KR20190008237A - Ii형 점액다당류증의 치료를 위한 유전자 요법 - Google Patents

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크리스티안 힌더러
제임스 엠. 윌슨
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

hIDS 유전자를 함유하는 발현 카세트의 AAV9-매개된 척추강내 및/또는 전신 전달에 유용한 현탁액이 본 명세서에 제공된다. 또한 헌터 증후군 및 헌터 증후군과 연관된 증상의 치료에 유용한 이들 벡터 및 조성물을 함유하는 키트 및 방법이 제공된다.

Description

II형 점액다당류증의 치료를 위한 유전자 요법
연방 기금 연구의 진술
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)으로부터의 증서 번호 R01DK54481, P40OD010939 및 P30ES013508 하에 정부 지원으로 수행되었다. US 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가질 수 있다.
전자 문서의 참고로서의 포함
본 출원은 파일 번호 "UPN-16-7771PCT_ST.25" 하에 전자적으로 제출된 서열 목록을 참고로 포함한다.
1. 도입부
본 발명은 헌터 증후군(Hunter Syndrome)이라고도 공지된, II형 점액다당류증(Mucopolysaccharidosis Type II: MPS II)의 치료를 위한 유전자 요법 접근법에 관한 것이다.
헌터 증후군으로도 공지된 MPS II는 주로 남성에서, 100,000명 중 1명 내지 170,000명 중 1명에 영향을 주는 희귀한 X-연관된 열성 유전병이다. 이러한 진행형이고, 파괴적인 질환은 IDS 유전자에서의 돌연변이에 의해서 유발되고, 이것은 리소좀 효소, 이두로네이트-2-설페이타제 - 헤파란 설페이트 및 더마탄 설페이트의 리소좀 이화작용에 필요한 효소의 결핍으로 이어진다. GAG(글리코사미노글리칸)이라 지칭되는 이러한 아주 흔한 다당류는, MPS II 환자의 조직 및 기관에서 축적되어, 특징적인 저장 병변 및 다양한 질환 후유증을 초래한다. 이병률 및 사망률은 이러한 환자 집단 -- 중증 표현형을 갖는 환자(신경인지 악화를 특징으로 함)에서 높고, 사망은 11.7세의 평균 연령에서 일어난다고 보고되어 있으며; 경증 또는 약화된 표현형을 갖는 환자에서, 사망은 21.7세로 보고되어 있다.
MPS II를 갖는 환자는 출생 시에는 정상으로 보이나, 질환의 징후 및 증상은 전형적으로 18개월 내지 4세에 심각한 형태로 제시되고, 약화된 형태에서는 4세 내지 8세에 제시된다. 모든 영향을 받은 환자에 대해서 일반적인 징후 및 증상은 저신장, 거친 안면 특징, 대두증, 대설증, 청력 상실, 간- 및 비장비대, 다이스토시스 멀티플렉스(dystosis multiplex), 관절 구축(joint contracture), 척추관 협착증 및 손목 터널 증후군을 포함한다. 빈번한 상기도 및 귀 감염이 대부분의 환자에서 발생하고, 진행형 기도 폐쇄는 수면성 무호흡 및 종종 사망으로 이어진다고 일반적으로 밝혀져 있다. 심장 질환은 이러한 집단에서 사망의 주요 원인이고, 우뇌실 비대 및 좌뇌실 비대 및 심부전으로 이어지는 심장판막 기능장애를 특징으로 한다. 사망은 일반적으로 폐쇄성 기도 질환 또는 심부전으로 인한 것이다.
질환의 중증 형태에서, 초기 발달 이정표는 충족될 수 있지만, 18 내지 24개월까지 발달 지연이 상당히 명백하다. 일부 환자는 1년차에서 청력 선별 검사를 통과하지 못하고, 도움 없이 앉아 있는 능력, 걷는 능력 및 말하기를 비롯한 다른 이정표가 지연된다. 발달 진행은 대략 6.5세에 정체되기 시작한다. MPS II를 갖는 소아의 절반은 배변 훈련이 되지만, 전부는 아니지만, 대부분의 소아는 질환 진행에 따라서 이 능력을 잃어버릴 것이다.
상당한 신경 관여를 갖는 환자는 과잉행동, 고집 및 공격성을 비롯한 심각한 행동 폐해를 나타내는데, 이것은 생애 2년차에서 시작되고, 신경퇴화가 이러한 행동을 약화시키는 경우 8 내지 9세까지 계속된다.
발작은 10세에 도달한 심각하게 영향을 받은 환자의 절반 초과에서 보고되어 있고, 사망 시까지 CNS 관여를 갖는 대부분의 환자는 심각한 지적 장애가 있고, 지속적인 케어가 요구된다. 약화된 질환을 갖는 환자는 정상적인 지적 기능을 나타내지만, MRI 영상은 MPS II를 갖는 모든 환자에서 백질 병변, 비대해진 뇌실 및 뇌 위축을 비롯하여 총 뇌 이상을 나타낸다.
재조합 이두설파제(엘라프라제(Elaprase)(등록상표), 샤이어 휴먼 제네틱 쎄라피즈(Shire Human Genetic Therapies))를 사용한 효소 대체 요법("ERT")이 헌터 증후군을 위해서 유일하게 승인된 치료제이고, 매주 인퓨젼으로서 투여된다. 그러나, 현재 투여되는 ERT는 혈액 뇌 장벽("BBB")을 통과하지 않고, 따라서 중증 질환 - 즉, CNS/신경인지 및 행동 관여를 갖는 MPS II를 갖는 환자에서 충족되지 않은 요구를 해결할 수 없다. 이러한 문제를 해결하기 위한 현재 노력은 BBB를 통과하는 것을 가능하게 하기 위해서 효소를 변형시키는 것을 목적으로 한다.
인간 이두로네이트-2-설페이타제(human iduronate-2-sulfatase: "hIDS") 유전자를 헌터 증후군이라고도 공지된 MPS II로 진단된 환자(인간 대상체)의 CNS로 전달하기 위한 복제 결함 아데노-연관 바이러스(replication deficient adeno-associated virus)("AAV")의 용도가 본 명세서에 제공된다. hIDS 유전자("rAAV.hIDS")를 전달하기 위해서 사용되는 재조합 AAV("rAAV") 벡터는 CNS에 대해서 향성(tropism)을 가져야 하고(예를 들어, AAV9 캡시드를 보유하는 rAAV), hIDS 이식유전자는 특이적 발현 제어 요소, 예를 들어, 거대세포바이러스(CMV) 인핸서와 닭 베타 액틴 프로모터(CB7)의 혼성체에 의해서 제어되어야 한다. 척추강내/수조내(intracisternal) 투여에 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 상용성인 수성 완충액, 계면활성제 및 임의적인 부형제를 포함하는 제형 완충액 중의 rAAV.hIDS 벡터의 현탁액을 포함한다. rAAV 현탁액은 하기를 추가로 특징으로 한다:
(i) rAAV 게놈 카피(GC) 역가는 적어도 1.0 x 1013GC/㎖(+/-20%)이고/이거나;
(ii) rAAV 중공 입자/전입자 비는 SDS-PAGE 분석법(실시예 5D 참고)에 의해서 결정되는 경우 0.01 내지 0.05(95% 내지 99% 중공 캡시드 무함유), 또는 다른 실시형태에서, 적어도 약 50%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 중공 캡시드 무함유이고/이거나; (iii) 적어도 약 2.5 x 1010GC/g 뇌 질량 내지 약 3.6 x 1011GC/g 뇌 질량의의rAAV 현탁액의 용량이 효력을 가짐.
또한 본 명세서에는 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 척추강내 주사에 의해서 투여될 수 있는 본 명세서에 제공된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 rAAV.hIDS를 함유하는 약제학적 조성물의 용도는 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 척추강내 주사에 의해서 투여될 수 있는 의약의 제조에서 사용된다. 인간 대상체(환자)는 점액다당류증 II(MPS II) 또는 중증 헌터 증후군으로 이미 진단될 수 있다.
효력은 시험관내에 세포 배양 검정, 예를 들어, 본 명세서에서 실시예 5G에 기술된 시험관내 효력 검정에 의해서 측정될 수 있는데, 여기서 HEK293 또는 Huh7 세포를 세포당 기지의 다중도의 rAAVGC로 형질도입시키고, 상청액을 4MU-이두로나이드 효소 검정을 사용하여 형질도입 72시간 후 IDS 활성도에 대해서 검정하였다.
이러한 rAAV.hIDS 벡터 제제를 척추강내/수조내 주사에 의해서 소아 또는 성인 인간 대상체에게 투여하여 CNS에서 hIDS 발현의 치료 수준을 달성할 수 있다. 치료 후보인 환자는 중증 또는 약화된 MPS II 질환을 갖는 소아 및 성인 환자이다. 중증 질환은 평균보다 적어도 1 표준 편차 더 낮은 발달 지수(DQ)(BSID-III) 또는 순차 시험에 대해서 1 표준 편차보다 큰 감소의 문서화된 역사적 증거를 갖는 초기 단계 신경인지 결핍으로서 정의된다.
헌터 증후군을 갖는 환자에 대한 rAAV.hIDS의 치료적으로 유효한 척추강내/수조내 용량은 1.4 x 1013 내지 7.0 x 1013GC(고정 용량(flat dose)) - 1010 내지 5 x 1010GC/g 환자의 뇌 질량의 등가물, 또는 3.8 x 1012 내지 7.0 x 1013 GC(고정 용량) - 1010 내지 5 x 1010GC/g 환자의 뇌 질량의 등가물 범위이다. 대안적으로, 하기의 치료적으로 유효한 고정 용량이 제시된 연령군의 환자에게 투여될 수 있다:
Figure pct00001
신생아: 약 3.8 x 1012 내지 약 1.9 x 1014GC;
Figure pct00002
3 내지 9개월: 약 6 x 1012 내지 약 3 x 1014GC;
Figure pct00003
9 내지 36개월: 약 1013 내지 약 5 x 1014GC;
Figure pct00004
3 내지 12세: 약 1.2 x 1013 내지 약 6 x 1014GC;
Figure pct00005
12+세: 약 1.4 x 1013 내지 약 7.0 x 1014GC;
Figure pct00006
18+세(성인): 약 1.4 x 1013 내지 약 7.0 x 1014GC.
일부 실시형태에서, 12+세 MPS II 환자(18+세 포함)에게 투여되는 용량은 1.4 Х 1013게놈 카피(GC)(1.1 Х 1010GC/g 뇌 질량)이다. 일부 실시형태에서, 12+세 MPS II 환자(18+세 포함)에게 투여되는 용량은 7 Х 1013GC(5.6 Х 1010GC/g 뇌 질량)이다. 더 추가의 실시형태에서, MPS II 환자에게 투여되는 용량은 적어도 약 4 x 108GC/g 뇌 질량 내지 약 4 x 1011GC/g 뇌 질량이다. 특정 실시형태에서, MPS II 신생아에게 투여되는 용량은 약 1.4 x 1011 내지 약 1.4 x 1014GC 범위이고; 유아 3 내지 9개월에게 투여되는 용량은 약 2.4 x 1011 내지 약 2.4 x 1014GC 범위이고; MPS II 소아 9 내지 36개월에게 투여되는 용량은 약 4 x 1011 내지 약 4 x 1014GC 범위이고; MPS II 소아 3 내지 12세에게 투여되는 용량은 약 4.8 x 1011 내지 약 4.8 x 1014GC 범위이고; 12+세 소아 및 성인에게 투여되는 용량은 약 5.6 x 1011 내지 약 5.6 x 1014GC 범위이다.
치료 목표는 질환을 치료하기 위한 실행 가능한 접근법으로서 rAAV-기반 CNS-지향된 유전자 요법을 통해서 환자의 결함이 있는 이두로네이트-2-설페이타제를 기능적으로 대체하는 것이다. 요법의 효능은 (a) MPS II(헌터 증후군)를 갖는 환자에서 신경인지 감소의 예방; 및 (b) 질환의 바이오마커, 예를 들어, CSF, 혈청 및/또는 소변, 및/또는 간 및 비장 체적 중의 GAG 수준 및/또는 효소 활성도(IDS 또는 헥소스아미니아다제)의 감소를 평가함으로써 측정될 수 있다. 유아에서의 신경인지는 문헌[Bayley Scales of Infant and Toddler Development, Third Ed., BSID-III]을 통해서 측정될 수 있다. 신경인지 및 적응 행동 평가(예를 들어, 각각 베일리 영아 발달 검사(Bayley Scales of Infant Development) 및 비인랜드 적응 행동 척도(Vineland Adaptive Behavior Scales))를 수행할 수 있다.
치료 이전에, MPS II 환자는 hIDS 유전자를 전달하는 데 사용된 rAAV 벡터의 캡시드에 대한 중화 항체(Nab)에 대해서 평가될 수 있다. 이러한 Nab는 형질도입 효율과 경쟁하고, 치료 효능을 감소시킬 수 있다. 1:5 이하의 기준선 혈청 Nab 역가를 갖는 MPS II 환자가 rAAV.hIDS 유전자 요법 프로토콜로의 치료에 대한 양호한 후보자이다. 1:5 초과의 혈청 Nab의 역가를 갖는 MPS II 환자의 치료는 병용 요법, 예컨대, rAAV.hIDS 벡터 전달로의 치료 이전에 그리고/또는 치료 동안 면역억제제와의 일시적인 공동 치료가 필요할 수 있다. 임의로, 면역억제 공동-요법은 AAV 벡터 캡시드 및/또는 제형의 다른 성분에 대한 중화 항체의 이전 평가 없이 예방 조치로서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이전 면역억제 요법이 특히, IDS 활성도 수준을 사실상 갖지 않는 환자(여기서 이식유전자 산물은 "이물"로서 인지될 수 있음)에서, hIDS 이식유전자 산물에 대해서 잠재적인 부정적인 면역 반응을 예방하는 것이 바람직할 수 있다. 동물에서 관찰되는 것과 유사한 반응이 인간 대상체에서 일어날 수 있지만, 예방 면역억제 요법이 rAAV-hIDS의 모든 수여자에 대해서 권고된다.
hIDS의 전신 전달을 수반한 CNS에 대한 rAAV.hIDS의 유전자 요법 전달의 조합이 본 발명의 방법에 포함된다. 전신 전달은 이두설파제(예를 들어, 엘라프라제(등록상표) 사용)의 ERT 인퓨젼, 또는 간에 대해서 향성을 갖는 rAAV.hIDS를 사용한 추가적인 유전자 요법(예를 들어, AAV8 캡시드 보유 rAAV.hIDS)을 사용하여 성취될 수 있다.
특정 실시형태에서, 환자를 hIDS에 대해서 관용화(tolerizing)시키기 위해서 간-지향된 주사를 통해서 환자에게 AAV.hIDS가 투여되고, CNS에서 hIDS의 치료적 농도를 발현하기 위해서 환자가 유아, 소아 및/또는 성인인 경우 그 다음 척추강내 주사를 통해서 환자에게 AAV.hIDS가 투여된다.
특정 실시형태는, (i) 본 발명의 rAAV.hIDS 벡터로의 치료가 IDS 발현을 정상화하였고; 질환의 바이오마커를 감소시켰고; 행동(CNS) 증상을 개선시켰다는 것을 예증한 MPS II의 마우스 모델(하기 실시예 2에 기술됨)에서 생성된 유망한 데이터; 및 (ii) 하기 실시예 3에 기술된 바와 같은 비인간 영장류(NHP)에서의 안전성 및 생체분포 연구를 부분적으로 기반으로 한다. 본 발명의 특정 실시형태는 rAAV.hIDS 약제학적 조성물(하기 실시예 4 및 5)의 제조 및 특징규명을 기술하는 예의 방식에 의해서 예시된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "척추강내 전달" 또는 "척추강내 투여"는, 약물이 뇌척수액(CSF)에 도달하도록 척추관, 보다 구체적으로는 지주막하 공간 내로의 주사를 통한 약물에 대한 투여 경로를 지칭한다. 척추강내 전달은 요추 천자(lumbar puncture), 뇌실내(intraventricular), 후두골하(suboccipital)/수조내(intracisternal), 및/또는 C1-2 천자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 물질은 요추 천자에 의해서 지주막하 공간을 통한 확산을 위해서 도입될 수 있다. 또 다른 예에서, 주사는 대수조(cisterna magna) 내로 행해질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수조내 전달" 또는 "수조내 투여"는 대수조 소뇌연수의 뇌척수액 내로 직접, 보다 구체적으로는 후두골하 천자를 통해서 또는 대수조 내로의 직접 주사에 의해서 또는 영구적으로 배치된 관을 통해서인 것인 약물에 대한 투여 경로를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료적 유효량"은 표적 세포에서 MPS II의 증상 중 하나 이상을 개선시키거나 치료하기에 충분한 효소의 양을 전달 및 발현하는 AAV.hIDS 조성물의 양을 지칭한다. "치료"는 MPS II 증후군 중 하나의 증상의 악화의 예방 및 가능하게는 이의 증상 중 하나 이상의 반전을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료적 유효량의 rAAV.hIDS는 MPS II를 갖는 환자에서 신경인지 기능을 개선시키는 양이다. 이러한 신경인지 기능의 개선은 베일리 영유아 발달 검사를 사용한 대상체의 신경인지 발달 지수(DQ)를 평가함으로써 측정될 수 있다. 신경인지 기능의 개선은 또한 예를 들어, 웩슬러 지능 검사(Wechsler Abbreviated Scale of Intelligence: WASI)(IQ), 베일리 유아 발달 검사, 홉스킨 언어 학습 시험(Hopkins Verbal Learning Test)(기억력), 및/또는 주의력 검사(Tests of Variables of Attention: TOVA)의 사용을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여, 대상체의 지능 지수(IQ)를 평가함으로써 측정될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 치료적 유효량의 rAAV.hIDS는 소변 및/또는 뇌척수액 및/또는 혈청 및/또는 다른 조직 중의 병원성 GAG, 헤파란 설페이트, 및/또는 헥소스아미니다제 농도를 감소시키는 양이다. 추가의 다른 실시형태에서, 각막 혼탁의 교정이 관찰될 수 있고, 중추신경계(CNS)에서의 병변의 교정이 관찰되고/관찰되거나 혈관주위 및/또는 뇌막 gag 저장의 반전이 관찰된다.
"치료적 유효량"은 인간 환자가 아닌, 동물 모델을 기반으로 결정될 수 있다. 적합한 뮤린(murine) 모델의 예가 본 명세서에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "기능성 인간 이두로네이트-2-설페이타제"는 MPS II 또는 연관된 증후군이 없는 인간에서 일반적으로 기능하는 인간 이두로네이트-2-설페이타제 효소를 지칭한다. 이에 반해서, MPS II 또는 연관된 증후군을 유발하는 인간 이두로네이트-2-설페이타제 효소 변이체는 비-기능성이라고 간주된다. 일 실시형태에서, 기능성 인간 이두로네이트-2-설페이타제는 문헌[Wilson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (21): 8531-8535 (1990)]에 기술된 야생형 인간 이두로네이트-2-설페이타제의 아미노산 서열, 즉, 서열번호 2(550개 아미노산)에 제시된 NCBI 참조 서열 NP_000193.1을 갖고, 이러한 프레프로단백질은 신호 펩타이드(아미노산 1 내지 25), 프로-펩타이드(아미노산 26 내지 33) 및 아미노산 34 내지 455(42kDa 쇄) 및 아미노산 456 내지 550(14kDa 쇄)으로 구성된 성숙 펩타이드를 포함한다(UniProtKB/Swiss-Prot (P22304.1) 참고).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "NAb 역가"는 이의 표적화된 에피토프(예를 들어, AAV)의 생리학적 효과를 중화시키는 얼마나 많은 중화 항체(예를 들어, 항-AAV Nab)가 생산되는지에 대한 척도를 지칭한다. 항-AAV NAb 역가는 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009. 199(3): p. 381-390]에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "발현 카세트"는 IDS 유전자, 프로모터를 포함하는 핵산 분자를 지칭하고, 이를 위한 다른 조절 서열을 포함할 수 있고, 이 카세트는 유전 요소(예를 들어, 플라스미드)를 통해서 패키징 숙주 세포로 전달되어, 바이러스 벡터(예를 들어, 바이러스 입자)의 캡시드 내에 패키징될 수 있다. 전형적으로, 바이러스 벡터를 생성시키기 위한 이러한 발현 벡터는 바이러스 게놈의 패키징 신호에 의해서 플랭킹된 본 명세서에 기술된 IDS 암호 서열 및 다른 발현 제어 서열, 예컨대 본 명세서에 기술된 것을 함유한다.
약어 "sc"는 자가-상보성을 지칭한다. "자가-상보성 AAV"는 재조합 AAV 핵산 서열에 의해서 보유된 암호 영역이 분자내 이중 가닥 DNA 템플레이트를 형성하도록 설계된 작제물을 지칭한다. 감염 시, 제2 가닥의 세포 매개된 합성을 기다리지 않고, scAAV의 2개의 상보성 절반부는 회합하여 즉각적인 복제 및 전사 준비가 된 하나의 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 형성할 것이다(예를 들어, 문헌[DM McCarty et al, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254] 참고). 자가-상보성 AAV는 예를 들어, 각각 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,596,535호; 제7,125,717호; 및 제7,456,683호에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 관심 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 트랜스로 또는 관심 유전자를 제어하도록 하는 거리에서 작용하는 발현 제어 서열 둘 모두를 지칭한다.
용어 "이종성(heterologous)"은 단백질 또는 핵산과 관련하여 사용되는 경우 단백질 또는 핵산이 본래 서로와 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 포함하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 새로운 기능성 핵산을 제조하도록 배열된 관련되지 않은 유전자로부터의 2개 이상의 서열을 갖는 핵산은 전형적으로 재조합 방식으로 생산된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 핵산은 상이한 유전자로부터 암호 서열의 발현을 유도하도록 배열된 하나의 유전자로부터의 프로모터를 갖는다. 따라서, 암호 서열과 관련하여, 프로모터는 이종성이다.
"복제-결함 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심 유전자를 함유하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프(envelope) 내에 패키징된 합성 또는 인공 바이러스 입자를 지칭하고, 여기서 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프 내에 또한 패키징된 임의의 바이러스 게놈 서열은 복제-결함이고; 즉, 이들은 자손 비리온을 생성할 수 없지만 표적 세포를 감염시키는 능력을 보유한다. 일 실시형태에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제에 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 포함하지 않지만(게놈은 "거트리스(gutless)"- 인공 게놈의 증폭 및 패키징에 필요한 신호에 의해서 플랭킹된 관심 이식유전자 만을 함유함이도록 조작될 수 있음), 이들 유전자는 생산 동안 공급될 수 있다. 따라서, 그것은 유전자 요법에서 사용하기에 안전한 것으로 여겨지는데, 그 이유는 복제에 필요한 바이러스 효소의 존재 하에서를 제외하고는 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 일어날 수 없기 때문이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "재조합 AAV9 바이러스 입자"는 목적하는 유전자 산물을 위한 발현 카세트를 포함하는 이종성 핵산 분자가 내부에 패키징된 캡시드인, AAV9 캡시드를 갖는 뉴클레아제-내성 입자(NRP)를 지칭한다. 이러한 발현 카세트는 전형적으로 유전자 서열을 플랭킹한 AAV 5' 및/또는 3' 반전 말단 반복부 서열을 함유하며, 여기서 유전자 서열은 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 발현 카세트의 이들 및 다른 적합한 요소는 하기에 보다 상세하게 기술되어 있고, 이식유전자 게놈 서열로서 본 명세서에서 대안적으로 지칭될 수 있다. 이것은 또한 "전(full)" AAV 캡시드라 지칭될 수 있다. 이러한 rAAV 바이러스 입자는, 그것이 발현 카세트에 의해서 보유된 목적하는 유전자 산물을 발현할 수 있는 숙주 세포에 이식유전자를 전달하는 경우 "약물학적으로 활성"이라고 지칭된다.
다수의 예에서, rAAV 입자는 "DNase 내성"이라고 지칭된다. 그러나, 이러한 엔도뉴클레아제(DNase)에 더하여, 다른 엔도- 및 엑소- 뉴클레아제가 또한 본 명세서에 기술된 정제 단계에 사용되어, 오염된 핵산을 제거할 수 있다. 이러한 뉴클레아제는 단일 가닥 DNA 및/또는 이중 가닥 DNA, 및 RNA를 분해하도록 선택될 수 있다. 이러한 단계는 단일 뉴클레아제, 또는 상이한 표적에 지향된 뉴클레아제의 혼합물을 함유할 수 있고, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제일 수 있다.
용어 "뉴클레아제-내성"은, AAV 캡시드가 이식유전자를 숙주 세포에 전달하도록 설계된 발현 카세트 주변에서 완전히 조립되고, 생산 공정으로부터 존재할 수 있는 오염된 핵산을 제거하도록 설계된 뉴클레아제 인큐베이션 단계 동안 분해(소화)로부터 이들 게놈 서열을 보호하는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "AAV9 캡시드"는 젠뱅크 수탁: AAS99264의 아미노산 서열을 갖는 AAV9를 지칭하고, 이것은 본 명세서에 참고로 포함되고, AAV vp1 캡시드 단백질은 서열번호 13에 다시 제시되어 있다. 이러한 암호화화된 서열로부터의 일부 변이는 본 발명에 포함되고, 이것은 젠뱅크 수탁: AAS99264, 서열번호 13 및 미국 특허 제US7906111호(또한 국제 특허 제WO 2005/033321호)(즉, 참조 서열로부터 약 1% 미만의 변이)에서의 참조 아미노산 서열과 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 AAV는 예를 들어, 자연 단리물(예를 들어, hu31 또는 hu32), 또는 예를 들어, AAV9 캡시드와 정렬된 임의의 다른 AAV 캡시드 내의 상응하는 위치로부터 "모집된" 대안적인 잔기로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 갖는 AAV9의 변이체; 예를 들어, 예컨대 미국 특허 제US 9,102,949호, 제US 8,927,514호, 제US2015/349911호; 국제 특허 제WO 2016/049230A1호에 기술된 것을 포함할 수 있다. 그러나, 다른 실시형태에서, AAV9의 다른 변이체, 또는 상기-참조 서열과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 AAV9 캡시드가 선택될 수 있다(예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2015/0079038호 참고). 캡시드, 따라서 암호 서열을 생성하는 방법 및 rAAV 바이러스 벡터의 생산 방법이 기술되어 있다(예를 들어, 문헌[Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)] 및 미국 특허 제US 2013/0045186A1호 참고).
용어 "AAV9 중간체" 또는 "AAV9 벡터 중간체"는 내부에 패키징된 목적하는 게놈 서열이 결여된 조립된 rAAV 캡시드를 지칭한다. 이들은 또한 "중공" 캡시드라 지칭될 수 있다. 이러한 캡시드는 발현 카세트의 어떠한 검출 가능한 게놈 서열도 함유할 수 없거나, 또는 유전자 산물의 발현을 달성하기에 불충분한 단지 부분적으로 패키징된 게놈 서열을 함유할 수 있다. 이들 중공 캡시드는 관심 유전자를 숙주 세포에 전달하기에 비-기능성이다.
단수 표현은 하나 이상을 지칭한다. 이와 같이, 단수 표현, "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
단어 "포함하다", "포함한다", 및 "포함하는"은 배타적인 것이 아니라 포괄적인 것으로 이해되어야 한다. 단어 "이루어지다", "이루어진", 및 이의 변형은, 포괄적인 것이 아니라 배타적인 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 다양한 실시형태가 다른 상황 하에서, 표현 "포함하는"을 사용하여 제시되는 경우, 관련된 실시형태는 표현 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진"을 사용하여 설명 및 기술되도록 의도된다.
용어 "약"은 달리 명시되지 않는 한 ± 10%를 비롯한 이것 내의 변형을 포함한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서서 사용된 기술 용어 및 과학 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 출원에서 사용되는 용어 중 다수에 대한 일반적인 지침을 제공하는 공개된 문헌을 참고로 한다.
도 1은 AAV9.CB.hIDS 벡터 게놈의 개략적인 표현. IDS 발현 카세트는 반전 말단 반복부(ITR)에 의해서 플랭킹되어 있고, 발현은 거대세포바이러스(CMV) 인핸서 및 닭 베타 액틴 프로모터(CB7)의 혼성체에 의해서 유도된다. 이식유전자는 닭 베타 액틴 인트론 및 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화(폴리A) 신호를 포함한다.
도 2A 내지 2C는 IT 벡터 처리 후 MPS II 마우스의 CNS 및 혈청에서의 IDS 발현을 제공한 도면. MPS II 마우스를 2 내지 3개월령에서 AAV9.CB.hIDS의 ICV 주사로 하기 3종의 용량 중 하나로 처리하였다: 3 x 108GC(저), 3 x 109GC(중) 또는 3 x 1010GC(고). 동물을 주사 3주 후에 희생시켰다. IDS 활성도를 CSF(도 2A), 호모제네이트(homogenate)(도 2B) 및 혈청(도 2C)에서 측정하였다. 야생형 및 미처리 MPS II 마우스를 대조군으로서 사용하였다.
도 3은 AAV9.CB.hIDS 투여된 MPS II 마우스에서 벡터 DNA의 생체분포를 제공한 도면. MPS II 마우스를 3 x 1010GC의 AAV9 벡터의 ICV 주사로 처리하였다. 주사 3주 후에, 동물을 희생시키고, 벡터 게놈을 태크만(Taqman) PCR에 의해서 조직 DNA에서 정량하였다.
도 4A 내지 4D는 MPS II 마우스에서 IT 벡터 전달 후 말초 GAG의 보정을 제공한 도면. MPS II 마우스를 2 내지 3개월령에서 AAV9.CB.hIDS의 ICV 주사로 하기 3종의 용량 중 하나로 처리하였다: 3 x 108GC(저), 3 x 109GC(중) 또는 3 x 1010GC(고). 동물을 주사 3개월 후에 희생시켰다. 헥소스아미니다제 활성도를 간(도 4A) 및 심장(도 4B)에서 측정하였다. 간에서는 모든 용량에서 그리고 심장에서는 중- 및 고-용량에서 저장 보정이 인지되었다. GAG 함량을 간(도 4C) 및 심장(도 4D)에서 측정하였다. 야생형 및 미처리 MPS II 마우스를 대조군으로서 사용하였다. *p < 0.05, 일측 ANOVA는 듀넷 시험(Dunnett's test)을 따랐다.
도 5A 내지 5L은 MPS II 마우스에서 뇌 저장 병변의 용량-의존적인 분해능을 제공한 도면. MPS II 마우스를 2 내지 3개월령에서 AAV9.CB.hIDS의 ICV 주사로 하기 3종의 용량 중 하나로 처리하였다: 3 x 108GC(저), 3 x 109GC(중) 또는 3 x 1010GC(고). 동물을 주사 3개월 후에 희생시키고, 뇌를 리소좀 막 단백질 LIMP2 및 강글리오사이드 GM3에 대해서 염색하였다. GM3(도 5A, 5C, 5E, 5G 및 5I) 및 LIMP2(5B, 5D, 5F, 5H and 5J)에 대해서 양성으로 염색된 세포를 각각의 동물로부터의 4개의 피질 뇌 단편에서 맹검 검토자에 의해서 정량하였다. 대표적인 피질 뇌 단편을 도시한다(GM3, 도 5K; LIMP2, 도 5L). 야생형 및 미처리 MPS II 마우스를 대조군으로서 사용하였다. *p < 0.05, 일측 ANOVA는 듀넷 시험을 따랐다.
도 6A 내지 6C는 벡터-처리 MPS II 마우스에서 개선된 물체 식별을 나타낸 도면. 미처리 MPS II 마우스 및 WT 수컷 한배새끼를 4 내지 5개월령에 행동 시험에 적용하였다. MPS II 마우스를 2 내지 3개월령에서 AAV9.CB.hIDS의 ICV 주사로 하기 3종의 용량 중 하나로 처리하였다: 3 x 108GC(저), 3 x 109GC(중) 또는 3 x 1010GC(고). 주사 2개월 후 동물을 행동 시험에 적용하였다. 도 6A는 Y 미로 행동을 도시하고, 도 6B는 공포 상황 조건화(contextual fear conditioning)를 도시하는데, 이것은 맹검 검토자에 의해서 주사 2개월 후에 평가되었다. "Pre"는 비신호화 1.5mA 발 쇼크를 제공한지 24시간 후에 인클로저에 재노출되는 경우 프리징 시간(freezing time)을 나타내었다. *p < 0.05, 이측 ANOVA는 시닥 다중 비교 시험(Sidak's multiple omparisons test)을 따랐다. 도 6C는 신규 물체 인식 시험에서 신규 물체 또는 익숙한 물체를 탐색하는 데 소모되는 백분율 시간을 나타내는데, 이것은 장기간 기억력을 평가하는 데 사용된다. 야생형 및 미처리 MPS II 마우스를 대조군으로서 사용하였다. *p < 0.05, 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 t-시험.
도 7A 및 7B는 IT AAV9로 처리된 MPS I 마우스에서 효소 발현 및 뇌 저장 병변의 보정의 비교를 제공한 도면. MPS I 마우스를 2 내지 3개월령에서 AAV9.CB.hIDUA의 ICV 주사로 하기 3종의 용량 중 하나로 처리하였다: 3 x 108GC(저), 3 x 109GC(중) 또는 3 x 1010GC(고). 동물의 하나의 코호트를 벡터 주사 3주 후에 희생시키고, IDUA 활성도의 측정을 위해서 뇌를 수거하였다. 이것을 도 7A에 나타낸다. 도 7B는 동물의 제2 코호트를 나타내는데, 이것은 동물을 주사 3개월 후에 희생시키고, 뇌를 리소좀 막 단백질 LIMP2에 대해서 염색하였다. LIMP2에 대해서 양성으로 염색된 세포를 4개의 피질 뇌 단편에서 맹검 검토자에 의해서 정량하였다. 야생형 및 미처리 MPS II 마우스를 대조군으로서 사용하였다. *p < 0.05, 일측 ANOVA는 듀넷 시험을 따랐다.
도 8은 ICV AAV9.CB.hIDS 처리된 MPS II 마우스에서 인간 IDS에 대한 항체 반응을 나타낸 도면. MPS II 마우스를 2 내지 3개월령에서 AAV9.CB.hIDS의 ICV 주사로 하기 3종의 용량 중 하나로 처리하였다: 3 x 108GC(저), 3 x 109GC(중) 또는 3 x 1010GC(고). 벡터 투여 21일 또는 90일 후 희생시킨 마우스로부터의 부검에서 혈청을 수집하였다. 인간 IDS에 대한 항체를 간접 ELISA에 의해서 평가하였다. 점선은 미치료 동물로부터의 미경험(naive) 혈청에서 평균 역가를 초과한 2 SD를 나타낸다. 대부분의 동물은 검출 가능한 항체를 갖지 않았다(미경험 혈청의 배경 수준).
도 9A 내지 9D는 MPS II 마우스에서 일반 오픈 필드 활성도 및 Y 미로 성능을 예시한다. 미처리 MPS II 마우스 및 WT 수컷 한배새끼를 4 내지 5개월령에 행동 시험에 적용하였다. 오픈 필드 활성도는 수평 활성도의 경우에는 XY 축 빔 브레이크(도 9A), 수직 활성도의 경우에는 Z 축 빔 브레이크(도 9B) 및 중심 활성도의 경우에는 백분율 중심 빔 브레이크에 의해서 측정되었다(도 9C). 총 아암 입장(도 9D)을 8분 Y 미로 시험 세션 동안 기록하였다.
도 10A 및 10B는 제조 공정 흐름도를 제공한 도면.
도 11은 동축 삽입 방법을 위한 임의적인 도입기 니들(28)을 포함하는 약제학적 조성물의 수조내 전달을 위한 장치(10)의 도면이고, 이것은 10cc의 벡터 주사기(12), 10cc의 사전 충전된 플러쉬 주사기(14), T-연결기 연장 세트(튜빙(20), 튜빙의 단부의 클립(22) 및 연결기(24)), 22G x 5" 척추 니들(26), 및 임의적인 18G x 3.5" 도입기 니들(28)을 포함한다. 또한 교접한 수 루어 락(swive male luer lock)을 갖는 4-웨이 스탑콕(16)이 도시되어 있다.
도 12A 내지 12I는 ICV AAV9로 치료된 개에서 뇌염 및 이식유전자 특이적 T 세포 반응을 도시한다. 1년령 MPS I 개를 GFP를 발현하는 AAV9 벡터의 단일 ICV 또는 IC 주사로 처리하였다. 주사 12일 후에 죽은 것으로 발견된 I-567을 제외하고는, 모든 동물을 주사 14일 후에 희생시켰다. 뇌를 관상 단편으로 나누었고, 이것은 ICV 처리된 동물에서 주사 부위 부근의 전체 병변을 드러내었다(화살촉)(도 12A 내지 12F). 전체 병변을 둘러싼 뇌 영역으로부터의 조직 단편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다(도 12G 및 12H). 본래 배율 = 4 x (좌측 패널), 및 20 x (우축 패널). 말초 혈액 단핵구 세포를 부검 시에 1마리의 ICV 처리된 개(I-565)로부터 수집하고, AAV9 캡시드 및 인간 IDUA 단백질에 대한 T 세포 반응을 인터페론-γ ELISPOT로부터 측정하였다(도 12I). GFP 이식유전자 산물에 대한 T 세포 반응을 완전 GFP 서열을 포함하는 중첩하는 15개 아미노산 펩타이드의 단일 풀을 사용하여 측정하였다. AAV9 캡시드 단백질을 포함하는 펩타이드를 3개의 풀(풀 A 내지 C로 지정함)로 나누었다. * = 양성 반응, 배경(비자극 세포)의 3-배 초과 및 55개 스팟/백만개 세포 초과로서 정의됨. 파이토헤마글루티닌(PHA) 및 이오노마이신과 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)가 T 세포 활성화에 대한 양성 대조군으로서 제공되었다.
도 13은 ICV 또는 IC AAV9로 처리된 개에서 벡터 생체분포를 나타낸 막대 차트. 주사 12일 후 부검한 동물 I-567을 제외하고는, GFP를 발현하는 AAV9 벡터의 단일 ICV 또는 IC 주사로의 주사 14일 후 개를 희생시켰다. 벡터 게놈을 정량 PCR에 의해서 조직 샘플에서 검출하였다. 벡터 게놈 카피/이배체 세포(GC/이배체 게놈)로서 값을 표현한다. 해마 또는 대뇌 피질로부터 수집된 뇌 샘플을 ICV 처리된 개의 경우 주사된 반구 또는 주사되지 않은 반구 중 어느 하나로서 나타내고; IC 처리된 동물의 경우 이들은 각각 우 반구 및 좌 반구이다. 동물 I-567의 주사된 대뇌 반구로부터의 PCR을 위해서 샘플을 수집하지 않았다.
도 14A 내지 14H는 ICV 또는 IC AAV9로 처리된 개의 뇌 및 척수에서 GFP 발현을 나타낸 도면. GFP를 발현하는 AAV9 벡터의 ICV 또는 IC 주사로 처리된 개로부터 수집된 뇌 및 척수 샘플의 직접 형광 현미경 관찰법에 의해서 GFP 발현을 평가하였다. 대표적인 단편을 전두엽의 샘플 및 경부, 흉부, 및 요추 수준에서 수집된 척수의 전각(anterior horn)으로부터의 샘플에 대해서 나타낸다. 본래 배율 = 10 x.
도 15A 내지 15Q는 리소좀 효소 β-글루쿠로니다제(GUSB)를 발현하는 ICV AAV9로 치료된 MPS VII 개에서 뇌염의 부재 및 안정적인 이식유전자 발현을 나타낸 도면. GUSB의 유전적 결합을 갖는 6주령 개(MPS VII의 모델)를 GUSB를 발현하는 AAV9 벡터의 단일 ICV 주사로 처리하였다. GUSB 효소 활성도를 주사 시, 주사 7일 후 및 21일 후에 수집된 CSF 샘플에서 측정하였다(도 15A). 개를 주사 3주 후에 희생시킨다. 주사 부위를 둘러싼 뇌 영역의 전체 및 현미경 평가를 수행하였다(도 15B 내지 15D). 본래 배율 = 4 x (중심 패널), 및 10 x (우측 패널). 활성 GUSB에 의해서 절단되는 경우 적색 산물을 생성하는 기질을 사용하여 뇌 및 척수 단편에서 GUSB 활성도를 검출하였다(도 15E 내지 15N). 대표적인 단편을 대뇌 피질, 소뇌 및 경부, 흉부, 및 요추 수준에서 수집된 척수의 전각의 샘플에 대해서 나타낸다. 본래 배율 = 4 x (피질 및 소뇌), 및 10 x (척수). 미처리 MPS VII 개, 정상 개, 및 ICV AAV9로 처리된 MPS VII 개로부터 수집된 대뇌 피질의 단편을 강글리오사이드 GM3에 대해서 염색하였는데, 이것은 MPS VII 개의 뇌에 병리학적으로 축적된다(도 15O 내지 15Q). 본래 배율 = 4 x.
도 16A 내지 16B는 비인간 영장류(NHP)에서 요추 척추강내 주사 후에 조영제 분포를 나타낸 도면. 성체 시노몰거스 마카크(cynomolgus macaque)에게 5㎖의 이오헥솔(Iohexol) 180 중에 용해된 AAV9 벡터의 요추 천자를 통한 척추강내 주사를 제공하였다. 척수를 따른 조영제의 분포를 형광투시법(fluoroscopy)에 의해서 평가하였다. 흉부 및 경부 영역의 대표적인 영상을 나타낸다. 조영제 물질(화살촉)이 모든 동물에서 주사 10분 이내에 척수의 전체 길이를 따라서 보였다.
도 17은 척추강내 AAV9로 처리된 NHP에서 벡터 생체분포를 나타낸 막대 차트. 5㎖의 이오헥솔 180 중에 용해된 AAV9 벡터의 요추 천자를 통한 척추강내 주사 14일 후에 NHP를 희생시켰다. 동물 중 2마리를 주사 후 10분 동안 트렌델렌버그 자세(Trendelenburg position)로 두었다. 벡터 게놈을 정량 PCR에 의해서 조직 샘플에서 검출하였다. 벡터 게놈 카피/이배체 세포(GC/이배체 게놈)로서 값을 표현한다.
도 18A 내지 18H는 척추강내 AAV9로 처리된 NHP의 뇌 및 척수에서 GFP 발현을 나타낸 도면. AAV9 벡터의 척추강내 주사로 처리된 NHP로부터 수집된 뇌 및 척수 샘플의 직접 형광 현미경 관찰법에 의해서 GFP 발현을 평가하였다. 벡터를 요추 천자에 의해서 투여하였다. 동물 중 2마리를 주사 후 10분 동안 트렌델렌버그 자세로 두었다. 대표적인 단편을 전두엽의 샘플 및 경부, 흉부, 및 요추 수준에서 수집된 척수의 전각(anterior horn)으로부터의 샘플에 대해서 나타낸다. 일부 NHP 조직에서 자가형광 물질의 존재로 인해서, 적색 채널 영상을 포획하여 GFP 신호로부터의 자가형광을 구별하였다. 자가형광 영상은 자홍색으로 중첩된다. 본래 배율 = 4 x (피질), 및 10 x (척수).
도 19A 및 19B는 MPS I에서 증가된 CSF 스퍼민을 나타낸 도면. MPS I 개(n = 15) 및 정상 대조군(n = 15)으로부터의 CSF 샘플 상에서 고 처리량 LC/MS 및 GC/MS 대사산물 스크린을 수행하였다. 상위 100개의 별개로 검출된 대사산물의 히트맵(ANOVA)을 도시한다(도 19A). MPS I 코호트에서 가장 젊은 동물(28일령)을 별표로 나타낸다. MPS I을 갖는 6마리의 유아 및 2마리의 정상 유아로부터의 CSF 샘플에서 정량적 동위원소 희석 LC/MS 검정에 의해서 스퍼민 농도를 측정하였다(도 19B).
도 20A 내지 20J는 MPS I 뉴런에서 스퍼민 의존적인 비정상적인 신경돌기 성장을 나타낸 도면. E18 야생형 또는 MPS I 마우스 배아로부터 수거된 피질 뉴런을 플레이팅(plating) 24시간 후 스퍼민(50ng/㎖) 또는 스퍼민 신타제 저해제 APCHA로 처리하였다. 위상차 영상을 플레이팅 96시간 후 획득하였다(도 20A 내지 20D). 맹검 검토자에 의해서 처리 조건당 2개 반복 배양물로부터의 45 내지 65개의 무작위로 선택된 뉴런에 대해서 신경돌기 수, 길이 및 가지를 정량하였다(도 20E 및 20H, 20G 및 20J, 및 20F 및 20I). *** p < 0.0001(ANOVA는 듀넷 시험에 따름).
도 21A 내지 21K는 유전자 요법 이후에 MPS I 개에서 CSF 스퍼민 수준 및 뇌 GAP43 발현의 정상화를 도시한 도면. 5마리의 MPS I 개를 1개월령에서 개 IDUA를 발현하는 AAV9 벡터의 척추강내 주사로 처리하였다. 일부 MPS I 개에서 IDUA에 대해서 도출되는 항체 반응을 예방하기 위해서 개 중 2마리(I-549, I-552)를 출생 후 1일에 간 지향된 유전자 요법에 의해서 IDUA에 대해서 관용화시켰다. 척추강내 벡터 주사 6개월 후, IDUA 활성도를 뇌 조직에서 측정하였다(도 21A). 리소좀 막 단백질 LIMP2에 대한 염색에 의해서 뇌 저장 병변을 평가하였다(도 21B 내지 21H). GAP43을 웨스턴 블롯(도 21I)에 의해서 피질 뇌 샘플에서 측정하고, 덴시오메트리(densitometry)(도 21J)에 의해서 β-액틴에 대해서 정량하였다. 동위원소 희석 LC/MS에 의해서 희생 시에 CSF 스퍼민을 측정하였다(도 21K). 미처리 MPS I 개(n = 3) 및 정상 개(n = 2)를 대조군으로서 제공하였다. * p < 0.05(크러스칼-발리스 시험(Kruskal-Wallis test) 후 던 시험(Dunn's test)).
도 22A 및 22B는 MPS I에서 CNS 지향된 유전자 요법의 평가를 위해서 CSF 바이오마커로서 스퍼민을 사용하는 것을 예시한 도면. 출생 시에 인간 IDUA에 대해서 관용화된 6마리의 MPS I 개를 1개월령에 인간 IDUA(1012GC/㎏, n = 2, 1011GC/㎏, n = 2, 1010GC/㎏, n = 2)를 발현하는 척추강내 AAV9로 처리하였다. CSF 스퍼민 수준을 처리 6개월 후에 측정하였다(도 22A). 3마리의 MPS I 고양이를 고양이 IDUA를 발현하는 척추강내 AAV9(1012GC/㎏)로 처리하였다. CSF 스퍼민을 치료 6개월 후에 정량하였다(도 22B). 미처리 MPS I 개(n = 3) 및 정상 개(n = 2)를 대조군으로서 제공하였다.
도 23은 랜덤 포레스트 분석법(random forest analysis)에 의해서 식별된 대사산물에 대한 평균 감소 정확도를 도시한 도면.
도 24는 MPS I 개 뇌 샘플에서 폴리아민 합성 경로에서 효소의 발현을 도시한 도면.
도 25는 MPS VII 개 CSF에서 스퍼민 농도를 도시한 도면.
도 26A 내지 26C는 WT 뉴런 성장에 대해서 APCHA 처리가 영향이 없음을 도시한 도면.
도 27은 다양한 용량(3e8, 3 x 108GC; 3e9, 3 x 109GC; 3e10, 3 x 1010GC)을 사용하여 ICV AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG로 처리된 MPS II 마우스(IDSγ/-)에서 MPS II-관련된 병리학 발견의 용량 의존적인 감소를 도시한 도면. 누적 병리학 점수를 평가하고, y-축 상에 플롯팅하였다. 이형접합 마우스(IDSγ/+)를 대조군으로서 제공하였다. 결과는, ICV AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG로 처리된 MPS II 마우스에서 MPS II-관련된 병리학 발견의 용량 의존적인 감소를 예증하였다.
도 28은 실시예 9에 기술된 레서스 마카크에서 CSF 플레오사이토시스(pleocytosis)를 도시한 도면. 백혈구(백혈구, y축)를 다양한 일(x 축, 0일, 7일, 14일, 21일, 30일, 45일, 60일 및 90일)에 수집된 CSF 샘플에서 계수하였다. 다이아몬드는 AAV9.CB7.hIDS로 처리되지 않은 RA 2198로부터의 데이터를 나타낸다. 사각형, 삼각형 및 x는 각각 5x1013GC의 AAV9.CB7.hIDS로 치료된 RA 1399, RA 2203 및 RA 2231로부터의 데이터를 나타내낸다. *, 원 및 +는 각각 1.7 x1013GC의 AAV9.CB7.hIDS로 처리된 RA 1358, RA 1356 and RA 2197로부터의 데이터를 나타낸다.
도 29는 실시예 9에 기술된 바와 같이 60일에 NHP의 혈청에서 발생된 항 hIDS 항체를 측정한 ELISA 결과를 나타낸다. 희석을 x 축으로 플롯팅하고, 광학 밀도(OD)를 y축으로 플롯팅하였다. 다이아몬드는 AAV9.CB7.hIDS로 처리되지 않은 RA2198로부터의 데이터를 나타낸다. 사각형은 1.7 x1013GC의 AAV9.CB7.hIDS로 처리된 RA2197로부터의 데이터를 나타내는 반면, 삼각형 및 x는 각각 5x1013GC의 AAV9.CB7.hIDS로 처리된 RA 2203 및 RA 2231의 데이터를 나타낸다.
hIDS 유전자를 MPS II로 진단된 환자(인간 대상체)의 CNS로 전달하기 위한 복제 결함 AAV의 용도가 제공된다. hIDS 유전자("rAAV.hIDS")를 전달하기 위해서 사용되는 재조합 AAV("rAAV") 벡터는 CNS에 대해서 향성을 갖고(예를 들어, AAV9 캡시드를 보유하는 rAAV), hIDS 이식유전자는 특이적 발현 제어 요소, 예를 들어, 거대세포바이러스(CMV) 인핸서와 닭 베타 액틴 프로모터(CB7)의 혼성체에 의해서 제어된다. 특정 실시형태에서, 생리학적으로 상용성인 수성 완충액, 계면활성제 및 임의적인 부형제를 포함하는 제형 완충액 중의 rAAV.hIDS 벡터의 현탁액을 포함하는, 척추강내, 수조내, 및 전신 투여에 적합한 약제학적 조성물이 제공된다. rAAV 현탁액은 하기를 추가로 특징으로 한다:
(i) rAAV 게놈 카피(GC) 역가는 적어도 1.0 x 1013GC/㎖이고/이거나;
(ii) rAAV 중공 입자/전입자 비는 SDS-PAGE 분석법(실시예 5D 참고)에 의해서 결정되는 경우 0.01 내지 0.05(95% 내지 99% 중공 캡시드 무함유)이고; 다른 실시형태에서, 본 명세서 제공된 rAAV9.hIDS는 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90% 중공 캡시드 무함유이고/이거나;
(iii) 적어도 약 4 x 108GC/g 뇌 질량 내지 약 4 x 1011GC/g 뇌 질량의 rAAV 현탁액의 용량이 효력을 가짐.
효력은 시험관내에 세포 배양 검정, 예를 들어, 실시예 5G에 기술된 시험관내 효력 검정에 의해서 측정될 수 있는데, 여기서 HEK293 세포를 세포당 기지의 다중도의 rAAV GC로 형질도입시키고, 상청액을 형질도입 72시간 후 IDS 활성도에 대해서 검정하였다. hIDS의 기능(활성도) 및/또는 효력을 예를 들어, 형광원 기질, 4-메틸엄벨리페릴 알파-L-이두로나이드-2 설페이트를 절단하는 hIDS의 능력을 측정하는 4MU-이두로나이드 효소 검정을 사용하여, 적합한 시험관내 검정으로 측정할 수 있다. 특이적 활성도는 기술된 조건 하에서 측정되는 경우 7,500p㏖/분/㎍ 초과이다(www.RnDSystems.com 상의 활성도 검정 프로토콜을 참고). 효소 활성도를 측정하는 다른 적합한 방법은 본 명세서에 기술된 것을 비롯하여, 예를 들어, 문헌[Kakkis, E. D., et al (1994). Protein Expression Purif. 5: 225-232; Rome, L. H., et al (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 2331-2334]에 기술되어 있다. 활성도는 또한 예를 들어, 문헌[E. Oussoren, et al, Mol Genet Metab. 2013 Aug;109(4):377-81. doi: 10.1016/j.ymgme.2013.05.016. Epub 2013 Jun 4]에 기술된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 치료를 위한 후보자인 환자는 MPS II(헌터 증후군) 및/또는 MPS II와 연관된 증상을 갖는 소아 및 성인 환자이다.
rAAV9.hIDS의 하기의 치료적으로 유효한 고정 용량이 제시된 연령군의 MPS II 환자에게 투여될 수 있다:
Figure pct00007
신생아: 약 3.8 x 1012 내지 약 1.9 x 1014GC;
Figure pct00008
3 내지 9개월: 약 6 x 1012 내지 약 3 x 1014GC;
Figure pct00009
9 내지 36개월: 약 1013 내지 약 5 x 1014GC;
Figure pct00010
3 내지 12세: 약 1.2 x 1013 내지 약 6 x 1014GC;
Figure pct00011
12+세: 약 1.4 x 1013 내지 약 7.0 x 1014GC;
Figure pct00012
18+세(성인): 약 1.4 x 1013 내지 약 7.0 x 1014GC.
일부 실시형태에서, 12+세 MPII 환자(18+세 포함)에게 투여되는 용량은 1.4 Х 1013게놈 카피(GC)(1.1 Х 1010GC/g 뇌 질량)이다. 일부 실시형태에서, 12+세 MPII 환자(18+세 포함)에게 투여되는 용량은 7 Х 1013GC(5.6 Х 1010GC/g 뇌 질량)이다. 더 추가의 실시형태에서, MPSII 환자에게 투여되는 용량은 적어도 약 4 x 108GC/g 뇌 질량 내지 약 4 x 1011GC/g 뇌 질량이다. 특정 실시형태에서, MPS II 신생아에게 투여되는 용량은 약 1.4 x 1011 내지 약 1.4 x 1014GC 범위이고; 유아 3 내지 9개월에게 투여되는 용량은 약 2.4 x 1011 내지 약 2.4 x 1014GC 범위이고; MPS II 소아 9 내지 36개월에게 투여되는 용량은 약 4 x 1011 내지 약 4 x 1014GC 범위이고; MPS II 소아 3 내지 12세에게 투여되는 용량은 약 4.8 x 1011 내지 약 4.8 x 1014GC 범위이고; 12+세 소아 및 성인에게 투여되는 용량은 약 5.6 x 1011 내지 약 5.6 x 1014GC 범위이다.
치료 목표는 질환을 치료하기 위한 실행 가능한 접근법으로서 rAAV-기반 CNS-지향된 유전자 요법을 통해서 환자의 결함이 있는 이두로네이트-2-설페이타제를 기능적으로 대체하는 것이다. 본 명세서에 기술된 rAAV 벡터로부터 발현될 때, CSF, 혈청, 뉴런 또는 다른 조직에서 검출되는 경우 적어도 약 2%의 발현 수준이 치료 효과를 제공할 수 있다. 그러나, 더 높은 발현 수준이 달성될 수 있다. 이러한 발현 수준은 정상 기능성 인간 IDS 수준의 2% 내지 약 100%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 정상 발현 수준보다 더 높은 수준이 CSF, 혈청 또는 다른 조직에서 검출될 수 있다.
요법의 효능은 (a) MPS II(헌터 증후군)를 갖는 환자에서 신경인지 감소의 예방; 및 (b) 질환의 바이오마커, 예를 들어, CSF, 혈청 및/또는 소변, 및/또는 간 및 비장 체적 중의 GAG 수준 및/또는 효소 활성도의 감소를 평가함으로써 측정될 수 있다. 유아에서의 신경인지는 문헌[Bayley Scales of Infant and Toddler Development, Third Ed., BSID-III]을 통해서 측정될 수 있다. 신경인지 및 적응 행동 평가(예를 들어, 각각 베일리 영아 발달 검사 및 비인랜드 적응 행동 척도)를 수행할 수 있다.
hIDS의 전신 전달을 수반한 CNS에 대한 rAAV.hIDS의 유전자 요법 전달의 조합이 특정 실시형태에 포함된다. 전신 전달은 ERT(예를 들어, 엘라프라제(등록상표) 사용) 또는 간에 대해서 향성을 갖는 rAAV.hIDS를 사용한 추가적인 유전자 요법(예를 들어, AAV8 캡시드 보유 rAAV.hIDS)을 사용하여 성취될 수 있다.
특정 실시형태는 rAAV.hIDS 약제학적 조성물의 제조 및 특징규명을 위해서 제공된다(하기 실시예 4).
5.1. AAV.hIDS 작제물 및 제형
5.1.1. 발현 카세트
서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열(CCDS 14685.1)을 갖는 것을 특징으로 하는 hIDS 유전자를 함유하는 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터가 제공된다. 이 서열은 서열번호 2로서 본 명세서에 또한 포함된, 젠뱅크 NP000193.1을 암호화하는 공개된 유전자 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 1과 적어도 약 75% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 hIDS 유전자를 함유하고, 기능성 인간 이두로네이트-2-설페이타제를 암호화한다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 1과 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 hIDS 유전자를 함유하고, 기능성 인간 이두로네이트-2-설페이타제를 암호화한다. 또 다른 실시형태에서, 서열은 서열번호 1과 적어도 약 85% 동일성이거나 또는 서열번호 1과 적어도 약 90% 동일하고, 기능성 인간 이두로네이트-2-설페이타제를 암호화한다. 또 다른 실시형태에서, 서열은 서열번호 1과 적어도 약 95% 동일하거나, 서열번호 1과 적어도 약 97% 동일하고, 서열번호 1과 적어도 약 99% 동일하고, 기능성 인간 이두로네이트-2-설페이타제를 암호화한다. 일 실시형태에서, 서열은 서열번호 1과 적어도 약 77% 동일하다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 11의 nt 1937 내지 nt 3589로서도 표현된, 서열번호 8의 nt 1177 내지 nt 2829의 hIDS 암호 서열을 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 8의 nt 1177 내지 nt 2829(서열번호 11의 nt 1937 내지 nt 3589라고도 나타냄)과 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 hIDS 암호 서열을 함유한다.
또 다른 실시형태에서, 기능성 인간 이두로네이트-2-설페이타제는 합성 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 여기서 리더(신호) 펩타이드에 상응하는, 프레프로단백질 서열번호 2의 첫 번째 25개의 아미노산은 이종성 리더 펩타이드로 대체된다. 이러한 리더 펩타이드, 예를 들어, 예컨대, 인터류킨-2(IL-2) 또는 온코스타틴으로부터의 리더 펩타이드는 이의 분비 경로를 통해서 세포로부터 순환계로의 효소의 이송을 개선시킬 수 있다. 적합한 리더 펩타이드가 바람직하지만, 인간 본래는 필요하지 않다. 적합한 리더 펩타이드는 본 명세서에 참고로 포함된 proline.bic.nus.edu.sg/spdb/zhang270.htm으로부터 선택될 수 있거나, 또는 선택된 단백질에서 리더(신호) 펩타이드를 결정하기 위한 다양한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 제한되지는 않지만, 이러한 서열은 약 15 내지 약 50개 아미노산 길이, 또는 약 19 내지 약 28개 아미노산 길이일 수 있거나, 또는 필요한 경우 더 길거나 더 짧을 수 있다. 또한, IDS 효소의 효소 활성도를 측정하는 데 유용한 바와 같은 적어도 하나의 시험관내 검정이 기술되어 있다[예를 들어, 문헌[Dean et al, Clinical Chemistry, 2006 Apr; 52(4): 643-649] 참고]. 프레프로단백질(서열번호 2의 아미노산 1 내지 25)의 전부 또는 일부, 프로단백질(서열번호 2의 아미노산 26 내지 33)의 전부 또는 일부가 제거될 수 있고, 이종성 성숙 펩타이드로 임의로 대체될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 서열번호 5의 nt 3423 내지 nt 4547(젠뱅크의 CDS: AB448737.1)의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 SUMF1 유전자를 추가로 함유하는 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터가 제공된다. 이러한 서열은 서열번호 7 및 서열번호 10으로서 또한 본 명세서에 포함된, NCBI 참조 서열: NP_877437.2를 암호화하는 공개된 유전자 서열이다. 일부 연구는, 설페이타제, 예컨대, IDS의 발현이, IDS의 번역후 변형에 필요한 설페이타제 변형 인자, SUMF1의 유용성에 의해서 제한될 수 있다고 시사하였다(Fraldi, et al, Biochemical J, 2007: 403: 305-312). 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 5의 nt 3423 내지 nt 4547와 적어도 약 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 SUMF1 유전자를 함유하고, 기능성 인간 SUMF1을 암호화한다. 또 다른 실시형태에서, 서열은 서열번호 5의 nt 3423 내지 nt 4547과 적어도 약 85% 동일성이거나 또는 서열번호 5의 nt 3423 내지 nt 4547과 적어도 약 90% 동일하고, 기능성 인간 SUMF1을 암호화한다. 일 실시형태에서, 서열은 서열번호 5의 nt 3423 내지 nt 4547과 적어도 약 95%, 약 97%, 또는 약 99% 동일하고, 기능성 인간 SUMF1을 암호화한다. 일 실시형태에서, 서열은 서열번호 5의 nt 3423 내지 nt 4547와 적어도 약 76.6% 동일하다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 8의 nt 3423 내지 nt 4553의 hSUMF1 암호 서열을 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 8의 nt 3423 내지 nt 4553과 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 hSUMF1 암호 서열을 함유한다.
일 실시형태에서, hIDS 암호화 서열 및 hSUMF1 암호화 서열을 함유하는 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, hIDS 암호화 서열 및 hSUMF1 암호화 서열을 내부 리보솜 유입 부위(IRES)에 연결하였다. 추가 실시형태에서, IRES는 서열번호 5의 nt 2830 내지 nt 3422 또는 서열번호 8의 nt 2830 내지 nt 3422의 서열을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 hIDS 암호화 서열, IRES 및 hSUMF1 암호화 서열을 포함하는, 서열번호 5의 nt 1177 내지 nt 4547 또는 서열번호 8의 nt 1177 내지 nt 4553을 함유한다.
서열에 대한 동일성 또는 유사성은, 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해서 서열을 정렬하고, 필요한 경우 갭을 도입한 후, 본 명세서에 제공된 펩타이드 및 폴리펩타이드 영역과 동일한(즉, 동일한 잔기) 또는 유사한(즉, 일반적인 측쇄 특성을 기반으로 동일한 기로부터의 아미노산 잔기, 하기 참고) 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 본 명세서에서 정의된다. 백분율(%) 동일성은 각각 이들의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 비교함으로써 결정되는 바와 같이, 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 2개의 폴리펩타이드 간의 관계의 척도이다. 일반적으로, 비교될 2개의 서열을 정렬하여 서열들 간의 최대 상관관계를 제공한다. 2개의 서열의 정렬을 조사하고, 두 서열 간의 정확한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 상관성을 제공하는 위치의 수를 결정하고, 정렬의 총 길이로 나누고, 100을 곱해서 % 동일성 수치를 제공한다. 이러한 % 동일성 수치는, 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐서(이것은 동일하거나 또는 매우 유사한 길이의 서열에 특히 적합하고, 고도로 상동성임) 또는 더 짧은 정의된 길이에 걸쳐서(이것은 동등하지 않은 길이의 서열에 더 적합하거나 더 낮은 상동성 수준을 가짐) 결정될 수 있다.　정렬 및 백분율 동일성을 수행하기 위해서 문헌에서 사용되도록 입수 가능하고/가능하거나 공공적으로 또는 상업적으로 입수 가능한, 이를 기반으로 하는 다수의 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램이 존재한다. 알고리즘 또는 프로그램의 선택은 본 발명의 제한이 아니다.
적합한 정렬 프로그램의 예는 예를 들어, 유닉스(Unix) 하의 그리고 이후에 바이오에디트(Bioedit) 프로그램으로 임포팅된 소프트웨어 CLUSTALW(문헌[Hall, T. A. 1999, BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98]); EMBL-EBI로부터 입수 가능한 클러스탈 오메가(Clustal Omega)(문헌[Sievers, Fabian, et al. "Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega." Molecular systems biology 7.1 (2011): 539 및 Goujon, Mickael, et al. "A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI." Nucleic acids research 38.suppl 2(2010): W695-W699]); 위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), 버전 9.1(문헌[Devereux J. et al., Nucleic Acids Res., 12:387-395, 1984], 제네틱스 컴퓨터 그룹(미국 위스콘신주 매디슨 소재))를 포함한다. 프로그램 BESTFIT 및 GAP를 사용하여 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 % 동일성 및 두 폴리펩타이드 서열 사이의 % 동일성을 결정할 수 있다.
서열들 사이의 동일성 및/또는 유사성의 결정을 위한 다른 프로그램은 예를 들어, 미국 국립 생물 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information; NCB), 미국 메릴랜드주 베서스다 소재)로부터 입수 가능한, 그리고 NCBI의 홈페이지 www.ncbi.nlm.nih.gov를 통하여 접근 가능한 BLAST 패밀리의 프로그램, GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)을 포함한다. 아미노산 서열들의 비교를 위해서 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 가중 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티(penalty), 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있으며; FASTA (문헌[Pearson W. R. and Lipman D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988], 위스콘신 서열 분석 패키지의 일부로서 입수가능함)가 이용될 수 있다. SeqWeb 소프트웨어(GCG 위스콘신 패키지로의 웹 기반의 인터페이스: Gap 프로그램).
일부 실시형태에서, 카세트는 재조합 아데노-연관 바이러스로부터 발현되도록 설계되고, 벡터 게놈은 또한 AAV 반전 말단 반복부(ITR)를 함유한다. 일 실시형태에서, rAAV는 위형(pseudotype)이고, 즉, AAV 캡시드는 ITR을 제공하는 AAV와 상이한 공급원 AAV로부터 유래된다. 일 실시형태에서, AAV 항원형 2의 ITR이 사용된다. 그러나, 다른 적합한 공급원으로부터의 ITR이 선택될 수 있다. 임의로, AAV는 자가-상보성 AAV일 수 있다.
본 명세서에 기술된 발현 카세트는 AAV 5' 반전 말단 반복부(ITR) 및 AAV 3' ITR을 사용하였다. 그러나, 이들 요소의 다른 구성이 적합할 수 있다. D-서열 및 말단 분해능 부위(trs)가 결실된 ΔITR이라 지칭되는 5' ITR의 짧아진 버전이 기술되어 있다. 다른 실시형태에서, 전장 AAV 5' 및/또는 3' ITR이 사용된다. 위형 AAV가 생성되려는 경우, 발현 시의 ITR은 캡시드의 AAV 공급원과 상이한 공급원으로부터 선택된다. 예를 들어, AAV2 ITR은 CNS 또는 CNS 내의 조직 또는 세포를 표적화하는데 특별한 효율을 갖는 AAV 캡시드와 함께 사용하기 위해서 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, AAV2로부터의 ITR 서열, 또는 이의 결실된 버전(ΔITR)이 편의를 위해서 그리고 규제 승인을 가속화하기 위해서 사용된다. 그러나, 다른 AAV 공급원으로부터의 ITR이 선택될 수 있다. ITR의 공급원이 AAV2로부터 유래되고, AAV 캡시드가 또 다른 AAV 공급원으로부터 유래된 경우, 생성된 벡터는 위형이라 지칭될 수 있다. 그러나, AAV ITR의 다른 공급원이 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 대뇌 척추 유체 및 뇌를 비롯한, 중추신경계(CNS)에서의 발현 및 분비를 위해서 설계된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 발현 카세트는 CNS 및 간 둘 모두에서 발현에 유용하고, 이에 의해서 MPS II의 전신 및 CNS-관련 효과 둘 모두의 치료를 가능하게 한다. 예를 들어, 본 발명자들은, 척추강내로 전달되는 경우 특정 구성적 프로모터(예를 들어, CMV)는 목적하는 수준으로 발현을 유도하지 않고, 이에 의해서 최적수준보다 낮은 hIDS 발현 수준을 제공한다는 것을 발견하였다. 그러나, 닭 베타-액틴 프로모터는 척추강내 전달 및 전신 전달 둘 모두에서 발현을 양호하게 유도한다. 따라서, 이것은 특히 바람직한 프로모터이다. 다른 프로모터가 선택될 수 있지만, 이를 함유하는 발현 카세트는 닭 베타-액틴 프로모터가 갖는 이점 모두를 가질 수 있는 것은 아니다. 다양한 닭 베타-액틴 프로모터는 단독으로 또는 다양한 인핸서 요소(예를 들어, CB7은 거대세포바이러스 인핸서 요소를 갖는 닭 베타-액틴 프로모터, 닭 베타 액틴의 프로모터, 제1 엑손 및 제1 인트론을 포함하는 GAG 프로모터, 및 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 억셉터), CBh 프로모터와 조합하여 기술되어 있다[SJ Gray et al, Hu Gene Ther, 2011 Sep; 22(9): 1143-1153].
조직-특이적인 프로모터의 예는 간 및 다른 조직에 대해서 널리 공지되어 있다(특히 알부민, 문헌[Miyatake et al., (1997) J. Virol., 71:5124-32]; B형 간염 바이러스 코어 프로모터, 문헌[Sandig et al., (1996) Gene Ther., 3:1002-9]; 알파-페토프로테인(AFP), 문헌[Arbuthnot et al., (1996) Hum. Gene Ther., 7:1503-14)], 골 오스테오칼신(Stein et al., (1997) Mol. Biol. Rep., 24:185-96); 골 시알로프로테인(Chen et al., (1996) J. Bone Miner. Res., 11:654-64), 림프구(CD2, Hansal et al., (1998) J. Immunol., 161:1063-8; 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 쇄), 뉴론, 예컨대, 뉴론-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터(Andersen et al., (1993) Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15), 신경필라멘트 경쇄 유전자(Piccioli et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5), 및 뉴런-특이적 vgf 유전자(Piccioli et al., (1995) Neuron, 15:373-84). 대안적으로, 조절 가능한 프로모터가 선택될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 국제 특허 제WO 2011/126808B2호 참고).
일 실시형태에서, 발현 카세트는 1종 이상의 발현 인핸서를 포함한다. 일 실시형태에서, 발현 카세트는 2종 이상의 발현 인핸서를 함유한다. 이들 인핸서는 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 인핸서는 알파 mic/bik 인핸서 또는 CMV 인핸서를 포함할 수 있다. 이러한 인핸서는 서로에 인접하게 위치된 2개의 카피에 존재할 수 있다. 대안적으로, 인핸서의 이중 카피는 하나 이상의 서열에 의해서 분리될 수 있다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 인트론, 예를 들어, 닭 베타-액틴 인트론, 인간 β-글로불린 인트론, 및/또는 상업적으로 입수 가능한 프로메가(Promega)(등록상표) 인트론을 추가로 함유한다. 다른 적합한 인트론은 관련 기술 분야에 공지된 것을 포함하고, 예를 들어, 예컨대, 국제 특허 제WO 2011/126808호에 기술되어 있다.
추가로, 적합한 폴리아데닐화 신호를 갖는 발현 카세트가 제공된다. 일 실시형태에서, 폴리A 서열은 토끼 글로불린 폴리 A이다(예를 들어, 국제 특허 제WO 2014/151341호 참고). 대안적으로, 또 다른 폴리A, 예를 들어, 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 서열, SV40 폴리 A, SV50 폴리A, 또는 합성 폴리A. 추가의 다른 종래의 조절 요소가 추가될 수 있거나 임의로 발현 카세트에 포함될 수 있다.
예시적인 rAAV.hIDS 벡터 게놈은 서열번호 3의 nt 2 내지 nt 3967, 서열번호 5의 nt 11 내지 nt 4964, 서열번호 8의 nt 11 내지 nt 4964, 서열번호 11의 nt 2 내지 nt 3967, 또는 서열번호 14의 nt 2 내지 nt 3965에 제시되어 있다.
5.1.2. rAAV.hIDS 바이러스 입자의 생산
일 실시형태에서, AAV 캡시드를 갖고, 그 내에 패키징된 AAV 반전 말단 반복부, 발현을 제어하는 조절 서열의 제어 하의 인간 이두로네이트-2-설페이타제(hIDS) 유전자를 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자가 제공되며, 여기서 상기 hIDS 유전자는 서열번호 1(도 1)에 제시된 서열 또는 이와적어도 95% 동일한 서열을 갖고, 기능성 인간 이두로네이트-2-설페이타제를 암호화한다. 일 실시형태에서, hIDS 발현 카세트는 AAV5' ITR 및 AAV3' ITR에 의해서 플랭킹되어있다. 또 다른 실시형태에서, AAV는 단일 가닥 AAV이다.
척추강내 및/또는 수조내 전달을 위해서, AAV9가 특히 바람직하다. 임의로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 rAAV9.hIDS 벡터는 간을 특이적으로 표적화하도록 설계된 벡터와 공동투여될 수 있다. 간 향성을 갖는 다수의 rAAV 벡터 중 임의의 것이 사용될 수 있다. rAAV의 캡시드를 위한 공급원으로서 선택될 수 있는 AAV의 예는 예를 들어, rh10, AAVrh64R1, AAVrh64R2, rh8을 포함한다[예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2007-0036760-A1호; 미국 공개 특허 출원 제2009-0197338-A1호; 유럽 특허 제EP 1310571호 참고]. 또한, 국제 특허 제WO 2003/042397호(AAV7 및 다른 유인원 AAV), 미국 특허 제7790449호 및 미국 특허 제7282199호(AAV8), 국제 특허 제WO 2005/033321호 및 미국 특허 제US 7,906,111호(AAV9), 및 국제 특허 제WO 2006/110689호], 및 rh10[국제 특허 제WO 2003/042397호], AAV3B; AAVdj[미국 특허 제US 2010/0047174호]를 참고하기 바란다. 특별하게 바람직한 하나의 rAAV는 AAV2/8.TBG.hIDS.co이다.
다수의 예에서, rAAV 입자는 "DNase 내성"이라고 지칭된다. 그러나, 이러한 엔도뉴클레아제(DNase)에 더하여, 다른 엔도- 및 엑소- 뉴클레아제가 또한 본 명세서에 기술된 정제 단계에 사용되어, 오염된 핵산을 제거할 수 있다. 이러한 뉴클레아제는 단일 가닥 DNA 및/또는 이중 가닥 DNA, 및 RNA를 분해하도록 선택될 수 있다. 이러한 단계는 단일 뉴클레아제, 또는 상이한 표적에 지향된 뉴클레아제의 혼합물을 함유할 수 있고, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제일 수 있다.
AAV-기반 벡터의 제조 방법은 공지되어 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 공개 특허 출원 제2007/0036760호(2007년 2월15일) 참고). AAV9의 AAV 캡시드의 사용이 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법에 특히 양호하게 적합하다. AAV9의 서열 및 AAV9 캡시드를 기반으로 하는 벡터의 생성 방법은 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제US 7,906,111호; 제US2015/0315612호; 국제 특허 제WO 2012/112832호에 기술되어 있다. 그러나, 다른 AAV 캡시드가 선택되거나 생성될 수 있다. 예를 들어, AAV8의 서열 및 AAV8 캡시드를 기반으로 하는 벡터의 생성 방법은 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,282,199 B2호, 제US 7,790,449호, 및 제US 8,318,480호에 기술되어 있다. 다수의 이러한 AAV의 서열은 상기에 인용된 미국 특허 제7,282,199 B2호, 제US 7,790,449호, 제US 8,318,480호, 및 미국 특허 제7,906,111호에 제공되어 있고/있거나 젠뱅크로부터 입수 가능하다. AAV 캡시드 중 임의의 것의 서열은 합성 방식으로 또는 다양한 분자 생물학 및 유전 조작 기술을 사용하여 쉽게 생성될 수 있다. 적합한 생산 기술은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY] 참고). 대안적으로, 펩타이드를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, CDR) 또는 펩타이드 자체는 예를 들어, 널리 공지된 고체상 펩타이드 합성 방법에 의해서 합성 방식으로 생성될 수 있다(Merrifield, (1962) J. Am. Chem. Soc., 85:2149; Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969) pp. 27-62). 이들 및 다른 적합한 생산 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 지식 범위 내이고, 본 발명의 제한이 아니다.
본 명세서에 기술된 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV)는 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 국제 특허 제WO 2003/042397호; 제WO 2005/033321호, 제WO 2006/110689호; 미국 특허 제US 7588772 B2호 참고). 이러한 방법은 AAV 캡시드를 암호화하는 핵산 서열; 기능성 rep 유전자; 최소한, AAV 반전 말단 반복부(ITR) 및 이식유전자로 구성된 발현 카세트; 및 발현 카세트의 AAV 캡시드 단백질 내로의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
중공 입자 및 전입자 함량을 계산하기 위해서, 선택된 샘플에 대한 VP3 밴드 체적(예를 들어, 본 명세서 실시예에서, 아이오딕산올 구배-정제된 제제이고, 여기서 GC의 # = 입자의 #)을 로딩된 GC 입자에 대해서 플롯팅한다. 생성된 일차 방정식(y = mx+c)을 사용하여 시험품 피크의 밴드 체적 내의 입자의 수를 계산한다. 이어서, 로딩된 20㎕당 입자의 수(pt)에 50을 곱하여 입자(pt)/㎖를 제공한다. Pt/㎖를 GC/㎖로 나누어 게놈 카피에 대한 입자의 비(pt/GC)를 제공한다. Pt/㎖-GC/㎖은 중공 pt/㎖을 제공한다. 중공 pt/㎖를 pt/㎖로 나누고 100을 곱하여 중공 입자의 백분율을 제공한다.
일반적으로, 패키징된 게놈을 갖는 AAV 벡터 입자 및 중공 캡시드에 대한 검정 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Grimm et al.,　Gene Therapy　(1999) 6:1322-1330; Sommer et al.,　Molec. Ther. (2003) 7:122-128] 참고). 변성 캡시드에 대해서 시험하기 위해서, 방법은 처리된 AAV 스톡을, 3종의 캡시드 단백질, 예를 들어, 완충제 중에 3 내지 8%의 트리스-아세테이트를 함유하는 구배 젤을 분리할 수 있는 임의의 젤로 이루어진, SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법에 적용하는 단계, 이어서, 젤을 샘플 물질이 분리될 때까지 이동시키는 단계, 및 젤을 나일론 또는 나이트로셀룰로스 막, 바람직하게는 나일론 상에 블롯팅하는 단계를 포함한다. 이어서, 항-AAV 캡시드 항체는 변성 캡시드 단백질, 바람직하게는 항-AAV 캡시드 단클론성 항체, 가장 바람직하게는 B1 항-AAV-2 단클론성 항체에 결합하는 1차 항체로서 사용된다(Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293). 이어서, 2차 항체, 즉, 1차 항체에 결합하고, 1차 항체와의 결합을 검출하기 위한 수단, 보다 바람직하게는 그것에 공유 결합된 검출 분자를 함유하는 항-IgG 항체, 가장 바람직하게는 호스래디쉬 퍼옥시다제에 공유 연결된 양 항-마우스 IgG 항체인 것이 사용된다. 결합을 검출하기 위한 방법을 사용하여 1차 항체와 2차 항체 간의 결합을 반-정량적으로 결정하는데, 바람직하게는 검출 방법은 방사성 동위원소 방출, 전자기 방사선, 또는 표색계 변화, 가장 바람직하게는 화학발광 검출 키트를 검출할 수 있다. 예를 들어, SDS-PAGE의 경우, 칼럼 분획으로부터의 샘플을 취하고, 환원제(예를 들어, DTT)를 함유하는 SDS-PAGE 로딩 완충액 중에서 가열할 수 있고, 캡시드 단백질을 프리-캐스트(pre-cast) 구배 폴리아크릴아마이드 젤(예를 들어, 노벡스(Novex)) 상에서 분할시켰다. 제조사의 설명서에 따라서 실버엑스프레스(SilverXpress)(인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 소재)를 사용하여 또는 다른 적합한 염색 방법, 즉 SYPRO 루비 또는 쿠마시 염색제를 사용하여 은 염색을 수행할 수 있다. 일 실시형태에서, 칼럼 분획 중의 AAV 벡터 게놈(vg)의 농도를 정량적 실시간 PCR(Q-PCR)에 의해서 측정할 수 있다. 샘플을 희석하고, DNase I(또는 또 다른 적합한 뉴클레아제)로 소화시켜 외인성 DNA를 제거한다. 뉴클레아제의 불활성화 후에, 샘플을 추가로 희석하고, 프라이머 및 프라이머들 간의 DNA 서열에 특이적인 태크만(상표명) 형광원 프로브를 사용하여 증폭시켰다. 정의된 형광 수준에 도달하는 데 필요한 사이클의 수(역치 사이클, Ct)를 어플라이드 바이오시스템즈 프리즘(Applied Biosystems Prism) 7700 서열 검출 시스템 상에서 각각의 샘플에 대해서 측정한다. AAV 벡터에 함유된 것과 동일한 서열을 함유하는 플라스미드 DNA를 사용하여 Q-PCR 반응에서 표준 곡선을 생성시킨다. 샘플로부터 얻은 사이클 역치(Ct) 값을 사용하여 그것을 플라스미드 표준 곡선의 Ct 값에 정규화시킴으로써 벡터 게놈 역가를 결정한다. 디지털 PCR을 기반으로 한 종점 검정을 또한 사용할 수 있다.
일 양상에서, 광역 스펙트럼 세린 프로테아제, 예를 들어, 프로테이나제 K(예컨대, 퀴아젠(Qiagen)으로부터 상업적으로 입수 가능함)를 사용하는 최적화된 q-PCR 방법을 사용한다. 보다 특별하게는, 최적화된 qPCR 게놈 역가 검정은, DNase I 소화 후에, 샘플을 프로테이나제 K 완충액으로 희석하고, 프로테이나제 K로 처리한 후 열 불활성화시키는 것을 제외하고는, 표준 검정과 유사하다. 적합하게는 샘플을 샘플 크기와 동일한 양의 프로테이나제 K 완충액으로 희석한다. 프로테이나제 K 완충액을 2배수 이상으로 농축시킬 수 있다. 전형적으로, 프로테이나제 K 처리는 약 0.2㎎/㎖이지만, 0.1㎎/㎖ 내지 약 1㎎/㎖ 달라질 수 있다. 처리 단계는 일반적으로 약 55℃에서 약 15분 동안 수행되지만, 더 낮은 온도(예를 들어, 약 37℃ 내지 약 50℃)에서 더 긴 시간 기간(예를 들어, 약 20분 내지 약 30분) 동안, 또는 더 높은 온도(예를 들어, 최대 약 60℃)에서 더 짧은 시간 기간(예를 들어, 약 5 내지 10분) 동안 수행될 수 있다. 유사하게, 열 불활성화는 일반적으로 약 95℃에서 약 15분 동안이지만, 그 온도는 더 낮을 수 있고(예를 들어, 약 70 내지 약 90℃), 그 시간은 연장될 수 있다(예를 들어, 약 20분 내지 약 30분). 이어서, 샘플을 희석(예를 들어, 1000배)하고, 표준 검정에 기술된 바와 같이 태크만 분석법에 적용한다.
추가로, 또는 대안적으로, 드로플렛 디지털(Droplet digital) PCR(ddPCR)을 사용할 수 있다. 예를 들어, ddPCR에 의해서 단일-가닥 및 자가-상보성 AAV 벡터 게놈 역가를 결정하는 방법은 기술되어 있다(예를 들어, 문헌[M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14] 참고).
간략하면, 게놈-결함 AAV9 중간체로부터 패키징된 게놈 서열을 갖는 rAAV9 입자를 분리하는 방법은 재조합 AAV9 바이러스 입자 및 AAV 9 캡시드 중간체를 포함하는 현탁액을 약 260 및 약 280에서의 자외 흡광도에 대해서 모니터링하면서 고속 성능 액체 크로마토그래피에 적용하는 것을 포함하는데, 여기서 AAV9 바이러스 입자 및 AAV9 중간체는 pH 10.2에서 평형화된 강한 음이온 교환 수지에 결합되고, 염 구배에 적용된다. rAAV9에 대해서 덜 적합하긴 하지만, pH는 약 10.0 내지 10.4 범위일 수 있다. 이러한 방법에서, A260/A280의 비가 변곡점에 도달한 경우 용리된 분획으로부터 AAV9 전 캡시드를 분리한다. 일례에서, 친화도 크로마토그래피 단계의 경우, 투석여과된 산물을 AAV2/9 항원형을 효율적으로 포획하는 포획 셀렉트(Capture Select)(상표명) 포러스(Poros)- AAV2/9 친화도 수지(라이프 테크놀로지스)에 적용할 수 있다. 이러한 이온 조건 하에서, 상당한 백분율의 잔류하는 세포 DNA 및 단백질이 칼럼을 통해서 유동하면서, AAV 입자가 효율적으로 포획된다.
rAAV.hIDS 벡터는 하기 섹션 5.4 및 실시예 4에 보다 상세하게 기술된, 도 11에 도시된 흐름도에 도시된 바와 같이 제조될 수 있다.
5.1.3. rAAV.hIDS의 약제학적 제형
rAAV9.hIDS 제형은 염수, 계면활성제, 및 생리학적으로 상용성인 염 또는 염의 혼합물을 함유하는 수성 용액 중에 현탁된 유효한 양의 AAV.hIDS 벡터를 함유하는 현탁액이다. 적합하게는, 이 제형은 생리학적으로 허용 가능한 pH, 예를 들어, pH 6 내지 9, 또는 pH 6.5 내지 7.5, pH 7.0 내지 7.7, 또는 pH 7.2 내지 7.8로 조정된다. 뇌척수액의 pH가 약 7.28 내지 약 7.32이기 때문에, 척추강내 전달을 위해서, 이러한 범위 내의 pH가 바람직할 수 있는 반면; 정맥내 전달을 위해서는, 6.8 내지 약 7.2의 pH가 바람직할 수 있다. 그러나, 가장 넓은 범위 및 이들 하위 범위 내의 다른 pH가 다른 전달 경로를 위해서 선택될 수 있다.
적합한 계면활성제, 또는 계면활성제의 조합물은, 비독성인 비이온성 계면활성제로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 1차 하이드록실기로 말단화된 2작용성 블록 공중합체 계면활성제, 예를 들어, 예컨대, 폴록사머 188라고도 공지된 플루로닉(Pluronic)(등록상표) F68[바스프(BASF)]가 선택되는데, 이것은 중성 pH를 갖고, 8400의 중량 평균 분자량을 갖는다. 다른 계면활성제 및 다른 폴록사머, 즉, 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2개의 친수성 쇄에 의해서 플랭킹된 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 쇄로 구성된 비이온성 트라이블록 공중합체, SOLUTOL HS 15(마크로골(Macrogol)-15 하이드록시스테아레이트), LABRASOL(폴리옥시 카프릴 글리세리드), 폴리옥시 10 올레일 에터, TWEEN(폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스터), 에탄올 및 폴리에틸렌 글리콜이 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 제형은 폴록사머를 함유한다. 이들 공중합체는 문자 "P"(폴록사머의 경우), 그 다음 3개의 숫자로 일반적으로 명명되는데: 첫 번째 2개의 숫자 x 100은 폴리옥시프로필렌 코어의 대략적인 분자량을 제공하고, 마지막 숫자 x 10은 백분율 폴리옥시에틸렌 함량을 제공한다. 일 실시형태에서 폴록사머 188이 선택된다. 계면활성제는 현탁액의 최대 약 0.0005% 내지 약 0.001%의 양으로 존재할 수 있다.
일 실시형태에서, 제형은 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14]에 기술된 바와 같이 oqPCR 또는 디지털 드로플렛 PCR(ddPCR)에 의해서 측정되는 경우, 예를 들어, 적어도 약 1 x 109GC/㎖ 내지 3 x1013GC/㎖의 농도를 함유할 수 있다.
일 실시형태에서, 동결된 형태의, 본 명세서에 기술된 바와 같은 완충액 용액 중에 rAAV를 함유하는 동결된 조성물이 제공된다. 임의로, 1종 이상의 계면활성제(예를 들어, 플루로닉 F68), 안정화제 또는 보존제가 이러한 조성물 중에 존재한다. 적합하게는, 사용을 위해서, 조성물을 해동하고, 적합한 희석제, 예를 들어, 멸균 염수 또는 완충 염수를 사용하여 목적하는 용량으로 적정한다.
일례에서, 제형은 예를 들어, 물 중에, 염화나트륨, 중탄산나트륨, 덱스트로스, 황산마그네슘(예를 들어, 황산마그네슘·7H2O), 염화칼륨, 염화칼슘(예를 들어, 염화칼슘·2H2O), 이염기성 인산나트륨, 및 이들의 혼합물 중 1종 이상을 포함하는 완충 염수 용액을 함유할 수 있다. 적합하게는, 척추강내 전달을 위해서, 오스몰농도는 뇌척수액과 사용성인 범위 이내(예를 들어, 약 275 내지 약 290)이다(예를 들어, http://emedicine.medscape.com/article/2093316-overview 참고). 임의로, 척추강내 전달을 위해서, 상업적으로 입수 가능한 희석제를 현탁화제로서, 또는 또 다른 현탁화제 및 다른 임의적인 부형제와 조합하여 사용할 수 있다(예를 들어, 엘리엇츠(Elliotts) B(등록상표) 용액 [Lukare Medical] 참고). 다른 실시형태에서, 제형은 1종 이상의 투과 인핸서를 함유할 수 있다. 적합한 투과 인핸서의 예는 예를 들어, 만니톨, 소듐 글리코콜레이트, 소듐 타우로콜레이트, 소듐 데옥시콜레이트, 소듐 살리실레이트, 소듐 카프릴레이트, 소듐 카프레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우렐 에터, 또는 EDTA를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, (임의로 동결된) 제형 중에 현탁된 농축된 벡터, 임의적인 희석 완충액, 및 척추강내 투여에 필요한 장치 및 다른 구성성분을 포함하는 키트가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 추가로 또는 대안적으로 정맥내 전달을 위한 구성성분을 포함한다. 일 실시형태에서, 키트는 주사를 허용하기에 충분한 완충액을 제공한다. 이러한 완충액은 농축된 벡터의 약 1:1 내지 1:5 희석, 또는 그 초과를 허용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 임상의가 용량 적정 및 다른 조정을 할 수 있도록 더 많거나 더 적은 양의 완충액 또는 멸균수가 포함된다. 추가의 다른 실시형태에서, 장치의 1종 이상의 구성성분이 키트에 포함된다.
5.2. 유전자 요법 프로토콜
5.2.1 표적 환자 집단
본 명세서에는 치료적 유효량의 본 명세서에 기술된 rAAV.hIDS를 이를 필요로 하는 환자에게 전달하는 단계를 포함하는 II형 점액다당류증을 치료하는 방법이 제공된다. 특히, 본 명세서에는 치료적 유효량의 본 명세서에 기술된 rAAV.hIDS를 이를 필요로 하는 환자에게 전달하는 단계를 포함하는, MPS II로 진단된 환자에서 신경인지 감소를 예방, 치료 및/또는 개선하는 방법이 제공된다. "치료적 유효량"의 본 명세서에 기술된 rAAV.hIDS 벡터는 하기 단락 중 임의의 것에 식별된 증상 증 하나 이상을 보정할 수 있다.
치료를 위한 후보자인 환자는 MPS II(헌터 증후군) 및/또는 MPS II와 연관된 증상을 갖는 소아 및 성인 환자이다. MPS II는 경증/약화된 표현형 또는 중증 표현형을 특징으로 한다. 사망은 중증 표현형(신경인지 악화를 특징으로 함)을 갖는 환자에서는 평균 11.7세 일어나고, 경증 또는 약화된 표현형을 갖는 환자에서는 21.7세에 일어난다. 환자의 대부분(2/3)은 이러한 질환의 중증 형태를 갖는다. MPS II를 갖는 환자는 출생 시에는 정상으로 보이나, 질환의 징후 및 증상은 전형적으로 18개월 내지 4세의 연령에 심각한 형태로 제시되고, 약화된 형태에서는 4세내지 8세에 제시된다. 모든 영향을 받은 환자에 대해서 일반적인 징후 및 증상은 저신장, 거친 안면 특징, 대두증, 대설증, 청력 상실, 간- 및 비장비대, 다이스토시스 멀티플렉스, 관절 구축, 척추관 협착증 및 손목 터널 증후군을 포함한다. 빈번한 상기도 및 귀 감염이 대부분의 환자에서 발생하고, 진행형 기도 폐쇄는 수면성 무호흡 및 종종 사망으로 이어진다고 일반적으로 밝혀져 있다. 심장 질환은 이러한 집단에서 사망의 주요 원인이고, 우뇌실 비대 및 좌뇌실 비대 및 심부전으로 이어지는 심장판막 기능장애를 특징으로 한다. 사망은 일반적으로 폐쇄성 기도 질환 또는 심부전으로 인한 것이다.
MPS II의 중증 형태에서, 초기 발달 이정표는 충족될 수 있지만, 18 내지 24개월까지 발달 지연이 상당히 명백하다. 일부 환자는 1년차에서 청력 선별 검사를 통과하지 못하고, 도움 없이 앉아 있는 능력, 걷는 능력 및 말하기를 비롯한 다른 이정표가 지연된다. 발달 진행은 3 내지 5세에 정체되기 시작하고, 퇴행은 대략 6.5세에 시작된다고 보고되어 있다. 배변 훈련이 된 MPS II를 갖는 아동의 약 50% 중에서, 전부는 아니지만, 대부분은 질환 진행에 따라서 이 능력을 잃어버릴 것이다.
상당한 신경 관여를 갖는 환자는 과잉행동, 고집 및 공격성을 비롯한 심각한 행동 폐해를 나타내는데, 이것은 생애 2년차에서 시작되고, 신경퇴화가 이러한 행동을 약화시키는 경우 8 내지 9세까지 계속된다.
발작은 10세에 도달한 심각하게 영향을 받은 환자의 절반 초과에서 보고되어 있고, 사망 시기까지 CNS 관여를 갖는 대부분의 환자는 심각한 지적 장애가 있고, 지속적인 케어가 요구된다. 약화된 질환을 갖는 환자는 정상적인 지적 기능을 나타내지만, MRI 영상은 MPS II를 갖는 모든 환자에서 백질 병변, 비대해진 뇌실 및 뇌 위축을 비롯하여 총 뇌 이상을 나타낸다.
본 발명의 조성물은 경증에서 완전-발달 아나필락시스까지의 범위일 수 있는 재조합 효소에 대한 면역 반응에 관련된 장기간 효소 대체 요법(ERT)의 합병증뿐만 아니라 평생 말초 접근, 예컨대, 국소 및 전신 감염의 합병증을 회피한다. ERT에 반해서, 본 발명의 조성물은 평생, 반복되는 매주 주사가 필요하지 않다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 본 명세서에 기술된 치료 방법은, 계속적인 증가된 순환 IDS 수준을 제공하고, CNS 컴파트먼트 외부에 치료 영향력을 제공하는 높은 형질도입 효율로 벡터에 의해서 제공된 효율적인 장기간 유전자 전달을 제공함으로써 적어도 MPS II 장애와 연관된 중추신경계 표현형을 보정하는 데 유용하다고 여겨진다. 또한, 본 명세서에는 활성 관용을 제공하는 방법 및 CNS 내로의 AAV-매개된 전달 이전에 단백질 형태 또는 AAV-hIDS의 형태의 효소의 직접적인 전신 전달에 의한 것을 비롯한, 다양한 경로에 의해서 효소에 대해서 항체 형성을 예방하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 중증 MPS II로 진단된 환자를 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 치료한다. 일부 실시형태에서, 약화된 MPS II로 진단된 환자를 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 치료한다. 일부 실시형태에서, 초기 단계 신경인지 결핍을 갖는 MPS II를 갖는 소아 대상체를 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 치료한다. 특정 실시형태에서, 헌터 증후군으로 진단되고, 신경인지 결핍 또는 신경인지 결핍 발생의 위험을 갖는 2세 이상의 환자를 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 치료한다. 특정 실시형태에서, 중증 헌터 증후군과 상관관계가 있다고 공지된 주요 재배열 또는 결실 돌연변이의 존재를 갖는 2세 이상의 환자를 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 치료한다.
특정 실시형태에서, 신생아 아기(3개월령 이하)를 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 치료한다. 특정 실시형태에서, 3개월령 내지 9개월령인 아기를 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 치료한다. 특정 실시형태에서, 9개월령 내지 36개월령인 소아를 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 치료한다. 특정 실시형태에서, 3세 내지 12세인 소아를 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 치료한다. 특정 실시형태에서, 12세 내지 18세인 소아를 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 치료한다. 특정 실시형태에서, 18세 이상인 성인을 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 치료한다.
적합하게는, 치료를 위해서 선택된 환자는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 사람을 포함할 수 있다: 혈청, 혈장, 섬유모세포 또는 백혈구에서 측정되는 경우 결여 또는 감소된 IDS 효소 활성도에 의해서 확인된 MPS II의 기록된 진단; 임의의 다른 신경 또는 정신의학적 인자에 의해서 설명될 수 없는 경우: - 평균보다 적어도 1 표준 편차 더 낮거나 순차 시험에 대해서 1 표준 편차보다 큰 감소의 문서화된 역사적 증거인 DQ(BSID-III) 중 어느 하나로서 정의된 MPS II로 인한 초기 단계 신경인지 결핍의 문서화된 증거. 대안적으로, 소변, 혈청, CSF, 또는 유전 시험에서 증가된 GAG가 사용될 수 있다.
치료 전에, 대상체, 예를 들어, 유아는, 바람직하게는 MPS II 환자, 즉, hIDS를 암호화하는 유전자 내에 돌연변이를 갖는 환자를 식별하기 위해서 유전자형 분석이 수행된다. 치료 이전에, MPS II 환자는 hIDS 유전자를 전달하는 데 사용되는 AAV 항원형에 대한 중화 항체(Nab)에 대해서 평가될 수 있다. 이러한 Nab는 형질도입 효율과 경쟁하고, 치료 효능을 감소시킬 수 있다. 1:5 이하의 기준선 혈청 Nab 역가를 갖는 MPS II 환자가 rAAV.hIDS 유전자 요법 프로토콜로의 치료에 대한 양호한 후보자이다. 1:5 초과의 혈청 Nab의 역가를 갖는 MPS II 환자의 치료는 병용 요법, 예컨대, rAAV.hIDS 벡터 전달로의 치료 이전에 그리고/또는 치료 동안 면역억제제와의 일시적인 공동 치료가 필요할 수 있다. 임의로, 면역억제 공동-요법은 AAV 벡터 캡시드 및/또는 제형의 다른 성분에 대한 중화 항체의 이전 평가 없이 예방 조치로서 사용될 수 있다. 이전 면역억제 요법이 특히, IDUA 활성도 수준을 사실상 갖지 않는 환자(여기서 이식유전자 산물은 "이물"로서 인지될 수 있음)에서, hIDS 이식유전자 산물에 대해서 잠재적인 부정적인 면역 반응을 예방하는 것이 바람직할 수 있다. 하기에 기술된 마우스, 개 및 NHP에서의 비임상 연구의 결과는 hIDS 및 신경염(neuroinflammation)에 대한 면역 반응의 발달과 일치한다. 유사한 반응이 인간 대상체에서 일어날 수 있지만, 예방 면역억제 요법이 rAAV-hIDS의 모든 수여자에 대해서 권고된다.
이러한 공동요법을 위한 면역억제제는 글루코코티코이드, 스테로이드, 항대사산물, T-세포 저해제, 마크롤라이드(예를 들어, 라파마이신 또는 라파로그), 및 알킬화제를 비롯한 세포정지제, 항-대사산물, 세포독성 항생제, 항체 또는 이뮤노필린에 대해서 활성인 작용제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 면역 억제제는 질소 머스타드, 나이트로소유레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL-2 수용체-(CD25-) 또는 CD3-지향된 항체, 항-IL-2 항체, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 오피오이드, 또는 TNF-α(종양 괴사 인자-알파) 결합제를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역억제 요법은 유전자 요법 투여 0, 1, 2, 7일, 또는 그 초과 일 이전에 시작될 수 있다. 이러한 요법은 동일한 날에 2종 이상의 약물, (예를 들어, 프레드넬리손, 마이코페놀레이트 모페틸(MMF) 및/또는 시롤리무스(즉, 라파마이신))의 공동투여를 포함할 수 있다. 이들 약물 중 하나 이상은 유전자 요법 투여 이후에, 동일 용량으로 또는 조정된 용량으로 계속될 수 있다. 이러한 요법은 필요한 경우 약 1주(7일), 약 60일 또는 더 길 수 있다. 특정 실시형태에서, 타크로리무스-무함유 요법이 선택된다.
특정 실시형태에서, 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 환자는 이의 의료진의 재량으로 치료로부터 제외될 수 있다:
Figure pct00013
연구자 또는 의료 모니터 중 어느 하나의 의견으로 연구 결과의 해석을 혼동하게 할 수 있는 MPS II로 기인되지 않는 신경인지 결핍을 갖는 환자
Figure pct00014
연구자의 의견으로, 대상체를 과도한 위험에 빠뜨리거나 또는 조사 제품의 평가 또는 대상체 안정성 또는 연구 결과의 해석을 방해할 임의의 조건(예를 들어, 임의의 질환의 이력, 임의의 현재 질환의 증거, 신체 검사 시의 임의의 발견, 또는 임의의 실험실 이상)을 갖는 환자
Figure pct00015
신경정신의학적 병태의 진단
Figure pct00016
형광 염상화에 대한 금기를 비롯하여, 척추강내/두개내 치료 투여에 대한 임의의 금기를 갖는 환자
Figure pct00017
MRI에 대해서 임의의 금기를 갖는 환자
Figure pct00018
등록 시에 급성 수두증을 갖는 환자
Figure pct00019
스크리닝 4주 전 이내에 조사 제품을 사용한 임의의 다른 임상 연구에 현재 등록되어 있거나 또는 그 임상 연구에서 사용된 조사 제품의 5회 반감기 이내에 있는 환자
Figure pct00020
조혈 줄기세포 이식(HSCT)된 환자
Figure pct00021
스크리닝 6개월 이전 내에 척추강내 투여를 통해서 이두설파제가 제공된 환자
Figure pct00022
임의의 시기에 척추강내 이두설파제가 제공되고, 연구자 및/또는 의학적 모니터의 의견에서 대상체를 과도한 위험에 빠뜨릴 척추강내 투여와 관련된다고 간주되는 상당한 부작용(AE)을 경험한 환자.
다른 실시형태에서, 의료진은 이들 신체 특징(병력) 중 하나 이상의 존재가 본 명세서에 제공된 바와 같은 치료를 불가능하게 할 것이라고 결정할 수 있다.
5.2.2. 투여량 및 투여 모드
환자에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 상용성인 수성 완충액, 계면활성제 및 임의적인 부형제를 포함하는 제형 완충액 중의 rAAV.hIDS 벡터의 현탁액을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 척추강내로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 수조내로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 정맥내로 투여된다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 인퓨젼에 의해서 20분(±5분)에 걸쳐서 말초 정맥을 통해서 전달된다. 그러나, 이러한 시간은 필요 및 목적에 따라서 조정될 수 있다. 그러나, 추가의 다른 투여 경로가 선택될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 투여 경로는 바람지한 경우 조합될 수 있다.
rAAV의 단일 투여가 효과적이라고 예상되지만, 투여는 반복될 수 있다(예를 들어, 분기마다, 2년마다, 매년 또는 달리 필요한 경우, 특히 신생아의 치료에서). 임의로, 치료적 유효량의 초기 용량은 인퓨젼/주사를 용인하는 대상체의 능력 및 연령을 고려하여, 스플리트 인퓨젼/주사 세션에 걸쳐서 전달될 수 있다. 그러나, 완전 치료 용량의 반복적인 매주 주사가 필요하지 않고, 편안함 및 치료 결과 둘 모두와 관련하여 환자에게 이점을 제공한다.
일부 실시형태에서, rAAV 현탁액은 적어도 1.0 x 1013GC/㎖인 rAAV 게놈 카피(GC) 역가를 갖는다. 특정 실시형태에서, rAAV 현탁액 중의 rAAV 중공 입자/전입자 비는 0.01 내지 0.05(95% 내지 99% 중공 캡시드 무함유)이다. 일부 실시형태에서, 이를 필요로 하는 MPS II 환자는 적어도 약 4 x 108GC/g 뇌 질량 내지 약 4 x 1011GC/g 뇌 질량의 rAAV 현탁액의 용량이 투여된다.
rAAV.hIDS의 하기의 치료적으로 유효한 고정 용량이 제시된 연령군의 MPS II 환자에게 투여될 수 있다:
Figure pct00023
신생아: 약 3.8 x 1012 내지 약 1.9 x 1014GC;
Figure pct00024
3 내지 9개월: 약 6 x 1012 내지 약 3 x 1014GC;
Figure pct00025
9 내지 36개월: 약 1013 내지 약 5 x 1014GC;
Figure pct00026
3 내지 12세: 약 1.2 x 1013 내지 약 6 x 1014GC;
Figure pct00027
12+세: 약 1.4 x 1013 내지 약 7.0 x 1014GC;
Figure pct00028
18+세(성인): 약 1.4 x 1013 내지 약 7.0 x 1014GC.
일부 실시형태에서, 12+세 MPS II 환자(18+세 포함)에게 투여되는 용량은 1.4 Х 1013게놈 카피(GC)(1.1 Х 1010GC/g 뇌 질량)이다. 일부 실시형태에서, 12+세 MPS II 환자(18+세 포함)에게 투여되는 용량은 7 Х 1013GC(5.6 Х 1010GC/g 뇌 질량)이다. 더 추가의 실시형태에서, MPS II 환자에게 투여되는 용량은 적어도 약 4 x 108GC/g 뇌 질량 내지 약 4 x 1011GC/g 뇌 질량이다. 특정 실시형태에서, MPS II 신생아에게 투여되는 용량은 약 1.4 x 1011 내지 약 1.4 x 1014GC 범위이고; 유아 3 내지 9개월에게 투여되는 용량은 약 2.4 x 1011 내지 약 2.4 x 1014GC 범위이고; MPS II 소아 9 내지 36개월에게 투여되는 용량은 약 4 x 1011 내지 약 4 x 1014GC 범위이고; MPS II 소아 3 내지 12세에게 투여되는 용량은 약 4.8 x 1011 내지 약 4.8 x 1014GC 범위이고; 12+세 소아 및 성인에게 투여되는 용량은 약 5.6 x 1011 내지 약 5.6 x 1014GC 범위이다.
이러한 용량 및 농도의 전달을 위한 적합한 부피는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 결정될 수 있다. 예를 들어, 약 1㎕ 내지 150㎖의 부피가 선택될 수 있고, 더 높은 부피가 성인에 대해서 선택된다. 전형적으로, 신생아 유아의 경우, 적합한 체적은 약 0.5㎖ 내지 약 10㎖이고, 더 나이든 유아의 경우, 약 0.5㎖ 내지 약 15㎖가 선택될 수 있다. 걸음마기 유아(toddler)의 경우, 약 0.5㎖ 내지 약 20㎖의 체적이 선택될 수 있다. 소아의 경우, 최대 약 30㎖의 체적이 선택될 수 있다. 십대 초반 및 십대의 경우, 최대 약 50㎖의 체적이 선택될 수 있다. 추가의 다른 실시형태에서, 환자에게 척추강내 투여를 제공할 수 있고, 약 5㎖ 내지 약 15㎖의 체적, 또는 약 7.5㎖ 내지 약 10㎖가 선택된다. 다른 적합한 체적 및 투여량이 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 부작용에 대해서 치료 이익의 균형을 이루도록 조절될 것이고, 이러한 투여량은 재조합 벡터가 이용되는 치료 응용에 따라서 달라질 수 있다.
5.2.3. 효능 모니터링
본 명세서에 기술된 요법의 효능은 (a) MPS II(헌터 증후군)를 갖는 환자에서 신경인지 감소의 예방; 및 (b) 질환의 바이오마커, 예를 들어, CSF, 혈청 및/또는 소변, 및/또는 간 및 비장 체적 중의 GAG 수준 및/또는 효소 활성도의 감소를 평가함으로써 측정될 수 있다. 신경인지는 예를 들어, 헐러(Hurler) 대상체에 대해서 베일리 유아 발달 검사에 의해서 측정되는 바와 같이 또는 헐러-샤이에(Hurler-Scheie) 대상체에 대해서 웩슬러 지능 검사(WASI)에 의해서 측정되는 바와 같이 지능 지수(IQ)를 측정함으로써 결정될 수 있다. 신경인지 발달 및 기능의 다른 적절한 척도, 예를 들어, 베일리 영아 발달 검사(BSID-III)를 사용하여 발달 지수(DQ)를 평가하는 것, 홉스킨 언어 학습 시험을 사용하여 기억력을 평가하는 것, 및/또는 주의력 검사(TOVA)를 사용하는 것을 사용할 수 있다. 다른 신경심리학적 기능, 예컨대, 비인랜드 적응 행동 척도, 시각적 처리, 소근육 운동, 의사소통, 사회화, 일상 생활 기술, 및 감정 및 행동 건강을 모니터링한다. 체적, 확산 텐서 영상(DTI), 및 정지 상태데이터, 초음파 검사에 의한 중간 신경 단면적, 척수 압박의 개선, 안전성, 간 크기 및 비장 크기를 획득하기 위한 뇌의 자기 공명 영상(MRI)이 또한 투여된다.
임의로, 효능의 다른 척도는 바이오마커(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리아민) 및 임상 결과의 평가를 포함할 수 있다. 소변을 총 GAG 함량, 크레아티닌에 대한 GAG의 농도, 뿐만 아니라 MPS II 특이적 pGAG에 대해서 평가한다. 혈청 및/또는 혈장을 IDS 활성도, 항-IDS 항체, pGAG, 및 헤파린 보조인자 II-트롬빈 복합체 및 염증의 마커의 농도에 대해서 평가한다. CSF를 IDUA 활성도, 항-IDS 항체, 헥소스아미니다제(hex) 활성도, 및 pGAG(예컨대, 헤파란 설페이트 및 더마탄 설페이트)에 대해서 평가한다. 벡터(예를 들어, AAV9)에 대한 중화 항체 및 항-IDS 항체에 대한 결합 항체의 존재를 CSF 및 혈청에서 평가할 수 있다. 벡터 캡시드(예를 들어, AAV9) 또는 hIDS 이식유전자 산물에 대한 T-세포 반응을 ELISPOT 검정에 의해서 평가할 수 있다. CSF, 혈청, 및 소변에서의 IDS 발현의 약동학뿐만 아니라 벡터 농도(AAV9 DNA에 대한 PCR)를 또한 모니터링할 수 있다.
hIDS의 전신 전달을 수반한 CNS에 대한 rAAV.hIDS의 유전자 요법 전달의 조합이 본 발명의 방법에 포함된다. 전신 전달은 ERT(예를 들어, 엘라프라제(등록상표)(이두설파제) 사용) 또는 간에 대해서 향성을 갖는 rAAV.hIDS를 사용한 추가적인 유전자 요법(예를 들어, AAV8 캡시드 보유 rAAV.hIDS)을 사용하여 성취될 수 있다.
전신 전달과 연관된 임상 효능의 추가적인 척도는 예를 들어, 정형외과적 측정, 예컨대, 골염밀도, 골염 함량, 골 기하학 및 강도, 이중 에너지 x-선 흡수법(DXA)에 의해서 측정된 골 밀도; 신장(연령별 선키/누운 키에 대한 Z-점수); 골 대사의 마커: 혈청 오스테오칼신(OCN) 및 골-특이적 알칼린 포스파타제(BSAP), I형 콜라겐의 카복시 말단 텔로펩타이드(ICTP) 및 I형 콜라겐의 카복시 말단 텔로펩타이드 α1 쇄(CTX); 유연성 및 근육 강도: 6분 보행 연구를 비롯한 바이오덱스 및 물리 요법 평가(바이오덱스 III 등속 강도 시험 시스템을 사용하여 각각의 참가자에 대한 무릎 및 팔꿈치에서 강도를 평가함); 능동 관절 운동 범위(Active 관절 Range of Motion: ROM); 소아 건강 평가 설문지/건강 평가 설문지(CHAQ/HAQ) 장애 지수 점수; 근전도(EMG) 및/또는 개인의 심혈관 건강상태를 모니터링하기 위한 산소 이용: 운동 시험 동안 최고 산소 흡수(VO2 피크); 무호흡증/호흡 곤란 지수(AHI); 강제 폐활량(FVC); 좌심실 질량(LVM)을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 환자에서 MPS II를 진단 및/또는 치료하는 방법, 또는 치료를 모니터링하는 방법이 제공된다. 방법은 MPS II를 갖는 것으로 의심되는 인간 환자로부터 뇌척수액 또는 혈장 샘플을 획득하는 단계; 샘플에서 스퍼민 농도 수준을 검출하는 단계; 1ng/㎖ 초과의 스퍼민 농도를 갖는 환자에서 MPS II로부터 선택된 점액다당류증을 갖는 환자를 진단하는 단계; 및 본 명세서에 제공된 바와 같은 진단된 환자에게 유효량의 인간 IDS를 전달하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 방법은 MPS II 요법을 진단 및 조정하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 MPS II에 대한 요법이 진행된 인간 환자로부터 뇌척수액 또는 혈장 샘플을 획득하는 단계; 질량 스펙트럼 분석법을 수행함으로써 샘플에서 스퍼민 농도 수준을 검출하는 단계; MPS II 요법의 투여 수준을 조정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, "정상" 인간 스퍼민 농도는 뇌척수액에서 약 1ng/㎖ 내지 2ng/㎖ 또는 그 미만이다. 그러나, 미치료 MPS II를 갖는 환자는 2ng/㎖ 초과 내지 약 100ng/㎖ 이하의 스퍼민 농도 수준을 가질 수 있다. 환자가 정상 수준에 접근하는 수준을 갖는 경우, 임의의 동반자의 투여가 낮아질 수 있다. 이에 반해서, 환자가 목적하는 MPS II 수준보다 더 높은 수준을 갖는 경우, 더 높은 용량, 또는 추가적인 요법, 예를 들어, ERT이 환자에게 제공될 수 있다.
스퍼민 농도는 적합한 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[J Sanchez-Lopez, et al, "Underivatives polyamine analysis is plant samples by ion pair liquid chromatography coupled with electrospray tandem mass spectrometry," Plant Physiology and Biochemistry, 47 (2009): 592-598, avail online 28 Feb 2009; MR Hakkinen et al, "Analysis of underivatized polyamines by reversed phase liquid chromatography with electrospray tandem mass spectrometry", J Pharm Biomec Analysis, 44 (2007): 625-634, quantitative isotope dilution liquid chromatography (LC)/mass spectrometry (MS) assay]에 검정이 기술되어 있다. 다른 적합한 검정을 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료의 효능은 초기 단계 신경인지 결핍을 갖는 MPS II를 갖는 소아 대상체에서 투여 52주 후에 신경인지를 평가함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료의 효능은 MPS II 환자에서 CSF 글리코사미노글리칸(GAG) 대 신경인지의 상관관계를 평가함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료의 효능은 자기 공명 영상 (MRI), 예를 들어, 회백질 및 백질 및 CSF 뇌실의 체적 분석법에 의해서 측정되는 바와 같이 MPS II 환자에서 CNS에 대한 물리적 변화에 대한 치료의 효과를 평가함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료의 효능은 MPS II 환자의 뇌척수액(CSF), 혈청 및 소변에서 바이오마커(예를 들어, GAG, HS)에 대한 치료의 약력학적 효과를 평가함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료의 효능은 MPS II 환자의 삶의 질(QOL)에 대한 치료의 영향을 평가함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료의 효능은 MPS II 환자의 운동 기능에 대한 치료의 영향을 평가함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 치료의 효능은 MPS II 환자의 성장 및 발달 이정표에 대한 치료의 효과를 평가함으로써 결정된다.
본 명세서에 기술된 rAAV 벡터로부터 발현될 때, CSF, 혈청 또는 다른 조직에서 검출되는 경우 적어도 약 2%의 hIDS의 발현 수준이 치료 효과를 제공할 수 있다. 그러나, 더 높은 발현 수준이 달성될 수 있다. 이러한 발현 수준은 정상 기능성 인간 IDS 수준의 2% 내지 약 100%일 수 있다. 특정 실시형태에서, 정상 발현 수준보다 더 높은 수준이 CSF, 혈청 또는 다른 조직에서 검출될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 MPS II 및/또는 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 개선하는 방법은 베일리 영아 발달 검사를 사용하여 평가되는 경우, 치료된 환자에서 신경인지 발달 지수(DQ)의 상당한 증가를 초래한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 MPS II 및/또는 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 개선시키는 방법은 헌터 증후군을 갖는 환자에서 미치료/자연 이력 대조군 데이터에 비해서 치료된 환자에서 15점 이하의 DQ의 감소를 초래한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 MPS II 및/또는 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 개선하는 방법은 기능성 인간 IDS 수준의 상당한 증가를 초래한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 MPS II 및/또는 이의 증상을 치료, 예방 및/또는 개선하는 방법은 환자의 혈청, 소변 및/또는 뇌척수액(CSF)의 샘플에서 측정되는 경우 GAG 수준의 상당한 감소를 초래한다.
5.3. 병용 요법
hIDS의 전신 전달을 수반한 CNS에 대한 rAAV.hIDS의 유전자 요법 전달의 조합이 본 발명의 특정 실시형태에 포함된다. 전신 전달은 ERT(예를 들어, 엘라프라제(등록상표) 사용) 또는 간에 대해서 향성을 갖는 rAAV.hIDS를 사용한 추가적인 유전자 요법(예를 들어, AAV8 캡시드 보유 rAAV.hIDS)을 사용하여 성취될 수 있다.
특정 실시형태에서, rAAV9.hIDS의 척추강내 투여는 예를 들어, 간에 지향되는, 제2 AAV.hIDS 주사와 공동투여될 것이다. 이러한 예에서, 벡터는 동일할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 동일한 캡시드 및/또는 동일한 벡터 게놈 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 벡터는 상이할 수 있다. 예를 들어, 벡터 스톡 각각은 상이한 조절 서열(예를 들어, 각각 상이한 조직-특이적 프로모터를 가짐), 예를 들어, 간-특이적 프로모터 및 CNS-특이적 프로모터를 갖도록 설계될 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 벡터 스톡 각각은 상이한 캡시드를 가질 수 있다. 예를 들어, 간으로 전달될 벡터 스톡은 특히 AAV8, AAVrh64R1, AAVrh64R2, rh8, rh10, AAV3B, 또는 AAVdj로부터 선택된 캡시드를 가질 수 있다. 이러한 치료요법에서, 각각의 벡터 스톡의 용량은 척추강내로 전달되는 총 벡터가 약 1 x 108GC 내지 x 1 x 1014GC 범위 이내이도록 조정될 수 있고; 다른 실시형태에서, 두 경로 모두에 의해서 전달되는 조합된 벡터는 1 x 1011GC 내지 1 x 1016GC의 범위이다. 대안적으로, 각각의 벡터는 약 108GC 내지 약 1012GC/벡터의 양으로 전달될 수 있다. 이러한 용량은 실질적으로 동시에, 또는 상이한 시기에, 예를 들어, 약 1일 내지 약 12주 떨어져서, 또는 약 3일 내지 약 30일, 또는 다른 적합한 시기에 전달될 수 있다.
일부 실시형태에서 치료를 위한 방법은 (a) MPS II 및/또는 헌터 증후군의 증상을 갖는 환자에게 이식유전자-특이적 관용을 유도하기에 충분한 양의 hIDS 효소 또는 간-지향된 rAAV-hIDUA를 투여하는 단계; 및 (b) rAAV.hIDS를 환자의 CNS에 투여하고, rAAV.hIDS가 환자에서 hIDS의 치료 수준의 발현을 유도하는 단계를 포함한다.
추가 실시형태에서, MPS II 및/또는 헌터 증후군과 연관된 증상을 갖는 환자를, 환자에게 이식유전자-특이적 관용, 그 다음 hIDS의 rAAV-매개된 전달을 유도하기에 충분한 양의 hIDS 효소 또는 간-지향된 rAAV-hIDS로 관용화시키는 단계를 포함하는, MPS II 및/또는 헌터 증후군과 연관된 증상을 갖는 인간 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, 환자가 4주령 미만(신생아기) 또는 유아인 경우, 환자를 hIDS에 대해서 관용화시키기 위해서 간-지향된 주사를 통해서 환자에게 rAAV.hIDS가 투여되고, 그 다음 환자가 유아, 소아 및/또는 성인인 경우 CNS에서 hIDS의 치료적 농도를 발현하기 위해서 척추강내 주사를 통해서 환자에게 rAAV.hIDS가 투여된다.
일례에서, hIDS를 환자에 전달함으로써 MPS II 환자가 관용화된다. 생후 약 2주 이내, 예를 들어, 약 0 내지 약 14일, 또는 약 1일 내지 12일, 또는 약 3일 내지 약 10일, 또는 약 5일 내지 약 8일 이내에, 즉, 환자는 신생아 유아이다. 다른 실시형태에서, 더 나이든 유아가 선택될 수 있다. hIDS의 관용화 용량은 rAAV를 통해서 전달될 수 있다. 그러나, 또 다른 실시형태에서, 용량은 효소의 직접 전달(효소 대체 요법)에 의해서 전달된다. 재조합 hIDS의 생산 방법은 문헌에 기술되어 있다.
추가적으로, 엘라프라제(등록상표)(이두설파제)로서 상업적으로 생산된 재조합 hIDS가 전신 전달에 유용할 수 있다. 현재 덜 바람직하지만, 효소는 "네이키드(naked)" DNA, RNA, 또는 또 다른 적합한 벡터를 통해서 전달될 수 있다. 일 실시형태에서, 효소는 환자에게 정맥내 및/또는 척추강내로 전달된다. 또 다른 실시형태에서, 또 다른 투여 경로(예를 들어, 근육내, 피하 등)가 사용된다. 일 실시형태에서, 관용화를 위해서 선택된 MPS II 환자는 관용화 용량의 개시 이전에 어떠한 검출 가능한 양의 hIDS도 발현할 수 없다. 재조합 인간 IDS 효소가 전달되는 경우, 정맥내 rhIDS 주사는 약 0.5㎎/㎏ 체중으로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 더 높거나 더 낮은 용량이 선택된다. 유사하게, 벡터로부터 발현되는 경우, 더 낮게 발현된 단백질 수준이 전달될 수 있다. 일 실시형태에서, 관용화를 위해서 전달되는 hIDS의 양은 치료적 유효량보다 더 낮다. 그러나, 다른 용량이 선택될 수 있다.
전형적으로, 관용화 용량의 투여 이후에, 치료 용량이 예를 들어, 관용화 용량 약 3일 내지 약 6개월 후에, 보다 바람직하게는, 관용화 용량 약 7일 내지 약 1개월 후에 대상체에게 전달된다. 그러나, 더 길거나 더 짧은 기다림 기간일 수 있는 바와 같은 이들 범위 내의 다른 시간 지점이 선택될 수 있다.
대안으로서, 면역억제 요법이 벡터에 더하여 - 벡터 투여 이전에, 벡터 투여 동안 및/또는 벡터 투여 이후에 제공될 수 있다. 면역억제 요법은 상기에 기술된 바와 같은 프레드니솔론, 마이코페놀레이트 모페틸(MMF) 및 타크로리무스 또는 시롤리무스를 포함할 수 있다. 하기에 기술된 타크로리무스-무함유 치료요법이 바람직할 수 있다.
5.4. 제조
일 실시형태는 본 명세서에 기술된 rAAV.hIDS 약제학적 조성물의 제조를 제공한다(하기 실시예 4). 예시적인 제조 공정이 도 10A 및 10B에 제공되어 있다. rAAV.hIDS 벡터는 도 10A 및 10B에 도시된 흐름도에 도시된 바와 같이 제조될 수 있다. 간략하면, 세포를 적합한 세포 배양(예를 들어, HEK 293) 세포 중에서 제조한다. 본 명세서에 기술된 유전자 요법 벡터를 제조하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법, 예컨대, 유전자 요법 벡터의 생산을 위해서 사용되는 플라스미드 DNA의 생성, 벡터의 생성, 및 벡터의 정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 벡터이고, 생성된 플라스미드는 AAV 게놈 및 관심 유전자를 암호화하는 AAV 시스-플라스미드, AAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 트랜스-플라스미드, 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드이다. 벡터 생성 공정은 방법 단계, 예컨대, 세포 배양의 개시, 세포의 계대, 세포의 시딩, 세포의 플라스미드 DNA로의 형질주입, 혈청 무함유 배지로의 형질주입 후 배지 교환, 및 벡터-함유 세포 및 배양 배지의 수거를 포함할 수 있다. 수거된 벡터-함유 세포 및 배양 배지를 본 명세서에서 조 세포 수거물이라 지칭한다.
그 후, 조 세포 수거물을 방법 단계, 예컨대, 벡터 수거물의 농축, 벡터 수거물의 투석여과, 벡터 수거물의 미세유동화, 벡터 수거물의 뉴클레아제 소화, 미세유동화된 중간체의 여과, 크로마토그래피에 의해서 조물질 정제, 초원심분리에 의한 조물질 정제, 접선 유동 여과에 의한 완충액 교환, 및/또는 벌크 벡터를 제조하기 위한 제형화 및 여과에 적용할 수 있다.
고 염 농도에서, 그 다음 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 의한 2-단계 친화도 크로마토그래피 정제를 사용하여 벡터 약물 제품을 정제하고, 중공 캡시드를 제거한다. 이러한 방법은 본 명세서에 참고로 포함된 국제 특허 출원 제PCT/US2016/065970호(출원일 2016년 12월 9일) 및 이의 우선권 문헌, 미국 특허 출원 제62/322,071호(출원일 2016년 4월 13일), 및 제62/226,357호(출원일 2015년 12월 11일, 발명의 명칭 "Scalable Purification Method for AAV9")에 보다 상세하게 기술되어 있다. AAV8에 대한 정제 방법, 국제 특허 출원 제PCT/US2016/065976호(출원일 2016년 12월 9일) 및 이의 우선권 문헌 미국 특허 출원 제62/322,098호(출원일 2016년 4월 13일) 및 제62/266,341호(출원일 2015년 12월 11일) 및 rh10에 대한 정제 방법, 국제 특허 출원 제PCT/US16/66013호(출원일 2016년 12월 9일) 및 이의 우선권 문헌, 미국 특허 출원 제62/322,055호(출원일 2016년 4월 13일) 및 제62/266,347호(발명의 명칭 "Scalable Purification Method for AAVrh10", 또한 출원일 2015년 12월 11일), 및 AAV1에 대한 정제 방법, 국제 특허 출원 제PCT/US2016/065974호(출원일 2016년 12월 9일), 및 이의 우선권 문헌 미국 특허 출원 제62/322,083호(출원일 2016년 4월 13일) 및 제62/26,351호("Scalable Purification Method for AAV1", 출원일 2015년 12월 11일)은 모두 본 명세서에 참고로 포함된다.
5.5. 약제학적 조성물을 뇌척수액에 전달하기 위한 장치 및 방법
일 양상에서, 본 명세서에 제공된 벡터는 이 부분에 제공되고, 실시예 및 도 11에 추가로 기술된 방법 및/또는 장치를 통해서 척추강내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 다른 장치 및 방법이 선택될 수 있다. 방법은 척추 니들을 환자의 대수조로 전진시키는 단계, 가요성 튜빙의 길이를 척추 니들의 근위 허브에 연결시키고, 밸브의 산출 포트를 가요성 튜빙의 근위 단부에 연결시키는 단계, 및 상기 전진 단계 및 연결 단계 후에 그리고 튜빙이 환자의 뇌척수액으로 자가-프라이밍되도록 한 후에, 임의의 양의 등장성 용액을 함유하는 제1 용기를 밸브의 플러쉬 입구 포트에 연결하는 단계, 및 그 후 임의의 양의 약제학적 조성물을 함유하는 제2 용기를 밸브의 벡터 입구 포트에 연결하는 단계를 포함한다. 제1 용기 및 제2 용기를 밸브에 연결한 후에, 유체 유동을 위한 경로가 벡터 입구 포트와 밸브의 출구 포트 사이에서 개방되고, 약제학적 조성물이 척추 니들을 통해서 환자에게 주사되고, 약제학적 조성물의 주사 후, 유체 유동을 위한 경로가 플러쉬 입구 포트 및 밸브의 출구 포트를 통해서 개방되고, 등장성 용액이 척추 니들로 주사되어 약제학적 조성물이 환자에게 플러슁된다.
또 다른 양상에서, 약제학적 조성물의 수조내 전달을 위한 장치가 제공된다. 장치는 임의의 양의 약제학적 조성물을 함유하는 제1 용기, 등장성 용액을 함유하는 제2 용기, 및 약제학적 조성물이 장치로부터 환자의 대수조 내의 뇌척수액으로 직접 배출될 수 있는 척추 니들을 포함한다. 장치는 제1 용기에 서로 연결된 제1 입구 포트, 제2 용기에 서로 연결된 제2 입구 포트, 척추 니들에 서로 연결된 출구 포트, 및 약제학적 조성물 및 등장성 용액의 척추 니들을 통한 유동을 제어하기 위한 루어 락을 갖는 밸브를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 컴퓨터 단층촬영(CT)은 신체 구조의 3차원 영상이 축을 따라서 제조된 일련의 평면 단면 영상으로부터 컴퓨터에 의해서 구축되는 방사선촬영을 지칭한다.
도 11에 도시된 장치 또는 의학 장치(10)는 밸브(16)를 통해서 서로 연결된 하나 이상의 용기(12 및 14)를 포함한다. 용기(12 및 14)는 각각 약제학적 조성물, 약물, 벡터, 또는 유사한 물질의 새로운 공급원 및 등장성 용액, 예컨대, 염수의 새로운 공급원을 제공한다. 용기(12 및 14)는 환자에게의 유체의 주사를 가능하게 하는 의학 장치의 임의의 형태일 수 있다.
예의 방식에 의해서, 각각의 용기(12 및 14)는 주사기, 캐눌라 등의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 예시된 실시형태에서, 용기(12)는 임의의 양의 약제학적 조성물을 함유하는 개별 주사기로서 제공되고, 본 명세서에서 "벡터 주사기"라 지칭된다. 단지 예의 목적을 위해서, 용기(12)는 약 10cc의 약제학적 조성물 등을 함유할 수 있다.
마찬가지로, 용기(14)는 임의의 양의 염수 용액을 함유하는 별개의 주사기, 캐눌라 등의 형태로 제공될 수 있고, "플러쉬 주사기"라 지칭될 수 있다. 단지 예의 목적을 위해서, 용기(14)는 약 10cc의 염수 용액을 함유할 수 있다.
대안으로서, 용기(12 및 14)는 주사기가 아닌 형태로 제공될 수 있고, 단일 장치로 통합될 수 있고, 예컨대, 통합된 의학 주사 장치는 별개의 챔버의 쌍을 갖는데, 하나는 약제학적 조성물을 위한 것이고, 나머지는 염수 용액을 위한 것이다. 또한, 챔버 또는 용기의 크기는 목적하는 양의 유체를 함유하도록 필요에 따라서 제공될 수 있다.
예시된 실시형태에서, 밸브(16)는 스위블(swivel) 수 루어 락(18)을 갖는 4-웨이 스탑콕으로서 제공된다. 밸브(16)는 용기(12 및 14)(즉, 예시된 실시형태에서 벡터 주사기 및 플러쉬 주사기)에 서로 연결되고, 스위블 수 루어 락은 밸브(16)를 통과하는 경로가 용기(12 및 14) 각각에 대해서 폐쇄되거나 개방되는 것을 가능하게 한다. 이러한 방식에서, 밸브(16)를 통과하는 경로는 벡터 주사기 및 플러쉬 주사기 둘 모두에 대해서 폐쇄될 수 있거나 또는 벡터 주사기 및 플러쉬 주사기 중 선택된 하나에 대해서 개방될 수 있다. 4-웨이 스탑콕에 대한 대안으로서, 밸브는 3-웨이 스탑콕 또는 유체 제어 장치일 수 있다.
예시된 실시형태에서, 밸브(16)는 연장 튜빙(20)의 길이의 하나의 단부 또는 유체를 위한 유사한 도관에 연결된다. 튜빙(20)은 목적하는 길이 또는 내부 체적을 기초로 선택될 수 있다. 단지 예의 방식으로, 튜빙은 약 6 내지 7인치 길이일 수 있다.
예시된 실시형태에서, 튜빙(12)의 반대 단부(22)는 T-연결기 연장 세트(24)에 연결되고, 결국, 이것은 척추 니들(26)에 연결된다. 예의 방식으로, 니들(26)은 5인치, 22 또는 25게이지의 척추 니들일 수 있다. 또한, 선택으로서, 척추 니들(26)은 도입기 니들(28), 예컨대, 3 및 1/2인치, 18게이지 도입기 니들에 연결될 수 있다.
사용 시에, 척추 니들(26) 및/또는 임의적인 도입기 니들(28)은 대수조를 향해서 환자에게 전진될 수 있다. 니들 전진 후, 니들(26 및/또는 28) 및 상응하는 연조직(예를 들어, 척추옆 근육, 골, 뇌줄기 및 척수)의 가시화를 허용하는 컴퓨터 단층촬영(CT) 영상을 얻을 수 있다. 올바른 니들 배치는 니들 허브 내의 뇌척수액(CSF)의 관찰 및 대수조 내의 니들 팁의 가시화에 의해서 확인된다. 그 후, 상대적으로 짧은 연장 튜빙(20)이 삽입된 척추 니들(26)에 부착될 수 있고, 이어서 4-웨이 스탑콕(16)이 튜빙(20)의 반대 단부에 부착될 수 있다.
상기 조립체는 환자의 CSF로 "자가-프라이밍"되도록 허용된다. 그 후, 사전 충전된 정상 염수 플러쉬 주사기(14)가 4-웨이 스탑콕(16)의 플러쉬 입구 포트에 부착되고, 약제학적 조성물을 함유하는 벡터 주사기(12)가 4-웨이 스탑콕(16)의 벡터 입구 포트에 부착된다. 그 후, 스탑콕(16)의 산출 포트가 벡터 주사기(12)에 대해서 개방되고, 벡터 주사기의 내용물이 일정 시간 기간에 걸쳐서 밸브(16) 및 조립된 장치를 통해서 환자에게 서서히 주사될 수 있다. 단지 예의 목적을 위해서, 이러한 시간 기간은 대략 1 내지 2분 및/또는 목적하는 임의의 다른 시간일 수 있다.
벡터 주사기(12)의 내용물이 주사된 후, 스탑콕(16) 상의 스위블 락(18)은 스탑콕(16) 및 니들 조립체가 부착된 사전 충전된 플러쉬 주사기(14)를 사용하여 목적하는 양의 생리 식염수로 플러슁될 수 있도록 제2 위치로 돌려진다. 단지 예의 방식으로, 1 내지 2cc의 생리 식염수가 사용될 수 있지만; 더 많거나 더 적은 양이 필요에 따라서 사용될 수 있다. 생리 식염수는 모든 또는 대부분의 약제학적 조성물이 조립된 장치를 통해서 환자에게 주사되어, 약제학적 조성물이 조립된 장치 내에 거의 또는 전혀 남아있지 않도록 보장한다.
조립된 장치가 염수로 플러슁된 후, 니들(들), 연장 튜빙, 스탑콕, 및 주사기를 비롯한 이의 전체적으로 조립된 장치는 대상체로부터 제거되고, 폐기를 위해서 수술 트레이 상의 생물재해 폐기물 리셉터클 또는 두꺼운 용기(니들(들)을 위해서)에 놓인다.
스크리닝 공정은 연구 책임자에 의해서 수행될 수 있고, 이것은 궁극적으로 수조내(IC) 절차로 이어질 수 있다. 연구 책임자는 대상체(또는 지정된 간병인)에게 안전한 정보를 제공하기 위해서 공정, 절차, 투여 절차 자체 및 모든 가능한 안정성 위험을 기술할 수 있다. 병력, 수반된 의약, 신체 검사, 활력 징후, 심전도(ECG) 및 실험실 시험 결과가 수득되거나 수행되어, IC 절차에 대한 대상체 적격성의 스크리닝 평가에서 사용하기 위해서 신경방사선전문의, 신경외과의사, 및 마취과의사에게 제공된다.
적격성을 검토하기 위한 적절한 시간을 허용하기 위해서, 하기 절차를 제1 스크리닝 방문과 연구 방문 일주일 전까지 사이의 임의의 시간에 수행될 수 있다. 예를 들어, "0일"에, 가돌리늄(즉, eGFR >30㎖/분/1.73㎡)과 함께 또는 그것 없이 머리/목 자기 공명 영상(MRI)이 수득될 수 있다. 머리/목 MRI에 더하여, 연구자는 굴/신 연구를 통해서 목의 임의의 추가 평가에 대한 필요성을 결정할 수 있다. MRI 프로토콜은 T1, T2, DTI, FLAIR 및 CINE 프로토콜 영상을 포함할 수 있다.
또한, 머리/목 MRA/MRV는 CSF 유동의 적절한 평가 및 CSF 공간 사이에서 의사소통의 가능한 차단 또는 결여의 식별을 허용하는 제도적 프로토콜에 따라서 수득될 수 있다(즉, 경막내/경막경유 수술의 이력이 있는 대상체는 배제될 수 있거나 또는 추가 시험(예를 들어, 방사성뉴클레오타이드 뇌수조조형술(cisternography)이 필요할 수 있음).
신경방사선전문의, 신경외과의사, 및 마취과의사는 궁극적으로 모든 입수 가능한 정보(스캔, 병력, 신체 검사, 랩 등)를 기초로 IC 절차에 대해서 각각의 대상체의 적격성을 논의하고, 결정한다. MPS 대상체의 특별한 생리학적 요구를 명심하면서, 기도, 목(짧아짐/두꺼워짐) 및 머리 운동 범위(목 굽힘 정도)의 상세한 평가를 제공하는 마취 수술전 평가가 또한 "-28일" 내지 "1일"로부터 수득될 수 있다.
IC 절차 이전에, CT 세트(Suite)는 하기 장비 및 의약이 존재하는지를 확인해줄 것이다:
성인 요추 천자(LP) 키트(기관에 따라서 공급됨);
BD(벡톤 디킨슨) 22 또는 25게이지 x 3 - 7" 척추 니들(퀸케 베벨(Quincke bevel);
동축 도입기 니들, 중재자(interventionalist)의 재량으로 사용됨(척추 니들의 도입을 위해서);
스위블(스핀) 수 루어 락을 갖는 4 웨이 스몰 보어 스탑콕;
암 루어 락 어댑터를 갖는 T-연결기 연장 세트(튜빙), 대략적인 길이 6.7인치;
옴니파큐(Omnipaque) 180 (이오헥솔), 척추강내 투여용;
정맥내(IV) 투여용 아이오딘화 조영제;
주사용 1% 리도카인 용액(성인 LP 키트에 제공되지 않은 경우);
사전 충전된 10cc 생리 식염수(멸균) 플러쉬 주사기;
방사선불투과성 마커(들);
외과용 장비/면도날;
삽관된 대상체의 적절한 배치를 허용하기 위한 필로/지지체;
기관내 삽관 장비, 일반적인 마취 기계 및 기계적 환기;
수술중 신경생리학적 모니터링(IONM) 장비(및 소요 인원); 및
벡터를 함유하는 10cc 주사기; 별도의 약제학 매뉴얼에 따라서 CT/수술실(OR)에서 준비하고 운반됨.
절차에 대해서 정보를 제공한 동의서를 의료 기록 및/또는 연구 파일 내에서 확인하고 문서화한다. 영상의학과 및 마취통증의학과 스탭으로부터의 절차를 위한 별개의 동의서를 제도적 요건에 따라서 획득한다. 대상체는 제도적 가이드라인에 따라서 적절한 병원 진료 유닛 내에 놓인 정맥내 접근(예를 들어, 2개의 IV 접근 부위)을 허용한다. 정맥내 유체를 마취과의사의 재량으로 투여한다. 마취과의사의 재량으로 그리고 제도적 가이드라인에 따라서, 대상체에게 적절한 환자 진료 유닛, 대기 구역 또는 수술/CT 절차 공간에서 일반적인 마취제의 투여와 함께 기관내 삽관을 유도하거나 행할 수 있다.
요추 천자를 먼저 수행하여 5cc의 뇌척수액(CSF)을 제거하고, 그 다음 조영제(옴니파큐 180)를 척추강내로 주사하여 대수조의 가시화를 돕는다. 적절한 대상체 배치 조작을 수행하여 대수조 내에서 조영제의 확산을 가능하게 할 수 있다
수술중 신경생리학적 모니터링(IONM) 장비를 대상체에게 부착한다. 대상체를 엎드리거나 측와위 위치로 CT 스캐너 테이블 상에 놓는다. 이송 및 배치 동안 대상체 안정성을 보장하기 위해서 적절한 스탭이 존재해야 한다. 적절하다고 생각되는 경우, 대상체를 수술전 평가 동안 안전한 것으로 결정된 정도까지 그리고 배치 후에 문서화된 정상 신경생리학적 모니터 신호를 사용하여 목 굽힘을 제공하는 방식으로 배치할 수 있다.
하기 스탭이 현장에 존재하는지 확인할 수 있고, 식별할 수 있다. 절차를 수행하는 중재자/신경외과의사; 마취과의사 및 호흡 테크니션(들); 간호사 및 보조 의사; CT(또는 OR) 테크니션; 신경생리학 테크니션; 및 현장 코디네이터(Site Coordinator). "타임-아웃"을 의료기관 평가위원회 인증(Joint Commission/hospital protocol)/병원 프로토콜에 따라서 완결하여 올바른 대상체, 절차, 부위, 배치, 및 공간 내의 모든 필수적인 장비의 존재를 입증한다. 이어서, 책임 사이트 연구자는, 그/그녀가 대상체 준비를 진행할 수 있는지를 스탭과 함께 확인할 수 있다.
두개저(skull base) 하의 대상체의 피부를 적절한 경우 면도한다. CT 스카우트 영상을 수행하고, 그 다음 표적 위치를 국한시키고, 혈관을 영상화하기 위해서 중재자가 필요하다고 판단하는 경우, IV 조영제를 사용하여 사전 절차 계획 CT를 수행한다. 표적 부위(대수조)를 식별하고, 니들 궤도를 계획한 후, 피부를 수술준비시키고, 제도적 가이드라인에 따라서 멸균 기술을 사용하여 가린다. 방사선불투과성 마커를 중재자에 의해서 제시된 바와 같은 표적 피부 위치에 놓는다. 마커 하의 피부를 1% 리도카인으로의 침투를 통해서 마취시킨다. 이어서, 동축 도입기 니들을 사용하는 선택으로, 22G 또는 25G 척추 니들을 대수조를 향해서 전진시킨다.
니들 전진 후, 제도적 장비를 사용하여 실현 가능한 가장 얇은 CT 슬라이스 두께(이상적으로는 2.5㎜ 이하)를 사용하여 CT 영상을 수득한다. 니들 및 상응하는 연조직(예를 들어, 척추옆 근육, 골, 뇌줄기 및 척수)의 적절한 가시화를 허용하는 가능한 가장 낮은 방사선 용량을 사용하여 순차적인 CT 영상을 수득한다. 니들 허브 내의 CSF의 관찰 및 대수조 내의 니들 팁의 가시화에 의해서 올바른 니들 배치를 확인한다.
중재자는 벡터 주사기가 멸균 필드에 가깝게, 그리나 그 외부에 배치되는지를 확인한다. 벡터 주사기 내의 약제학적 조성물을 취급 또는 투여하기 전에, 멸균 필드 내에서 절차를 돕는 스탭은 장갑, 마스크 및 눈 보호기를 착용한다.
연장 튜빙을 삽입된 척추 니들에 부착하고, 이어서 이것을 4-웨이 스탑콕에 부착한다. 이러한 장치가 대상체의 CSF로 "자가-프라이밍"된 후, 10cc의 사전 충전된 생리 식염수 플러쉬 주사기를 4-웨이 스탑콕의 플러쉬 입구 포트에 부착한다. 이어서 벡터 주사기를 중재자에게 제공하고, 4-웨이 스탑 콕 상의 벡터 입구 포트에 부착한다.
스탑콕의 스위블 록을 제1 위치에 놓음으로써 스탑콕의 출구 포트를 벡터 주사기에 대해서 개방한 후, 주사 동안 주사기의 플런저 상에 과도한 힘이 적용되지 않도록 주의하면서, 벡터 주사기의 내용물을 서서히 주입한다(대략 1 내지 2분에 걸쳐서). 벡터 주사기의 내용물을 주사한 후, 스탑콕의 스위블 락을 스탑콕 및 니들 조립체가 부착된 사전 충전된 플러쉬 주사기를 사용하여 1 내지 2cc의 생리 식염수로 플러슁될 수 있도록 제2 위치로 돌린다.
준비되면, 이어서 중재자는 그/그녀가 대상체로부터 장치를 제거할 것을 스탭에게 알린다. 단일 행동으로, 니들, 연장 튜빙, 스탑콕, 및 주사기를 대상체로부터 서서히 제거하고, 폐기를 위해서 수술 트레이 상의 생물재해 폐기물 리셉터클 또는 두꺼운 용기(니들을 위해서)에 넣는다.
니들 삽입 부위를 출혈 또는 CSF 누출의 징후에 대해서 조사하고, 연구자에 의해서 제시된 바와 같이 처리한다. 부위를 제시된 바와 같이 거즈, 수술 테이프 및/또는 테가덤 드레싱(Tegaderm dressing)을 사용하여 드레싱한다. 이어서 대상체를 CT 스캐너로부터 제거하고, 들것 상에 반듯이 눕힌다. 이송 및 배치 동안 대상체 안정성을 보장하기 위해서 적절한 스탭이 존재한다.
마취를 중단하고, 마취 후 케어를 위한 제도적 가이드라인에 따라서 대상체를 케어한다. 신경생리학적 모니터를 대상체로부터 제거한다. 대상체가 누워있는 들것의 머리를 회복 동안 약간 상승시켜야 한다(약 30도). 제도적 가이드라인에 따라서 대상체를 적합한 마취 후 케어 유닛으로 옮긴다. 대상체가 의식을 적절하게 회복하고, 안정적인 상태가 된 후, 그/그녀를 프로토콜 위임 평가를 위해서 적절한 장소/유닛으로 이동시킬 것이다. 신경학적 평가가 프로토콜에 따라서 이어질 것이며, 1차 연구자는 병원 및 연구 스탭과 공동으로 대상 치료를 감독한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물의 전달 방법은 척추 니들을 환자의 대수조로 전진시키는 단계; 가용성 튜빙의 길이를 척추 니들의 근위 허브에 연결시키고, 밸브의 출구 포트를 가요성 튜빙의 근위 단부에 연결시키는 단계; 상기 전진 단계 및 연결 단계 후에 그리고 튜빙이 환자의 뇌척수액으로 자가-프라이밍되도록 한 후에, 임의의 양의 등장성 용액을 함유하는 제1 용기를 밸브의 플러쉬 입구 포트에 연결하는 단계, 및 그 후 임의의 양의 약제학적 조성물을 함유하는 제2 용기를 밸브의 벡터 입구 포트에 연결하는 단계; 상기 제1 용기 및 제2 용기를 밸브에 연결시키는 단계 후에, 유체 유동을 위한 경로를 벡터 입구 포트와 밸브의 출구 포트 사이에서 개방시키는 단계 및 약제학적 조성물을 척추 니들을 통해서 환자에게 주사하는 단계; 및 약제학적 조성물을 주사하는 단계 후에, 유체 유동을 위한 경로를 플러쉬 입구 포트 및 밸브의 출구 포트를 통해서 개방시키는 단계 및 등장성 용액을 척추 니들로 주사하여 약제학적 조성물을 환자에게 플러슁하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 튜빙 및 밸브를 척추 니들의 허브에 연결시키는 단계 이전에 대수조 내에서 척추 니들의 원위 팁의 적절한 배치를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 확인하는 단계는 대수조 내의 척추 니들의 원위 팁을 컴퓨터 단층촬영(CT) 영상을 사용하여 가시화하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 확인하는 단계는 척추 니들의 허브에서 환자의 뇌척수액의 존재를 관찰하는 단계를 포함한다.
상기에 기술된 방법에서, 밸브는 플러쉬 입구 포트를 통한 유동을 동시에 차단하면서 벡터 입구 포트로부터 출구 포트로의 유동을 허용하는 제1 위치 및 벡터 입구 포트를 통한 유동을 동시에 차단하면서 플러쉬 입구 포트로부터 출구 포트로의 유동을 허용하는 제2 위치로 스위블에 대해서 개작된 스위블 루어 락을 갖는 스탑콕일 수 있고, 여기서 스위블 루어 락은 상기 약제학적 조성물이 환자에게 주사되는 경우에는 상기 제1 위치에 배치되고, 상기 약제학적 조성물이 등장성 용액에 의해서 상기 환자에게 플러슁되는 경우에는 상기 제2 위치에 배치된다. 특정 실시형태에서, 등장성 용액을 척추 니들에 주사하여 약제학적 조성물을 환자 내에서 플러슁한 후, 튜빙, 밸브, 및 제1 및 제2 용기가 조립체로서 이에 연결된 척추 니들을 환자로부터 배출한다. 특정 실시형태에서, 밸브는 스위블 수 루어 락을 갖는 4-웨이 스탑콕이다. 특정 실시형태에서, 제1 용기 및 제2 용기는 별개의 주사기이다. 특정 실시형태에서, T-연결기는 척추 니들의 허브에 위치되고, 튜빙을 척추 니들에 서로 연결한다. 임의로, 척추 니들은 척추 니들의 원위 단부에서 도입기 니들을 포함한다. 척추 니들은 5인치, 22 또는 24게이지 척추 니들일 수 있다. 특정 실시형태에서, 도입기 니들은 3.5인치, 18게이지 도입기 니들이다.
특정 양상에서, 방법은, 최소한, 임의의 양의 약제학적 조성물을 함유하기 위한 제1 용기; 등장성 용액을 함유하기 위한 제2 용기; 약제학적 조성물이 장치로부터 환자의 대수조 내의 뇌척수액으로 직접 배출될 수 있는 척추 니들; 및 제1 용기에 서로 연결된 제1 입구 포트, 제2 용기에 서로 연결된 제2 입구 포트, 척추 니들에 서로 연결된 출구 포트, 및 약제학적 조성물 및 등장성 용액의 척추 니들을 통한 유동을 제어하기 위한 루어 락을 갖는 밸브로 구성된 장치를 사용한다. 특정 실시형태에서, 밸브는 제2 입구 포트를 통한 유동을 동시에 차단하면서 제1 입구 포트로부터 출구 포트로의 유동을 허용하는 제1 위치 및 제1 입구 포트를 통한 유동을 동시에 차단하면서 제2 입구 포트로부터 출구 포트로의 유동을 허용하는 제2 위치로 스위블에 대해서 개작된 스위블 루어 락을 갖는 스탑콕이다. 임의로, 밸브는 스위블 수 루어 락을 갖는 4-웨이 스탑콕이다. 특정 실시형태에서, 제1 용기 및 제2 용기는 별개의 주사기이다. 특정 실시형태에서, 척추 니들은 가요성 튜빙의 길이를 통해서 밸브에 서로 연결되어 있다. T-연결기는 튜빙을 척추 니들에 서로 연결할 수 있다. 특정 실시형태에서, 척추 니들은 5인치, 22 또는 24게이지 척추 니들이다. 특정 실시형태에서, 장치는 추가로 척추 니들의 원위 단부에 연결된 도입기 니들을 추가로 포함한다. 임의로, 도입기 니들은 3.5인치, 18게이지 도입기 니들이다.
이러한 방법 및 이러한 장치는 본 명세서에 제공된 조성물의 척추강내 전달을 위해서 각각 임의로 사용될 수 있다. 대안적으로, 다른 방법 및 장치가 이러한 척추강내 전달을 위해서 사용될 수 있다.
하기 실시예는 본 명세서에 기술된 발명을 단지 예시하고, 이에 대한 제한이 아니다.
6. 실시예
실시예 1: 인간 대상체의 치료를 한 프로토콜
본 실시예는 MPS II, 즉, 헌터 증후군을 갖는 환자를 위한 유전자 요법 치료에 관한 것이다 본 실시예에서, 유전자 요법 벡터, 야생형 hIDS 효소를 암호화하는 변형된 hIDS 유전자를 발현하는 복제 결함 아데노-연관 바이러스 벡터 9(AAV9)인 AAV9.CB.hIDS를 MPS II 환자의 중추신경계(CNS)에 투여한다. AAV 벡터의 용량을 일반적인 마취 하에서 CNS에 직접 주사한다. 치료의 효능을 본 명세서에 기술된 바와 같이, 신경인지 발달 및/또는 바이오마커를 비롯한 대용 마커의 임상적 측정치, 예를 들어, 병원성 GAG의 감소 및/또는 대상체의 CSF 또는 혈청 중의 헤파린 설페이트(HS) 농도를 사용하여 평가한다.
A. 유전자 요법 벡터
유전자 요법 벡터는 인간 이두로네이트-2-설페이타제(IDS)를 발현하는 항원형 9의 비-복제성 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이고, 본 실시예에서 AAV9.CB. IDS라 지칭된다(도 1 참고). AAV9 항원형은 IC 투여 이후에 CNS에서 hIDS 산물의 효율적인 발현을 허용한다.
IDS 발현 카세트는 반전 말단 반복부(ITR)에 의해서 플랭킹되어 있고, 발현은 거대세포바이러스(CMV) 인핸서 및 닭 베타 액틴 프로모터(CB7)의 혼성체에 의해서 유도된다. 이식유전자는 닭 베타 액틴 인트론 및 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화(폴리A) 신호를 포함한다.
벡터를 제형 완충액(엘리엇츠 B 용액, 0.001% 플루로닉 F68) 중에 현탁시킨다. 작제물을 문헌[M. Lock et al, Human Gene Ther, 21: 1259-1271 (2010)]에 이미 기술된 바와 같이 AAV9 캡시드에 패키징하고, 정제하고, 적정한다. 제조 공정은 하기 실시예 4에 보다 상세하게 기술되어 있다.
벡터 생산:
벡터 생산:
일련의 벡터를 생성하였다. 하나의 플라스미드는 코돈-최적화된 IDS 서열(서열번호 11의 nt 1177 내지 nt 2829)을 함유한다. 나머지 2개는 CB7 프로모터(CB6)의 짧은 버전을 사용하였고, SUMF1 [서열번호 7 및 서열번호 10]이라 지칭되는 제2 단백질을 발현하였다. 생산된 벡터 게놈, AAV.CB7.CI.hIDSco.RBG는 서열번호 11의 nt 2 내지 nt 3967의 서열을 갖는 반면, AAV.CB6.hIDSco.IRES.hSUMF1co는 서열번호 8의 nt 11 내지 nt 4964의 서열을 갖는다. hIDS 서열 플라스미드를 코돈-최적화하고, 합성함으로써 플라스미드를 작제하고, 이어서 생성된 작제물을 CB7 또는 CB6, CI 및 RBG 발현 요소를 함유하는 AAV2 ITR-플랭킹된 발현 카세트인 플라스미드 pENN.AAV.CB7.CI.RBG 또는 pENN.AAV.CB6.CI.RBG 내에 클로닝하여 상기 벡터 게놈을 제공하였다.
더 추가로 네이티브 인간 IDS cDNA를 함유하는 플라스미드를 생성하였고; 이들 플라스미드를 본 명세서에서 pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG 및 pAAV.CB6.CI.hIDS.IRES.SUMF1.RBG라 칭한다. 이들 플라스미드로부터 유래된 벡터 게놈[서열번호 3의 nt 2 내지 nt 3967 및 서열번호 5의 nt 11 내지 nt 4964]은 hIDS 발현 카세트를 플랭킹한 AAV2 유래된 ITR을 갖는 단일-가닥 DNA 게놈이다. 이식유전자 카세트로부터의 발현은 CMV 극 초기 인핸서(C4)와 닭 베타 액틴 프로모터 간의 혼성체인, CB7 또는 CB6 프로모터에 의해서 유래된 반면, 이러한 프로모터로부터의 전사는 닭 베타 액틴 인트론(CI)의 존재에 의해서 향상된다. 발현 카세트를 위한 폴리A 신호는 RBG 폴리A이다. hIDS 서열 플라스미드를 합성함으로써 플라스미드를 작제하고, 이어서 생성된 작제물을 플라스미드 pENN.AAV.CB7.CI.RBG 또는 pENN.AAV.CB6.CI.RBG, CB7, CI 및 RBG 발현 요소를 함유하는 AAV2 ITR-플랭킹된 발현 카세트 내에 클로닝하여 상기 벡터 게놈을 제공하였다.
서열 요소의 설명:
반전 말단 반복부(ITR): AAV ITR(젠뱅크 # NC001401)은 두 단부 모두에 대해서 동일하지만, 반대 배향으로 존재하는 서열이다. AAV 및 아데노바이러스 헬퍼 기능부가 트랜스로 제공된 경우, AV2 ITR 서열은 벡터 DNA 복제점 및 벡터 게놈의 패키징 신호 둘 모두로서 기능한다. 이와 같이, ITR 서열은 벡터 게놈 복제 및 패키징에 필요한 유일한 시스 서열을 나타낸다.
CMV 극 초기 인핸서(382bp, C4; 젠뱅크 # K03104.1). 이러한 요소가 벡터 게놈 플라스미드 중에 존재한다.
닭 베타-액틴 프로모터(282bp; CB; 젠뱅크 # X00182.1)를 사용하여 고-수준 hIDS 발현을 유도한다.
닭 베타-액틴 인트론: 닭 베타 액틴 유전자(젠뱅크 # X00182.1)로부터의 973bp 인트론이 벡터 발현 카세트 내에 존재한다. 인트론은 전사되지만, 스플라이싱에 의해서 성숙 메신저 RNA(mRNA)로부터 제거되고, 그것 중 어느 하나의 측면 상에서 서열을 함께 연결시킨다. 발현 카세트 내의 인트론의 존재는 mRNA의 핵으로부터 세포질로의 이송을 가능하게 하여, 번역을 위한 mRNA의 꾸준한 수준의 축적을 향상시킨다고 밝혀져 있다. 이것은 유전자 발현의 증가된 수준을 위해서 의도되는 유전자 벡터에서의 일반적인 특징이다. 이러한 요소는 벡터 게놈 및 플라스미드 둘 모두에 존재한다.
이두로네이트-2-설페이타제 암호 서열: hIDS 서열을 합성하였다[서열번호 1]. 암호화된 단백질은 본 명세서 초반부에 기술된 550 아미노산[서열번호 2; 젠뱅크 NP_000193, UnitProtKB/Swiss-Prot (P22304.1)]이다. 서열번호 1 및 2를 참고하기 바란다. 코돈-최적화된 hIDS 암호 서열은 서열번호 8의 nt 3423 내지 nt 4553뿐만 아니라 서열번호 11의 nt 1937 내지 nt 3589에 제시되어 있다.
폴리아데닐화 신호: 127bp 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호(젠뱅크 # V00882.1)를 항체 mRNA의 효율적인 폴리아데닐화를 위해서 시스 서열에 제공한다. 이러한 요소는 전사 종결, 초기 전사물의 3' 단부에서의 특이적 절단 사건 및 폴리아데닐 꼬리의 부가의 신호로서 기능한다. 이러한 요소는 벡터 게놈 및 플라스미드 둘 모두에 존재한다.
B. 투여 및 투여 경로
환자에게 1.0 x 1013 내지 5.0 x 1014GC(고정 용량)(2.5 x 1010 내지 3.6 x 1011GC/g 환자의 뇌 질량에 동등함) 범위인 rAAV9.CB7.hIDS의 단일 척추강내/수조내 용량을 제공한다. 대안적으로, 하기 고정 용량을 제시된 연령군의 환자에게 투여한다:
Figure pct00029
신생아: 약 3.8 x 1012 내지 약 1.9 x 1014GC;
Figure pct00030
3 내지 9개월: 약 6 x 1012 내지 약 3 x 1014GC;
Figure pct00031
9 - 36개월: 약 1 x 1013 내지 약 5 x 1014GC;
Figure pct00032
3 내지 12세: 약 1.2 x 1013 내지 약 6 x 1014GC;
Figure pct00033
12+세: 약 1.4 x 1013 내지 약 7.0 x 1014GC;
Figure pct00034
18+세(성인): 약 1.4 x 1013 내지 약 7.0 x 1014GC.
중공 캡시드가 환자에 투여되는 rAAV9.CB7.hIDS의 용량으로부터 제거되는 것을 보장하기 위해서, 본 명세서에 논의된 바와 같이, 벡터 정제 공정 동안 염화세슘 구배 초원심분리에 의해서 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해서 중공 캡시드를 벡터 입자로부터 분리한다.
C. 환자 하위집단
적합한 환자는 하기 연령의 남성 또는 여성 대상체를 포함한다:
Figure pct00035
신생아;
Figure pct00036
3 내지 9개월령;
Figure pct00037
9 내지 36개월령;
Figure pct00038
3 내지 12세;
Figure pct00039
12+세;
Figure pct00040
18+세(성인).
D. 임상 목표 측정
1차 임상 목표는 MPS II 결함과 연관된 신경인지 감소를 예방 및/또는 임의로 반전시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Bayley Scales of Infant and Toddler Development, Third Edition, BSID-III]에 의해서 측정되는 바와 같이, 신경인지를 측정함으로써 임상 목표를 결정할 수 있다. 다른 적절한 측정치는 예를 들어, 문헌[Vineland Adaptive Behavior Scales, Second Edition (VABS-II)]에 의해서 측정되는 바와 같은 적응 행동 평가, 및 예를 들어, 문헌[Infant Toddler Quality of Life Questionnaire(상표명) (ITQOL)]에 의해서 측정되는 바와 같은 삶의 질 측정이다.
2차 종점은 바이오마커 및 임상 결과의 평가를 포함한다. 임의로 청각이 2차 종점으로서 평가될 수 있다. 소변을 총 GAG 함량, 뿐만 아니라 헤파란 설페이트에 대해서 평가한다. 혈청을 IDS 활성도, 항-IDS 항체, GAG, 및 헤파린 보조인자 II-트롬빈 복합체의 농도에 대해서 평가한다. CSF를 GAG, IDS 활성도, 항-IDS 항체, 및 헤파린 설페이트에 대해서 평가한다. CSF 및 혈청 중의 IDS 발현의 약동학에서와 같이 항-IDS 항체의 존재를 평가한다. 회백질 및 백질 및 CSF 뇌실의 체적 분석법을 또한 MRI에 의해서 수행한다.
실시예 2: II형 점액다당류증의 뮤린 모델에서의 연구 - 아데노-연관 바이러스 벡터의 CSF 내로의 전달은 II형 점액다당류증 마우스에서 중추신경계 질환을 약화시킨다
A. 뇌척수액 내로의 AAV9 전달은 CNS 질환을 보정한다
II형 점액다당류증(MPS II)은 골 및 관절 기형, 심장 및 호흡기 질환 및 발달 지연을 갖는 유아기에서 전형적으로 나타나는 X-연결된 리소좀 저장 장애이다. 결함 효소, 이두로네이트-2-설페이타제(IDS)의 전신 전달은 MPS II의 다수의 증상을 개선시키지만, 이 효소는 혈액-뇌 장벽을 통과하지 않기 때문에, 중추신경계(CNS) 질환의 진행을 예방하는 데는 현재 유효한 방법이 아니다. MPS II의 마우스 모델을 사용하여, CNS에서 연속적인 IDS 발현을 달성하는 수단으로서 IDS 유전자의 AAV 항원형 9 벡터-매개된 전달을 평가하였다. IDS 넉아웃 마우스에게 3종의 벡터 용량(저 - 3 x 108, 중 - 3 x 109 또는 고 - 3 x 1010 게놈 카피) 중 하나를 측뇌실 내로의 단일 주사로 제공하고, 벡터 생체분포 및 IDS 발현의 평가를 위해서 벡터 투여 3주 후에(군당 n = 7 내지 8마리 마우스) 또는 질환 진행에 대한 유전자 전달의 영향을 평가하기 위해서 벡터 투여 3개월 후에(군당 n = 7 내지 8마리 마우스) 희생시켰다. IDS 활성도는 뇌척수액에서 검출 가능하였는데, 저-용량 코호트에서는 야생형 수준의 15%에 도달하였고, 최고 용량에서는 정상의 268%에 도달하였다. 뇌 효소 활성도는 저-용량 코호트에서는 정상의 2.7%로부터 고-용량 코호트에서는 32%까지의 범위였다. 강글리오사이드 GM3에 대한 염색에 의한 뇌 저장 병변의 정량화는 용량-의존적인 보정을 나타내었는데, 각각 저-, 중-, 및 고-용량 코호트에서 35%, 46%, 및 86%였다. 처리된 마우스는 또한 신규 물체 탐색 시험에서 개선된 인지 기능을 나타내었다. 이들 발견은, 척추강내 AAV-매개된 유전자 전달이 CNS로의 일관된 효소 전달을 위한 플랫폼으로서 작용하고, MPS II를 갖는 환자에 대해서 이러한 중요한 충족되지 않은 요구를 해결한다는 것을 나타낸다.
B. AAV9.CB.hIDS의 약리학 및 신경행동학적 효과
IDS 유전자의 엑손 4 및 5를 네오마이신 내성 유전자로 대체함으로써 MPS II의 넉아웃 마우스 모델(IDS-넉아웃; IDSy/-)을 생성하였다(문헌[Garcia et al., 2007, J Inherit Metab Dis, 30:924-34] 참고). 모델은 어떠한 검출 가능한 효소 활성도도 나타내지 않고, MPS II 환자에서 발견되는 것과 유사한 조직학적 저장 병변을 발달시킨다. IDS-넉아웃 마우스는 골격 이상을 비롯한, MPS II의 임상 특징 중 다수를 나타낸다. 마우스의 신경행동학적 표현형은 광범위하게 평가되지 않았지만, 일부 연구는 제시된 이상을 가지며(Muenzer et al., 2001, Acta Paediatr Suppl, 91(439): 99-9), 따라서 MPS II에 대한 치료제로서 AAV9.CB.hIDS의 효과를 연구하기 위한 상응하는 모델이다. 사실, 이것은 이러한 집단에서 임상 시험을 지지하여 MPS II에서의 효소 대체 요법의 효과를 평가하는 데 사용된 동일한 넉아웃 마우스 모델이다. 이러한 MPS II 마우스 모델에서 수행된 하기 연구는 치료활성도 AAV9.CB.hIDS를 수립하였다.
C. 물질 및 방법
벡터. 인간 IDUA 및 IDS cDNA를 닭 베타 액틴 프로모터, CMV 인핸서, 인트론, 및 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 서열을 함유하는 발현 작제물 내에 클로닝하였다. 발현 작제물을 AAV2 반전 말단 반복부에 의해서 플랭킹하였다. 상기에 기술된 바와 같이(Lock et al. (2010). Hum Gene Ther 21: 1259-71) HEK 293 세포의 삼중 형질주입 및 아이오딕산올 정제에 의해서 이들 작제물로부터 AAV9 벡터를 생성하였다.
동물 절차. 펜실베니아 대학교의 실험 동물 운영 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Pennsylvania)에 의해서 모든 동물 프로토콜을 승인받았다. IDS 넉아웃 마우스는 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory)(스톡 번호: 024744)로부터 얻었고, 실험실내에서 사육하였다. 집락으로부터의 야생형 C57BL/6 수컷을 대조군으로서 제공하였다. 2내지 3개월령에서, 동물을 아이소플루란으로 마취시키고, 멸균 인산염 완충 염수 중에 희석된 5㎕ 벡터로 ICV로 주입하였다. 폴리에틸렌 튜빙에 연결된 32-게이지 니들을 사용한 후두골하 천자에 의해서 부검 시기에 CSF를 수집하였다. 최종 혈청 샘플을 심장 천자에 의해서 수집하였다. 동물을 케타민/자일라진 마취 하에서 전채혈에 의해서 안락사시켰다. 경추 파열법에 의해서 사망을 확인하였다. 뇌, 심장, 폐, 간 및 비장을 드라이아이스 상에서 수집하였다. 조직학 실험을 위해서, 뇌를 전방 절반부로 나누고, 이것을 LIMP2 면역조직화학을 위해서 고정시키고, 후방 절반부를 GM3 면역조직화학을 위해서 고정시켰다. 마우스의 2개의 코호트를 행동 실험을 위해서 사용하였다. 야생형 및 IDS KO 마우스의 초기 코호트를 일련의 절차로 시험하여 유전자 결실이 학습력 및 기억력에 영향을 주는지를 결정하였다. AAV9.CB.hIDS의 저, 중 또는 고 벡터 용량(각각 3 x 108, 3 x 109, 또는 3 x 1010게놈 카피(GC))으로 시험된 마우스의 제2 코호트를 사용하여 행동 결핍의 구조를 위한 전략으로서 IT 전달의 실행 가능성을 조사하였다.
행동 절차: 유전자형 및 처리군에 대해서 맹검된 작동자에 의해서 모든 행동 절차를 수행하였다.
오픈 필드 활성도: 오픈 필드에서의 자발적인 활성도를 포토빔 활성도 시스템(PAS)-오픈 필드(샌디에고 인스트루먼츠(San Diego Instruments))에서 측정하였다. 마우스를 단일 10분 시험을 위해서 시험장에 개별적으로 놓았다. 수평 및 수직 빔 브레이크를 수집하여 일반적인 운동 능력 및 양육 활성도를 평가하였다.
Y 미로: 표준 Y-자형상 미로(샌디에고 인스트루먼츠)를 사용하여 단기간 기억력을 평가하였다. 아암 입장의 순서 및 수를 8분 시험 동안 기록하였다. 이미 들어간 아암으로 즉각적으로 복귀하지 않고 미로의 3개의 암 모두로의 순차적인 입장으로서 자발적인 교대(SA)를 정의하였다. 총 아암 입장(AE)를 운동 활성도의 측정치로서 수집하였다. 백분율 자발적인 교대를 %SA= (SA/(AE-2)*100)로서 계산하였다.
공포 상황 조건화: 조건화 실험을 문헌[Abel et al. Cell. 1997 Mar 7;88(5):615-26]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 훈련일에, 마우스에게 300초 동안 특정 조건화 챔버(메드 어소시에이츠(Med Associates))를 탐색하게 하였다. 비-신호화, 1.5mA의 연속적인 발쇼크를 248 내지 250초 사이에 전달하였다. 챔버에서 추가적인 30초 후, 마우스를 그의 홈 케이지로 복귀시켰다. 24시간 후에, 훈련이 수행된 동일한 챔버에서 연속되는 5분 동안 공간적 맥락의 회상을 평가하였다. 프리징 행동(프리즈스캔(Freezescan), 클레버시스템즈(CleverSystems))을 점수매기는 데 사용되는 소프트웨어를 사용하여 기억력을 평가하였다. 훈련 세션의 2.5분 사전자극기(prestimulus epoch)에서의 백분율 프리징을 챔버에 재노출될 때의 백분율 프리징과 비교한다. 프리징의 증가는 교육이 수행되었음을 나타낸다.
신규 물체 인식: 실험 장치는 백색 마루 상의 회색 직사각형 시험장(60㎝ x 50㎝ x 26㎝) 및 2개의 독특한 물체로 이루어졌다: 3.8x3.8x15㎝ 금속 막대 및 3.2 ㎝ 직경 x 15㎝ PVC 파이프. 장치에 노출시키기 전에, 마우스를 5일 동안 1 내지 2분/일 처리하였다. 5일 습관화 단계 동안, 마우스를 5분/일 동안 빈 시험장을 탐색하게 하였다. 훈련 단계 동안, 마우스는 15분 동안 동일한 물체 2개를 탐색하여 친숙화를 확립하였다. 회상 단계에서 24시간 후에, 마우스를 하나의 친숙하지 않은 물체 및 신규 물체를 갖는 시험장으로 복귀시켰다. 마우스는 신규 물체를 우선적으로 탐색할 것이다. 새로움에 대한 감소된 선호는 익숙한 물체를 회상하는 것에 대한 실패를 시사하며, 따라서 학습력 결핍을 시사한다. 모든 세션을 기록하고, 물체를 탐색하는 데 소모한 시간을 오픈 소스 이미지 분석법 프로그램(Patel el al., Front Behav Neurosci. 2014 Oct 8;8:349)을 사용하여 점수매겼다.
효소 및 GAG 검정. GAG, Hex 및 IDUA 검정을 이미 기술된 바와 같이 수행하였다(Hinderer et al. (2015). Mol Ther 23: 1298-307). 10㎕ 샘플을 0.01M 납 아세테이트, pH 5.0를 갖는 0.1M 소듐 아세테이트 중에 용해된 20㎕의 1.25mM 4-메틸엄벨리페릴 α-L-이도피라노사이두론산 2-설페이트(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology))와 함께 인큐베이션시킴으로써 IDS 활성도를 측정하였다. 37℃에서 2시간 인큐베이션시킨 후에, 45㎕의 맥일바인 완충액(McIlvain's buffer)(0.4M 인산나트륨, 0.2M 시트르산나트륨, pH 4.5) 및 5㎕의 재조합 인간 이두로니다제(알두라자임(Aldurazyme), 0.58㎎/㎖, 젠자임(Genzyme))를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 혼합물을 글리신 완충액, pH 10.9 중에서 희석하고, 방출된 4-MU를 4-MU 무함유의 표준 희석물과 비교하여 형광에 의해서 정량하였다(여기 365nm, 방출 450nm).
조직학. 뇌를 전방 절반부로 나누고, 이것을 LIMP2 면역조직화학을 위해서 고정시키고, 후방 절반부를 GM3 면역조직화학을 위해서 고정시켰다. LIMP2 및 GM3 면역조직화학을 이미 기술된 바와 같이 수행하였다(Hinderer et al. (2015). Mol Ther 23: 1298-307). LIMP2 및 GM3에 대해서 양성으로 염색된 세포의 수를 맹검 검토자에 의해서 각각의 동물로부터의 4개의 뇌 단편에서 정량하였다.
벡터 생체분포. 벡터 생체분포 분석법을 위한 조직을 신속하게 해부하고, 드라이아이스 상에서 동결시켰다. 샘플을 분석법의 시기까지 -80℃에서 저장하였다. DNA를 QIAmp DNA 미니 키트를 사용하여 조직으로부터 단리하고, 벡터 게놈을 기술된 바와 같이 태크만 PCR에 의해서 정량하였다(Wang, et al. (2011). Hum. Gene Ther. 22: 1389-1401).
항-hIDS 항체를 위한 ELISA. 폴리스타이렌 ELISA 플레이트를 pH 5.8로 적정된 PBS 중의 재조합 인간 IDS(알앤디 시스템스(R&D Systems)) 5㎍/㎖로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척하고, 1시간 동안 중성 PBS 중의 2% 소 혈청 알부민 중에서 차단시켰다. 이어서, 플레이트를 PBS 중에 1:1000으로 희석된 혈청 샘플과 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 항체를 2% BSA를 갖는 PBS 중에 1:10,000으로 희석된 HRP 접합된 염소 항-마우스 항체(압캄(Abcam))로 검출하였다. 검정을 테트라메틸벤지딘 기질을 사용하여 현상시키고, 2N 황산을 사용하여 중단시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정한다. 1:10,000의 역가를 독단적으로 배정한 양성 혈청 샘플의 연속 희석에 의해서 생성된 표준 곡선으로부터 역가를 결정하였다.
통계학. 처리 마우스 및 미처리 마우스에서의 조직 GAG 함량, Hex 활성도, 및 뇌 저장 병변을 일측 ANOVA, 그 다음 두넷 다중 비교 시험을 사용하여 비교하였다. 오픈 필드 및 Y 미로 데이터를 스튜던트 t-시험으로 분석하였다. 이측 ANOVA 및 두넷 사후-hoc 분석법을 공포 조건화 데이터에 적용하여 시험 및 유전자형 효과를 평가하였다. 신규 물체 인식 시험의 경우, 신규 물체 참색 시간 대 익숙한 물체 탐색 시간을 각각의 군에 대해서 t-시험을 사용하여 비교하였고, 그 다음 다중 비교를 위해서 본페로니 보정하였다.
수컷 IDS-넉아웃 마우스의 4개의 연령-매칭된 군 및 야생형 한배새끼의 하나의 군(군당 8마리의 마우스(n=8))에게 2 내지 3개월령에서 하기 치료를 제공하였다:
Figure pct00041
군 1: 미처리
Figure pct00042
군 2: 뇌실내 AAV9.CB.hIDS 저 용량 3 x 108GC(1.875 X 109GC/g 뇌 질량)
Figure pct00043
군 3: 뇌실내 AAV9.CB.hIDS 중 용량 3 x 109GC(1.875 X 1010GC/g 뇌 질량)
Figure pct00044
군 4: 뇌실내 AAV9.CB.hIDS 고 용량 3 x 1010GC(1.875 X 1011GC/G 뇌 질량)
Figure pct00045
군 5: 미처리 야생형 한배새끼
D. 결과:
2개월령 내지 3개월령의 수컷 IDSy/- 마우스를 닭 베타 액틴 프로모터와 거대세포바이러스 인핸서로부터 인간 IDS를 발현하는 AAV9 벡터(AAV9.CB.hIDS)의 뇌실내(ICV) 주사로 처리하였다. 초기 코호트에서, 마우스를 3종의 벡터 용량[3 x 108, 3 x 109, 또는 3 x 1010게놈 카피 (GC)] 중 하나로 처리하고, 벡터 생체분포 및 IDS 발현의 평가를 위해서 벡터 투여 3주 후에 희생시켰다. 미처리 IDSy/- 마우스 및 야생형 수컷 한배새끼를 대조군으로서 제공하였다. 조직을 생체분포 분석법을 위해서 수거하였다. 고-용량군에서의 벡터 생체분포의 분석법은, 숙주 이배체 게놈당 평균 하나의 벡터 게놈을 사용하여, 효율적인 뇌 표적화를 나타내었다(도 3). CSF 내로의 AAV 전달의 이전 연구와 일관되게, 숙주 이배체 게놈당 하나를 초과하는 벡터 게놈을 사용하여, 말초로의 벡터 탈출 및 효율적인 간 표적화가 존재하였다(도 3). 뇌 조직, CSF, 및 혈청 모두는 IDS 활성도에서 용량-의존적인 증가를 나타내었는데, 이는 고-용량군에서 야생형 수준에 근접하거나 이를 초과하였다(도 2A 내지 2C). 인간 IDS에 대한 항체는 중- 및 고-용량 코호트에서 몇몇 동물의 혈청에서 검출되었지만, 이는 순환 효소 활성도에 유의하게 영향을 주는 것 같지 않았다(도 8).
IDS 유전자의 IT AAV9-매개된 전달의 치료 가능성을 평가하기 위해서, IDSy/- 마우스의 추가적인 코호트를 동등한 벡터 용량으로 처리하고, 이어서, 추후 시점에 평가하여 질환 진행에 대한 유전자 전달의 영향을 평가하였다. 벡터 투여 2개월 후 마우스를 행동 및 신경인지 시험에 적용하였다. 처리 3개월 후 동물을 희생시키고, 조직을 질환 활성도의 조직학적 평가 및 생화학적 평가를 위해서 수거하였다.
고 수준의 혈청 효소 활성도와 일관되게, GAG 저장은 간에서 감소되었고, 심장에서 GAG 저장의 정상화를 향한 유의하지 않은 경향성이 존재하였다(도 4A 및 4B). 또한, GAG 저장의 설정에서 상향조절되는 리소좀 효소 헥소스아미니다제(Hex)의 활성도는 두 조직 모두에서 정상화되었다(도 4C 및 4D). 이들 데이터는, AAV9.CB.hIDS의 척추강내 투여 후 전신 치료 활성도에 대한 가능성을 나타낸다.
미처리 MPS II 마우스의 뇌는, 리소좀 막 단백질 LIMP2의 축적, 뿐만 아니라 GM3을 비롯한 강글리오사이드의 2차 저장을 비롯하여, 뉴런에서 리소좀 저장의 명확한 조직학적 증거를 나타내었다(도 5L). 처리된 마우스는, LIMP2 및 GM3 염색 둘 모두에 의해서 명백한 뉴런 저장 병변에서의 용량-의존적인 감소를 나타내었다(도 5A 내지 5L). 이러한 데이터를 기초로, 1.875 X 109GC/g의 저용량이 마우스에서 최소 유효량(MED)인 것으로 예측되었는데, 그 이유는 이것이 마우스가 GM3 및 LIMP2 저장 병변 둘 모두에서 유의한(대략 50%) 감소를 나타낸 최저 용량이었기 때문이다.
마우스가 4 내지 5개월령에 도달한 경우 벡터 투여 2개월 후 행동 시험을 수행하였다. 포괄적인 다수의 시험을 수행하여 일반적인 행동뿐만 아니라 단기간 및 장기간 기억력을 평가하였다. IDSy/- 마우스는 오픈 필드 시험장에서 정상 탐색 활성도를 나타내었다(도 9A 내지 9C). Y-미로에서의 자발적인 교대(도 9D)를 사용하여 단기간 작업 기억력을 평가하였다. IDSy/- 마우스는 유사한 수의 아암 입장 및 야생형 한배새끼에 대해서 동등한 자발적인 교대를 가졌는데, 이는 무손상 단기간 기억력을 입증하였다. 전통적인 공포 상황 조건화(FC) 및 신규 물체 인식(NOR)을 사용하여 장기간 기억력을 평가하였다. FC에서, 특이적 맥락으로의 혐오 자극의 연합은 그 맥락에 재노출 시에 프리징 행동을 떠올려 준다. 모든 마우스는 시험의 회상 단계 동안 백분율 시간 프리징의 증가를 나타내었는데, 이는 학습이 일어났다는 것을 입증하였지만, IDSy/- 마우스는 야생형 한배새끼에 비해서 감소된 프리징을 나타내었다(도 6A). 처리된 동물에서, 공포 상황 조건화에서 어떠한 명확한 개선도 존재하지 않았지만, 처리 효과는 정상 마우스와 미처리 IDSy/- 마우스 간의 작은 차이로 인해서 평가하기 어려웠다(도 6B). NOR에서, 마우스에게 유사한 물체 쌍을 탐색하게 하였다. 훈련 24시간 후에, 하나의 현재-익숙한 물체를 신규 물체로 대체한다. 마우스는 신규 물체를 탐색하는데 타고난 성향을 가지며; 이렇게 하지 않으면 익숙한 물체의 인식의 결여를 나타내고, 기억력 결핍을 드러낸다. 야생형 마우스는, 신규 물체에 대한 선호를 나타내었지만, IDSy/- 마우스는 선호를 나타내지 않았다. 현저하게, 척추강내 AAV9 유전자 요법은 IDSy/- 마우스에서 관찰된 장기간 NOR 결핍을 구조하였다(도 6C). 물체 식별은 모든 처리된 IDSy/- 마우스에서 개선된 것으로 보였으며, 모든 군은 익숙한 것에 비해서 신규 물체를 탐색하는 데 더 많은 백분율의 시간에 대한 경향성을 나타내었다. 신규 물체에 대한 선호는 중-용량 코호트에서만 통계학적으로 유의하였지만, 그 연구는 투여군들 중에서 행동 결핍의 상대적인 구조도를 비교하기 위해서는 충분하지 않았다(도 6A 내지 6C).
뮤린 질환 모델에서 IT AAV 전달을 평가하는 것의 하나의 단점은, 매우 작은 마우스 CNS - 단지 0.4g의 뇌 질량 및 40㎕의 CSF 체적을 가짐-가 3,500배 더 큰 인간 뇌에서의 벡터 및 분비된 효소의 확산을 정확하게 모델링할 수 없다는 것이다. 관련된 리소좀 저장 질환 뮤코폴리사카라이디오시스 타입 I(MPSI)의 이전 연구에서, 본 발명자들은 이러한 문제를 다루기 위해서 자연 발생하는 큰 동물 질환 모델을 사용하였다[Hinderer et al, Mol Therapy: the Journal of the Am Soc Gen Therapy, 2014: 22: 2018-2027; Hinderer et al, Mol Therapy: the Journal of the Am Soc Gen Therapy, 2015: 23: 1298-1307]. 각각 30g 및 72g의 평균 뇌 질량을 갖기 때문에, MPS I 고양이 및 개는 인간 뇌에서의 광범위한 벡터 및 효소 전달을 달성하는 도전을 다루기 위한 훨씬 더 양호한 현실적인 모델을 제공하였다. 이러한 모델에서 수행된 연구는 MPS I을 위한 IT AAV9 전달의 효능의 중요한 증거를 제공하였다[Hinderer et al, Mol Therapy: the Journal of the Am Soc Gen Therapy, 2014: 22: 2018-2027; Hinderer et al, Mol Therapy: the Journal of the Am Soc Gen Therapy, 2015: 23: 1298-1307]. MPS II에서 이러한 동일한 접근법을 사용하여 유사한 효능이 가능한지의 여부를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 MPS I 마우스에서 병행 용량-범위 연구를 수행하여 MPS II에서 효소 발현 및 교차-보정의 상대적인 효율성을 조사하였다. IDS 대신에 α-L-이두로니다제(IDUA) 이식유전자를 사용한 것을 제외하고는, MPS I 마우스를 IDSy/- 마우스에 대해서 사용된 것과 동일한 벡터로 처리하였다. MPS II 연구와 마찬가지로, MPS I 마우스를 2 내지 3개월령에서 3 x 108, 3 x 109, 또는 3 x 1010GC의 용량(군당 n= 8)으로 처리하고, 뇌 효소 활성도의 측정을 위해서 처리 21일 후에 도는 조직학적 분석법을 위해서 처리 3개월 후에 희생시켰다. IDSy/- 마우스에서 관찰된 것과 유사한 뇌 효소 발현에서의 용량 반응이 존재하였지만, 절대적 효소 활성도 및 야생형 발현 수준에 대한 상대적인 수준 둘 모두에서 IDUA의 발현은 IDS와 비교할 때 다소 더 효율적인 것으로 보였다(도 7A). 뇌 저장 병변의 보정은 두 질환 모델 사이에서 유사하였지만, 치료는 최저 벡터 용량에서 MPS I 마우스에서 약간 보다 유효한 것으로 나타났다(도 7A 및 7B). 함께 이들 결과는, MPS II에 대한 IT AAV9-매개된 유전자 전달이 거의 MPS I에서 관찰된 것만큼 유효한 뇌 저장 병변의 보정을 생성하였고, 이러한 접근법이 마우스로부터 대규모화되는 경우에도 유효하게 유지되는 것을 시사한다. 그러나, 뇌에서 덜 효율적인 효소 발현을 극복하기 위해서 MPS I에 비해서 약간 더 높은 벡터 용량이 MPS II에서 필수적일 수 있다.
본 연구에서, MPS II 마우스에서 인간 IDS 유전자를 보유하는 AAV9 벡터의 IT 전달은 CNS에서 발현의 치료 수준 및 뇌 저장 병변의 해결을 초래하였다. 기능성 개선은, 미치료 대조군에 비해서 치료된 마우스에서 더 양호한 신규 물체 식별에 의해서 나타났다. 신경인지 결핍은 IDSy/- 마우스에서 이전에 널리 특징규명되어 있지 않았다. 이러한 발견은, IDSy/- 마우스가 야생형 한배새끼에 비해서 오픈 필드뿐만 아니라 Y-미로에서의 유사한 아암 입장에서 정상적인 탐색 활성도를 갖는다는 것을 입증한다. 이러한 운동력 평가는 정상적인 탐색에 필요한 다른 유형의 행동을 고려하는 데 중요하다. IDSy/- 마우스는 대조군과 비교할 때 Y-미로에서 유사한 자발적인 교대에 의해서 입증된 온전한 단기간 작업 기억력을 갖는 것을 발견되었다. 이에 반해서, 히구치(Higuchi) 등[Mol Genet and Metabolism, 2012: 107: 122-128]은, 32주령 IDSy/- 마우스에서 감소된 자발적인 교대 및 증가된 아암 입장을 보고하였다. 다른 Y-미로 결과는 시험의 상이한 연령으로 인한 것일 수 있고, MPS II의 진행형 본성을 강조한다. 본 발명자들은 장기간 기억력의 두 형태에 대한 IDS 결함의 영향을 평가하였다. 경증 결핍을 IDSy/- 마우스에서 공포 상황 조건화에서 식별하였다. IDSy/- 마우스는 그들에게 혐오 자극이 제공된 맥락을 회상할 수 있지만, 그들은 야생형 한배새끼와 비교할 때 상당히 감소된 프리징 반응을 나타내었다. AAV9의 IT 전달이 제공된 IDSy/- 마우스는 주사되지 않은 마우스와 유사한 프리징 반응을 나타내었다. 따라서, 회복이 검출되지 않았다. 장기간 기억력 결핍은 신규 물체 인식에서도 발견되었다. NOR에서, IDSy/- 마우스는 익숙한 물체에 비해서 신규 물체에 대한 선호를 나타내지 않았다. 벡터 처리된 마우스는 미처리 IDSy/- 마우스에서 인지된 NOR 결핍의 회복을 나타내었다. 물체 식별은 중-용량 코호트에서만 통계학적으로 유의하였지만, 군당 8마리의 동물을 사용하여, 본 연구는 행동 종점의 용량 반응을 평가하기에는 충분하지 않았다. 장기간 기억력의 두 유형의 회복에 별개로 영향을 주는 AAV9의 IT 전달의 능력은 각각의 과제에 필요한 신경 기질로 인한 것일 수 있다. 공포 상황 조건화는 페리엔테오히날(perienteorhinal) 피질을 필요로 하는 NOR과 상반되는 바와 같은 해마-의존적 과제이다[Oliveira, et al, Post-training reversible inactivation of the hippocampus enhances novel object recognition memory. Learning & memory (Cold Spring Harbor, NY) 2010;17:155-160; Abel, et al, Cell 1997;88:615-626].
MPS I의 대동물 모델에서 이미 나타낸 바와 같이, MPS II 및 MPS I의 마우스 모델에서 IT AAV9 전달의 효율의 비교는, 효소 발현 및 조직 보정이 두 질환 간에 유사하였음을 나타내었는데, 이는 MPS II를 위한 IT AAV 전달이 훨씬 더 큰 뇌 크기 및 CSF 체적의 맥락에서 광범위한 질환 보정을 산출하기에 충분히 효율적이라는 증거를 제공한다[Hinderer et al, Mol Therapy: the Journal of the Am Soc Gen Therapy, 2014: 22: 2018-2027; Hinderer et al, Mol Therapy: the Journal of the Am Soc Gen Therapy, 2015: 23: 1298-1307]. 흥미롭게도, 결함 효소의 발현은 MPS I과 비교할 때 MPS II에서 다소 덜 효율적이었다. 발현 작제물에서의 제어 요소가 동일하였음에도 불구하고, 이것은 단순히 이들 특정 벡터의 발현 효율의 산물일 수 있다. 일부 연구는, 설페이타제, 예컨대, IDS의 발현이, IDS의 번역후 변형에 필요한 설페이타제 변형 인자, SUMF1의 유용성에 의해서 제한될 수 있다고 시사하였다(Fraldi, et al, Biochemical J, 2007: 403: 305-312). 그러나, IDS 및 SUMF1의 공동-발현을 평가하는 파일럿 실험은 보다 활성인 IDS 발현을 입증하지 않았다(데이터 나타내지 않음). 그럼에도 불구하고, 저장 병변의 보정은 거의 MPS I 마우스에서만큼 MPS II 마우스에서 효율적이었는데, 이는, MPS II 환자 경우에서 약간 더 높은 벡터 용량이 최적의 결과에 필수적일 수 있음에도 불구하고, MPS I 환자 및 MPS II 환자 둘 모두에 대해서 유전자 전달이 유사하게 유효하다는 것을 나타낸다.
CNS 유전자 전달에 더하여, 처리된 MPS II 마우스에서 상당한 간 형질도입 및 말초 효소 발현이 존재하였는데, 이는 MPS II에서 IT AAV9 전달의 가능한 전신 이득을 나타낸다. 이는 다양한 다른 종에서의 IT AAV 전달의 연구와 일치한다[Passini et al, Hu Gene Therapy, 2014; 25: 619-630; Hinderer et al, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development 2014; 1; ; Hinderer et al, Molecular therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy 2014;22:2018-2027; Hinderer, et al, Molecular therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy 2015;23:1298-1307; Gurda, et al, Molecular therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy 2015; Higuchi et al, 상기에 인용됨; Haurigot, et al, J Clin Invest, 2013: 123: 3254-3271; Gray et al, Gene Therapy, 2013: 20: 450-459]. 특히, IT AAV 벡터 전달 후 간 형질도입은 종들 사이에서 실질적으로 상이하여, 인간이 유의한 말초 발현을 나타낼지의 여부는 아직 명확하지 않다.
본 연구는 IT AAV9 전달이 뇌로의 유효한 IDS 유전자 전달을 달성하고, MPS II의 CNS 양상을 해결한다는 것을 입증하는데, 이는 이러한 접근법이 임상으로 발달되는 것을 지지한다.
이러한 데이터는 AAV9.CB.hIDS가 MPS II 마우스에서 신경인지 결핍을 개선시킬 수 있다는 예비 증거를 제공한다.
실시예 3: 비-인간 영장류 연구
비-인간 영장류(NHP)에서의 연구를 수행하여 성인 수컷 레서스 마카크에서 AAV9.CB.hIDS의 안전성 및 효과를 평가한다. 본 연구의 목적은 척추강내(IT) AAV9.CB.hIDS의 국지, 급성, 및 만성 독성을 평가하고, 벡터의 생체분포를 한정하는 것이다. 총 21마리의 수컷 마카크를 AAV9.CB.hIDS(5.6 x 1011 또는 1.875 x 1011GC/g 뇌 질량)의 두 용량 중 하나로 AAV9.CB.hIDS의 IT 주사로 또는 비히클 대조군 희석제로 처리하였다. 저용량은 MPS II 마우스에서의 MED(MED 1.875 x 109GC/g)보다 대략 100-배 더 높고, MPS II 마우스에서 통계학적으로 유의한 조직학적 개선 및 인지 기능을 반영한다고 생각되는 신경행동 변화를 생성하는 최저 용량에 상응한다. 더 높은 용량(대략 300X MED)은 벡터가 제형화될 수 있고, CSF에 안전하게 투여될 수 있는 주사 체적(<10% CSF 체적)을 유지하기 위한 요건에 의해서 제한되는 최대 농도이다. 주사 절차 동안, 동물을 일반적인 마취 하에 유지시켰다. 척추 니들을 후두골하 공간에 배치하고; 배치를 형광투시법에 의해서 확인하고, 용량을 총 체적 1㎖로 투여한다. 혈청 및 CSF를 주사 0일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 30일 후에 그리고 그 후 매달 임상 병리학 평가를 위해서 수집한다. 주사 14일, 90일, 및 180일 후에, 각각의 용량군(시간 지점 당 총 6마리)으로부터의 3마리의 수컷 마카크를 병리학 및 생체분포를 위해서 희생시킨다. 비히클 처리된 동물을 대조군으로서 제공한다. 완전 조직병리학을 모든 동물로부터의 조직 상에서 수행하고, 벡터 생체분포의 분석법을 고-용량 코호트에 대해서 수행한다. DNA 추출 및 정량적 PCR에 의한 벡터 게놈의 검출을 아미 기술된 바와 같이 수행한다(문헌[Chen et al, 2013, Hum Gene Ther Clin Dev, 24(4): 154-160] 참고). 이러한 검정은 DNA ㎍당 20개 초과의 벡터 게놈 카피 민감성을 갖고, 스파이크 대조군을 포함시켜 개별 샘플에서 반응 효율을 입증한다. 생체분포, 생화학 및 면역원성 데이터를 14일, 3개월 및 6개월에 수집한다.
실시예 4: rAAV9.CB7.hIDS 벡터의 제조
(i) hIDS 벡터 게놈 플라스미드, (ii) AAV rep2 및 cap 9 야생형 유전자를 함유하는 pAAV29라 지칭되는 AAV 헬퍼 플라스미드 및 (iii) pAdΔF6(Kan)이라 지칭되는 헬퍼 아데노바이러스 플라스미드로의 인간 HEK293 MCB 세포의 삼중 플라스미드 형질주입에 의해서 AAV9.CB7.hIDS를 생성한다.
플라스미드 pAAV.CB7.CI.hIDS.RGB의 클로닝은 상기 실시예 1에 기술되어 있다. 이러한 플라스미드로부터 유래된 벡터 게놈은 hIDS 발현 카세트를 플랭킹한 AAV2 유래된 ITR을 갖는 단일-가닥 DNA 게놈이다. 이식유전자 카세트로부터의 발현은 거대세포바이러스(CMV) 극 초기 인핸서(C4)와 닭 베타 액틴 프로모터 간의 혼성체인, CB7 프로모터에 의해서 유래된 반면, 이러한 프로모터로부터의 전사는 닭 베타 액틴 인트론(CI)의 존재에 의해서 향상된다. 발현 카세트를 위한 폴리A 신호는 토끼 베타-글로빈(RBG) 폴리A이다. hIDS 서열[서열번호 8의 nt 1177 내지 nt 2829, 및 서열번호 11의 nt 1937 내지 nt 3589]을 코돈-최적화하고, 합성함으로서 플라스미드를 작제하고, 이어서, 생성된 작제물을 CB7, CI 및 RBG 발현 요소를 함유하는 AAV2 ITR-플랭킹된 발현 카세트인 플라스미드 pENN.AAV.CB7.CI.RBG(p1044) 내에 클로닝하여 pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG를 제공하였다.
시스 플라스미드 pAAV.CB7CIhIDS.RGB.KanR의 클로닝: PacI 제한 효소를 사용하여 이러한 플라스미드로부터 벡터 게놈을 절제하고, 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 pKSS-기반 플라스미드 골격(p2017) 내에 클로닝하였다. 최종 벡터 게놈 플라스미드는 pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG.KanR이다.
AAV2/9 헬퍼 플라스미드 pAAV29KanRGXRep2: AAV2/9 헬퍼 플라스미드 pAAV29KanRGXRep2는 AAV9로부터 4 야생형 AAV2 rep 단백질 및 3 야생형 AAV VP 캡시드 단백질을 암호화한다. 키메라 패키징 작제물을 생성하기 위해서, 먼저 야생형 AAV2 rep 및 cap 유전자를 함유하는, 플라스미드 p5E18로부터 AAV2 cap 유전자를 제거하고, 간 DNA로부터 증폭된 AAV9 cap 유전자의 PCR 단편으로 대체하였다. 생성된 플라스미드에게 식별명 pAAV2-9(p0008)를 제공하였다. rep 발현을 정상적으로 유도하는 AAV p5 프로모터가 rep의 5' 단부로부터 cap의 3' 단부까지 이 작제물로 이동됨을 주목하기 바란다. 이러한 배열은 프로모터와 rep 유전자(즉 플라스미드 골격) 사이에 스페이서를 도입하고, rep의 발현을 하향조절하고, 벡터 생산을 지지하는 능력을 증가시키기 위해서 제공된다. p5E18 내의 플라스미드 골격은 pBluescript KS로부터 유래된다. AAV2/9 헬퍼 플라스미드 pAAV29KanRGXRep2는 4 야생형 AAV2 rep 단백질, AAV9로부터 3 야생형 AAV VP 캡시드 단백질, 및 카나마이신 내성을 암호화한다.
pAdDeltaF6(Kan) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드는 크기가 15,770bp이다. 플라스미드는 AAV 복제에 중요한 아데노바이러스 게놈의 영역, 즉 E2A, E4, 및 VA RNA(아데노바이러스 E1 기능부는 293개 세포에 의해서 제공됨)를 함유하지만, 다른 아데노바이러스 복제 또는 구조적 유전자를 함유하지 않는다. 플라스미드는 복제에 중요한 시스 요소, 예컨대, 아데노바이러스 반전 말단 반복부를 함유하지 않고, 따라서 어떠한 감염성 아데노바이러스도 생성되지 않는다고 예상된다. 그것은 Ad5(pBHG10, pBR322 기반 플라스미드)의 E1, E3 결실된 분자 클론으로부터 유래되엇다. 결실을 Ad5 DNA 내에 도입하여 불필요한 아데노바이러스 유전자의 발현을 제거하고, 32Kb 내지 12kb의 아데노바이러스 DNA의 양을 제거하였다. 마지막으로, 암피실린 내성 유전자를 카나마이신 내성 유전자에 의해서 교체하여 pAdΔF6(Kan)을 제공하였다. AAV 벡터 생산에 필요한 E2, E4 및 VAI 아데노바이러스 유전자의 기능성 요소가 이 플라스미드에서 유지된다. 아데노바이러스 E1 본질적인 유전자 기능은 EK293 세포에 의해서 공급된다. DNA 플라스미드 서열결정을 퀴아젠 제노믹 서비스즈에 의해서 수행하고, 참조 서열 pAdDeltaF6(Kan) p1707FH-Q의 하기 중요한 기능성 요소와 100% 상동성을 나타내었다: E4 ORF6 3692-2808bp; E2A DNA 결합 단백질 11784-10194bp; VA RNA 영역 12426 내지 13378bp.
제조 공정을 요약한 흐름도가 도 10A 및 10B에 제공된다.
세포 시딩: 자격이 있는 인간 배아 신장 293 세포주를 생산 공정을 위해서 사용할 것이다. 코닝(Corning) T-플라스크 및 CS-10을 사용하여 세포를 5 x 109 내지 5 x 1010 세포까지 확장시킬 것인데, 이것은 BDS 로트당 벡터 생산을 위해서 50 HS-36까지 시딩하기에 충분한 세포 덩어리가 생성되도록 할 것이다. 세포를 10% 감마 조사된, US-공급, 우태아 혈청(FBS)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM)로 구성된 배지에서 배양할 것이다. 세포는 앵커리지 의존적이고, 세포 해리는 동물 산물-무함유 세포 해리제인 TrypLE Select를 사용하여 달성될 것이다. 세포 시딩은 멸균, 단회-사용 일회용 생물공정 백 및 튜빙 시험기를 사용하여 달성한다. 세포를 37℃(± 2℃), 5%(± 0.5%) CO2 분위기 중에서 유지시킨다. 세포 배양 배지를 새로운 무혈청 DMEM 배지로 대체하고, 최적화된 PEI-기반 형질주입 방법을 사용하여 3종의 생산 플라스미드로 형질주입한다. 생산 공정에 사용된 모든 플라스미드를 cGMP 제조의 가장 두드러진 특징; 추적성, 문서 제어 및 물질 분리를 활용하는 CMO 품질 시스템 및 인프라스트럭쳐의 맥락에서 생산한다.
충분한 DNA 플라스미드 형질주입 복합체를 BSC에서 제조하여 50 HS-36(BDS 배취당)까지 형질주입한다. 먼저 7.5㎎의 pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG.KanR 벡터 게놈 플라스미드, 150㎎의 pAdDeltaF6(Kan), 75㎎의 pAAV29KanRGXRep2 AAV 헬퍼 플라스미드 및 GMP 등급 PEI(PEIPro, 폴리플러스 트랜스펙션 에스에이(PolyPlus Transfection SA))를 함유하는 DNA/PEI 혼합물을 제조한다. 이러한 플라스미드 비는 소규모 최적화 연구에서 AAV 생산에 최적인 것으로 결정되었다. 잘 혼합한 후, 용액을 실온에서 25분 동안 정치시키고, 이어서 혈청-무함유 배지를 첨가하여 반응을 켄칭하고, 이어서 HS-36에 첨가한다. 형질주입 혼합물을 HS-36의 모든 36개층 사이에서 평형화시키고, 세포를 37℃(±2℃)에서 5%(± 0.5%) CO2 분위기에서 5일 동안 인큐베이션시킨다.
세포 배지 수거: 형질주입된 세포 및 배지를 일회용 생물공정 백을 사용하여 유닛으로부터 배지를 무균방식으로 배출함으로써 각각의 HS-36으로부터 수거한다. 배지의 수거 후에, 약 80리터의 체적에 MgCl2를 2mM의 최종 농도로 공급하고(벤조나제에 대한 보조-인자), 벤조나제 뉴클레아제(Cat#: 1.016797.0001, 머크 그룹(Merck Group))를 25단위/㎖의 최종 농도로 첨가한다. 산물(일회용 생물공정 백 내에서)을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이터 내에서 인큐베이션시켜 형질주입 절차의 결과로서 수거물 내에 존재하는 잔류하는 세포 및 플라스미드 DNA의 효소 소화에 충분한 시간을 제공한다. 이러한 단계는 최종 벡터 내에 잔류하는 DNA의 양을 최소화하기 위해서 수행된다. 인큐베이션 시간 후에, NaCl을 500mM의 최종 농도로 첨가하여 여과 동안 그리고 하류 접선 유동 여과 동안 산물의 회수를 돕는다.
정화: 세포 및 세포 잔해물을 연동 펌프에 의해서 구동되는 백 세트 및 멸균 폐쇄 튜빙으로서 직렬로 연결된 뎁쓰 필터 캡슐(1.2㎛/0.22um)을 사용하여 산물로부터 제거한다. 정화는 하류 필터 및 크로마토그래피 칼럼이 파울링으로부터 보호되는 것을 보장하고, 생균수(bioburden) 감소 여과는 필터 트레인의 마지막에, 상류 생산 공정 동안 잠재적으로 도입된 임의의 생균수가 하류 정제 전에 제거되는 것을 보장한다. 수거 물질을 사토리우스 사토가드(Sartorius Sartoguard) PES 캡슐 필터 (1.2/0.22㎛)(사토리우스 스테딤 바이오테크 인크(Sartorius Stedim Biotech Inc.))를 통과시킨다.
대규모 접선 유동 여과: 종래의 멸균 폐쇄 생물가공 튜빙, 백 및 막 세트를 사용하여 접선 유동 여과(TFF)에 의해서 정화된 산물의 체적 감소(10-배)를 달성한다. TFF의 원리는 용액을 적합한 공극율(100kDa)의 막에 평행한 압력 하에서 용액을 유동시키는 것이다. 압력차는 막 기공보다 더 큰 분자를 보유하면서 더 작은 크기의 분자가 막을 통해서 그리고 폐 스트림으로 효과적으로 이동하게 한다. 용액을 재순환시킴으로써, 평행한 유동은 막 표면을 스위핑하여 막 기공 파울링을 예방한다. 적절한 막 기공 크기 및 표면적을 선택함으로써, 목적하는 분자를 보유 및 농축시키면서, 액체 샘플은 체적이 급속하게 감소될 수 있다. TFF 응용에서의 투석여과는 새로운 완충액을, 액체가 막을 통해서 폐 스트림으로 통과하는 것과 동일한 속도로 재순환 샘플에 새로운 완충액을 첨가하는 것을 포함한다. 투석여과의 체적의 증가로 인해서, 증가된 양의 작은 분자는 재순환 샘플로부터 제거된다. 이것은 정화된 산물의 가장 온화한 정제를 초래하지만, 또한 후속 친화도 칼럼 크로마토그래피 단계와 사용성인 완충액 교환을 달성한다. 따라서, 본 발명자들은 농축을 위해서 100kDa, PES 막을 사용하고, 이어서 이것을 20mM 트리스 pH 7.5 및 400mM NaCl로 구성된 완충액 4배 체적으로 투석여과한다. 투석여과된 산물을 밤새 4℃에서 저장하고, 이어서 1.2㎛/0.22um 뎁쓰 필터 캡슐로 추가로 정화하여 임의의 침전된 물질을 제거한다.
친화도 크로마토그래피: 투석여과된 산물을 AAV2/9 항원형을 효율적으로 캡처하는 캡처 셀렉트(Capture Select)(상표명) 포러스- AAV2/9 친화도 수지(라이프 테크놀로지스)에 적용한다. 이러한 이온 조건 하에서, 상당한 백분율의 잔류하는 세포 DNA 및 단백질이 칼럼을 통해서 유동하면서, AAV 입자가 효율적으로 포획된다. 적용 이후에, 칼럼을 세척하여 추가적인 공급물 불순물을 제거하고, 그 다음 1/10 체적의 중화 완충액(비스 트리스 프로판, 200mM, pH 10.2) 중에서의 수집에 의해서 즉시 중화된 낮은 pH 단계 용리(400mM NaCl, 20mM 시트르산나트륨; pH 2.5)를 수행한다.
음이온 교환 크로마토그래피: 중공 AAV 입자를 비롯한 공정내 불순물의 추가 감소를 달성하기 위해서, 포로스(Poros)-AAV2/9 용리 풀을 50-배(20mM 비스 트리스 프로판, 0.001% 플루로닉 F68; pH 10.2)로 희석시켜 이온 강도를 감소시켜 CIMultus Q 모노리쓰 매트릭스(바어 세퍼레이션즈(BIA Separations)에 대한 결합을 가능하게 한다. 저-염 세척 이후에, 벡터 산물을 60 CV NaCl 선형 염 구배(10 내지 180mM NaCl)를 사용하여 용리시킨다. 이러한 얕은 염 구배는 벡터 게놈을 함유하는 입자(전입자)로부터 벡터 게놈이 없는 캡시드 입자(중공 입자)를 효과적으로 분리하고, 전 캡시드가 풍부한 제제를 초래한다. 1/100 체적의 0.1% 플루로닉 F68 및 1/27 체적의 비스 트리스 pH 6.3을 함유하는 튜브에 분획을 수집하여 각각 튜브 및 고 pH에 대한 노출의 길이에 대한 비-특이적 결합을 최소화한다. 적절한 피크 분획을 수집하고, 피크 면적을 평가하고, 대략적인 벡터 수율의 결정을 위해서 이전 데이터와 비교한다.
BDS를 산출하기 위한 최종 제형 및 멸균 여과: TFF을 사용하여 100kDa 막을 갖는 풀링된 AEX 분획 상에 최종 제형을 달성한다. 이것은 4배 체적의 제형 완충액(엘리엇츠 B 용액, 0.001% 플루로닉 F68)으로의 투석여과에 의해서 달성되고, 이것을 농축시켜 BDS를 산출하고, 이에 의해서 5 x 1013GC/㎖ 이상의 역가를 달성하기 위한 농도 인자를 예측하기 위해서 음이온 교환 크로마토그래피로부터의 피크 면적을 이전 데이터와 비교한다. 샘플을 BDS 시험을 위해서 제거한다(하기 섹션에 기술됨). 여과된 정제된 벌크를 멸균 폴리프로필렌 튜브에 저장하고, 최종 충전을 위한 방출 시까지 격리 위치에서 -60℃이하에서 동결시킨다. 예비 안정성 연구는, DP가 본 발명자들의 제안된 제형 완충액 중에서 동결 및 해동 이후에 활성도를 잃어버리지 않는다는 것을 나타낸다. 추가 연구를 수행하여 -80℃에서의 장기간 저장 이후에 안정성을 평가한다.
최종 충전: 동결된 BDS를 해동시키고, 풀링시키고, 최종 제형 완충액을 사용하여 표적 역가로 희석시키고, 마지막으로 0.22um 필터(밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)를 통해서 여과하고, 웨스트 파마슈티컬(West Pharmaceutical)의 "레디-투-유즈(ready-to-Use)"(사전-멸균된) 2㎖ 유리 바이알 및 13㎜ 마개에 충전시키고, 바이알당 0.6㎖ 이상 내지 2.0㎖ 이하의 충전 체적으로 밀봉시킨다. 개별적으로 표지된 바이알을 하기 본 명세서에 따라서 표지한다. 표지된 바이알을 -60℃ 이하에서 저장한다.
벡터(약물 산물)를 단일 고정 농도로 바이알에 담고, 유일한 변수는 바이알당 체적이다. 더 낮은 용량 농도를 달성하기 위해서, 약물 산물을 엘리엇츠 B 용액, 0.001% 플루로닉 F68로 희석시킨다. 고용량 벡터는 희석하지 않고 직접 사용되지만, 저 벡터는 투여 시기에 약사에 의해서 수행되는 제형 완충액 중의 1:5 희석이 요구된다.
실시예 5: 벡터의 시험
항원형 동일성, 중공 입자 함량 및 이식유전자 산물 동일성을 비롯한 특징규명 검정을 수행한다. 검정의 설명을 하기에 나타낸다.
A. 벡터 게놈 동일성: DNA 서열결정
바이러스 벡터 게놈 DNA를 단리하고, 서열을 프라이머 워킹을 사용하여 2-배 서열결정 커버리지에 의해서 결정한다. 서열 정렬을 수행하고, 예측된 서열과 비교한다.
B. 벡터 캡시드 동일성: VP3의 AAV 캡시드 질량 분광분석법
벡터의 AAV2/9 항원형의 확인은 질량 분광분석법(MS)에 의한 VP3 캡시드 단백질의 펩타이드의 분석법을 기반으로 하는 검정에 의해서 달성된다. 방법은 SDS-PAGE 젤로부터 절단된 VP3 단백질 밴드의 다중-효소 소화(트립신 키모트립신 및 엔도프로테이나제 Glu-C), 이후의 Q-이그잭티브 오비트랩(Exactive Orbitrap) 질량 분광계 상의 UPLC-MS/MS 상에서의 특징규명으로 캡시드 단백질을 서열결정하는 것을 포함한다. 숙주 단백질 산물의 차감 및 질량 스펙트럼으로부터 캡시드 펩타이드 서열의 유도를 허용하는 탠덤 질량 스펙트럼(MS) 방법을 개발하였다.
C. 게놈 카피(GC) 역가
oqPCR 기반 게놈 카피 역가를 다양한 연속 희석물에 걸쳐서 결정하고, 동족 플라스미드 표준품(pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG.KanR)과 비교한다. oqPCR 검정은 DNase I 및 프로테이나제 K로의 순차적인 소화, 그 이후의 qPCR 분석법을 사용하여 캡시드화된 벡터 게놈 카피를 측정한다. DNA 검출은 이러한 동일한 영역에 대한 형광 태깅된 프로브 혼성화와 조합하여 RBG 폴리A 영역을 표적화한 서열 특이적 프라이머를 사용하여 달성된다. 플라스미드 DNA 표준 곡선과의 비교는 어떠한 PCR 후 샘플 조작의 필요성도 없이 역가 결정을 가능하게 한다. 다수의 표준품, 검증 샘플 및 대조군(배경 및 DNA 오염을 위한 것임)을 검정에 도입하였다. 검정은 민감도, 검출 한계치, 품질 범위 및 자격이 있는 인트라 및 인터 검정 정밀도를 비롯한, 검정 파라미터를 확립 및 정의함으로써 자격이 있다. 내부 AAV9 참고 롯트가 확립되고, 이를 사용하여 자격 연구를 수행한다. 본 발명자들의 이전 경험은, 본 명세서에 기술된 최적화된 qPCR 검정에 의해서 수득된 역가가 일반적으로 임상전 데이터의 생성을 위해서 사용된 본 발명자들의 표준 qPCR에 의해서 달성된 것보다 2.5배 더 높다는 것을 주목하기 바란다.
D. 중공 입자 대 전입자 비
약물 산물의 총 입자 함량을 SDS-PAGE 분석법에 의해서 결정한다. 아이오딕산올 구배 상에서 정제된 참고 벡터 제제를 다양한 방법(분석 초원심분리, 전자 현미경 관찰법 및 260/280nm에서의 흡광도)에 의해서 분석하여 제제가 95% 초과의 게놈-함유(전) 입자를 함유함을 확립한다. 이러한 참고 물질을 알고 있는 게놈 카피 수(그리고 따라서 연장에 의해서, 입자 수)로 연속적으로 희석하고, 각각의 희석물을 약물 산물의 유사한 희석 시리즈와 함께 SDS PAGE 젤 상에서 유동시킨다. 참고 물질 및 약물 산물 VP3 단백질 밴드 둘 모두의 피크 면적 체적을 덴시오메트리에 의해서 결정하고, 참고 물질 체적을 입자 수에 대해서 플롯팅한다. 약물 산물의 총 입자 농도를 이러한 곡선으로부터의 외삽에 의해서 결정하고, 이어서 게놈 카피(GC) 역가를 뺄셈하여 중공 입자 역가를 수득한다. 중공 입자 대 전입자 비는 중공 입자 역가 대 GC 역가의 비이다.
E. 감염성 역가
감염성 단위(IU) 검정을 사용하여 RC32 세포(rep2 발현 HeLa 세포)에서 벡터의 생산적인 흡수 및 복제를 결정한다. 96-웰 종점 포맷을 이전에 공개된 것과 유사하게 사용하였다. 간략하면, RC32 세포를 rAAV9.CB.hIDS의 연속 희석물 및 Ad5의 균일한 희석물에 의해서 공동-감염시키고, rAAV의 각각의 희석 시에 12개의 반복물이 존재한다. 감염 72시간 후에, 세포를 용해시키고, qPCR을 수행하여 투입에 대한 rAAV 벡터 증폭을 측정한다. 종점 희석 TCID50 계산(스피어만-카버(Spearman-Karber))을 수행하여 IU/㎖ 단위로 표현된 복제 역가를 결정한다. "감염성" 값은 세포와 접촉한 입자, 수용체 결합, 내재화, 핵으로의 이송 및 게놈 복제에 의존적이기 때문에, 이것은 검정 기하학적 형상 및 적절한 수용체의 존재 및 사용된 세포주에서의 결합 구 경로에 의해서 영향을 받는다. 수용체 및 결합 후 경로는 통상적으로 불멸화된 세포주에서 유지되지 않고, 따라서 감염성 검정 역가는 존재하는 "감염성" 입자의 수의 절대적 척도가 아니다. 그러나, 캡시드화된 GC 대 "감염성 단위"의 비(GC/IU 비로서 기술됨)는 롯트 대 롯트의 산물 일관성의 척도로서 사용될 수 있다.
GC/IU 비는 산물 일관성의 척도이다. oqPCR 역가(GC/㎖)를 감염성 단위(IU/㎖)로 나누어 계산된 GC/IU 비를 제공한다.
F. 복제-가능 AAV(rcAAV) 검정
샘플을 생산 공정 동안 잠재적으로 발생할 수 있는 복제 가능 AAV2/9(rcAAV)의 존재에 대해서 분석한다. 세포-기반 증폭 및 계대, 그 다음 실시간 qPCR(cap 9 표적)에 의한 rcAAV DNA의 검출로 이루어진 3 계대 검정을 개발하였다. 세포-기반 성분은 HEK293 세포(P1)의 단층을 시험 샘플 및 야생형 인간 아데노바이러스 타입 5(Ad5)의 의 희석물로 접종시키는 것으로 이루어진다. 1010GC의 벡터 산물은 시험된 산물의 최대 양이다. 아데노바이러스의 존재로 인해서, 복제 가능 AAV는 세포 배양물 중에서 증폭한다. 2일 후, 세포 용해물을 생성하고, Ad5를 열 불활성화시킨다. 이어서, 정화된 용해물을 제2 라운드의 세포(P2)에 통과시켜 민감성을 향상시킨다(다시 Ad5의 존재 하에서). 2일 후, 세포 용해물을 생성하고, Ad5를 열 불활성화시킨다. 이어서, 정화된 용해물을 제3 라운드의 세포(P3)에 통과시켜 민감성을 최대화시킨다(다시 Ad5의 존재 하에서). 2일 후, 세포를 용해시켜 DNA를 방출하고, 이어서 이것을 qPCR에 적용하여 AAV9 cap 서열을 검출한다. Ad5 의존적 방식에서의 AAV9 cap 서열의 증폭은 rcAAV의 존재를 나타낸다. AAV2 rep 및 AAV9 cap 유전자를 함유하는 AAV2/9 대용 양성 대조군의 사용은 검정의 검출 한계치(LOD)가 결정되는 것을 가능하게 하고(0.1, 1, 10 및 100IU), rAAV9.CB.hIDS 벡터의 연속 희석물을 사용하여(1 x 1010, 1 x 109, 1 x 108, 1 x 107GC) 시험 샘플에 존재하는 rcAAV의 대략적인 수준을 정량화할 수 있다.
G. 시험관내 효력
qPCRGC 역가를 유전자 발현에 관련시키기 위해서, HEK293(인간 배아 신장) 세포를 세포당 기지의 다중도의 GC로 형질도입시키고, 형질도입 72시간 후 IDS 활성도에 대해서 상청액을 검정함으로써 시험관내 생물검정을 수행한다. 0.1㎖의 100m㏖/l 4MU-이두로나이드-2-설페이트를 갖는 0.1㎖ 물 중에 희석된 샘플을 37도에서 1 내지 3시간 동안 인큐베이션시킴으로써 IDS 활성도를 측정한다. 2㎖의 290m㏖/l 글리신, 180m㏖/l의 시트르산나트륨, pH 10.9을 첨가함으로써 반응을 중단시키고, 형광을 4MU의 표준 희석물과 비교함으로써 해방된 4MU를 정량화한다. 고도로 활성인 전임상 및 tox 벡터 제제에 대한 비교는 산물 활성도의 해석을 가능하게 한다.
H. 총 단백질, 캡시드 단백질, 단백질 순도 결정 및 캡시드 단백질 비
벡터 샘플을 먼저 바이신코닌산(BCA) 검정을 사용하여 소 혈청 알부민(BSA) 단백질 표준 곡선에 대한 총 단백질에 대해서 정량화한다. 동일 부의 샘플과 키트 내에 제공된 마이크로-BCA 시약을 혼합함으로써 결정을 수행한다. 동일한 절차를 BSA 표준품의 희석물에 적용한다. 혼합물을 60℃에서 인큐베이션시키고, 흡광도를 562nm에서 측정한다. 4-파라미터 핏을 사용하여 알고 있는 농도의 표준 흡광도로부터 표준 곡선을 생성한다. 미지의 샘플을 4-파라미터 회귀에 따라서 정량화한다.
AAV 순도의 반-정량적 결정을 제공하기 위해서, 이어서 샘플을 게놈 역가에 대해서 정규화하고, 환원 조건 하에서 SDS-폴리아크릴아마이드(SDS-PAGE) 젤 상에서 5 x 109GC를 분리한다. 이어서 젤을 SYPRO 루비 염료로 염색한다. 레인당 25, 50, 및 100ng의 단백질의 공동-전기영동된 BSA 표준품과 비교함으로써 덴시오메트리에 의해서 임의의 불순물 밴드를 정량화한다. 이러한 양은 총 AAV 단백질 샘플의 1%, 2% 및 4%를 나타낸다. 3종의 AAV 특이적 단백질 VP1, VP2 및 VP3 이외에 나타난 염색된 밴드를 단백질 불순물이라 간주한다. 모든 불순물 밴드를 참고 단백질과 비교하고, 불순물 질량 백분율뿐만 아니라 대략적인 분자량을 기록한다. SDS-PAGE 젤을 또한 사용하여 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 정량하고 이의 비를 결정한다.
실시예 6: MPS II 바이오마커
본 연구에서, MPS I 개로부터의 CSF 샘플의 대사산물 프로파일링을 수행하였는데, 이는 CSF 대사체에서 상당한 질환 관련된 변경을 드러내었다. 가장 두드러진 차이는 정상 대조군과 비교할 때 스퍼민 수준이 30-배를 초과하게 높다는 것이었다. 이러한 발견은 MPS I 환자 샘플, 뿐만 아니라 MPS I의 고양이 모델에서 확인되었으며, 이것은 MPS II에서 또한 발견될 것이라고 예측된다. HS에 대한 스퍼민 결합, 스퍼민의 세포 흡수는 이러한 상호작용에 좌우된다[M. Belting, S. Persson, L.-Å. Fransson, Proteoglycan involvement in polyamine uptake. Biochemical Journal 338, 317-323 (1999); J. E. Welch, P. Bengtson, K. Svensson, A. Wittrup, G. J. Jenniskens, G. B. Ten Dam, T. H. Van Kuppevelt, M. Belting, Single chain fragment anti-heparan sulfate antibody targets the polyamine transport system and attenuates polyamine-dependent cell proliferation. International Journal of oncology 32, 749-756 (2008); 온라인 공개 EpubApr]. 세포 표면 프로테오글리칸, 예컨대, 글리피칸-1은 이의 HS 모이어티를 통해서 스퍼민에 결합할 수 있고, 글리피칸 단백질의 엔도사이토시스 후에, HS 쇄의 세포내 절단은 결합된 스퍼민을 세포로 방출한다(Belting et al; K. Ding, S et al, The Journal of biological chemistry 276, 46779-46791 (2001); 온라인 공개 EpubDec 14). 따라서, 무손상 HS 재순환은 스퍼민 흡수에 본질적이다. MPS I에서, 세포외 스퍼민 축적은 비효율적인 HS 재순환으로 인한 이러한 흡수 기전의 저해를 통해서, 또는 MPS에서 축적하는 세포외 GAG에 대한 스퍼민의 단순한 결합을 통해서 일어날 수 있고, 세포외 분포를 선호하도록 스퍼민 결합 평형이 이동할 수 있다. 미래의 연구는 MPS I CSF에서 스퍼민 축적에 대한 이러한 기전의 상대적인 기여를 다루어야 한다.
본 발명자들은 스퍼민 합성의 저해제가 MPS 뉴런에서 과도한 신경돌기 성장을 차단하였고, 신경돌기 성장은 환자 CSF에서 발견되는 것과 유사한 스퍼민 농도에 의해서 WT 뉴런에서 유도될 수 있다는 것을 발견하였다. MPS I의 개 모델에서의 유전자 요법은 스퍼민 축적을 반전시켰고, 및 GAP43의 발현을 정상화하였는데, 이는 동일한 경로가 생체내에서 영향을 미친다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 생체내에서 스퍼민 합성 저해의 영향을 직접 평가할 수 없었는데, 그 이유는 입수 가능한 저해제가 혈액-뇌 장벽을 통과하지 않고, 출생시로부터의 만성 직접 CNS 투여가 본 발명자들의 동물 모델에서 실행 가능하지 않기 때문이다. 본 발명자들의 시험관내 발견은 MPS I에서 비정상적인 신경돌기 성장에서의 스퍼민에 대한 역할을 뒷받침하지만, 스퍼민 합성을 저해하는 것은 표현형을 완전히 반전시키지 않았고, 정상 뉴런에 대한 스퍼민의 첨가는 신경돌기 성장을 MPS I 뉴런의 수준까지 증가시키지 않았다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 스퍼민 조절의 효과는 비교적 단기간의 치료에 제한될 수 있다. 또한 스퍼민 축적은 MPS I에서 신경돌기 증식에 기여하는 유일한 매개인자가 아닐 수 있다. 특히 다수의 신경영양적 인자가 HS 변형된 수용체를 통해서 결합하고, 세포외 매트릭스에서의 HS와의 상호작용이 신경돌기 성장에 영향을 줄 수 있다[[D. Van Vactor, D. P. Wall, K. G. Johnson, Heparan sulfate proteoglycans and the emergence of neuronal connectivity. Current opinion in neurobiology 16, 40-51 (2006); 온라인 공개 EpubFeb (10.1016/j.conb.2006.01.011)]. 따라서 스퍼민 축적은 MPS I에서 비정상적인 신경돌기 성장을 촉진시키는 몇몇 인자 중 하나일 수 있다.
스크리닝된 15종의 MPS I 개 CSF 샘플 중에서, 단지 하나가 스퍼민 농도의 정상 범위에 포함되었다. 28일령에, 이것은 본 연구에 포함된 최연소 동물이었다. 이러한 발견은, 스퍼민 축적이 연령 의존적일 수 있음을 나타낸다. 미래의 연구는 MPS 환자에서 CSF 스퍼민 수준을 종방향으로 평가해야 한다. 스퍼민이 MPS 환자에서 연령에 따라서 증가하면, 이것은 인지 감소의 속도론을 설명할 수 있는데, 그 이유는 대부분의 환자가 발달 지연의 시작 이전에 1 내지 2년의 정상 발달을 경험하기 때문이다.
뉴런 성장을 변경하는 대사산물의 축적을 촉발하는 손상된 HS 대사에 대한 가능성은 MPS I에서 효소 결핍과 비정상적인 신경돌기 성장 표현형 간의 새로운 연결을 지적할 수 있는데, 이것은 이들 장애와 연관된 인지 기능장애를 설명할 수 있다. 이러한 발견은 또한 CSF 스퍼민이 MPSI을 위한 신규한 CNS-지향된 요법을 평가하기 위한 비침습적 바이오마커로서 유용함을 나타낸다.
물질 및 방법:
실험 설계: 본 연구는 먼저 건강한 대조군으로부터의 샘플과 비교할 때 MPS I 환자 CSF 샘플에서 상당히 상이한 수준으로 존재하는 대사산물을 검출하기 위해서 설계되었다. MPS IH를 갖는 소아 및 건강한 대조군으로부터의 CSF 샘플의 제한된 유용성으로 인해서, 더 많은 수가 입수 가능한 MPS I 개로부터의 CSF 샘플을 사용하여 초기 스크린을 수행하였고, 이는 인간 샘플에서 후보 바이오마커를 후속으로 평가하려는 의도였다. 개별 미치료 MPS I 개로부터의 총 15종의 CSF 샘플이 분석법을 위해서 입수 가능하였고, 추가적인 15종의 샘플을 건강한 대조군으로부터 입수하였다. 장래의 대사산물 스크린에서 MPS I 개 CSF에서 증가된 스퍼민의 식별 이후에, 스퍼민을 유전자 요법으로 치료된 MPS I 개 및 고양이의 이전 연구로부터의 CSF 샘플, 뿐만 아니라 환자 샘플에서 소급적으로 측정하였다. 이들 분석을 위해서 각각의 군에 포함된 대상체의 수는 샘플 유용성에 의해서 제한되었고, 통계학적 고려사항을 기초로 하지 않았고; 따라서 일부 경우에 수는 통계학적 비교를 위해서 불충분하였다. 시험관내 신경돌기 성장의 연구를 위해서, 각각의 조건에 대해서 정량화된 세포의 수는 파일럿 실험을 기초로 하였는데, 이것은 아버(arbor) 길이, 신경돌기 수 또는 세포당 신경돌기 분지에서 20% 차이를 검출하는 데 조건당 30개 초과의 세포가 필요하였다는 것을 나타내었다. 세포를 플레이팅하고, 지정된 약물로 처리한 후, 웰을 암호화하고, 세포 영상의 획득 및 신경돌기 길이 및 분지화의 수동 정량화를 맹검 검토자에 의해서 수행하였다. 유사한 결과를 갖는 상이한 기질[챔버 슬라이드(시그마(Sigma) S6815)가 아니라 폴리-L-라이신(시그마) 코팅된 조직 배양 플레이트]을 사용하여 야생형 마우스 뉴런과 MPS 마우스 뉴런의 비교를 반복하였다. 스퍼민이 첨가된 야생형 뉴런과 스퍼민이 첨가되지 않은 야생형 뉴런의 비교를 유사한 결과를 갖는 두 기질을 사용하여 4회 수행하였다.
CSF 대사산물 프로파일링: CSF 대사산물 프로파일링을 메타볼론(Metabolon)에 의해서 수행하였다.
샘플을 가공시까지 -80℃에서 저장하였다. 마이크로랩 STAR(등록상표) 시스템(헤밀톤 컴퍼니(Hamilton Company))을 사용하여 샘플을 제조하였다. 회수 표준품을 제1 단계 이전에 QC 목적을 위한 추출 공정에 첨가하였다. 2분 동안 격렬한 진탕 하에서 단백질을 메탄올로 침전시키고, 그 다음 원심분리하였다. 생성된 추출물을 5개의 분획으로 나누었는데: 하나는 양이온 모두 전기분무 이온화를 사용한 역상(RP) UPLC-MS/MS에 의한 분석법용이고, 하나는 음이온 모드 전기분무 이온화를 사용한 RP/UPLC-MS/MS에 의한 분석법용이고, 하나는 음이온 모드 전기분무 이온화를 사용한 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC) /UPLC-MS/MS에 의한 분석법용이고, 하나는 GC-MS에 의한 분석법용이고, 하나의 샘플은 백업을 위해서 보존하였다. 샘플을 터보뱁(TurboVap)(등록상표)(지마크(Zymark)) 상에 잠시 두어 유기 용매를 제거하였다. LC를 위해서, 분석법을 위해서 제조하기 전에 샘플을 밤새 질소 하에서 저장하였다. GC를 위해서, 분석법을 위해서 제조하기 전에 각각의 샘플을 진공 하에서 밤새 건조시켰다.
플랫폼의 LC/MS 부분은 워터스 ACQUITY 초고-성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 및 가열된 전기분무 이온화(HESI-II) 공급원 및 35,000 질량 분해능에서 작동되는 오비트랩(Orbitrap) 질량 분석기와 인터페이스된 및 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) Q-이그잭티브 고 분해능/정밀 질량 분광계를 기반으로 하였다. 샘플 추출물을 건조시키고, 이어서 LC/MS 방법 각각에 대해서 사용성인 용매 중에 재구성하였다. 각각의 재구성 용매는 고정된 농도의 일련의 표준품을 함유하여 주입 및 크로마토그래피 일관성을 보장하였다. RP 크로마토그래피를 위해서, 하나의 분취물을 산성 양이온 최적화된 조건을 사용하여 분석하였고, 나머지를 염기성 음이온 최적화된 조건을 사용하여 분석하였다. 각각의 방법은 별개의 전용 칼럼(워터스 UPLC BEH C18-2.1x100㎜, 1.7㎛)을 사용하였다. 산성 조건 중에 재구성된 추출물을 0.1% 폼산을 함유하는 메탄올 및 물을 사용하여 구배 용리시켰다. 염기성 추출물을 6.5mM 암모늄 바이카보네이트를 갖는 메탄올 및 물을 사용하여 유사하게 용리시켰다. 제3 분취물을 10mM 암모늄 폼에이트를 갖는 물 및 아세토나이트릴로 이루어진 구배를 사용하여 HILIC 칼럼(워터스 UPLC BEH 아마이드 2.1x150㎜, 1.7㎛)으로부터 용리시킨 후에 음성 이온화를 통해서 분석하였다. MS 분석법을 동적 배제를 사용하여 MS와 데이터-의존적인 MSn 스캔 사이에서 변경하였다. 스캔 범위는 방법들 간에 약간 달랐지만 80 내지 1000m/z를 포함하였다.
GC-MS에 의한 분석이 예정된 샘플을 진공 하에서 최소 18시간 동안 건조시키고, 그 후 비스트라이메틸-실릴트라이플루오로아세트아마이드를 사용하여 건조된 질소 하에서 유도체화하였다. 유도체화된 샘플을 담체 기체로서 헬륨을 사용하고, 17.5분의 기간 동안 60°에서 340℃로의 온도 상승을 사용하여 5% 다이페닐 / 95% 다이메틸 폴리실록산 융합된 실리카 칼럼(20m x 0.18㎜ ID; 0.18um 막 두께) 상에서 분리하였다. 샘플을 전자 충격 이온화(EI)를 사용하고, 단위 질량 분해 전력에서 작동되는 쏘모-피니간 트레이스(Thermo-Finnigan Trace) DSQ 신속-스캐닝 단일-사중극자 질량 분광계 상에서 분석하였다. 스캔 범위는 50 내지 750m/z였다.
몇몇 유형의 대조군을 실험 샘플과 함께 분석하였다: 소량의 각각의 실험 샘플을 취하여 생성된 풀링된 매트릭스 샘플을 데이터 세트 전체에서 기술적 복제물로서 제공하였고; 추출된 물 샘플을 공정 블랭크로서 제공하였고; 내인성 화합물의 측정을 방해하지 않도록 선택된 주위깊게 선택된 QC 표준품의 칵테일을 모든 분석되는 샘플 내에 스파이킹하여, 장비 성능 모니터링을 허용하고, 크로마토그래피 정렬을 도왔다. 질량 분광계에 주입하기 전에 각각의 샘플에 첨가된 표준품에 대해서 중간 상대 표준 편차(RSD)를 계산함으로써 장비 변동성을 결정하였다. 풀링된 매트릭스 샘플 100%에 존재하는 모든 내인성 대사산물(즉, 비-장비 표준품)에 대한 중간 RSD를 계산함으로써 전체 공정 변동성을 결정하였다. 주입 사이에서 균일하게 이격된 QC 샘플을 사용하여 플랫폼 실시에 걸쳐서 실험 샘플을 무작위화하였다.
실험 샘플 내의 이온 특징부를 체류 시간, 분자량(m/z), 바람직한 부가물, 및 공급원내 단편뿐만 아니라 연관된 MS 스펙트럼을 포함한 화학적 표준 입장의 참고 라이브러리와 자동 비교함으로써 대사 산물을 식별하고, 메타볼론에서 개발된 소프트웨어를 사용하여 품질 제어를 위해서 육안 관찰에 의해서 큐레이팅하였다. 공지된 화학 엔티티의 식별은 정제된 표준품의 메타볼로믹스 라이브러리 입장에 대한 비교를 기초로 하였다. 피크를 곡선하 면적 측정을 사용하여 정량하였다. 각각의 샘플에서 각각의 대사산물에 대한 원 면적 카운트를 정규화하여 각각의 실행일에 대한 중간 값에 의해서 장비의 일별 조정 차이로부터 초래한 변동에 대해서 보정하고, 그 중간값을 각각의 실시에 대해서 1.0으로 설정하였다. 이것은 샘플들 간의 변동을 보존하였지만, 매우 상이한 원 피크 면적의 대사산물이 유사한 그래프 스케일에 대해서 비교되는 것을 허용하였다. 누락 값을 정규화 후 관찰된 최소값으로 입력하였다.
정량적 MS 검정: CSF 샘플(50㎕)을 스퍼민-d8 내부 표준물(아이소사이언시스(IsoSciences))과 혼합하였다. 4배 과량의 메탄올과 혼합하고, 12,000 x g에서 4℃에서 원심분리함으로써 샘플에서 단백질을 제거하였다. 상청액을 질소 스트림 하에서 건조시키고, 이어서 50㎕의 물 중에 재현탁하였다. 5㎕의 분취물을 LC-MS 분석법에 적용하였다. 엑스브릿지(등록상표) C18 칼럼(3.5㎛, 150 Х 2.1㎜)이 장치된 워터스 ACQUITY UPLC 시스템(워터스 코프. 미국 매사추세츠주 밀리포드 소재)을 사용하여 LC 분리를 수행하였다. 유량은 0.15㎖/분이었고, 용매 A는 0.1% 폼산이었고, 용매 B는 0.1% 폼산을 갖는 98/2 아세토나이트릴/H2O(v/v)였다. 용리 조건은 다음과 같았다: 0분에 2% B, 2분에 2% B, 5분에 60% B, 10분에 80% B, 11분에 98% B, 16분에 98% B, 17분에 2% B, 22분에 2% B, 칼럼 온도 35℃. A 피니간 TSQ 퀀텀 울트라 분광계(써모 피셔, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)를 사용하여 하기 파라미터를 사용하여 양이온 모드로 MS/MS 분석법을 수행하였다: 분무 전압 4000 V, 모세관 온도 270℃, 시쓰(sheath) 기체 압력 35임의 단위, 이온 스위 기체 압력 2임의 단위, 보조 기체 압력 10임의 단위, 증발기 온도 200℃, 튜브 렌즈 오프셋 50, 모세관 오프셋 35 및 스키머(skimmer) 오스펫 0. 하기 전이를 모니터링하였다: 203.1/112.1(스퍼민); 211.1/120.1(스퍼민-d8), 0.002m/z의 스캔 폭 사용, 스캔 시칸 0.15초임.
동물 절차: 펜실베니아 대학교의 실험 동물 운영 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Pennsylvania)에 의해서 모든 동물 프로토콜을 승인받았다. CSF 대사산물 스크리닝을 위해서, 3 내지 26개월령의 정상 개에서 그리고 1 내지 18개월령의 MPS I 개에서 후두골하 천자에 의해서 샘플을 수집하였다. MPS I 개 및 고양이에서의 유전자 전달 연구를 이미 기술된 바와 같이 수행하였다(20, 22). CSF 샘플을 벡터 투여 6 내지8개월 후에 수집하였다. 마우스 피질 뉴런 실험을 위해서, 1차 피질 뉴런 배양물을 E18 IDUA-/- 또는 IDUA+/+ 배아로부터 제조하였다.
환자 샘플: 각각의 대상체의 부모 또는 법적 보호자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었다. 이 프로토콜은 미네소타 대학교의 임상심사 위원회에 의해서 승인되었다. CSF를 요추 천자에 의해서 수집하였다. 모든 MPS I 환자는 헐러 증후군으로 진단되었고, 샘플 수집 이전에 효소 대체 요법 또는 조혈 줄기세포 이식이 제공되지 않았다. MPS I 환자는 6 내지 26개월령이었다. 건강한 대조군은 36개월령 및 48개월령이었다.
통계학적 분석법: 메타보어날리스트 3.0을 사용하여 랜덤 포레스트 분석법 및 히트 맵 생성을 수행하였다[R. G. Kalb, Development 120, 3063-3071 (1994); J. Zhong, et al, Journal of neurochemistry 64, 531-539 (1995) D. Van Vactor, D. P. W et al, Current opinion in neurobiology 16, 40-51 (2006); 온라인 공개 EpubFeb (10.1016/j.conb.2006.01.011). 원 피크 데이터를 로그 변환하고, 정상 샘플 값의 평균에 대해서 정규화하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6을 사용하여 모든 다른 통계학적 분석법을 수행하였다. 배양된 뉴런 아버 길이, 신경돌기 수 및 분지화를 ANOVA, 그 다음 듀넷 시험에 의해서 비교하였다. CSF 스퍼민 및 피질 GAP43을 크러스칼-발리스 시험, 그 다음 던 시험에 의해서 비교하였다.
GAP43 웨스턴: 전두엽의 샘플을 퀴아젠 조직용해기를 사용하여 30Hz에서 5분 동안 0.2% 트리톤 X-100 중에서 균질화하였다. 샘플을 4℃에서의 원심분리에 의해서 정화하였다. 단백질 농도를 BCA 검정에 의해서 상청액에서 결정하였다. 샘플을 DTT를 갖는 NuPAGE LDS 완충액(써모 피셔 사이언티픽) 중에서 70℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, MOPS 완충액 중에서 비스-트리스 4-12% 폴리아크릴아마이드 젤 상에서 분리하였다. 단백질을 PVDF 막으로 전달하고, 1시간 동안 5% 탈지 분유 중에서 차단하였다. 막을 1㎍/㎖로 5% 탈지 분유 중에 희석된 토끼 다클론성 항-GAP43 항체(압캄)로 프로빙하고, 그 다음 5% 탈지 분유 중에 1:10,000으로 희석된 HRP 접합된 다클론성 항-토끼 항체(써모 피셔 사이언티픽)로 프로빙하였다. 슈퍼시그널 웨스트 피코 기질(SuperSignal West Pico substrate)(써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 밴드를 검출하였다. 덴시오메트리를 이미지 랩(Image Lab) 5.1(바이오-라드(Bio-Rad))을 사용하여 수행하였다.
신경돌기 성장 검정: 18일 배아 피질 뉴런을 상기에 기술된 바와 같이 수거하였고, B27(깁코(Gibco))이 보충된 무혈청 뉴로바살 배지(Neurobasal medium)(깁코) 중에서 챕버 슬라이드(시그마 S6815) 상에 또는 폴리-L-라이신(시그마) 코팅된 조직 배양 플레이트 상에 100,000개 세포/㎖의 농도로 플레이팅하였다. 처리를 적용하여 2회 반복물 웰에 플레이팅 24시간 후(1일)에 적용하였다. 정량화를 위한 위상-대비 영상을 600ms 수동 노출 및 높은 대비의 1.70x 게인을 사용하여 닉콘 이클립스 티(Nikon Eclipse Ti) 상에서 찍었다. 처리 조건에 대해서 맹검된 개인이 웰당 10 내지 20개의 영상을 캡처하고, 그들을 암호화하였다. 영상을 이미지제이(ImageJ)(NIH)로 8-비트 포맷으로 전환하고, 맹검 검토자에 의해서 뉴런제이(NeuronJ)로 추적하였다[E. Meijering, M. Jacob, J. C. Sarria, P. Steiner, H. Hirling, M. Unser, Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology 58, 167-176 (2004); 온라인 공개 EpubApr (10.1002/cyto.a.20022)]. 소마 직경, 신경돌기 수 및 분지점 및 아버 길이를 수동으로 추적하였다. 뉴런J에서 추적된 영상을 영상 크기를 기초로 변환 인자를 사용하여 마이크로미터로 변환하고; 2560x1920 픽셀 영상을 0.17마이크로미터/픽셀의 변환 인자를 사용하여 마이크로미터로 변환하였다.
조직학: 뇌 조직 가공 및 LIMP2 면역형광을 이미 기술된 바와 같이 수행하였다[C. Hinderer, et al, Molecular therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy 22, 2018-2027 (2014); published online EpubDec (10.1038/mt.2014.135)].
RT-PCR: 3마리의 정상 개 및 5마리의 MPS 개로부터의 전두엽의 샘플을 부검 시에 드라이아이스 상에서 즉시 동결시켰다. RNA를 제조사의 지시에 따라서 TRIzol 시약(써모 피셔 사이언티픽)으로 추출하고, DNAse I(로슈)으로 20분 동안 실온에서 처리하고, RNeasy 키트(퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA(500ng)를 랜덤 헥사머 프라이머를 갖는 하이 커패시티 cDNA 합성 키트(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 역전사시켰다. 아르기나제, 오르니틴 데카복실라제, 스퍼민 신타제, 스퍼미딘 신타제, 스퍼민-스퍼미딘 아세틸트랜스퍼라제 및 글리세르알데하이드 포스페이트 데하이드로게나제에 대한 전사물을 어플라이드 바이오시스템즈 7500을 사용하여 Sybr 그린 PCR에 의해서 정량하였다.
실시간 PCR 시스템. 모든 개별 샘플로 구성된 풀링된 표준품의 4배 희석을 사용하여 각각의 표적 유전자에 대해서 표준 곡선을 생성하였다. 최고 표준품에 임의의 전사물 번호를 할당하고, 개별 샘플에 대한 Ct 값을 표준 곡선을 기초로 전사물 번호로 변환하였다. 값을 GAPDH 대조군에 대해서 표현한다.
통계학적 분석법: 랜덤 포레스트 분석법 및 히트 맵 생성을 메타보어날리스트 3.0을 사용하여 수행하였다[J. Xia, et al, MetaboAnalyst 2.0―a comprehensive server for metabolomic data analysis. Nucleic Acids Research, (2012); 온라인 공개 EpubMay 2, 2012(10.1093/nar/gks374); J. Xia, et al., MetaboAnalyst: a web server for metabolomic data analysis and interpretation. Nucleic Acids Research 37, W652-W660 (2009); 온라인 공개 EpubJuly 1, 2009 (10.1093/nar/gkp356). J. Xia, et al, MetaboAnalyst 3.0―making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research, (2015); 온라인 공개 EpubApril 20, 2015 (10.1093/nar/gkv380)]. 대사산물 스크린에서 검출 가능하지 않은 값에 데이터 세트에서 관찰된 최소 값을 입력하였다. 원 피크 데이터를 정상 샘플 값의 평균에 대해서 정규화하고, 로그 변환하였다. 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 모든 다른 통계학적 분석법을 수행하였다. 배양된 뉴런 아버 길이, 신경돌기 수 및 분지화를 ANOVA, 그 다음 듀넷 시험에 의해서 비교하였다. CSF 스퍼민 및 피질 GAP43을 크러스칼-발리스 시험, 그 다음 던 시험에 의해서 비교하였다.
결과
1. 대사산물 프로파일링을 통한 증가된 CSF 스퍼민의 식별
MPS I의 개 모델을 사용하여 CSF 대사산물의 초기 스크린을 수행하였다. 이들 동물은 IDUA 유전자 내에 스플라이스 부위 돌연변이를 보유하여, 효소 발현의 완전한 손실 및 MPS I 환자의 것과 유사한 임상적 특징부 및 조직학적 특징부의 발달을 초래한다[K. P. Menon, et al, Genomics 14, 763-768 (1992); R. Shull, et al., The American Journal of pathology 114, 487 (1984)]. CSF 샘플을 15마리의 정상 개 및 15마리의 MPS I 개로부터 수집하였다. LC 및 GC-MS에 의해서 대사산물의 상대적인 양에 대해서 CSF 샘플을 평가하였다. 총 281종의 대사산물이 질량 분광분석법에 의해서 CSF 샘플에서 긍정적으로 확인될 수 있었다. 이들 중에서, 47종(17%)은 대조군에 비해서 MPS I 개에서 상당히 증가되었고, 88종(31%)은 대조군에 비해서 감소되었다. 군들 간에 가장 상이한 50종의 대사산물의 히트 맵을 도 19A에 나타낸다. 대사산물 프로파일링은 MPS I 개와 정상 개 사이에서 폴리아민, 스핑고리피드, 아세틸화된 아미노산, 및 뉴클레오타이드 대사에서 상당한 차이를 식별하였다. 랜덤 포레스트 클러스터링 분석법은 MPS I 개와 정상 개 사이에서 대사산물 차이에 대한 최대 기여인자로서 폴리아민 스퍼민을 식별하였다(도 23). 샘플 수집 시기에 1개월령 미만인 1마리의 MPS I 개를 제외하고, 평균적으로 스퍼민은 MPS I 개에서 30-배를 초과하게 상승하였다. 안정적인 동위원소 희석(SID)-LC-MS/MS 검정을 개발하여 CSF에서 스퍼민을 정량적으로 측정하였다. 헐러 증후군을 갖는 6마리의 소아(6 내지 26개월령), 뿐만 아니라 2마리의 건강한 대조군(36 및 48개월령)으로부터 샘플을 스크리닝하였다. 건강한 대조군 모두는 검정의 정량 한계치(1ng/㎖)보다 낮은 CSF 스퍼민 수준을 가졌지만, MPS I 환자로부터의 CSF 샘플은 정량 한계치를 평균 10-배 초과하였다(도 19B). MPS IH 환자에서의 스퍼민 상승은 스퍼민 결합 및 흡수에서의 HS의 공지된 역할과 일치하는 것으로 보였고[M. Belting, et al, Journal of Biological Chemistry 278, 47181-47189 (2003); M. Belting, et al, Proteoglycan involvement in polyamine uptake. Biochemical Journal 338, 317-323 (1999); J. E. Welch, et al, International Journal of oncology 32, 749-756 (2008))]; 증가된 합성은 증가된 CSF 스퍼민의 원인으로 보이지 않았는데, 그 이유는 정상 개 및 MPS I 개 뇌 샘플은 폴리아민 합성 경로에서 전사적으로 조절되는 효소에 대해서 유사한 mRNA 발현 수준을 가졌기 때문이다(도 24). 스퍼민 상승이 헤파란 설페이트 저장 질환의 일반적인 특성인지 또는 MPS I에 대해서 특이적인 것인지를 결정하기 위해서, 스퍼민을 유사한 상승을 나타낸 MPS VII의 개 모델로부터의 CSF 샘플에서 측정하였다(도 25).
2. MPS와 연관된 비정상적인 신경돌기 성장에서의 스퍼민의 역할
축삭 돌기 손상 후 뉴런은 신경돌기 증식을 촉진시키는 폴리아민 합성을 상향조절한다[D. Cai, et al, Neuron 35, 711-719 (2002); 온라인 공개 EpubAug 15; K. Deng, et al, The Journal of neuroscience : the official Journal of the Society for Neuroscience 29, 9545-9552(2009); 온라인 공개 EpubJul 29; Y. Gao, et al, Neuron 44, 609-621 (2004); 온라인 공개 EpubNov 18; R. C. Schreiber, et al., Neuroscience 128, 741-749 (2004)]. 따라서 본 발명자들은 MPS 뉴런에서 기술된 비정상적인 신경돌기 과다성장 표현형에서 스퍼민의 역할을 평가하였다[Hocquemiller, S., et al, Journal of neuroscience research 88, 202-213 (2010)]. MPS I 마우스로부터의 E18 피질 뉴런의 배양물은 집락으로부터의 야생형 마우스로부터 유래된 뉴런보다 배양물 중에서 4일 후에 더 큰 신경돌기 수, 분지화 및 총 아버 길이를 나타내었다(도 20A 내지 20F). 스퍼민 합성의 저해제인 APCHA로의 MPS 뉴런의 치료는 신경돌기 성장 및 분지화를 상당히 감소시켰다. 스퍼민을 대체함으로써 효과는 가역적이었다(도 20A 내지 20F). 동일한 APCHA 농도는 정상 뉴런의 성장에 영향을 주지 않았다(도 26). 생체내에서 식별된 것과 유사한 농도로 야생형 뉴런 배양물에 스퍼민을 첨가하는 것은 신경돌기 성장 및 분지화의 상당한 증가를 초래하였다(도 20A 내지 20F).
3. CSF 스퍼민 및 GAP43 발현에 대한 유전자 요법의 영향
신경돌기 성장의 중심 조절인자인 GAP43은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 MPS III 마우스 뉴런에 의해서 과다발현되는데, 이는 뉴런 배양물에서 비정상적으로 활성화된 동일한 신경돌기 성장 경로가 또한 생체내에서 또한 활성이라는 것을 시사한다. 생체내에서 GAP43 발현 및 스퍼민 축적에 대한 IDUA 결함의 효과를 평가하기 위해서, 본 발명자들은 미치료 MPS I 개뿐만 아니라 CNS 지향된 유전자 요법으로 치료된 것에서 CSF 스퍼민 및 뇌 GAP43 수준을 측정하였다. 본 발명자들은 개 IDUA 이식유전자를 보유한 아데노-연관 바이러스 항원형 9 벡터의 척추강내 주사로 치료된 5마리의 MPS I 개를 이미 기술하였다[C. Hinderer, et al, Molecular therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy 23, 1298-1307 (2015); 온라인 공개 Epub Aug]. MPS I 개는 정상 IDUA 효소에 대한 항체를 발달시킬 수 있고, 따라서 개 중 2마리를 간 IDUA 유전자 전달을 갖는 신생아로서 사전 처리하여 단백질에 대한 면역 관용을 유도하였다. 관용화된 개 둘 모두는 AAV9 처리 이후에 정상을 훨씬 초과하는 뇌 IDUA 활성도를 나타내었다. 3마리의 비-관용화된 개는 다양한 수준의 발현을 나타내었는데, 한 마리의 동물은 정상을 초과하는 수준에 도달하였고, 나머지 두 마리는 정상 근처의 발현을 나타내었다(도 21A). CSF 스퍼민 감소는 뇌 IDUA 활성도와 반비례하였고, 최저 IDUA 발현을 갖는 2마리의 개에서 미처리 동물에 비해서 3-배 감소하였고, 최고 발현을 갖는 동물에서 20-배를 초과하게 감소하였다(도 21A, 21B 내지 21H 및 21K). GAP43은 MPS I 개의 전두엽에서 상향조절되었고, 발현은 모든 벡터 처리된 동물에서 정상화되었다(도 21I 및 21J).
본 발명자들은 다양한 벡터 용량으로 처리된 MPS I 개에서 CSF 스퍼민 수준과 IDUA 재구성 간의 상관관계를 추가로 평가하였다. 신생아 간 유전자 전달에 의해서 인간 IDUA에 대해서 이미 관용화된 MPS I 개를 3종의 용량(1010, 1011, 1012GC/㎏, 용량당 n = 2) 중 하나로 인간 IDUA를 발현하는 AAV9 벡터의 척추강내 주사로 처리하였다[(C. Hinderer, et al, Neonatal tolerance induction enables accurate evaluation of gene therapy for MPS I in a canine model. Molecular Genetics and Metabolism, dx.doi.org/10.1016/j.ymgme.2016.06.006]. CSF 스퍼민을 주사 6개월 후에 평가하였다(도 22A). CSF 스퍼민의 감소는 용량 의존적이었고, 중 및 고 벡터 용량에서의 동물은 정상 범위에 도달한 반면, CSF 스퍼민은 저 용량 동물에서 단지 부분적으로 감소되었다. IDUA 결함과 CSF 스퍼민 축적 간의 연결성의 독립적인 확인을 위해서, 본 발명자들은 MPS I의 고양이 모델에서 CSF 스퍼민 수준을 평가하였다. 본 발명자들의 이전에 보고된 유전자 요법 연구로부터의 CSF 샘플을 사용하여, 본 발명자들은 미치료 MPS I 고양이가 증가된 CSF 스퍼민을 나타내었다는 것을 발견하였다(도 22B)[C. Hinderer, P. Bell, B. L. Gurda, Q. Wang, J. P. Louboutin, Y. Zhu, J. Bagel, P. O'Donnell, T. Sikora, T. Ruane, P. Wang, M. E. Haskins, J. M. Wilson, Intrathecal gene therapy corrects CNS pathology in a feline model of mucopolysaccharidosis I. Molecular therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy 22, 2018-2027 (2014); 온라인 공개 EpubDec (10.1038/mt.2014.135)]. 고양이 IDUA를 발현하는 AAV9 벡터의 고 용량의 척추강내 투여는 CSF 스퍼민 수준을 정상화하였다(도 22B).
C. 논의
본 연구에서, 본 발명자들은 MPS I 개로부터의 CSF 샘플의 대사산물 프로파일링을 수행하였는데, 이는 CSF 대사체에서 상당한 질환 관련된 변경을 드러내었다. 가장 두드러진 차이는 정상 대조군과 비교할 때 스퍼민 수준이 30-배를 초과하게 높다는 것이었다. 이러한 발견은 MPS I 환자 샘플, 뿐만 아니라 MPS I의 고양이 모델 및 MPS VII의 개 모델에서 확인되었다. 스퍼민은 높은 친화도로 HS에 직접 결합하고, 스퍼민의 세포 흡수는 이러한 상호작용에 좌우된다[M. Belting, S. PERSSON, L.-A. Fransson, Proteoglycan involvement in polyamine uptake. Biochemical Journal 338, 317-323 (1999); J. E. Welch, et al, International Journal of oncology 32, 749-756 (2008)]. 세포 표면 프로테오글리칸, 예컨대, 글리피칸-1은 이의 HS 모이어티를 통해서 스퍼민에 결합할 수 있고, 글리피칸 단백질의 엔도사이토시스 후에, HS 쇄의 세포내 절단은 결합된 스퍼민을 세포로 방출한다[Belting et al, 상기에 언급됨; K. Ding, et al, The Journal of biological chemistry 276, 46779-46791 (2001); 온라인 공개 EpubDec 14]. 따라서, 무손상 HS 재순환은 스퍼민 흡수에 본질적이다. IDUA 결함으로 인한 비효율적인 HS 재순환은 이러한 스퍼민 흡수 기전을 저해할 수 있고, 세포외 스퍼민 축적으로 이어진다. 대안적으로, 세포외 GAG은 스퍼민을 격리시킬 수 있고, 세포외 분포를 선호하도록 평형을 이동시킨다. 본 연구에서 LC-MS 샘플 제조를 위해서 사용된 메탄올 단백질제거 단계는 또한 가용성 HS를 침전시키는데, 이는 CSF에서 검출된 스퍼민이 결합되지 않고, 따라서 GAG 결합이 아닌 흡수 저해는 세포외 스퍼민 축적에 책임이 있다[N. Volpi, Journal of chromatography. B, Biomedical applications 685, 27-34 (1996); 온라인 공개 EpubOct 11]. 기능성 신경 네트워크의 형성 및 유지는 신경돌기 성장 및 시냅스 형성의 정확한 제어를 필요로 한다. 발달 동안, CNS 환경은 신경돌기 형성에 대해서 상당히 저해성이 되고, 마이엘린 연관된 단백질은 성인 뇌에서 신경돌기 성장을 상당히 차단한다. 감소된 신경돌기 성장을 향한 이러한 발달 이동은 GAP43 발현에서의 감소와 병행된다[S. M. De la Monte, et al, Developmental Brain Research 46, 161-168 (1989); 온라인 공개 Epub4/1/]. MPS 뉴런에 의해서 나타나는 지속되는 GAP43 발현 및 과장된 신경돌기 증식은 저해 및 성장 촉진 신호의 이러한 정상적인 균형을 방해할 수 있고, 비정상적인 연결성 및 손상된 인지를 초래한다. HS 저장이 어떻게 신경돌기 성장에서의 이러한 증가로 이어지는지는 확립되어 있지 않다. 다수의 연구는 신경돌기 증식에서 폴리아민이 연루되었고; 축삭 돌기 손상 이후에, 스퍼민 및 이의 전구체 푸트레신 및 스퍼미딘의 합성을 위한 속도-제한 효소가 상승되고, 이는 마이엘린으로부터의 저해 신호의 존재 하에서도 향상된 신경돌기 증식을 허용한다[Cia (2002), Deng (2009), Gao (2004), 모두 상기에 인용됨]. 추가로, 푸트레신으로의 뉴런의 치료는 CSF 내로 직접 주사되는 경우, 스퍼민 합성의 저해제에 의해서 차단되는 효과인, 신경돌기 성장을 유도한다(Deng (2009), 상기에 언급됨). 폴리아민이 신경돌기 성장에 대해서 이의 효과를 발휘하는 기전은 공지되어 있지 않다. 하나의 가능한 표적은 NMDA 수용체, 스퍼민 결합에 의해서 증강되는 활성화이다(J. Lerma, Neuron 8, 343-352(1992); 온라인 공개 Epub2// (http://dx.doi.org/10.1016/0896-6273(92)90300-3)). NMDA 신호전달은 신경돌기 증식을 유도하고, 수용체의 스퍼민 민감성 소단위는 발달 동안 높게 발현된다[D. Georgiev, et al, Experimental cell research 314, 2603-2617 (2008); published online EpubAug 15 (10.1016/j.yexcr.2008.06.009); R. G. Kalb, Regulation of motor neuron dendrite growth by NMDA receptor activation. Development 120, 3063-3071 (1994); J. Zhong, et al, Journal of neurochemistry 64, 531-539 (1995). 특히 다수의 신경영양적 인자가 HS 변형된 수용체를 통해서 결합하고, 세포외 매트릭스에서의 HS와의 상호작용은 신경돌기 성장에 영향을 줄 수 있다(D. Van Vactor, et al, Current opinion in neurobiology 16, 40-51 (2006); 온라인 공개 EpubFeb]. 따라서 스퍼민 축적은 MPS I에서 비정상적인 신경돌기 성장을 촉진시키는 몇몇 인자 중 하나일 수 있다. 스크리닝된 15종의 MPS I 개 CSF 샘플 중에서, 단지 하나가 스퍼민 농도의 정상 범위에 포함되었다. 28일령에, 이것은 본 연구에 포함된 최연소 동물이었다. 이러한 발견은, 본 연구가 헐러 증후군을 갖는 유아에서 6개월령에 그것이 이미 상승된다는 것을 입증하지만, 스퍼민 축적이 연령 의존적일 수 있음을 나타낸다. 미래의 연구는 MPS 환자에서 CSF 스퍼민 수준을 종방향으로 평가한다. 스퍼민이 MPS 환자에서 연령에 따라서 증가하면, 이것은 인지 감소의 속도론을 설명하는데, 그 이유는 대부분의 환자가 발달 지연의 시작 이전에 1 내지 2년의 정상 발달을 경험하기 때문이다. 뉴런 성장을 변경하는 대사산물의 축적을 촉발하는 손상된 HS 대사에 대한 가능성은 MPS에서 효소 결핍과 비정상적인 신경돌기 성장 표현형 간의 새로운 연결을 지적하고, 이것은 이들 장애와 연관된 인지 기능장애를 설명할 수 있다. 추가 연구는 다른 MPS, 예컨대, MPS II에서 스퍼민 상승을 확인해 준다. 이러한 발견은 또한 CSF 스퍼민이 MPS를 위한 신규한 CNS-지향된 요법을 평가하기 위한 비침습적 바이오마커로서 유용함을 나타낸다. CNS 지향된 요법을 위한 미래의 임상은 인지 종점과 CSF 스퍼민에서의 변화 간의 상관관계를 평가한다.
실시예 7: CT 안내된 ICV 전달 장치
A. 사전-절차 스크리닝 평가
1. 프로토콜 방문 1: 스크리닝
정보에 입각한 동의서에 사인한 후 대상체(또는 지정된 간병인)에게 안전하게 정보를 제공하기 위해서 연구 책임자는 수조내(IC) 절차로 진행되는 스크리닝 공정, 투여 절차 자체, 및 모든 가능한 안전성 위험성을 설명한다.
하기를 수행하고, IC 절차에 대한 대상체 적격성의 이의 스크리닝 평가에서 신경방사선전문의/신경외과의사/ 마취과의사에게 제공한다: 병력, 수반된 의약, 신체 검사, 활력 징후, 심전도(ECG) 및 실험실 시험 결과.
2. 간격: 연구 방문 2에 대한 스크리닝
적격성을 검토하기 위한 적절한 시간을 허용하기 위해서, 하기 절차가 제1 스크리닝 방문과 연구 방문 2(0일) 일주일 전까지 사이의 임의의 시간에 수행된다:
Figure pct00046
가돌리늄과 함께 또는 그것 없이 머리/목 자기 공명 영상(MRI)[주석: 대상체는 가돌리늄이 제공되기에 적합한 후보자여야 함(즉, eGFR >30㎖/분/1.73㎡)]
Figure pct00047
머리/목 MRI에 더하여, 연구자는 굴/신 연구를 통해서 목의 임의의 추가 평가에 대한 필요성을 결정한다.
Figure pct00048
MRI 프로토콜은 T1, T2, DTI, FLAIR 및 CINE 프로토콜 영상을 포함한다.
Figure pct00049
머리/목 MRA/MRV는 CSF 유동의 적절한 평가 및 CSF 공간 사이에서 의사소통의 가능한 차단 또는 결여의 식별을 허용하는 제도적 프로토콜에 따름(주석: 경막내/경막경유 수술의 이력이 있는 대상체는 배제될 수 있거나 또는 추가 시험(예를 들어, 방사성뉴클레오타이드 뇌수조조형술이 필요할 수 있음).
Figure pct00050
신경방사선전문의/신경외과의사 대상 절차 평가 미팅: 3개의 위치로부터의 대표자는 모든 입수 가능한 정보(스캔, 병력, 신체 검사, 랩 등)를 기초로 IC 절차에 대해서 각각의 대상체의 적격성을 논의하기 위해서 컨퍼런스 콜(또는 웹-미팅)을 갖는다. IC 절차를 향한 행위 및 대상체에 실패한 스크린에 대한 합의를 달성하기 위해서 모든 시도를 수행해야 한다(즉, 각각의 구성원은 행해진 결정을 허용할 준비를 해야 한다).
Figure pct00051
MPS 대상체의 특별한 생리학적 요구를 명심하면서, 기도, 목(짧아짐/두꺼워짐) 및 머리 운동 범위의 상세한 평가와 함께, 마취 수술전 평가 -28일 내지 1일.
3. 1일: 컴퓨터 단층촬영 세트 및 투여를 위한 벡터 제제. IC 절차 이전에, CT 세트는 하기 장비 및 의약이 존재하는지를 확인해준다:
Figure pct00052
성인 요추 천자(LP) 키트(기관에 따라서 공급됨);
Figure pct00053
BD(벡톤 디킨슨) 22 또는 25게이지 x 3 - 7" 척추 니들(퀸케 베벨)
Figure pct00054
동축 도입기 니들(예를 들어, 18G x 3.5"), 중재자의 재량으로 사용됨(척추 니들의 도입을 위해서)
Figure pct00055
스위블(스핀) 수 루어 락을 갖는 4 웨이 스몰 보어 스탑콕
Figure pct00056
암 루어 락 어댑터를 갖는 T-연결기 연장 세트(튜빙), 대략적인 길이 6.7"
Figure pct00057
옴니파큐 180(이오헥솔), 척추강내 투여용
Figure pct00058
정맥내(IV) 투여용 아이오딘화 조영제
Figure pct00059
주사용 1% 리도카인 용액(성인 LP 키트에 제공되지 않은 경우)
Figure pct00060
사전 충전된 10cc 생리 식염수(멸균) 플러쉬 주사기
Figure pct00061
방사선불투과성 마커(들)
Figure pct00062
외과용 장비 / 면도날
Figure pct00063
삽관된 대상체의 적절한 배치를 허용하기 위한 필로/지지체
Figure pct00064
기관내 삽관 장비, 일반적인 마취 기계 및 기계적 환기
Figure pct00065
수술중 신경생리학적 모니터링(IONM) 장비(및 소요 인원)
Figure pct00066
AAV9.hIDUA 벡터를 함유하는 10cc 주사기; 별도의 약제학 매뉴얼에 따라서 CT/수술실(OR)에서 준비하고 운반됨
4. 1일: 대상체 준비 및 투여
Figure pct00067
연구 및 절차에 대해서 정보를 제공한 동의서를 의료 기록 및/또는 연구 파일 내에서 확인하고 문서화한다. 영상의학과 및 마취통증의학과 스탭으로부터의 절차를 위한 별개의 동의서를 제도적 요건에 따라서 획득한다.
Figure pct00068
연구 대상체는 제도적 가이드라인에 따라서 적절한 병원 진료 유닛 내에 놓인 정맥내 접근(예를 들어, 2개의 IV 접근 부위)을 허용한다. 정맥내 유체를 마취과의사의 재량으로 투여한다.
Figure pct00069
마취과의사의 재량으로 그리고 제도적 가이드라인에 따라서, 연구 대상체에게 적절한 환자 진료 유닛, 대기 구역 또는 수술/CT 절차 공간에서 일반적인 마취제의 투여와 함께 기관내 삽관을 유도하거나 행한다
Figure pct00070
요추 천자를 먼저 수행하여 5cc의 뇌척수액(CSF)을 제거하고, 그 다음 조영제(옴니파큐 180)를 척추강내로 주사하여 대수조의 가시화를 돕는다. 적절한 대상체 배치 조작을 수행하여 대수조 내에서 조영제의 확산을 가능하게 한다.
Figure pct00071
이미 그렇게 되지 않았으면, 수술중 신경생리학적 모니터링(IONM) 장비를 대상체에게 부착한다.
Figure pct00072
대상체를 엎드리거나 측와위 위치로 CT 스캐너 테이블 상에 놓는다.
Figure pct00073
적절하다고 생각되는 경우, 대상체를 수술전 평가 동안 안전한 것으로 결정된 정도까지 그리고 배치 후에 문서화된 정상 신경생리학적 모니터 신호를 사용하여 목 굽힘을 제공하는 방식으로 배치한다.
Figure pct00074
하기 연구 스탭 및 연구자(들)가 현장에 존재하는지 확인하고, 식별한다:
o 절차를 수행하는 중재자/신경외과의사
o 마취과의사 및 호흡기관 테크니션(들)
o 간호사 및 보조 의사
o CT(또는 OR) 테크니션
o 신경생리학 테크니션
o 현장 연구 코디네이터
Figure pct00075
두개저 하의 대상체의 피부를 적절한 경우 면도한다.
Figure pct00076
CT 스카우트 영상을 수행하고, 그 다음 표적 위치를 국한시키고, 혈관을 영상화하기 위해서 중재자가 필요하다고 판단하는 경우, IV 조영제를 사용하여 사전 절차 계획 CT를 수행한다.
Figure pct00077
표적 부위(대수조)를 식별하고, 니들 궤도를 계획한 후, 피부를 수술준비시키고, 제도적 가이드라인에 따라서 멸균 기술을 사용하여 가린다.
Figure pct00078
방사선불투과성 마커를 중재자에 의해서 제시된 바와 같은 표적 피부 위치에 놓는다.
Figure pct00079
마커 하의 피부를 1% 리도카인으로의 침투를 통해서 마취시킨다.
Figure pct00080
동축 도입기 니들을 사용하는 선택으로, 22G 또는 25G 척추 니들을 대수조를 향해서 전진시킨다.
Figure pct00081
니들 전진 후, 제도적 장비를 사용하여 실현 가능한 가장 얇은 CT 슬라이스 두께(이상적으로는 = 2.5㎜)를 사용하여 CT 영상을 수득한다. 순차적인 CT 영상은 니들 및 상응하는 연조직(예를 들어, 척추옆 근육, 골, 뇌줄기 및 척수)의 적절한 가시화를 허용하는 가능한 가장 낮은 방사선 용량을 사용해야 한다.
Figure pct00082
니들 허브 내의 CSF의 관찰 및 대수조 내의 니들 팁의 가시화에 의해서 올바른 니들 배치를 확인한다.
Figure pct00083
중재자는 벡터 함유 주사기가 멸균 필드에 가깝게, 그리나 그 외부에 배치되는지를 확인한다. 벡터를 취급 또는 투여하기 전에, 현장은 멸균 필드 내에서 절차를 돕는 스탭(멸균 필드 외부의 다른 스탭은 이러한 절차를 지킬 필요는 없음)이 장갑, 마스크 및 눈 보호기를 착용하고 있는지를 확인한다.
Figure pct00084
짧은(약 6") 연장 튜빙을 삽입된 척추 니들에 부착하고, 이어서 이것을 4-웨이 스탑콕에 부착한다. 이러한 장치가 대상체의 CSF로 "자가-프라이밍"된 후, 10cc의 사전 충전된 생리 식염수 플러쉬 주사기를 4-웨이 스탑콕에 부착할 것이다.
Figure pct00085
벡터 함유 주사기를 중재자가 취급하고, 4-웨이 스탑 콕 상의 포트에 부착한다.
Figure pct00086
스탑콕 포트를 벡터 함유 주사기에 대해서 개방한 후, 주사 동안 플런저 상에 과도한 힘이 적용되지 않도록 주의하면서, 주사기 내용물을 서서히 주입할 것이다(대략 1 내지 2분에 걸쳐서).
Figure pct00087
AAV9.hIDUA 함유 주사기의 내용물을 주사한 후, 스탑콕 및 니들 조립체가 부착된 사전 충전된 주사기를 사용하여 1 내지 2cc의 생리 식염수로 플러슁될 수 있도록 스탑콕을 돌린다.
Figure pct00088
준비된 경우, 중재자는 그/그녀가 대상체로부터 장치를 제거할 것을 스탭에게 알린다.
Figure pct00089
단일 행동으로, 니들, 연장 튜빙, 스탑콕, 및 주사기를 대상체로부터 서서히 제거하고, 폐기를 위해서 수술 트레이 상의 생물재해 폐기물 리셉터클 또는 두꺼운 용기(니들을 위해서)에 넣는다.
Figure pct00090
니들 삽입 부위를 출혈 또는 CSF 누출의 징후에 대해서 조사하고, 연구자에 의해서 제시된 바와 같이 처리한다. 부위를 제시된 바와 같이 거즈, 수술 테이프 및/또는 테가덤 드레싱을 사용하여 드레싱한다.
Figure pct00091
대상체를 CT 스캐너로부터 제거하고, 들것 상에 반드시 눕힌다.
Figure pct00092
마취를 중단하고, 마취 후 케어를 위한 제도적 가이드라인에 따라서 대상체를 케어한다. 신경생리학적 모니터를 연구 대상체로부터 제거할 수 있다.
Figure pct00093
대상체가 누워있는 들것의 머리를 회복 동안 약간 상승시켜야 한다(약 30도).
Figure pct00094
제도적 가이드라인에 따라서 대상체를 적합한 마취 후 케어 유닛으로 옮긴다.
Figure pct00095
대상체가 의식을 적절하게 회복하고, 안정적인 상태가 된 후, 그/그녀를 프로토콜 위임 평가를 위해서 적절한 장소/유닛으로 이동시킨다. 신경학적 평가가 프로토콜에 따라서 이어지며, 1차 연구자는 병원 및 연구 스탭과 공동으로 대상 치료를 감독한다.
실시예 8: 대동물에서의 척추강내 투여 경로의 평가
본 연구의 목적은 뇌실내(ICV) 주사, 및 요추 천자를 통한 주사를 비롯한, CSF 내로의 보다 일상적인 투여 방법을 평가하는 것이었다. 간략하면, 본 연구에서 ICV 및 IC AAV 투여를 개에서 비교하였다. 벡터의 두개 분포를 개선시킨다고 제안된 조치인, 주사 후 트렌델렌버그 자세로 놓인 일부 동물을 사용하여 비인간 영장류에서 벡터 투여를 요추 천자를 통해서 평가하였다. 개 연구에서, ICV 및 IC 벡터 투여는 뇌 및 척수 전체에서 유사하게 효율적인 형질도입을 초래하였다. 그러나, ICV 코호트의 동물은 아마도 이식유전자 산물에 대한 중증 T 세포 반응으로 인해서 뇌염이 발생하였다. 단지 ICV 코호트에서의 이러한 이식유전자-특이적 면역 반응의 발생은 이식유전자 발현의 부위에서 주사 절차로부터의 국지적인 염증의 존재와 관련된다고 의심된다. 비-인간 영장류(NHP) 연구에서, 요수조(lumbar cistern) 내로의 벡터 투여 후 형질도입 효율은 상당히 큰 주사 체적(대략 총 CSF 체적의 대략 40%)을 사용함으로써 본 발명자들의 이전 연구에 비해서 개선되었다. 그러나, 이러한 접근법은 IC 투여보다 여전히 덜 효율적이었다. 주사 후 동물을 트렌델렌버그로 배치하는 것은 어떠한 추가적인 이득도 제공하지 않았다. 그러나, 넓은 주사 체적은 벡터의 두개 분포를 개선시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
척추강내 AAV 전달의 효과를 최대화하기 위해서, CSF 내로의 벡터 투여의 최적의 경로를 결정하는 것이 중요할 것이다. 본 발명자들은 후두골하 천자에 의한 대수조(소뇌수뇌 수조(cerebellomedullary cistern)) 내로의 벡터 주사가 비인간 영장류에서 유효한 벡터 분포를 달성하였지만, 요추 천자를 통한 주사는 척수의 실질적으로 더 낮은 형질도입을 초래하고, 사실상 뇌에 분포되지 않았다는 것을 이미 보고하였는데, 이는 투여 경로의 중요성을 강조한다 [Hinderer, Molecular Therapy ― Methods & Clinical Development. 12/10/online 2014;1]. 다른 연구자들은, 일반적인 임상 절차인, 측뇌실 내로의 벡터 전달이 유효한 벡터 분포를 초래한다는 것을 제안하였다[Haurigot et al, J Clin Invest., Aug 2013; 123(8): 3254-3271]. 요추 천자를 통한 전달은 동물을 주사 후에 트렌델렌버그 자세로 배치하여 두개 벡터 분포를 촉진시킴으로서 개선될 수 있다는 것이 또한 보고되어 있다[Meyer et al, Molecular therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. Oct 31 2014]. 본 연구에서, 본 발명자들은 개에서 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터 유전자를 발현하는 AAV9 벡터의 뇌실내 투여 및 수조내 투여를 비교하였다. 본 발명자들은 두 경로 모두가 CNS 전체에서 유효한 분포를 달성하지만, 뇌실내 전달은 이식유전자-특이적 면역 반응의 추가적인 위험을 보유할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 NHP에서 요추 천자에 의한 벡터 전달, 및 주사 후 렌델렌버그 자세로 동물을 배치하는 것의 영향을 평가하였다. 주사후 배치의 효과는 명확하지 않았지만, 본 발명자들은 넓은 주사 체적이 벡터의 두개 분포를 향상시킬 수 있다는 것을 발견하지 못했다.
A. 물질 및 방법:
1. 벡터 생산: GFP 벡터는 닭 베타 액틴 프로모터와 거대세포바이러스 극 초기 인핸서, 인공 인트론, 향상된 녹색 형광 단백질 cDNA, 우드처크 간염 바이러스 전사 후 조절 요소, 및 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 보유하는 AAV 항원형 9 캡시드로 이루어졌다. GUSB 벡터는 닭 베타 액틴 프로모터와 거대세포바이러스 극 초기 인핸서, 인공 인트론, 개 GUSB cDNA, 및 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 보유한 AAV 항원형 9 캡시드로 이루어졌다. 이미 기술된 바와 같이 HEK 293 세포의 삼중 형질주입에 의해서 벡터를 생산하고, 아이오딕산올 구배 상에서 정제하였다[Lock et al, Human gene therapy. Oct 2010; 21(10):1259-1271].
2. 동물 실험: 모든 개를 연구에서의 동물의 보호 및 사용을 위한 미국 국립 보건원(National Institutes of Health) 및 USDA 가이드라인 하에서 펜실베니아 대학교의 수의과 대학의 인간 유전병의 동물 모델을 위한 국립 위탁 센터(National Referral Center for Animal Models of Human Genetic Disease of the School of Veterinary Medicine of the University of Pennsylvania)(NIH OD P40- 010939)에서 사육하였다.
3. NHP 연구: 본 연구는 9 내지 12년령의 6마리의 시노몰거스 원숭이를 포함하였다. 동물은 주사 시에 4 내지 8㎏이었다. 벡터(2 x 1013GC)를 주사 전에 5㎖의 옴니파큐(이오헥솔) 180 조영제 물질 중에 희석하였다. 요추 천자를 통한 벡터의 주사를 이미 기술된 바와 같이 수행하였다[Hinderer, Molecular Therapy ― Methods & Clinical Development. 12/10/online 2014;1]. 척추강내 공간 내로의 정확한 주사를 형광투시법에 의해서 확인하였다. 트렌델렌버그군의 동물의 경우, 주사 이후에 즉시 10분 동안 침대 머리를 30도 낮췄다. 안락사 및 조직 수집을 이미 기술된 바와 같이 수행하였다[Hinderer, Molecular Therapy ― Methods & Clinical Development. 12/10/online 2014;1].
4. 개 연구: 본 연구는 6마리의 1년령 MPS I 개, 뿐만 아니라 2개월령의 MPS VII 개를 포함하였다. 기준선 MRI를 모든 ICV 처리된 개에서 수행하여 주사 코디네이트를 계획하였다. 수조내 주사를 이미 기술된 바와 같이 수행하였다[Hinderer et al, Molecular therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. Aug 2015;23(8):1298-1307]. ICV 주사를 위해서, 개를 정맥내 프로포폴로 마취시키고, 기관내 삽관술을 수행하고, 아이소플루란으로의 마취 하에 유지시키고, 정위 프레임에 두었다. 피부를 멸균 처리하고, 절개를 주사 부위 상에서 수행하였다. 단일 천두(burr hole)를 주사 부위에서 드릴로 뚫고, 이를 통해서 26-게이지 니들을 미리 결정된 깊이로 전진시켰다. 배치를 CSF 복귀에 의해서 확인하였다. 벡터(1㎖ 중의 1.8 x 1013GC)를 1 내지 2분에 걸쳐서 서서히 주입하였다. 안락사 및 조직 수집을 이미 기술된 바와 같이 수행하였다[Hinderer et al, Molecular therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. Aug 2015;23(8):1298-1307].
5. 조직학: 뇌를 GFP 발현의 평가에 대해서 기술된 바와 같이 처리하였다[Hinderer, Molecular Therapy ― Methods & Clinical Development. 12/10/online 2014;1]. GUSB 효소 염색 및 GM3 염색을 이미 기술된 바와 같이 수행하였다[Gurda et al, Molecular therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. Oct 8 2015.]
6. ELISPOT: 부검 시에 혈액을 벡터 처리된 개로부터 헤파린처리된 튜브 내에 수집하였다. 말초 혈액 단핵구 세포를 피콜 구배 원심분리에 의해서 단리하였다. AAV9 캡시드 펩타이드 및 GFP 펩타이드에 대한 T 세포 반응을 인터페론 감마 ELISPOT에 의해서 평가하였다. AAV9 및 GFP 펩타이드 라이브러리를 10 아미노산 오버랩(미모토프스(Mimotopes))를 사용하여 15-머로 합성하였다. AAV9 펩타이드 라이브러리를 3종의 풀로 묶었다: 펩타이드 1 내지 50으로부터의 풀 A, 펩타이드 51 내지 100으로부터의 풀 B 및 펩타이드 101 내지 146로부터의 풀 C. GFP 펩타이드 라이브러리를 또한 3종의 풀로 묶었다. 포르볼 12- 미리스테이트 13-아세테이트 및 이오노마이신염(PMA+ION)을 양성 대조군으로 사용하였다. DMSO를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 펩타이드로 자극하고, 인터페론 감마 분비를 기술된 바와 같이 검출하였다. 반응이 백만개의 림프구당 55 초과의 스팟 형성 단위(Spots Forming Units: SFU)이고, DMSO 음성 대조군값의 적어도 3배이면, 반응을 양성인 것으로 간주하였다.
7. 생체분포: 부검 시 생체분포를 위한 조직을 즉시 드라이아이스 상에서 동결시켰다. DNA 단리 및 태크만 PCR에 의한 벡터 게놈의 정량화를 기술된 바와 같이 수행하였다[Wang et al, Human gene therapy. Nov 2011;22(11):1389-1401].
8. GUSB 효소 검정: GUSB 활성도를 기술된 바와 같이 CSF에서 측정하였다[Gurda et al, Molecular therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. Oct 8 2015].
B. 결과
1. 개에서 뇌실내 벡터 전달과 수조내 벡터 전달의 비교
I형 리소좀 저장 질환 점액다당류증(MPS I)의 개 모델을 사용한 본 발명자들의 이전 연구는, 대수조 내로의 AAV9 주사가 전체 뇌 및 척수를 유효하게 표적화할 수 있다는 것을 입증하였다[Hinderer et al, Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. Aug 2015;23(8):1298-1307]. 본 연구에서, 본 발명자들은 성인 MPS I 개에서 대수조 또는 측뇌실로 투여된 GFP 리포터 유전자를 발현하는 AAV9 벡터의 분포를 ㅣㅂ교하였다. 3마리의 개를 대수조 내로의 단일 1㎖ 주사의 벡터(1.8 x 1013 게놈 카피)로 처리하였다. 3마리의 추가적인 개에게 측뇌실 내로의 동일한 벡터의 단일 벡터 주사를 제공하였다. ICV 주사에 의해서 처리된 개를 위해서, 기준선 MRI를 수행하여 주사를 위해서 더 큰 측뇌실을 선택하고, 표적 코디네이터를 한정하였다. 지정된 뇌실 주사를 정확하게 표적화하는 정위 프레임을 사용하여 뇌실 주사를 수행하였다.
IC 벡터 주사로 처리된 3마리의 개는 연구 전체에서 건강한 것으로 보였다. 이들을 벡터 생체분포 및 이식유전자 발현의 평가를 위해서 벡터 주사 2주 후에 안락사시켰다. 어떠한 IC 처리된 개에서도 어떠한 전체 또는 현미경 뇌 병변이 관찰되지 않았다(도 12A 내지 12F). 정량적 PCR에 의한 벡터 게놈의 측정은 뇌 및 척수의 모든 샘플링된 영역에 걸쳐서 벡터 침착을 나타내었다(도 13). 벡터 게놈의 분포와 일치되게, 견고한 이식유전자 발현이 대뇌 피질의 대부분의 영역뿐만 아니라 척수 전체에서 검출 가능하였다(도 14A 내지 14H). 척수 조직학은 알파 운동 뉴런의 강한 형질도입에 주목할 만하며, 형질도입의 구배는 흉부 및 요추 분절을 선호한다.
ICV 주사된 벡터로 처리된 3마리의 개는 절차 이후에 초기에는 건강해 보였다. 그러나, 1마리의 동물(I-567)이 주사 12일 후에 죽은 것을 발견하였다. 다른 2마리의 동물은 지정된 14일 부검 시점에 살아남았지만, 1마리의 동물(I-565)은 안락사 전에 혼수상태였고, 나머지(I-568)는 안면 근육의 약호를 나타내기 시작하였다. 3가지의 임상적 발견은 상당한 전체 뇌 병변과 상관관계가 있었다(도 12A 내지 12F). 3마리 동물 모두로부터의 뇌는 니들 트랙 주변에서 착색을 나타내었고, 죽은 것으로 발견된 동물에서 출혈과 연관되었다. 조직학적 평가는 주사 부위 주변 영역에서 중증 림프구성 염증을 드러내었다. 혈관주위 림프구성 침투가 또한 각각의 동물의 뇌 전체에서 관찰되었다(도 12G 및 12H). 면역학적 독성에 대한 이러한 증거를 고려하여, AAV9 캡시드 단백질 및 GFP 이식유전자 둘 모두에 대한 T 세포 반응을 부검 시에 ICV-치료된 개 중 1마리(I-565)로부터 수집된 말초 혈액 샘플에서 평가하였다. 인터페론 감마 ELISPOT는 GFP에 대해서 지향된 강한 T 세포 반응을 나타내었으며, 캡시드 펩타이드에 대한 반응의 증가는 없었다(도 12I). 이는, 관찰된 뇌염이 이식유전자 산물에 대한 세포-매개된 면역 반응에 의해서 유발되었다는 것을 시사한다.
ICV 처리된 동물에서의 벡터 분포는 IC 처리된 군에서 관찰된 것과 유사하였지만, 척수 형질도입은 IC 코호트에서 다소 더 높았다(도 13). GFP 발현은 ICV 처리된 동물에서 조사된 CNS 영역 전체에서 관찰되었다(도 14A 내지 14H).
2. NHP에서 요추 천자에 의한 AAV9 투여 후 CNS 형질도입에 대한 트렌델렌버그 자세의 영향
본 발명자들은 이미 NHP의 대수조 또는 요수조 내로의 AAV9 주사를 비교하였고, 요추 경로가 척수를 표적화하는 데 10-배 덜 효율적이고, 뇌를 표적화하는데 100-배 덜 효율적이라는 것을 발견하였다[C. Hinderer, et al, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 12/10/online 2014;1]. 다른 연구자들은 이후에 요추 천자에 의한 AAV9 투여를 사용하여 보다 양호한 형질도입을 입증하였고, 벡터의 두개 분포에서의 개선은 동물을 주사 후에 트렌델렌버그 자세로 배치함으로써 달성되었다[Myer et al, Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. Oct 31 2014]. 이러한 접근법에서, 벡터를 과량의 체적의 조영제 물질 중에 희석시켜 용액의 밀도를 증가시키고, 트렌델렌버그 동안 중력 유도된 분포를 촉진시켰다. 6마리의 성인 시노몰거스 원숭이를 L3 내지 4 인터스페이스에서 GFP를 발현하는 AAV9(2 x 1013게놈 카피)의 단일 주사로 처리하였다. 벡터를 이오헥솔 180 조영제 물질 중에 5㎖의 최종 체적으로 희석하였다. 동물 중 4마리를 주사 직후 10분 동안 -30° 각도로 절차 테이블의 머리 부분에 놓았다. 10분 후, 형광투시 영상을 캡처하여 CSF에서 조영제 분포를 입증하였다. 특히 이러한 넓은 주사 체적(동물의 총 CSF 체적의 대략 40%)[Reiselbach et al, New England Journal of Medicine. 1962;267(25):1273-1278]을 사용하면, 조영제 물질은 트렌델렌버그 자세로 배치되지 않은 동물에서도 전체 척추 지주막하 공간을 따라서 기저 뇌조(basal cistern)로 신속하게 분포하였다(도 16A 및 16B). PCR에 의한 벡터 게놈 분포의 분석법(도 17) 및 GFP 발현(도 18A 내지 18H)은 뇌 및 척수 전체에서 형질도입을 입증하였다. 형질도입된 세포의 수 또는 분포에 대한 주사 후 배치의 영향은 명확하지 않았다. 이미 보고된 바와 같이, 척추강내 AAV 투여 후 말초로의 벡터 탈출 및 간 형질도입이 존재하였다[Hinderer et al, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 12/10/online 2014;1; Haurigot et al, Journal of Clinical Investigation. Aug 2013;123(8):3254-3271]. 간 형질도입의 양은 AAV9에 대한 미리 존재하는 중화 항체(nAb)의 존재에 존재에 좌우되었다. 6마리의 동물 중 4마리는 검출 가능한 기준선 AAV9 nAb를 갖지 않았고(역가 <1:5), 2마리의 동물(4051 및 07-11)은 AAV9에 대한 검출 가능한 미리 존재하는 항체를 갖지 않았고, 역가는 1:40이었다. 이전 결과와 일치되게, 미리 존재하는 항체는 간 형질도입을 차단하였고, 비장으로의 벡터 분포를 증가시켰다[Wang et al, Human gene therapy. Nov 2011;22(11):1389-1401, but had no impact on CNS transduction; Haurigot et al, Journal of Clinical Investigation. Aug 2013;123(8):3254-3271].
C. 논의
후두골하 천자는 임상 실시에서 일반적인 절차가 아니기 때문에, 본 발명자들은 측뇌실 및 요수조를 비롯한, CSF 접근의 보다 일상적인 부위를 평가하였다. 여기서 본 발명자들은 요추 영역으로부터 두개로의 벡터 분포를 향상시키기 위해서 더 높은 밀도를 갖는 벡터 용액 및 주사 후 트렌델렌버그 자세를 사용하는 방법을 평가하였다.
개 연구에서, IC 및 ICV 벡터 주사 둘 모두는 유사하게 유효한 벡터 분포를 생성하였지만, 뇌염은 ICV군에서만 발생하였다. GFP 이식유전자에 대한 T 세포 반응은 ICV 처리된 개 중 1마리에서 검출 가능하였는데, 이는 이들 동물에서 관찰된 림프구성 뇌염이 이식유전자-특이적 면역 반응으로 인한 것이었음을 시사한다. 새로운 항원에 대한 T 세포 반응의 유도는, 2가지 요소―미경험 T 세포에 의한 단백질로부터의 에피토프의 인식, 및 T 세포의 활성화를 촉진시키는 염증성 "위험 신호"를 필요로 한다. AAV는 이식유전자 산물에 대해서 면역을 도출하지 않으면서 외부 이식유전자를 발현할 수 있다고 여겨지는데, 이는 그것이 선천적인 면역계를 활성화시키지 않아서, 염증성 신호를 회피하고, 미경험 림프구가 새로 발현된 항원을 만날 때 면역보다는 관용을 촉진시키기 때문이다. 외부 이식유전자 산물이 발현되는 동일한 위치에서 일어나는, 뇌 실질을 관통하는 외상에 의해서 유발된 국지 염증은 이식유전자 산물에 대한 면역 반응을 유도하는 데 필요한 위험 신호를 제공할 수 있다. 이는 MPS I 개에서의 이전 연구에 의해서 뒷받침되는데, 이것은 직접 뇌 주사에 의해서 전달된 AAV 벡터로부터 발현된 효소에 대해서 세포-매개된 면역 반응을 발생시키지만, IC 주사에 의해서는 그렇지 않다[Ciron et al, Annals of Neurology. Aug 2006;60(2):204-213; Hinderer, et al, Molecular therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. Aug 2015;23(8):1298-1307]. 이러한 면역 반응에 대한 가능성은, 주사에 의해서 유발된 염증성 반응이 자가-단백질에 대한 관용을 파괴하지 않을 수 있더라도, 이식유전자 산물이 내인성으로 또한 생산된 단백질을 발현하는 벡터의 전달에 대해서 이물로서 인식되는지의 여부에 좌우된다. MPS VII 개에서 ICV 벡터 전달의 연구에서의 결과는 이러한 개념을 뒷받침하는데, 그 이유는 내인성 단백질에 대한 이식유전자 산물의 유사성이 GFP에 대해서 관찰된 T 세포 반응의 유형의 부재에 대한 책임이 있을 가능성이 있었기 때문이다. 이는 이식유전자 산물과 유사한 단백질의 생산을 허용하는 미스센스 돌연변이를 보유하는 열성 질환을 갖는 환자에서 사실일 수 있다. 따라서, 면역의 위험은 환자 집단 및 이식유전자 산물에 따라서 달라질 수 있고, 일부 경우에, 면역억제는 이식유전자에 대한 파괴적인 T 세포 반응을 예방하는 것이 필요할 수 있다. 본 발견은, 유해한 면역 반응의 위험은 ICV 투여 경로가 아닌 IC를 사용함으로써 완화될 수 있다는 것을 시사한다.
NHP에서 요추 천자를 통한 AAV9 투여의 연구는 본 발명자들이 이러한 투여 경로에서 이미 발견한 것보다 CNS 전체에서 더 높은 형질도입을 나타내었다. 이러한 차이는 본 연구에서 넓은 주사 체적으로 인한 것일 것인데, 이것은 조영제 물질의 과량의 체적 중에 벡터를 희석하기 위해서 필요하였다. 이전 연구는 이러한 넓은 체적 주사(CSF 체적의 대략 40%)가 주입된 물질을 기저 뇌조, 및 심지어는 마카크의 뇌실 CSF 내로 직접 안내할 수 있다는 것을 나타내었다[Reiselbach, 상기에 언급됨]. 이러한 접근법은 환자에게 일상적으로 투여되지 않는 상당히 넓은 주사 체적(60㎖ 초과)을 필요로 할 것이라는 것을 고려할 때, 이러한 접근법을 인간에 대해서 해석할 가능성은 불명확하다. 더욱이, 이러한 고 체적 접근법을 사용하더라도, 요추 천자를 통한 주사는 IC 전달을 사용한 이전 결과보다 덜 효율적이었다. 이러한 이전 연구에서, 동물에게 중량 기준으로 투여하였고, 단지 하나의 동물에게 여기서 사용된 것과 동등한 IC 벡터 용량을 제공하였다[Hinderer, et al, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 12/10/online 2014;1]. 그 동물은 뇌 및 척수에서 평균 3-배 더 높은 벡터 분포를 가졌는데, 이는 심지어는 요수조로의 매우 넓은 체적 벡터 전달도 IC 전달보다 덜 효율적이라는 것을 나타낸다. 문헌에서의 보고와 상반되게, 본 발명자들은 요추 벡터 주사 이후에 동물을 트렌델렌버그 자세로 배치하는 것의 추가적인 이점을 발견하지 못했다[Meyer et al, Molecular therapy : the Journal of the American Society of Gene Therapy. Oct 31 2014].
함께 이러한 발견은, 대수조의 수준에서의 벡터 투여를 뒷받침하는데, 그 이유는 이러한 접근법이 요추 천자를 통한 투여보다 더 효율적인 벡터 분포를 달성하고, ICV 투여보다 이식유전자 산물에 대한 면역의 위험을 덜 보유하는 것으로 보이기 때문이다. 대수조로의 벡터 전달은 전임상 연구에서 사용된 후두골하 천자 접근법을 사용하여 임상적으로 수행될 수 있었다. 추가로, 측면 접근법(C1-2 천자)을 사용한 제1 경추와 제2 경추 사이의 지주막하 공간 내로의 주사는 대수조에 대해서 주사 부위의 근접성이 제공되면 유사한 벡터 분포를 생성할 가능성이 있다. C1-2 접근법은, 후두골하 천자와 달리, 그것이 CSF 접근, 특히 척추강내 조영제 투여를 위해서 임상적으로 널리 사용된다는 추가적인 이점을 갖는다.
실시예 9: 레서스 마카크에서 척추강내로 주사된 AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBG의 비-임상적인 약리학/독성학 연구
인간 투여를 위한 최소 효능 용량(MED)을 초과하는 적절한 안정역을 수득하기 위해서, 레서스 마카크에서, 인간 IDS를 암호화하는 벡터인 AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBG의 2개의 용량의 척추강내 투여의 안전성을 평가하기 위해서 설계된 연구를 수행한다.
대조품을 후두골하 천자를 통해서 군 1로 무작위화된 단일 마카크에게 투여한다. 시험품을 후두골하 천자를 통해서 군 2 내지 3으로 무작위화된 6마리의 레서스 마카크에게 투여한다. 군 2의 마카크에게 시험품을 5x1013게놈 카피(GC)의 고 용량으로 제공하고(N=3); 군 3의 마카크에게 시험품을 1.7x1013GC의 저 용량으로 제공한다(N=3). 혈액 및 뇌척수액을 일반적인 안전성 패널의 부분으로서 수집한다.
벡터 투여 후 90 ± 3일에 이들 연구의 생존 단계가 끝난 후에, 마카크를 부검하여, 포괄적인 조직병리학 검사를 위해서 조직을 수거하였다. 림프구를 간, 비장, 및 골수로부터 수거하여 부검 시기에 이들 기관에서 세포독성 T 림프구(CTL)의 존재를 조사한다.
I. 실험 설계
A. 물질
시험품 - AAV9.CB7.hIDS는 AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBG라고도 공지되어 있고, AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBG.KanR라고도 공지되어 있다. 이러한 명칭은 동의어이고, 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
드로플렛 디지털(dd) PCR에 의해서 측정하는 경우 5.72 x 1013GC/㎖의 농도를 갖는 단일 롯트로 생산된 시험품을 사용한다. 벡터를 생산 후에 주사일까지 -60℃ 이하에서 저장한다. 주사일에, 벡터를 대조품으로 희석한다. 희석 후, 벡터를 주사 시간까지 냉장고에서 2 내지 4℃에서 저장하거나 젖은 얼음 상에 저장한다. 벡터 제조를 주사일에 수행한다.
대조군 동물에게 대조품 엘리엇츠 제형 완충액(Elliot's Formulation Buffer: EFB)을 투여하고, 시험품(EFB + 0.001% 플루로닉 F68)을 투여하지 않는다. 대조품을 생산 후에 그리고 주사일까지 실온에 저장한다.
B. 시험 시스템
시험 시스템 선택에 대한 타당한 이유: 본 연구는 CNS 질환을 위한 유전자 요법 벡터의 척추강내(IT) 전달을 포함한다. 비-인간 영장류(NHP)에서의 CNS의 치수는 본 발명자들의 임상 표적 집단의 가장 우수한 대표적인 모델로서 작용한다. 본 연구는 IT 주사 후 벡터의 용량-관련 독성에 대한 데이터를 제공한다.
코반스 리서치 프로덕츠, 인크.(Covance Research Products, Inc.)(미국 텍사스주 앨리스 소재)에서 공급된 체중이 3 내지 10㎏인 일곱(7)마리의 3 내지 7세 수컷 마카카 물라타(마카카 물라타)(레서스 마카크)를 사용한다.
II. 일반적인 설계 절차
7마리의 레서스 마카크(수컷)를 본 연구에서 사용한다. 동물을 표 1에 열거된 3개의 연구군으로 나눈다. 모든 7마리의 동물에게 후두골하 천자를 통해서 IT 주사를 제공한다.
Figure pct00096
동물을 마취시키고, 후두골하 천자를 통해서 대수조 내로 시험품을 투여한다.
마취시킨 마카크를 처치실에서 준비시키고, 형광투시법 공간으로 이동시키고, 측와위 위치로 영상 테이블 상에 배치하고, CSF 수집 및 대수조 내로의 투여를 위해서 머리를 앞으로 굽힌다. 주사 부위를 무균성으로 준비한다. 무균 기술을 사용하여, 21 내지 27게이지, 1 내지 1.5인치 퀸케 척추 니들(벡톤 디킨슨)을 CSF의 유동이 관찰될 때까지 후두골하 공간으로 전진시킨다. 최대 1.0㎖의 CSF를 기준선 분석법을 위해서 투여 전에 수집한다. 횡단 해부 구조는 피부, 피하 지방, 경막외 공간, 경막 및 환추후두 근막(atlanto-occipital fascia)을 포함한다. 니들을 대수조의 더 넓은 상부 갭에 안내하여 혈액 오염 및 잠재적인 뇌줄기 손상을 회피한다. 니들 천자의 정확한 배치를 형광투시기(OEC9800 C-Arm, GE)를 사용하여 척수조영술를 통해서 확인한다. 형광투시기를 제조사의 설명서에 따라서 조작한다. CSF 수집 후, 루어 접근 연장 카테너를 척추 니들에 연결하여 이오헥산알(상표명: 옴니파큐 180㎎/㎖, 제너럴 일렉트릭 헬쓰케어(General Electric Healthcare)) 조영제 매질 및 시험품 또는 대조품의 투여를 용이하게 한다. 일(1)㎖의 이오헥솔을 카테터 및 척추 니들을 통해서 투여한다. 니들 배치를 확인한 후, 시험품(1mL에 동등한 체적 + 주사기 및 링커 데드 공간의 체적)을 함유한 주사기를 가요성 링커에 연결하고, 20 내지 60초에 걸쳐서 서서히 주사한다. 니들을 제거하고, 직접 압력을 천자 부위에 가한다. 주사 장치에 남아있는 잔류하는 시험품을 수집하고, -60℃ 이하에서 저장한다.
동물에게 대수조로 성공적으로 투여할 수 없는 경우, C1-C2 척추강내 공간(환축 관절(atlanto-axial joint)) 내로의 투여를 대안적인 투여 부위로서 사용할 수 있다. 투여 절차는 하기와 같다. 동물을 측와위 위치로 배치하고, CSF 수집 및 C1-C2 척추강내 공간 내로의 투여를 위해서 머리를 앞으로 굽힌다. 주사 부위를 무균성으로 준비한다. 무균 기술을 사용하여, 21 내지 27게이지, 1 내지 1.5인치 퀸케 척추 니들(벡톤 디킨슨)을 CSF의 유동이 관찰될 때까지 척추강내 공간으로 전진시킨다. 최대 1.0㎖의 CSF를 기준선 분석법을 위해서 투여 전에 수집한다. 횡단 해부 구조는 피부, 피하 지방, 경막외 공간, 경막 및 근막을 포함한다. 혈액 오염 및 경부 척수에 대한 잠재적인 손상을 회피하기 위해서 니들을 C2 척추 상부의 척추 공간에 삽입한다. 나머지 절차는 대수조 투여에 대해서 이미 기술된 것과 유사하다.
동물에게 AAV9.CB7.hIDS 또는 대조품 중 어느 하나의 척추강내 주사를 제공한다. 투여 빈도를 표 3에 제공한다. 고 용량의 AAV9.CB7.hIDS는 5x1013GC이고, 저 용량은 1.7x 1013GC이다. 마카크당 주사될 희석된 AAV9.CB7.hIDS 또는 대조품의 총 체적은 1㎖이다.
III. 결과
CSF에서 백혈구 계수치로서 나타난 바와 같이 CSF 플레오사이토시스가 고-용량 처리군(군 2)에서는 3마리의 동물 중 2마리에서 관찰되었고, 저-용량 처리군(군 3)에서는 3마리의 동물 중 1마리에서 발견되었다(도 28). 이러한 플레오사이토시스는 모든 동물에서 90일에 해결되었지만, 1마리의 고-용량 처리된 동물(RA 2203)에서는 해결되지 않았다.
또한, 등쪽 기둥 축삭병(dorsal columns axonopathy)이 존재한다(데이터 나타내지 않음).
현재 저 용량은 1.9 x 1011GC/g 뇌 중량에 상응하고, 이것은 제안된 임상 고 용량, 9.4 x 1010GC/g 뇌 중량에 근접한다. 현재 고 용량은 5.6 x 1011GC/g 뇌 중량에 상응하고, 이것은 임상 용량의 대략 5배이다.
항-hIDS 항체의 ELISA 검정을 상기에 기술된 동물로부터 수집된 혈청 샘플 상에서 수행하였다. 60일에 얻은 결과를 도 29에 플롯팅하고, 하기 표 2에 나타내었다. CSF 샘플을 항-hIDS 항체의 ELISA 검정을 통한 평가를 위해서 20배로 희석하였다. 결과를 표 3에 나타낸다. 혈청 및 CSF 둘 모두에서 감소된 면역원성이 고-용량군(군 3)과 비교할 때 저-용량 처리군(군 2)에서 관찰되었다. 미처리 대조군에서는 hIDS에 대해서 어떠한 면역원성도 관찰되지 않았다.
Figure pct00097
Figure pct00098
실시예 10: 면역억제된 레서스 마카크에서 척추강내로 투여된 AAV9.CB7.hIDS의 비임상적인 약리학/독성학 연구
레서스 마카크에서, 인간 IDS를 암호화하는 벡터인 AAV9.CB7.hIDS의 2개의 용량의 척추강내 투여의 안정성에 대한 화학적으로 유도된 면역억제(IS)의 영향을 평가하기 위해서 설계된 연구를 수행한다. 연구는 실시예 9에 기술된 바와 같고 변형은 하기에서 주목한다.
대조품 투여된 동물을 실시예 9에서와 같이 반복한다. 시험품을 후두골하 천자를 통해서 군 1 내지 2로 무작위화된 6마리의 레서스 마카크에게 투여한다. 군 1의 마카크에게 시험품을 5x1013게놈 카피(GC)의 고 용량으로 제공하고(N=3); 군 2의 마카크에게 시험품을 1.7x1013GC의 저 용량으로 제공한다(N=3). 혈액 및 뇌척수액을 일반적인 안전성 패널의 부분으로서 수집한다. 군 1 및 2로부터의 원숭이에게 AAV9.CB7.hIDS 투여 적어도 2주 전에 그리고 투여 후 60일(60일 포함)까지 마이코페놀레이트 모페틸(MMF)을 제공하였고, 투여 적어도 2주 전에 그리고 투여 후 90일(+/- 3일)(90일(+/- 3일) 포함)까지 라파마이신을 제공하였다. 두 면역억제 약물 모두에 대한 혈장 트로프 수준을 모니터링하고, 마이코페놀레이트산(MPA, MMF의 활성 대사산물)의 경우 2 내지 3.5㎎/L 및 라파마이신의 경우 10 내지 15㎍/L의 범위를 유지하도록 용량을 조정한다.
벡터 투여 후 90 ± 3일에 이들 연구의 생존 단계가 끝난 후에, 마카크를 부검하여, 포괄적인 조직병리학 검사를 위해서 조직을 수거하였다. 림프구를 혈액, 비장, 및 골수로부터 수거하여 부검 시기에 이들 조직에서 세포독성 T 림프구(CTL)의 존재를 조사한다.
A. 물질
시험품, 대조품, 이의 제제는 실시예 9에 기술되어 있다.
B. 시험 시스템
마카카 물라타(레서스 마카크)를 사용하고, 실시예 9에 기술된 바와 같이 유지시킨다. 6마리의 동물(6마리의 수컷)의 코호트를 연구를 위해서 사용한다. 동물을 최저 ID에서 최고까지 1 내지 6의 번호로 배정한다. 번호 1 내지 6의 무작위 목록을 random.org에 의해서 생성하고, 랜덤화한 후, 동물을 하기와 같은 순서로 배정한다: 군 1에 3마리의 동물을 배정하고; 군 2에 3마리의 동물을 배정한다.
C. 일반적인 설계 절차
샘플 크기 및 군 명칭:
6마리의 레서스 마카크를 연구에서 사용한다. 동물을 표 4에 열거된 2개의 연구군으로 나눈다. 모든 6마리의 동물에게 후두골하 천자를 통해서 IT 주사를 제공한다.
Figure pct00099
면역억제 요법을 군 1 및 2의 모든 동물에게 투여한다. 동물 각각의 군을 위한 약물 조합물, 용량, 및 투여 스케줄을 표 5에 요약한다. 동물을 전신 항생제 및/또는 항진균제로 처리하여 이것이 일어난 경우 면역억제와 연관된 기회감염균 감염을 치료할 수 있다.
동물에게 마이코페놀레이트 모페틸(MMF) 및 라파마이신의 병용 요법을 투여한다. 면역억제 약물 둘 모두를 입위 공급관 또는 코위 공급관을 통해서 마취되거나 또는 의자에 억제된 의식이 있는 마카크에게 투여한다. 마취된 동물을 관으로부터의 위 내용물의 흡입을 허용하기 위해서 금식시키지 않는다(정확한 배치 확인). 면역억제 요법을 시험품의 척추강내 투여 적어도 2주 전에 시작한다. IS 약물의 시작 용량은 다른 연구를 위해서 GTP에서 이전에 사용된 용량으로, 레서스 마카크에서 이미 기술된 효능을 기초로 하고, 수준 모니터링을 통해서 혈장에 대해서 조정한다.
면역 억제 제1일에 동물의 중량을 사용하여 초기 용량을 계산한다. 이어서, 동물을 매일 아침에 체중을 제고, 체중 변화가 +/- 10 %를 초과하면 용량을 다시 계산한다.
트로프 수준을 초기에는 주당 2회, 그리고 60일 후에는 주 1회 모니터링한다(라파마이신 단독이 투여될 경우).
Figure pct00100
c. IS 약물
라파마이신을 척추강내 투여 최소 14일 전에 그리고 연구 90일(+/- 3일)(90일(+/- 3일) 포함)까지 0.5 내지 4㎎/㎏ PO, SID의 용량으로 투여한다. 시작 용량은 1㎎/㎏이다. 라파마이신 용량을 계산하여 연구 기간 동안 가능한 10 내지 15㎍/L에 가깝게 표적 트로프 수준을 유지시킨다. 표적 트로프 약물 수준이 1주 이내에 달성되지 않으면, 용량을 0.25 내지 2㎎/㎏ 용량 간격으로 적정한다. 안정화 기간 후, 트로프 수준이 2회의 연이은 채혈 동안 너무 낮으면, 조정한다. 이것이 너무 높으면, 즉각적인 조정을 수행한다.
MMF를 척추강내 투여 최소 14일 전에 그리고 연구 60일(60일 포함)까지 50㎎/㎏ PO, BID의 시작 용량으로 투여한다. 이어서, 트로프 수준 결과를 사용하여 용량을 조정하고, 이것을 5 내지 25㎎/㎏ 용량 간격으로 적정한다. MPA에 대한 트로프 수준을 가능한 2 내지 3.5㎎/L에 가깝게 유지시킨다. 안정화 기간 후, 트로프 수준이 2회의 연이은 채혈 동안 너무 낮으면, 조정한다. 이것이 너무 높으면, 즉각적인 조정을 수행한다.
d. IS 약물의 제형
MMF를 200㎎/㎖의 농도로 상업적으로 입수 가능한 경구 용액을 사용하여 시험 시스템에 경구로 투여한다.
라파마이신을 하기 상업적으로 입수 가능한 제형 중 하나 이상을 사용하여 시험 시스템에 경구로 투여한다: 0.5㎎의 코팅 정제; 1㎎의 코팅 정제; 2㎎의 코팅 정제.
환제 제형으로 투여되는 경우, 정제를 하기와 같이 제조한다:
각각의 라파마이신 환제를 실온수 또는 온수 중 어느 하나의 희석액 중에 넣어(필요한 경우 온소룰 사용하여 용해를 가속화함) 정제의 외부 코팅을 용해시킨다. 대략 10㎖의 물을 사용한다. 환제는 황색 코팅 하에 백색이다.
외부 코팅이 용해되면, 각각의 환제를 막자사발을 사용하여 미세한 분말이 될 때까지 분쇄하여, 균일한 용액을 생성한다. 정제(들)를 용해하는 데 사용된 희석액의 총 체적을 연구 보고서에 기록한다.
총 혼합물을 투여 주사기를 통해서 배출시키고, 본 실험에 이미 기술된 바와 같이 OG 또는 NG관을 통해서 투여한다.
MMF 및/또는 라파마이신의 투여 이후에, 입위 또는 코위 공급관을 식수로 플러슁한다. 플러쉬의 체적을 연구 보고서에 기록한다.
하기 연구를 수행하여 MPS II 마우스에서 AAV9.CB7.CI.hIDS의 뇌실내(ICV) 전달의 효능을 평가하고, 최소 유효량을 결정하였다. 효능은 벡터에 대한 약력학적 반응(gene비n of 효소ally active hIDS 단백질)의 증거 및 MPS II 질환(IDS 결함)의 행동 및 조직학적 양상에 대한 효과를 기초로 한다.
실시예 11: MPS II의 마우스 모델에서 뇌실내 AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG의 효능
I. 요약
헌터 증후군, II형 점액다당류증(MPS II)은, 글리코사미노글리칸(GAG) 더마탄 및 헤파란 설페이트의 리소좀 이화작용에 관여된, 효소 이두로네이트-2-설페이타제(IDS)의 결함에 의해서 유발되는 X-연관된 유전 장애이다. 이러한 결함은 절단되지 않은 GAG의 세포내 축적, 및 결국 진행형 중증 임상 표현형으로 이어진다. 유전자 요법 및 체세포 요법을 비롯한, 장애를 위한 가능한 치료 전략을 식별하기 위해서 지난 20 내지 30년 동안 다수의 시도가 수행되었다. MPS II의 뮤린 모델에서, 인간 IDS를 발현하는 AAV9 벡터인, AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG의 단기간(21일) 생체분포, 발현, 및 단일 뇌실내(ICV) 투여의 활성도를 평가하기 위해서 연구를 수행하였다. MPS II의 뮤린 모델에서, 주사(pi) 후 3개월 관찰 기간으로, 단일 용량으로서 ICV 경로를 통해서 투여된 AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG의 최소 유효량(MED)을 결정하기 위해서 추가 연구를 설계하고 수행하였다. 연구는 또한 일부 안전성 종점(이식유전자 및 뇌 조직병리학의 체액성 면역 반응의 평가)을 포함하였다.
AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG를 0일에 뇌실내로 2내지 3개월령의 C57BL/6 IDS γ/-(MPS II) 마우스(16마리 수컷/군)에게 3x108GC 또는 3x109GC 또는 3x1010GC(벡터의 qPCR 역가에 의해서 결정됨)의 용량으로 투여하였다. 21일에, 군 3 내지 5로부터의 마우스(표 6)를 CNS IDS 활성도, 생체분포 및 항-hIDS 면역원성의 평가를 위해서 안락사시키고, 부검하였다. 60일과 89일 사이에, 야생형 마우스 및 미처리 MPS II 마우스를 일련의 신경행동학적 검정(오픈 필드, Y-미로, 공포 상황 조건화 및 신규 물체 인식)으로 평가하여 이들 종점에 대한 질환 상태의 효과를 특징규명하였다. 이러한 초기 검정의 결과를 기초로, 나머지 처리된 마우스를 장기간 기억력(공포 상황 조건화 및 신규 물체 인식)을 평가한 2가지 검정으로 평가하였다. AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG의 ICV 투여 대략 3개월 후에, 모든 남아있는 마우스를 안락사시키고, 부검하였다. IDS 활성도에 대해서 혈청 및 CSF를 평가하였고, 뿐만 아니라 항-IDS 항체에 대해서 혈청을 평가하였다. 간 및 심장을 GAG 조직 함량에 대해서 평가하였다. 뇌 전체 리소좀 저장(1차 GAG 저장 및 2차 강글리오사이드 저장)을 LIMP2 및 GM3의 면역조직화학 염색에 의해서 평가하였다. 조직 헥소스아미니다제 수준은 MPS II 마우스 및 MPS II 환자에서 더 높고, 리소좀 항상성 붕괴의 바이오마커인 것으로 나타났다. 따라서 조직 헥소스아미니다제 효소 활성도를 AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG 투여에 대해서 부수적인 리소좀 기능의 바이오마커로서 측정하였다. 뇌의 조직병리학을 평가하여 효능 및 안전성 둘 모두를 조사하였다.
Figure pct00101
C57BL/6 IDS γ/-(MPS II) 마우스에 최대 3x1010GC(ddPCR 방법에 의해서 5.2x1010GC)로 AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG를 ICV 투여하는 것은 널리 용인되었으며, 어떠한 임상적 징후 또는 사망률도 없었고, CNS뿐만 아니라 말초 조직, 특히 간으로의 분포를 초래하였고, 따라서 CSF로부터 말초 혈액으로의 주사된 바이러스 입자의 부분적인 재분포를 예증하였다.
21일에 뇌에서 그리고 pi 3개월에서 CSF에서의 벡터의 검출 및 IDS 활성도의 용량 의존적인 증가에 의해서 입증된 바와 같이 뇌에서의 IDS 유전자 발현의 증거가 존재하였고, 효소 활성도는 최고 용량(뇌 조직)에서 야생형 수준과 유사하였고, 중 용량 및 고 용량(CSF)에서 야생형보다 더 높은 수준에 대등하였다. pi 3개월의 모든 용량에서 CNS에서 LIMP2 및 GM3 염색에서의 감소에 의해서 나타난 바와 같이, 리소좀 컴파트먼트의 용량 의존적인 정상화가 존재하였다. H&E 염색된 뇌 단편에서, 신경교 액포화(glial vacuolation) 및 MPS II CNS 표현형의 지시인자인 양염색성 물질의 뉴런 축적의 양 및 빈도에서 용량 의존적인 감소가 또한 관찰되었다. H&E 염색된 단편에서 CNS 리소좀 함량의 변화 및 질환-관련된 모폴로지의 개선에 상응하게, 장기간 기억력의 하나의 척도(신규 물체 인식, NOR)가 개선되었지만, 나머지 공포 상황 조건화(CFC)는 개선되지 않았다. 어떠한 명확한 용량 반응도 NOR의 개선에서 나타나지 않았다.
혈청 IDS 활성도에서의 용량 의존적인 증가가 또한 pi 3개월에서 관찰되었고, 효소 활성도는 중 용량 및 고 용량에서 야생형과 대등하거나 또는 이보다 더 높았다. 혈청에서 IDS 활성도의 정상화를 반영하여, 처리된 MPS II 마우스는 간 및 심장에서 헥소스아미니다제 활성도 및 GAG 함량에서 용량 의존적인 감소를 가졌다. 간 헥소스아미니다제 및 GAG 수준은 간에서는 모든 용량 수준에서 정상화되었고, 심장에서는 중 용량 및 고 용량에서 정상화되었다. 고도로 형질도입된 간(이배체 게놈당 1 내지 10GC)은 아마도 혈청 중의 IDS의 분비 및 더 높은 용량에서 심장의 상호-보정을 위한 저장소로서 작용하였다.
뇌에서 시험품 관련 독성의 증거가 존재하지 않았지만, ICV 투여 절차 자체와 관련된 변화는 일부 마우스에게 관찰되었다. 이식유전자에 대한 체액 면역 반응은 약했고, 일부 중-용량 및 고- 용량 동물에서만 관찰되었고, 이는 이들 동물의 건강 또는 뇌 조직병리학에 영향이 없었다.
결론적으로, AAV9.CB7.CI.IDS.rBG는 모든 용량 수준에서 MPS II 마우스에게 양호하게 용인되었고, MPS II의 CNS 및 말초 파라미터 둘 모두에서 개선과 연관된 IDS 수준(발현 및 효소 활성도)의 용량-의존적인 증가를 초래하였다. 투여된 최저 용량인, 3x108GC(5.2x108GC ddPCR 방법)가 본 연구에서 최소 유효량이었다.
II. 물질 및 방법
A. AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG라 식별된 시험품은 qPCR에 의해서 측정되는 경우 1.18 x 1013GC/㎖ 및 ddPCR에 의해서 측정되는 경우 2.057 x 1013GV/㎖의 역가를 갖는 갖는, 맑은 무색 액체이다. 엔도톡신은 1.0EU/㎖ 미만이다. 순도는 100%이다. 시험품을 -60℃ 이하에서 저장하였다.
B. 용량 제형 및 분석법
1. 시험품의 제조:
시험품을 멸균 인산염 완충 염수(PBS)로 각각의 군을 위해서 적절한 농도로 희석하였다. 희석된 벡터를 젖은 얼음 상에 놓고, 희석 4시간 이내에 동물에게 주사하였다.
C. 시험 시스템
무스 무스쿨루스(Mus musculus) C57BL/6J IDSγ/-(MPS II 표현형, N= 56마리 수컷) 및 C57BL/6J IDSγ/+(야생형 표현형, N= 8마리 수컷)을 잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories)로부터 본래 얻은 스톡(스톡 번호 024744)으로부터 트랜스레이셔널 리서치 래보러토리즈(TRL) 동물사육장(Vivarium)에서 사육하였다. 동물은 0일(투여일)에 2 내지 3개월령이었다.
D. 실험 실계
1. 연구 W2356
0일에, 군 3 내지 5으로부터의 모든 동물(16마리 수컷/군, 조합된 W2356 및 W2301 연구)을 AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG로 ICV 투여하였다. 21일에, 군 3 내지 5으롤부터의 마우스/군(8마리 수컷/군, W2356 연구)을 안락사시키고, 부검하고, 뇌, 심장, 폐, 간 및 비장을 수집하고, 뇌 IDS 활성도 및 조직 벡터 생체분포의 평가를 위해서 드라이아이스 상에서 스냅 동결시켰다.
Figure pct00102
2. 연구 W2301
0일에, 군 3 내지 5으로부터의 모든 동물(16마리 수컷/군)을 AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG로 ICV 투여하였다. 2 내지 pi 3개월: 군 1 및 2로부터의 동물(8마리 마우스/군)을 오픈 필드 활성도, Y-미로 활성도, 공포 상황 조건화, 및 신규 물체 인식을 비롯한 일련의 신경행동학적 검정으로 평가하여 이들 종점에 대한 질환 상태의 효과(MPS II 유전자형)가 존재하는지를 결정하였다. 질환의 명백한 효과가 관찰되면, 군 3 내지 5로부터의 8마리 마우스/군을 또한 벡터로의 치료가 반응에 효과를 갖는지의 여부를 결정하기 위한 검정으로 평가하였다.
군 1 내지 5로부터의 동물(신경행동학적 검정에서 평가된 동물, 8마리 마우스/군)을 혈청 및 CSF IDS 활성도 및 혈청 항-hIDS 항체의 평가를 위해서 깊게 마취시켜(케타민-자일라진) CSF(대수조 천자) 및 혈액(심장 천자)을 수집하였다. 이어서, 뇌 조직병리학; 뇌 리소좀 저장(면역조직화학 및 영상 분석법에 의해서 평가); 간 및 심장 헥소스아미니다제 활성도; 및 간 및 심장 GAG 함량(조직 함량에 의해서 평가)을 위해서 마우스를 안락사시키고, 부검하고, 샘플을 수집하였다.
Figure pct00103
3. 시험품의 투여
ICV 경로를 선택하였는데, 그 이유는 그것이 최소한으로 비침습성이고, 마우스에서 어떠한 수술 절차도 필요하지 않기 때문이다(목 피부 및 근육 절개가 필요한 대수조 경로에 비해서). 본 연구는 마우스 활성도 기록을 비롯한 일부 신경행동학적 종점을 포함하였기 때문에, 생존 수술이 필요하지 않은 비-침습성 주사가 바람직하였다. 그것은 마우스 및 대동물 둘 모두에서, 뇌척수액 내로의 AAV9의 단일 주사(ICV 또는 대수조)가 전체 CNS 내의 뉴런을 표적화한다는 것은 본 발명자들 및 다른 연구자들에 의해서 예증되었다(Dirren at al., Hum. Gene. Therapy 25, 109-120 (2014); Snyder et al. Hum. Gene Ther 22, 1129-1135 (2011), Federici et al. Gene Therapy 19, 852-859 (2012), Haurigot et al. J Clin Invest 123, 3254-3271 (2013), Bucher et al. Gene Therapy 21, 522-528 (2014), Hinderer et al. Mol Ther: 22, 2018-2027 (2014) 및 Mol Ther - Methods & Clin Dev 1, 14051 (2014)]. 문헌[Haurigot et al. (2013)]에 의해서 공개된 데이터는 또 다른 리소좀 저장 질환과 관련하여 ICV와 대수조 주사 간의 비교를 구체적으로 다루는데, 이것은 두 투여 경로가 이식유전자 발현 및 생체분포와 관련하여 대등하다는 것을 예증한다.
체적 제약으로 인해서 최대 실현 가능한 용량(성인 마우스에서 ICV 주사의 경우 5㎕)은 마우스당 대략 6x1010GC였다(qPCR 역가 방법). 다른 MPS의 치료에 대해서 GPT에서 얻은 이전 결과로 인해서 그리고 대동물로의 확장성에 관련된 문제점으로 인해서, 마우스당 3x1010, 3 x109, 또는 3 x108GC(qPCR 역가 방법)를 주사하기 위해서 벡터를 희석하였다. ddPCR 방법을 기초로, 실제 용량은 마우스당 5.2x1010, 5.2x109, 및 5.2x108GC였다. 젊은 성인 C57Bl6 마우스(Biology of the laboratory mouse by the staff of the Jackson laboratory, second revised edition, Earl L. Green Editor)에서 0.4g의 평균 뇌 질량을 고려하면, 이것은 최고 용량에서 1.31x1011GC/뇌 질량 그램 및 최저 용량에서 1.31x109GC/뇌 질량 그램과 동등하다.
벡터를 우측 측뇌실에 ICV로 투여하였다. 마우스를 아이소플루란으로 마취시켰다. 각각의 마취시킨 마우스를 머리 뒤의 느슨한 피부를 단단히 잡고, 26-게이지 니들이 장치된 해밀톤 주사기를 사용하여 브레그마 앞면 및 측면에 수동으로 주사하였고, 이것을 조정하여 3㎜ 깊이로 삽입하였다. 염료 또는 물질 P를 우측 측뇌실에 주사함으로써 마우스에서 주사 방법을 미리 검증하였다. 성공은 뇌척수액 내로의 주사 이후에 청색 염료의 가시화로서 또는 마우스의 가려움 행동(피하 P 투여 후)에 의해서 정의되었다.
F. 절차, 관찰 및 측정
동물을 이병률/사망률에 대해서 모니터링하였다. 일반적인 외관, 독성 징후, 고통, 행동 변화에 대해서 매일 케이지 옆에서 육안으로 관찰함으로써 동물을 모니터링하였다. 이들 데이터는 이러한 비-GLP 연구에서 보고하지 않았다.
60일과 90일(벡터 투여 후 2 내지 3개월) 사이에, 연구 W2356의 군 1 및 2로부터의 8마리의 동물을 행동학적 시험 및 신경인지 시험에 적용하여 이들 종점 시에 유전자형의 효과를 결정하였다. 유전자형의 효과가 식별되면, 치료의 효과가 존재하는지를 결정하기 위해서 연구 W2356 군 3 내지 5로부터의 8마리의 동물을 사용하여 추가적인 시험을 수행하였다. 유전자형 및 군에 대해서 맹검된 작동자에 의해서 모든 행동 절차를 수행하였다.
a) 일반적인 운동 능력 (오픈 필드 활성도):
오픈 필드에서의 자발적인 활성도를 포토빔 활성도 시스템(PAS)-오픈 필드(샌디에고 인스트루먼츠)에서 측정하였다. 이러한 평가 시에, 마우스를 단일 10분 시험을 위해서 시험장에 개별적으로 놓았다. 수평 및 수직 빔 브레이크를 수집하여 일반적인 운동 능력 및 양육 활성도를 평가하였다.
b) 단기간 기억력(Y 미로 활성도):
Y 미로 자발적인 교대는 새로운 환경을 탐색하는 설치류의 의지를 평가하기 위한 행동학적 시험이다. 시험은 서로 120° 각도의 3개의 백색의 불투명한 플라스틱 아암을 갖는 Y-자형 미로에서 수행한다. 미로의 중심에 넣은 후, 동물을 3개의 암을 자유롭게 탐색하게 한다. 설치류는 전형적으로 이전에 방문한 곳으로 복귀하기 보다는 미로의 새로운 아암을 조사하는 것을 선호한다. 다수의 암 입장의 기간에 걸쳐서, 대상체는 최근에 덜 방문한 아암에 들어가려는 경향성을 나타내어야 한다. 교대 백분율을 계산하기 위해서 아암 입장의 횟수 및 트라이어드의 수를 기록한다. 입장은 아암 내에 존재하는 4개의 사지로서 정의한다. 이 시험을 사용하여 마우스의 이식유전자 계통의 마우스 인지 결핍을 정량하고, 인지에 대한 이의 효과에 대해서 신규 화학 엔티티를 평가한다. 뇌--해마, 격막, 기저 전뇌, 및 전전두엽 포함--의 다수의 부분이 이러한 과제에 관여된다. 본 연구에서, 표준 Y-자형 미로(샌디에고 인스트루먼츠)를 사용하였고, 아암 입장의 순서 및 횟수를 8-분 시도 동안 기록하였다. 이미 들어간 아암으로 즉각적으로 복귀하지 않고 미로의 3개의 암 모두로의 순차적인 입장으로서 자발적인 교대(SA)를 정의하였다. 총 아암 입장(AE)를 운동 활성도의 측정치로서 수집하였다. 백분율 자발적인 교대를 %SA= (SA/(AE-2)*100)로서 계산하였다.
c) 장기간 기억력(공포 상황 조건화):
이들 과제에서, 동물은 새로운 환경 또는 감정 중립적인 조건화된 자극(CS), 예컨대, 분위기(tone)에 대한 두려움을 학습하는데, 그 이유는 이것과 혐오적인 비조건화된 자극(US), 통상적으로 발 충격의 시간적인 연합으로 인해서이다. 동일한 상황 또는 동일한 CS에 노출되는 경우, 조건화된 동물은 프리징 행동을 나타낸다(Abel et al, Cell 88: 615-626. 1997). 훈련일에, 마우스에게 300초 동안 특정 조건화 챔버(메드 어소시에이츠 인크(Med Associates Inc))를 탐색하게 하였다. 300초 기간 중 248 내지 250초 사이에, 비-신호화, 1.5mA의 연속적인 발 쇼크를 전달하였다. 챔버에서 추가적인 30초 후, 마우스를 그의 홈 케이지로 복귀시켰다. 24시간 후에, 훈련이 수행된 동일한 챔버에서 연속되는 5분 동안 공간적 맥락의 회상을 평가하였다. 프리징 행동(프리즈스캔(Freezescan), 클레버시스 인크(CleverSys Inc))을 점수매기는 데 사용되는 소프트웨어를 사용하여 기억력을 평가하였다. 훈련 세션(발 쇼크의 적용 전)의 2.5분 사전자극기에서의 백분율 프리징을 챔버에 재노출될 때의 백분율 프리징과 비교한다. 프리징의 증가는, 발 쇼크의 회상을 나타낸다(즉 학습이 일어났고, 동물이 발 쇼크가 있는 챔버를 연상함).
d) 장기간 기억력(신규 물체 인식):
신규 물체 인식(NOR) 과제를 사용하여 CNS 장애의 설치류 모델에서, 인지, 특히 인식 기억력을 평가한다. 본 시험은 익숙한 물체보다 신규 물체를 탐색하는 데 더 많은 시간을 소비하는 설치류의 자발적인 경향성을 기초로 한다. 신규 물체를 탐색하기 위한 선택은 학습 및 인식 기억력의 사용을 반영한다. 신규 물체 인식 과제를 일반적으로 높이 및 체적이 일치하지만 형상 및 외관이 상이한 2종의 상이한 부류의 물체를 갖는 오픈 필드 시험장에서 수행한다. 습관화 동안, 동물에게 빈 시험장을 탐색하게 한다. 습관화 24시간 후에, 동물을 동일한 거리에 배치된 2개의 동일한 물체를 갖는 익숙한 시험장에 노출시킨다. 다음날, 마우스가 익숙한 물체 및 신규 물체의 존재 하에서 오픈 필드를 탐색하게 하여 장기간 인식 기억력을 시험한다. 각각의 물체를 탐색하는 데 소모된 시간 및 식별력 지수 백분율을 기록한다. 본 연구에서, 백색 마루 상의 회색 직사각형 시험장(60㎝ x 50㎝ x 26㎝) 및 2개의 독특한 물체로 이루어진 시험 장치는 금속 막대 3.8x3.8x15㎝ 및 PVC 파이프 3.2㎝ 직경 x 15㎝ 길이였다. 5-일 습관화 단계 동안, 마우스를 1 내지 2분/일 처리하고, 5분/일 동안 빈 시험장을 탐색하게 하였다. 학습 단계 동안, 2개의 동일한 물체를 시험장에 넣고, 마우스가 15분 동안 그 물체를 탐색하게 하였다. 회상 단계에서, 마우스를 하나의 친숙하지 않은 물체 및 하나의 신규 물체를 갖는 시험장으로 복귀시켰다. 정상 마우스는 신규 물체를 우선적으로 탐색한다. 모든 세션을 기록하고, 물체를 탐색하는 데 소모한 시간을 오픈 소스 이미지 분석법 프로그램[Patel et al Front Behav Neurosci 8:349 (2014)]을 사용하여 점수매겼다.
I. 실험실 평가
1. 혈청 및 CSF에서의 IDS 활성도
혈청 및 CSF IDS 활성도를 위한 혈액을 대략 주사 3개월 후에 부검 시에 수집하였다. 혈청을 혈액으로부터 분리하고, 혈청 및 CSF를 드라이아이스 상에서 동결시키고, 분석시까지 -80℃에서 저장하였다. 10㎕ 샘플을 0.01M 납 아세테이트, pH 5.0를 갖는 0.1M 소듐 아세테이트 중에 용해된 20㎕의 1.25mM 4-메틸엄벨리페릴(MU) a-L-이도피라노사이두론산 2-설페이트(산타 크루즈 바이오테크놀로지)와 함께 인큐베이션시킴으로써 IDS 활성도를 측정하였다. 37℃에서 2시간 인큐베이션시킨 후에, 45㎕의 맥일바인 완충액(McIlvain's buffer)(0.4M 인산나트륨, 0.2M 시트르산나트륨, pH 4.5) 및 5㎕의 재조합 인간 이두로니다제(알두라자임(Al경막zyme), 0.58㎎/㎖, 젠자임(Genzyme))를 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 혼합물을 글리신 완충액, pH 10.9 중에서 희석하고, 방출된 4-MU를 4-MU 무함유의 표준 희석물과 비교하여 형광에 의해서 정량하였다(여기 365nm, 방출 450nm).
2. 혈청 항-IDS 항체
혈청 항-hIDS 항체의 측정을 위한 혈액을 심장 천자에 의해서 연구 W2356의 종결 부검 종점(21일) 및 연구 W2301(대략 3개월)의 종결 부검 종점에서 에서 수집하였다. 혈청을 분리하고, 드라이아이스 상에서 동결시키고, 분석시까지 -80℃에서 저장하였다. 폴리스타이렌 플레이트를 pH 5.8로 적정된 PBS 중의 재조합 인간 IDS(알앤디 시스템스(R&D Systems)) 5㎍/㎖로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척하고, 1시간 동안 중성 PBS 중의 2% 소 혈청 알부민(BAS) 중에서 차단시켰다. 이어서, 플레이트를 PBS 중에 1:1000으로 희석된 혈청 샘플과 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 항체를 2% BSA를 갖는 PBS 중에 1:10,000으로 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합된 염소 항-마우스 항체(압캄)로 검출하였다. 검정을 테트라메틸벤지딘 기질을 사용하여 현상시키고, 2N 황산을 사용하여 중단시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정한다. 1:10,000의 역가를 독단적으로 배정한 양성 혈청 샘플의 연속 희석에 의해서 생성된 표준 곡선으로부터 역가를 결정하였다.
DNA를 QIAmp DNA 미니 키트를 사용하여 고 용량 군의 조직으로부터 단리하고, 벡터 게놈을 이미 기술된 바와 같이 태크만 PCR에 의해서 정량하였다(Bell et al, 2006). 총 세포 DNA를 QIAamp DNA 미니 키트(퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 조직으로부터 추출하였다. 추출된 DNA에서 벡터 게놈의 검출 및 정량화를 rBG 폴리A 서열에 표적화된 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 실시간 PCR(태크만 만능 마스터 혼합기, 어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에 의해서 수행하였다
포워드 프라이머: 5V-TTCCCTCTGCCAAAAATTATGG-3V, 서열번호 16;
리버스 프라이머: 5V-CCTTTATTAGCCAGAAGTCAGATGCT-3V, 서열번호 17;
프로브: 6FAM-ACATCATGAAGCCCC-MGBNFQ, 서열번호 18.
PCR 조건을 템플레이트, 300nm 프라이머, 및 200nm 프로브 각각으로서 100ng 총 세포 DNA로 설정하였다. 사이클은 95C에서 10분 동안, 95℃에서 15s의 40회 사이클, 및 60℃에서 1분이었다. 세포당 하나의 게놈 카피를 나타내기 위해서 1x104게놈 카피/ 100ng DNA의 값을 계산하였다.
표준 프로토콜에 따라서, pi 3개월에 부검으로부터의 포르말린-고정된 파라핀-포매된 문측 뇌 단편 상에서 H&E 염색을 수행하였다. 뇌의 H&E 단편을 면허가 있는 수의과 병리학자에 의해서 독성의 증거에 대해서 평가하고, MPS II 표현형에 관련된 발견 범위를 특징규명하였다. 그 다음, 병리학자는 치료에 대한 지식 없이 슬라이드를 재조사하고, 신경교 세포질 액포화, 뉴런 세포질 팽윤 및 양염색성 물질의 축적을 비롯한 MPS II 표현형의 조직학 양상을 점수 매겼다. LIMP2 및 GM3에 대해서 양성으로 염색된 세포의 수를 교육된 GTP 모폴로지 핵심 인력에 의해서 W2356 연구의 각각의 동물로부터의 2 내지 4개의 뇌 단편에서 정량하였다.
GM3(동결된 단편): 기술된 바와 같이 GM3 면역염색을 30㎛ 두께의 플로팅 동결단편 상에서 1차 항체로서 단클론성 항체 DH2(글리코테크(Glycotech), 미국 매릴랜드주 가이터버그 소재)를 사용하고, 그 다음 바이오틴일화 2차 항-마우스 항체(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)를 사용하여 수행하고, 벡타스타틴 엘리트(Vectastain Elite) ABC 키트(벡터 랩스(Vector Labs), 미국 캘리포니아주 벌린게임 소재)를 사용하여 검출하였다. 염색된 단편을 유리 슬라이드 상에 전달하고, 플루오로마운트(Fluoromount) G(일렉트론 마이크로스코피 사이언시스(Electron Microscopy Sciences, 미국 펜실베니아주 해트필드 소재)로 장착하였다.
LIMP2(포르말린-고정된 단편): LIMP2 면역염색을 포르말린-고정된 파라핀-포매된 뇌 조직으로부터의 6㎛ 단편 상에서 수행하였다. 에탄올 및 자일렌 시리즈를 통해서 단편을 파라핀으로부터 제거하고, 항원 인출을 위해서 6분 동안 10m㏖/L 시트레이트 완충액(pH 6.0) 중에서 마이크로파에서 비등시키고, 15분 동안 PBS + 0.2% 트리톤 중의 1% 당나귀 혈청으로 차단시키고, 그 다음 차단 완충액 중에 희석된 1차(1시간) 항체와 함께 그리고 표지된 2차(45분) 항체와 함께 순차적으로 인큐베이션시켰다. 1차 항체는 토끼 항-LIMP2(노부스 바이올로지컬즈, 미국 코네티컷주 리틀톤 소재, 1:200)였고, 2차 항체는 FITC- 또는 TRITC-표지된 당나귀 항-토끼(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))였다.
상기에 기술된 바와 같이 얻은 조직 샘플(단편 b)을 용해 완충액(0.2% 트리톤-X100, 0.9% NaCl, pH 4.0) 중에서 조직용해기(퀴아젠)를 사용하여 균질화하였다. 샘플을 동결-해동시키고, 원심분리에 의해서 정화하였다. 단백질을 BCA 검정에 의해서 정량하였다. IDS 활성도를 형광원 기질 4-메틸엄벨리페릴 α-L-이도피라노사이두론산 2-설페이트(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용하여 측정하였다. 헥소스아미니다제 활성도 및 GAG 농도를 기술된 바와 같이 표준 절차를 사용하여 측정하였다(Hinderer et al. 2015).
IV. 컴퓨터 시스템
오픈 필드에 대해서, 데이터를 엑셀에 넣고, 그래프패드 프리즘을 사용하여 분석하였다. Y-미로에 대해서, 데이터를 엑셀에 넣고, 그래프패드 프리즘을 사용하여 분석하였다. CFC에 대해서, 프리즈스캔(Freezescan), 클레버시스 인크(CleverSys Inc)를 사용하였다. NOR에 대해서, [MATLAB Implementation and User Guide: www.seas.upenn.edu/~molneuro/autotyping.html]를 사용하였다.
V. 통계학적 분석법
처리 마우스 및 미처리 마우스에서의 조직 GAG 함량, Hex 활성도, 및 뇌 저장 병변을 일측 ANOVA, 그 다음 두넷 다중 비교 시험을 사용하여 비교하였다. 오픈 필드 및 Y-미로 데이터를 스튜던트 t-시험으로 분석하였다. 이측 ANOVA 및 두넷 사후-hoc 분석법을 공포 조건화 데이터에 적용하여 시험 및 유전자형 효과를 평가하였다. 신규 물체 인식 시험의 경우, 신규 물체 탐색 시간 대 익숙한 물체 탐색 시간을 각각의 군에 대해서 t-시험을 사용하여 비교하였고, 그 다음 다중 비교를 위해서 본페로니 보정하였다.
VI. 결과
어떠한 사망률도 관찰되지 않았다. 벡터의 처리와 관련된 것으로 고려된 어떠한 임상적 관찰도 존재하지 않았다.
일반적인 운동력 활성도를 평가하기 위해서, 오픈 필드 시험을 수행하였다. IDSγ/- 마우스는 야생형 한배새끼와 비교할 때 오픈 필드 시험장에서 정상 탐색 활성도를 나타내었다(도 9A 내지 9C).
오픈 필드 시험장(수평 이동)에서 야생형 마우스와 IDS γ/-(MPS II) 마우스 성능의 비교를 수행하였다(도 9A). 10분 시험 동안 자발적인 활성도를 수평 이동을 캡처하는 XY-축 빔 브레이크를 기초로 자동으로 기록하였다. WT 마우스와 MPS II 마우스 간에는 어떠한 차이도 인지되지 않았다.
오픈 필드 시험장(수직 이동 또는 후퇴)에서 야생형 마우스와 IDS γ/-(MPS II) 마우스 성능의 비교를 수행하였다(도 9B). 10분 시험 동안 자발적인 활성도를 마우스의 뒷다리의 후퇴를 캡처하는 Z-축 빔 브레이크를 기초로 자동으로 기록하였다. WT 마우스와 MPS II 마우스 간에는 어떠한 차이도 인지되지 않았다.
오픈 필드 시험장(중심 활성도)에서 야생형 마우스와 IDS γ/-(MPS II) 마우스 성능의 비교를 수행하였다(도 9C). 10분 시험 동안 자발적인 활성도를 불안의 마커로서의 개방 면적에서 소모되는 시간을 캡처하는 중심 빔 브레이크를 기초로 자동으로 기록하였다. WT 마우스와 MPS II 마우스 간에는 어떠한 유의한 차이도 인지되지 않았다.
단기간 기억력을 평가하기 위해서, Y-미로 활성도를 분석하였다. 8-분 Y-미로 시험 세션 동안 야생형 마우스와 IDS γ/- (MPS II) 마우스의 비교 WT 마우스와 MPS II 마우스 간에는 아암의 입장의 총 수에서 어떠한 차이도 인지되지 않았다. IDSγ/- 마우스는 또한 야생형 한배새끼와 비교할 때 Y-미로에서 유사한 아암 입장의 수 및 동일한 자발적인 교대를 가졌는데, 이는 그 질환 과정이 단기간 기억력에 영향을 미치지 않음을 나타낸다(도 9D).
장기간 기억력을 평가하기 위해서, 공포 상황 조건화(FC)를 수행하였다. 공포 상황 조건화를 사용한 인지에 대한 치료 효과의 평가를 야생형, 미처리 및 처리된 MPS II 마우스에서 시험하였다. 백분율 프리징을 y축에 대해서 플롯팅하였다(도 6B). 각각의 군에 대해서 학습 전 프리징 행동(Pre)을 조건화 후 프리징 행동(프로브)과 비교하였다(도 6B). Fc 검정에서, 모든 마우스(IDSγ/- 및 야생형)는 시험의 회상 단계 동안 백분율 시간 프리징의 증가를 나타내었는데, 이는 학습이 일어났다는 것을 입증하였지만, IDSγ/- 마우스는 야생형 한배새끼에 비해서 감소된 프리징을 나타내었다(데이터 나타내지 않음). AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG로 처리된 마우스에서, 공포 상황 조건화에 대한 반응에서 어떠한 명확한 개선도 존재하지 않았지만, 처리-관련 효과는 정상 마우스와 미처리 IDSγ/- 마우스 간의 작은 차이로 인해서 평가하기 어려웠다(도 6B).
장기간 기억력을 추가로 평가하기 위해서, 신규 물체 인식을 수행하였다. 신규 물체 인식을 사용한 인지에 대한 치료 효과의 평가를 야생형, 미처리 및 처리된 MPS II 마우스에서 시험하였다. 야생형, 미처리 및 처리된 IDS γ/-(MPS II) 마우스에 대해서 신규 물체 대 익숙한 물체를 탐색하는 데 소모된 시간의 비교를 수행하였다. 신규 물체를 탐색하는 데 소모된 시간의 증가(익숙한 물체의 기억을 나타냄)는 처리된 마우스의 모든 군에서 인지되었지만, 중-용량 군에서만 통계학적으로 유의하였다(도 6C). 야생형 마우스는 예상된 바와 같이 신규 물체를 선호하는 것으로 나타났지만, IDSγ/-는 선호를 나타내지 않았는데, 이는 익숙한 물체의 기억의 결여(장기간 기억력 손상)를 나타낸다. 척추강내 AAV9 유전자 요법은 IDSγ/-(MPS II) 마우스에서 관찰된 NOR 결핍을 개선시켰지만, 용량 반응은 명확하지 않았다. 신규 물체에 대한 선호는 중-용량 코호트에서만 통계학적으로 유의하였지만, 그 연구는 투여군들 중에서 행동 결핍의 상대적인 구조도를 비교하기 위해서는 충분하지 않았다(도 6C).
야생형, 미처리 및 처리된 MPS II 마우스에서 뇌 IDS 활성도에서 용량-의존적인 증가(21일)가 관찰되었다(도 2B). 고 용량 군만 이러한 초기 시간 지점에서 야생형과 유사한 수준을 가졌는데, 이는 발현이 이의 최대에 아직 도달하지 않았기 때문에 예상되었다.
야생형, 미처리 및 처리된 MPS II 마우스에서 IDS 활성도에서 용량-의존적인 증가(90일)가 부검 pi 3개월에서 수집된 CSF에서 관찰되었다(도 2A). 미처리 IDS γ/- (MPS II) 마우스에서 본질적으로 어떠한 IDS 활성도도 검출되지 않았다.
추가로, 야생형, 미처리 및 처리된 MPS II 마우스에서 혈청 IDS 활성도에서의 용량-의존적인 증가(90일)는 부검 pi 3개월에서 관찰되었다(도 2C). 미처리 IDS γ/- (MPS II) 마우스의 혈청에서 본질적으로 어떠한 활성도도 검출되지 않았다.
pi 3개월에, 헥소스아미니다제 활성도(90일)는 야생형, 미처리 및 처리된 MPS II 마우스의 간(도 4C) 및 심장(도 4D) 둘 모두에서 용량-의존적인 방식으로 정상화되었다. 부수적으로 증가된 효소 활성도의 이러한 정상화는 리소좀 항상성의 복원을 나타내었다. 야생형, 미처리 및 처리된 MPS II 마우스에서 간 및 심장 GAG 저장을 관찰하였다. pi 3개월에, GAG의 조직 함량은 심장(도 4B) 및 간(도 4A) 둘 모두에서 용량 의존적으로 감소하였고, 이는 중 용량 수준 및 고 용량 수준에서 야생형 조직 함량과 대등하였다. 간은 모든 용량에서 보정되었고, 심장은 주로 중 용량 및 고 용량에서 부분적인 개선을 나타내었다.
추가로, 인간 IDS에 대한 항체 반응에 의해서 나타난 체액 면역원성을 ICV AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG로 처리된 MPS II 마우스에서 평가하였다. 인간 IDS에 대한 항체는 21일 및 90일에서만 중-용량 및 고-용량 코호트에서 몇몇 동물의 혈청에서 검출되었다(도 8). 두 시점 모두에서, 대부분의 동물은 검출 가능한 체액 면역 반응(대조군과 유사함)을 갖지 않았다. 중-용량에서 동물의 약 1/3 및 동물 군의 약 20%는 배경보다 높은 항체 수준을 가졌다. 이러한 반응은 고용량 군에서 덜 두드러졌다. 도 8은 응집물에서 두 부검 종점 데이터 모두를 나타낸다.
뇌에서 어떠한 처리-관련된 조직병리학 발견도 존재하지 않았다. 본 연구에서 존재하는 모든 현미경 발견은 질병 모델과 관련하여 또는 벡터 투여 절차와 관련하여 이러한 종, 연령, 및 성별의 동물에 대해서 정상 배경인 것으로 간주되었다.
세포질 액포화를 기초로 하는 점수 매김 시스템을 확립하고, 처리 또는 표현형의 지식 없이 모든 시험 동물의 후속 재평가를 위해서 사용하였다. 핵의 원심성 또는 주변 변위를 갖는 넓은 투명한 액포를 특징으로 하는, 교세포에서의 세포질 액포화는 IDSγ/- 유전자형의 독특한 특징이 있다. 평가된 뇌 영역에서 액포화의 양에서 영역 변동성이 존재하였다. 양염색성 물질의 뉴런 축적은 덜 두드러졌고, 미치료 IDSγ/- 마우스에서만 관찰되었다. AAV9.CB7.CI.hIDS.RBG로의 처리는 조사된 모든 뇌 영역에서 신경교 액포화 및 양염색성 물질의 뉴런 축적의 양 및 빈도를 감소시켰다. 누적 병리학 점수는 신경교 및 뉴런 병변에서의 치료-관련 개선을 예증한다(도 27).
야생형, 미처리 및 처리된 MPS II 마우스에서 GM3 및 LIMP2의 면역조직화학 염색을 수행하였다. 미처리 IDS γ/- 마우스의 뇌는, 리소좀 막 단백질 LIMP2의 축적, 뿐만 아니라 GM3을 비롯한 강글리오사이드의 2차 저장을 비롯하여, 뉴런에서 리소좀 저장의 명확한 조직학적 증거를 나타내었다(도 5A 내지 5J). 영상은, 모든 용량에서 리소좀 저장의 감소가 존재하였음을 예증하였고, 고 용량 군 동물은 WT 대조군과 본질적으로 유사하였다(도 5A 내지 5J). GM3-양성 세포 및 LIMP2-양성 세포에서의 용량-의존적인 감소의 정량을 야생형, 미처리 및 처리된 MPS II 마우스에서 수행하였다. 모든 용량에서 리소좀 저장의 상당한 감소가 존재하였고, 고 용량 군 동물은 WT 대조군과 본질적으로 유사하였다. 처리된 마우스는, 감소된 LIMP2 및 GM3 염색에 의해서 입증된 바와 같이, 뉴런 저장 병변에서의 용량-의존적인 감소를 나타내었다(도 5K 내지 5L).
고 용량 군으로부터의 MPS II 마우스에서 AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG의 생체분포(21일)를 분석하였다. 생체분포 데이터는, 평가된 말초 조직 모두, 특히 간에서와 같이, 뇌 조직이 형질도입되었음(1 내지 10GC/이배체 게놈)을 예증하였다(도 3). 간 및 CNS에서의 농도는 1 내지 10GC/이배체 게놈이었고; 폐에서의 농도는 0.1 내지 1GC/이배체 게놈이었고, 심장 및 비장에서의 농도는 0.1GC/이배체 게놈 미만이었다.
VIII. 결론
C57BL/6 IDS γ/-(MPS II) 마우스에 최대 3x1010GC(5.2x1010GC ddPCR)로 AAV9.CB7.CI.hIDS.rBG를 ICV 투여하는 것은 널리 용인되었으며, 어떠한 임상적 징후 또는 사망률도 없었고, CNS뿐만 아니라 말초 조직, 특히 간으로의 분포를 초래하였는데, 이는 CSF로부터 말초 혈액으로의 주사된 바이러스 입자의 부분적인 재분포를 나타내었다.
21일에 뇌에서 그리고 pi 3개월에서 CSF에서의 벡터의 검출 및 IDS 활성도의 용량 의존적인 증가에 의해서 입증된 바와 같이 뇌에서의 IDS 유전자 발현의 증거가 존재하였고, 효소 활성도는 고 용량(뇌 조직)에서 야생형 수준과 유사하였고, 중 용량 및 고 용량(CSF)에서 야생형보다 더 높은 수준에 대등하였다. pi 3개월의 모든 용량에서 CNS에서 LIMP2 및 GM3 염색에서의 감소에 의해서 나타난 바와 같이, 리소좀 컴파트먼트의 용량 의존적인 정상화가 존재하였다. H&E 염색된 뇌 단편에서, 신경교 액포화(glial vacuolation) 및 MPS II CNS 표현형의 지시인자인 양염색성 물질의 뉴런 축적의 양 및 빈도에서 용량 의존적인 감소가 또한 관찰되었다. H&E 염색된 단편에서 CNS 리소좀 함량의 변화 및 질환-관련된 모폴로지의 개선에 상응하게, 장기간 기억력의 하나의 척도(신규 물체 인식)가 개선되었지만, 나머지 장기간 기억력의 척도인, 공포 상황 조건화는 개선되지 않았다. 어떠한 명확한 용량 반응도 NOR의 개선에서 나타나지 않았다. CNS 기능의 다른 시험, 오픈 필드 시험 및 Y-미로에서 MPS II 마우스의 성능은 야생형 마우스의 성능과 대등하였고, 따라서 벡터로 처리된 마우스를 이들 검정에서 평가하지 않았다.
혈청 IDS 활성도에서의 용량 의존적인 증가가 또한 pi 3개월에서 관찰되었고, 야생형(중/고 용량)과 대등하거나(저 용량) 또는 더 높은 수준을 가졌다 혈청에서 IDS 활성도의 정상화를 반영하여, MPS II 마우스는 간 및 심장에서 헥소스아미니다제 활성도 및 GAG 함량에서 용량 의존적인 감소를 가졌고; 간 헥소스아미니다제 및 GAG 수준은 모든 용량 수준에서 정상화되었고, 심장 헥소스아미니다제 및 GAG 활성도는 각각 중 용량 및 고 용량에서 정상화되었다. 고도로 형질도입된 간(이배체 게놈당 1 내지 10GC)은 아마도 혈청 중의 IDS의 분비 및 더 높은 용량에서 심장의 상호-보정을 위한 저장소로서 작용하였다.
뇌에서 시험품 관련 독성의 증거가 존재하지 않았지만, ICV 투여 절차 자체와 관련된 변화는 일부 마우스에게 관찰되었다. 이식유전자에 대한 체액 면역 반응은 약했고, 일부 중-용량 및 고- 용량 동물에서만 관찰되었고, 이는 이들 동물의 건강 또는 뇌 조직병리학에 영향이 없었다.
결론적으로, AAV9.CB7.CI.IDS.rBG는 모든 용량 수준에서 MPS II 마우스에게 양호하게 용인되었고, MPS II의 CNS 및 말초 파라미터 둘 모두에서 개선과 연관된 IDS 수준의 용량-의존적인 증가를 초래하였다.
투여된 최저 용량인, 3x108 GC(5.2x108GC ddPCR)가 본 연구에서 최소 유효량이었다.
(서열 목록 프리 텍스트)
하기 정보는 번호 식별인자<223> 하의 서열 함유 프리 텍스트를 제공한다.
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Figure pct00115
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원, 뿐만 아니라 2017년 1월 31일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/452,494호, 2016년 7월 28일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/367,780호, 2016년 5월 16일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/337,163호, 2016년 5월 3일자로 출원된 미국 가출원 제62/330,938호, 2016년 4월 15일자로 출원된 미국 가출원 제62/323,194호, 뿐만 아니라 이것과 함께 제출된 서열 목록은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함된 것으로 제시된 것처럼 이들의 전문이 참고로 포함된다. 상기 발명은 이해의 명확성의 목적을 위해서 설명 및 예의 방식에 의해서 일부 상세하게 기술되어 있지만, 첨부된 청구범위의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 특정 변경 및 변형이 이것에 행해질 수 있음은 본 발명의 교시에 비추어 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 쉽게 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA <120> GENE THERAPY FOR TREATING MUCOPOLYSACCHARIDOSIS TYPE II <130> WO/2017/181113 <140> PCT/US2017/027770 <141> 2017-04-14 <150> US 62/323,194 <151> 2016-04-15 <150> US 62/330,938 <151> 2016-05-03 <150> US 62/337,163 <151> 2016-05-16 <150> US 62/367,780 <151> 2016-07-28 <150> US 62/452,494 <151> 2017-01-31 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1653 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1653) <223> human IDS enzyme <400> 1 atg ccg cca ccc cgg acc ggc cga ggc ctt ctc tgg ctg ggt ctg gtt 48 Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 ctg agc tcc gtc tgc gtc gcc ctc gga tcc gaa acg cag gcc aac tcg 96 Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser 20 25 30 acc aca gat gct ctg aac gtt ctt ctc atc atc gtg gat gac ctg cgc 144 Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg 35 40 45 ccc tcc ctg ggc tgt tat ggg gat aag ctg gtg agg tcc cca aat att 192 Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile 50 55 60 gac caa ctg gca tcc cac agc ctc ctc ttc cag aat gcc ttt gcg cag 240 Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln 65 70 75 80 caa gca gtg tgc gcc ccg agc cgc gtt tct ttc ctc act ggc agg aga 288 Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg 85 90 95 cct gac acc acc cgc ctg tac gac ttc aac tcc tac tgg agg gtg cac 336 Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His 100 105 110 gct gga aac ttc tcc acc atc ccc cag tac ttc aag gag aat ggc tat 384 Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr 115 120 125 gtg acc atg tcg gtg gga aaa gtc ttt cac cct ggg ata tct tct aac 432 Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn 130 135 140 cat acc gat gat tct ccg tat agc tgg tct ttt cca cct tat cat cct 480 His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro 145 150 155 160 tcc tct gag aag tat gaa aac act aag aca tgt cga ggg cca gat gga 528 Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly 165 170 175 gaa ctc cat gcc aac ctg ctt tgc cct gtg gat gtg ctg gat gtt ccc 576 Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro 180 185 190 gag ggc acc ttg cct gac aaa cag agc act gag caa gcc ata cag ttg 624 Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu 195 200 205 ttg gaa aag atg aaa acg tca gcc agt cct ttc ttc ctg gcc gtt ggg 672 Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly 210 215 220 tat cat aag cca cac atc ccc ttc aga tac ccc aag gaa ttt cag aag 720 Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys 225 230 235 240 ttg tat ccc ttg gag aac atc acc ctg gcc ccc gat ccc gag gtc cct 768 Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro 245 250 255 gat ggc cta ccc cct gtg gcc tac aac ccc tgg atg gac atc agg caa 816 Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln 260 265 270 cgg gaa gac gtc caa gcc tta aac atc agt gtg ccg tat ggt cca att 864 Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile 275 280 285 cct gtg gac ttt cag cgg aaa atc cgc cag agc tac ttt gcc tct gtg 912 Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val 290 295 300 tca tat ttg gat aca cag gtc ggc cgc ctc ttg agt gct ttg gac gat 960 Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp 305 310 315 320 ctt cag ctg gcc aac agc acc atc att gca ttt acc tcg gat cat ggg 1008 Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly 325 330 335 tgg gct cta ggt gaa cat gga gaa tgg gcc aaa tac agc aat ttt gat 1056 Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp 340 345 350 gtt gct acc cat gtt ccc ctg ata ttc tat gtt cct gga agg acg gct 1104 Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala 355 360 365 tca ctt ccg gag gca ggc gag aag ctt ttc cct tac ctc gac cct ttt 1152 Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe 370 375 380 gat tcc gcc tca cag ttg atg gag cca ggc agg caa tcc atg gac ctt 1200 Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu 385 390 395 400 gtg gaa ctt gtg tct ctt ttt ccc acg ctg gct gga ctt gca gga ctg 1248 Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu 405 410 415 cag gtt cca cct cgc tgc ccc gtt cct tca ttt cac gtt gag ctg tgc 1296 Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys 420 425 430 aga gaa ggc aag aac ctt ctg aag cat ttt cga ttc cgt gac ttg gaa 1344 Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu 435 440 445 gag gat ccg tac ctc cct ggt aat ccc cgt gaa ctg att gcc tat agc 1392 Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser 450 455 460 cag tat ccc cgg cct tca gac atc cct cag tgg aat tct gac aag ccg 1440 Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro 465 470 475 480 agt tta aaa gat ata aag atc atg ggc tat tcc ata cgc acc ata gac 1488 Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp 485 490 495 tat agg tat act gtg tgg gtt ggc ttc aat cct gat gaa ttt cta gct 1536 Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala 500 505 510 aac ttt tct gac atc cat gca ggg gaa ctg tat ttt gtg gat tct gac 1584 Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp 515 520 525 cca ttg cag gat cac aat atg tat aat gat tcc caa ggt gga gat ctt 1632 Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu 530 535 540 ttc cag ttg ttg atg cct tga 1653 Phe Gln Leu Leu Met Pro 545 550 <210> 2 <211> 550 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser 20 25 30 Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg 35 40 45 Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile 50 55 60 Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln 65 70 75 80 Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg 85 90 95 Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His 100 105 110 Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr 115 120 125 Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn 130 135 140 His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro 145 150 155 160 Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly 165 170 175 Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro 180 185 190 Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu 195 200 205 Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly 210 215 220 Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys 225 230 235 240 Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro 245 250 255 Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln 260 265 270 Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile 275 280 285 Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val 290 295 300 Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp 305 310 315 320 Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly 325 330 335 Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp 340 345 350 Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala 355 360 365 Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe 370 375 380 Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu 385 390 395 400 Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu 405 410 415 Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys 420 425 430 Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu 435 440 445 Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser 450 455 460 Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro 465 470 475 480 Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp 485 490 495 Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala 500 505 510 Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp 515 520 525 Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu 530 535 540 Phe Gln Leu Leu Met Pro 545 550 <210> 3 <211> 3967 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CB7.CI.hIDS.RBG <220> <221> misc_feature <222> (2)..(131) <223> 5' ITR <220> <221> promoter <222> (199)..(580) <223> CMV IE promoter <220> <221> promoter <222> (583)..(864) <223> CB promoter <220> <221> TATA_signal <222> (837)..(840) <220> <221> Intron <222> (959)..(1930) <223> chicken beta-actin intron <220> <221> CDS <222> (1937)..(3589) <223> hIDS <220> <221> polyA_signal <222> (3623)..(3749) <223> rabbit globin polyA <220> <221> misc_feature <222> (3838)..(3967) <223> 3' ITR <400> 3 gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120 taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctacca gggtaatggg 180 gatcctctag aactatagct agtcgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 240 ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 300 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 360 ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggac tatttacggt 420 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 480 tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 540 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca 600 cgttctgctt cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta 660 ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg 720 gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 780 agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 840 aaaagcgaag cgcgcggcgg gcggggagtc gctgcgacgc tgccttcgcc ccgtgccccg 900 ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt 960 gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct 1020 tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc cgggagggcc ctttgtgcgg 1080 ggggagcggc tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggctc 1140 cgcgctgccc ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcag 1200 tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg tgcggggggg gctgcgaggg 1260 gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcgtc 1320 ggtcgggctg caaccccccc tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc 1380 gggtgcgggg ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg 1440 gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg 1500 gcgcggcggc ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct 1560 tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc 1620 gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc 1680 cggcaggaag gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct 1740 ccctctccag cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag 1800 ggcggggttc ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca 1860 tgccttcttc tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca 1920 ttttggcaaa gaattc atg ccg cca ccc cgg acc ggc cga ggc ctt ctc tgg 1972 Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp 1 5 10 ctg ggt ctg gtt ctg agc tcc gtc tgc gtc gcc ctc gga tcc gaa acg 2020 Leu Gly Leu Val Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr 15 20 25 cag gcc aac tcg acc aca gat gct ctg aac gtt ctt ctc atc atc gtg 2068 Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val 30 35 40 gat gac ctg cgc ccc tcc ctg ggc tgt tat ggg gat aag ctg gtg agg 2116 Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg 45 50 55 60 tcc cca aat att gac caa ctg gca tcc cac agc ctc ctc ttc cag aat 2164 Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn 65 70 75 gcc ttt gcg cag caa gca gtg tgc gcc ccg agc cgc gtt tct ttc ctc 2212 Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu 80 85 90 act ggc agg aga cct gac acc acc cgc ctg tac gac ttc aac tcc tac 2260 Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr 95 100 105 tgg agg gtg cac gct gga aac ttc tcc acc atc ccc cag tac ttc aag 2308 Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys 110 115 120 gag aat ggc tat gtg acc atg tcg gtg gga aaa gtc ttt cac cct ggg 2356 Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly 125 130 135 140 ata tct tct aac cat acc gat gat tct ccg tat agc tgg tct ttt cca 2404 Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro 145 150 155 cct tat cat cct tcc tct gag aag tat gaa aac act aag aca tgt cga 2452 Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg 160 165 170 ggg cca gat gga gaa ctc cat gcc aac ctg ctt tgc cct gtg gat gtg 2500 Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val 175 180 185 ctg gat gtt ccc gag ggc acc ttg cct gac aaa cag agc act gag caa 2548 Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln 190 195 200 gcc ata cag ttg ttg gaa aag atg aaa acg tca gcc agt cct ttc ttc 2596 Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe 205 210 215 220 ctg gcc gtt ggg tat cat aag cca cac atc ccc ttc aga tac ccc aag 2644 Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys 225 230 235 gaa ttt cag aag ttg tat ccc ttg gag aac atc acc ctg gcc ccc gat 2692 Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp 240 245 250 ccc gag gtc cct gat ggc cta ccc cct gtg gcc tac aac ccc tgg atg 2740 Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met 255 260 265 gac atc agg caa cgg gaa gac gtc caa gcc tta aac atc agt gtg ccg 2788 Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro 270 275 280 tat ggt cca att cct gtg gac ttt cag cgg aaa atc cgc cag agc tac 2836 Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr 285 290 295 300 ttt gcc tct gtg tca tat ttg gat aca cag gtc ggc cgc ctc ttg agt 2884 Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser 305 310 315 gct ttg gac gat ctt cag ctg gcc aac agc acc atc att gca ttt acc 2932 Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr 320 325 330 tcg gat cat ggg tgg gct cta ggt gaa cat gga gaa tgg gcc aaa tac 2980 Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr 335 340 345 agc aat ttt gat gtt gct acc cat gtt ccc ctg ata ttc tat gtt cct 3028 Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro 350 355 360 gga agg acg gct tca ctt ccg gag gca ggc gag aag ctt ttc cct tac 3076 Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr 365 370 375 380 ctc gac cct ttt gat tcc gcc tca cag ttg atg gag cca ggc agg caa 3124 Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln 385 390 395 tcc atg gac ctt gtg gaa ctt gtg tct ctt ttt ccc acg ctg gct gga 3172 Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly 400 405 410 ctt gca gga ctg cag gtt cca cct cgc tgc ccc gtt cct tca ttt cac 3220 Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His 415 420 425 gtt gag ctg tgc aga gaa ggc aag aac ctt ctg aag cat ttt cga ttc 3268 Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe 430 435 440 cgt gac ttg gaa gag gat ccg tac ctc cct ggt aat ccc cgt gaa ctg 3316 Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu 445 450 455 460 att gcc tat agc cag tat ccc cgg cct tca gac atc cct cag tgg aat 3364 Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn 465 470 475 tct gac aag ccg agt tta aaa gat ata aag atc atg ggc tat tcc ata 3412 Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile 480 485 490 cgc acc ata gac tat agg tat act gtg tgg gtt ggc ttc aat cct gat 3460 Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp 495 500 505 gaa ttt cta gct aac ttt tct gac atc cat gca ggg gaa ctg tat ttt 3508 Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe 510 515 520 gtg gat tct gac cca ttg cag gat cac aat atg tat aat gat tcc caa 3556 Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln 525 530 535 540 ggt gga gat ctt ttc cag ttg ttg atg cct tga ctcgaggacg gggtgaacta 3609 Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 545 550 cgcctgagga tccgatcttt ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct 3669 tgagcatctg acttctggct aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa 3729 ttttttgtgt ctctcactcg gaagcaattc gttgatctga atttcgacca cccataatac 3789 ccattaccct ggtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag 3849 tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa 3909 aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcag 3967 <210> 4 <211> 550 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser 20 25 30 Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg 35 40 45 Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile 50 55 60 Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln 65 70 75 80 Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu 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tat tgt tac agg tat cgc tgt gct gct cgg agc cag 4475 Cys His Arg Ser Tyr Cys Tyr Arg Tyr Arg Cys Ala Ala Arg Ser Gln 890 895 900 aac aca cct gat agc tct gct tcg aat ctg gga ttc cgc tgt gca gcc 4523 Asn Thr Pro Asp Ser Ser Ala Ser Asn Leu Gly Phe Arg Cys Ala Ala 905 910 915 gac cgc ctg ccc acc atg gac tga gaattcacgc gtggtacctc tagagtcgac 4577 Asp Arg Leu Pro Thr Met Asp 920 ccgggcggcc tcgaggacgg ggtgaactac gcctgaggat ccgatctttt tccctctgcc 4637 aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa 4697 tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aagcaattcg 4757 ttgatctgaa tttcgaccac ccataatacc cattaccctg gtagataagt agcatggcgg 4817 gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 4877 tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 4937 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcag 4964 <210> 6 <211> 550 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val 1 5 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cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc ctctgctaac catgttcatg 1860 ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt 1920 ttggcaaaga attc atg ccg cca ccc cgg acc ggc cga ggc ctt ctc tgg 1970 Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp 1 5 10 ctg ggt ctg gtt ctg agc tcc gtc tgc gtc gcc ctc gga tcc gaa acg 2018 Leu Gly Leu Val Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr 15 20 25 cag gcc aac tcg acc aca gat gct ctg aac gtt ctt ctc atc atc gtg 2066 Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val 30 35 40 gat gac ctg cgc ccc tcc ctg ggc tgt tat ggg gat aag ctg gtg agg 2114 Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg 45 50 55 60 tcc cca aat att gac caa ctg gca tcc cac agc ctc ctc ttc cag aat 2162 Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn 65 70 75 gcc ttt gcg cag caa gca gtg tgc gcc ccg agc cgc gtt tct ttc ctc 2210 Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu 80 85 90 act ggc agg aga cct gac acc acc cgc ctg tac gac ttc aac tcc tac 2258 Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr 95 100 105 tgg agg gtg cac gct gga aac ttc tcc acc atc ccc cag tac ttc aag 2306 Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys 110 115 120 gag aat ggc tat gtg acc atg tcg gtg gga aaa gtc ttt cac cct ggg 2354 Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly 125 130 135 140 ata tct tct aac cat acc gat gat tct ccg tat agc tgg tct ttt cca 2402 Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro 145 150 155 cct tat cat cct tcc tct gag aag tat gaa aac act aag aca tgt cga 2450 Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg 160 165 170 ggg cca gat gga gaa ctc cat gcc aac ctg ctt tgc cct gtg gat gtg 2498 Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val 175 180 185 ctg gat gtt ccc gag ggc acc ttg cct gac aaa cag agc act gag caa 2546 Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln 190 195 200 gcc ata cag ttg ttg gaa aag atg aaa acg tca gcc agt cct ttc ttc 2594 Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe 205 210 215 220 ctg gcc gtt ggg tat cat aag cca cac atc ccc ttc aga tac ccc aag 2642 Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys 225 230 235 gaa ttt cag aag ttg tat ccc ttg gag aac atc acc ctg gcc ccc gat 2690 Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp 240 245 250 ccc gag gtc cct gat ggc cta ccc cct gtg gcc tac aac ccc tgg atg 2738 Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met 255 260 265 gac atc agg caa cgg gaa gac gtc caa gcc tta aac atc agt gtg ccg 2786 Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro 270 275 280 tat ggt cca att cct gtg gac ttt cag cgg aaa atc cgc cag agc tac 2834 Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr 285 290 295 300 ttt gcc tct gtg tca tat ttg gat aca cag gtc ggc cgc ctc ttg agt 2882 Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser 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Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln 525 530 535 540 ggt gga gat ctt ttc cag ttg ttg atg cct tga ctcgaggacg gggtgaacta 3607 Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 545 550 cgcctgagga tccgatcttt ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct 3667 tgagcatctg acttctggct aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa 3727 ttttttgtgt ctctcactcg gaagcaattc gttgatctga atttcgacca cccataatac 3787 ccattaccct ggtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag 3847 tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa 3907 aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcag 3965 <210> 15 <211> 550 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser 20 25 30 Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg 35 40 45 Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile 50 55 60 Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln 65 70 75 80 Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg 85 90 95 Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His 100 105 110 Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr 115 120 125 Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn 130 135 140 His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro 145 150 155 160 Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly 165 170 175 Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro 180 185 190 Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu 195 200 205 Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly 210 215 220 Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys 225 230 235 240 Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro 245 250 255 Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln 260 265 270 Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile 275 280 285 Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val 290 295 300 Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp 305 310 315 320 Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly 325 330 335 Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp 340 345 350 Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala 355 360 365 Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe 370 375 380 Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu 385 390 395 400 Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu 405 410 415 Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys 420 425 430 Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu 435 440 445 Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser 450 455 460 Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro 465 470 475 480 Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp 485 490 495 Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala 500 505 510 Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp 515 520 525 Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu 530 535 540 Phe Gln Leu Leu Met Pro 545 550 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized sequence <400> 16 ttccctctgc caaaaattat gg 22 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized sequence <400> 17 cctttattag ccagaagtca gatgct 26 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 18 acatcatgaa gcccc 15

Claims (51)

  1. 인간 대상체에서 척추강내 투여에 적합한 약제학적 조성물로서, 제형 완충액 중의 복제 결함 재조합 아데노-연관 바이러스(replication deficient recombinant adeno-associated virus)(rAAV)의 현탁액을 포함하되,
    (a) 상기 rAAV는 AAV9 캡시드 내에 패키징된 인간 이두로네이트-2-설페이타제(human iduronate-2-sulfatase: hIDS)를 암호화하는 이종성(heterologous) 핵산을 포함하고/포함하거나;
    (b) 상기 제형 완충액은 생리학적으로 상용성인 수성 완충액, 및 임의적인 계면활성제 및 부형제를 포함하고/포함하거나;
    (c) (i) 상기 rAAV 게놈 카피(GC) 역가는 적어도 1.0 x 1013GC/㎖(+/-20%)이고/이거나;
    (ii) 상기 rAAV 중공 입자(Empty particle)/전입자(Full particle) 비는 적어도 약 80% 중공 캡시드 무함유이고/이거나;
    (iii) 적어도 약 2.5 x 1010GC/g 뇌 질량 내지 약 3.6 x 1011GC/g 뇌 질량의 rAAV 현탁액의 용량이 효력을 갖는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 효력은 시험관내 검정에 의해서 측정되는, 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 시험관내 검정은 세포당 기지의 다중도의 rAAV GC 역가로 HEK293 세포를 형질도입시키는 단계, 및 4MU-이두로나이드 효소 검정을 사용하여 형질도입 72시간 후 hIDS 활성도에 대해서 상청액을 검정하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV의 중공 입자/전입자 비는 0.01 내지 0.05(95% 내지 99% 중공 캡시드 무함유)인, 약제학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암호화된 hIDS는 하기로부터 선택된 서열을 갖는, 약제학적 조성물:
    (a) 서열번호 2(젠뱅크 NP_000193)의 약 아미노산 1 내지 약 550; 및
    (b) 서열번호 2의 약 산 21 내지 약 550에 융합된 이종성 리더 서열을 포함하는 합성 인간 효소;
    (c) 서열번호 2의 약 산 21 내지 약 455에 융합된 이종성 리더 서열을 포함하는 합성 인간 효소;
    (d) 서열번호 2의 약 산 34 내지 약 550에 융합된 이종성 리더 서열을 포함하는 합성 인간 효소; 또는
    (d) 서열번호 2의 약 산 34 내지 약 455에 융합된 이종성 리더 서열을 포함하는 합성 인간 효소.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 5' 반전 말단 반복부(ITR) 서열, CB7 프로모터, 닭 베타 액틴 인트론, 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화(폴리A) 신호, 및/또는 3' ITR 서열을 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 AAV ITR은 AAV9에 대해서 이종성인, 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 ITR은 AAV2로부터 유래된, 약제학적 현탁액.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 6 내지 9의 pH를 갖는, 약제학적 현탁액.
  10. 제9항에 있어서, 상기 현탁액은 6.8 내지 7.8의 pH를 갖는, 약제학적 현탁액.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 척추강내 주사를 통한 전달을 위해서 제형화된, 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 신생아 환자에게 전달하기 위해서 제형화되고, 약 3.8 x 1012게놈 카피(GC) 내지 약 1.9 x 1014GC를 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 약 3개월 내지 약 9개월령인 환자에게 전달하기 위해서 제형화되고, 약 6 x 1012GC 내지 약 3 x 1014GC를 포함하는, 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 약 9개월 내지 약 36개월령인 환자에게 전달하기 위해서 제형화되고, 약 1 x 1013GC 내지 약 5 x 1014GC를 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 약 3세 내지 약 12세인 환자에게 전달하기 위해서 제형화되고, 약 1.2 x 1013GC 내지 약 6 x 1014GC를 포함하는, 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 약 12세 이상인 환자에게 전달하기 위해서 제형화되고, 약 1.4 x 1013GC 내지 약 7 x 1014GC를 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 척추강내 주사에 의해서 투여될 수 있는, 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 필요로 하는 인간 대상체에게 척추강내 주사에 의해서 투여될 수 있는 의약의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  19. 제18항에 있어서, 상기 인간 대상체는 점액다당류증 II(mucopolysaccharidosis II: MPS II) 또는 중증 헌터 증후군(Hunter syndrome)으로 진단된, 용도.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 현탁액의 구성성분 및 척추강내 투여에 필요한 구성성분을 포함하는, 키트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 현탁액을 희석하는 데 유용한 희석 완충액을 더 포함하는, 키트.
  22. 수성 현탁액 베이스, 및 5' ITR, 닭 베타 액틴 프로모터, 인트론, 인간 IDS 암호 서열, 토끼 베타 글로빈 폴리A 및 3' ITR을 포함하는 게놈을 갖는 rAAV9 벡터를 포함하는 6 내지 9 범위의 pH를 갖는, 수성 액체 현탁액.
  23. 점액다당류증 II(MPS II)로 진단된 인간 대상체의 치료 방법으로서, 점액다당류증 II(MPS II)의 치료를 필요로 하는 상기 인간 대상체에게 척추강내 주사에 의해서, 제형 완충액 중의 복제 결함 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)의 현탁액을 2.5 x 1010GC/g 뇌 질량 내지 약 3.6 x 1011GC/g 뇌 질량의 용량으로 투여하는 단계를 포함하되,
    (a) 상기 rAAV는 AAV9 캡시드에 패키징된 인간 이두로네이트-2-설페이타제(hIDS)를 암호화하는 이종성 핵산을 포함하는 rAAV를 포함하고;
    (b) 상기 제형 완충액은 생리학적으로 상용성인 수성 완충액, 계면활성제 및 임의적인 부형제를 포함하며;
    (c) (i) 상기 rAAV 게놈 카피(GC) 역가는 적어도 1.0 x 1013GC/㎖(+/-20%)이고/이거나; (ii) 상기 rAAV 중공 입자/전입자 비는 0.01 내지 0.05(95% 내지 99% 중공 캡시드 무함유)이고/이거나; (iii) 적어도 약 2.5 x 1010GC/g 뇌 질량 내지 약 3.6 x 1011GC/g 뇌 질량의 rAAV 현탁액의 용량이 효력을 갖는, 치료 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 인간 대상체는 2세 이상이고, 중증 헌터 증후군으로 진단된, 치료 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 인간 대상체는 신경인지 결핍을 갖거나 또는 신경인지 결핍 발달의 위험이 있는, 치료 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 2세 이상이고, 중증 헌터병과 상관관계가 있다고 공지된 주요 재배열 또는 결실 돌연변이의 존재로 진단된, 치료 방법.
  27. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 베일리 영아 발달 검사(Bayley Scales of Infant Development)를 사용하여 평가되는 경우, 상기 대상체에서 신경인지 발달 지수(DQ)의 증가를 초래하는, 치료 방법.
  28. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 헌터 증후군을 갖는 환자에서 미치료/자연 이력 대조군 데이터에 비해서 상기 대상체에서 15점 이하의 DQ의 감소를 초래하는, 치료 방법.
  29. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 환자로부터의 혈청 샘플에서 측정되는 경우, 기능성 hIDS 수준의 증가를 초래하는, 치료 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 환자의 혈청, 소변 및/또는 뇌척수액(CSF)의 샘플에서 측정되는 경우, GAG 수준의 감소를 초래하는, 치료 방법.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 간-지향된 주사에 의해서 상기 환자에게 AAV.hIDS를 투여하는 단계를 더 포함하는, 치료 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 간-지향된 AAV.hIDS는 AAV8, AAVrh64R1, AAVrh64R2, rh8, rh10, AAV3B 또는 AAVdj로부터 선택된 캡시드를 갖는, 치료 방법.
  33. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 효력은 시험관내 검정에 의해서 측정되는, 치료 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 시험관내 검정은 세포당 기지의 다중도의 rAAV GC 역가로 HEK293 세포를 형질도입시키는 단계, 및 4MU-이두로나이드-2-설페이트 효소 검정을 사용하여 형질도입 72시간 후 hIDS 활성도에 대해서 상청액을 검정하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  35. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 hIDS 암호 서열은 기능성 hIDS를 암호화하는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1과 적어도 약 80% 동일한 서열을 갖는, 치료 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암호화된 것은 하기와 같은, 치료 방법:
    (a) 서열번호 2(젠뱅크 NP_000193)의 약 아미노산 1 내지 약 550; 및
    (b) 서열번호 2의 약 산 21 내지 약 550에 융합된 이종성 리더 서열을 포함하는 합성 인간 효소;
    (c) 서열번호 2의 약 산 21 내지 약 455에 융합된 이종성 리더 서열을 포함하는 합성 인간 효소;
    (d) 서열번호 2의 약 산 34 내지 약 550에 융합된 이종성 리더 서열을 포함하는 합성 인간 효소;
    (d) 서열번호 2의 약 산 34 내지 약 455에 융합된 이종성 리더 서열을 포함하는 합성 인간 효소.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 5' 반전 말단 반복부(ITR) 서열, CB7 프로모터, 닭 베타 액틴 인트론, 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화(폴리A) 신호, 및/또는 3' ITR 서열을 더 포함하는, 치료 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 AAV ITR은 AAV9에 대해서 이종성인, 치료 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 ITR은 AAV2로부터 유래된, 치료 방법.
  40. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 6 내지 9의 pH를 갖는, 치료 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 현탁액은 6.8 내지 7.8의 pH를 갖는, 치료 방법.
  42. 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 척추강내 주사를 통한 전달을 위해서 제형화된, 치료 방법.
  43. 제23항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 신생아 환자에게 전달하기 위해서 제형화되고, 약 3.8 x 1012게놈 카피(GC) 내지 약 1.9 x 1014GC를 포함하는, 치료 방법.
  44. 제23항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 약 3개월 내지 약 9개월령인 환자에게 전달하기 위해서 제형화되고, 약 6 x 10123GC 내지 약 3 x 1014GC를 포함하는, 치료 방법.
  45. 제23항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 약 9개월 내지 약 36개월령인 환자에게 전달하기 위해서 제형화되고, 약 1 x 1013GC 내지 약 5 x 1014GC를 포함하는, 치료 방법.
  46. 제23항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 약 3세 내지 약 12세인 환자에게 전달하기 위해서 제형화되고, 약 1.2 x 1013GC 내지 약 6 x 1014GC를 포함하는, 치료 방법.
  47. 제23항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁액은 약 12세 이상인 환자에게 전달하기 위해서 제형화되고, 약 1.4 x 1013GC 내지 약 7 x 1014GC를 포함하는, 치료 방법.
  48. MPS II 및/또는 헌터 증후군과 연관된 증상을 갖는 인간 환자의 치료 방법으로서,
    (a) MPS II 및/또는 헌터 증후군과 연관된 증상을 갖는 환자에게 이식유전자-특이적 관용(transgene-specific tolerance)을 유도하기에 충분한 양의 hIDS 효소를 투여하는 단계; 및
    (b) rAAV.hIDS를 상기 환자에게 투여하고, rAAV.hIDS가 상기 환자에서 hIDS의 치료 수준의 발현을 유도하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 단계 (a)의 hIDS는 재조합 단백질로서 투여되는, 치료 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 환자는 유아인, 치료 방법.
  51. 제48항에 있어서, 상기 투여 단계 (b)는 투여 단계 (a) 약 3일 내지 약 14일 후에 수행되는, 치료 방법.
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