CN116209477A - 使用重组人酸性鞘氨醇酶改善骨骼肌纤维的修复 - Google Patents

Abstract

提供了用于治疗肌营养不良症的组合物和方法。

Description

使用重组人酸性鞘氨醇酶改善骨骼肌纤维的修复

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2020年6月30日提交的美国临时专利申请第63/046,202号的优先权。前述申请通过引用的方式纳入本文。

本发明是在政府的支持下，由美国关节炎和肌肉骨骼及皮肤病研究所(NIAMS)授予的第5R01AR055686号资金完成的。政府对本发明拥有某些权利。

技术领域

本发明涉及肌纤维修复，特别是提供了用于治疗、抑制和/或预防dysferlinopathy的组合物和方法。

背景技术

dysferlinopathy是一种进行性肌肉萎缩疾病，如肢腰肌营养不良症2B型(LGMD2B)或Miyoshi肌营养不良症1型，根据其肌肉介入情况(Bashir等人,(1998)Nat.Genet.,20:37-42；Liu等人,(1998)Nat.Genet.,20:31-36)。Dysferlin缺失导致囊泡形成和贩运的改变，受伤的细胞膜修复不良，以及肌肉炎症增加(Cenacchi等人,(2005)J.Clin.Pathol.,58:190-195；Demonbreun等人,(2011)Hum.Mol.Genet.,20:779-789；Bansal等人,(2003)Nature 423:168-172；Ho等人,(2004)Hum.Mol.Genet.,13:1999-2010；Gallardo等人,(2001)Neurology57:2136-2138；Bonnemann等人,(1996)Curr.Opin.Pediatr.,8:569-582)。

dysferlinopathy的疾病严重程度与肌肉的脂肪替代有关。事实上，脂肪的积累与dysferlin缺乏患者的发病机制直接相关，这是dysferlinopathy的一个独特特性。纤维/脂肪生成前体细胞(FAPs)的积累也与疾病的严重程度相关，因为FAPs导致dysferlinopathy肌肉的脂肪生成损失(Hogarth等人,(2019)Nat.Commun.,10:2430)。值得注意的是，膜联蛋白A2的缺失可以防止dysferlinopathy肌肉的脂肪生成损失(Defour等人,(2017)Hum.Mol.Genet.，26(11)：1979-1991)。细胞外膜联蛋白A2通过与巨噬细胞相互作用，促进了dysferlinopathy肌肉的脂肪生成转化。FAP激活的减少可能是膜联蛋白A2缺乏的dysferlinopathy肌肉中脂肪生成减少的基础。事实上，阻断FAP的脂肪生成限制了dysferlinopathy肌肉的脂肪生成损失。

dysferlin含有C2结构域，这些结构域存在于依赖Ca²⁺的膜融合蛋白中，如突触蛋白(Lek等人,(2012)Traffic 13:185-194)。因此，dysferlin可能通过调节囊泡贩运和融合来调节肌肉功能(Posey等人,(2011)Curr.Top.Dev.96:203-230；Lennon等人,(2003)J.Biol.Chem.,278:50466-50473；Kesari等人,(2008)Am.J.Pathol.,173:1476-1487；Nagaraju等人,(2008)Am.J.Pathol.,172:774-785)。dysferlin缺乏也被牵涉到有关dysferlinopathy肌细胞融合能力的矛盾报告中(Demonbreun等人,(2011)Hum.Mol.Genet.,20:779-789；de Luna等人,(2006)J.Biol.Chem.,281:17092-17098；Humphrey等人,(2012)Exp.Cell.Res.,318:127-135；Philippi等人,(2012)PLoS Curr.,4:RRN1298)。

由于dysferlin的作用如此多样，因此dysferlin缺乏导致肌肉病变的机制仍未解决。由于dysferlin的骨骼肌特异性再表达可以挽救所有dysferlinopathy病症，因此有人认为肌纤维修复是dysferlinopathy病症中肌肉病变表象下的统一缺陷(Millay等人,(2009)Am.J.Pathol.,175:1817-1823；Lostal等人,(2010)Hum.Mol.Genet.,19:1897-1907；Han,R.(2011)Skelet.Muscle 1:10)。修复受伤的细胞膜需要亚细胞区室，其在哺乳动物细胞中包括溶酶体、放大体、小窝蛋白、含dysferlin的囊泡和线粒体(Lennon等人,(2003)J.Biol.Chem.,278:50466-50473；Bansal等人,(2003)Nature 423:168-172；Borgonovo等人,(2002)Nat.Cell.Biol.,4:955-962；Corrotte等人,(2013)Elife 2:e00926；Sharma等人,(2012)J.Biol.Chem.287:30455-30467)。

来自肌营养不良症患者的细胞，如果有正常的dysferlin表达，就会表现出正常的溶酶体和放大体胞外分泌(Jaiswal等人,(2007)Traffic 8:77-88)。然而，Dysferlinopathy肌肉细胞表现出LAMP2阳性溶酶体增大，早期内体融合减少，调节晚期内体/溶酶体融合的蛋白质表达改变，以及损伤触发的细胞表面LAMP1水平下降(Demonbreun等人,(2011)Hum.Mol.Genet.,20:779-789；Lennon等人,(2003)J.Biol.Chem.,278:50466-50473；Kesari等人,(2008)Am.J.Pathol.,173:1476-1487)。在非肌肉细胞中，缺乏dysferlin会减少溶酶体的胞外分泌(Han等人,(2012)J.Cell.Sci.,125:1225-1234)。这些发现牵涉到在dysferlin介导的肌肉细胞膜修复中的溶酶体(Corrotte等人,(2013)Elife2:e00926；McDade等人,(2013)Hum.Mol.Genet.,23:1677-1686)。

尽管有上述研究，仍然需要有效的治疗方法。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了治疗、抑制和/或预防受试者的肌营养不良症的方法。所述方法包括向受试者施用酸性鞘磷脂酶。在一个特定的实施方案中，该方法包括向受试者施用编码酸性鞘磷脂酶的核酸，特别是其中该核酸在肝脏或肝细胞中表达。在某些实施方案中，编码酸性鞘磷脂酶的核酸是在肝脏特异性或肝细胞特异性启动子的控制下或与之相连。通常情况下，肌营养不良症是dysferlinopathy或者是dysferlin缺乏的。dysferlinopathy的例子包括肢腰肌营养不良症2B型(LGMD2B)或宫氏肌营养不良症1型。在一个特定的实施方案中，酸性鞘磷脂酶是人类酸性鞘磷脂酶。在一个特定的实施方案中，编码酸性鞘磷脂酶的核酸包含在病毒载体中，如腺相关病毒载体。

根据本发明的另一个方面，还提供了用于实施上述方法的组合物和载体(例如，AAV载体)。

附图说明

图1A提供了用增加剂量的纯化hASM蛋白处理的LGMD2B患者肌细胞的图像。提供了病灶激光损伤(白色箭头标记的部位)之前和之后肌细胞的共聚焦图像，显示了FM染料的标记。比例尺＝10μm。图1B提供了膜损伤后FM-染料进入肌细胞的动力学图(每个条件下n＝50个细胞)。数据以平均值±SEM表示。*P<0.05(与未处理和3U/L相比)、#(与5U/L相比)通过混合模型方差分析，分析处理条件和时间之间的相互影响效应。图1C提供了一个图表，显示了激光损伤的细胞中修复失败的比例的量化(每个条件下n>45个细胞)。数据以平均值±SEM表示。1-way ANOVA，Tukey HSD事后检验，α值设置为P<0.05(n＝3次实验重复，每个条件下每次重复15-18个细胞)。

图2A提供了表达mRFP标记的caveolin-1的小鼠肌细胞未经处理(顶部)或用6U/L纯化的hASM处理(底部)的底面(细胞-盖玻片界面)的共聚焦图像。灰度图像显示了成像开始时的整个细胞(时间点0)。细胞上的线标志着灰度kymograph中显示的像素，显示了caveolin-1的移动能力，以每秒1帧的速度获得的图像，持续3分钟(kymograph y轴＝180秒的总采集时间)。像素的断裂轨迹表示存在于细胞膜上的小窝蛋白的移动。hASM处理过的Kymograph中的箭头表示在60秒时加入hASM的时间标记。图2B提供了显示了每个条件(n＝10个细胞的50个点状物)下caveolin-1点状物量化的图。图2C提供了细胞膜脱落的图像，其中活细胞在成像前用FITC-胆固醇标记。灰度图像显示了成像开始时盖玻片表面的细胞膜共聚焦图像(时间点0)，白色方框标志着盖玻片上邻近细胞的细胞外空间，用于监测细胞脱落的胆固醇标记的囊泡。该区域的放大显示在右边的面板上，其中显示了成像开始时存在的囊泡(基线)，以及模拟(未处理)处理或用6U/L hASM处理(hASM-处理)后2分钟存在的囊泡。图2D提供了显示用6U/L hASM处理或未处理的细胞所脱落的富含FITC胆固醇的颗粒的量化图(每个条件n＝10个细胞)。图2E提供了图2C和2D中成像的细胞相关FITC-胆固醇荧光损失率的量化图(每个条件n＝10个细胞)。图2F提供的图像显示了用6U/L hASM处理前和4分钟后，通过小鼠肌细胞中间表达CLIC/GEEC报告子GPI-GFP的光学切片。图2G-2J提供了显示GPI-GFP在C2C12-肌细胞(图2G、2H)和健康及患者肌细胞(图2I、2J)中的动力学(图2G、2H)和内化率(图2H、2J)的图。数据代表平均值±SEM。通过独立样本t检验*P<0.05(与未处理的细胞相比)(图2B、2D、2E)。动力学和速率分析是通过混合模型方差分析进行的，α值设定为p<0.05(图2G-2J)。整个细胞的比例尺为10μm，放大的图像比例尺为5μm。

图3A提供了未经处理和hASM处理的细胞在基线和内吞3分钟后用WGA标记的小鼠肌细胞的共焦图像。比例尺＝10μm。图3B提供了显示不同剂量的hASM对小鼠肌细胞大量膜内吞的影响的图。图3C提供了显示荧光WGA标记的健康和患者肌细胞在基线(左图)和3分钟内吞后(右图)的共聚焦图像。比例尺＝10μm。图3D提供了显示健康和LGMD2B患者肌肉细胞大量内吞的量化以及hASM对患者和健康细胞内吞的影响的图(每个条件n>2次实验重复)。所有数据均以平均值±SEM表示。图3B，3D：通过1-way ANOVA和Tukey HSD事后检验评估，*p<0.05(与未处理的细胞相比)。

图4A提供了肝脏特异性启动子下用Control-AV或hASM-AAV转导的HepG2细胞裂解物中hASM的Western印迹图像(n＝3个独立重复)。图4B提供了肝脏特异性启动子下用Control-AV或hASM-AAV转导的HepG2细胞裂解物中hASM活性的定量图(n＝3个独立重复)。图4C提供了对照-AAV和hASM-AAV感染的HepG2细胞的培养上清液中hASM活性的定量图(n＝3个独立重复)。图4D提供了健康和LGMD2B患者肌细胞在病灶激光损伤(箭头标记的部位)之前和之后的共聚焦图像，显示了FM染料的标记。LGMD2B患者的肌细胞在CIM中用对照组和hASM-AAV感染的HepG2细胞的培养上清液处理。比例尺＝10μm。图4E提供了一个显示健康和患者肌细胞中FM-染料进入的平均动力学的图(每个条件n>15个细胞)。数据以平均值±SEM表示。通过独立样本t检验(图4B、4C)，*p<0.001(与对照-AAV处理的细胞相比)。对于图4E，使用混合模型方差分析，分析处理条件和时间之间的交互效应(*p<0.001，与对照-AAV处理的细胞上清液相比)。

图5A提供了显示从hASM-AAV和对照-AAV注射小鼠的肝脏中分离出的hASM活性的图(每个条件n＝5只小鼠)。图5B提供了注射后12周hASM-AAV和对照-AAV的血清中hASM活性的图(以U/L表示)。图5C提供了一个显示血清丙氨酸转氨酶(ALT)浓度的图，以评估对照组和hASM-AAV处理的小鼠在注射后12周的肝脏损伤程度。图5D提供了显示用IgM标记的肌纤维定量的图。图5E提供了用IgM标记的肌纤维的图像(箭头)(顶行；比例尺＝1000μm)；新鲜分离的肱二头肌的FM-染料摄取图像，在用白色箭头标记的部位进行病灶激光损伤后(每只小鼠n＝20个肌纤维)(中间两行；比例尺＝50μm)；以及来自对照组-AAV和hASM-AAV处理的小鼠的分离EDL肌肉的图像，这些小鼠因重复的10％偏心收缩和肌纤维膜损伤而受伤，并用普施安橙染料标记(箭头)(底行；比例尺＝100μm)。图5F提供了新鲜分离的肱二头肌的肌纤维吸收FM-染料的动力学图，在白色箭头标记的部位进行病灶激光损伤后(每只小鼠n＝20个肌纤维)。图5G提供了显示从激光损伤中成功修复的肌纤维的图(n>15)。图5H提供了显示了每块肌肉中普施安橙标记的纤维数量量化的图(每组n＝4块肌肉，因为每组中的一只小鼠在准备EDL肌肉过程中的过多损伤)。图5I提供了显示肌肉收缩力在10次重复的偏心收缩中变化的图(每组n＝5只小鼠)。数据以平均值±SEM表示。*p<0.05，与对照组AAV相比，独立样本t检验或混合模型方差分析，分析处理条件和时间之间的交互效应。图5J提供了显示5μg肌肉蛋白(股四头肌)中重组人ASM活性的图(每个样品分析三次重复-对照-AAV，hASM-AAV，每个AAV组n＝5只小鼠，每个野生型3只)。数据以平均hASM活性±SEM表示。通过独立样本t检验，*p＝0.011(与对照-AAV相比)。

图6A：第1行提供了LGMD2B模型的股四头肌横断面的H&E染色图像，该模型在接受单次静脉注射对照AAV或hASM-AAV治疗12周后(箭头标记炎症病灶)(比例尺＝100μm)；第2行提供了显示使用层粘连蛋白和DAPI分别显现基底膜和肌核的图像(比例尺＝100μm)。第3行提供了肌肉横截面的Masson三色染色图像(每组n＝5)(比例尺＝100μm)；第4行提供了股四头肌横截面脂滴包被蛋白标记区域的图像(比例尺＝100μm)。图6B提供了显示炎症病灶量化的图(从整个股四头肌横截面随机选择10个区域，每组n＝5只小鼠)。图6C提供了显示整个股四头肌横截面上以中心核的存在为标志的再生肌纤维量化的图，并以总纤维的百分比表示。图6D提供了一个显示肌纤维横截面积分布的图表(每组n＝3000根纤维)。图6E提供了显示肌肉横截面中Masson三色染色定量的图(每组n＝5)。图6F提供了股四头肌横断面中脂滴包被蛋白标记面积的量化图。图6G和6H提供了经上述处理的小鼠前肢和后肢握力的量化图，收缩力与体重呈正比(每组5只小鼠，每只小鼠重复测量5次的平均值；前肢：p>0.05)。数据以平均值±SEM表示。后肢：*p<0.05，与对照组-AAV相比。

图7A提供了一个显示AAV处理的小鼠在单次AAV注射前和12周后体重对应变化的图。图7B显示了在基线(第0周)、注射后1周、4周和12周，hASM-AAV和对照-AAV注射小鼠血清中的hASM活性(以U/L表示)。评估两只22周大的野生型BL6小鼠的血清ASM活性，作为与正常水平的比较(平均值＝虚线，灰色阴影＝最小/最大)。*p＝0.011(与对照组-AAV)。图7C提供了显示hASM细胞毒性和浓度关系的图。人肌细胞在补充了滴定浓度的hASM蛋白(Control/PBS，8、80、800U/L)的生长培养基中培养24小时(6U/L是最小治疗剂量-以虚线表示)。收集细胞并通过台盼蓝试验评估细胞活力/死亡。数据以总细胞数中死亡细胞的平均比例(％)表示。通过独立的1-way ANOVA，*p<0.001(与800U/L hASM相比)。图7D提供了每个治疗组的小鼠的组织学评分图，有合适的/高质量的组织学图像，可以进行组织病理学分级(等级：1-10，分数越高表示病理越差；3＝局部变性/坏死，4＝局部/广泛的炎症/变性/或坏死，5＝大量坏死/肝细胞丧失；PBS注射的BLA/J小鼠得分3：局域变性和坏死)。图7E提供了显示12周研究期间血清ALT水平的图，以评估肝脏靶向AAV对肝脏健康和/或肝脏损伤的影响(正常范围5个月大的BL6小鼠：～22-40U/L)(Otto等人,(2016)J.Am.Assoc.Lab.Anim Sci.,55(4):375-86)。数据以平均值±SEM表示。

具体实施方式

在此，我们利用腺相关病毒(AAV)病毒载体将重组人酸性鞘磷脂酶基因(rhASM)特异性地传递到小鼠肝脏中。这种rhASM-AAV可插入肝细胞基因组中，并诱导肝脏上调其rhASM蛋白的产量。肌营养不良症，如肢腰肌营养不良症2B(LGMD2B)，其特点是骨骼肌中缺乏dysferlin蛋白，遭受损伤肌纤维的修复不良。肌纤维在日常活动和肌肉收缩过程中经常受损，特别是在肌纤维膜处。这种膜损伤通常会在几分钟内得到有效修复，部分原因是由dysferlin介导的修复性酶ASM的释放。受损的肌肉细胞释放的ASM使酶作用于受损的细胞膜，在那里它水解脂质鞘磷脂并帮助稳定膜以促进损伤的修复(Defour等人,(2014)CellDeath Disease 5:e1306)。然而，缺乏ASM或抑制其酶促作用使肌纤维无法有效修复，并导致肌纤维死亡和肌肉变性。这种缺陷是在LGMD2B和其他肌肉疾病中观察到的肌肉健康状况不佳的潜在机制。

一种治疗dysferlin缺失的基因治疗方法涉及反复将编码dysferlin的AAVs直接输送到肌肉中。这种方法受到了针对AAV载体的免疫反应和炎症反应的阻碍。此外，dysferlin基因的大尺寸阻碍或阻止其包装在单一的AAV载体中，从而降低了治疗的效果。

与此相反，本发明规避了反复将dysferlin基因输送到肌肉中的需要。事实上，通过处理dysferlin缺失的下游后果—即ASM分泌减少导致dysferlin缺失的肌纤维修复能力差—并将rhASM-AAV靶向到肝脏，本发明提供了意想不到的卓越和长期的dysferlinopathy肌纤维修复能力和/或dysferlin恢复的改善。因此，本发明代表了一种稳定的治疗方法，可以治疗缺失dysferlin的肌营养不良症(特别是如LGMD2B的dysferliopathy)中不良的肌纤维修复能力。本发明的方法避免了反复施用的要求和AAV载体有效输送到肌肉中相关的困难。

因此，本发明提供了通过外源性提供ASM(特别是rhASM)来治疗dysferlin缺乏的方法。本发明的基于AAV的基因疗法能使ASM(如rhASM)酶的生产和分泌进入循环，以增加有dysferlin缺失的骨骼肌中ASM(如rhASM)酶的水平，这反过来又有助于患病肌肉的有效修复。使用基于AAV2/8的载体，通过尾静脉注射将rhASM基因输送到小鼠模型(BL6/AJ)中，用于治疗dysferlin缺乏症(LGMD2B)，并检查了这种方法对减少患病小鼠肌肉的缺陷的功效。值得注意的是，肌肉健康的多个方面(收缩力、组织病理学和修复能力)都得到了改善，其程度优于报道的其他方法。

根据本发明，提供了治疗、抑制和/或预防有需要的受试者的肌营养不良症的方法。在一个特定的实施方案中，肌营养不良症的特征是dysferlin缺乏。在一个特定的实施方案中，该肌营养不良症是dysferlinopathy。dysferlinopathy的例子包括但不限于肢腰肌营养不良症2B(LGMD2B)和Miyoshi肌肉疾病(MM)或Miyoshi肌营养不良症1。

根据本发明的另一个方面，提供了改善或增加肌纤维，特别是骨骼肌纤维的修复方法，特别是在需要的受试者中。在一个特定的实施方案中，该肌纤维的特征是dysferlin缺乏。在一个特定的实施方案中，该受试者有肌营养不良症。在一个特定的实施方案中，该受试者有dysferlinopathy。在一个特定的实施方案中，受试者有尼曼-皮克病(NeimannPick Disease)(例如，A型或B型)。

本发明的方法包括将酸性鞘磷脂酶(ASM)施用于有需要的受试者。在某些实施方案中，本发明的方法包括将编码酸性鞘氨醇酶(ASM)的核酸分子施用于有需要的受试者。在一个特定的实施方案中，该ASM是人的(hASM)。在一个特定的实施方案中，ASM是重组的人ASM(rhASM)，如Olipudase alpha(Sanofi Pharmaceuticals,Bridgewater,NJ)。GenBank基因ID：6609和GenBank登录号：NM_000543和NP_000534提供了氨基酸和核苷酸序列的实例。ASM可以是ASM的任何变体或异构体(例如，异构体1、2、3、4或5)。在一个特定的实施方案中，ASM的异构体1或变体1。在一个特定的实施方案中，ASM包括信号肽。

带有信号肽的前体人ASM序列的一个实例是：MPRYGASLRQSCPRSGREQGQDGTAGAPGLLWMGLVLALALALALALALSDSRVLWAPAEAHPLSPQGHPARLHRIVPRLRDVFGWGNLTCPICKGLFTAINLGLKKEPNVARVGSVAIKLCNLLKIAPPAVCQSIVHLFEDDMVEVWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGHWDIFSSWNISLPTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILFLTDLHWDHDYLEGTDPDCADPLCCRRGSGLPPASRPGAGYWGEYSKCDLPLRTLESLLSGLGPAGPFDMVYWTGDIPAHDVWHQTRQDQLRALTTVTALVRKFLGPVPVYPAVGNHESTPVNSFPPPFIEGNHSSRWLYEAMAKAWEPWLPAEALRTLRIGGFYALSPYPGLRLISLNMNFCSRENFWLLINSTDPAGQLQWLVGELQAAEDRGDKVHIIGHIPPGHCLKSWSWNYYRIVARYENTLAAQFFGHTHVDEFEVFYDEETLSRPLAVAFLAPSATTYIGLNPGYRVYQIDGNYSGSSHVVLDHETYILNLTQANIPGAIPHWQLLYRARETYGLPNTLPTAWHNLVYRMRGDMQLFQTFWFLYHKGHPPSEPCGTPCRLATLCAQLSARADSPALCRHLMPDGSLPEAQSLWPRPLFC(SEQ IDNO:1)。

一个成熟的人ASM序列的实例是：LALSDSRVLWAPAEAHPLSPQGHPARLHRIVPRLRDVFGWGNLTCPICKGLFTAINLGLKKEPNVARVGSVAIKLCNLLKIAPPAVCQSIVHLFEDDMVEVWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGHWDIFSSWNISLPTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILFLTDLHWDHDYLEGTDPDCADPLCCRRGSGLPPASRPGAGYWGEYSKCDLPLRTLESLLSGLGPAGPFDMVYWTGDIPAHDVWHQTRQDQLRALTTVTALVRKFLGPVPVYPAVGNHESTPVNSFPPPFIEGNHSSRWLYEAMAKAWEPWLPAEALRTLRIGGFYALSPYPGLRLISLNMNFCSRENFWLLINSTDPAGQLQWLVGELQAAEDRGDKVHIIGHIPPGHCLKSWSWNYYRIVARYENTLAAQFFGHTHVDEFEVFYDEETLSRPLAVAFLAPSATTYIGLNPGYRVYQIDGNYSGSSHVVLDHETYILNLTQANIPGAIPHWQLLYRARETYGLPNTLPTAWHNLVYRMRGDMQLFQTFWFLYHKGHPPSEPCGTPCRLATLCAQLSARADSPALCRHLMPDGSLPEAQSLWPRPLFC(SEQ ID NO:2)。

编码人ASM序列的核酸序列的一个例子是：

在一个特定的实施方案中，编码人ASM序列的核酸序列包括SEQ ID NO:3中从起始密码子到终止密码子的部分(在前文中用下划线表示)。

本发明的ASM可以具有与SEQ ID NO：1或2至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

在一个特定的实施方案中，编码酸性鞘磷脂酶的核酸分子是在肝脏特异性或肝细胞特异性启动子的控制下(Jacobs等人,(2008)Gene Ther.,15(8):594-603；Kramer等人,(2003)Mol.Ther.,7(3):375-385)。肝脏特异性或肝细胞特异性启动子在肝细胞或肝细胞中优先于其他细胞类型或组织表达所连接的核酸。肝脏特异性或肝细胞特异性启动子不需要(但可以)在肝细胞或肝细胞中专门表达所连接的核酸。肝脏特异性或肝细胞特异性启动子的实例包括但不限于人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、杂交肝脏启动子(HLP；McIntosh等人,(2013)Blood121(17):3335-44)、人甲状腺结合球蛋白(TBG)、人血清白蛋白启动子(可选择与一个或多个人凝血酶增强剂拷贝连接)、DC190启动子(Ziegler等人,(2004)Mol.Ther.,9:231-240)。在一个特定的实施方案中，肝脏特异性或肝细胞特异性启动子是人血清白蛋白启动子或DC190启动子。

在一个特定的实施方案中，编码酸性鞘磷脂酶的核酸分子被输送(例如，被动输送(例如，静脉注射)或直接输送(例如，注射))到肝脏。在某些实施方案中，编码酸性鞘磷脂酶的核酸分子不直接输送(例如，通过注射)到受试者的肌肉。

在一个特定的实施方案中，编码酸性鞘磷脂酶的核酸分子包含在质粒或载体(如表达载体)中，特别是病毒载体。本发明的核酸分子可以选择被非病毒载体(如脂质体、胶束、裸cDNA、转座子等)包含或被封装。可用于本发明的病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体(例如，AAV-1至AAV-13，特别是AAV-2、AAV-5、AAV-7和AAV-8，或混合AAV载体)，慢病毒载体和假型慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、牛痘病毒载体和逆转录病毒载体。在一个特定的实施方案中，编码酸性鞘磷脂酶的核酸分子包含在一个AAV载体中。在一个特定的实施方案中，AAV载体是AAV2/8载体或AAV8载体。在一个特定的实施方案中，该载体或病毒载体被靶向到肝脏或肝细胞(例如，用一个靶向配体或肝脏或肝细胞特异性受体配体)。在一个特定的实施方案中，编码酸性鞘磷脂酶的核酸分子是在上述肝脏特异性或肝细胞特异性启动子的控制下。

编码酸性鞘磷脂酶的核酸分子或包含本发明相同内容的载体(或包含相同内容与药学上可接受的载体的组合物)可被施用于动物，特别是哺乳动物，尤其是人类，以治疗、抑制或预防肌营养不良症。本发明的方法和组合物还可包括至少一种用于治疗、抑制或预防肌营养不良症的其他治疗剂(例如，蛋白质ASM)。另外的治疗剂也可以在与本发明的化合物分开的组合物中施用。这些组合物可以在同一时间和/或不同时间(例如，顺序)施用。

本文所述的本发明的化合物一般将作为药物制剂对患者或受试者施用。本文所用的术语“患者”是指人类或动物受试者。本发明的化合物可以在医生或其他医疗专业人员的指导下进行治疗性使用。

包含编码酸性鞘磷脂酶的核酸分子或包含本发明相同的载体的药物制剂可方便地配制成可接受的介质，如水、缓冲盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、二甲亚砜(DMSO)、油、洗涤剂、悬浮剂或其合适的混合物来施用。本领域的技术人员可以很容易地确定溶解度限值。

在本文中使用时，“药学上可接受的介质”或“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质和可能适合于药物制剂的预期施用途径的类似物，如前面讨论中所举例的。使用这类介质来处理药物活性物质是本领域内已知的。除非任何常规介质或制剂与要施用的化合物不相容，否则均可以考虑将其用于药物制剂。

适用于对特定患者施用的根据本发明的化合物剂量和用量方案可由医生考虑患者的年龄、性别、体重、一般医疗状况、以及施用该化合物的具体条件及其严重程度来确定。医务人员还可以考虑到化合物的施用途径、包含化合物的药物载体以及化合物的生物活性。

选择合适的药物制剂也将取决于所选择的施用方式(如进入血流、静脉注射或直接注射)。例如，编码酸性鞘磷脂酶的核酸分子或包含本发明相同内容的载体可以通过注射施用，例如直接注入肝脏或靠近肝脏注射。在这些情况下，药物制剂包括分散在与注射部位兼容的介质中的本发明化合物。

编码酸性鞘磷脂酶的核酸分子或包含本发明相同内容的载体可通过任何方法，如鼻内、肌肉内、皮下、局部、口服或注射施用。用于注射的药物制剂在本领域中是已知的。如果选择注射作为施用化合物的方法，应采取确保有足够数量的化合物到达其目标细胞以发挥生物效应的步骤。

含有本发明的化合物作为活性成分与药物载体紧密混合的药物组合物可以按照常规的药物配制技术来制备。载体可以采取多种形式，这取决于所需的制剂形式，例如注射。例如，可以使用适当的液体载体、悬浮剂及类似物来制备可注射的悬浮液。

定义

为便于理解本发明，提供以下定义：

单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指称，除非上下文有明确规定。

“药学上可接受的”表示由联邦或州政府的监管机构批准，或被列入美国药典或其他公认的药典，用于动物，尤其是人类。

“载体”是指，例如，稀释剂、佐剂、防腐剂(如Thimersol、苄醇)、抗氧化剂(如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、增溶剂(如聚山梨酯80)、乳化剂、缓冲剂(如Tris HCl、乙酸盐、磷酸盐)、抗菌剂、增容物质(如乳糖、甘露醇)、赋形剂、辅助剂或与本发明的活性剂一起施用的载体。药学上可接受的载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些来自石油、动物、植物或合成的液体。水或盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液可被用作载体，特别是用于注射溶液。合适的药物载体在E.W.Martin,“Remington's Pharmaceutical Sciences”(MackPublishing Co.,Easton,PA)、Gennaro,A.R.,Remington:The Science and Practice ofPharmacy,(Lippincott,Williams and Wilkins)、Liberman等人,Eds.,PharmaceuticalDosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.、Kibbe等人,Eds.,Handbook ofPharmaceutical Excipients,American Pharmaceutical Association,Washington中有所描述。

本文所使用的术语“治疗”是指给患有某种疾病的患者带来好处的任何类型的治疗，包括改善患者病情(例如，在一种或多种症状上)，延迟病情进展等。

如本文所使用的，术语“预防”是指对有患某种疾病风险的受试者进行预防性治疗，从而降低受试者患这种疾病的可能性。

如本文所用，术语“受试者”指的是动物，特别是哺乳动物，特别是人类。

一种化合物或药物组合物的“治疗有效量”是指能有效地预防、抑制、治疗或减轻某种特定的紊乱或疾病的症状的量。这里的疾病或紊乱的治疗可以指治愈、缓解和/或预防疾病或紊乱、其症状或对其的倾向性。

如本文所用，术语“治疗剂”是指一种化合物或生物分子，包括但不限于核酸、肽、蛋白质和抗体，可用于治疗某种病症、疾病或紊乱，或减轻该病症、疾病或紊乱的症状。

“载体”是一种基因元素，如质粒、粘粒、杆菌、噬菌体或病毒，另一种遗传序列或元素(DNA或RNA)可与之连接，以实现所连接序列或元素的复制和/或表达。载体可以是RNA或DNA，可以是单链或双链。“表达载体”是一种专门的载体，其含有基因或核酸序列以及在宿主细胞中表达所需的调节区(如启动子)。

术语“连接”或“可操作地连接”是指编码序列表达所需的调控序列被放置在核酸分子中相对于编码序列的适当位置，以实现编码序列的表达。这个定义有时也适用于表达载体或重组载体中编码序列和转录控制元件(如启动子、增强子和终止元件)的排列。

下面的例子描述了实施本发明的说明性方法，不意指以任何方式限制本发明的范围。

实施例

骨骼肌细胞，或肌纤维，使身体运动成为可能，并经常因剧烈活动、超负荷和偏心收缩而受损(McNeil等人,(2003)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.,19:697-731；Horn等人,(2018)Cellular Molecular Life Sci.,75(20):3751-70)。增加肌纤维脆性或阻碍修复的突变会导致肌肉退化和肌营养不良症(Wallace等人,(2009)Annu.Rev.Physiol.,71:37-57)。三好氏(Miyoshi)肌肉疾病(MM)和肢腰肌营养不良症2B(LGMD2B)是两种这样的常染色体隐性肌营养不良症，在成年早期表现出来，导致进行性骨骼肌无力和消瘦(Aoki,M.,In:Adam等人,eds.,GeneReviews,Seattle,WA，1993)。这些疾病(统称为dysferlinopathy)是由DYSF基因中的突变引起的，该基因编码一种大的(237kDa)肌肉膜蛋白-dysferlin(Liu等人,(1998)Nat.Genet.,20(1):31-6；Bashir等人,(1998)Nat.Genet.,20(1):37-42)。甚至在明显的肌肉变性之前，dysferlinopathy患者的肌纤维就表现出质膜(肌膜)缺陷，包括膜撕裂、挤压、肉膜下堆积囊泡和空泡，以及基底层的增厚(Selcen等人,(2001)Neurology 56(11):1472-81)。缺少肌层损伤修复是这些早期异常的原因之一(Selcen等人,(2001)Neurology 56(11):1472-81；Cenacchi等人,(2005)J.Clin.Pathol.,58(2):190-5)。肌纤维肉膜的损伤通过一个复杂的多步骤过程进行修复，该过程由损伤触发的细胞外钙流入激活，而细胞外钙流入会受到dysferlin缺失的影响(Bansal等人,(2003)Nature 423(6936):168-72；Defour等人,(2014)Cell Death Dis.,5:e1306)。肌纤维修复失败或不足会激活慢性炎症反应，并导致肌肉退化—dysferlinopathy的一个明显特征(Nagaraju等人,(2008)Am.J.Pathol.,172(3):774-85；Gallardo等人,(2001)Neurology 57(11):2136-8；Hogarth等人,(2019)Nature Comm.,10(1):2430)。

质膜损伤的修复涉及钙触发的信号传递和囊泡的融合与裂变，这是由包括突触结合蛋白在内的钙结合蛋白促进的(Bansal等人,(2003)Nature423(6936):168-72；Sonder等人,(2019)Sci.Rep.,9(1):6726；Horn等人,(2019)Curr.Top.Membr.,84:67-98；Horn等人,(2017)Sci.Signal.,10(495):eaaj1978；Sreetama等人,(2016)Cell Death Differ.,23(4):596-607；Scheffer等人,(2014)Nat.Commun.,5:5646；Jaiswal等人,(2014)Nat.Commun.,5:3795；Bittel等人,(2019)Front.Phys.,10:828；Jaiswal等人,(2002)J.Cell Biol.,159(4):625-35；Jaiswal等人,(2004)PLoS Biol.,2(8):e233)。与突触结合蛋白类似，dysferlin是C2结构域蛋白家族的成员，该家族包括以钙依赖的方式结合带负电荷的膜磷脂的蛋白(Rizo等人,(1998)J.Biol.Chem.,273(26):15879-82；Lek等人,(2012)Traffic 13(2):185-94)。Dysferlin通过将溶酶体拴在质膜上，促进溶酶体在膜损伤后立即流出细胞，从而介导了肌纤维膜的修复(Defour等人,(2014)Cell Death Dis.)。快速的溶酶体外渗使溶酶体酶ASM在肌纤维膜损伤后几秒钟内分泌出来—这是修复所需的过程(Tam等人,(2010)J.Cell Biol.,189(6):1027-38；Michailowsky等人,(2019)Skelet.Muscle 9(1):1)。缺乏dysferlin延迟和减少损伤触发的溶酶体外渗，从而减缓和减少细胞损伤后的ASM分泌(Defour等人,(2014)Cell Death Dis.,5:e1306)。因此，受伤的LGMD2B细胞中ASM分泌的减少或尼曼-皮克病A型(NPDA)细胞中ASM生产的缺乏，损害了肌纤维肌膜的修复(Defour等人,(2014)Cell Death Dis.,5:e1306；Michailowsky等人,(2019)Skelet.Muscle 9(1):1)。这些缺陷使细胞外ASM补充成为改善LGMD2B和NPDA患者肌纤维修复的潜在疗法。

在分泌到细胞外介质时，ASM将质膜内的鞘磷脂水解为神经酰胺，这被认为是通过细胞外囊泡(ECV)脱落和内吞作用来清除质膜的受损部分(Tam等人,(2010)J.Cell Biol.,189(6):1027-38；Bianco等人,(2009)EMBO J.,28(8):1043-54)。已发现被形成孔洞的毒素伤害的质膜会发生ECV脱落和小窝内吞作用(Keyel等人,(2011)J.Cell Sci,124(Pt 14):2414-23；Corrotte等人,(2013)Elife2:e00926),这些毒素还与糖基磷脂酰肌醇(GPI)—由网格蛋白-独立载体(CLIC)形成的内体的标志物—共同定位(Idone等人,(2008)J.Cell.Biol.,180(5):905-14；Mayor等人,(2014)Cold Spring Harb.Perspect.Biol.,6(6):a016758)。然而，ASM如何帮助修复质膜的生理(病灶或机械)损伤的细节还没有解决。了解ASM在修复生理性膜损伤中的作用，对于为肌肉、肺和其他涉及细胞膜损伤的疾病的治疗提供信息非常重要。

旨在重新表达骨骼肌的dysferlin基因的针对LGMD2B的临床前基因治疗方法，具有喜忧参半，但总体上是积极的治疗前景(Potter等人,(2018)Hum.Gene Ther.,29(7):749-62；Pryadkina等人,(2015)Mol.Ther.Methods Clin.Dev.,2:15009；Lostal等人,(2012)PLoS One,7(5):e38036)。然而，这些疗法在临床上的进展需要克服与大基因如dysferlin的有效包装和肌肉输送有关的障碍(Bulaklak等人,(2017)Curr.Opin.Pharmacol.,34:56-63)。基于药物的疗法提供了一种选择，但目前还没有批准的药物来解决修复缺陷，或其他疾病病因的dysferlinopathy。然而，临床前研究表明，稳定肌纤维膜的药物可以增强肌纤维的修复，改善障碍性肌肉功能(Sreetama等人,(2018)Molecular Therapy,26(9):2231-42；Gushchina等人,(2017)Mol.Ther.,25(10):2360-71)。细胞外ASM改善了dysferlinopathy肌纤维的修复(Defour等人,(2014)Cell DeathDis.,5:e1306)。静脉注射hASM递送已显示出疗效(Miranda等人,(2000)FASEB J.,14(13):1988-95；Murray等人,(2015)Mol.Genet.Metab.,114(2):217-25；Samaranch等人,(2019)Sci.Transl.Med.,11(506):eaat3738；Dodge等人,(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.,102(49):17822-7)，以及hASM治疗NPDA的临床安全性(Wasserstein等人,(2019)Mol.Genet.Metab.,126(2):98-105；Wasserstein等人,(2018)J.Inherit.Metab.Dis.，41(5)：829-38)。然而，这种方法在治疗LGMD2B，或改善NPDA的骨骼肌缺陷方面的效用还没有得到测试。在此，我们利用患者的肌肉细胞和小鼠模型，对hASM蛋白和基于AAV的非肌肉靶向基因治疗方法的临床前疗效进行了研究，以改善LGMD2B的肌浆膜修复。同时，还利用LGMD2B小鼠模型考察了使用hASM-AAV基因疗法对肌纤维修复、肌肉组织病理学和肌肉功能的慢性改善。

材料和方法

动物

B6.A-Dysfprmd/GeneJ(B6A/J)小鼠购自杰克逊实验室(Bar Harbor,ME)，并在儿童研究所(CRI)的动物房内饲养。所有涉及使用小鼠的实验都得到了CRI动物护理和使用委员会的批准。动物被安置在无菌设施中，控制12小时的光照/黑暗周期，自由获取食物和水。在实验中使用动物之前，对其进行基因分型。

细胞培养和处理

免疫对照(健康捐赠者)和LGMD2B患者(具有同源的c.4882G突变，导致失去任何可检测到的dysferlin蛋白)的肌细胞如所描述的使用(Defour等人,(2014)Cell DeathDis.,5:e1306)。肌细胞在人类肌细胞培养基套件(Promocell)中培养，补充10％的FBS，放在0.4％的明胶涂层盘中，并在37℃和5％的CO₂下维持。HepG2和C2C12成肌细胞系在补充有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的高葡萄糖DMEM中培养。对于激光损伤，细胞被安置在纤维蛋白涂层的玻璃盖玻片上。细胞亦或就这样受损，亦或在细胞成像介质(CIM：HBSS加10mMHEPES、1mM氯化钙，pH7.4)中与不同浓度的纯化hASM(R&D系统，Minneapolis，MN)或在用hASM-AAV或对照(eGFP-AAV)病毒颗粒转导的HepG2细胞的培养上清液中预孵化20分钟。细胞在CIM中被激光损伤，该CIM含有1μg/μl细胞防渗染料FM1-43(N-(3-三乙基氨丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)二溴化吡啶)和与培养期相同浓度的hASM和细胞上清液。损伤和随后的成像是在37℃下在阶段性顶部ZILCS孵化器(Tokai Hit Co.,Fujinomiya-shi,Japan)中进行。用脉冲激光(Ablate！^TM,3i Intelligent Imaging Innovations,Inc.Denver,CO)辐照1-5μm²面积的质膜<10ms，用装有488nm二极管激光(Cobolt,Sweden)的IX81奥林巴斯显微镜(Olympus America,Center Valley,PA)上的60X/1.45NA油镜以2秒的间隔对细胞进行成像。对FM染料强度(F/F₀，其中F₀是原始强度)进行量化，并通过阻止FM进入导致的FM染料荧光增加来表示修复，如所描述的那样(Defour等人,(2014)J.Vis.Exp.，2014(85)：e51106)。

内吞试验

对大量内吞作用，用AF488结合的小麦胚芽凝集素(WGA)(3ug/mL)在37℃下标记肌细胞(约70％融合)的细胞膜2分钟。用CIM清洗多余的WGA后，细胞不作处理或用hASM(CIM中6U/L)处理，在IX81奥林巴斯显微镜(Olympus America,Center Valley，PA)上用40X/1.4NA或60X/1.45NA油镜进行成像，同时采用宽视场和共聚焦模式。允许WGA内吞，并在不同的时间点向成像室注入溴酚蓝(BPB)(最终浓度为4mM)以淬灭细胞表面的WGA。为了评估膜内吞的程度，在背景校正后，将每个细胞淬灭后的平均荧光除以其初始淬灭前的荧光，并将其归一化为立即淬灭后(0分钟内吞)评估的内化膜的分数。

对于转染了mRFP标记的小窝-1的细胞，按照描述进行成像(Tagawa等人,(2005)J.Cell Biol.,170(5):769-79)。如上所述，使用在膜-盖玻片界面配备560nm的共聚焦二极管激光器(Cobolt,Sweden)的IX81奥林巴斯显微镜(Olympus America,Center Valley,PA)，用60X/1.45NA油镜在CIM中对细胞进行成像。以1Hz的速度对细胞成像，如图所示。为了量化小窝蛋白的流动性，在成像开始时，在每个细胞中标记50个单独的小窝蛋白点/囊泡。每个囊泡随后被手动追踪。如果一个囊泡横向移动的距离>1.5μm，或轴向移动使其在成像平面上消失>10秒，或两者兼而有之，则视为可移动。量化在2分钟内囊泡的分数(相对于每个细胞50个)。

为了进行CLIC/GEEC内吞试验，细胞被转染了带有GFP(GPI-GFP)标签的糖基磷脂酰肌醇(Nichols等人,(2001)J.Cell Biol.,153(3):529-41)。转染的细胞以1帧/分钟的速度通过细胞体中部在Z平面上进行成像，持续20分钟。根据需要，在第2次成像后将hASM添加到室中。通过标记细胞膜监测GPI-GFP膜的荧光，并对光漂白进行校正。通过曲线拟合横跨感兴趣的时间点的膜荧光动力学轨迹获得内吞效率，并以此来计算该特定时间点的膜荧光损失率。使用SlideBook^TM6.0(Intelligent Imaging Innovations,Inc,Denver CO)对图像进行量化。

膜脱落试验

将C2C12细胞(

50％融合)用FITC-PEG-胆固醇(5μM；PEG-2000，Nanocs Inc.，PG2-CSFC-2k)在CIM中37℃下标记30分钟。洗掉多余的标签后，立即在CIM中用装有488nm二极管激光器的IX81显微镜上的60X/1.45NA油镜同时对细胞进行进行共聚焦和宽视场显微镜成像。以0.2Hz的速度对细胞进行成像，持续2分钟。根据需要，在延时采集开始前约20-30秒加入hASM。图像被收集在位于细胞-盖玻片界面的Z平面上，以监测囊泡在周围盖玻片区域的脱落。使用Metamorph 7.0(Molecular Devices,CA)对细胞附近盖玻片表面上5,000μm²区域内的囊泡进行量化(2分钟内脱落的囊泡之和)，并将其与采集开始时存在的囊泡进行归一化。为了评估细胞荧光的损失，使用SlideBook^TM 6.0软件对宽视场图像进行了光漂白校正，然后分析2分钟内的荧光损失。

Western印迹法和免疫染色法

将HepG2细胞裂解液在4-12％梯度聚丙烯酰胺凝胶中解析，转移到硝酸纤维素膜上，并用指定的抗体(ASM(Abcam，Cambridge，MA)和β-肌动蛋白(Abcam，Cambridge，MA))对其进行检测。一级抗体之后采用结合适当的HRP的二级抗体(Sigma-Aldrich)和化学发光western印迹底物(GE Healthcare，Pittsburgh，PA)，并在Chemidoc^TM MP系统(BioRadLaboratories，CA)上处理。

AAV载体的生成和传递

为了生产AAV8/DC190-hASM载体，构建了一个携带人类ASM cDNA的前病毒质粒(Barbon等人,(2005)Mol.Ther.,12(3):431-40)。简而言之，人类酸性鞘磷脂酶cDNA(NM_000543)的表达是由肝脏限制性启动子/增强子DC190驱动的(Ziegler等人,(2004)Mol.Ther.,9:231-240；人血清白蛋白启动子与人凝血酶增强子的两个拷贝相连)。该表达盒还包含一个杂合内含子。多腺苷酸化信号之后是人α1-抗胰蛋白酶内含子的一个片段，使重组病毒DNA的大小达到约4.5Kb，以达到最佳包装。质粒DNA使用Qiagen

质粒纯化试剂盒(Germantown，MD)进行纯化。基于AAV2的前病毒质粒被包装到AAV血清型8的外壳上。重组AAV病毒通过三重质粒转染，然后由马萨诸塞大学医学院载体核心基因治疗中心(Worcester，MA)进行氯化铯密度梯度纯化而产生。AAV载体的基因组拷贝滴度用实时

PCR测定(ABI Prism 7700；Applied Biosystems，Foster City，CA)，其引物对牛生长激素多腺苷酸化信号序列具有特异性。AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH(批号CS0273)被用作对照AAV载体(宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的载体核心)。病毒颗粒在-80℃下以悬浮液的形式保存在含5％的甘油缓冲液的无菌PBS中。病毒颗粒悬浮液被解冻、稀释并通过静脉注射以每只小鼠3.4x1011颗粒或1.1x1013 vg/kg的病毒剂量施用。用于本研究的小鼠来自两窝独立的BLA/J小鼠，由同一天出生的雌雄小鼠混合组成。每只幼崽都由耳标ID识别，并根据编码的ID号码从每窝小鼠中随机抽取，以确保：1)两窝小鼠混合分配到每个治疗组；2)每个治疗组都有雄性和雌性小鼠。在hASM-AAV组，5只小鼠被注射了hASM-AAV。对照组有相同数量的小鼠被注射对照AAVs。注射后，实验小鼠在家庭笼子里饲养3个月，并进行具体的实验。

ASM测量

将肝脏和股四头肌在液氮冷却的异戊烷中速冻(并储存在-80℃)，同时将血清—在注射后的基线、1周、4周和12周通过眼眶后出血收集—储存在-80℃。为了进行检测，组织样本在冰上用微管匀浆器在RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich，St.Louis MO)+蛋白酶抑制剂混合物(Fisher Scientific，Waltham，MA)中进行研磨和匀浆。使用BCA蛋白测定法和酶标仪评估裂解液的总蛋白浓度。所有样品使用等量的总裂解物蛋白(肝脏为4.1μg，股四头肌为25μg)和血清量(5μL)。由于ASM蛋白会发生翻译后的修饰，从而影响酶的活性，因此使用AmplexTMRed鞘磷脂酶检测试剂盒(Invitrogen)来测量hASM的活性，而不是蛋白量。所有样品均进行三次重复。因此，活性表示为每克肝脏和肌肉组织的水解活性(U)单位(肝脏/肌肉ASM活性)，以及每升血清的U。活性为每个处理条件下的5个样品的平均，并表示为平均值+SEM。

血清丙氨酸转氨酶(ALT)浓度

根据制造商的说明，使用比色法(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)对上述AAV注射后每个时间点的血清(5μL)进行ALT浓度检测，ALT是肝脏损伤/疾病的一个标志物。所有样品进行三次重复，ALT浓度为每个处理条件和每个时间点的所有样品的平均，并以平均值±SEM表示。

hASM-AAV介导的体外hASM生产和量化

在无抗生素的DMEM中用4.5x106个Ad5颗粒(感染倍数(MOI)为45pts/cell)感染96孔盘中的Hep G2细胞2小时，其密度为～1x10⁵细胞/孔。用AAV2/8DC190-hASM或对照载体以1x1010个基因组拷贝/mL(MOI为104)在100μL的体积中感染细胞1小时。1小时后，加入100μL的完全DMEM。第5天，收集细胞培养基并立即用于后续实验或储存在-80℃下。在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中刮取细胞，用含有蛋白酶抑制剂混合物(Fisher Scientific，Waltham，MA)的RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich)进行裂解。培养上清和细胞裂解液被用于使用Amplex^TM RedSphingomyelinase测定试剂盒(Invitrogen)对hASM活性测定进行荧光测定，并用于Western印迹。使用

多模式读板仪(PerkinElmer)分析20分钟内的ASM动力学，荧光发射检测波长为585nm。所有样品进行三次重复评估，并生成标准曲线。使用已知的活性和细菌鞘磷脂酶阳性对照(10U/L)的荧光发射和这里显示的生成的标准曲线，将hASM的ASM活性从荧光发射值转为活性单位。hASM蛋白具有每克蛋白0.1单位的ASM活性单位转化率。

hASM在体外的细胞毒性

健康的供体肌细胞在0.4％明胶包裹的51cm培养皿中培养，并在补充10％FBS的人类肌细胞培养基套件(Promocell)中生长至60％融合，并在37℃和5％CO₂下保持。达到60％融合后，在生长介质中补充滴定浓度的hASM蛋白(对照/PBS，8、80、800U/L)，持续24小时。随后，收集细胞并通过台盼蓝试验评估细胞活力/死亡，细胞死亡以总细胞的百分比表示。细胞死亡实验是以每个hASM剂量的3个生物学重复进行的。

组织学和免疫组织化学

使用CM3050S冷冻仪(Leica Biosystems，Buffalo Grove，IL)制备8-μm厚的股四头肌和肝脏的横向冷冻切片，并储存在-20℃下以备以后染色(每组n＝5个)。解冻后，肌肉切片进行H&E、层粘连蛋白(1:100，抗层粘连蛋白-2α-链，大鼠单克隆，Sigma-Aldrich)、IgM(1:100，Invitrogen)、脂滴包被蛋白(1:250，Sigma)、Masson三色染色(三色染色套件，Abcam，Cambridge，MA)处理，而肝脏切片仅进行H&E处理。用VS120幻灯片扫描显微镜(Olympus America，MA)以40倍放大率拍摄图像，并用CellSens软件进行量化。对于免疫染色，肌肉切片在5％BSA中阻断1小时(层粘连蛋白染色)或1％BSA、10％山羊血清和0.1％吐温(用于脂滴包被蛋白)。使用Alexa

488或594(1:500)二级抗体并与WGA和DAPI共染色。

为了量化肌肉炎症，由>9个核组成的纤维外核团被记为炎症病灶，并从H&E染色的整个股四头肌截面中随机选择10个区域进行量化，并以每mm²截面面积表示。这些切片也被用来量化中央有核纤维，表示为每个肌肉切片中计数的总肌纤维的百分比。使用层粘连蛋白和DAPI共染色的切片和CellProfiler肌肉分析器管道独立验证中心有核肌纤维计数，如文献所述(Lau等人,(2018)Skelet.Muscle 8(1):32.)。同样的管道被用来评估每组3只小鼠的肌纤维横截面积，每组共3000个纤维，并以μm²为单位进行测量。用Masson三色染色法量化肌肉纤维化/胶原蛋白的积累。从整个肌肉图像中每个股四头肌横截面取5张代表图像，使用ImageJ评估被染色的胶原组织(染成蓝色)占总肌肉面积的百分比，如文献所述(Corbiere等人,(2018)J.Funct.Morphol.Kinesiol.，3(1):1)。将选定的图像被分成红色、蓝色和绿色通道，随后对蓝色通道图像进行阈值处理，以量化胶原蛋白染色的纤维化组织。

为了量化体内受伤的肌纤维，从整个股四头肌横截面上随机选择的区域，对IgM阳性的纤维进行评分，得出小麦胚芽凝集素(WGA)标记的纤维总数。然后以1mm²的肌肉横截面面积上IgM阳性纤维的数量表示。为了量化脂肪的沉积，使用

软件测量了脂滴包被蛋白染色的股四头肌切片，并以脂滴包被蛋白阳性面积的百分比表示。对于肝脏组织病理学评分，H&E染色的切片按1-5分(分数越高表示病理越差)对肝细胞坏死、凋亡、裂解、变性、损失(局限或弥漫)、空泡、肥大、纤维化和炎症等特征进行评分。每个肝脏样本的得分是每个肝脏切片的5个代表性区域的平均得分。

握力测量

前肢和后肢握力测量(GSM)使用握力计(Columbus Instruments，Columbus，OH)进行评估，如描述的那样(Spurney等人,(2009)Muscle Nerve39(5):591-602)。在收集数据之前，动物已经适应3天。然后连续5天收集前肢和后肢的握力数据，并以5天的平均握力/公斤体重表示，如所述(Sreetama等人,(2018)Molecular Therapy 26(9):2231-42)。

体外肌纤维损伤

对于收缩诱导的肉膜损伤，从野生型BL6小鼠或用hASM-AAV或对照-AAV处理的B6A/J小鼠中提取EDL肌肉，并置于林格氏溶液(137mM NaCl，24mM NaHCO₃，11mM葡萄糖，5mMKCl，2mM CaCl₂，1mM MgSO₄，1mM NaH₂PO₄，和0.025mM氯化钾)，用95％的O₂-5％的CO₂鼓气，以保持pH值为7.4。远端肌腱被牢牢地连接到一个固定的底板上，近端肌腱用6-0丝线缝合连接到一个伺服电机(800A体外肌肉仪，Aurora Scientific)的臂。垂直排列的EDL肌肉的两侧是两个不锈钢板电极。使用单个0.2-mm的方形模拟脉冲，肌肉被调整到最佳的肌肉长度以产生力量。在最佳长度下，以250Hz的频率进行持续时间为300ms的等长四肢收缩，并间隔2分钟的休息时间，确定最大的力量。收缩引起的肉膜损伤是由伴随着10％应变的九个连续的拉长收缩(LCs)诱发的，速度为每秒两个纤维长度。每次收缩都有1分钟的休息间隔。延长收缩引起的力量损失以占第一次收缩的百分比表示。在低速收缩试验结束时，肌肉被修剪掉肌腱、印迹、称重，并在室温下用0.2％的PO溶液培养30分钟。洗掉多余的染料后，将组织在液氮冷却的异戊烷中速冻，然后切片并对PO标记的纤维进行成像，未标记的组织则用于确定背景荧光。PO阳性肌纤维的数量表示为相对于肌肉横截面中总肌纤维的百分比，切片边缘的纤维被排除在分析之外。对于病灶激光损伤测定，将完整的肱二头肌安装在预热的tyrodes缓冲液(119mM NaCL，5mM KCL，25mM Hepes缓冲液，2mM CaCl₂，2mM MgCl₂，葡萄糖-6g/L，pH 7.4)中，用FM 1-43染料(1-2mg/mL)，用40X/1.4NA the IX81 Olympus显微镜成像，如上述细胞激光损伤所述。确定修复动力学和成功的肌纤维修复，如文献对细胞损伤试验所述(Horn等人,(2017)Sci Signal,10(495):eaaj1978)。

研究严谨性

本研究体内部分的先验样本量确定来自于两项评估膜脂稳定药物(细菌鞘磷脂酶和Vamorolone)促进修复效果的研究(Defour等人,(2014)Cell Death Dis.,5:e1306；Sreetama等人,(2018)Molecular Therapy 26(9):2231-42)。对于激光烧蚀损伤的修复能力评估，从Vamorolone试验中进行了功率分析，发现这种膜脂质修饰药物的效应大小为0.725。在双尾α值设定为0.05，功率为80％的情况下，这决定了每个治疗组需要有5只小鼠才能达到统计学显著性。同样，细菌鞘磷脂酶改善肌纤维膜修复能力的效应大小为0.6，假设双尾α值为0.05，功率为80％，每组需要使用6只小鼠来评估对修复能力的显著性影响。因此，当从研究改性LGMD2B(BLA/J小鼠)细胞膜脂质的化合物或药物(如hASM)的效果的研究中收集这些数据，每组需要5只小鼠用于主要终点测量(膜修复能力)，每个治疗组需要4-7只小鼠来发现其他测试终点统计学上的显著性差异。

所有的体内测量(激光损伤测定、所有的肌肉和肝脏组织学测量、ASM和ALT活性、偏心力测定)都是由研究小组的一名盲法成员获得的。盲法是通过使用一个包含小鼠耳标号码和治疗组的非识别代码表来完成的。修复试验的编码是为了让评分者/数据分析者对条件不了解。涉及添加重组hASM的试验由一个非盲法的团队成员进行，但评分者对体外ASM活性试验的样品身份是不了解的。

统计学

对于细胞损伤和肱二头肌纤维修复动力学(FM-染料强度动力学)、偏心力减退痕迹和CLIC-GEEC内吞动力学，所有生成的曲线都通过混合模型方差分析与分析处理条件和时间或试验的主效应之间的相互作用效果进行比较。在有显著交互作用的情况下，通过Holm-Sidak检验评估每个时间点的FM染料荧光强度/膜荧光/偏心力的组间差异，并且由于违反球性进行Huynh-Feldt校正。单向方差分析用于确定损伤后未能修复的细胞和/或肌纤维数量的差异，以及一般膜内吞作用的测量。重复测量方差分析被用来评估12周治疗期间体重变化的差异，以及不同条件下CLIC/GEEC内吞率的差异。使用独立样本t检验计算对照组-AAV和hASM处理的小鼠在以下方面的比较：肝脏ASM的产生、血清ASM活性、血清ALT浓度、受伤后修复的纤维比例、组织学测量(IgM+比例、Mason三色染色的纤维化面积、炎症病灶、中心核、脂滴包被蛋白+比例、普施安橙+比例和肌纤维面积)，以及肢体力量测量。同样，独立样本t检验用于计算转染的HepG2细胞(细胞上清液和裂解液)的ASM活性差异，以及C2C12小窝蛋白内吞移动部分和膜脱落的测量(未处理与hASM-处理)。对于所有的统计分析，α水平被设定为p<0.05。

结果

hASM恢复了LGMD2B患者的细胞修复，与囊泡脱落和小窝内吞作用无关

为了测试hASM对膜修复的影响，用纯化的人ASM(hASM)蛋白处理来自LGMD2B患者的肌细胞。患者细胞接触纯化的hASM后，其质膜修复有剂量依赖性的改善(图1A-1C)。纯化的hASM，在3U/L或4U/L的浓度下，对改善患者肌细胞的修复没有效果(图1A、1B)。然而，用4U/L以上的纯化hASM剂量处理患者细胞可改善细胞膜修复，减少FM染料进入受伤细胞(图1A、1B)。hASM对患者细胞膜修复的影响出现了明显的剂量反应，如膜修复在5U/L的hASM剂量时得到改善，而在6U/L或以上的hASM浓度时达到高峰(图1B、1C)。因此，虽然5U/L的hASM减少了受伤后无法修复的细胞数量，但在6U/L及以上的hASM剂量时获得最大的改善(图1C)。

由于小窝内吞作用和膜脱落参与了孔洞形成的毒素对膜损伤的修复，检测了hASM对这些途径的影响。通过对表达小窝蛋白1-RFP的肌细胞的小窝动态进行活体成像来监测小窝内吞作用(图2A)。通过共聚焦显微镜对单个与质膜相关的小窝成像显示，在2分钟的时间内，质膜上超过75％的小窝从其起始位置移动，用6U/L纯化的hASM处理并不影响这部分移动的小窝(78％±1.8对比80％±1.4；图2A、2B)。接下来，我们研究了这种剂量的hASM是否会引发质膜脱落。由于ECV富含胆固醇(Bittel等人,(2019)Front.Physiology 10:828)，用FITC标记的PEG胆固醇对细胞膜进行标记，在2分钟内对囊泡脱落进行量化(图2C)。未处理的和6U/L hASM处理的细胞脱落的ECV数量相似—未处理的：158±24对比hASM处理的：147±15(图2D)，并导致在hASM处理的和未处理的细胞中失去近似数量的细胞相关胆固醇标记(图2E)。这些结果确定了在患者细胞中改善膜修复的hASM剂量并没有增强小窝内吞或ECV的脱落，暗示了hASM改善细胞膜修复的替代膜贩运机制的存在。

hASM处理增强了大量质膜内吞作用

由于细胞的大量内吞作用是由独立凝集素载体(CLIC)支持的，而CLIC促进了dysferlin和成孔毒素的内吞作用(Idone等人,(2008)J.Cell.Biol.,180(5):905-14；Hernandez-Deviez等人,(2008)J.Biol.Chem.,283(10):6476-88)，检测了hASM处理对CLIC标记物糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定绿色荧光蛋白(GPI-GFP)的影响。使用C2C12肌细胞，观察到CLIC从质膜上的稳定内吞，用hASM处理后，这种内吞迅速增强(图2F-2H)。在未经处理的健康和LGMD2B患者肌细胞中观察到类似的CLIC内吞率(图2F、2I、2J)。与小鼠肌细胞中CLIC内吞率的增加相似(图2H)，hASM治疗患者肌细胞也增加了CLIC内吞率(图2I、2J)。

借助CLIC在体膜清除中的作用，通过使用凝集素小麦胚芽凝集素(WGA)来标记质膜并评估其在不同剂量的hASM下的内吞作用，检测了体膜内吞在修复中的作用。简而言之，用荧光WGA标记细胞膜，并在3分钟内通过在内吞期结束时使用溴酚蓝(BPB)淬灭细胞表面的WGA荧光来监测膜的内吞。细胞内的点状荧光没有被BPB淬灭，标志着内化的WGA定位在内体中。内化的WGA荧光是相对于淬灭前的基线标记表示的。未处理的小鼠肌细胞和用3U/LhASM处理的小鼠肌细胞内吞类似数量的质膜相关WGA，但用6U/L hASM处理的小鼠肌细胞内吞WGA的速率明显增加(未处理：16.2％+1.6，3U/L hASM：15.5％+0.9，6U/L hASM：23％+1.6，WGA内化)(图3A、3B)。

根据LGMD2B患者肌细胞ASM分泌减少的研究结果(Defour等人,(2014)Cell DeathDis.,5:e1306)，这些细胞内吞WGA的能力减少了2倍(11％+1患者对比21％+1.6健康的)(图3C、3D)。用改善LGMD2B细胞修复的hASM剂量(6U/L)处理，也能增强这些细胞的WGA内吞能力，而低剂量(3U/L)则不能做到这一点(图3C、3D)。用6U/L的hASM处理健康的肌肉细胞也增加了其对WGA的内吞作用(未处理：20.9％+1.6，6U/L的hASM：29.7％+1.4)(图3D)，而没有引起任何细胞毒性(图7)。这些发现表明，hASM介导的修复改善安全地增强了大量的质膜内吞作用。

hASM-AAV为恢复LGMD2B的膜修复提供了一种基因方法

虽然上述研究证明了hASM治疗的实用性，可以安全地解决LGMD2B患者细胞中的大量内吞缺陷，但为了发挥其治疗作用，该蛋白需要频繁施用以维持体内的治疗水平。为了克服这一挑战，探索了另一种方法，即通过基因表达分泌的hASM来维持血清中这种蛋白的稳定治疗水平。在肝脏特异性启动子的控制下，使用了一种腺相关病毒(AAV)载体来表达hASM蛋白的分泌形式。通过用hASM-AAV感染人类肝脏细胞系HepG2在体内评估AAV载体，该载体在肝脏特异性启动子的控制下产生分泌型hASM(Barbon等人,(2005)Mol.Ther.,12(3):431-40)。与对照载体相比，感染了hASM-AAV的HepG2细胞分泌了6.4U/L的hASM(图4A-4C)。由于这高于改善膜修复所需的治疗剂量(6U/L)，所以测试了人类肝脏细胞分泌的hASM改善受伤的LGMD2B患者肌肉细胞的修复能力。与用对照-AAV表达的HepG2细胞的培养上清液处理的患者肌细胞相比，用hASM表达的HepG2细胞的上清液处理的患者肌细胞修复效率高，其动力学与健康供体肌细胞类似(图4D、4E)。这些发现确立了肝脏靶向hASM-AAV基因疗法在体外改善LGMD2B患者肌肉细胞的质膜修复的功效。

肝脏靶向hASM-AAV可改善肌纤维膜修复

为了测试hASM在改善LGMD2B肌纤维膜修复方面的体内疗效，采用了LGMD2B的小鼠模型(B6A/J)。这些dysferlin缺乏的小鼠在10周龄时用肝脏特异性hASM-AAV或对照-AAV进行尾静脉注射治疗一次。在单剂量hASM-AAV的12周后，这些小鼠在22周龄时被评估。到15-24周龄时，B6A/J小鼠显示出肌肉损伤、肌纤维修复缺陷和运动障碍的迹象，并继续逐步恶化(Defour等人,(2014)Cell Death Dis.,5:e1306；Hogarth等人,(2019)NatureCommunications 10(1):2430；Nagy等人,(2017)Physiol Rep.,5(6):e13173)。在用hASM-AAV处理的小鼠中，与用对照-AAV治疗的小鼠相比，肝脏hASM活性高4倍，血清ASM活性高2倍(600+54.7U/g对比171.6+2.4)(图5A)。血清中的ASM活性在注射hASM-AAV一周内增加，用hASM-AAV治疗的B6A/J小鼠血清和肌肉中的ASM水平较高，甚至在治疗12周后仍保持不变(图5B、5J、7)。这种增加的hASM对动物的整体健康或肝脏没有不利影响，这是由动物在治疗12周内的生长情况、肝脏组织病理学和血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平评估的(图5B、5C、7)。鉴于hASM在体外的肌肉细胞修复方面有明显的改善，评估了体内hASM的增加是否能改善肌纤维膜的修复，并减少肌纤维的损伤和dysferlin-缺乏肌纤维的退化。使用肌纤维内IgM的存在作为肌纤维损伤的指标，hASM-AAV处理导致受损肌纤维的程度减少了3倍(图5D、5E)。为了直接评估体内hASM处理对肌纤维修复的益处，采用了间接体外激光损伤试验来监测用对照和hASM-AAV处理的小鼠完整的肱二头肌的肌纤维修复。使用这种方法，与对照-AAV处理的小鼠相比，观察到hASM-AAV处理的小鼠的肌纤维修复能力有所提高(图5E、5F、5G)。由于激光损伤导致了可控的局灶性损伤，因此我们对通过机械活动损伤的肌纤维的修复能力进行了检测。在用hASM-AAV或对照AAV处理的B6A/J小鼠以及年龄匹配的WT小鼠的完整EDL肌肉中评估了这种机械损伤的修复。肌肉通过10次10％的偏心收缩受伤，然后用膜不透性的重要染料丙种球蛋白(PO)标记受伤的肌纤维。机械性损伤导致PO标记的受伤肌纤维未能修复，在hASM-AAV处理的小鼠中，这种情况减少了2倍以上(图5E、5H)。hASM-AAV治疗小鼠肌纤维修复的改善与机械损伤诱导的肌肉力量损失的减弱相关，达到了与健康(WT)肌肉相同的水平(图5I)。这些研究结果表明，有dysferlinopathy的肌肉长期在体内暴露于偏高的hASM中，可恢复体内自发损伤后的肌纤维修复能力，以及局灶性或体外机械损伤。

hASM-AV治疗LGMD2B的临床前益处

有了上述hASM-AAV疗法对治疗dysferlin缺乏引起的肌纤维修复不良和过度肌纤维坏死的有益效果，接下来要检测这种疗法是否也能改善体内的肌肉组织病理学和功能。股四头肌是主要的运动肌群，经常受到dysferlin缺乏的影响(Ho等人,(2004)Hum.Mol.Genet.,13(18):1999-2010)。因此，对这些肌肉的组织病理学进行了检查，显示肌肉炎症减少了约80％(图6A、6B)。鉴于慢性骨骼肌炎症具有破坏性，并导致需要更多的再生，因此检查了hASM-AAV处理的肌肉中炎症的减少是否也降低了再生能力。对H&E标记的肌肉切片中具有中心核的肌纤维(再生的标志物)的比例进行量化，显示hASM-AAV处理使肌纤维再生的需要降低了2倍(对照-AAV：40.5％+5.5，rhASM-AAV：19.3％+4.7)(图6C)，这被中心核的肌纤维的自动计数证实(图6A)。此外，对大约3000根肌纤维的横截面积进行量化，显示在hASM-AAV处理的情况下，肌纤维比对照组AAV大45％(图6A、6D)。此外，hASM-AAV处理的肌肉还显示出肌肉纤维化(Masso三色染色)(图6A、6E)以及肌纤维的脂肪生成损失(脂滴包被蛋白-1染色)(图6A、6F)减少了近3倍。最后，我们研究了hASM-AAV治疗后，这些组织病理学的改善是否导致了肌肉力量的改善。Dysferlin缺失会导致后肢肌肉更大的力量损失(Defour等人,(2017)Human Mol.Genetics 26(11):1979-91)，而改进的膜修复可以解决这一缺陷(Sreetama等人,(2018)Molecular Therapy26(9):2231-42)。因此，测量了对照和hASM-AAV处理的小鼠的前肢和后肢肌肉握力(Sreetama等人,(2018)Molecular Therapy26(9):2231-42)。结果发现，与对照-AAV处理组群相比，虽然前肢握力没有明显改变，但hASM-AAV处理组群的后肢握力却明显改善(图6G、6H)。鉴于这些发现，很明显，单剂量的hASM-AAV处理可以延长LGMD2B的组织病理学和功能性的肌肉改善。

恢复dysferlin缺少下游的细胞缺陷是LGMD2B的一种治疗方法。为了补充正在进行的旨在恢复LGMD2B患者肌肉中大型dysferlin蛋白表达的基因治疗工作，这里的工作提供了一种替代方法。利用肝脏靶向表达一种比dysferlin小近四倍的蛋白质(ASM)，解决了dysferlin缺少下游的后果。这提供了与骨骼肌dysferlin恢复相当的临床前益处。Dysferlin使及时分泌ASM所需的溶酶体外分泌快速有效，以帮助受伤的肌肉细胞修复频繁的膜损伤(Defour等人,(2014)Cell Death Dis.,5:e1306)。受伤细胞释放的ASM不足是LGMD2B和NPDA患者的共同缺陷(Defour等人,(2014)Cell Death Dis.,5:e1306；Michailowsky等人,(2019)Skelet.Muscle.9(1):1)。然而，发现与NPDA不同，dysferlin缺乏的肌肉并不缺少ASM表达(图5J)。令人惊讶的是，细胞外hASM的增加改善了LGMD2B小鼠模型的肌肉健康，不受理论约束的，通过增强CLIC介导的内吞作用改善质膜修复(图2、3)。由于CLIC促进了dysferlin的内吞作用(Hernandez-Deviez等人,(2008)J.Biol.Chem.,283(10):6476-88)，并与结合在质膜上的形成孔的毒素一起定位(Idone等人,(2008)J.Cell.Biol.,180(5):905-14)，CLIC的内吞作用与质膜修复有着错综复杂的联系，正如这里所证明的—ASM介导的修复(Corrotte等人,(2013)Elife 2:e00926)。

hASM的外源性施用对人类来说是安全的，并且在治疗NPD患者ASM缺失引起的症状方面显示出疗效(Murray等人,(2015)Mol.Genet.Metab.,114(2):217-25；Defour等人,(2017)Human Mol.Genetics 26(11):1979-91)。然而，这类研究没有评估hASM改善膜修复的能力，也没有评估其在治疗LGMD2B—一种不是由ASM生产不足引起的，而是由其分泌减少引起的疾病—的疗效。该研究检测了hASM的修复特性，并意外地确定了hASM的有效胞外剂量，该剂量可以恢复dysferlin缺乏的肌肉细胞的膜修复能力(图1)。这个剂量低于用于加强修复被成孔毒素伤害的ASM缺陷细胞的剂量(Tam等人,(2010)J.Cell.Biol.,189(6):1027-38)。这种能有效改善质膜修复的hASM剂量对其在LGMD2B中的临床应用是鼓舞人心的，因为它远远低于既定的用于人类的hASM安全最大剂量，并且比诱导细胞死亡的剂量低100倍(图7)(McGovern等人,(2016)Genet.Med.,18(1):34-40)。然而，鉴于注射的hASM蛋白的循环半衰期很短(21-24小时)，倚赖hASM直接递送的疗法将需要频繁施用和剂量递增以维持疗效，从而降低了其治疗LGMD2B等慢性疾病的实用性。为了克服这一局限性，我们测试了一种更具有临床可行性的方法，即通过AAV介导的肝脏表达hASM蛋白的基因递送。由于AAV在广泛的组织中具有良好的安全性和高转导效率，迄今为止有超过2000项临床试验利用这些基因转移载体(Kumar等人,Ther.Methods Clin.Dev.,3:16034)。其中，基于肝脏特异性靶向AAV的疗法通过静脉施用提供了更大的靶向疗效，在单次施用后可实现多年的转基因表达，并能有效治疗血浆蛋白缺乏症(Nathwani等人,(2014)N.Engl.J.Med,371(21):1994-2004；Dobrzynski等人,(2004)Blood 104(4):969-77；Cao等人,(2007)Blood 110(4):1132-40；Colella等人,(2018)Mol.Ther.Methods Clin.Dev.,8:87-104)。尽管这种方法很安全，但最近利用AAV8剂量递增的MTM1蛋白(AT132)治疗x连锁肌管病(MTM)的1、2期临床试验(NCT03199469)观察到，当使用高水平的病毒负荷(1x10¹⁴vg/kg至3x10¹⁴ vg/kg)时，观察到有害的肝脏结果。这里的研究显示，hASM-AAV在小鼠中的治疗效果为1.1x10¹³ vg/kg(人类等效剂量为1.1x10¹² vg/kg)。这一明显较低的人类等效剂量将使安全使用成为可能。支持这种安全性的是，在使用hASM-AV的12周治疗期间，乃至在治疗结束时，都没有观察到明显的肝脏损伤(血清ALT水平和肝脏组织病理学)。

在体外使用hASM-AAV显示，它可以使人类肝脏细胞(HepG2细胞)分泌的hASM的水平达到治疗效果的浓度，并恢复了dysferlin缺乏的患者肌肉细胞的修复(图4)。这种疗效还体现在该载体在临床前dysferlin缺乏的小鼠模型中的使用。在NPD小鼠模型中使用该载体，在为期12周的研究中证明了hASM生产的增加和稳定(Barbon等人,(2005)Mol.Ther.,12(3):431-40)。hASM-AAV在体内的应用是通过LGMD2B小鼠模型显示的，在用单剂量该载体治疗12周后，可检测到高水平的肝脏和血清hASM，有效恢复肌纤维修复能力(图5)。这些发现虽然对LGMD2B有意义，但对NPDA患者也有意义，因为NPDA小鼠模型的肌纤维也表现为肌纤维膜修复不良(Michailowsky等人,(2019)Skelet.Muscle 9(1):1)。

肌肉退化的增加需要更多的肌肉再生，研究发现，通过hASM-AAV改善对dysferlin缺乏的肌纤维的修复，减少了再生的需要，导致再生的肌纤维数量减少了2倍。还减少了hASM-AAV处理的小鼠中小(新再生)肌纤维的比例(图6)。hASM-AAV的这些体内改善与Dysferlin-AAV介导的基因治疗方法获得的结果相当(Potter等人,(2018)Hum.GeneTher.,29(7):749-62)，并证明基于hASM分泌的基因疗法在挽救LGMD2B肌纤维修复缺陷方面与恢复肌纤维dysferlin表达的基因疗法同样有效。持续的肌纤维损伤的其他后果包括慢性肌肉炎症(Tidball等人,(2011)Compr.Physiol.,1(4):2029-62.)。可以通过改善dysferlin缺乏的肌纤维的体内修复能力(图6)论证的，hASM-AAV对dysferlin缺乏的小鼠的治疗也减轻了这种情况。

连续的损伤发作和膜修复不良也会促进肌肉的纤维化脂肪生成替代，hASM-AAV引起的纤维化脂肪生成替代dysferlinopathy肌肉的减少程度与使用AAV-dysferlin基因疗法实现的减少程度相当(Potter等人,(2018)Hum.Gene Ther.,29(7):749-62)(图6)。这些发现表明，在改善肌肉修复和整体肌肉质量和健康的能力中，hASM-AAV处理会同时保护肌肉功能。与这些改善一致，在hASM-AAV处理后观察到后肢握力的增加。前肢握力(在LGMD2B小鼠模型中不受影响(Lloyd等人,(2019)PLoS One 14(4):e0214908))没有受到hASM-AAV处理的影响。此外，观察到的后肢握力的改善与其他临床前的方法一致，这些方法为dysferlinopathy提供了治疗效果(Farini等人,(2012)Exp.Cell Res.,318(10):1160-74；Han等人,(2010)J.Clin.Invest.,120(12):4366-74；Halevy等人,(2013)Histol.Histopathol.,28(2):211-26)。

总之，这里报告的结果表明，hASM蛋白以剂量依赖的方式改善了LGMD2B肌肉细胞的肌膜修复。他们建立了纯化的hASM蛋白和AAV介导的肝脏hASM基因转移方法，作为提高dysferlinopathy肌纤维修复能力的可行策略。基因转移方法的使用确立了其在减少肌纤维死亡和组织病理学，以及改善肌肉功能方面的长期体内效益。

细胞和组织水平的脂质失衡是dysferlinopathy中肌肉退化的特征。纤维化脂肪生成细胞的异常积累和脂肪生成分化导致dysferlinopathy的肌肉损失。靶向纤维化脂肪生成细胞提供了一种遏制脂肪变性引起的肌肉损失的治疗方法。通过基因方式增加分泌的酸性鞘磷脂酶，可以维持dysferlinopathy肌肉并防止其功能衰退。

在上述说明书中，为了描述本发明所涉及的技术状况，引用了一些出版物和专利文件。这些引文的全部内容都通过参考纳入本文。

虽然上文已经描述了本发明的某些优选实施方案并具体举例说明，但并不意在将本发明局限于这些实施方案。在不偏离本发明的范围和本质的情况下，可以对其进行各种修改，如以下权利要求中所述。

序列表

<110> 乔蒂·K·杰斯瓦尔

奥雷利娅·德福尔

丹尼尔·比特尔

钱德拉·古塔姆

森·钱德拉·斯里塔玛

<120> 使用重组人酸性鞘氨醇酶改善骨骼肌纤维的修复

<130> 5410-P06791WO00

<150> 63/046,202

<151> 2020-06-30

<160> 3

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 631

<212> PRT

<213> 人类

<400> 1

Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly

1 5 10 15

Arg Glu Gln Gly Gln Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp

20 25 30

Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala

35 40 45

Leu Ser Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu

50 55 60

Ser Pro Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu

65 70 75 80

Arg Asp Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly

85 90 95

Leu Phe Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala

100 105 110

Arg Val Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala

115 120 125

Pro Pro Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met

130 135 140

Val Glu Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly

145 150 155 160

Leu Leu Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp

165 170 175

Asn Ile Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser

180 185 190

Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp

195 200 205

Leu His Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala

210 215 220

Asp Pro Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg

225 230 235 240

Pro Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu

245 250 255

Arg Thr Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe

260 265 270

Asp Met Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His

275 280 285

Gln Thr Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu

290 295 300

Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn

305 310 315 320

His Glu Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly

325 330 335

Asn His Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu

340 345 350

Pro Trp Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe

355 360 365

Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met

370 375 380

Asn Phe Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp

385 390 395 400

Pro Ala Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu

405 410 415

Asp Arg Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His

420 425 430

Cys Leu Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr

435 440 445

Glu Asn Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu

450 455 460

Phe Glu Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val

465 470 475 480

Ala Phe Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly

485 490 495

Tyr Arg Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser His Val

500 505 510

Val Leu Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile

515 520 525

Pro Gly Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr

530 535 540

Tyr Gly Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr

545 550 555 560

Arg Met Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr

565 570 575

His Lys Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu

580 585 590

Ala Thr Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu

595 600 605

Cys Arg His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu

610 615 620

Trp Pro Arg Pro Leu Phe Cys

625 630

<210> 2

<211> 585

<212> PRT

<213>人类

<400> 2

Leu Ala Leu Ser Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His

1 5 10 15

Pro Leu Ser Pro Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro

20 25 30

Arg Leu Arg Asp Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys

35 40 45

Lys Gly Leu Phe Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn

50 55 60

Val Ala Arg Val Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ala Pro Pro Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp

85 90 95

Asp Met Val Glu Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala

100 105 110

Cys Gly Leu Leu Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser

115 120 125

Ser Trp Asn Ile Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro

130 135 140

Pro Ser Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu

145 150 155 160

Thr Asp Leu His Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp

165 170 175

Cys Ala Asp Pro Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala

180 185 190

Ser Arg Pro Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu

195 200 205

Pro Leu Arg Thr Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly

210 215 220

Pro Phe Asp Met Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val

225 230 235 240

Trp His Gln Thr Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr

245 250 255

Ala Leu Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val

260 265 270

Gly Asn His Glu Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile

275 280 285

Glu Gly Asn His Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala

290 295 300

Trp Glu Pro Trp Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly

305 310 315 320

Gly Phe Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu

325 330 335

Asn Met Asn Phe Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser

340 345 350

Thr Asp Pro Ala Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala

355 360 365

Ala Glu Asp Arg Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro

370 375 380

Gly His Cys Leu Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala

385 390 395 400

Arg Tyr Glu Asn Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val

405 410 415

Asp Glu Phe Glu Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu

420 425 430

Ala Val Ala Phe Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn

435 440 445

Pro Gly Tyr Arg Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser

450 455 460

His Val Val Leu Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala

465 470 475 480

Asn Ile Pro Gly Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg

485 490 495

Glu Thr Tyr Gly Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu

500 505 510

Val Tyr Arg Met Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe

515 520 525

Leu Tyr His Lys Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys

530 535 540

Arg Leu Ala Thr Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro

545 550 555 560

Ala Leu Cys Arg His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln

565 570 575

Ser Leu Trp Pro Arg Pro Leu Phe Cys

580 585

<210> 3

<211> 2410

<212> DNA

<213> 人类

<400> 3

agtcagccga ctacagagaa gggtaatcgg gtgtccccgg cgccgcccgg ggccctgagg 60

gctggctagg gtccaggccg ggggggacgg gacagacgaa ccagccccgt gtaggaagcg 120

cgacaatgcc ccgctacgga gcgtcactcc gccagagctg ccccaggtcc ggccgggagc 180

agggacaaga cgggaccgcc ggagcccccg gactcctttg gatgggcctg gtgctggcgc 240

tggcgctggc gctggcgctg gcgctggctc tgtctgactc tcgggttctc tgggctccgg 300

cagaggctca ccctctttct ccccaaggcc atcctgccag gttacatcgc atagtgcccc 360

ggctccgaga tgtctttggg tgggggaacc tcacctgccc aatctgcaaa ggtctattca 420

ccgccatcaa cctcgggctg aagaaggaac ccaatgtggc tcgcgtgggc tccgtggcca 480

tcaagctgtg caatctgctg aagatagcac cacctgccgt gtgccaatcc attgtccacc 540

tctttgagga tgacatggtg gaggtgtgga gacgctcagt gctgagccca tctgaggcct 600

gtggcctgct cctgggctcc acctgtgggc actgggacat tttctcatct tggaacatct 660

ctttgcctac tgtgccgaag ccgcccccca aaccccctag ccccccagcc ccaggtgccc 720

ctgtcagccg catcctcttc ctcactgacc tgcactggga tcatgactac ctggagggca 780

cggaccctga ctgtgcagac ccactgtgct gccgccgggg ttctggcctg ccgcccgcat 840

cccggccagg tgccggatac tggggcgaat acagcaagtg tgacctgccc ctgaggaccc 900

tggagagcct gttgagtggg ctgggcccag ccggcccttt tgatatggtg tactggacag 960

gagacatccc cgcacatgat gtctggcacc agactcgtca ggaccaactg cgggccctga 1020

ccaccgtcac agcacttgtg aggaagttcc tggggccagt gccagtgtac cctgctgtgg 1080

gtaaccatga aagcacacct gtcaatagct tccctccccc cttcattgag ggcaaccact 1140

cctcccgctg gctctatgaa gcgatggcca aggcttggga gccctggctg cctgccgaag 1200

ccctgcgcac cctcagaatt ggggggttct atgctctttc cccatacccc ggtctccgcc 1260

tcatctctct caatatgaat ttttgttccc gtgagaactt ctggctcttg atcaactcca 1320

cggatcccgc aggacagctc cagtggctgg tgggggagct tcaggctgct gaggatcgag 1380

gagacaaagt gcatataatt ggccacattc ccccagggca ctgtctgaag agctggagct 1440

ggaattatta ccgaattgta gccaggtatg agaacaccct ggctgctcag ttctttggcc 1500

acactcatgt ggatgaattt gaggtcttct atgatgaaga gactctgagc cggccgctgg 1560

ctgtagcctt cctggcaccc agtgcaacta cctacatcgg ccttaatcct ggttaccgtg 1620

tgtaccaaat agatggaaac tactccggga gctctcacgt ggtcctggac catgagacct 1680

acatcctgaa tctgacccag gcaaacatac cgggagccat accgcactgg cagcttctct 1740

acagggctcg agaaacctat gggctgccca acacactgcc taccgcctgg cacaacctgg 1800

tatatcgcat gcggggcgac atgcaacttt tccagacctt ctggtttctc taccataagg 1860

gccacccacc ctcggagccc tgtggcacgc cctgccgtct ggctactctt tgtgcccagc 1920

tctctgcccg tgctgacagc cctgctctgt gccgccacct gatgccagat gggagcctcc 1980

cagaggccca gagcctgtgg ccaaggccac tgttttgcta gggccccagg gcccacattt 2040

gggaaagttc ttgatgtagg aaagggtgaa aaagcccaaa tgctgctgtg gttcaaccag 2100

gcaagatcat ccggtgaaag aaccagtccc tgggccccaa ggatgccggg gaaacaggac 2160

cttctccttt cctggagctg gtttagctgg atatgggagg gggtttggct gcctgtgccc 2220

aggagctaga ctgccttgag gctgctgtcc tttcacagcc atggagtaga ggcctaagtt 2280

gacactgccc tgggcagaca agacaggagc tgtcgcccca ggcctgtgct gcccagccag 2340

gaaccctgta ctgctgctgc gacctgatgc tgccagtctg ttaaaataaa gataagagac 2400

ttggactcca 2410

Claims (11)

1.一种治疗、抑制和/或预防受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括向所述受试者施用编码酸性鞘磷脂酶的核酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的肌营养不良症是dysferlinopathy或者是dysferlin缺乏的。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的dysferlinopathy是肢腰肌营养不良症2B型(LGMD2B)或宫氏肌营养不良症1。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码酸性鞘磷脂酶的核酸与肝脏特异性或肝细胞特异性启动子相连。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述肝脏特异性或肝细胞特异性启动子选自由人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、混合肝脏启动子(HLP)、人甲状腺结合球蛋白(TBG)、人血清白蛋白启动子和DC190启动子组成的组。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述肝脏特异性或肝细胞特异性启动子是人血清白蛋白启动子。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述的肝脏特异性或肝细胞特异性启动子是DC190启动子。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码酸性鞘磷脂酶的核酸被直接注射到肝脏或血液中。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的酸性鞘氨醇酶是人类酸性鞘氨醇酶。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码酸性鞘磷脂酶的核酸包含在病毒性载体中。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述病毒性载体是一种腺相关病毒载体。

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