BRPI0707590A2 - terapia gÊnica para a doenÇa de niemann-pick do tipo a - Google Patents

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Marco A Passini
Robin J Ziegler
James Dodge
Lamya Shihabuddin
Seng H Cheng
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Abstract

TERAPIA GÊNICA PARA A DOENÇA DE NIE-MANN-PICK DO TIPO A. A prsente invenção refere-se a processos e a composições para fornecer capacidade de tolerância ao cérebro de um mamífero ao polipeptídeo da esfingomielinase ácida administrado exogenamente fornecendo pri- meiro uma quantidade eficiente de um transgene que codifica o polipeptídeo ao tecido hepático do mamífero e então a administração de uma quantidade eficiente do transgene ao sistema nervoso central (SNC) do mamífero.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPIAGÊNICA PARA A DOENÇA DE NIEMANN-PICK DO TIPO A".
Referência Cruzada aos Pedidos de Patentes Relacionados
Este pedido de patente reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) ao Pedido de Patente U.S. Provisório N2 de Série 60/771.628, depositadoem 8 de fevereiro de 2006 e ao Pedido de Patente U.S. Provisório N2 de Sé-rie 60/772.360 depositado em 9 de fevereiro de 2006 cujos conteúdos sãoincorporados aqui como referência na presente descrição.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a composições e a métodos parao tratamento de distúrbios que afetam o cérebro e as vísceras, por exemplo,a Doença de Niemann-Pick do Tipo A.
Sumário da Invenção
Um grupo de distúrbios metabólicos conhecidos como doençasde armazenamento Iisossomal (LSD) inclui mais de quarenta distúrbios ge-néticos, dos quais muitos envolvem defeitos genéticos em várias hidrolaseslisossomais. As doenças de armazenamento Iisossomal representativas e asenzimas defeituosas associadas são listadas na Tabela 1
Tabela 1
<table>table see original document page 2</column></row><table><table>table see original document page 3</column></row><table>
* envolvimento do SNC
A característica marcante das LSD é o acúmulo anormal de me-tabólitos nos Iisossomos que leva à formação de grandes números de lisos-somos distendidos no pericário. Um desafio principal para o tratamento dasLSD (que é oposto ao tratamento de uma enzimopatia específica ao fígado)é a necessidade de reverter a patologia de armazenamento Iisossomal emvários tecidos separados. Algumas LSDs podem ser tratadas eficientementeatravés da infusão intravenosa da enzima que está faltando, conhecida co-mo terapia de reposição enzimática (ERT). Por exemplo, pacientes comGaucher do tipo 1 possuem apenas doença visceral e respondem favora-velmente a ERT com a glucocerebrosidase recombinante (Cerezyme®,Genzyme Corp.). Entretanto, pacientes com doença metabólica que afeta oSNC (por exemplo, doença de Gaucher do tipo 2 ou 3) não respondem com-pletamente à ERT intravenosa porque a enzima de reposição é impedida deentrar no cérebro pela barreira cérebro sangue (BBB). Além disso, as tenta-tivas iniciais de introduzir uma enzima de reposição no cérebro através dainjeção direta da proteína foram limitadas em parte por causa da citotoxici-dade da enzima em altas concentrações locais e taxas de difusão parenqui-mal limitadas no cérebro (Pardridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, Ra-ven Press, 1991).
Em adição, podem ser desenvolvidos anticorpos contra as enzi-mas infundidas utilizadas na terapia de reposição enzimática. Tais anticor-pos podem não ter significado clínico ou podem levar a reações de hiper-sensibilidade ou à menor disponibilidade biológica das proteínas terapêuti-cas. Hunley, Τ. E. e outros (2004) Pediatrics 114(4):e532-e535. Por exem-plo, Kakkis E. e outros (2004) PNAS 101 (3): 829-834 relatam que efeitosadversos de anticorpos sobre a terapia de reposição enzimática de distúr-bios de armazenamento Iisossomal foram observados no modelo canino demucopolissacaridose I (MPS I). Os autores também relatam resultados simi-lares em outros modelos de animais de distúrbios de MPS, incluindo MPS I,MPS Vl e MPS VII. A redução na resposta imunológica gerada por estas pro-teínas pode ser desejável. A indução de tolerância específica ao antígeno éum método potencial para reduzir tal resposta imunológica, mas foi relatadacomo sendo difícil de conseguir.
A terapia gênica é uma modalidade de tratamento emergentepara distúrbios que afetam o SNC1 incluindo as LSDs. Os resultados promis-sores em um modelo de animal aceito foram conseguidos utilizando a tera-pia gênica para o tratamento da doença de Neimann-Pick do Tipo A (NPA).Dodge e outros (2005) PNAS 102(49): 18722-17827. A NPA é um distúrbiode armazenamento Iisossomal causado por uma deficiência na atividade daesfingomielinase ácida (ASM). A perda da atividade da ASM resulta no acú-mulo da esfingomielina (SPM) lisossomal, defeitos metabólicos secundáriostal como o metabolismo aberrante do colesterol e a perda subseqüente dafunção celular em sistemas de órgãos incluindo o sistema nervoso central(SNC). Schuchman e Desnick, The Metabolic and Molecular Bases of Inher-ited Disease, McGraw-HiII1 Nova York, pp. 3589-3610 e Horinouchi e outros(1995) Nat. Genet. 10:288-293.
Esta invenção fornece um método que compreende as etapasde administração de uma quantidade eficiente de um vetor viral que compre-ende um transgene que codifica um agente imunogênico ao tecido hepáticode mamífero e de administração subseqüentemente de uma quantidade efi-ciente de um segundo vetor viral que compreende um transgene que codificaum agente imunogênico ao cérebro do mamífero.
É também fornecido um método para o tratamento da Doença deNiemann-Pick do Tipo A em um mamífero que compreende as etapas deadministração de uma quantidade eficiente de um vetor viral que compreen-de um transgene que codifica um polipeptídeo da esfingomielinase ácida aotecido hepático do mamífero e subseqüentemente de administração de umaquantidade eficiente de um segundo vetor viral que compreende um trans-gene que codifica um polipeptídeo da esfingomielinase ácida ao cérebro dodito mamífero, tratando assim a Doença de Niemann-Pick do Tipo A no ma-mífero.
A invenção fornece ainda métodos e composições para fornecera capacidade de tolerância ao cérebro de um mamífero a um agente imuno-gênico pré-selecionado fornecendo primeiramente de forma sistemática umaquantidade eficiente do agente imunogênico através de um transgene e en-tão administrando uma quantidade eficiente do agente imunogênico ao sis-tema nervoso central (SNC) do mamífero.
Fornece ainda métodos e composições para fornecer capacida-de de tolerância ao cérebro de um mamífero ao polipeptídeo da esfingomie-Iinase ácida fornecendo primeiramente uma quantidade eficiente de umtransgene que codifica o polipeptídeo ao fígado do mamífero e então admi-nistrando uma quantidade eficiente do transgene para o polipeptídeo ao sis-tema nervoso central (SNC) do mamífero.
A invenção fornece ainda métodos e composições para melhoraros sintomas associados com a Doença de Niemann-Pick do Tipo A (NPA)em um mamífero sofrendo de NPA através da transdução do tecido cerebraldo mamífero com uma quantidade eficiente de um transgene que codifica opolipeptídeo da esfingomielinase ácida após a transdução do fígado do ma-mífero com o mesmo transgene.
As vantagens adicionais da invenção serão apresentadas emparte na descrição a seguir e em parte serão entendidas partindo da descri-ção ou podem ser aprendidas através da prática da invenção.Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 mostra graficamente vários sítios de administração dotransgene nos sistemas nervosos centrais dos camundongos.20 A Figura 2 mostra graficamente o peso corporal dos camundon-
gos tratados como uma medida de bom estado. As medidas começaram naidade de 6 semanas (o tratamento começou na quarta semana). Durante operíodo de tempo de 6 até 36 semanas (2 até 32 semanas após a injeçãosistêmica do transgene) todos os grupos foram comparados com os camun-25 dongos ASMKO não tratados. Legenda da figura: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p< 0,001; ns (não significativo).
A Figura 3 mostra graficamente os resultados do teste de Rota-rod de Aceleração como uma medida da recuperação da função motora. Asmedidas começaram na idade de 10 semanas (o tratamento começou na30 quarta semana). Durante o período de tempo entre 10 e 36 semanas (6 até32 semanas após a injeção sistêmica do transgene) todos os grupos foramcomparados com os camundongos ASMKO não tratados. Legenda da figura:*ρ < 0,05; **ρ < 0,01; ***ρ < 0,001; ns (não significativo).
A Figura 4 mostra graficamente os resultados do teste de Rota-rod de Balanço como uma medida da recuperação da função motora. Asmedidas começaram na idade de 10 semanas (o tratamento começou naquarta semana). Durante o período de tempo entre 10 e 36 semanas (6 até32 semanas após a injeção sistêmica do transgene) todos os grupos foramcomparados com os camundongos ASMKO não tratados. Legenda da figura:*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ns (não significativo).
A Figura 5 mostra graficamente os resultados do teste no Labi-rinto de Barnes como uma medida da recuperação da função cognitiva. Asmedidas começaram na idade de 17 semanas (o tratamento começou naquarta semana). Durante o período de tempo entre 17 e 33 semanas (13 até29 semanas após a injeção sistêmica do transgene) todos os grupos foramcomparados com os camundongos ASMKO não tratados. Legenda da figura:*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ns (não significativo).
A Figura 6 mostra graficamente que a terapia de combinaçãogênica de ASM estende o tempo de vida de camundongos ASMKO. O tempode vida médio dos camundongos ASMKO era de 34 semanas. O tempo devida médio para camundongos que receberam o transgene sistêmico era de45 semanas (p < 0,0001). O tempo de vida médio para os camundongos quereceberam o transgene intracraniano era de 43 semanas (p < 0,0001). Otempo de vida para os camundongos que receberam a terapia com o trans-gene intracraniano e sistêmico era de 100 % em 54 semanas.
As Figuras 7 A até 7 D mostram graficamente níveis de anticor-pos anti-hASM na circulação para camundongos tratados e não tratados.Legenda da figura: *p < 0,05; **p < 0,01 ; ***p < 0,001. A Figura 7 E mostraos níveis de proteína ASM humana no soro sangüíneo ao longo do tempo.
As Figuras 8 A até 8 F mostram graficamente os níveis de esfin-gomielina no cérebro de camundongos tratados e não tratados.
As Figuras 9 A até 9 D mostram graficamente os níveis de esfin-gomielina em várias vísceras de camundongos tratados e não tratados.
Descrição Detalhada da InvençãoAo longo de toda esta descrição, várias publicações, patentes erelatórios descritivos de patentes publicados são referidos através de umacitação de identificação. As descrições destas publicações, patentes e rela-tórios descritivos de patentes publicados são incorporados aqui como refe-rência na presente descrição para descrever mais completamente o estadoda técnica ao qual esta invenção se refere.
Definições
A prática da presente invenção empregará, a não ser que sejaindicado de outra maneira, técnicas convencionais de imunologia, de biolo-gia molecular, de microbiologia, de biologia celular e de DNA recombinante,que estão dentro da perícia da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsche Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- edição (1989); Cur-rent Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel e outros eds., (1987)); asérie Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.): Pcr 2: A Practical Ap-proach (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow eLane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL AND ANIMALCELL CULTURE (R.l. Freshney, ed. (1987)).
Como utilizado aqui, certos termos possuem os significados de-finidos a seguir. Como utilizado no relatório descritivo e nas reivindicações,as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem referências no plural anão ser que o contexto indique claramente de outra maneira. Por exemplo, otermo "uma célula" inclui um grande número de células, incluindo misturasdas mesmas.
Os termos "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" são utilizadosde forma intercambiável e se referem a uma forma polimérica de nucleotí-deos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeosou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estruturatridimensional e podem realizar qualquer função, conhecida ou desconheci-da. A seguir, estão os exemplos não Iimitantes de polinucleotídeos: um geneou um fragmento gênico (por exemplo, uma sonda, um iniciador, uma ESTou uma marcação SAGE), éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNAde transferência, RNA ribossomal, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos re-combinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isola-do de qualquer seqüência, RNA isolado de qualquer seqüência, sondas einiciadores da ácidos nucléicos. Um polinucleotídeo pode compreender nu-cleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nu-cleotídeos. Se presentes, as modificações na estrutura dos nucleotídeos po-dem ser concedidas antes ou após a montagem do polímero. A seqüênciade nucleotídeos pode ser interrompida por componentes sem ser nucleotí-deos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após a poli-merização, tal como através da conjugação com um componente de marca-ção. O termo refere-se ainda a moléculas de filamento tanto duplo quantosimples. A não ser que seja especificado ou requerido de outra maneira,qualquer modalidade desta invenção que é um polinucleotídeo abrange tantoa forma de filamento duplo quanto cada uma das duas formas de filamentosimples complementares conhecidas ou previstas por constituírem a formade filamento duplo.
Um polinucleotídeo é composto de uma seqüência específica dequatro bases de nucleotídeos: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina(T); e uracila (U) para guanina quando o polinucleotídeo for RNA. Assim, otermo "seqüência de polinucleotídeo" é a representação alfabética de umamolécula de polinucleotídeo. Esta representação alfabética pode ser inseridanos bancos de dados em um computador que possui uma unidade de pro-cessamento central e utilizado para as aplicações de bioinformática tais co-mo a genômica funcional e a pesquisa de homologia.
Um "gene" refere-se a um polinucleotídeo que contém pelo me-nos um quadro aberto de leitura (ORF) que é capaz de codificar um polipep-tídeo ou uma proteína particular após ser transcrito e traduzido. Qualqueruma das seqüências de polinucleotídeos descritas aqui pode ser utilizadapara a identificação de fragmentos maiores ou seqüências codificadoras decomprimento completo do gene com o qual estão associadas. Os métodosde isolamento de seqüências de fragmentos maiores são conhecidos pelosversados na técnica.
Um "produto gênico" ou alternativamente um "produto da ex-pressão gênica" refere-se ao aminoácido (por exemplo, peptídeo ou polipep-tídeo) gerado quando um gene é transcrito e traduzido.
O termo "polipeptídeo" é utilizado de forma intercambiável com otermo "proteína" e em seu sentido mais amplo refere-se a um composto deduas ou mais subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos e imi-tadores de peptídeos. As subunidades podem ser ligadas por ligações peptí-dicas. Em uma outra modalidade, a subunidade pode ser ligada por outrasligações, por exemplo, éster, éter etc. Como utilizado aqui o termo "aminoá-cido" refere-se a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, inclu-indo glicina e isômeros ópticos tanto D quanto L, análogos de aminoácidos eimitadores de peptídeos. Um peptídeo de três ou mais aminoácidos é co-mumente chamado de oligopeptídeo se a cadeia peptídica for curta. Se acadeia peptídica for longa, o peptídeo é comumente chamado de polipeptí-deo ou proteína.
"Sob controle transcricional" é um termo bem entendido na téc-
nica e indica que a transcrição de uma seqüência de polinucleotídeo, geral-mente uma seqüência de DNA, depende do fato desta estar ligada de formaoperacional a um elemento que contribui ao início de ou promove, a transcri-ção. "Ligados de forma operacional" refere-se a uma justaposição em que oselementos estão em um arranjo que os permite funcionar.
Como utilizado aqui, é entendido que o termo "compreendendo"significa que as composições e os métodos incluem os elementos citados,mas não excluindo outros. "Consistindo essencialmente de" quando utilizadopara definir as composições e os métodos, deve significar a exclusão de ou-tros elementos de qualquer significado essencial para a combinação. Assim,uma composição que consiste essencialmente nos elementos que são defi-nidos aqui não excluiriam contaminantes traços do método de isolamento ede purificação e veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como soluçãosalina tamponada com fosfato, preservantes e similares. "Consistindo em"deve significar a exclusão de mais do que os elementos traços de outrosingredientes e etapas do método substanciais para a administração dascomposições desta invenção. As modalidades definidas através de qualquerum destes termos de transição estão dentro do âmbito desta invenção.
O termo "isolado" significa separado de constituintes, células eoutros, em que o polinucleotídeo, o peptídeo, o polipeptídeo, a proteína, oanticorpo ou o(s) fragmento(s) dos mesmos, aos quais está(ão) normalmen-te associado(s) na natureza. Em um aspecto desta invenção, um polinucleo-tídeo isolado é separado dos nucleotídeos contíguos a 3' e a 5' com os quaisestá normalmente associado em seu ambiente nativo ou natural, por exem-plo, no cromossomo. Como é evidente aos versados na técnica, um polinu-cleotídeo, um peptídeo, um polipeptídeo, uma proteína, um anticorpo oufragmento(s) dos mesmos que não ocorre(m) naturalmente, não requer(em)"isolamento" para distingui-lo(s) de seu correspondente que ocorre natural-mente. Em adição, um polinucleotídeo, um peptídeo, um polipeptídeo, umaproteína, um anticorpo ou fragmento(s) dos mesmos "concentrado(s)", "se-parado(s)" ou "diluído(s)", pode(m) ser distinguido(s) de seu correspondenteque ocorre naturalmente em que a concentração ou o número de moléculaspor volume é maior que "concentrado" ou menor que "separado" do que seucorrespondente que ocorre naturalmente. Um polinucleotídeo, um peptídeo,um polipeptídeo, uma proteína, um anticorpo ou fragmento(s) dos mesmos,que difere(m) do correspondente que ocorre naturalmente em sua seqüênciaprimária ou, por exemplo, em seu padrão de glicosilação, não precisa(m)estar presente(s) em sua forma isolada uma vez que pode(m) ser distingui-do(s) de seu correspondente que ocorre naturalmente por sua seqüênciaprimária ou, alternativamente, por uma outra característica tal como o padrãode glicosilação. Assim, um polinucleotídeo que não ocorre naturalmente éfornecido como uma modalidade separada do polinucleotídeo isolado queocorre naturalmente. Uma proteína produzida em uma célula bacteriana éfornecida como uma modalidade separada da proteína que ocorre natural-mente isolada de uma célula eucariótica em que é produzida na natureza.
"Fornecimento de gene", "transferência gênica" e similar comoutilizado aqui, são termos que se referem à introdução de um polinucleotídeoexógeno (algumas vezes referido como um "transgene") em uma célula hos-pedeira, independente do método utilizado para a introdução. Tais métodosincluem uma variedade de técnicas bem-conhecidas tal como a transferênciagênica mediada por vetor (por exemplo, através de infecção/transfecção viralou vários outros complexos de fornecimento de genes baseados em proteí-nas ou baseados em lipídeos) assim como técnicas que facilitam o forneci-mento de polinucleotídeos "nus" (tais como eletroporação, fornecimento por"pistola gênica" e várias outras técnicas utilizadas para a introdução de poli-nucleotídeos). O polinucleotídeo introduzido pode ser mantido de forma es-tável ou transitória na célula hospedeira. A manutenção estável requer tipi-camente que o polinucleotídeo introduzido contenha uma origem de replica-ção compatível com a célula hospedeira ou que se integre dentro de um re-plicon da célula hospedeira tal como um replicon extracromossômico (porexemplo, um plasmídeo) ou um cromossomo nuclear ou mitocondrial. É co-nhecido na técnica um número de vetores que são capazes de mediar atransferência de genes para células de mamíferos.
Um "veículo de fornecimento gênico" é definido como qualquermolécula que possa carregar polinucleotídeos inseridos dentro de uma célu-la hospedeira. Os exemplos de veículos de fornecimento gênico são Iipos-somos, polímeros biocompatíveis, incluindo polímeros naturais e polímerossintéticos; lipoproteínas; polipeptídeos; polissacarídeos; lipopolissacarídeos;envelopes virais artificiais; células de levedura recombinantes, partículasmetálicas; e bactérias ou vírus, tais como baculovírus, adenovírus e retroví-rus, bacteriófago, cosmídeo, vetores fúngicos e outros veículos de recombi-nação tipicamente utilizados na técnica que foram descritos para a expres-são em uma variedade de hospedeiros eucarióticos e procarióticos e podemser utilizados para terapia gênica assim como para a expressão simples deproteína.
Um "vetor viral" é definido como um vírus ou uma partícula viralproduzida de forma recombinante que compreende um polinucleotídeo queserá fornecido para dentro de uma célula hospedeira, in vivo, ex vivo ou invitro. Os exemplos de vetores virais incluem vetores retrovirais, vetores ade-novirais, vetores virais associados a adeno, vetores alfavirais e similares. Osvetores alfavirais, tais como os vetores baseados no vírus Semliki Forest evetores baseados no vírus Sindbis, também foram desenvolvidos para usona terapia gênica e na imunoterapia. Ver, Schlesinger e Dubensky (1999)Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 e Ying e outros (1999) Nat. Med. 5(7):823-827. Em aspectos em que a transferência gênica é mediada por um vetorretroviral, uma construção de vetor refere-se ao polinucleotídeo que compre-ende o genoma retroviral ou parte do mesmo e um gene terapêutico. Comoutilizado aqui, "transferência gênica mediada por retrovírus" ou "transduçãoretroviral" carrega o mesmo significado e refere-se ao processo através doqual um gene ou seqüências de ácidos nucléicos são transferidas de formaestável para dentro da célula hospedeira em virtude do vírus entrar na célulae integrar seu genoma dentro do genoma da célula hospedeira. O vírus podeentrar na célula hospedeira através de seu mecanismo de infecção normalou pode ser modificado de forma que se liga a um receptor de superfície ouligante diferente da célula hospedeira para entrar na célula. Como utilizado aqui, "vetor retroviral" refere-se a uma partícula viral capaz de introduzir oácido nucléico exógeno dentro de uma célula através de um mecanismo deentrada viral ou similar ao viral.
Em aspectos em que a transferência gênica é mediada por umvetor viral de DNA, tal como um adenovírus (Ad) ou um vírus associado aadeno (AAV)1 uma construção de vetor refere-se ao polinucleotídeo quecompreende o genoma viral ou parte do mesmo e um transgene. Os adeno-vírus (Ads) são um grupo de vírus homogêneo relativamente bem caracteri-zado, que inclui mais de 50 sorotipos. Ver, por exemplo, a WO 95/27071. OsAds são fáceis de cultivar e não requerem integração dentro do genoma dacélula hospedeira. Os vetores derivados de Ad recombinante, particularmen-te aqueles que reduzem o potencial de recombinação e a obtenção do vírusdo tipo selvagem, também foram construídos. Ver, por exemplo, a WO95/00655 e a WO 95/11984. O AAV do tipo selvagem possui alta capacidadede infecção e especificidade de integração dentro do genoma da célula hos-pedeira. Ver, Hermonat e Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA81:6466-6470 e Lebkowski e outros (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996. Osvetores AAV recombinantes também são conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, a WO 01/36620 A2.
Os vetores que contêm tanto um promotor quanto um sítio declonagem nos quais um polinucleotídeo pode ser ligado de forma operacio-nal são bem conhecidos na técnica. Tais vetores são capazes de transcreverRNA in vitro ou in vivo e estão disponíveis comercialmente de fontes taiscomo Stratagene (La Jolla, CA) e Promega Biotech (Madison, Wl). Para oti-mizar a expressão e/ou a transcrição in vitro, pode ser necessário remover,adicionar ou alterar as partes não traduzidas a 5' e/ou a 3' dos clones paraeliminar códons de início da tradução alternativos inapropriados potenciaisextras ou outras seqüências que podem interferir na ou reduzir a expressão,no nível da transcrição ou da tradução. Alternativamente, os sítios de ligaçãode ribossomos consensos podem ser inseridos imediatamente a 5' do códonde início para aumentar a expressão.
Os veículos de fornecimento gênico também incluem vários ve-tores não virais, incluindo complexos de DNA/lipossomo, células de levedurarecombinantes e complexos de proteína-DNA virais direcionados. Os Iipos-somos que compreendem também um anticorpo de direcionamento ou umfragmento do mesmo podem ser utilizados nos métodos desta invenção. Pa-ra aumentar o fornecimento para uma célula, o ácido nucléico ou as proteí-nas desta invenção podem ser conjugados a anticorpos ou fragmento(s) deligação dos mesmos que ligam antígenos da superfície celular, por exemplo,TCR, CD3 ou CD4.
Os termos "partículas genômicas (gp)" ou "equivalentes genômi-cos", como utilizado em referência a um título viral, referem-se ao número devírions contendo o genoma de DNA do AAV recombinante, independente dacapacidade de infecção ou da funcionalidade. O número de partículas ge-nômicas em uma preparação de vetor particular pode ser medido através deprocedimentos tais como os descritos nos Exemplos contidos aqui ou, porexemplo, em Clark e outros (1999) Hum. Gene Ther. 10:1031-1039 e Veld-wijk e outros (2002) Mol. Ther. 6:272-278.
Os termos "unidade de infecção (iu)", "partícula infecciosa" ou"unidade de replicação", que são utilizados em referência a um título viral,referem-se ao número de partículas infecciosas de vetor que é medido atra-vés do ensaio de centro infeccioso, também conhecido como ensaio de cen-tro de replicação, que é descrito, por exemplo, em McLaughIin e outros(1988) J. Virol. 62:1963-1973.
O termo "unidade de transdução (tu)" que é utilizado em referên-cia a um título viral, refere-se ao número de partículas infecciosas de vetorque resultam na obtenção de um produto de transgene funcional que é me-dido em ensaios funcionais tais como os descritos em Xiao e outros (1997)Exp. Neurobiol. 144:113-124 ou em Fisher e outros (1996) J. Virol. 70:520-532 (ensaio LFU).
Os termos "terapêutica", "quantidade terapeuticamente eficiente"e seus correspondentes referem-se à quantidade de um composto que resul-ta na prevenção ou no retardo do início ou na melhora de sintomas em umindivíduo ou na obtenção de um resultado biológico desejado, tal como acorreção de neuropatologia, por exemplo, patologia celular associada comuma doença de armazenamento Iipossomal tal com a descrita aqui ou emWalkley (1998) Brain Pathol. 8:175-193. O termo "correção terapêutica" refe-re-se ao grau de correção que resulta na prevenção ou no retardo do inícioou na melhora dos sintomas em um indivíduo. A quantidade eficiente podeser determinada através de métodos bem conhecidos na técnica e comodescrito nas seções subseqüentes.
É pretendido que uma "composição" signifique uma combinaçãode agente ativo e um outro componente ou composição, inerte (por exemplo,um agente ou uma marcação que pode ser detectada) ou ativa, tal como umadjuvante.
É pretendido que uma "composição farmacêutica" inclua a com-binação de um agente ativo com um veículo, inerte ou ativo, tornando acomposição adequada para uso para diagnóstico ou terapêutico in vitro, invivo ou ex vivo.
Como utilizado aqui, o termo "veículo farmaceuticamente aceitá-vel" abrange qualquer um dos veículos farmacêuticos padronizados, tal co-mo uma solução salina tamponada com fosfato, água e emulsões, tal comoum emulsão de óleo/água ou água/óleo e vários tipos de agentes umectan-tes. As composições também podem incluir agentes estabilizantes e preser-vantes. Para exemplos de veículos, estabilizantes e adjuvantes; ver, Martin,Remington1S Pharm. Sci., 15â Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975)).
Uma "quantidade eficiente" é uma quantidade suficiente pararealizar resultados benéficos ou desejados tal como a prevenção ou o trata-mento. Uma quantidade eficiente pode ser administrada em uma ou maisadministrações, aplicações ou dosagens.
Um "sujeito", "indivíduo" ou "paciente" é utilizado de forma inter-cambiável aqui e refere-se a um vertebrado, preferencialmente um mamífe-ro, mais preferencialmente um ser humano. Os mamíferos incluem, mas nãoestão limitados a murinos, símios, humanos, animais de fazenda, animais deesporte e animais de estimação.
Um "controle" é um indivíduo ou uma amostra alternativa utiliza-da em um experimento com a finalidade de comparação. Um controle podeser "positivo" ou "negativo". Por exemplo, quando a finalidade do experimen-to for determinar uma correlação de um nível de expressão alterado de umgene com uma doença, é geralmente preferível utilizar um controle positivo(um indivíduo ou uma amostra de um indivíduo, que carrega tal alteração eexibe síndromes características de tal doença) e um controle negativo (umindivíduo ou uma amostra de um indivíduo que não possui a expressão alte-rada e a síndrome clínica de tal doença).
Administração de proteínas através da terapia gênica de vetoresvirais capazes de infectar neurônios pós-mitóticos. Para uma revisão de ve-tores virais para fornecimento gênico no SNC, ver Davidson e outros (2003)Nature Rev. 4:353-364. Os vetores de vírus associados a adeno (AAV) sãoúteis para a terapia gênica para o SNC porque são substancialmente não-tóxicos, não-imunogênicos, neurotrópicos e podem manter a expressão noSNC (Kaplitt e outros (1994) Nat. Genet. 8:148-154; Bartlett e outros (1998)Hum. Gene Ther. 9:1181-1186; e Passini e outros (2002) J. Neurosci.,22:6437-6446). Como demonstrado aqui, a expressão de um transgene nocérebro de um animal resultou em uma resposta imunológica ao produto dotransgene. Ver a Figura 7A.
Os requerentes descobriram que a administração de um trans-gene ao SNC de um mamífero que obteve capacidade de tolerância aotransgene aumenta a eficiência do tratamento. Assim, em um aspecto, estainvenção fornece um método para fornecer capacidade de tolerância ao cé-rebro de um mamífero a um agente imunogênico pré-selecionado através daadministração sistêmica de uma quantidade eficiente do agente imunogênicopré-selecionado ao mamífero antes da administração de uma quantidadeeficiente do agente imunogênico pré-selecionado ao SNC do mamífero. Co-mo utilizado aqui, é pretendido que o termo "fornecer capacidade de tolerân-cia" signifique reduzir a resposta imunológica a um agente imunogênico. Otermo "agente imunogênico" deve incluir qualquer agente que ative inicial-mente uma resposta imunológica (mediada por células T ou por células B).
Como demonstrado por Ziegler e outros (2004), a expressão do transgeneno fígado após a administração de um vetor AAV recombinante que codificao transgene sob o controle de um intensificador/promotor específico ao fíga-do resultou em uma resposta de anticorpo reduzida contra o transgene ex-presso.
O método é adequado para qualquer mamífero e, como tal, um"mamífero" inclui, mas não está limitado a murinos, símios, humanos, ani-mais de fazenda, animais de esporte e animais de estimação. Em um aspec-to particular, o mamífero é o camundongo ASKMO que é o modelo de animalaceito da doença de Niemann-Pick dos Tipos AeB. Horinouchi e outros(1995) Nat. Genetics 10:288-293; Jin e outros (2002) J. Clin. Invest.109:1183-1191; e Otterbach (1995) Cell 81:1053-1061.
A doença de Niemann-Pick A (NPA) é classificada como umadoença de armazenamento Iisossomal e é um distúrbio neurometabólico he-reditário caracterizado por uma deficiência genética na esfingomielinase áci-da (ASM; esfingomielina colinafosfohidrolase, EC 3.1.3.12). A falta da prote-ína ASM funcional resulta no acúmulo do substrato esfingomielina dentrodos Iisossomos de neurônios e na glia ao longo de todo o cérebro. Isto levaà formação de grandes números de Iisossomos distendidos no pericário, queconstituem uma característica marcante e o fenótipo celular primário da NDPdo Tipo A. A presença de Iisossomos distendidos se correlaciona com a per-da da função celular normal e um curso neurodegenerativo progressivo queleva à morte do indivíduo afetado no início da infância (The Metabolic andMolecular Bases of Inherited Diseases, eds. Scriver e outros, McGraw-HiII,Nova York, 2001, pp. 3589-3610). Fenótipos celulares secundários (por e-xemplo, anormalidades metabólicas adicionais) também estão associadoscom esta doença, notavelmente o alto nível de acúmulo de colesterol nocompartimento lisossomal. A esfingomielina possui forte afinidade pelo co-lesterol, que resulta no seqüestro de grandes quantidades de colesterol nosIisossomos de camundongos ASMKO e em pacientes humanos. Leventhal eoutros (2001) J. Biol. Chem., 276:44976-44983; Slotte (1997) Subcell. Bio-chem. 28:277-293; e Viana e outros (1990) J. Med. Genet. 27:499-504.
Em um aspecto específico, o sítio sistêmico de administração éo fígado do mamífero. Qualquer método de administração pode ser utilizado,cujos exemplos são fornecidos abaixo.
Após a administração sistêmica do transgene, este é administra-do ao SNC do mamífero e em particular, de forma intracraniana diretamentepara dentro do cérebro do mamífero e mais particularmente em um sítio se-lecionado do grupo que consiste no tronco cerebral, do hipocampo, do estri-ado, da medula, das pontes, do mesencéfalo, do cerebelo, do cérebro mé-dio, do tálamo, do hipotálamo, do córtex cerebral, do lóbulo occipital, do ló-bulo temporal, do lóbulo parietal e do lóbulo frontal. Em uma modalidade, aadministração é específica aos núcleos cerebelares profundos do cerebelo.
Como citado anteriormente, o transgene que codifica o polipep-tídeo ou a proteína é administrado ao mamífero para, em última análise, for-necer o polipeptídeo ou a proteína utilizando quaisquer métodos de transfe-rência gênica apropriados, cujos exemplos são descritos supra e na PatenteU.S. N2 6.066.626. Em um aspecto, o transgene codifica a ASM. As seqüên-cias de cDNA genômicas e funcionais da ASM humana foram publicadas,por exemplo, nas Patentes U.S. N-: 5.773.278 e 6.541.218). Outros agentesimunogênicos protéicos adequados que possuem envolvimento no SNC sãoidentificados na Tabela 1.
Os vetores virais são vetores de transferência gênica úteis. Emuma modalidade particular, o vetor viral é selecionado do grupo que consisteem adenovírus, vírus associado a adeno (AAV), vaccinia, herpesvírus, bacu-lovírus e retrovírus.
Os vetores AAV adequados são descritos ao longo de toda aPatente U.S. N2 6.066.626 e na Publicação PCT N2 WO 01/36620 A2. Osvetores modificados, que são descritos na coluna 9, linhas 14 até 66, tam-bém podem ser utilizados. Os sorotipos adequados incluem, mas não estãolimitados a AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 ou AAV8. O ve-tor AAV pode ser um vetor AAV recombinante ou híbrido, por exemplo, umselecionado do grupo que consiste nos vetores dos sorotipos AAV2/1, A-AV2/5, AAV2/7, AAV2/8, AAV1/2, AAV1/3, AAV1/5, AAV1/7 e AAV1/8, emque a nomenclatura refere-se ao sorotipo do qual as ITRs são geradas/osorotipo do qual o capsídeo é gerado. Por exemplo, um vetor AAV2/5 com-preende as ITRs do sorotipo AAV2 e o capsídeo do sorotipo AAV5.
Uma quantidade eficiente do polipeptídeo, através da adminis-tração de um vetor viral que compreende um transgene partindo do qual opolipeptídeo é gerado, é fornecida ao mamífero. Em um aspecto, um vetorviral que compreende um transgene é fornecido ao fígado e, imediatamentesubseqüente ao fornecimento ao fígado, um vetor viral que compreende odito transgene é fornecido ao SNC.
Em uma modalidade alternativa, a administração subseqüentedo vetor viral ao SNC ocorre após o polipeptídeo ter sido expresso no mamí-fero durante uma quantidade de tempo eficiente para gerar a capacidade detolerância do mamífero ao dito polipeptídeo. Isto pode variar com o pacienteque está sendo tratado, o polipeptídeo fornecido e o efeito terapêutico dese-jado. O curso de tempo apropriado e o número de administrações subse-qüentes ao SNC são determinados pelo médico que está fazendo o trata-mento. Para determinar se um mamífero obteve capacidade de tolerância aum polipeptídeo, o mamífero pode ser desafiado com o polipeptídeo paradeterminar se tal desafio gera uma resposta imunológica contra o polipeptí-deo. A resposta imunológica pode ser determinada através da medida dotítulo de um anticorpo contra o polipeptídeo após o desafio. Um título de an-ticorpo reduzido ou insignificante, quando comparado com os controles a-propriados, após o desafio pode ser indicativo de uma condição de tolerân-cia. Os meios para medir e gerar respostas de anticorpos em mamíferos,para desafiar um mamífero com um antígeno ou um agente imunogênico epara determinar os títulos de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Aquantidade apropriada de tempo para gerar uma capacidade de tolerânciado mamífero pode também ser selecionada através da determinação daquantidade eficiente de tempo para expressão para gerar tal capacidade detolerância em um indivíduo de teste. A quantidade selecionada de tempopode então ser aplicada aos presentes métodos sem a necessidade de tes-tar cada paciente individualmente.
Em uma modalidade, a administração subseqüente do vetor viralao SNC ocorre após a expressão do polipeptídeo codificado pelo vetor viralfornecido no fígado ser detectada. A detecção da expressão do polipeptídeopode ser realizada através de qualquer método conhecido na técnica, cujosexemplos incluem, mas não estão limitados ao método molecular (através dadetecção de mRNA) ou ao método imunológico (através da detecção da ex-pressão de proteína) ou ao método bioquímico (através da detecção da ati-vidade do polipeptídeo, tal como a atividade enzimática, quando tal atividadeexiste).
Alternativamente, a administração subseqüente pode ser de ho-ras, dias ou semanas subseqüentes à primeira administração. O uso de vá-rias administrações ao SNC em vários sítios de administração ao SNC tam-bém está dentro do âmbito desta invenção.
Assim, em um aspecto específico desta invenção, é fornecidoum método para fornecer tolerância ao cérebro de um mamífero ao polipep-tídeo da esfingomielinase ácida. O método administra de forma sistêmicauma quantidade eficiente de um transgene que codifica o polipeptídeo aofígado do mamífero antes da administração de uma quantidade eficiente dotransgene que codifica o polipeptídeo no tecido do sistema nervoso central(SNC) do mamífero.
Em um aspecto particular adicional desta invenção, é fornecidoum método para melhorar os sintomas associados com a Doença de Nie-mann-Pick do Tipo A (NPA) em um mamífero sofrendo de NPA. Este métodorequer a administração ao sistema nervoso central (SNC) do mamífero deuma quantidade eficiente do transgene que codifica um polipeptídeo da es-fingomielinase ácida e em que a dita administração seja subseqüente à ad-ministração sistêmica de uma quantidade eficiente do transgene ao tecidohepático do mamífero, de forma que a capacidade do mamífero de produziruma resposta imunológica específica ao antígeno para o polipeptídeo sejaanulada ou significativamente reduzida antes da administração ao SNC.
Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para me-lhorar os sintomas associados com a Doença de Niemann-Pick do Tipo A(NPA) em um mamífero sofrendo de NPA. Tais sintomas incluem, mas nãoestão limitados à perda de peso ou caquexia, à perda da função motora, àperda da função cognitiva e à morte prematura. O método requer a adminis-tração ao SNC do mamífero de uma quantidade eficiente de um vetor viralque compreende um transgene que codifica o polipeptídeo da esfingomieli-nase ácida após a administração de uma quantidade eficiente de um vetorviral que compreende o dito transgene ao tecido hepático do mamífero. Emuma outra modalidade, a área do SNC à qual o vetor viral é fornecido é océrebro.
Ainda em um aspecto adicional, a invenção fornece um métodopara tratar a doença de Niemann-Pick do Tipo A (NPA) em um mamíferosofrendo de NPA através da administração de uma quantidade eficiente deum vetor viral AAV que compreende um transgene que codifica um polipep-tídeo da esfingomielinase ácida ao tecido hepático do mamífero e subse-qüentemente do fornecimento de uma quantidade eficiente de um vetor AAVque compreende um transgene que codifica um polipeptídeo da esfingomie-Iinase ácida ao SNC do mamífero, tratando assim a NPA no mamífero. Emuma outra modalidade, a área do SNC à qual o vetor viral é fornecido é océrebro.Como utilizado aqui, os termos "tratar", "tratamento" e similaressão utilizados aqui para significar a obtenção de um efeito terapêutico, far-macológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termosde prevenir completamente ou parcialmente a doença ou um sinal ou umsintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcialou completa para o distúrbio e/ou o efeito adverso que pode ser atribuído aodistúrbio.
"Tratar" também cobre qualquer tratamento de um distúrbio emum mamífero e inclui: a prevenção de um distúrbio de ocorrer em um indiví-duo que pode ser pré-disposto a um distúrbio, mas ainda não foi diagnosti-cado como possuindo o mesmo, por exemplo, um paciente que teve testepositivo para o marcador genético para a doença; a inibição de um distúrbio,isto é, a interrupção de seu desenvolvimento; ou o alívio ou a melhora dodistúrbio, por exemplo, causar a regressão do distúrbio, por exemplo, da do-ença NPA.
Como utilizado aqui, "tratar" inclui ainda a melhora sistêmica dossintomas associados com a patologia e/ou um retardo no início dos sinto-mas. A evidência clínica e subclínica de "tratamento" variará com a patologi-a, o indivíduo e o tratamento.
Em algumas modalidades, o método compreende a administra-ção de um vetor AAV que carrega um agente imunogênico ou um transgenepré-selecionado de forma que o produto do transgene seja expresso em umnível terapêutico no sítio selecionado. Em algumas modalidades, o título viralda composição é de pelo menos: (a) 1,5, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5,4,0, 4,5 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 ou 50 (x1011 cópias do genomapor injeção (gc); (b) 1,5, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8,8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 ou 50 (*109 tu/mL); ou (c) 1,5, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75,3,0, 3,25, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25 ou 50 (*1010 uni-dades infecciosas [iu]/mL).
A administração intracraniana pode ser em qualquer região nocérebro e pode abranger várias regiões quando mais de um fornecimentointracraniano é administrado. Tais sítios incluem, por exemplo, no tronco ce-rebral (medula e pontes), mesencéfalo, cérebro médio, cerebelo (incluindoos núcleos cerebelares profundos), no diencéfalo (tálamo, hipotálamo), notelencéfalo (corpo estriado, cérebro médio, córtex cerebral ou, dentro do cór-tex, os lóbulos occipital, temporal, parietal e frontal). Os exemplos específi-cos de sítios de injeção intracraniana são mostrados na Figura 1.
Para a identificação de estruturas no cérebro humano, ver, porexemplo, The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional AnatomyWith MRI, and Blood Supply, 2- ed., eds. Deuteron e outros, Springer Vela,1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai e outros, Academic Press; 1997; eCo-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional ProportionalSystem: An Approach to Cerebral lmaging, eds. Tamarack e outros, ThymeMedicai Pub., 1988. Para a identificação de estruturas no cérebro de ca-mundongo, ver, por exemplo, The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates, 2-ed., Academic Press, 2000. Se desejado, as estruturas do cérebro humanopodem ser correlacionadas com estruturas similares no cérebro de um outromamífero. Por exemplo, a maior parte dos mamíferos, incluindo seres hu-manos e roedores, exibe uma organização topográfica similar das projeçõesentorrinais-hipocampo, com neurônios na parte lateral do córtex entorrinaltanto lateral quanto mediai que se projeta para a parte dorsal ou para o póloseptal do hipocampo, enquanto a projeção para o hipocampo ventral se ori-gina primariamente dos neurônios nas partes mediais do córtex entorrinal(Principies of Neural Science, 4- ed., eds Kandel e outros, McGraw-HiII,1991; The Rat Nervous System, 2- ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995).Além disso, as células da camada Il do córtex entorrinal se projetam para ogiro dentado e terminam nos dois terços externos da camada molecular dogiro dentado. Os axônios das células da camada Ill se projetam bilateral-mente para as áreas do cornu ammonis CA1 e CA3 do hipocampo, termi-nando na camada molecular do estrato lacunoso.
Para fornecer o vetor especificamente a uma região particular dosistema nervoso central, especialmente a uma região particular do cérebro,este pode ser administrado através de microinjeção esterotáxica. Por exem-plo, no dia da cirurgia, os pacientes terão a base da estrutura esterotáxicafixa no lugar (aparafusada no crânio). O cérebro com a base da estruturaestereotáxica (compatível a MRI com marcações fiduciárias) terá imagensformadas utilizando MRI de alta resolução. As imagens de MRI serão entãotransferidas para um computador que roda o software estereotáxico. Umasérie de imagens coronais, sagitais e axiais será utilizada para determinar osítio alvo de injeção e a trajetória. O software traduz diretamente a trajetóriaem coordenadas tridimensionais apropriadas para a estrutura estereotáxica.Orifícios de Burr são perfurados acima do sítio de entrada e o aparelho este-reotáxico localizado com a agulha implantada na certa profundidade. O vetorem um veículo farmaceuticamente aceitável será então injetado. O vetorAAV é então administrado através da injeção direta no sítio alvo primário etransportado de forma retrógrada para os sítios alvos distais através dos a-xônios. Vias adicionais de administração podem ser utilizadas, por exemplo,a aplicação cortical superficial sob visualização direta ou outra aplicação nãoestereotáxica.
O volume total de material que será administrado e o númerototal de partículas de vetor que será administrado, serão determinados pelosversados na técnica com base em aspectos conhecidos de terapia gênica. Aeficiência terapêutica e a segurança podem ser testadas em um modelo deanimal apropriado. Por exemplo, existe uma variedade de modelos de ani-mais bem caracterizados para LSDs, por exemplo, que são descritos aqui ouem Watson e outros (2001) Methods Mol. Med., 76:383-403; ou Jeyakumar eoutros (2002) Neuropath. Appl. Neurobiol., 28:343-357; ou em Metabolic andMolecular Bases of Inherited Disease1 8â edição (2001), publicado por Mc-Graw-Hill.
Em camundongos experimentais, o volume total de solução deAAV injetada é, por exemplo, entre 1 até 5 μL ou aproximadamente 3 μL porsítio de injeção ou alternativamente entre 10 até 400 μL ou alternativamente,entre 100 até 400 μL, alternativamente entre 150 até 250 μL ou alternativa-mente aproximadamente 200 μL. Para outros mamíferos, incluindo o cérebrohumano, os volumes e as taxas de fornecimento são medidos apropriada-mente. Por exemplo, foi demonstrado que volumes de 150 μL podem serinjetados de forma segura no cérebro de primatas (Janson e outros (2002)Hum. Gene Ther., 13:1391-1412). O tratamento pode consistirem uma únicainjeção por sítio alvo ou pode ser repetida ao longo da área de injeção, senecessário. Vários sítios de injeção podem ser utilizados. Por exemplo, emalgumas modalidades, em adição ao primeiro sítio de administração, umacomposição que compreende AAV que carrega um transgene é administradaem um outro sítio que pode ser contralateral ou ipsilateral ao primeiro sítiode administração.
Nos métodos da invenção, pode ser utilizado o AAV de qualquersorotipo. Em uma modalidade da invenção, podem ser utilizados vetoresAAV capazes de sofrer transporte axonal retrógrado. O sorotipo do vetor vi-ral pode ser selecionado do grupo que consiste em AAV1, AAV2, AAV3,AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 e AAV8 (ver, por exemplo, Gao e outros (2002)PNAS, 99: 11854-11859; e Viral Vectors for Gene Therapy: Methods andProtocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Outro sorotipo além dos lis-tados aqui podem ser utilizados. Vetores AAV de pseudotipo também podemser utilizados, que são aqueles que compreendem as ITRs de um sorotipode AAV no capsídeo de um segundo sorotipo de AAV; por exemplo, um ve-tor AAV que contém o capsídeo de AAV2 e o genoma de AAV1 ou um vetorAAV que contém o capsídeo de AAV5 e o genoma de AAV2. (Auricchio eoutros (2001) Hum. Mol. Genet, 10(26):3075-81.)
Os vetores AAV são derivados de parvovírus de DNA de fila-mento simples (SS) que não são patogênicos para mamíferos (revisado emMuzyscka (1992) Curr. Top. Microb. Immunol., 158:97-129). Sucintamente,os vetores baseados em AAV possuem os genes virais rep e cap removidosque correspondem a 96% do genoma viral, deixando as duas repetiçõesterminais invertidas (ITRs) de 145 pares de bases (pb) flanqueadoras, quesão utilizadas para iniciar a replicação, o empacotamento e a integração doDNA viral. Na ausência de vírus auxiliador, o AAV do tipo selvagem se inte-gra dentro do genoma da célula hospedeira humana com especificidade aosítio preferencial no cromossomo 19q 13.3 ou pode permanecer expresso deforma epissomal. Uma única partícula de AAV pode acomodar até 5 kb dessDNA, deixando, portanto, aproximadamente 4,5 kb para um transgene eelementos reguladores, que são tipicamente suficientes. Entretanto, os sis-temas de processamento em trans que são descritos, por exemplo, na Pa-tente U.S. N- 6.544.785, podem quase duplicar este limite.
Em uma modalidade ilustrativa, o AAV é AAV2 ou AAV8. O vírusassociado a adeno de muitos sorotipos, tal como AAV2, foi extensivamenteestudado e caracterizado como vetores para terapia gênica. Os versados natécnica estarão familiarizados com a preparação de vetores para terapia gê-nica baseados em AAV funcionais. Várias referências a vários métodos deprodução, purificação e preparação de AAV para a administração a indiví-duos humanos podem ser encontradas no corpo extensivo da literatura pu-blicada (ver, por exemplo, Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Pro-tocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Adicionalmente, a terapia gênicabaseada em AAV direcionada para células do SNC foi descrita nas PatentesU.S. N—6.180.613 e 6.503.888.
O nível de expressão do transgene em células eucarióticas podeser regulado pelo promotor e/ou intensificador(es) da transcrição dentro docassete de expressão do transgene. Os promotores específicos ao tecido,tais como promotores específicos ao fígado, podem ser utilizados em algu-mas modalidades. Os intensificadores específicos ao tecido, tais como in-tensificadores específicos ao fígado, podem ser utilizados em algumas mo-dalidades. As combinações de promotores específicos ao tecido e intensifi-cadores específicos ao tecido, tais como promotores e intensificadores es-pecíficos ao fígado podem ser utilizadas na prática da presente invenção.
Os exemplos não Iimitantes de promotores incluem, mas nãoestão limitados ao promotor de citomegalovírus (CMV) (Kaplitt e outros(1994) Nat. Genet. 8:148-154), a promotor da p3-globina de CMV/humano(Mandei e outros (1998) J. Neurosci. 18:4271-4284), ao promotor GFAP (Xue outros (2001) Gene Ther, 8:1323-1332), ao promotor da enolase específicoao neurônio (NSE) de 1,8 kb (Klein e outros (1998) Exp. Neurol. 150:183-194), ao proporção da beta actina de frango (CBA) (Miyazaki (1989) Gene79:269-277) e ao promotor da β-glucuronidase (GUSB) (Shipley e outros(1991) Genetics 10:1009-1018), ao promotor da albumina do soro humano,ao promotor da antitripsina alfa-1. Para aumentar a expressão, outros ele-mentos reguladores podem ser adicionalmente ligados de forma operacionalao transgene, tal como, por exemplo, o Elemento Pós-Regulador do Vírus deHepatite Woodchuck (WPRE) (Donello e outros (1998) J. Virol. 72: 5085-5092) ou sítio de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH).
Os promotores adicionais que podem ser adequados para a pre-sente invenção podem ser qualquer promotor constitutivo forte que seja ca-paz de promover a expressão de uma seqüência de DNA codificadora asso-ciada no fígado. Tais promotores constitutivos fortes incluem o promotor decitomegalovírus humano e murino, os promotores CMV truncados, o promo-tor da albumina do soro humano [HSA] e o promotor da antitripsina alfa-1.
Os elementos intensificadores específicos ao fígado úteis para apresente invenção podem ser qualquer intensificador específico ao fígadoque seja capaz de aumentar a expressão específica ao tecido de uma se-qüência de DNA codificadora associada no fígado. Tais intensificadores es-pecíficos ao fígado incluem um ou mais intensificadores da albumina do sorohumano (HSA), intensificadores da protrombina humana (HPrT), intensifica-dores da microglobulina alfa-1 (A1MB) e intensificadores da aldolase intrôni-ca. Os vários elementos intensificadores podem ser combinados para atingirmaior expressão. Por exemplo, dois intensificadores idênticos podem sercombinados com um promotor específico ao fígado.
Os vetores virais que compreendem as combinações de promo-tor/intensificador a seguir podem ser utilizados na prática da presente inven-ção: um ou mais intensificadores da HSA em combinação com um promotordo CMV ou um promotor da HSA; um ou mais intensificadores selecionadosdo grupo que consiste no intensificador da protrombina humana (HPrT) e ointensificador da microglobulina alfa-1 (A1MB) em combinação com um pro-motor do CMV; e um ou mais elementos intensificadores selecionados dogrupo que consiste em intensificadores da HPrT e intensificadores da A1MB,em combinação com um promotor da a-1-antitripsina.
Informação adicional em relação às construções específicas aofígado é descrita no Pedido de Patente Publicado PCT N-: WO 01/36620.Alternativamente, os promotores e/ou os intensificadores específicos neuro-nais são úteis para o fornecimento direcionado e para a expressão de trans-genes no SNC.
Em alguns aspectos, será desejável controlar a atividade detranscrição. Para esta finalidade, a regulação farmacológica da expressãogênica com vetores AAV pode ser obtida através da inclusão de vários ele-mentos reguladores e promotores que respondem a fármacos como descrito,por exemplo, em Haberma e outros (1998) Gene Ther., 5:1604-16011; e Yee outros (1995) Science 283:88-91.
As preparações de AAV podem ser produzidas utilizando técni-cas conhecidas na técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N25.658.776 e Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Ma-chida, Humana Press, 2003.
Em certos aspectos, a detecção e/ou o nível de expressão dotransgene pode ser desejado. O método para detectar a expressão gênica éconhecido na técnica e pode ser facilmente aplicado como discutido infra oumodificado pelos versados na técnica.
São conhecidos vários métodos para a quantificação da expres-são de um gene de interesse e incluem, mas não estão limitados aos ensai-os de hibridização (análise de Northern blot) e ensaios de hibridização base-ados na PCR.
Na análise de uma alteração no nível de mRNA, o ácido nucléicocontido em uma amostra é primeiramente extraído de acordo com um méto-do padronizado na técnica. Por exemplo, o mRNA pode ser isolado utilizan-do várias enzimas líticas ou soluções químicas de acordo com os procedi-mentos apresentados em Sambrook e outros (1989), supra ou extraído atra-vés de resinas que se ligam a ácidos nucléicos seguindo as instruções queas acompanham fornecidas pelos fabricantes.
As moléculas de ácidos nucléicos que possuem pelo menos 10nucleotídeos e exibem complementaridade ou homologia de seqüência aoproduto de expressão podem ser utilizadas como sondas de hibridização ouiniciadores da PCR. É sabido na técnica que uma sonda "que se combinaperfeitamente" não é necessária para uma hibridização específica. Peque-nas alterações na seqüência da sonda conseguidas através da substituição,da deleção ou da inserção de um pequeno número de bases não afetam aespecificidade de hibridização. Em geral, um pareamento errado de pares debases de tanto quanto 20% (quando alinhadas de forma ótima) pode ser to-lerado. Por exemplo, uma sonda útil para a detecção de mRNA é pelo me-nos aproximadamente 80% idêntica à região homóloga de tamanho compa-rável contida em uma seqüência identificada previamente, por exemplo, umaseqüência de ASM. Alternativamente, a sonda é pelo menos 85% ou aindapelo menos 90% idêntica à seqüência gênica correspondente após o ali-nhamento da região homóloga. O tamanho total do fragmento, assim como otamanho dos filamentos complementares, dependerá do uso pretendido ouda aplicação do segmento de ácido nucléico particular. Fragmento menoresdo gene geralmente encontrarão uso nas modalidades de hibridização, emque o comprimento da região complementar pode ser variado, tal como entreaproximadamente 10 e aproximadamente 100 nucleotídeos ou até mesmo ocomprimento completo de acordo com as seqüências complementares quese deseja detectar.
As sondas de nucleotídeos que possuem seqüências comple-mentares ao longo de filamentos maiores que aproximadamente 10 nucleo-tídeos de comprimento aumentarão a estabilidade e a seletividade do híbridoe, dessa maneira, aumentam a especificidade de moléculas híbridas particu-lares obtidas. Podem ser planejadas moléculas de ácidos nucléicos quepossuem filamentos complementares ao gene de mais de aproximadamente25 e ainda mais preferencialmente de mais de aproximadamente 50 nucleo-tídeos de comprimento ou ainda mais longos quando desejado. Tais frag-mentos podem ser facilmente preparados, por exemplo, através da síntesedireta do fragmento por meios químicos, através da aplicação da tecnologiade reprodução de ácidos nucléicos, tal como a tecnologia da PCR™ comdois oligonucleotídeos iniciadores como descrito na Patente U.S. N24.603.102 ou através da introdução de seqüências selecionadas em vetoresrecombinantes para a produção recombinante.
Em certas modalidades, será vantajoso empregar seqüências deácidos nucléicos da presente invenção em combinação com um meio apro-priado, tal como uma marcação, para a detecção da hibridização e, portanto,das seqüências complementares. Uma ampla variedade de meios indicado-res apropriados é conhecida na técnica, incluindo ligantes fluorescentes, ra-dioativos, enzimáticos ou outros, tais como avidina/biotina, que são capazesde fornecer um sinal detectável. Uma marcação fluorescente ou uma marca-ção (tag) enzimática, tal como urease, fosfatase alcalina ou peroxidase, aoinvés de reagentes radioativos ou outros indesejáveis para o ambiente tam-bém pode ser utilizada. No caso de marcações enzimáticas, são conhecidossubstratos indicadores colorimétricos que podem ser empregados para for-necer um meio visível ao olho humano ou espectrofotometricamente, para aidentificação da hibridização específica com amostras contendo ácidos nu-cléicos complementares.
As reações de hibridização podem ser realizadas sob condiçõesde "rigor" diferentes. As condições relevantes incluem temperatura, forçaiônica, tempo de incubação, a presença de solutos adicionais na mistura dereação tal como formamida e o procedimento de lavagem. As condições demaior rigor são as condições, tais como temperatura maior e menor concen-tração de íons de sódio, que requerem maior complementaridade mínimaentre os elementos de hibridização para que um complexo de hibridizaçãoestável se forme. As condições que aumentam o rigor de uma reação dehibridização são amplamente conhecidas e publicadas na técnica. Ver,Sambrook e outros (1989) supra.
Pode-se também detectar e quantificar o nível de mRNA ou suaexpressão utilizando PCR quantitativa ou análise de alta circulação tal comoa Análise em Série da Expressão Gênica (Serial Analysis of Gene Expres-sion (SAGE)) como descrito em Velculescu, V. e outros (1995) Science270:484- 487. Sucintamente, o método compreende o isolamento de váriosmRNAs de amostras de células ou tecido suspeitas de conterem o produtoda transcrição. Opcionalmente, os produtos da transcrição gênica podem serconvertidos em cDNA. Uma amostragem dos produtos da transcrição gênicaé submetida à análise específica à seqüência e é quantificada. Estas abun-dâncias das seqüências do produto da transcrição gênica são comparadascontra as abundâncias das seqüências do banco de dados de referência in-cluindo conjuntos de dados normais para pacientes doentes e saudáveis.
As sondas também podem ser ligadas a um suporte sólido parauso nos ensaios de seleção de alta circulação utilizando métodos conheci-dos na técnica. O Pedido de Patente PCT Internacional N- WO 97/10365 eas Patentes U.S. Nes 5.405.783, 5.412.087 e 5.445.934, por exemplo, divul-gam a construção de chips de oligonucleotídeos de alta densidade que po-dem conter uma ou mais seqüências. Os chips podem ser sintetizados sobreuma superfície de vidro derivatizada utilizando os métodos divulgados nasPatentes U.S. N25 5.405.783; 5.412.087 e 5.445.934. As fosforamiditas nu-cleosídeos fotoprotegidas podem ser acopladas à superfície de vidro, des-protegidas seletivamente por fotólise através de uma máscara fotolitográficae reagidas com uma segunda fosforamidita nucleosídeo protegida. O pro-cesso de acoplamento/desproteção é repetido até a sonda desejada estarcompleta.
O nível de expressão do gene pode ser determinado através daexposição de uma amostra suspeita de conter o polinucleotídeo ao chip mo-dificado com a sonda. O ácido nucléico extraído é marcado, por exemplo,com uma marcação fluorescente, preferencialmente durante uma etapa deamplificação. A hibridização da amostra marcada é realizada em um nível derigor apropriado. O grau de hibridização de sonda-ácido nucléico é medidode forma quantitativa utilizando um dispositivo de detecção, tal como um mi-croscópio confocal. Ver, as Patentes U.S. N— 5.578.832 e 5.631.734. A me-dida obtida é diretamente correlacionada com o nível de expressão gênica.
A sonda hibridizada e os ácidos nucléicos da amostra podem serdetectados através de vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo,os ácidos nucléicos hibridizados podem ser detectados através da detecçãode uma ou mais marcações ligadas aos ácidos nucléicos da amostra. Asmarcações podem ser incorporadas através de qualquer de um número demaneiras conhecidas pelos versados na técnica. Em um aspecto, a marca-ção é incorporada simultaneamente durante a etapa de amplificação na pre-paração do ácido nucléico da amostra. Assim, por exemplo, a reação emcadeia da polimerase (PCR) com iniciadores marcados ou nucleotídeosmarcados fornecerá um produto da amplificação marcado. Em uma modali-dade separada, a amplificação da transcrição que é descrita anteriormente,utilizando um nucleotídeo marcado (por exemplo, UTP e/ou CTP marcadocom fluoresceína) incorpora uma marcação nos ácidos nucléicos transcritos.
Alternativamente, uma marcação pode ser adicionada direta-mente na amostra de ácido nucléico original (por exemplo, mRNA, poliA,mRNA, cDNA etc.) ou no produto da amplificação após a amplificação sercompletada. Os meios de ligação de marcações aos ácidos nucléicos sãoconhecidos pelos versados na técnica e incluem, por exemplo, a traduçãocom pequenos cortes e a marcação de extremidade (por exemplo, com umRNA marcado) através do tratamento com quinase do ácido nucléico e aadesão (ligação) subseqüente de um Iigante de ácido nucléico que une oácido nucléico da amostra com uma marcação (por exemplo, um fluoróforo).
As marcações detectáveis adequadas para uso na presente in-venção incluem qualquer composto detectável por meios espectoscópicos,fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicos. Asmarcações úteis na presente invenção incluem biotina para a coloração comconjugado de estreptavidina marcado, esferas magnéticas (por exemplo,Dynabeads™), corantes fluorescentes (por exemplo, fluoresceína, vermelhoTexas, rodamina, proteína fluorescente verde e similares), marcações radio-ativas (por exemplo, 3H, 125I, 35S1 14C ou 32P) enzimas (por exemplo, peroxi-dase de raiz forte, fosfatase alcalina e outras comumente utilizadas em umELISA) e marcações colorimétricas tal como ouro coloidal ou esferas de vi-dro ou plástico colorido (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex etc.).As patentes que ensinam o uso de tais marcadores incluem as Patentes30 U.S. N— 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149;e 4.366.241.
Os meios de detecção de tais marcadores são conhecidos pelosversados na técnica. Assim, por exemplo, as marcações radioativas podemser detectadas utilizando filme fotográfico ou contadores de cintilação, asmarcações fluorescentes podem ser detectadas utilizando um fotodector pa-ra detectar a luz emitida. As marcações enzimáticas são tipicamente detec-tadas através do fornecimento da enzima com um substrato e da detecçãodo produto de reação pela ação da enzima sobre o substrato e as marca-ções colorimétricas são detectadas através da simples visualização da mar-cação colorida.
A Publicação de Patente WO 97/10365 descreve métodos paraa adição da marcação ao(s) ácido(s) nucléico(s) alvo(s) (amostra) antes oualternativamente, depois da hibridização. Estas são marcações detectáveisque são ligadas diretamente a ou incorporadas no ácido nucléico alvo (a-mostra) antes da hibridização. Em contraste, as "marcações indiretas" sãoligadas ao duplex híbrido após a hibridização. Freqüentemente, a marcaçãoindireta é ligada a um grupamento de ligação que foi ligado ao ácido nucléicoalvo antes da hibridização. Assim, por exemplo, o ácido nucléico alvo podeser biotinilado antes da hibridização. Após a hibridização, um fluoróforo con-jugado com avidina se ligará com a biotina que carrega os dúplices híbridosfornecendo uma marcação que é facilmente detectada. Para uma revisãodetalhada dos métodos de marcação de ácidos nucléicos e de detecção dosácidos nucléicos hibridizados marcados, ver Laboratory Techniques in Bio-chemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Nucleic AcidProbes, P. Tijssen1 ed. Elsevier, Ν. Y. (1993).
A amostra de ácido nucléico também pode ser modificada antesda hibridização ao arranjo de sondas de alta densidade para reduzir a com-plexidade da amostra diminuindo assim o sinal de fundo e aumentando asensibilidade da medida utilizando os métodos descritos no Pedido de Pa-tente PCT Internacional N2WO 97/10365.
Os resultados provenientes do ensaio de chip são tipicamenteanalisados utilizando um programa de software de computador. Ver, por e-xemplo, a EP 0717 113 A2 e a WO 95/20681. Os dados de hibridização sãolidos dentro do programa, que calcula o nível de expressão do(s) gene(s)alvo(s). Este número é comparado com os conjuntos de dados existentes deníveis de expressão gênica para indivíduos doentes e saudáveis. Uma corre-lação entre os dados obtidos e os de um conjunto de indivíduos doentes in-dica o início de uma doença no paciente.
Ensaios imunológicos conhecidos podem ser modificados para adetecção e a quantificação da expressão. A determinação do produto gênicorequer a medida da quantidade de ligação imunoespecífica que ocorre entreum anticorpo reativo ao produto gênico. Para detectar e quantificar a ligaçãoimunoespecífica ou os sinais gerados durante os procedimentos de hibridi-zação ou de amplificação, sistemas de análise de imagens digitais incluindo,mas não limitados aos que detectam a radioatividade das sondas ou a qui-mioluminescência podem ser empregados.
A expressão de um produto de polipeptídeo também pode serdetectada utilizando meios bioquímicos que são conhecidos na técnica parao polipeptídeo particular expresso.
Os exemplos a seguir fornecem modalidades ilustrativas da in-venção. Um versado comum na técnica reconhecerá as várias modificaçõese variações que podem ser realizadas sem alterar o espírito ou o âmbito dapresente invenção. Tais modificações e variações estão abrangidas dentrodo âmbito da invenção. Os exemplos não limitam de forma alguma a inven-ção.
EXEMPLOS
Titulação de Vetores Recombinantes
Os títulos de vetores AAV podem ser medidos de acordo com onúmero de cópia do genoma (partículas de genoma por mililitro). As concen-trações de partículas de genoma podem ser baseadas na Taqman® PCR doDNA do vetor como relatado anteriormente (Clark e outros (1999) Hum. Ge-ne Ther. 10:1031-1039; Veldwijk e outros (2002) Mol. Ther. 6:272-278). Su-cintamente, o vetor AAV é tratado com uma solução de DNAse para removerqualquer DNA contaminante que possa interferir com uma medida acuradado DNA viral. O vetor AAV é então tratado com tampão de digestão do cap-sídeo (50 mM de Tris-HCI pH 8,0, 1,0 mM de EDTA, 0,5% de SDS, 1,0mg/mL de proteinase K) a 50°C durante 1 hora para liberar o DNA do vetor.As amostras de DNA são colocadas através de uma reação em cadeia dapolimerase (PCR) com iniciadores que se anelam a seqüências específicasno DNA do vetor, tal como a região promotora, o transgene ou a seqüênciapoli A. Os resultados da PCR são então quantificados através de um softwa-re Real-time Taqman®, tal como o que é fornecido pela Perkin Elmer-AppliedBiosystems (Foster City, CA) Prism 7700 Sequence Detector System.
Os vetores que carregam um gene marcador que pode ser ana-lisado tal como a β-galactosidase ou a proteína fluorescente verde (GFP)podem ser titulados utilizando um ensaio de capacidade de infecção. As cé-lulas susceptíveis (por exemplo, células HeLa ou COS) são transduzidascom o AAV e é realizado um ensaio para determinar a expressão gênica talcomo a coloração de células transduzidas com o vetor com β-galactosidasecom X-gal (5-bromo-4cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo) ou microscopiapor fluorescência para células transduzidas com GFP. Por exemplo, o ensaioé realizado como a seguir: 4x104 células HeLa são plaqueadas em cada po-ço de uma placa de cultura de 24 poços utilizando meios de cultivo normais.Após a adesão, isto é, aproximadamente 24 horas depois, as células sãoinfectadas com Ad 5 a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 e trans-duzidas com diluições em série do vetor empacotado e incubadas a 37°C.Um até três dias depois, antes dos efeitos citopáticos extensivos serem ob-servados, o ensaio apropriado é realizado nas células (por exemplo, colora-ção com X-gal ou microscopia por fluorescência). Se um gene repórter talcomo β-galactosidase for utilizado, as células são fixadas em 2% de para-formaldeído, 0,5% de glutaraldeído e coradas em relação à atividade da β-galactosidase utilizando X-gal. As diluições do vetor que fornecem célulasbem separadas são contadas. Cada célula positiva representa 1 unidade detransdução (tu) do vetor.
O cDNA da ASM humana de comprimento completo foi clonadoem um plasmídeo contendo ITRs de AAV sorotipos 2 e 8. Jin e outros (2002)J Clin Invest. 109:1183-1191. O AAV8-hASM continha as repetições termi-nais invertidas (ITRs) do sorotipo 2 e o cDNA da esfingomielinase ácida hu-mana (hASM) sob o controle do promotor restrito ao fígado DC-190 [Zieglere outros (2004). Mol. Ther. 9:231-240]. O AAV2-hASM continha as repeti-ções terminais invertidas (ITRs) do sorotipo 2 e o cDNA da esfingomielinaseácida humana (hASM) sob o controle do intensificador de CMV e o promotorda β-actina de frango. Ambos os vetores recombinantes foram produzidosatravés da co-transfecção tripla de plasmídeos das células 293 humanas epurificados em coluna. Os títulos finais das preparações de AAV8-hASM ede AAV2-hASM eram de 5,0 χ 1012 cópias do genoma (gc) por mL, que fo-ram determinados através da TaqMan PCR da seqüência de sinal de polia-denilação do hormônio de crescimento bovino que cada vetor contém.
Os vetores híbridos podem ser produzidos através da transfec-ção tripla utilizando uma série de plasmídeos auxiliadores contendo o capsí-deo específico ao sorotipo que codifica os domínios em adição aos genes rereplicação do sorotipo de AAV. Esta estratégia permite o empacotamento devetores AAV ITR dentro de cada virion específico ao sorotipo. Rabinowitz eoutros (2002) J Virol. 76:791-801. Com esta abordagem o genoma recombi-nante de hASM pode ser utilizado para gerar uma série de vetores rAAV-hASM de pseudotipo. Os vetores AAV recombinantes podem ser purificadosatravés da cromatografia de troca iônica. O1Riordan e outros (2000) J Gene Med 2: 444-54. Os vetores AAV recombinantes também podem ser purifica-dos através da centrifugação em CsCI Rabinowitz e outros (2002) J. Urrol.76:791-801. O título final das partículas de virion de AAV-ASM (partículasresistentes à DNAse) pode ser determinado através da TaqMan PCR da se-qüência de CMV. Clark e outros (1999) Hum. Gene Therapy 10:1031-1039.Terapia Gênica Cerebral de Combinação e Sistêmica em CamundonaosASMKO
Os camundongos deficientes em relação à esfingomielinase áci-da (ASMKO), K. Horinouchi e outros, Nat Genet. 10 (1995), pp. 288-292,foram tratados como a seguir:
Grupo 1) os camundongos receberam injeção com 3 e11 gc deum vetor AAV2/8 compreendendo dois intensificadores da HPrT, um promo-tor da albumina do soro humano e um transgene de ASM humana atravésde uma injeção na veia caudal com 4 semanas de idade;
Grupo 2) os camundongos receberam injeção com 2 e11 gccompreendendo um intensificador, um promotor e um transgene de ASMhumana através de injeção no cérebro dividida em 8 sítios no cérebro com 6semanas de idade;
Grupo 3) os camundongos receberam injeção com 3 e11 gc devetor AAV2/8 compreendendo dois intensificadores da HPrT1 um promotorda albumina do soro humano e um transgene de ASM humana através deuma injeção na veia caudal com 4 semanas de idade e duas semanas de-pois, os mesmos camundongos receberam injeção com 2 e11 gc de um ve-tor AAV2 compreendendo um intensificador, um promotor e um transgene deASM humana através de injeção no cérebro dividida entre 8 sítios no cére-bro; e
Grupo 4) os camundongos não receberam injeções ou recebe-ram injeções simuladas apenas com veículo.
Grupo 5) Os camundongos sem ser ASMKO ou do tipo selva-gem, não receberam injeções.
Todos os camundongos ASMKO que sofreram cirurgia estereo-táxica receberam injeção em 8 regiões do cérebro com 3 μΙ_ de AAV2-hASM(1,5 e10 gc) por sítio para um total de 24 μΙ_ (1,2 e11 gc) por cérebro. Ossítios injetados no hemisfério direito eram o hipotálamo (-0,50, -1,00 mm, -3,50 mm), o hipocampo (-2,00 mm, -1,75 mm, - 1,75 mm), a medula (-6,00mm, -1,50 mm, -3,75 mm) e o cerebelo (-6,00 mm, - 1,50 mm, -2,25 mm); eos sítios injetados no hemisfério esquerdo eram o estriado (0,50 mm, 1,75mm, -2,75 mm), o córtex motor (0,50 mm, 1,75 mm, -1,25 mm), o cérebromédio (-4,50 mm, 1,00 mm, -3,50 mm) e o cerebelo (-6,00 mm, 1,50 mm, -2,25 mm). As injeções foram realizadas com uma seringa Hamilton (Hamil-ton USA,. Reno, NV) a uma vazão de 0,5 pLVmin e a agulha foi deixada nolocal durante 2 minutos após cada injeção para minimizar o fluxo ascendenteda solução viral após erguer a agulha.
Todos os camundongos ASMKO não tratados e os camundon-gos ASMKO nos grupos somente com AAV2 no cérebro e AAV8 sistêmicoeventualmente ficavam moribundos. Em contraste, os camundongos ASM-KO tratados através das injeções Com combinação cerebral e sistêmica nãoatingiram o estado moribundo, mas, apesar disso, foram sacrificados com 54semanas para análise comparativa. Os animais sofreram perfusões extensi- vas para remover todo o sangue e foram divididos em grupos bioquímicos ehistológicos. No grupo bioquímico, o fígado, os pulmões e o músculo esque-lético foram cortados em dois pedaços; um pedaço foi analisado em relaçãoaos níveis de hASM e o outro em relação ao armazenamento de esfingomie-lina. No cérebro, os hemisférios esquerdo e direito foram separados e cadahemisfério foi adicionalmente cortado em cinco placas de 2 mm ao longo doeixo Α-P. As placas do hemisfério esquerdo foram analisadas em relação àproteína hASM e a anti-hASM.
Os níveis no soro da esfingomielinase ácida (ASM) e os níveisde anticorpo no soro anti-ASM foram medidos ao longo de todo o estudo. Oscamundongos sofreram vários testes ao longo do estudo: avaliações do pe-so corporal, teste de rotarod de aceleração, teste de rotarod de balanço eteste no labirinto de Barnes. Os dados da curva de sobrevivência tambémforam coletados ao longo de toda a duração do estudo. Após a morte doscamundongos, os tecidos foram coletados e os níveis de esfingomielina fo-ram medidos nos cérebros, nos fígados, nos pulmões, nos baços e no tecidomuscular de cada camundongo. A expressão da proteína ASM humana nocérebro e no fígado também foi avaliada qualitativamente utilizando imuno-histoquímica. O estudo foi terminado com 54 semanas; todos os camundon-gos do grupo 3 (combo) estavam vivos e saudáveis quando o estudo foi ter-minado.
Os níveis no soro de esfingomielinase ácida foram quantificadosatravés do ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) utilizando anti-corpos policlonais que foram gerados especificamente contra a enzima hu-mana. A Figura 7 mostra graficamente os níveis da proteína ASM no sorosangüíneo ao longo do tempo. A ASM também foi medida através da imuno-histoquímica nos cérebros e nos fígados de camundongos na morte. A colo-ração positiva de ASM foi observada nos cérebros de camundongos dosgrupos 2 e 3, com coloração qualitativamente mais radiante observada noscamundongos do grupo 3. A coloração foi observada no estriado, no hipo-campo, no cérebro médio e no cerebelo. Não foi observada coloração deASM nos cérebros de camundongos do grupo 1 ou nos camundongos ASM-KO não tratados. A coloração positiva de ASM foi observada nos fígados decamundongos dos grupos 1 e 3. Nenhuma coloração de ASM foi observadanos fígados de camundongos do grupo 2 ou nos camundongos ASMKO nãotratados.
Os níveis de esfingomielina no tecido foram quantificados com aseguir. Os extratos de tecido foram preparados através da homogeneizaçãode 10 até 50 mg de tecido em clorofórmio:metanol (1:2) e da incubação a37°C durante 1 h. Após a remoção dos restos celulares por centrifugação, oshomogenados foram extraídos duas vezes com água e a fase orgânica (con-tendo os lipídeos) foi transferida para tubos de vidro limpos e então secossob nitrogênio com aquecimento a 37°C. A quantidade de esfingomielinapresente nos extratos foi determinada independentemente utilizando o kit deensaio da esfingomielinase Amplex Red (Molecular Probes). Os extratos fo-ram tratados com uma quantidade fixa de esfingomielinase bacteriana exó-gena de Bacillus cereus (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO, USA) na solução detrabalho do Amplex Red. A esfingomielina foi hidrolisada pela enzima bacte-riana para fornecer ceramida e fosforilcolina. A última foi adicionalmente hi-drolisada em colina, que por sua vez foi oxidada em betaína e peróxido dehidrogênio. O peróxido de hidrogênio liberado foi quantificado através dareação com Amplex Red para gerar uma resorufina fluorescente que podiaser detectada por emissão de fluorescência a 590 nm. Os níveis normais deesfingomielina nos tecidos de camundongos C57BLV6 são aproximadamente5-10% dos observados nos camundongos ASMKO com idade combinada.As Figuras 8 e 9 mostram graficamente os níveis de esfingomielina no cére-bro e nos órgãos viscerais.
Os níveis de anticorpos específicos antiesfingomielinase ácidahumana no soro foram determinados por ELISA. Ver a Figura 7 E. Diluiçõesem série de soro foram adicionadas nos poços de uma placa de 96 poçosrevestidos com a enzima ou com as partículas de AAV inativadas por calor.Os anticorpos ligados foram detectados utilizando imunoglobulinas G (IgG),IgM e IgA anticamundongo de cabra conjugadas com peroxidase de raiz for-te (Zymed, San Francisco, CA, USA). As placas foram incubadas com subs-trato (Sigma-AIdrich) durante 20 min à temperatura ambiente para o desen-volvimento da coloração. Os títulos foram definidos como o recíproco da dilu-ição mais alta de soro que produziu uma D0450 igual ou menor que 0,1. AsFiguras 7 A até 7 D mostram graficamente os níveis de anticorpos anti-hASM na circulação para camundongos tratados e não tratados.
Os anticorpos dentro do parênquima cerebral foram medidoscom um ensaio modificado como a seguir. Os Iisados de tecidos foram diluí-dos 1:20 em tampão de diluição de anticorpo e aplicados em duplicadas emuma placa de 96 cavidades revestida com 100 ng de hASM. As reações doconjugado de HRP com o anticorpo secundário e o substrato cromogênicoforam realizadas como descrito anteriormente. A concentração de anticorpoespecífico a hASM ligado deve ser diretamente correlacionada com a inten-sidade da cor da reação de HRP do conjugado. Assim, os dados finais sãorelatados como a alteração absoluta na D0450 gerada pela diluição do Iisa-do de 1:20 para fornecer uma determinação mais sensível dos níveis de an-ticorpo comparada com o método de titulação utilizado para o soro.
As seções do cérebro foram analisadas em relação à expressãode hASM utilizando um anticorpo monoclonal biotinilado anti-hASM a umadiluição de 1:200 e visualizadas com um anticorpo secundário conjugadocom estreptavidina-Cy3 sob fluorescência vermelha [Passini, M.A. e outros(2005). Mol. Ther. 11:754-762], O substrato de colesterol no cérebro foi de-tectado utilizando um protocolo de coloração com filipina como relatado[Passini, M.A. e outros (2005). Mol. Ther. 11:754-762]. Sucintamente, a filipi-na (Sigma, St. Louis1 MO) foi dissolvida em 100% de metanol até uma con-centração de trabalho de 10 mg/mL. As seções do cérebro foram incubadasdurante 3 h à temperatura ambiente (TA) na escuridão, seguidas por trêslavagens à temperatura ambiente com PBS e verificadas sob fluorescênciaazul. A coloração com Iisenina foi feita para determinar o padrão do substra-to de esfingomielina in situ, como relatado [Shihabuddin, LS. e outros (2004).J. Neurosci. 24:10642-10651]. Sucintamente, a Iisenina (Peptides Internatio-nal, Louisville, Kentucky) que é dissolvida até 10 mg/mL em PBS contendo0,5% de BSA, 0,02% de saponina (Sigma) e 5% de soro normal de jumento.
As seções do cérebro foram incubadas com Iisenina a 4°C durante a noite,seguida pela incubação durante a noite da diluição 1:250 do anticorpo antili-senina de coelho (Peptides International). As células positivas para a Iiseninaforam visualizadas com a diluição de 1:250 de anticorpo anticoelho FITC(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) e verificadas utilizando fluo-rescência verde.
Cada camundongo foi testado através do rotarod de aceleraçãoe de balanço em relação à função motora no Smartrod (AccuScan) utilizandométodos conhecidos na técnica e reproduzidos Sleat e outros (2004) J. Neu-rosci. 24:9117-9126. Os camundongos foram testados no rotarod de acele-ração e de balanço utilizando o Smartrod Rotorod Program (AccuScan Ins-truments, Columbus, OH) para avaliar a função motora. A velocidade de ro-tação do cilindro no rotarod de aceleração foi programada para acelerar auma taxa constante de 0-30 rpm ao longo de 60 segundos e o rotarod debalanço foi programado para acelerar para frente e para trás a cada 2,5 se-gundos até uma velocidade final de 25 rpm ao longo de 54 segundos. Foramrealizados quatro testes em cada animal em cada ponto de tempo e a latên-cia até cair da plataforma foi registrada. O escore de latência alta eqüivale aum bom desempenho. Os testes individuais foram separados por pelo me-nos 15 min para permitir ao animal um período de descanso. As Figuras 3 e4 mostram graficamente os resultados dos testes de rotarod como uma me-dida da recuperação da função motora.
Cada camundongo foi testado utilizando o teste no Labirinto deBarnes. Os camundongos foram treinados para localizar um túnel escuroescondido abaixo de um dos 20 orifícios posicionados em torno do perímetrode um disco de plástico chato grade que era fortemente iluminado por quatrolâmpadas de halogênio na parte de cima. O tempo para navegar ao longo dolabirinto para localizar o orifício escuro correto se correlaciona inversamentecom a função cognitiva - um tempo de navegação mais curto é indicativo deuma melhor função cognitiva. A Figura 5 mostra graficamente os resultadosdo teste no Labirinto de Barnes como uma medida da recuperação da fun-ção cognitiva.
As curvas de sobrevivência são mostradas na Figura 6.
Um protocolo de injeção de combinação de AAVhASM que édirecionado tanto para o cérebro quanto para as vísceras foi avaliado na in-dicação das anormalidades funcionais e das seqüelas da doença dos ca-mundongos ASMKO. No grupo de combinação (n = 11), os camundongosASMKO com 4 semanas de idade receberam 3,0 x1011 cópias do genoma(gc) de AAV8-hASM através de injeção na veia caudal. Duas semanas de-pois, com 6 semanas de idade, os mesmos camundongos receberam inje-ção com AAV2-hASM no córtex motor, no estriado, no cérebro médio e nocerebelo do hemisfério esquerdo e no hipotálamo, no hipocampo, na medula e no cerebelo do hemisfério direito. Cada estrutura foi injetada com 1,5 X1010 gc para um total de 1,2 X 1011 gc por cérebro. Os grupos de controletratados receberam apenas injeções sistêmicas de AAV8-hASM com 4 se-manas de idade (n = 12) ou apenas injeções no cérebro de AAV2-hASMcom 6 semanas de idade (n = 14) e os grupos de controle não tratados inclu-iam camundongos ASMKO (n = 23) e do tipo selvagem (n = 10).
Sangramentos periódicos dos olhos foram realizados para mediros níveis de hASM e de anticorpos anti-hASM na circulação. A análise dosoro proveniente de camundongos ASMKO tratados apenas através da inje-ção sistêmica e através de injeções de combinação exibia os níveis maisaltos de hASM circulante. A transdução e a expressão subseqüente peloAAV8-hASM foi primariamente mediada pelo fígado por causa do tropismodeste sorotipo viral e da seleção de um promotor restrito ao fígado (DC190)no planejamento do cassete de expressão. Ambos os grupos atingiram ní-veis máximos de hASM em 2 semanas após a injeção, que subseqüente-mente declinaram até 10 vezes ao longo do período do estudo. O soro dosgrupos de ASMKO não tratados e com AAV2 no cérebro apenas não exibianíveis detectáveis de hASM. Análises adicionais do soro sangüíneo mostra-ram que os níveis de anticorpo anti-hASM nos camundongos tratados atra-vés da combinação ou de apenas injeções sistêmicas de AAV8 eram simila-res ao nível baixo da linha de base observado nos camundongos ASMKOnão tratados. Em contraste, os camundongos do grupo com apenas AAV2no cérebro exibiam uma indução rápida e robusta (aumento de 200 vezes)dos títulos de anticorpo anti-hASM. Assim, os camundongos tratados atravésda injeção sistêmica de AAV8-hASM pareciam ter tolerância imunológica àhASM expressa.
Os altos níveis da enzima eram evidentes no fígado, nos pul-mões, no baço e nos músculos de camundongos tratados através da combi-nação ou de injeções sistêmicas de AAV8 apenas, presumidamente após aendocitose mediada pelo receptor da manose 6-fosfato da enzima na circu-lação. Os níveis de ASM humana nos órgãos viscerais do grupo com apenasAAV2 no cérebro não foram elevados significativamente acima dos observa-dos nos camundongos de controle ASMKO não tratados. As análises do cé-rebro dos grupos com a combinação e com apenas AAV2 no cérebro exibi-ram altos níveis de hASM ao longo de todo o neuroeixo. Entretanto, o grupocom a combinação exibia níveis significativamente maiores de hASM compa-rados com o do tratamento apenas no cérebro apesar do uso do mesmo ve-tor AAV2 recombinante em ambos os grupos. Os níveis de hASM nos cére-bros de camundongos tratados exclusivamente através de injeção sistêmicaeram baixos e comparáveis com os dos camundongos ASMKO não tratados.Isto indicava que a hASM derivada do fígado na circulação não era capaz deatravessar a barreira sangue-cérebro para dentro do SNC. De forma interes-sante, o título do anticorpo anti-hASM nos homogenados de cérebro era a-proximadamente 10 vezes maior no grupo com apenas AAV2 no cérebrocomparado com o dos outros grupos, incluindo o grupo de combinação. As-sim, os níveis de expressão no cérebro eram recíprocos dos títulos de anti-corpos; o grupo de combinação exibia altos níveis de hASM e baixos níveisde anticorpos anti-hASM, enquanto que o grupo com apenas AAV2 no cére-bro exibia baixos níveis de hASM e altos níveis de anticorpos anti-hASM.
Foi determinado o efeito da expressão de hASM na correção dapatologia de armazenamento nas vísceras e no cérebro de camundongosASMKO. Havia uma correção completa do armazenamento de esfingomieli-na em todos os tecidos viscerais verificados partindo dos grupos de apenasAAV8 sistêmico e de combinação. Em contraste, os animais que receberamapenas injeções no cérebro continham níveis altos de esfingomielina nasvísceras que eram similares aos dos camundongos ASMKO não-tratados.As análises dos níveis de esfingomielina no cérebro de camundongos ASM-KO tratados através das injeções de combinação mostravam uma reduçãoglobal do substrato em relação aos níveis do tipo selvagem. Isto era umamelhoria em relação ao grupo com apenas AAV2 no cérebro, que exibia umdecréscimo significativo de esfingomielina apenas nas placas de cérebro quecorrespondiam a um sítio de injeção. Assim, a extensão da correção no gru-po apenas no cérebro era significativamente menor e nunca se aproximava àeficiência observada no grupo de combinação. A redução menos eficiente doarmazenamento de esfingomielina no grupo com apenas AAV2 no cérebrose correlacionava com os níveis menores de enzima observados neste gru-po. Um alto nível de esfingomielina no cérebro foi observado no grupo comapenas AAV8 sistêmico que era similar ao do ASMKO não tratado.
As seções do cérebro também foram analisadas histologicamen-te em relação à expressão de hASM e em relação ao armazenamento deesfingomielina e colesterol in situ. O padrão de expressão de hASM e deeliminação do armazenamento de esfingomielina se sobrepunha ao do grupocom apenas AAV2 no cérebro. Em contraste, a correção do armazenamentode esfingomielina se estendia bem além dos sítios de injeção nos animaisque receberam terapia de combinação. Isto produziu tanto um padrão desobreposição quanto de não sobreposição do inverso da patologia compara-do com as áreas de transdução com a terapia de combinação. Esta relaçãotambém foi observada com o marcador de colesterol, filipina. Regiões gran-des do cérebro tiveram o armazenamento de colesterol esvaziado no grupode combinação, enquanto que somente uma eliminação local e mais limitadafoi observada no grupo com apenas AAV2 no cérebro. Assim, a capacidadeda hASM de se difundir partindo dos sítios de injeção para corrigir a patolo-gia de armazenamento em regiões distais do cérebro era significativamentemelhor em camundongos tratados através de injeções de combinação com-parada com aquela em camundongos que receberam apenas injeção no cé-rebro. Como pode ser esperado partindo dos dados bioquímicos, o grupocom apenas AAV8 sistêmico não exibia qualquer correção mensurável doarmazenamento de esfingomielina ou colesterol no cérebro.
Começando com 10 semanas de idade, os camundongos foramtratados de forma bissemanal em relação à função motora nos rotarods deaceleração e de balanço. Os animais no grupo de combinação exibiam me-lhorias significativas do desempenho motor em ambos os testes de locomo-ção forçada em cilindro giratório (rotarod) em todos os pontos de tempo e-xaminados (p < 0,001). Os camundongos tratados apenas através de inje-ções no cérebro de AAV2 exibiam uma melhoria modesta no desempenhomotor no rotarod de aceleração nos pontos de tempo iniciais quando compa-rados com os camundongos ASMKO não tratados. Entretanto, seu desem-penho era deteriorado em pontos de tempo tardios demonstrando que asinjeções apenas no cérebro não eram suficientes para sustentar a correçãona função motora. Com o rotarod com balanço, que era um teste mais rigo-roso da função e da coordenação motora, o grupo com apenas AAV2 no cé-rebro tinha um desempenho fraco ao longo de todo o estudo. O grupo comapenas AAV8 sistêmico exibia pouco até nenhum benefício em qualquer tes-te de rotatod.
Começando com 17 semanas de idade, os camundongos foramtambém testados em relação à função cognitiva a cada 4 semanas no Iabi-rinto de Barnes. Os camundongos utilizaram dicas de navegação espacialmediada pela memória para escapar de um labirinto sob o estímulo luminosoadverso. O grupo com apenas AAV2 no cérebro teve melhor desempenhoque o dos ASMKO não tratados, mas nunca se aproximou ao nível de de-sempenho observado nos camundongos do tipo selvagem. Os camundon-gos tratados através de injeções sistêmicas apenas exibiam melhoria semgrande importância quando comparados com os controles não-tratados. Emcontraste, o grupo de combinação teve um desempenho no labirinto de Bar-nes com uma competência que era similar a dos camundongos do tipo sel-vagem (p>0,05). Junto com os dados do rotarod, a correção da patologiatanto no cérebro quanto nas vísceras era necessária para o melhor resultadofuncional.
Os camundongos foram pesados a cada duas semanas paraavaliar seu bom estado geral e sua sobrevivência foi analisada por uma re-presentação gráfica. O grupo de combinação tinha um perfil de ganho depeso que era similar ao dos animais do tipo selvagem, que era significativa-mente melhor que o dos grupos com apenas AAV2 no cérebro e apenasAA V8 sistêmico (p < 0,001). Os animais moribundos, definidos como ataxiaforte, incapacidade de andar em uma linha reta sem cair, inabilidade de selimparem, perda de 20% do peso corporal e desidratação foram sacrificadospor meios humanitários. Os grupos de combinação, com apenas AAV2 nocérebro e apenas AAV8 sistêmico exibiam maior sobrevivência comparadoscom os camundongos ASMKO não tratados, que tinham um tempo de vidamédio de 34 semanas. Entretanto, todos os camundongos ASMKO tratadosatravés da terapia de combinação sobreviveram até 54 semanas de idade enão exibiram sinais de ataxia. Isto era uma melhoria significativa em relaçãoaos grupos com apenas AAV2 no cérebro e apenas AAV8 sistêmico, em quetodos os animais eventualmente ficavam moribundos com tempos de vidamédios de 48 e 47 semanas (p <0,0001). Nenhum dos animais nos gruposcom injeção isolada sobreviveu até 54 semanas. Assim, embora o tratamen-to apenas do cérebro ou das vísceras fornecia um benefício de sobrevivên-cia significativo, este era menos eficiente que o tratamento de ambos oscompartimentos do corpo com a terapia de combinação.
O relatório descritivo é mais totalmente entendido à luz dos en-sinamentos das referências citadas dentro do relatório descritivo. As modali-dades dentro do relatório descritivo fornecem uma ilustração das modalida-des da invenção e não devem ser interpretadas como Iimitantes do âmbitoda invenção. O versado na técnica reconhece facilmente que muitas outrasmodalidades são abrangidas pela invenção. Todas as publicações, patentese seqüências biológicas citadas nesta descrição são incorporadas como re-ferência em sua totalidade. Até a extensão que o material incorporado con-tradiz ou é incoerente çom o presente relatório descritivo, o presente relató-rio descritivo substituirá qualquer tal material. A citação de quaisquer refe-rências contidas aqui não é uma admissão que tais referências são a técnicaanterior da presente invenção.
A não ser que seja indicado de outra maneira, todos os númerosque expressam quantidades de ingredientes, cultura de células, condiçõesde tratamento e assim por diante utilizados no relatório descritivo, incluindoas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados em todoscasos através do termo "aproximadamente". Conseqüentemente, a não serque seja indicado de outra maneira ao contrário, os parâmetros numéricossão aproximações e podem variar dependendo das propriedades desejadasbuscadas para serem obtidas pela presente invenção. A não ser que sejaindicado de outra maneira, o termo "pelo menos" precedendo uma série deelementos deve ser entendido como se referindo a cada elemento na série.Os versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de determinar o usode não mais que experimentos de rotina, muitos equivalentes às modalida-des específicas da invenção descritas aqui. É pretendido que tais equivalen-tes sejam abrangidos pelas reivindicações a seguir.

Claims (24)

1. Processo que compreende as etapas de: a) administração deuma quantidade eficiente de um vetor viral que compreende um transgeneque codifica um agente imunogênico ao tecido hepático de mamífero; e b)administração subseqüente de uma quantidade eficiente de um segundovetor viral que compreende um transgene que codifica um agente imunogê-nico ao cérebro de mamífero.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito se-gundo vetor é administrado após a expressão do transgene ser detectada nodito mamífero.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o transge-ne codifica uma proteína ou um polipeptídeo de distúrbio de armazenamentolisossomal.
4. Processo da reivindicação 3, em que a proteína ou o polipep-tídeo é um polipeptídeo ou uma proteína da esfingomielinase ácida.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o mamífe-ro é um ser humano.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a adminis-tração ao cérebro de mamífero é feita em um sítio selecionado do grupo queconsiste no tronco cerebral, do cérebro médio, do hipocampo, do estriado,da medula, das pontes, do mesencéfalo, do cerebelo, do tálamo, do hipotá-lamo, do córtex cerebral, do lóbulo occipital, do lóbulo temporal, do lóbuloparietal e do lóbulo frontal.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a adminis-tração ao cérebro de mamífero é feita nos núcleos cerebelares profundos docerebelo.
8. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o vetorviral é um vírus associado a adeno (AAV).
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que o vetor deAAV é selecionado do grupo que consiste em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4,AAV5, AAV6, AAV7 e AAV8.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o AAV éum vetor de AAV recombinante.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, em que o vetorde AAV recombinante é selecionado do grupo que consiste nos vetores dossorotipos AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8.
12. Processo de acordo com a reivindicação 10, em que o vetorde AAV recombinante compreende intensificadores e elementos promotoresespecíficos ao fígado.
13. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a etapab) é repetida.
14. Processo para o tratamento da Doença de Niemann-Pick doTipo A em um mamífero que compreende as etapas de: a) administração deuma quantidade eficiente de um vetor viral que compreende um transgeneque codifica um polipeptídeo ou uma proteína da esfingomielinase ácida aotecido hepático de mamífero; e b) administração subseqüente de uma quan-tidade eficiente de um segundo vetor viral que compreende um transgeneque codifica um polipeptídeo ou uma proteína da esfingomielinase ácida aocérebro do dito mamífero, tratando assim a Doença de Niemann-Pick do Ti-po A no mamífero.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a etapab) é repetida.
16. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o ditosegundo vetor é administrado após a expressão do transgene ser detectadano dito mamífero.
17. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que o mamí-fero é um ser humano.
18. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a admi-nistração ao cérebro de mamífero é feita em um sítio selecionado do grupoque consiste no tronco cerebral, do cérebro médio, do hipocampo, do estria-do, da medula, das pontes, do mesencéfalo, do cerebelo, do tálamo, do hi-potálamo, do córtex cerebral, do lóbulo occipital, do lóbulo temporal, do lóbu-lo parietal e do lóbulo frontal.
19. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a admi-nistração ao cérebro de mamífero é feita nos núcleos cerebelares profundosdo cerebelo.
20. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o vetorviral é um vírus associado a adeno (AAV).
21. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que o vetorde AAV é selecionado do grupo que consiste em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4,AAV5, AAV6, AAV7 e AAV8.
22. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que o AAV éum vetor de AAV recombinante.
23. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que o vetorde AAV recombinante é selecionado do grupo que consiste nos vetores dossorotipos AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8.
24. Processo de acordo com a reivindicação 20, em que o vetorde AAV recombinante compreende intensificadores e elementos promotoresespecíficos ao fígado.
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