 이는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.

재조합 바이러스 벡터

본 발명은 패키징을 위한 본원에 기재된 SMN 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열의 AAV 바이러스 입자로의 도입을 위한 재조합 바이러스 유전체의 용도를 고려한다. 재조합 바이러스 유전체는 SMN 단백질의 발현을 확립시키기 위한 임의의 요소, 예를 들어, 프로모터, SMN1 트랜스진, ITR, 리보솜 결합 요소, 종료자, 인핸서, 선택 마커, 인트론, polyA 신호, 및/또는 복제 기점을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 유전체는 SEQ ID NO:5의 핵산으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 유전체는 SEQ ID NO:6의 핵산으로부터 유래된다.

V. 바이러스 입자 및 바이러스 입자를 생성시키는 방법

rAAV 바이러스 입자

일부 구현예에서, 바이러스 입자는 1개 또는 2개의 ITR과 측면을 접한 본원에 기재된 SMN 단백질(예를 들어, 인간 SMN 단백질)을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자이다. 핵산은 AAV 입자 내에서 캡시드화된다. AAV 입자는 또한 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 전사 개시 및 종료 서열을 포함하는 조절 서열인 전사 방향의 성분에 작동 가능하게 연결된 관심 단백질 코딩 서열(들)(예를 들어, SMN 단백질을 인코딩하는 트랜스진)을 포함함으로써 발현 카세트를 형성한다. 발현 카세트는 5' 및 3' 말단 상에서 적어도 하나의 기능성 AAV ITR 서열과 측면을 접한다. "기능성 AAV ITR 서열"은 ITR 서열이 AAV 비리온의 구제, 복제 및 패키징을 위해 의도된 바와 같이 작용하는 것을 의미한다. 예를 들어, 모든 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; 및 Pechan et al., Gene Ther ., 2009, 16:10-16]을 참조하도록 한다. 본 발명의 일부 양태를 실시하기 위해, 재조합 벡터는 적어도 rAAV에 의한 감염을 위한 캡시드화 및 물리적 구조에 필수적인 AAV의 서열 모두를 포함한다. 본 발명의 벡터에서 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없으며(예를 들어, 문헌[Kotin, Hum. Gene Ther ., 1994, 5:793-801]에 기재된 바와 같음), 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있거나, AAV ITR은 여러 AAV 혈청형 중 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 40개 초과의 혈청형의 AAV가 현재 공지되어 있으며, 새로운 혈청형 및 현존하는 혈청형의 변이체가 지속적으로 확인되고 있다. 예를 들어, 문헌[Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; 및 Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810]을 참조하도록 한다. 임의의 AAV 혈청형의 용도가 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAV11, 또는 AAV12 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 AAV 혈청형으로부터 유래된 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 내의 핵산은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAV11, AAV12 등의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 내의 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 어느 하나 이상의 SMN 단백질(예를 들어, 인간 SMN 단백질)을 추가로 인코딩한다. 예를 들어, AAV 내의 핵산은 본원에서 고려되는 임의의 AAV 혈청형의 적어도 하나의 ITR을 포함할 수 있고, SEQ ID NO:1의 아미노산을 포함하는 SMN 단백질을 추가로 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 내의 핵산은 본원에서 고려되는 임의의 AAV 혈청형의 적어도 하나의 ITR 및 SEQ ID NO:2 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 내의 핵산은 SEQ ID NO:2 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하며, 이는 적어도 하나의 AAV ITR과 측면을 접한다. 일부 구현예에서, SMN 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하며, 이는 적어도 ITR과 측면을 접한다. 일부 구현예에서, AAV 내의 핵산은 SEQ ID NO:5 및 6으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 추가 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAV11, AAV12 등의 캡시드 단백질을 포함한다. 추가 구현예에서, rAAV 입자는 클레이드 A 내지 F로부터의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다(Gao, et al. J. Virol. 2004, 78(12):6381). 일부 구현예에서, AAV 내의 핵산은 SEQ ID NO:2 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하며, 이는 적어도 하나의 AAV2 ITR과 측면을 접한다.

다양한 AAV 혈청형이 특정 표적 세포의 형질도입을 최적화시키거나, 특정 표적 조직(예를 들어, 병에 걸린 조직) 내의 특정 세포 유형을 표적화시키기 위해 사용된다. rAAV 입자는 동일한 혈청형 또는 혼합된 혈청형의 바이러스 단백질 및 바이러스 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 AAV2 ITR을 포함할 수 있거나, 이는 AAV2 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 AAV9 ITR을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, rAAV 입자는 AAV9 및 AAV2 둘 모두로부터의 캡시드 단백질을 포함할 수 있고, 적어도 하나의 AAV2 ITR을 추가로 포함할 수 있다. rAAV 입자의 생성을 위한 AAV 혈청형의 임의의 조합물은 각각의 조합물이 본원에 명백히 언급된 것과 같이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 AAV9 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 AAV2 ITR과 측면을 접한 영장류 SMN, 예를 들어, 인간 SMN을 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 입자를 제공한다.

자가-상보성 AAV 바이러스 유전체

일부 양태에서, 본 발명은 재조합 자가-상보성 유전체를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 자가-상보성 유전체를 갖는 AAV 바이러스 입자 및 자가-상보성 AAV 유전체의 사용 방법은 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,596,535호; 7,125,717호; 7,765,583호; 7,785,888호; 7,790,154호; 7,846,729호; 8,093,054호; 및 8,361,457호; 및 문헌[Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111]에 기재되어 있다. 자가-상보성 유전체를 포함하는 rAAV는 이의 부분적인 상보성 서열(예를 들어, 트랜스진의 상보성 코딩 및 비-코딩 가닥)에 의해 이중 가닥 DNA 분자를 신속히 형성할 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 AAV 유전체를 포함하는 AAV 바이러스 입자를 제공하며, 상기 rAAV 유전체는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, SMN1 코딩 가닥) 및 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, SMN1 비코딩 또는 안티센스 가닥)을 포함하고, 상기 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 이의 길이 대부분 또는 전체를 따라 제2 폴리뉴클레오티드 서열과 사슬내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 및 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 사슬내 염기쌍 형성을 촉진하는 서열, 예를 들어, 헤어핀 DNA 구조에 의해 연결된다. 헤어핀 구조는 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, siRNA 분자 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 및 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 돌연변이된 ITR(예를 들어, 우측 ITR)에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, ITR은 폴리뉴클레오티드 서열 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3'(SEQ ID NO:7)을 포함한다. 돌연변이된 ITR은 말단 분해 서열을 포함하는 D 영역의 결실을 포함한다. 결과로서, AAV 바이러스 유전체 복제시, rep 단백질은 돌연변이된 ITR에서 바이러스 유전체를 분해하지 않을 것이며, 이와 같이, 5'에서 3' 순서에 따라 하기를 포함하는 재조합 바이러스 유전체가 바이러스 캡시드 내에 패키징될 것이다: 조절 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열인 AAV ITR, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드에 대해 역배향인 제2 이종성 폴리뉴클레오티드인 돌연변이된 AAV ITR 및 제 3 AAV ITR. 일부 구현예에서, 본 발명은 영장류 SMN을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열인 기능성 AAV2 ITR, 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 기능성 AAV2 ITR의 영장류 SMN을 인코딩하는 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열인 D 영역의 결실을 포함하고 기능성 말단 분해 서열이 결핍된 돌연변이된 AAV2 ITR을 포함하는 재조합 바이러스 유전체를 포함하는 AAV 바이러스 입자를 제공한다. 본 발명의 바이러스 입자의 재조합 바이러스 유전체는 SEQ ID NO:5 또는 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터 플라스미드로부터 유래될 수 있다.

AAV 입자의 생성

rAAV 입자는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,566,118호; 6,989,264호; 및 6,995,006호를 참조하도록 한다. 본 발명을 실시하는데 있어서, rAAV 입자를 생성시키기 위한 숙주 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 미생물 및 효모를 포함한다. 숙주 세포는 또한 AAV rep 및 cap 유전자가 숙주 세포 내에서 안정적으로 유지되는 패키징 세포 또는 AAV 벡터 유전체가 안정적으로 유지되는 생산자 세포일 수 있다. 예시적 패키징 및 생산자 세포는 293, A549 또는 HeLa 세포로부터 유래된다. AAV 벡터는 당 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 정제되고 포뮬레이션된다.

일부 양태에서, (a) rAAV 입자가 생성되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포가 (i) 하나 이상의 AAV 패키지 유전자로서, 각각의 상기 AAV 패키징 유전자가 AAV 복제 및/또는 캡시드화 단백질을 인코딩하는, 하나 이상의 AAV 패키지 유전자; (ii) 적어도 하나의 AAV ITR과 측면을 접한 본원에 개시된 임의의 SMN 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 프로-벡터, 및 (iii) AAV 헬퍼 기능을 포함하는, 단계; 및 (b) 숙주 세포에 의해 생성된 rAAV 입자를 회수하는 단계를 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 rAAV 입자를 생성시키기 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산은 SEQ ID NO:1의 SMN 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV8rh, AAV10hr, AAV11, AAV12 ITR 등으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 캡시드화 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV8rh, AAVrh10, AAV10, AAV11, AAV12 캡시드 단백질 등으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 구현예에서, rAAV 입자는 클레이드 A 내지 F로부터의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 및 AAV2 ITR, 돌연변이 AAV2 ITR 및 영장류 SMN을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 재조합 자가-상보성 유전체를 포함한다. 추가 구현예에서, rAAV 입자는 정제된다. 본원에서 사용되는 용어 "정제된"은 rAAV 입자가 천연 발생하는 곳에 또한 존재할 수 있거나 이로부터 최초로 제조되는 다른 성분 중 적어도 일부가 결여된 rAAV 입자의 제조물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 분리된 rAAV 입자는 공급원 혼합물, 예를 들어, 배양 용해질 또는 생성물 배양 상층액으로부터 이를 농축시키는 정제 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 농축은 다양한 방식, 예를 들어, 용액 내에 존재하는 DNase-내성 입자(DRP) 또는 유전체 카피(gc)의 비율, 또는 감염력에 의해 측정될 수 있거나, 이는 공급원 혼합물에 존재하는 제2의 잠재적 간섭 물질, 예를 들어, 오염물질, 예를 들어, 생성물 배양 오염물질 또는 공정중(in-process) 오염물질, 예를 들어, 헬퍼 바이러스, 배지 성분 등과 관련하여 측정될 수 있다.

본 발명의 SMN 단백질을 인코딩하는 트랜스진 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 rAAV 입자를 포함하는 약학적 조성물이 또한 본원에 제공된다. 약학적 조성물은 본원에 기재된 임의의 투여 방식에 적합할 수 있다. 본원에 기재된 SMN 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV의 약학적 조성물은, 예를 들어, 정맥내 주사, 카테터(예를 들어, 미국 특허 번호 5,328,470호 참조), 또는 정위 주사(문헌[Chen et al., 1994, PNAS, 91: 3054-3057])에 의해 전신적으로 도입될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 rAAV 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물은 인간으로의 투여에 적합하다. 이러한 담체는 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 and 1570-1580]을 참조하도록 한다). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 rAAV 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물은 수막강내 주사에 적합하다. 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 살균 액체, 예를 들어, 물 및 오일, 예를 들어, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 낙화생유, 대두유, 무기질유 등일 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사 용액을 위한 액체 담체로서 이용될 수 있다. 약학적 조성물은 추가 성분, 예를 들어, 보존제, 완충제, 등장제(tonicity agent), 항산화제 및 안정제, 비이온성 습윤제 또는 청징제(clarifying agent), 점도-증가제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 약학적 조성물은 단일 단위 투여량 또는 다중투여량 형태로 패키징될 수 있다. 조성물은 일반적으로 실질적으로 등장성인 살균 용액으로 포뮬레이션된다.

VI. 제조 물품 및 키트

본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 키트 또는 제조 물품이 또한 제공된다. 양태에서, 키트는 적합한 패키징 내에 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 영장류 SMN을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 rAAV 입자)을 포함한다. 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 수막강내 조성물)에 적합한 패키징은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 바이알(예를 들어, 밀봉된 바이알), 용기, 앰풀, 병, 단지, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 Mylar 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 이들 제조 물품은 추가로 살균되고/되거나 밀봉될 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 조성물을 포함하는 키트를 제공하며, 조성물을 사용하는 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 용도에 대한 설명서(들)을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 키트는 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 설명서와 함께 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 패키지 삽입물을 포함하는 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같이 적어도 1 × 10¹² 유전체 카피의 영장류로의 수막강내 전달을 위한 영장류 SMN을 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 rAAV, 수막강내 주사에 적합한 약학적으로 허용되는 담체, 및 수막강내 주사를 수행하기 위한 설명서와 함께 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 패키지 삽입물 중 하나 이상을 포함한다.

실시예

실시예 1: 척수성 근위축증에 대한 scAAV9 - SMN1의 수막강내 전달의 번역 충실성

척수성 근위축증(SMA)에 대한 치료 접근법으로서 생존 운동 신경세포 1(SMN1)을 인코딩하는 재조합 AAV 벡터의 수막강내 전달의 잠재성을 연구하였다. 첫째로, 치료 이익을 위해 형질도입될 필요가 있는 운동 신경세포의 최소 수를 결정하기 위해 SMA 마우스에서 용량-반응 연구를 수행하였다. 둘째로, 큰 포유동물 모델, 특히 소아 돼지로의 재조합 바이러스 벡터의 수막강내 전달을 통한 광범위한 유전자 전달의 실행가능성을 확인하였다. 셋째로, 비-인간 영장류(NHP)에서의 재조합 바이러스 벡터의 수막강내 전달을 통한 광범위한 유전자 전달의 적응성을 연구하였다.

방법

재조합 자가-상보성 AAV 벡터

인간 SMN1의 열린해독틀을 0.4 kb 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터를 함유한 자가-상보성 AAV2-ITR 플라스미드로 클로닝하고(도 5 및 6), 삼중-플라스미드 공동-트랜스펙션에 의해 혈청형-9 캡시드로 패키징시켜, scAAV9-hSMN1을 생성시켰다. 큰 동물 모델에서의 수막강내 전달 실험을 위해, 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터를 0.9 kb 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴 프로모터로 대체하고, 삼중-플라스미드 공동-트랜스펙션에 의해 혈청형-9 캡시드로 패키징시켜, scAAV9-eGFP를 생성시켰다(도 7 및 8). scAAV9-hSMN1 및 scAAV9-eGFP 제조물의 역가는 각각 ㎖ 당 8.3e12 및 4.3e12 유전체 카피(gc)였다.

마우스 수술

이형접합체 SMA 마우스(SMN^+/-, hSMN2^+/+, SMNΔ7^+/+)의 번식 쌍을 이전에 기재된 바와 같이 교배시켰다(Passini et al., 2010). 출생일(P₀)에, 각각의 새끼에 마우스 당 6 ㎕의 전체 부피를 위해 둘 모두의 반구의 대뇌 가쪽뇌실 및 허리 척수로 3회의 주사(각 부위에서 2 ㎕)를 제공하였다. 이러한 전달 방법은 CNS를 광범위하게 표적화하나, 목 부위는 허리 주사에 대한 이의 비교적 먼 위치로 인해 허리 및 가슴 부위에 비해 더 낮은 수준의 형질도입을 나타내었다(Passini et al., 2010). scAAV9-hSMN1 벡터를 마우스 당 5e10 gc로 전체적으로 주사하거나, 마우스 당 1e10 및 1e9 gc의 더 낮은 최종 용량을 전달하기 위해 염수 중에 희석시켰다. 이전에 기재된 바와 같이 미세하게 압연한 판유리 마이크로피펫 바늘을 이용하여 모든 주사를 수행하였다(Passini et al., 2010). 주사 후, 새끼를 토-클리핑(toe-clipping)시키고, 동형접합체(SMN^-/-, hSMN2^+/+, SMNΔ7^+/+), 이형접합체(SMN^+/-, hSMN2^+/+, SMNΔ7^+/+), 및 야생형(SMN^+/+, hSMN2^+/+, SMNΔ7^+/+) 동형접합 SMA 마우스를 확인하기 위해 지노타이핑(genotyping)하였다. 지노타이핑 후, SMA 마우스인 것으로 결정된 새끼뿐만 아니라 2개의 야생형 새끼(대조군)를 이전에 보고된 바와 같이 유지시켰다(Passini et al., 2011b).

돼지 수술

2개월령의 농장 돼지를 Palmetto Research Swine(Reevesville, SC)으로부터 수득하고, 건강을 보장하기 위해 격리하여 관찰하였다. 돼지를 수술 전에 밤새 금식시키고, 이소플로우란(isoflourane)으로 마취시켰다. 마비를 이용하지 않았다. 돼지를 이전에 기재된 장치 내에 엎드린 채로 위치시켰다(Federici et al 2012).　이러한 장치는 돼지의 복부가 복압을 방지하고 결과로서 정맥 출혈을 감소시키면서 자유롭게 매달려 있게 한다. 허리 부위를 면도하고, 세척하고, 표준 살균 방식으로 수술용 드레이프(drape)를 덮었다. 5 ㎝ 중간선 절개를 L5에서 수행하였다. 척추 주위 근육을 가시 돌기 및 판으로부터 자유롭게 절개하였다. 다음으로, 싱글 레벨 허리 척추후궁절제술(single level lumbar laminectomy)을 에어 드릴(air drill) 및 케리슨 론저(Kerrison Ronguer)를 이용하여 수행하였다. 경질막을 단일 4-0 뉴롤론 스티치(neurolon stitch)를 이용하여 텐트 업(tent up)시키고, 중간선에서 4 ㎜ 절개하였다. 다음으로, 수막강 카테터(EDM 허리 카테터, Medtronic Inc, Minneapolis MN)를 허리 수조로 부리쪽으로 전진시켰다. 카테터를 경추관의 부위로 50　㎝ 전진시켰다. 0.5 ㎖의 벡터를 볼루스로서 목 부위에 주사하고, 이후 카테터를 가슴 부위로 10 ㎝ 후퇴시켰다. 이 위치에서, 두번째 0.5 ㎖ 주사를 볼루스로서 수행하였다. 최종적으로, 카테터를 세번째 0.5 ㎖ 주사를 위해 허리 부위로 다시 10 ㎝ 후퇴시켰다. 카테터의 제거 전, 4-0 뉴롤론(nurolon)을 이용하여 쌈지 봉합(purse string suture)을 배치하였다. 뇌척수액의 역류를 방지하기 위해 카테터의 제거 즉시 죄었다. 척추 주위 근육을 단속 2-0 비크릴(vicryl) 봉합사로 재접근시켰다. 근막을 연속(running) 2-0 비크릴 봉합사로 꿰맸다. 피부를 단속 역 3-0 비크릴 봉합사 및 연속 2-0 나일론 스티치로 꿰맸다. 수술 후, 마취로부터의 적절한 회복을 보장하기 위해 동물을 관찰하였다. 모든 동물이 이들의 신경학적 기준선에 복귀하는 것을 보장하기 위해 생존 기간에 걸쳐 보행을 관찰하였다.

원숭이 수술

약 3.5 ㎏ 체중의 6마리의 소아(2 내지 3세) 시노몰구스 원숭이를 케타민(Ketaset, 7 ㎎/㎏)으로 마취시키고, 관을 삽입하고, 흡입 이소플루란(1 내지 3%) 상에 두었다. 목등 및 허리 척수 부위를 면도하고, 포비돈-요오드 및 알콜로 세척하였다. 22-게이지 척수 바늘을 L4와 L5 사이(2마리의 수컷 및 1마리의 암컷)의 수막강 공간, 및 각각의 동물의 대수조 공간으로 수작업으로 유도하였다. 미세원심분리기 튜브로 수거되는 1.5 ㎖ 이하의 뇌척수액(CSF)을 이용한 바늘로부터의 CSF의 유동에 의해 정확한 위치결정을 확인하였다. scAAV9-eGFP를 함유하는 주사기(3 ㎖) 및 수액연결줄을 척추 바늘에 조심스럽게 연결시키고, 1 ㎖/분의 속도로 각각의 부위에 3 ㎖를 수작업으로 주사하였다. 주사 완료 후, 수액연결줄을 바늘로부터 분리시키고, CSF 공간 내의 위치결정을 바늘 허브로의 CSF의 역류에 의해 확인하였다. 이후, 바늘을 즉시 제거하고, 주사 부위에 압력을 적용시켰다. 동물을 마취로부터 회복시키고, 수술 후 5일 동안 상세하게 우리에서의 관찰로 매일 관찰하였다. 대수조 및 수막강내 주사를 제공한 1마리의 암컷 동물은 마취로부터의 장기 회복으로 인해 호흡기 합병증을 가졌다. 이러한 동물을 감소된 식욕 및 체중 감소로 인해 처리 24일 후에 안락사시켰다. 모든 다른 동물을 주사 후 30일에 스케줄에 따라 안락사시켰다. 모든 동물은 깊이 마취되었고, 인산염-완충 염수 및 4% 파라포름알데하이드로 경심 관류시켰다. 뇌, 척수, 후근절, 간 및 비장을 면역조직화학 분석을 위해 수거하였다.

웨스턴 블롯 분석

생화학적 분석을 위해, 16 및 58 내지 66일에 처리된 마우스 및 미처리된 마우스를 인산염-완충 염수(PBS)로 관류시키고, 척수를 절개하고, 허리, 가슴 및 목 분절로 분리시킨 후, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 조직을 T-Per 용해 완충액 및 프로테아제 억제제 칵테일(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 50 ㎎ 단백질/㎖의 최종 농도로 균질화시켰다. 원심분리에 의해 균질액을 투명화시키고, 단백질 농도를 BCA 검정(Pierce, Rockford, IL)에 의해 측정하였다. 10 내지 20 마이크로그램의 균질액 단백질을 4 내지 12% SDS-PAGE에서 분리시키고, 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 항-SMN 모노클로날 항체(1:5,000 BD Biosciences, San Jose, CA) 및 항-β-튜불린 폴리클로날 항체(1:750, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로 탐색하였다. 막을 적외선 이차 항체(1:20,000, LI-COR Biosciences, Lincoln NB)와 함께 인큐베이션하고, 단백질 밴드를 Odyssey 소프트웨어(LI-COR Biosciences)를 이용한 정량 형광에 의해 시각화시켰다.

면역조직화학

조직학적 분석을 위해, 처리된 마우스 및 미처리된 마우스를 4% 파라포름알데하이드(pH 7.4)로 먼저 관류시켰다. 이후, 척수를 분리시키고, 48 내지 72시간 동안 30% 수크로스 용액에 두고 최적 절단 온도 복합기(Optimal Cutting Temperature)(OCT)에 포매시키고, 냉동미세절단기로 10 ㎛ 동결 절편으로 절단하였다. 척수 절편을 실온(RT)에서 1시간 동안 블로킹시킨 후, AAV-유래 hSMN의 위치를 정하기 위해 항-SMN 모노클로날 항체(BD Biosciences, 1:200 희석액) 및 운동 신경세포를 확인하기 위해 항-콜린 아세틸 트랜스페라제(ChAT) 폴리클로날 항체(Millipore; Burlington, MA; 1:100 희석액)와 함께 인큐베이션하였다. 일차 항체를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 가습화된 챔버 내에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 척수 절편을 비오티닐화된 항-마우스, Cy3-컨쥬게이션된 항-염소, 또는 FITC-컨쥬게이션된 항-토끼 이차 항체(Jackson ImmunoResearch; West Grove, PA; 1:250 희석액)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. SMN 및 ChAT 면역-양성 신호를 증가시키기 위해, TSA 신호 증폭 키트(Perkin Elmer; Waltham, MA) 또는 시트르산 항원 회복 프로토콜(Vector Labs; Burlingame, CA)을 제조업체의 설명서에 따라 수행하였다. 절편을 Vectashield 마운팅 매질(Vector Labs; Burlingame, CA)과 함께 덮개 유리로 덮었다. 돼지 및 NHP에서의 GFP 면역염색을 위해, 조직 절편을 4℃에서 밤새 토끼 항-eGFP 항체(Millipore; 1:500 희석액) 및 이후 실온에서 2시간 동안 비오티닐화된 항-토끼 이차 항체(Jackson Laboratories; 1:250 희석액)와 함께 인큐베이션하고, 면역-양성 신호를 제조업체의 프로토콜(Vectorstain Kit, Vector Lab)에 따라 디아미노벤지딘(DAB) 검출 검정을 이용하여 시각화시켰다.

운동 신경세포 계수

ChAT 면역-양성 세포의 수를 10 ㎛ 관상 조직 절편에서 계수하였다. 허리, 가슴 및 목 분절의 문미측 축을 따라 양측 계수를 수행하였다. 형광 ChAT 신호를 나타낸 척수의 판 8 및 9(복측각)에 위치된 세포를 운동 신경세포로 간주하였다. 각각의 척수 분절의 약 8 내지 10개의 상이한 수준을 계수하여, 각각의 동물에 대한 분절 당 운동 신경세포 수의 전체 평균 수를 생성시켰다. 동일 세포의 이중 계수를 방지하기 위해, 각각의 절편은 적어도 100 ㎛ 떨어져 있었다. 상이한 동물 사이의 해부학적으로 일치된 절편을 비교하기 위해 특별히 주의하였고, 세포 수를 맹검 관찰자가 수집하고 기록하였다.

근섬유 크기의 측정

각각의 마우스의 우측으로부터의 골격근(사두, 늑간, 횡경막)을 파라핀에 의해 처리하고, 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 근섬유 단면을 결정하였다. 각각의 근육으로부터의 약 500개의 중복되지 않는 근섬유를 무작위로 선택하고, 사진을 찍은 후, 이전에 보고된 바와 같이 각각의 근섬유의 단면적을 Metamorph(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 측정하여 각각의 동물에 대한 근육 당 근섬유의 전체 평균 크기를 생성시켰다(Passini et al., 2010, 2011b).

거동 시험

직립 반사 및 악력 시험을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Passini et al., 2010, 2011b). 요컨대, 직립 반사 시험은 각각의 마우스를 누운 자세로 둔 후, 마우스가 4개 모두의 발로 스스로 원래 자세를 잡는데 소요된 시간을 측정하는 것을 포함하였다. 악력 시험은 와이어 격자 상에 앞발 및 뒷발을 두고, 이후 마우스를 그물 축을 따라 수평으로 가볍게 당겨 저항을 기록하는 것을 포함하였다.

통계

거동 시험, 및 운동 신경세포의 수 및 근섬유의 단면적의 정량을 위해, 일원 분산분석(one-way ANOVA) 및 본페로니 다중 사후 검정(Bonferroni multiple post hoc) 비교를 이용하여 통계를 수행하였다. 만텔-헨젤 시험(Mantel-Haenszel test)과 동등한 로그-순위 검정(log-rank test)으로 카플란-마이어 생존 곡선을 분석하였다. 모든 통계 분석을 GraphPad Prism v4.0(GraphPad Software, San Diego, CA)을 이용하여 수행하였다. p<0.05인 값을 유의한 것으로 간주하였다.

결과

SMA 마우스의 CNS로의 증가하는 양의 scAAV9 - hSMN1의 투여는 점진적으로 더 높은 운동 신경세포 수 및 상응하는 근육 생리기능에서의 개선을 초래하였다.

SMA 마우스에서 치료 효능을 제공하는데 필요한 유전자-변형된 운동 신경세포의 수를 확인하기 위해, 5e10, 1e10, 및 1e9 유전체 카피(gc)의 용량의 scAAV9-hSMN1을 동물의 중추신경계(CNS)에 투여하였다. 바이러스 벡터를 출생 후 0일(P0)에 대뇌 가쪽뇌실 및 허리 척수로 주사하고, 이후 동물을 나이-일치된 분석을 위해 주사 14일 후(P14)에 희생시켰다. 각각의 용량에 대해, 한 코호트의 마우스의 척수를 조직 균질액에 대한 SMN의 수준을 정량하기 위한 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리하였고, 다른 코호트의 척수를 조직 절편에서의 유전자 발현의 공간 패턴을 결정하기 위한 면역조직화학을 위해 처리하였다.

SMA 마우스의 허리, 가슴 및 목 척수의 웨스턴 블롯 분석은 SMN 수준에서의 용량 의존적 증가를 나타내었다. SMA 마우스에 5e10, 1e10 및 1e9 유전체 카피의 scAAV9-hSMN1을 주사하였고, 이는 각각 WT 수준의 70 내지 180%, 30 내지 100%, 및 10 내지 20%인 hSMN 수준을 발생시켰다(도 9a). 미처리된 SMA 마우스는 척수 전체에 걸쳐 SMN의 WT 수준의 10%를 가졌다(도 9a). 조직 절편의 이중 면역조직화학(IHC) 염색은 척수의 복측각 내에서 hSMN과 ChAT의 공동-국소화를 나타내었으며, 이는 운동 신경세포의 부분집합이 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 것을 나타낸다(도 10). 허리 및 가슴 부위 내에 이중-염색된 세포의 수의 광범위한 분석은 5e10, 1e10, 및 1e9 gc의 용량을 이용하여 각각 30 내지 60%, 10 내지 30%, 및 5% 미만의 운동 신경세포 형질도입 효율이 실현된 것을 나타내었다(도 9b). 사용된 용량과 관계 없이, 목 조직 절편에서의 hSMN에 대한 염색의 강도는 매우 낮았고, 이는 상기 부위에서의 운동 신경세포 형질도입의 효율을 정확히 계산하는 것을 어렵게 만들었다(도 9b). 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 목 부위 내의 개별적 세포에서의 hSMN의 절대 수준이 면역-염색에 의한 검출에 대한 한계에 도달하였으나, 더욱 민감한 웨스턴 블롯 검정에 의해 응집체(균질액)로서 검출될 수도 있다.

SMA 마우스의 척수 및 골격근 조직에서의 병리학적 이상에 대한 증가하는 양의 scAAV9-hSMN1의 투여의 효능을 또한 평가하였다. 척수의 분석은 2개의 가장 높은 용량으로 처리된 마우스의 허리, 가슴 및 목 부위에서 유의하게 더 많은 수의 운동 신경세포가 관찰된 것을 나타내었다(도 9c). 흥미롭게도, 1e10 gc의 용량에서, 목 부위 내의 SMN의 WT 수준의 30%의 달성은 증가된 수의 운동 신경세포와 관련되었다(도 9a, 도 9c). 또한, 가장 낮은 용량(1e9 gc/마우스)으로 처리된 SMA 마우스의 허리 부위에서, SMN의 WT 수준의 약 20%의 달성이 증가된 수의 운동 신경세포를 제공하기에 충분하였다(도 9a, 도 9c). 이들 데이터는 척수에서 WT 수준의 약 20 내지 30%로 SMN 수준을 재구성시키는 것이 SMA 마우스에서 일정 수준의 치료 이익을 제공하기에 충분한 것을 나타내었다.

사두, 늑간, 및 횡경막은 허리, 가슴, 및 목 부위로부터 각각 유래되는 운동 신경세포에 의해 신경 자극되는 골격근이다. 2개의 가장 높은 용량이 투여된 SMA 마우스의 사두 및 늑간 근육에서의 개별적 근섬유의 단면적의 측정은 미처리된 대조군에 비해 이들의 크기에서 유의한 증가를 나타내었다(도 9d). 횡경막에서, 5e10 gc-처리된 그룹에서만 근섬유 크기에서의 유의한 증가가 인지되었다. 1e10 gc에서의 늑간 근육 및 5e10에서의 횡경막 근육 둘 모두가 70% SMN 수준과 관련된 근섬유 크기에서의 유의한 증가를 나타내었다(도 9a, 도 9d). 종합하면, 데이터는 WT 수준의 약 20 내지 30%로 SMN을 재구성시키는 것이 운동 신경세포를 세포 사멸로부터 구제하기에 충분하고, SMN 수준을 WT의 약 70%로 증가시키는 것이 근육 생리기능을 개선(즉, 근섬유 크기 증가)시키는 것을 나타낸다.

SMA 마우스에서 치료 효능에 필요한 scAAV9 - hSMN1에 의한 운동 신경세포 형질도입 정도의 측정.

증가하는 양의 scAAV9-hSMN1이 투여된 동물을 또한 기능 및 생존에 대한 이들의 효과에 대해 모니터하였다. 2개의 가장 높은 용량이 투여된 SMA 마우스의 악력 및 직립 반사 시험은 14 및 175일에서 시험되는 경우 근육 강도 및 협조에서 유의하고 지속된 개선을 나타내었다(도 11A, 도 11B). 2개의 가장 높은 용량이 투여된 마우스는 또한 가장 낮은 용량(1e9 gc)이 처리된 마우스 또는 미처리 대조군과 비교하는 경우 체중에서 유의한 증가를 나타내었다(도 11C). 중요하게는, scAAV9-hSMN1을 이용한 처리는 SMA 마우스의 정중 수명에서 현저한 증가를 초래하였다(도 11D). 5e10, 1e10 및 1e9 gc가 투여된 동물은 각각 153일(염수 대조군에 비한 +800% 증가, p<0.0001), 70일(+300%, p<0.0001), 및 18일(+6%, p=0.1329)의 정중 수명을 나타내었다(도 11D). 1e10 gc의 용량은 수명에서의 유의한 연장을 촉진시키기에 충분하였고, 이는 SMA 마우스에서 최소 10 내지 30% 운동 신경세포 형질도입(도 9b) 및 SMN의 WT 수준의 30 내지 70%(도 9a)의 달성과 관련되었다. 큰 동물 모델에서의 수막강내 전달 연구에서의 성공에 대한 평가 기준으로서 약 10 내지 30% 운동 신경세포 형질도입을 선택하였다.

소아 농장 돼지에서의 운동 신경세포의 효능을 위해 필요한 수를 형질도입시키는데 있어서의 scAAV9 - hSMN1의 수막강내 주사의 충실성.

큰 동물에서의 scAAV9-eGFP 벡터의 수막강내 투여를 평가하였다. 큰 동물 종 중 하나로서 돼지를 선택하였는데, 이는 이의 척수의 크기 및 형태가 인간의 것과 매우 유사하여, 척수에 대한 신경외과적 접근법의 중개 연구를 위한 신뢰성 있는 모델이 되기 때문이다(Federici et al 2012). 광범위한 운동 신경세포 형질도입이 큰 척수에서 달성될 수 있는지 결정하기 위해 소아 농장 돼지의 수막강내(IT) 공간에 scAAV9-eGFP(n=2) 또는 염수(n=1)를 주사하였다. L5에서 척추후궁절제술을 수행하였고, 카테터를 C8 분절까지 넣고, 이 접합점에서 0.5 ㎖ 부피의 1e12 gc의 scAAV9-eGFP를 주사하였다. 이후, 카테터를 대략 T8 분절까지 후퇴시키고, 또 다른 1e12 gc의 scAAV9-eGFP를 투여한 후, 대략 L2 분절까지 다시 후퇴시키고, 여기서 세번째 1e12 gc의 바이러스 벡터를 제공하였다. 따라서, 각각의 돼지에는 1.5 ㎖ 부피의 전체 3e12 gc의 scAAV9-eGFP를 제공하였다. 동물을 주사 35일 후에 희생시키고, 척수의 다양한 섹션을 확인하고, 절개하였다(도 12A). 풍부하게 GFP-양성으로 염색된 세포가 scAAV9-eGFP로 처리된 돼지의 척수의 복측각에서 관찰되었으나, 염수로 처리된 돼지에서는 관찰되지 않았다(도 12B 내지 도12D).

복측각에서의 GFP-양성 세포체의 크기 및 위치는 운동 신경세포 형질도입과 일치하였다. 그러나, GFP-양성 세포의 정체를 확인하고, scAAV9-eGFP에 의해 형질도입된 운동 신경세포의 백분율을 계산하기 위해, C2와 L6 사이의 그 밖에 모든 척수 분절에 대해 이중 IHC를 수행하였다. 분절 C8, T8, 및 L2에 의해 예시된 바와 같이, 다수의 세포가 GFP 및 ChAT와의 공동-염색을 나타내었고, 이는 형질도입된 세포의 부분집합이 확실히 운동 신경세포인 것을 나타낸다(도 12E 내지 도 12G). 전체 척수의 광범위한 분석은 분절 대부분에서 10% 초과의 운동 신경세포가 형질도입된 것을 나타내었다(도 12H). 일부 분절에서, 30% 초과의 운동 신경세포가 scAAV-eGFP에 의해 형질도입되었다(도 12H). 따라서, 어린 인간의 크기와 가까운 소아 돼지의 뇌척수액으로의 재조합 AAV 벡터의 수막강내 주사는 SMA 마우스에서의 효능에 필요한 것으로 밝혀진 최소 수준의 운동 신경세포 형질도입을 뒷받침한다.

소아 원숭이에서의 운동 신경세포의 효능을 위해 필요한 수를 형질도입시키 는데 있어서의 scAAV9-hSMN1의 수막강내 주사의 충실성.

광범위한 운동 신경세포 형질도입이 어린 인간 유아와 더더욱 유사한 큰 동물 모델에서 달성될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 소아 시노몰구스 원숭이의 수막강내 공간에 scAAV9-eGFP를 주사하였다. 그러나, 카테터를 IT 공간을 통해 넣은 돼지 주사와는 달리, 바이러스 벡터를 비-인간 영장류(NHP)의 대수조 및 허리 거미막밑 공간에 직접 주사하였다. 상기 접근법의 선택은 진입 과정 동안의 카테터 얽힘의 잠재성을 배제시키기 위한 시도였다. 원숭이의 한 코호트(n=3)의 허리 거미막밑 공간에 3 ㎖(1.25e13 gc)의 scAAV9-eGFP 및 대수조에 또 다른 3 ㎖(1.25e13 gc)로 원숭이 당 총 6 ㎖(2.5e13 gc)를 제공하였다. 광범위한 유전자 전달이 단일 주사로 달성될 수 있는지 결정하기 위해 두번째 코호트의 원숭이의 대수조 단독에 3 ㎖(1.25e13 gc)의 scAAV9-eGFP를 주사하였다. 모든 원숭이를 주사 30분 후에 희생시켰다.

원숭이 마그나(magna)의 둘 모두의 코호트로부터의 조직 절편의 분석은 허리 복측각에서의 GFP의 유사한 강한 발현을 나타내었다(도 13a 내지 도 13c). GFP 및 ChAT에 대한 공동-염색은 형질도입된 세포의 부분집합이 운동 신경세포인 것을 입증하였다(도 13d 내지 도 13f). 목, 가슴 및 천골 분절을 포함하는 척수의 다른 부위에서도 또한 운동 신경세포의 형질도입이 명백하였다(도 13g 내지 도 13n). 허리 및 대수조 주사의 조합에 의해 처리된 원숭이의 광범위한 분석은 분석된 모든 분절에서 25 내지 75% 운동 신경세포 형질도입을 나타내었다(도 13p). 대수조 주사에 의해 처리된 동물은 목, 가슴 및 허리 분절 전체에 걸쳐 15 내지 50% 운동 신경세포 형질도입을 초래하였다(도 13o). 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 허리 및 대수조 조합 그룹에서의 증가된 운동 신경세포 형질도입률은 상기 동물로의 더 많은 용량의 벡터의 전달로 인한 것일 수 있다.

CNS의 다른 부위가 또한 scAAV9-eGFP의 수막강내 전달 후에 형질도입되었다. 둘 모두의 처리 코호트에서 후근절(DRG)이 유전학적으로 변형되었다(GFP의 발현에 의해 입증됨)(도 14A 내지 도 14F). 또한, GFP-양성 피라미드 신경세포 및 아교세포가 둘 모두의 처리 코호트에서 후두 피질에 대해 이마엽앞에 걸쳐 있는 대뇌 피질을 따라 검출되었다(도 14G, 도 14I). 소뇌 피질 전체에 걸친 푸르킨예 세포가 또한 둘 모두의 코호트에서 효과적으로 형질도입되었다(도 14H, 도 14I). 종합적으로, DRG 및 뇌에서의 GFP 발현의 패턴이 2개의 그룹 사이에서 유사하였다. 조직 절편에 대한 GFP 발현이 원숭이의 간 및 비장에서 검출되지 않았으며, 이는 체순환에 진입한 scAAV9-eGFP의 양이 낮은 것을 암시한다. 혈청 및 CSF에서의 AAV9 캡시드에 대한 항체의 수준을 모니터하였다. 모든 원숭이의 혈청에서의 AAV9에 대한 미리 존재하는 중화 항체(NAB)의 기준선 수준은 낮았다(표 1). 주사 후 30일에서, 항-AAV9 NAB의 혈청 및 CSF 수준은 유의하게 더 높았다(표 1).

본원에 기재된 결과는 소아 원숭이의 대수조 및 허리 거미막밑 공간으로의 재조합 AAV 벡터의 수막강내 주사가 SMA 마우스에서 효과적인 것으로 밝혀진 운동 신경세포 형질도입의 수준을 뒷받침하는 것을 나타낸다.

표 1. NHP에서의 AAV9에 대한 NAB.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> GENZYME CORPORATION PASSINI, Marco A. SHIHABUDDIN, Lamya S. O'RIORDAN, Catherine R. WADSWORTH, Samuel C. CHENG, Seng H. <120> COMPOSITION AND METHODS FOR TREATING SPINAL MUSCULAR ATROPHY <130> 159792009940 <140> PCT/US2013/039163 <141> 2013-05-01 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 294 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Pro Glu Gln Glu 1 5 10 15 Asp Ser Val Leu Phe Arg Arg Gly Thr Gly Gln Ser Asp Asp Ser Asp 20 25 30 Ile Trp Asp Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Tyr Asp Lys Ala Val Ala 35 40 45 Ser Phe Lys His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Ile Cys Glu Thr Ser Gly 50 55 60 Lys Pro Lys Thr Thr Pro Lys Arg Lys Pro Ala Lys Lys Asn Lys Ser 65 70 75 80 Gln Lys Lys Asn Thr Ala Ala Ser Leu Gln Gln Trp Lys Val Gly Asp 85 90 95 Lys Cys Ser Ala Ile Trp Ser Glu Asp Gly Cys Ile Tyr Pro Ala Thr 100 105 110 Ile Ala Ser Ile Asp Phe Lys Arg Glu Thr Cys Val Val Val Tyr Thr 115 120 125 Gly Tyr Gly Asn Arg Glu Glu Gln Asn Leu Ser Asp Leu Leu Ser Pro 130 135 140 Ile Cys Glu Val Ala Asn Asn Ile Glu Gln Asn Ala Gln Glu Asn Glu 145 150 155 160 Asn Glu 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 60 acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc 120 caactccatc actaggggtt cctggagggg tggagtcgtg acagatctga attcctgctg 180 ggaaaagcaa gtggaggtgc tccttgaaga aacaggggga tcccaccgat ctcaggggtt 240 ctgttctggc ctgcggccct ggatcgtcca gcctgggtcg gggtggggag cagacctcgc 300 ccttatcggc tggggctgag ggtgagggtc ccgtttcccc aaaggcctag cctggggttc 360 cagccacaag ccctaccggg cagcgcccgg ccccgcccct ccaggcctgg cactcgtcct 420 caaccaagat ggcgcggatg gcttcaggcg catcacgaca ccggcgcgtc acgcgacccg 480 ccctacgggc acctcccgcg cttttcttag cgccgcagac ggtggccgag cgggggaccg 540 ggaagcatgg cccgggctgc agctctaagg taaatataaa atttttaagt gtataatgtg 600 ttaaactact gattctaatt gtttctctct tttagattcc aacctttgga actcgaattc 660 atggcgatga gcagcggcgg cagtggtggc ggcgtcccgg agcaggagga ttccgtgctg 720 ttccggcgcg gcacaggcca gagcgatgat tctgacattt gggatgatac agcactgata 780 aaagcatatg 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gggaagacaa tagcaggcat gcactagtcc actccctctc tgcgcgctcg 2280 ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcg 2338 <210> 7 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccacgc 60 ccgggctttg cccgggcg 78

Claims (48)

1. 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)의 바이러스 입자를 포함하며, 여기서 적어도 1 × 10¹²의 유전체 카피의 rAAV 바이러스 입자가 영장류의 척수에 직접 주사 및 대수조(cisterna magna)에 수조 내 주사를 통해 투여되는 것인, 영장류에서 척수성 근위축증을 치료하기 위한 약학적 조성물.
2. 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)의 바이러스 입자를 포함하며, 여기서 적어도 1 × 10¹²의 유전체 카피의 rAAV 바이러스 입자가 영장류의 척수에 직접 주사 및 대수조에 수조 내 주사를 통해 투여되는 것인, 영장류에서 척수성 근위축증의 증상을 개선하기 위한 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 척수성 근위축증의 증상이 근육 쇠약, 운동 이정표(motor milestone) 달성 불능, 착석 불능, 보행 불능, 마비, 호흡기 장애, 구기능 부전, 운동 신경세포 소실 및 신경근육 이음부 병리 중 하나 이상인 약학적 조성물.
4. 영장류 SMN을 인코딩하는 벡터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)의 바이러스 입자를 포함하며, 여기서 적어도 1 × 10¹²의 유전체 카피의 rAAV 바이러스 입자가 영장류의 척수에 직접 주사 및 대수조에 수조 내 주사를 통해 투여되는 것인, 영장류의 운동 신경세포 내에 영장류 SMN을 인코딩하는 이종성 트랜스진(transgene)을 전달하기 위한 약학적 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 척수의 허리, 가슴 및 목(cervical) 부위 내의 운동 신경세포의 적어도 10 내지 30%가 형질도입되는 것인 약학적 조성물.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, SMN 야생형 수준의 적어도 30%가 척수 전체에 걸쳐 발생되는 것인 약학적 조성물.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 척수 또는 대수조의 하나 초과의 위치에 투여되는 것인 약학적 조성물.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 영장류의 체중 1 ㎏당 적어도 3.5 × 10¹¹의 유전체 카피, 적어도 3.5 × 10¹²의 유전체 카피, 적어도 5 × 10¹²의 유전체 카피, 또는 적어도 5 × 10¹³의 유전체 카피의 rAAV가 영장류에 투여되는 것인 약학적 조성물.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2.5 × 10¹²의 유전체 카피 또는 적어도 1.25 × 10¹³의 유전체 카피의 rAAV가 영장류에 투여되는 것인 약학적 조성물.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 바이러스 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, 또는 AAV12 혈청형 캡시드를 포함하는 것인 약학적 조성물.
11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, 또는 AAV12 혈청형 역방위 말단 반복(ITR)을 포함하는 것인 약학적 조성물.
12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 바이러스 입자가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, 또는 AAV12 혈청형 캡시드를 포함하고, 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, 또는 AAV12 혈청형 역방위 말단 반복(ITR)을 포함하며, 여기서 ITR 및 캡시드가 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래되거나 또는 ITR 및 캡시드가 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래되는 것인 약학적 조성물.
13. 제12항에 있어서, rAAV 바이러스 입자가 AAV-9 캡시드를 포함하고, 벡터가 AAV2 ITR을 포함하는 것인 약학적 조성물.
14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 셀프-컴플리멘팅(self-complimenting) 벡터인 약학적 조성물.
15. 제14항에 있어서, 벡터가 SMN-1 트랜스진을 인코딩하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 및 SMN-1 트랜스진의 상보체를 인코딩하는 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열이 이의 길이 대부분 또는 전체를 따라 제2 폴리뉴클레오티드 서열과 사슬내 염기쌍을 형성할 수 있는 것인 약학적 조성물.
16. 제15항에 있어서, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 및 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 서열이 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이된 AAV ITR이 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열(terminal resolution sequence)의 돌연변이를 포함하는 것인 약학적 조성물.
17. 제15항에 있어서, SMN-1 트랜스진이 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 임의로는 프로모터가 척수의 신경세포에서 SMN-1 트랜스진을 발현시킬 수 있는 것인 약학적 조성물.
18. 제17항에 있어서, 프로모터가 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, 또는 닭 β-액틴 프로모터에 연결된 사이토메갈로바이러스 인핸서를 포함하는 것인 약학적 조성물.
19. 제17항에 있어서, SMN-1 트랜스진이 인간 SMN-1 트랜스진인 약학적 조성물.
20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 약학적 조성물.
21. 제20항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 핵산 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 바이러스 입자가 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 재조합 바이러스 유전체를 포함하는 것인 약학적 조성물.
23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 영장류가 인간, 임의로는 소아 대상체 또는 청년인 약학적 조성물.
24. 제23항에 있어서, 인간이 척수성 근위축증을 갖는 것인 약학적 조성물.
25. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 영장류가 내인성 SMN-1 유전자에 돌연변이를 갖거나, 내인성 SMN1 유전자의 부분적 결실을 갖거나, 또는 내인성 SMN-1 유전자의 완전 결실을 갖는 것인 약학적 조성물.
26. 제25항에 있어서, 영장류의 척수 또는 뇌에서의 돌연변이 SMN-1 유전자의 발현이 야생형 SMN-1 유전자를 갖는 영장류에서의 SMN-1의 발현에 비해 불충분한 것인 약학적 조성물.
27. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물이 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
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