BR112021007221A2 - proteínas inteínas e seus usos - Google Patents

Abstract

PROTEÍNAS INTEÍNAS E SEUS USOS. A presente invenção se refere a construções, vetores, células hospedeiras relativas e composições farmacêuticas que permitem uma terapia genética eficaz, em particular, de genes maiores do que 5 KB.

Description

PROTEÍNAS INTEÍNAS E SEUS USOS CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a construções, vetores, células hospedeiras relativas e composições farmacêuticas que permitem uma terapia genética eficaz, em particular, para doenças devido a mutações em genes com uma sequência de codificação (CDS) maior do que 5 kb.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A terapia gênica com vetores virais adeno- associados (AAV) é segura e eficaz em humanos. Os produtos de terapia gênica baseados em AAV foram aprovados nos últimos anos nos EUA e na Europa para doenças hereditárias e metabólicas, enquanto ensaios clínicos para abordagens de terapia gênica baseadas em AAV para doenças em diferentes áreas terapêuticas que vão desde oftalmologia a hematologia e distúrbios musculoesqueléticos e metabólicos estão sempre aumentando.

[003] No entanto, o limite da capacidade de carga dos vetores AAV impede o desenvolvimento de terapias baseadas em AAV para doenças devido a mutações em genes com uma sequência de codificação (CDS) maior do que 5 kb (aqui também referidos como genes grandes).

[004] Doenças genéticas devido a mutações em genes grandes (listadas na Tabela 1 abaixo) incluem, entre outras, distrofia muscular de Duchenne devido a mutações no gene DMD, fibrose cística devido a mutações no gene CFTR, hemofilia A devido a mutações no gene F8, disferlinopatias devido a mutações no gene DYSF, doença renal policística devido a mutação no gene PKD, doença de Wilson devido a mutação no gene ATP7B, doença de Huntington devido a mutação no gene HTT, Niemann-Pick tipo C devido a mutação no gene NPC1. Tabela 1: Doenças genéticas devido a mutações em genes grandes Doença Gene CDS Número de acesso Distrofia muscular Duchene DMD 11 Kb NM_000109 Fibrose cística CFTR 4,4 Kb NM_000492 Hemofilia A F8 7 Kb NM_000132 Disferlinopatias DYSF 6,2 Kb NM_001130455 Doença do rim policístico PKD1 12,9 Kb NM_000296 Doença de Wilson ATP7B 4,4 Kb NM_000053 Doença de Huntington HTT 9,4 Kb NM_002111 Niemann-Pick tipo C NPC1 3,8 Kb NM_000271

[005] Além disso, várias degenerações retinais hereditárias (IRDs) são devidas a mutações em genes grandes, conforme listado na tabela 2 abaixo. Os IRDs afetam cerca de 1 em 3.000 pessoas na Europa e nos Estados Unidos (58).

[006] Entre os IRDs mais frequentes e graves estão retinite pigmentosa (RP), amaurose congênita de Leber (LCA) e doença de Stargardt (STGD), que são mais frequentemente herdadas como condições monogênicas, com uma prevalência global geral de 1 / 2.000 (1), e são uma das principais causas de cegueira em todo o mundo. A maioria das mutações que causam IRDs ocorrem em genes expressos em fotorreceptores neuronais (PR), bastonetes e / ou cones na retina (2).

[007] A terapia gênica é uma grande promessa para o tratamento de IRDs. O primeiro produto de terapia gênica baseado em vetor viral adeno-associado (AAV) para uma forma hereditária de cegueira foi aprovado em dezembro de 2017 (3). Além disso, vários outros produtos baseados em AAV estão atualmente em desenvolvimento clínico para terapia genética de formas raras e comuns de cegueira (4). Embora esteja agora bem estabelecido que o AAV representa, até o momento, o veículo de terapia gênica mais eficiente para a retina (4,5), sua capacidade de carga limitada tem dificultado seu uso para condições que exigem a entrega de sequências de DNA que excedem 5 kb de tamanho (6) que incluem não apenas o transgene, mas também os elementos reguladores cis que são necessários para sua expressão.

[008] Exemplos de genes de doenças que excedem 5 kb em tamanho estão resumidos na tabela 2 abaixo. Doença Gene CDS Número de Expressão acesso doença de ABCA4 6,8 Kb NM_000350 Rod&cone PRs Stargardt e doenças associadas a ABCA4 Usher 1B MYO7A 6,7 Kb NM_000260 RPE e PRs Amaurose10 CEP290 7,5 Kb NM_025114 Principalmente congênita PRs (pan de Leber retinal) Usher 1D, CDH23 10,1 Kb NM_001171930 PRs surdez não sindrômica, recessiva autossÕmica (DFNB12) Retinite EYS 9,4 Kb NM_001142800 PR ECM pigmentosa Usher 2A USH2a 15,6 Kb NM_007123 Rod&cone PRs Usher 2C ADGRV1 18,0 Kb NM_032119 Principalmente PRs Síndrome de ALMS1 12,5 Kb NM_015120 Rod&cone PRs Alstrom

[009] A doença de Stargardt (STGD; MIM # 248200) é a forma mais comum de degeneração macular hereditária causada por mutações no gene ABCA4 (CDS: 6822 bp), que codifica o transportador retinal all-trans localizado no segmento externo PR (7); A síndrome de Usher tipo IB (USH1B; MIM # 276900) é a forma mais grave de RP e surdez causada por mutações no gene MY07A (CDS: 6648 bp) (8) que codifica o MY07A não convencional, um motor baseado em actina expresso em ambos PR e RPE na retina (9-11).

[0010] Distrofia de bastonete cônico tipo 3, fundo flavimaculatus, degeneração macular relacionada à idade tipo 2, distrofia retiniana grave de início precoce e retinite pigmentosa tipo 19 também estão associadas a mutações ABCA4 (aqui referidas como doenças associadas a ABCA4).

[0011] Os inventores e outros mostraram que esta limitação pode ser superada usando vetores AAV duplos (até 9 kb) (6, 12, 13) ou triplos (até 14 kb) (14), cada um contendo fragmentos da sequência de codificação (CDS) da grande cassete de expressão do transgene. Os vetores AAV duplos e triplos exploram a concatemerização e recombinação de genomas de AAV para reconstituir os genomas de comprimento total em células co-infectadas por múltiplos vetores de AAV. No entanto, a eficiência da expressão do transgene alcançada com vetores AAV duplos ou triplos em fotorreceptores, que são os principais alvos terapêuticos para a maioria das doenças retinais hereditárias, é menor do que a alcançada com vetores AAV únicos (6, 14, 15). Isso pode ser devido às várias etapas limitantes necessárias para a transdução eficiente, incluindo a formação adequada do concatemer de DNA, estabilidade do mRNA heterogêneo e eficiência de splicing através das junções dos vetores.

[0012] Os presentes inventores mostraram no documento W0 2014/170480 e Colella et al (15) vetores AAV duplos que reconstituem um grande gene por splicing (trans- splicing), recombinação homóloga (sobreposição) ou uma combinação dos dois (híbrido), encontrando que o trans- splicing dual e os vetores híbridos são particularmente eficientes para o tratamento de degenerações retinais hereditárias. Além disso, Maddalena et al. (14) demonstraram uma abordagem de vetor triplo AAV para genes de até 14 kb. No entanto, a eficiência da expressão do transgene alcançada com vetores AAV duplos ou triplos é menor do que aquela alcançada com vetores AAV únicos (6, 13, 14). Isso pode ser devido às várias etapas limitantes necessárias para a transdução eficiente, incluindo: formação adequada do concatemer de DNA, estabilidade do mRNA heterogêneo e eficiência de splicing através das junções dos vetores. Além disso, a estratégia de vetor triplo AAV produz níveis de expressão gênica abaixo do limite necessário para uma abordagem terapêutica.

[0013] Portanto, ainda há a necessidade de construções e vetores que possam ser explorados para reconstituir a expressão de genes grandes para uma terapia gênica eficaz.

[0014] Os inventores descobriram agora que a entrega de múltiplos vetores AAV, cada um codificando um dos fragmentos de qualquer um dos repórteres ou de proteínas terapêuticas grandes flanqueadas por inteínas divididas curtas, resulta em trans-splicing de proteína e reconstituição de proteína de comprimento total tanto in vitro quanto in vivo.

[0015] Inteínas são elementos genéticos transcritos e traduzidos dentro de uma proteína do hospedeiro da qual se auto-excisam de forma semelhante a um íntron de proteína, sem deixar modificações de aminoácidos no produto proteico final, na ausência de fornecimento de energia, proteases específicas do hospedeiro exógenas ou co-fatores (16, 17, 27, 28). A atividade de Inteína é dependente do contexto, com certas sequências de peptídeos circundando sua junção de ligação (chamadas de N- e C-exteínas) que são necessárias para que ocorra um trans-splicing eficiente, dos quais o mais importante é um aminoácido contendo um grupo tiol ou hidroxila (isto é, Cys, Ser ou Thr) como primeiro resíduo na C-exteína (18). Split-inteínas são um subconjunto de inteínas que são expressos como dois polipeptídeos separados nas extremidades de duas proteínas hospedeiras e catalisam seu trans-splicing resultando na geração de um único polipeptídeo maior (19). Inteínas, incluindo inteínas divididas, são amplamente utilizadas em aplicações biotecnológicas que incluem purificação de proteínas e etapas de marcação (19, 20), bem como a reconstituição da nuclease de edição do genoma CRISPR / Cas9 amplamente utilizada (21, 22).

[0016] Várias tentativas foram feitas na exploração de splicing de proteína à base de inteína para reconstituir a expressão de genes terapêuticos, incluindo o gene do Fator VIII, em que os genes de cadeia pesada e leve fundidos com inteínaa de Synechocystis sp (Ssp) DnaB do Fator VIII demonstraram levar à reconstituição de Fator VIII em cultura de células e em modelos animais (23, 24). Da mesma forma, uma forma altamente funcional do gene da distrofina foi expressa in vitro e in vivo, em que o gene da distrofina de Becker de 6,3 kb foi dividido em dois vetores AAV e cada metade foi fundida para dividir inteínas obtidas de Synechocystis sp. PCC 6803 (Ssp) DnaB inteína ou Rhodothermus marinus (Rma) DnaB inteína (25). Além disso, a estratégia de trans-splicing da proteína mediada por inteína dividida (nomeadamente N. punctiforme DnaE DnaE dividida) foi relatada para reconstituir a subunidade formadora de poros grandes de canais de cálcio do tipo L de dois fragmentos separados em células cardíacas, (26). A US 6,544,786 relata ainda o uso de inteínas divididas para fornecer um minigene de distrofina.

[0017] Os presentes inventores aproveitaram a capacidade intrínseca das inteínas divididas para mediar o trans-splicing de proteínas para reconstituir proteínas de comprimento total grandes após sua fragmentação em dois ou três polipeptídeos flanqueados por inteínas divididas, cujas sequências de codificação se encaixam em vetores AAV únicos. A presente invenção, portanto, implementa a reconstituição celular de proteína grande, fornecendo a uma célula alvo dois ou mais fragmentos da referida proteína grande fundida para dividir inteínas para promover o trans-splicing mediado por inteínas e reconstituir a proteína funcional.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0018] A presente invenção fornece terapia gênica com vetores AAV para doenças devido a mutações de genes, em particular, de genes com regiões codificantes que excedem 5 kb.

[0019] Com base nas descobertas de que o trans- splicing de proteína mediado por inteínas divididas é usado por organismos de célula única para reconstituir proteínas, os inventores construíram vários vetores AAV, cada um codificando um dos fragmentos de qualquer repórter ou proteínas terapêuticas grandes flanqueadas por inteínas divididas curtas, resultando em trans-splicing de proteína e reconstituição de proteína de comprimento total in vitro e in vivo.

[0020] Vantajosamente, a reconstituição de proteínas de doença mediada por trans-splicing de proteína baseada em AAV alcançada pela presente invenção proporcionou a expressão de maiores quantidades de proteínas alvo do que métodos baseados em AAV para proteínas grandes conhecidas na técnica. Isso é provavelmente devido à superação de várias etapas limitantes necessárias para a transdução eficiente de sistemas baseados em vetores duplos, incluindo: formação adequada de concatêmero de DNA, estabilidade do mRNA heterogêneo e eficiência de splicing entre as junções dos vetores.

[0021] A presente invenção fornece um sistema de vetor para expressar uma sequência de codificação em uma célula, a referida sequência de codificação consistindo em uma primeira parte (CDS1), uma segunda parte (CDS2) e, opcionalmente, uma terceira parte (CDS3), o referido sistema de vetor compreendendo: a) um primeiro vetor compreendendo: - a referida primeira porção da referida sequência de codificação (CDS1), - uma primeira sequência de nucleotídeos de inteína que codifica para uma N-inteína, estando a referida sequência localizada na extremidade 3' da CDS1; e b) um segundo vetor compreendendo: - a referida segunda porção da referida sequência de codificação (CDS2), - uma segunda sequência de nucleotídeos de inteína que codifica para uma C-inteína, a referida sequência estando localizada na extremidade 5' da CDS2; em que quando o primeiro vetor e o segundo vetor são inseridos em uma célula, o produto de proteína da sequência de codificação é produzido por splicing de proteína; ou o referido sistema de vetor compreendendo: a') um primeiro vetor compreendendo: - a referida primeira porção da referida sequência de codificação (CDS1),

[0022] - uma primeira sequência de nucleotídeos de inteína que codifica para um primeiro N-inteína, estando a referida sequência localizada na extremidade 3 'de CDS1; e b') um segundo vetor compreendendo: - a referida segunda porção da referida sequência de codificação (CDS2), - uma segunda sequência de nucleotídeos de inteína que codifica para um primeiro C-inteína, estando a referida sequência localizada na extremidade 5' da CDS2; - uma terceira sequência de nucleotídeos de inteína que codifica para uma segunda N-inteína, estando a referida sequência localizada na extremidade 3' da CDS2; e c') um terceiro vetor compreendendo: – a dita terceira parte da referida sequência de codificação (CDS3) - uma quarta sequência de nucleotídeos de inteína que codifica para uma segunda C-inteína, a referida sequência sendo localizada na extremidade 5' da CDS3, em que a primeira sequência de nucleotídeos de inteína é diferente da terceira sequência de nucleotídeos de inteína e a segunda sequência de inteína é diferente da quarta sequência de nucleotídeos de inteína, em que quando o primeiro vetor, o segundo vetor, o terceiro vetor são inseridos em uma célula, o produto de proteína da sequência de codificação é produzido por trans-splicing de proteína.

[0023] De preferência, no sistema de vetor, a primeira inteína, a segunda inteína, a terceira inteína e a quarta inteína codificam para uma inteína dividida, de preferência, a referida inteína dividida tem um comprimento máximo de 150 aminoácidos, mais preferencialmente, a referida inteína dividida é uma inteína DnaE ou DnaB.

[0024] De acordo com a presente invenção, uma inteína é um segmento de uma proteína que é capaz de extirpar-se e unir as porções restantes (as exteínas) com uma ligação peptídica em um processo conhecido como splicing de proteína. Os segmentos são chamados de "inteínos" para a sequência de proteína interna e "exteínos" para a sequência de proteína externa, com as exteínas a montante denominadas "N-exteínas" e as exteínas a jusante chamados "C-exteínas", a inteína a montante chamada "N-inteína" e o inteína a jusante denominado "C-inteína". "Portanto, no contexto da presente invenção, um N-inteína é um fragmento de inteína localizado no terminal N do (e fundido com) o primeiro polipeptídeo e um C-inteína é um fragmento de inteína localizado no terminal C do (e fundido com) o segundo polipeptídeo, em que após a expressão dos dois polipeptídeos, os dois fragmentos de inteína sofrem trans-splicing de proteína e são unidos para formar uma inteína completa, e os dois polipeptídeos são unidos, em que quando os dois polipeptídeos formam uma proteína de comprimento total, a referida proteína de comprimento total é reconstituída.

[0025] De acordo com a presente invenção, a primeira sequência inteína é uma sequência N-inteína e a segunda sequência inteína é uma sequência C-inteína, em que a referida N-inteína e a referida C-Inteína são preferencialmente derivadas da mesma inteína ou gene split inteína. Alternativamente, a referida N-inteína e a referida C-inteína derivam de dois genes diferentes de inteína que são capazes de sofrer a reação de trans-splicing naturalmente ou são modificados para isso. Consequentemente, o mesmo gene pode ser do mesmo organismo ou de organismos diferentes. Por exemplo, os inteínas divididos amplamente usados derivam do gene DnaE de diferentes organismos. De acordo com a presente invenção, quando a sequência de codificação da proteína de interesse é dividida em duas porções, a sequência de codificação de N-inteína é fundida em estrutura com a sequência de codificação para a parte do terminal N da proteína de interesse; a sequência de codificação C-inteína é fundida em quadro com a sequência de codificação para a porção C-terminal da sequência de interesse. Após a expressão das duas proteínas de fusão precursoras, as inteínas sofrem excisão autocatalítica e formam uma exteína ligada, por exemplo, a proteína reconstituída de interesse.

[0026] De acordo com a presente invenção, a sequência de codificação da proteína de interesse pode ser dividida em três porções. Por conseguinte, a primeira sequência de inteína é uma sequência de N-inteína e a segunda sequência de inteína é uma sequência de C-inteína, em que a primeira sequência de codificação de inteína é fundida na estrutura no terminal C para a sequência de codificação para a parte N da proteína de interesse, e a segunda sequência de codificação de inteína é fundida em estrutura no terminal N da sequência de codificação para a porção intermediária da proteína de interesse. Consequentemente, o referido N- inteína e o referido C-Inteína são preferencialmente derivados do mesmo gene inteína ou gene split inteína. Alternativamente, a referida N-inteína e a referida C- inteína derivam de dois genes diferentes de inteína que são capazes de sofrer a reação de trans-splicing naturalmente ou são modificados para isso. Consequentemente, o mesmo gene pode ser do mesmo organismo ou de organismos diferentes. Dentro da configuração presente, a terceira inteína é uma sequência de codificação de N-inteína fundida no quadro à sequência de codificação para o terminal C da porção intermediária da proteína de interesse, e a quarta inteína é uma sequência de codificação de C-inteína fundida em quadro para a sequência que codifica para o terminal N da porção C da proteína de interesse. Consequentemente, as referidas terceira e quarta inteínas são preferencialmente derivadas da mesma inteína ou gene da inteína dividida. Alternativamente, a referida N-inteína e a referida C- inteína derivam de dois genes diferentes de inteína que são capazes de sofrer a reação de trans-splicing naturalmente ou são modificados para isso. Consequentemente, o mesmo gene pode ser do mesmo organismo ou de organismos diferentes. No âmbito da presente invenção, as referidas primeira e segunda inteínas e as referidas terceira e quarta inteínas derivam de genes de inteínas diferentes e a primeira inteína liga- se seletivamente à segunda inteína, enquanto a terceira inteína se liga seletivamente à quarta inteína.

[0027] Na presente invenção, quando o primeiro vetor, o segundo vetor e, opcionalmente, o terceiro vetor são inseridos em uma célula, pelo menos duas proteínas de fusão ou três proteínas de fusão são formadas e ao entrar em contato com as referidas duas proteínas de fusão ou três proteínas de fusão, o produto de proteína de a sequência de codificação é produzida. A etapa de contato é realizada em condições que permitem a ligação da N-inteína à C-inteína.

[0028] Na presente invenção, quando o primeiro vetor, o segundo vetor e o terceiro vetor são inseridos em uma célula, três polipeptídeos independentes são produzidos e a proteína de comprimento total é produzida via trans- splicing. Fundamental para o desenvolvimento dos três vetores inteína AAV tem sido o uso de inteínas diferentes, isto é, DnaE e DnaB, que não apresentam reação cruzada, evitando, assim, o trans-splicing impróprio entre os polipeptídeos produzidos pelo primeiro e pelo terceiro vetor.

[0029] De acordo com concretizações preferidas da presente invenção, um sistema de vetor para expressar a sequência de codificação de um gene de interesse em uma célula compreende dois vetores, cada vetor compreendendo uma porção da referida sequência de codificação flanqueada por uma sequência inteína, em que a extremidade 5' de a referida sequência de codificação é flanqueada na extremidade 3' pela sequência de uma N-inteína, e a extremidade 3' da sequência de codificação do gene de interesse é flanqueada pela sequência de uma C-inteína, de modo que quando ambos os vetores são expressa em uma célula, duas proteínas de fusão são produzidas e a proteína de comprimento total de interesse é gerada como resultado de uma reação de trans-splicing espontânea.

[0030] De acordo com uma outra concretização preferida da invenção, o sistema de vetor para expressar a sequência de codificação de um gene de interesse em uma célula compreende três vetores, cada vetor compreendendo uma porção da referida sequência de codificação flanqueada por uma sequência de inteína, em que a sequência de codificação é dividido em três porções de modo que a extremidade 5 'da referida sequência de codificação seja flanqueada no terminal 3' pela sequência de uma primeira N-inteína; a porção do meio da referida sequência de codificação é flanqueada no terminal 5 'por um primeiro C-inteína, e no terminal 3' com um segundo N-inteína; a porção 3 'da referida sequência de codificação é flanqueada no terminal 5' por um segundo C-inteína, de modo que quando todos os três vetores são expressos em uma célula, três proteínas de fusão são produzidas e a proteína de comprimento total de interesse é gerada como um resultado de uma reação trans-splicing espontânea, em que o primeiro N-inteína reage com o primeiro C-inteína e o segundo N-inteína reage com o segundo C- inteína.

[0031] As inteínas divididas da invenção podem ser codificadas por um gene que é então modificado para codificar dois fragmentos separados de inteínas, por exemplo, inteínas divididas; alternativamente, inteínas divididas de ocorrência natural são codificadas por dois genes separados; por exemplo, em cianobactérias, DnaE, a subunidade catalítica a da DNA polimerase III, é codificada por dois genes separados, dnaE-n e dnaE-c. As inteínas preferidas dentro da presente invenção são inteínas que derivam de proteínas inteínas (por exemplo, mini inteínas) ou inteínas divididas que formam proteínas inteínas por meio da reação de trans-splicing, que têm 150 aa de comprimento ou menos.

[0032] As inteínas divididas da invenção podem ser

100% idênticas, 98%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50% idênticas às inteínas de ocorrência natural ou à SEQ ID No. 1 a 14 (homólogos), em que as referidas inteínas retêm a capacidade de sofrer reações de trans-splicing. No escopo da presente invenção encontram-se fragmentos ou variantes de inteínas de ocorrência natural ou modificadas que retêm a atividade de trans-splicing.

[0033] Convenientemente, as inteínas divididas da invenção podem ser derivadas do mesmo gene isolado de diferentes organismos. Genes inteína preferidos são Dna B e Dna E.

[0034] Em uma concretização preferida, a inteína da invenção é uma inteína dividida derivada do gene DnaE (por exemplo, subunidade alfa da DNA polimerase III) de cianobactérias incluindo Nostoc punctiforme (Npu) Synechocystis sp. PCC6803 (Ssp), Fischerella sp. PCC 9605, Scytonema tolypothrichoides, Cyanobacteria bacterium SW_9_47_5, Nodularia spumigena, Nostoc flagelliforme, Crocosphaera watsonii WH 8502, Chroococcidiopsis cubana CCALA 043, Trichodesmium erythraeum; de preferência, a inteína da invenção é derivada do gene Dna E isolado de Nostoc puntiforme ou Synechocystis sp. PCC6803.

[0035] Em uma outra concretização preferida, a inteína da invenção é uma inteína dividida derivada do gene DnaB de cianobactérias incluindo R. marinus (Rma), Synechocystis sp. PC6803 (Ssp), Porphyra purpurea chloroplast (Ppu) que são descritos por exemplo em (59).

[0036] Preferencialmente, - a primeira sequência de nucleotídeos inteína codifica para uma inteína selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID No 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou uma sua variante ou um seu fragmento ou um seu homólogo; - a segunda sequência de nucleotídeos de inteína codifica para uma inteína selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID No 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou uma variante desta ou um fragmento desta ou um homólogo desta; - a terceira sequência de nucleotídeos de inteína codifica para uma inteína selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID No: l, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou uma variante desta ou um fragmento desta ou um homólogo desta; - a quarta sequência de nucleotídeos de inteína codifica para uma inteína selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID No2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou uma variante desta ou um fragmento desta ou um homólogo desta.

[0037] De preferência, em que quando a primeira ou terceira inteína é SEQ. ID: 1, o segundo ou quarto é SEQ ID: 2; ou quando a primeira ou terceira inteína é SEQ ID: 3, a segunda ou quarta inteína é SEQ ID 4; ou quando a primeira ou terceira inteína é SEQ ID: 5, a segunda ou quarta é SEQ ID: 6; ou quando a primeira ou terceira inteína é SEQ ID: 7, a segunda ou quarta é SEQ ID: 8; ou quando a primeira ou terceira inteína é SEQ ID: 9, a segunda ou quarta é SEQ ID: 10; ou quando a primeira ou terceira inteína é SEQ ID: 11, a segunda ou quarta é SEQ ID: 12.

[0038] De preferência, quando a primeira inteína é SEQ ID: 1 e a segunda inteína é SEQ ID: 2, a terceira inteína não é SEQ ID: 1 e a quarta inteína não é SEQ: ID 2; de preferência, quando a primeira inteína é SEQ ID: 3 e a segunda inteína é SEQ ID: 4, a terceira inteína não é SEQ ID: 3 e a quarta inteína não é SEQ ID: 4; de preferência, quando a primeira inteína é SEQ ID: 5 e a segunda inteína é SEQ ID: 6, a terceira inteína não é SEQ ID 5: e a quarta inteína não é SEQ ID: 6; de preferência quando a primeira inteína é SEQ ID: 7 e a segunda inteína é SEQ ID: 8, a terceira inteína não é SEQ ID: 7 e a quarta inteína não é SEQ ID: 8; de preferência, quando a primeira inteína é SEQ ID: 9 e a segunda inteína é SEQ ID: 10, a terceira inteína não é SEQ ID: 9 e a quarta inteína não é SEQ ID: 10; de preferência, quando a primeira inteína é SEQ ID: 11 e a segunda inteína é SEQ ID: 12, a terceira inteína não é SEQ ID: 11 e a quarta inteína não é SEQ ID: 12.

[0039] Em uma concretização particular, a primeira inteína é SEQ ID: 1, a segunda inteína é SEQ ID: 2, a terceira inteína é SEQ: ID 3, a quarta Inteína é SEQ ID: 4; ou, a primeira inteína é SEQ ID: 5, a segundo inteína é SEQ ID: 6, o terceiro inteína é SEQ ID: 3 e a quarto Inteína é SEQ ID:

4.

[0040] Em uma concretização preferida, o primeiro vetor, o segundo vetor e o terceiro vetor compreendem ainda uma sequência promotora operacionalmente ligada à porção de extremidade 5' da referida primeira porção da sequência de codificação (CDS1) ou da referida segunda porção da sequência de codificação (CDS2) ou da referida terceira parte da sequência de codificação (CDS3).

[0041] Os promotores preferidos são promotores ubíquos, artificiais ou específicos de tecido, incluindo fragmentos e variantes dos mesmos que retêm uma atividade de promotor de transcrição. Os promotores particularmente preferidos são promotores específicos de fotorreceptor, incluindo receptor quinase 1 acoplado à proteína G humana específico de fotorreceptor (GRK1), promotor de proteína de ligação a retinoide interfotorreceptor (IRBP), promotor de rodopsina (RHO), promotor de distrofia macular viteliforme 2 (VMD2), rodopsina quinase promotor (RK); Outros promotores particularmente preferidos são promotores específicos do músculo, incluindo MCK, MYODI; promotores específicos do fígado, incluindo globulina de ligação à tiroxina (TBG), promotor híbrido específico do fígado (HLP) (67); promotores específicos de neurônios, incluindo hSYNl, CaMKIla; promotores específicos do rim, incluindo Ksp-caderinl6, NKCC2. Os promotores ubíquos de acordo com a presente invenção são, por exemplo, os promotores do citomegalovírus ubíquo (CMV) (32) e do CMV curto (33). Os promotores mais preferidos no escopo da presente invenção são GRK1, TBG, CaMKIla, Ksp-caderinl6.

[0042] Em uma concretização ainda preferida, o primeiro vetor, o segundo vetor e o terceiro vetor compreendem ainda uma sequência de nucleotídeos de repetição extremidade-5' (5'-TR) e uma sequência de nucleotídeos de repetição extremidade-3' (3'-TR), de preferência, o 5'-TR é uma sequência de nucleotídeos de repetição terminal invertida em 5' (5'-ITR) e o 3'-TR é uma sequência de nucleotídeos de repetição de terminal invertido em 3' (3'- ITR).

[0043] Em uma concretização ainda preferida, o primeiro vetor, o segundo vetor e o terceiro vetor compreendem ainda uma sequência de nucleotídeos de sinal de poliadenilação.

[0044] Em uma concretização ainda preferida, a sequência de codificação é dividida na primeira parte, na segunda parte e, opcionalmente, na terceira parte, em uma posição que consiste em um aminoácido nucleófilo que não cai dentro de um domínio estrutural ou de um domínio funcional do produto de proteína codificado, em que o aminoácido nucleófilo é selecionado de serina, treonina ou cisteína.

[0045] De preferência, pelo menos um do primeiro vetor, o segundo vetor e o terceiro vetor compreendem ainda pelo menos um intensificador ou sequência de nucleotídeos reguladora, operacionalmente ligada à sequência de codificação.

[0046] O intensificador preferido ou a sequência de nucleotídeos reguladora são o intron quimérico de IgG de 0- globina, o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota. Opcionalmente, pelo menos um dentre o primeiro vetor, o segundo vetor e o terceiro vetor compreende ainda pelo menos um sinal de degradação para diminuir a estabilidade da proteína inteína reconstituída.

[0047] De preferência, o referido sinal de degradação é um degron CL1 ou um degron PB29. Mais preferencialmente, o referido sinal de degradação é ecDHFR ou um fragmento do mesmo, preferencialmente o sinal de degradação ecDHFR é uma variante DHFR que funciona como degron interno conforme descrito neste documento. Mais preferencialmente, o fragmento retém a propriedade de degradação de ecDHFR, de preferência, a propriedade de um

DHFR variante que funciona como degron interno, de preferência o fragmento é miniecDHFR em que o mini ecDHFR é uma variante que funciona como degron interno.

[0048] De preferência, a sequência de codificação codifica uma proteína capaz de corrigir um estado ou distúrbio patológico, de preferência, o distúrbio é uma degeneração retinal, um distúrbio metabólico, um distúrbio do sangue, um distúrbio neurodegenerativo, perda auditiva, canalopatia, doença pulmonar, miopatia, doença cardíaca, muscular distrofia.

[0049] Ainda preferencialmente, a sequência de codificação codifica uma proteína capaz de corrigir um estado patológico ou distúrbio, de preferência o distúrbio é uma degeneração retinal, de preferência a degeneração retinal é herdada, de preferência, a patologia ou doença é selecionada a partir do grupo que consiste em: retinite pigmentosa (RP), Amaurose congênita de Leber (LCA), doença de Stargardt (STGD), doença de Usher (USH), síndrome de Alstrom, cegueira noturna estacionária congênita (CSNB), distrofia macular, distrofia macular oculta, uma doença causada por uma mutação no gene ABCA4. Mais preferencialmente, a sequência de codificação é a sequência de codificação de um gene selecionado do grupo que consiste em: ABCA4, MY07A, CEP290, CDH23, EYS, PCDH15, CACNA1, SNRNP200, RP1, PRPF8, RP1L1, ALMS1, USH2A, GPR98, HMCN1 ou um fragmento do mesmo ou um ortólogo do mesmo ou um minigene do mesmo com uma sequência de codificação superior a 5 kb de comprimento, ou seja, um fragmento de gene mínimo que inclui um ou mais éxons e os elementos reguladores necessários para o gene se expressar da mesma forma que um gene de tipo selvagem fragmento.

[0050] No entanto, de preferência, a sequência de codificação codifica uma proteína capaz de corrigir distrofia muscular, como distrofia muscular de Duchenne, fibrose cística, hemofilia A, doença de Wilson, fenilcetonúria, disferlinopatias, síndrome de Rett, doença renal policística, doença de Niemann-Pick tipo C, doença de Huntington.

[0051] Mais preferencialmente, a sequência de codificação é a sequência de codificação de um gene selecionado do grupo que consiste em: ABCA4, MY07A, CEP290, CDH23, EYS, PCDH15, CACNA1, SNRNP200, RP1, PRPF8, RP1L1, ALMS1, USH2A, GPR98, HMCN1 ou um fragmento do mesmo ou um ortólogo do mesmo ou um minigene do mesmo com uma sequência de codificação que excede 5 kb de comprimento, isto é, um fragmento de gene mínimo que inclui um ou mais e as regiões de controle necessárias para o gene se expressar da mesma maneira que um fragmento de gene de tipo selvagem.

[0052] Ainda preferencialmente, a sequência de codificação é a sequência de codificação de um gene selecionado a partir do grupo que consiste em: DMD, CFTR, F8, ATP7B, PAH, DYSF, MECP2, PKD, NPC1, HTT ou um fragmento deste ou um ortólogo ou um minigene do mesmo com uma sequência de codificação superior a 5 kb em comprimento, ou seja, um fragmento de gene mínimo que inclui um ou mais e os elementos reguladores necessários para o gene se expressar da mesma maneira que um fragmento de gene de tipo selvagem.

[0053] Em uma concretização particularmente preferida da invenção, a sequência de codificação codifica o gene ABCA4. De preferência, a referida sequência de codificação é dividida em um nucleotídeo correspondente a aa Cysll50, Serll68, Ser 1090 da referida proteína ABCA4, e uma inteína dividida é inserida no ponto de divisão.

[0054] Em uma outra concretização preferida, a sequência de codificação codifica o gene CEP290. De preferência, a referida sequência de codificação é dividida em um nucleotídeo correspondente a aa Cysl076; Serl275. Mais preferencialmente, a referida sequência de codificação é dividida numa sequência de nucleótidos correspondente aos aa Cys 929 e 1474; Ser 453 e Cys 1474 da referida proteína CEP290, e duas inteínas divididas são inseridas nos pontos de divisão.

[0055] EGFP - SEQ ID No. 15

[0056] O primeiro aminoácido da c-exteína é destacado dentro da sequência Split Cys.71 (negrito).

[0057] ABCA4 – SEQ ID NO: 16

[0058] O primeiro aminoácido da c-exteína é destacado na sequência. Split setl Cys.1150 (negrito) Split set2 Ser.1168 (sublinhado) Split set3 Ser.1090 (itálico)

[0059] CEP290 SEQ ID No. 17

[0060] O primeiro aminoácido da c-exteína é destacado na sequência. Split setl Cys.1076 (negrito) Split set 2-3 Ser.1275 (sublinhado) Split Set4 Cys.929 e Cys.l474 (itálico) Split Set5 Ser.453 e Cvs.1474 (sublinhado duplo)

[0061] F8 SEQ ID No. 18

[0062] O primeiro aminoácido da c-exteína é destacado na sequência. Split setl Cys.1312 (sublinhado) set Split set2 Ser.984 (negrito)

[0063] ecDHFR SEQ ID No. 19

[0064] mini ecDHFR SEQ ID No. 20

[0065] Em uma concretização preferida, o sistema de vetor da invenção compreende: a) um primeiro vetor compreendendo na direção 5'-3 ': - uma sequência de repetição terminal invertida 5' (5'- ITR); - uma sequência promotora; - uma porção da extremidade 5' de uma sequência de codificação (CDS1), a referida porção da extremidade 5' estando operacionalmente ligada a e sob o controle do referido promotor; - uma primeira sequência de nucleotídeos inteína que codifica para uma N-inteína; e - uma sequência de repetição terminal invertida 3' (3'- ITR); e b) um segundo vetor compreendendo na direção 5'-3 ': - uma sequência de repetição terminal invertida 5' (5'-

ITR); - uma sequência promotora; - uma segunda sequência de nucleotídeos inteína que codifica para uma C-inteína; - uma porção extremidade 3' da sequência de codificação (CDS2); e - uma sequência de repetição terminal invertida 3' (3'- ITR); ou compreende: a') um primeiro vetor compreendendo na direção 5'-3': - uma sequência de repetição terminal invertida 5' (5'- ITR); - uma sequência promotora; - uma porção da extremidade 5' de uma sequência de codificação (CDS1'), a referida porção da extremidade 5 'estando operacionalmente ligada a e sob o controle do referido promotor; - uma primeira sequência de nucleotídeos inteína que codifica para uma primeira N-inteína; e - uma sequência de repetição terminal invertida 3' (3'- ITR); e b') um segundo vetor compreendendo na direção 5'-3': - uma sequência de repetição terminal invertida 5' (5'- ITR); - uma sequência promotora; - uma segunda sequência de nucleotídeos inteína que codifica para uma primeira C-inteína; - a segunda parte da sequência de codificação (CDS2'); e

- uma terceira sequência de nucleotídeos inteína que codifica para uma segunda N-inteína; - uma sequência de repetição terminal invertida 3' (3'- ITR); e c') um terceiro vetor compreendendo na direção 5'-3': - uma sequência de repetição terminal invertida 5' (5'- ITR); - uma sequência promotora; - uma quarta sequência de nucleotídeos inteína que codifica uma segunda C-inteína; - a terceira porção da sequência de codificação (CDS3 '); e - uma sequência de repetição terminal invertida 3 '(3'- ITR).

[0066] De preferência, o referido primeiro, segundo e terceiro vetor são independentemente um vetor viral, de preferência um vetor adenoviral ou vetor adeno-associado viral (AAV), de preferência, os referidos primeiro, segundo e terceiro vetores adeno-associados (AAV) virais são selecionados a partir do mesmo ou diferentes serotipos de AAV, preferencialmente o serótipo é selecionado a partir do serótipo 2, serótipo 8, serótipo 5, serótipo 7 ou serótipo 9, serótipo 7m8, serótipo shlO; sorotipo 2 (quad Y-F). A presente invenção também fornece uma célula hospedeira transformada com o sistema de vetor como definido acima.

[0067] De preferência, o sistema de vetor ou a célula hospedeira são para uso médico, de preferência, para uso em terapia gênica, de preferência, para uso no tratamento e / ou prevenção de uma patologia ou doença caracterizada por uma degeneração retinal, um distúrbio metabólico, um distúrbio do sangue, um distúrbio neurodegenerativo, perda auditiva, canalopatia, doença pulmonar, miopatia, doença cardíaca, distrofia muscular.

[0068] De preferência, a degeneração retinal é herdada, de preferência a patologia ou doença é selecionada a partir do grupo que consiste em: retinite pigmentosa (RP), amaurose congênita de Leber (LCA), doença de Stargardt (STGD), doença de Usher (USH), síndrome de Alstrom, cegueira congênita noturna estacionária (CSNB), distrofia macular, distrofia macular oculta, uma doença causada por uma mutação no gene ABCA4.

[0069] De preferência, o sistema de vetor ou a célula hospedeira é para uso na prevenção e / ou tratamento de distrofia muscular de Duchenne, fibrose cística, hemofilia A, doença de Wilson, Fenilcetonúria, disferlinopatias, síndrome de Rett, doença renal policística, Niemann-Pick tipo C, Huntington doença.

[0070] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo o sistema de vetor ou a célula hospedeira da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0071] A Fig. 1 - AAV inteína reconstitui EGFP in vitro e na retina de camundongo e porco em níveis que são maiores do que AAV duplo e até aqueles alcançados com um único AAV. (A) Representação esquemática de trans-splicing de proteína mediada por inteína de AAV. ITR: repetições terminais invertidas de AAV2; CDS: sequência de codificação; ·: Tag 3xflag; PolyA: sinal de poliadenilação. (B) Análise de Western blot (WB) de lisados de HEK293 transfectados com plasmídeos CMV-EGFP inteína de comprimento total ou AAV. pEGFP: plasmídeo EGFP de comprimento completo; pAAV l + ll: plasmídeos inteín AAV-EGFP l + ll; pAAV I: plasmídeo único de inteína AAV-EGFP I; pAAV II: plasmídeo único de inteína AAV-EGFP II; Neg: células não transfectadas.

As setas indicam tanto a proteína EGFP de comprimento total (EGFP), as metades N- e C-terminais da proteína EGFP (B e A, respectivamente) e a inteína reconstituída excisada da proteína EGFP de comprimento total (C). Os WB são representativos de n = 3 experimentos independentes. (C) Análise de WB de lisados de HEK293 infectados com vetores AAV2 / 2- CMV-EGFP simples, inteínos ou duplos.

Os WB são representativos de n = 5 experimentos independentes. (D) Criosseções retinais de camundongos C57BL / 6J injetados sub-retinalmente com vetores inteína AAV2 / 8-CMV- EGFP.

Barra de escala: 50 horas.

EPR: epitélio pigmentar da retina; OS: segmentos externos; ONL: camada nuclear externa. (E-F) Criosseções retinais de camundongos C57BL / 6J (E) ou porcos Large White (F) injetados sub-retinalmente com vetores AAV2 / 8-GRK1-EGFP simples, inteína ou duplos.

Barra de escala: 50 pm (E); 200 pm (F). OS: segmento externo; ONL: camada nuclear externa. (G) Análise de fluorescência de organoides retinais infectados com vetores AAV2 / 2-GRKl-EGFP-inteína em 293 dias de cultura.

Barra de escala: 100 pm.

[0072] Fig. 2 - Otimização da inteína AAV permite a reconstituição apropriada das grandes proteínas ABCA4 e CEP290. (A-B) Análise de Western blot (WB) de lisados de HEK293 transfectados com diferentes conjuntos de plasmídeos AAV- shCMV-ABCA4 ou -CEP290 inteína (conjunto 1 e conjunto 5, respectivamente). Uma representação esquemática dos vários conjuntos usados é ilustrada na Fig. 16. Os WB são representativos de n = 3 experimentos independentes. (C-D) Imagens representativas da análise de imunofluorescência de células HeLa transfectadas com plasmídeos AAV-shCMV-ABCA4 (C) ou AAV-shCMV-CEP290 (D) inteína. pABCA4 (C) ou pCEP290 (D): plasmídeo incluindo a cassete de expressão de comprimento total; pAAV inteína: plasmídeos AAV-inteína (Conjunto 1 em C ou Conjunto 5 em D); l + ll + lll: plasmídeos AAV l + ll + lll inteína; l + ll: plasmídeos AAV l + ll inteína; l + lll: plasmídeos AAV l + lll inteína; ll + lll: plasmídeos AAV ll + lll inteína; I: único plasmídeo inteína de AAV I; II: plasmídeo inteína AAV II único; III: único plasmídeo inteína AAV III; Neg: células não transfectadas. As células foram coradas para 3xFLAG e VAP-B (marcador de retículo endoplasmático) e TGN46 (marcador de rede Trans-Golgi) em C, ou tubulina acetilada (marcador de microtúbulos) em D. As setas brancas apontam para as células mostradas em maior ampliação na Fig. 18

[0073] Fig. 3 - A inteína AAV reconstitui as proteínas ABCA4 e CEP290 grandes de forma mais eficiente do que os vetores AAV duplos. Análise de Western blot (WB) de lisados de células

HEK293 infectadas com vetores AAV2 / 2-shCMV-ABCA4 (A) ou - CEP290 (B) duplos ou inteína. AAV inteína: AAV-ABCA4 (conjunto 1, A) ou -CEP290 (conjunto 5, B) vetores inteína; l + ll + lll: AAV l + ll +111 vetores inteína; l + ll: vetores inteína AAV l + ll; l + lll: vetores inteína AAV l + lll; ll + lll: vetores inteína AAV ll + lll; I: único vetor inteína AAV I; II: único vetor inteína AAV II; III: único vetor inteína AAV III; AAV duplo: vetores AAV duplos; Neg: vetores AAV-EGFP. (A) As setas indicam a proteína ABCA4 de comprimento total e A: produto de proteína derivado de AAV I; B: produto proteico derivado de AAV II. * produto de proteína com uma modificação pós-tradução potencialmente diferente. (B) As setas indicam a proteína CEP290 de comprimento total e A: produto de proteína derivado de AAV II + III; B: produto proteico derivado de AAV l + ll; C: produto proteico derivado de AAV II; D: produto proteico derivado de AAV III; E: produto de proteína derivado de AAV I. Os WB são representativos de n = 3 experimentos independentes

[0074] Fig. 4 - A inteína AAV reconstitui proteínas grandes em fotorreceptores de camundongo, porco e humanos a níveis terapêuticos. (A-C) Análise de Western blot (WB) de lisados de retina de camundongos do tipo selvagem (A, B) ou de porcos brancos grandes (C) injetados com AAV2 / 8-GRK1-ABCA4 (A, C) ou - Vetores CEP290 (B) (conjunto 1 e conjunto 5, respectivamente). AAV inteína: vectores AAV inteína; AAV duplo: vetores AAV duplos; Neg: vetores AAV-EGFP ou PBS. (D) Análise de WB de lisados de organóides retinais 3D derivados de iPSCs humanos infectados com vetores inteína AAV2 / 2-GRK1-ABCA4. AAV inteína: vectores AAV-ABCA4 inteína; Neg: organóides não infectados; - / -: organóides derivados de pacientes STGD1. (A, C, D) As setas indicam a proteína ABCA4 de comprimento total (ABCA4) e A: produto de proteína derivado de AAV I; B: produto proteico derivado de AAV II. * produto de proteína com uma modificação pós-tradução potencialmente diferente. (B) As setas indicam a proteína CEP290 de comprimento total (CEP290); A: produto proteico derivado de AAV II + III e D: produto proteico derivado de AAV III.

[0075] Fig. 5 - A administração sub-retiniana de AAV inteína melhora o fenótipo retinal de modelos de camundongos de degenerações retinais hereditárias. (A) Quantificação da área média ocupada pela lipofuscina no EPR de camundongos Abca ^ tratados com inteína AAV. Cada ponto representa o valor médio medido para cada olho. O valor médio da área de lipofuscina para cada grupo é indicado no gráfico. + / + ou +/- ·. controle injetado Abca4 <+ / +> ou <+ /> olhos (PBS); - / -: olhos de Abca ^ injetados com controle negativo (AAV I ABCA4 ou AAV II ABCA4 ou PBS); - / - AAV inteína: olhos Abca ^ injetados com vetores inteína AAV (conjunto 1). * ANOVA valor de p <0,05; *** Valor de ANOVA p <0,001. (B) Imagens representativas de seções retinianas de camundongos de tipo selvagem não injetados e rdl6 injetados sub-retinalmente com vetores inteína AAV2 / 8-GRK1-CEP290 (AAV inteína, conjunto 5) ou injetados com controles negativos (Neg; ou seja, AAV l + ll ou AAV II + III ou PBS). Barra de escala: 25 miti. A espessura do ONL medida em cada imagem é indicada pela linha preta vertical. EPR: epitélio pigmentar da retina; ONL: camada nuclear externa; INL: camada nuclear interna; GCL: camada de células ganglionares. (C) Imagens representativas de olhos de camundongos de tipo selvagem não injetados e rdl6 injetados sub- retinalmente com vetores inteína AAV2 / 8-GRK1-CEP290 (inteína AAV, conjunto 5) ou injetados com controles negativos (Neg; ie AAV l + ll ou AAV ll + lll ou PBS). Círculos brancos definem as pupilas.

[0076] Fig. 6 - Representação esquemática da reconstituição mediada por trans-splicing de proteína de uma grande proteína A sequência de codificação (CDS) de um grande gene é dividida em duas metades (5' e 3'), flanqueada pelas repetições terminais invertidas (ITR), que são embaladas separadamente em dois capsídeos de AAV. Após a co-transdução da mesma célula, diferentes mecanismos são explorados para reconstituir a expressão da proteína de comprimento total por meio da união das duas metades no nível da proteína. O vetor 5 'inclui o 5' CDS, a 5'inteína (n-inteína) e o degron, enquanto o vetor 3'inclui o 3'CDS e a 3'inteína (c-inteína); ambos os vetores incluem o promotor e o poliA. O emparelhamento dos dois meios polipeptídeos é mediado por meio do auto-reconhecimento de inteínas; a auto-excisão subsequente de inteína da proteína hospedeira resulta na reconstituição de proteína de comprimento total. O degron, agora incorporado à inteína extirpada, é rapidamente ubiquitinado e degradado pelo proteassoma.

[0077] Fig. 7 - Expressão de EGFP in vitro de vetores inteína de AAV com e sem sinal de degradação. Análise de Western blot (WB) de lisados de células HEK293 transfectadas com plasmídeos inteína de AAV contendo ecDHFR (+) ou não (-). As setas indicam a proteína EGFP de comprimento total (EGFP), a inteína excisada contendo o degron (DnaE + ecDHFR) ou não (DnaE).

[0078] Fig. 8 - Expressão de ABCA4 in vitro de vetores inteína de AAV com e sem sinal de degradação. Análise de Western blot (WB) de lisados de células HEK293 transfectadas com plasmídeos inteína de AAV contendo ecDHFR (+) ou não (-). As setas indicam a proteína ABCA4 de comprimento total (ABCA4), a inteína excisada contendo o degron (DnaE + ecDHFR) ou não (DnaE).

[0079] Fig. 9 - A expressão de Inteína DnaE-ecDHFR é dependente de TMP. Análise de Western blot (WB) de lisados de células HEK293 transfectadas com plasmídeos de inteína AAV_ABCA4 contendo ecDHFR (pAAV inteína + ecDHFR) ou não (pAAV inteína) e tratados com dose aumentada de trimetrofina (de 1 a 50 0m). As setas indicam a inteína excisada contendo o degron (DnaE + ecDHFR) ou não (DnaE).

[0080] Fig. 10 – A Expressão de EGFP in vitro de vetores inteína de AAV com e sem sinal de degradação. Análise de Western blot (WB) de lisados de células HEK293 transfectadas com plasmídeos inteína AAV contendo mini ecDHFR (+) ou não (-). As setas indicam a proteína EGFP de comprimento total (EGFP), a inteína excisada contendo o degron (DnaE + mini ecDHFR) ou não (DnaE).

[0081] Fig. 11. Expressão de ABCA4 in vitro de vetores inteína de AAV com e sem sinal de degradação. Análise de Western blot (WB) de lisados de células HEK293 transfectadas com plasmídeos inteína AAV contendo mini ecDHFR (+) ou não (-). As setas indicam a proteína ABCA4 de comprimento total (ABCA4), a inteína excisada contendo o degron (DnaE + mini ecDHFR) ou não (DnaE).

[0082] Fig. 12 - Fluorescência de EGFP em células HEK293 transfectadas com AAV I + II, mas não com plasmídeos inteína de AAV I ou AAV II individuais. Análise de fluorescência de células HEK293 transfectadas com plasmídeos CMV-EGFP de comprimento total ou inteína. pEGFP: plasmídeo incluindo a cassete de expressão de EGFP de comprimento total; pAAV l + ll: plasmídeos de inteína AAV l + ll; pAAV I: plasmídeo único inteína de AAV I; pAAV II: plasmídeo único inteína de AAV II; Neg: células não transfectadas. Barra de escala: 100 pm.

[0083] Fig. 13 - Inteína em relação à proteína de comprimento total varia entre as espécies. Análise de Western blot (WB) de lisados de células HEK293 (A), camundongos C57BL / 6J (B) e retinas de porco brancas grandes (C) infectadas com vetores AAV-CMV-EGFP (A) ou AAV-GRK1-EGFPin (BC). AAV inteína: células infectadas (A) ou olhos injetados (B, C) com vetores inteína AAV; Neg: células não infectadas (A) ou olhos injetados com PBS (B, C). As setas indicam a proteína EGFP de comprimento total (EGFP) e a inteína excisada (DnaE).

[0084] Fig. 14 - Caracterização de organoides retinais 3D derivados de iPSCs humanos. (A) Análise de microscopia de luz de organoides da retina em 183 dias de cultura. (B) Análise de imunofluorescência com anticorpos direcionados a marcadores fotorreceptores maduros. Barra de escala: 100 pm. (C) Análise de fluorescência de organoides retinais infectados com os vetores AAV2 / 2-CMV-EGFP e AAV2 / 2-IRBP- DsRed. Barra de escala: 100 mih. (D) Estruturas semelhantes a segmentos externos foram observadas que se projetam da superfície de organoides da retina em 230 dias de cultura. A inserção mostra a presença de estruturas semelhantes a segmentos externos (OS) com arquitetura radial. NR: retina neural; EPR: epitélio pigmentar da retina. (E) A análise de microscopia eletrônica de varredura revela a presença de segmentos internos (IS), cílios conectores (CC) e estruturas semelhantes ao segmento externo (OS). Barra de escala: 16h. (F) A análise de microscopia eletrônica revela a presença da membrana limitante externa (*), centríolo (C), corpos basais (BB), cílios conectores (CC) e esboços de segmentos externos (OS). A inserção mostra a presença de discos membranosos desorganizados no OS. Barra de escala: 500 nm. D: dias de cultura.

[0085] Fig. 15 - Baixo inteína em relação à proteína de comprimento total em organoides retinais 3D humanos.

Análise de Western blot (WB) de lisados de organóides retinais 3D derivados de iPSCs humanos infectados com vetores inteína AAV2 / 2-GRK1-EGFP. AAV inteína: vectores AAV inteína; Neg: organóides não infectados. As setas indicam a proteína EGFP de comprimento total (EGFP) e a inteína excisada (DnaE).

[0086] Fig. 16 - Representação esquemática dos vários conjuntos de inteína AAV-ABCA4 e -CEP290. (A) Construções AAV-ABCA4-inteína. (Conjunto 1-2, conforme exemplificado pela construção) n-DnaE: n-inteína de DnaE de Npu; c-DnaE: c-inteína de DnaE de Npu; (Conjunto 3) n-mDnaE: n-inteína de DnaE mutado de Npu (mNpu); c-mDnaE: c- inteína de DnaE de mNpu. (B) Construções AAV-CEP290-inteína. (Conjunto 1) n- DnaE: n-inteína de DnaE de Npu; c-DnaE: c-inteína de DnaE de Npu; shPolyA: poliA sintético curto; (Conjunto 2) n-DnaE: n- inteína de DnaE de mNpu; c-DnaE: c-inteína de DnaE de mNpu; (Conjunto 3) n-mDnaE: n-inteína de DnaE de mNpu; c-mDnaE: c- inteína de DnaE de mNpu; (Conjunto 4) n-DnaE: n-inteína de DnaE de Npu; c- DnaE: c-inteína de DnaE de Npu entre AAV I e AAV II; n-DnaB: N-inteína de DnaB de Rhodothermus marinus (Rma); c-DnaB: c-inteína de DnaE de Rma entre AAV II e AAV III; wpre: Elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota. (Conjunto 5) n-mDnaE: n-inteína de DnaE de mNpu; c-mDnaE: c-inteína de DnaE de mNpu entre AAV l 'e AAV II; n-DnaB: n-inteína de DnaB de Rhodothermus marinus (Rma); c-DnaB: c-inteína de DnaE de Rma entre AAV II e AAV III; wpre: Elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota. (A-B) ITR: repetições terminais invertidas de AAV2; Tag 3xflag; Promotor: CMV curto para as experiências in vitro e o promotor do receptor acoplado à proteína G humana (GRK1) para as experiências in vivo; PolyA: sinal de poliadenilação do vírus símio 40 (para ABCA4, A) e sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (para CEP290, B). Os aminoácidos nos pontos de divisão de cada conjunto estão representados na figura. Pesos moleculares de proteínas previstos são descritos abaixo de cada vetor AAV.

[0087] Fig. 17 - Combinação de N- e C-inteínas heterólogas não resulta na reconstituição da proteína EGFP detectável in vitro. Análise de fluorescência de células HEK293 transfectadas com plasmídeos AAV-CMV-EGFP de comprimento total ou inteína. N + C-DnaE: AAV l + ll fundido a inteínas de DnaE; N + C-DnaB: AAV l + ll fundido a inteínas de DnaB; N + C-mDnaE: AAV l + ll fundido para separar inteínas de mDnaE; N-DnaE + C-DnaB: AAV I fundido a n-inteína de DnaE e AAV II fundido a c-inteína de DnaB; N-DnaB + C-DnaE: AAV I fundido a n-inteína de DnaB e AAV II fundido a c-inteína de DnaE; N-mDnaE + C-DnaB: AAV I fundido a n-inteína de mDnaE e AAV II fundido a c-inteína de DnaB; N-DnaB + C-mDnaE: AAV I fundido a n-inteína de DnaB e AAV II fundido a c-inteína de mDnaE; pEGFP: plasmídeo incluindo a cassete de expressão de EGFP de comprimento total; Neg: células não transfectadas. Barra de escala: 100 pm.

[0088] Fig. 18 - CEP290 alinha-se ao longo dos microtúbulos. Ampliação de células individuais da Figura 2D. Análise de imunofluorescência de células HeLa transfectadas com um plasmídeo incluindo a cassete de expressão CEP290 de comprimento total (pCEP290) ou com plasmídeos inteína CEP290 (conjunto 5, pAAV l + ll + lll). As células foram coradas para 3xFLAG e tubulina acetilada (marcador de microtúbulos). Barra de escala: 50 horas. Análise Western blot (WB) de lisados de células HEK293 transfectadas com plasmídeos inteiros ou AAV inteína que codificam para CMV-ABCA4 curto (conjunto 1, A) ou -CEP290 (conjunto 5, B). (A) pABCA4: cassete de expressão ABCA4 de comprimento total; Conjunto 1: plasmídeos ABCA4 (Cys.ll50) -inteína. (B) pCEP290: cassete de expressão CEP290 de comprimento completo; Conjunto 5: CEP290 (Ser.453 e Cys.1474) - plasmídeos inteína. Neg: plasmídeos AAV EGFP. Os WB são representativos de n = 3 experimentos independentes.

[0089] Fig. 19 - Transfecção de plasmídeos inteína de AAV reconstitui as proteínas ABCA4 e CEP290 em quantidades mais baixas do que a transfecção de plasmídeos únicos com cassetes de expressão de comprimento total Análise de Western blot (WB) de lisados de células HEK293 transfectadas com plasmídeos inteiros ou inteína AAV que codificam para CMV-ABCA4 curto (A) ou -CEP290 (B). (A) pABCA4: cassete de expressão ABCA4 de comprimento total; Conjunto 1: plasmídeos ABCA4 (Cys.ll50) -inteína. (B) pCEP290: cassete de expressão CEP290 de comprimento completo; Conjunto 5: plasmídeos CEP290 (Ser.453 e Cys.l474) -inteína. Neg: plasmídeos AAV EGFP. Os WB são representativos de n = 3 experimentos independentes.

[0090] Fig. 20 A entrega sub-retinal de vetores inteína AAV resulta na expressão de ABCA4 na retina de camundongo. Análise de Western blot (WB) de lisados retinais de camundongos de tipo selvagem injetados com vetores AAV2 / 8- GRK1-ABCA4 duplos ou inteína (conjunto 1). AAV inteína: vectores AAV inteína; AAV duplo: vetores AAV duplos; Neg: vetores AAV-EGFP.

[0091] Fig. 21 - Inteína AAV reconstitui cerca de 10% de Abca4 endógeno.

[0092] Análise de Western blot (WB) de lisados retinais de camundongos Abca4 <+ / ~> ou Abca4 <~ / ~> injetados com vetores inteína AAV2 / 8-GRK1-ABCA4 (conjunto 1). mAbca4: Abca4 <+ / ~> retina; AAV inteína: retina injetada com AAV inteína; Neg: retina não injetada. Os lisados retinais de Abca4 +/- carregados no Gel # 2 e # 3 são os mesmos. A porcentagem da expressão de AAV inteína ABCA4 em relação ao endógeno é representada abaixo de cada pista.

[0093] Fig. 22 - Inteína AAV reconstitui a proteína ABCA4 de comprimento total em organoides retinais humanos.

[0094] Análise de Western blot de lisados de organóides retinais 3D derivados de iPSCs humanos infectados com vetores inteína AAV2 / 2-GRK1-ABCA4 (conjunto 1). AAV inteína: vectores AAV inteína; Neg: organoides não infectados. - / -: organoides derivados de pacientes STGD1; + / +: organoides derivados de doadores saudáveis.

[0095] Fig. 23 A administração sub-retiniana de vetores AAV inteína resulta na redução do acúmulo de lipofuscina em camundongos Abca4-/-.

[0096] Imagens representativas da análise de microscopia eletrônica de transmissão mostrando grânulos de lipofuscina no EPR de camundongos do tipo selvagem e Abca4-/- injetados com controle negativo (Neg) ou vetores inteína AAV (conjunto 1). As setas brancas indicam grânulos de lipofuscina; M: mitocôndrias.

[0097] Fig. 24 - A entrega sub-retiniana de vetores inteína de AAV em camundongos não modifica a espessura de ONL.

[0098] Análise de tomograma de coerência óptica de domínio espectral de olhos de camundongos C57BL / 6J injetados sub-retinalmente com vetores inteína AAV, vetores AAV não relacionados (AAV neg) ou PBS. As barras pretas representam olhos 6 meses após a injeção com vetores inteína AAV-ABCA4 (conjunto 1) e seus controles correspondentes; as barras brancas representam olhos 4,5 meses após a injeção com vetores inteína AAV-CEP290 (conjunto 5) e seus controles correspondentes. Os dados são representados como média ± s.e. Os valores médios são indicados acima da barra correspondente.

[0099] Fig. 25. - Os vetores inteína AAV podem entregar o F8 de tipo selvagem de comprimento total A) Representação esquemática de um único AAV B-domínio deletado variante 3 Fator VIII (F8-V3) e vetores inteína AAV F8. A sequência de codificação do gene F8 é dividida em duas metades (5' e 3' de F8), flanqueada pelas repetições terminais invertidas (ITR), que são embaladas separadamente em duas cápsides de AAV. O vetor 5 'inclui a inteína 5' de F8 e 5'(n-DnaE), enquanto o vetor 3' inclui a inteína 3' de F8 e 3' (c-DnaE); ambos os vetores incluem o promotor HLP e o poliA sintético. V3, variante 3; SS, sequência de sinal. B) A inteína de F8 é devidamente empacotada em capsídeos de AAV com genomas de vetor definidos, ao contrário do AAV F8-V3 de tamanho único. A análise de Southern blot da integridade do genoma dos vetores com uma sonda específica para o promotor HLP mostrou produtos truncados no AAV F8-V3 de tamanho grande que não estavam presentes nos vetores inteína AAV F8. Neg, controle negativo. C) Os vetores inteína AAV F8 mostram ligeira correção do fenótipo de sangramento de camundongos knockout para hemofilia A em 8 semanas após a injeção. A análise de aPTT de amostras de plasma sanguíneo de camundongos knockout para hemofilia A 8 semanas após a injeção com AAV F8 inteína (ambos os pontos de divisão) mostram uma leve correção fenotípica em comparação com o grupo de controle injetado com PBS. aPTT, tempo de tromboplastina parcial ativada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Terapia Gênica

[00100] Durante a última década, a terapia gênica foi aplicada ao tratamento de doenças em centenas de ensaios clínicos. Várias ferramentas foram desenvolvidas para administrar genes às células humanas; entre eles, vírus geneticamente modificados, incluindo vírus adeno-associados, estão atualmente entre as ferramentas mais populares para entrega de genes.

[00101] A maioria dos sistemas contém vetores que são capazes de acomodar genes de interesse e células auxiliares que podem fornecer as proteínas estruturais virais e enzimas para permitir a geração de partículas virais infecciosas contendo vetores.

[00102] O vírus adeno-associado é uma família de vírus que difere na sequência de nucleotídeos e aminoácidos, estrutura do genoma, patogenicidade e variedade de hospedeiros. Essa diversidade oferece oportunidades de usar vírus com diferentes características biológicas para desenvolver diferentes aplicações terapêuticas.

[00103] Como acontece com qualquer ferramenta de entrega, a eficiência, a capacidade de direcionar determinado tecido ou tipo de célula, a expressão do gene de interesse e a segurança dos sistemas baseados em vírus adeno- associados são importantes para a aplicação bem-sucedida da terapia gênica. Esforços significativos foram dedicados a essas áreas de pesquisa nos últimos anos. Várias modificações foram feitas em vetores baseados em vírus adeno-associados e células auxiliares para alterar a expressão do gene, entrega de alvos, melhorar os títulos virais e aumentar a segurança.

[00104] A presente invenção representa uma melhoria neste processo de projeto, na medida em que atua para entregar eficientemente genes de interesse com um tamanho que excede a carga limite para um único vetor baseado em vírus adeno-associado.

[00105] Os vírus são ferramentas lógicas para admisntração de genes. Eles se replicam dentro das células e, portanto, desenvolveram mecanismos para entrar nas células e usar a maquinaria celular para expressar seus genes. O conceito de entrega de genes baseada em vírus é manipular o vírus para que ele possa expressar o gene de interesse. Dependendo da aplicação específica e do tipo de vírus, a maioria dos vetores virais contém mutações que dificultam sua capacidade de se replicar livremente como vírus de tipo selvagem no hospedeiro.

[00106] Os vírus de várias famílias diferentes foram modificados para gerar vetores virais para entrega de genes. Esses vírus incluem retrovírus, lentivírus, adenovírus, vírus adeno-associados, vírus herpes simplex, picornavírus e alfavírus.

[00107] A presente invenção emprega preferencialmente vírus adenoassociados. Portanto, os vetores baseados em vírus para entrega de genes incluem, sem limitações, vetores adenovirais, vetores virais adeno-associados (AAV), vetores AAV pseudotipados, vetores virais de herpes, vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores baculovirais.

[00108] Um vetor baseado em vírus adeno-associado ideal para entrega de genes deve ser eficiente, específico para células, regulado e seguro. A eficiência da administração é importante porque pode determinar a eficácia da terapia. Os esforços atuais têm como objetivo atingir a infecção específica do tipo de célula e a expressão gênica com vetores virais adeno-associados. Além disso, vetores virais adenoassociados estão sendo desenvolvidos para regular a expressão do gene de interesse, uma vez que a terapia pode requerer expressão regulada ou de longa duração. A segurança é uma questão importante para a entrega de genes virais porque a maioria dos vírus são patógenos ou têm potencial patogênico.

[00109] O vírus adeno-associado (AAV) é um pequeno vírus que infecta humanos e algumas outras espécies de primatas. Atualmente, não se sabe que o AAV causa doenças e, consequentemente, o vírus causa uma resposta imunológica muito moderada. Os vetores de terapia gênica usando AAV podem infectar células em divisão e quiescentes e persistir em um estado extracromossômico sem se integrar ao genoma da célula hospedeira. Essas características tornam o AAV um candidato muito atraente para a criação de vetores virais para terapia gênica e para a criação de modelos isogênicos de doenças humanas.

[00110] O AAV do tipo selvagem atraiu considerável interesse de pesquisadores de terapia gênica devido a uma série de características. A principal delas é a aparente falta de patogenicidade do vírus. Ele também pode infectar células que não se dividem e tem a capacidade de se integrar de forma estável ao genoma da célula hospedeira em um local específico (designado AAVS1) no cromossomo humano 19. A característica torna-o um pouco mais previsível do que os retrovírus, que apresentam a ameaça de uma inserção aleatória e de mutagênese, que às vezes é seguida pelo desenvolvimento de um câncer. O genoma de AAV se integra com mais frequência ao site mencionado, enquanto as incorporações aleatórias no genoma ocorrem com uma frequência desprezível. O desenvolvimento de AAVs como vetores de terapia gênica, no entanto, eliminou essa capacidade integrativa pela remoção do rep e do cap do DNA do vetor. O gene desejado juntamente com um promotor para conduzir a transcrição do gene é inserido entre as repetições terminais invertidas (ITR) que auxiliam na formação do concatâmero no núcleo após o DNA do vetor de fita simples ser convertido por complexos de polimerase de DNA da célula hospedeira em fita dupla DNA. Os vetores de terapia gênica baseados em AAV formam concatâmeros epissômicos no núcleo da célula hospedeira. Em células que não se dividem, esses concatemers permanecem intactos por toda a vida da célula hospedeira. Na divisão das células, o DNA de AAV é perdido através da divisão celular, uma vez que o DNA epissomal não é replicado junto com o DNA da célula hospedeira. A integração aleatória do DNA de AAV no genoma do hospedeiro é detectável, mas ocorre em frequência muito baixa. Os AAVs também apresentam imunogenicidade muito baixa, aparentemente restrita à geração de anticorpos neutralizantes, embora não induzam nenhuma resposta citotóxica claramente definida. Essa característica, juntamente com a capacidade de infectar células quiescentes, apresentam seu domínio sobre os adenovírus como vetores para a terapia gênica humana. Genoma, transcriptoma e proteoma de AAV

[00111] O genoma do AAV é construído de ácido desoxirribonucléico de fita simples (ssDNA), com detecção positiva ou negativa, que tem cerca de 4,7 quilobases de comprimento. O genoma compreende repetições terminais invertidas (ITRs) em ambas as extremidades da fita de DNA e duas estruturas de leitura aberta (ORFs): rep e cap. O primeiro é composto por quatro genes sobrepostos que codificam proteínas Rep necessárias para o ciclo de vida de AAV, e o último contém sequências de nucleotídeos sobrepostas de proteínas do capsídeo: VP1, VP2 e VP3, que interagem entre si para formar um capsídeo de uma simetria icosaédrica. Sequências ITR

[00112] As sequências Inverted Terminal Repeat (ITR) compreendem 145 bases cada. Elas foram chamadas assim por causa de sua simetria, que se mostrou necessária para a multiplicação eficiente do genoma de AAV. Outra propriedade dessas sequências é sua capacidade de formar um grampo de cabelo, o que contribui para o chamado auto-priming, que permite a síntese independente de primase da segunda fita de DNA. As ITRs também mostraram ser necessárias para a integração do DNA de AAV no genoma da célula hospedeira (19 cromossomo em humanos) e resgate dele, bem como para a encapsidação eficiente do DNA de AAV combinada com a geração de uma desoxirribonuclease totalmente montada -partículas de AAV resistentes.

[00113] Com relação à terapia gênica, os ITRs parecem ser as únicas sequências necessárias em cis ao lado do gene terapêutico: genes estruturais (cap) e de empacotamento (rep) podem ser entregues em trans. Com esta suposição, muitos métodos foram estabelecidos para a produção eficiente de vetores AAV recombinantes (rAAV) contendo um repórter ou gene terapêutico. No entanto, também foi publicado que as ITRs não são os únicos elementos necessários em cis para a replicação e encapsidação eficazes. Alguns grupos de pesquisa identificaram uma sequência designada por elemento dependente de Rep de ação cis (CARE) dentro da sequência de codificação do gene rep. CARE foi mostrado para aumentar a replicação e encapsidação quando presente em cis. Serotipos AAV

[00114] Até o momento, dezenas de diferentes variantes de AAV (sorotipos) foram identificadas e classificadas (60). Todos os sorotipos conhecidos podem infectar células de vários tipos de tecidos diversos. A especificidade do tecido é determinada pelo sorotipo do capsídeo e a pseudotipagem de vetores AAV para alterar sua faixa de tropismo provavelmente será importante para seu uso na terapia. Os vectores pseudotipados de AAV são aqueles que contêm o genoma de um serótipo de AAV na cápside de um segundo serótipo de AAV; por exemplo, um vetor AAV2 / 8 contém o capsídeo AAV8 e o genoma AAV 2 (61). Esses vetores também são conhecidos como vetores quiméricos SEROTIPO 2

[00115] O serotipo 2 (AAV2) foi o mais extensivamente examinado até agora. AAV2 apresenta tropismo natural para músculos esqueléticos, neurônios, células musculares lisas vasculares e hepatócitos. Três receptores celulares foram descritos para AAV2: heparan sulfato proteoglicano (HSPG), integrina qnb5 e receptor 1 do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR-1). O primeiro funciona como um receptor primário, enquanto os dois últimos têm uma atividade de co- receptor e permitem que AAV entre na célula por endocitose mediada por receptor. Os resultados deste estudo foram contestados por Qju, Handa, et al. O HSPG funciona como o receptor primário, embora sua abundância na matriz extracelular possa eliminar as partículas de AAV e prejudicar a eficiência da infecção.

[00116] Estudos mostraram que o sorotipo 2 do vírus (AAV-2) aparentemente mata as células cancerosas sem prejudicar as saudáveis. "Nossos resultados sugerem que o vírus adeno-associado tipo 2, que infecta a maioria da população, mas não tem efeitos nocivos conhecidos, mata vários tipos de células cancerosas, mas não tem efeito sobre as células saudáveis", disse Craig Meyers, professor de imunologia e microbiologia na Penn State College of Medicine, na Pensilvânia. Isso pode levar a um novo agente anticâncer.

OUTROS SEROTIPOS

[00117] Embora AAV2 seja o sorotipo mais popular em várias pesquisas baseadas em AAV, foi demonstrado que outros sorotipos podem ser mais eficazes como vetores de entrega de genes. Por exemplo, AAV6 parece muito melhor na infecção de células epiteliais das vias aéreas, AAV7 apresenta taxa de transdução muito alta de células musculares esqueléticas murinas (semelhante a AAV1 e AAV5), AAV8 é excelente na transdução de hepatócitos e fotorreceptores, AAV1 e 5 mostraram-se muito eficientes em entrega de genes às células endoteliais vasculares. No cérebro, a maioria dos sorotipos AAV mostra tropismo neuronal, enquanto AAV5 também traduz astrócitos. AAV6, um híbrido de AAV1 e AAV2, também mostra menor imunogenicidade do que AAV2.

[00118] Os serotipos podem diferir no que diz respeito aos receptores aos quais estão ligados. Por exemplo, a transdução de AAV4 e AAV5 pode ser inibida por ácidos siálicos solúveis (de forma diferente para cada um desses serotipos), e AAV5 mostrou entrar nas células através do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas. Variantes novas de AAV, como mutantes de tirosina quádruplos ou AAV 2 / 7m8, mostraram transduzir a retina externa do vítreo em modelos de animais pequenos (62, 63). Outro mutante de AAV denominado ShHIO, uma variante de AAV6 com tropismo glial melhorado após administração intravítrea (64). Um outro mutante de AAV com tropismo particularmente vantajoso para a retina é o AAV2 (quad Y-F) (65).

[00119] Os veículos de entrega de genes da presente invenção podem ser administrados a um paciente. A referida administração pode ser uma administração "in vivo" ou uma administração "ex vivo". Um trabalhador especializado seria capaz de determinar as taxas de dosagem apropriadas. O termo "administrado" inclui a entrega por técnicas virais ou não virais. Os mecanismos de entrega viral incluem, mas não estão limitados a vetores adenovirais, vetores virais adeno- associados (AAV), vetores virais de herpes, vetores retrovirais, vetores lentivirais e vetores baculovirais, etc, conforme descrito acima.

[00120] Os sistemas de distribuição não viral incluem transfecção de DNA, como eletroporação, transfecção mediada por lipídios, transfecção mediada por DNA compactado; lipossomas, imunolipossomas, lipofectina, anfifílicos faciais catiônicos (CFAs) e suas combinações. A entrega de um ou mais genes terapêuticos por um sistema de vetor de acordo com a presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros tratamentos ou componentes do tratamento. Composições Farmacêuticas

[00121] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica para o tratamento de um indivíduo por terapia gênica, em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do vetor / construção ou célula hospedeira da presente invenção compreendendo um ou mais transgenes terapêuticos e / ou diagnósticos administráveis (s) ou uma partícula viral produzida por ou obtida da mesma. A composição farmacêutica pode ser para uso humano ou animal. Normalmente, um médico determinará a dosagem real que será mais adequada para um sujeito individual e irá variar com a idade, peso e resposta do indivíduo em particular.

[00122] A composição pode compreender opcionalmente um transportador, diluente, excipiente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. A escolha do transportador, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser selecionada em relação à via de administração pretendida e à prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem compreender como - ou em adição ao - o transportador, excipiente ou diluente, qualquer ligante (s) adequado (s), lubrificante (s), agente (s) de suspensão, agente (s) de revestimento, agente (s) solubilizante (s) e outros agentes transportadores que podem auxiliar ou aumentar a entrada viral no local alvo (como, por exemplo, um sistema de distribuição de lipídios). Quando apropriado, as composições farmacêuticas podem ser administradas por qualquer um ou mais de: inalação, na forma de um supositório ou pessário, topicamente na forma de uma loção, solução, creme, unguento ou pó para polvilhar, pelo uso de um adesivo para a pele , por via oral na forma de comprimidos contendo excipientes, tais como amido ou lactose, ou em cápsulas ou óvulos, quer sozinhos ou em mistura com excipientes, ou na forma de elixires, soluções ou suspensões contendo agentes aromatizantes ou corantes; de preferência, podem ser injetados parentericamente, por exemplo intracavernosalmente, intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente. Para administração parentérica, as composições podem ser melhor utilizadas na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou monossacáridos suficientes para tornar a solução isotônica com o sangue. Para administração bucal ou sublingual, as composições podem ser administradas na forma de comprimidos ou pastilhas que podem ser formuladas de uma maneira convencional. Uma formulação preferida é aquela em que o sistema de vetor é administrado topicamente no saco conjuntival ou subconjuntivalmente, de preferência administrado de 1 a 10 vezes ao dia, de preferência por 1 dia a 6 meses, de preferência por 1 dia a 30 dias.

[00123] A administração preferida é a administração na câmara anterior, injeção intravítrea, injeção sub- retiniana, injeção parabulbar e / ou retrobulbar, injeção intraestromal da córnea.

[00124] De preferência, a composição farmacêutica da invenção é para uso ocular tópico, e, é, portanto, uma composição oftálmica.

[00125] O sistema de vetor, de acordo com a presente invenção, pode ser administrado por qualquer via conveniente, no entanto a via de administração preferida é topicamente na superfície ocular e especialmente topicamente na córnea. A rota ainda mais preferida é a instilação no saco conjuntival.

[00126] É um objetivo específico da presente invenção, o uso do sistema de vetor para a produção de uma composição oftálmica para ser administrada topicamente no olho para uso médico.

[00127] Mais geralmente, uma modalidade preferida da presente invenção é uma composição formulada para aplicação tópica em uma área local, superficial ou restrita do olho e / ou anexos do olho compreendendo o sistema de vetor opcionalmente em conjunto com um ou mais aditivos farmaceuticamente aceitáveis (como diluentes ou veículos).

[00128] Conforme usado neste relatório descritivo, os termos "veículo", "diluente", "transportador" e "aditivo" são intercambiáveis.

[00129] As composições oftálmicas da invenção podem estar na forma de solução, emulsão ou suspensão (colírio), pomada, gel, aerossol, névoa ou linimento em conjunto compreendendo um farmaceuticamente aceitável, tolerado aos olhos e compatível com o veículo oftálmico de princípio ativo.

[00130] Também dentro do âmbito da presente invenção estão vias particulares para administração oftálmica para libertação retardada, p. e., como inserções erodíveis oculares ou sistemas "reservatórios" de membrana polimérica a serem localizados no saco conjuntiva ou em lentes de contato. As composições oftálmicas da invenção podem ser administradas topicamente, por exemplo, a composição é distribuída e contacta diretamente o olho e / ou os anexos do olho.

[00131] A composição farmacêutica contendo pelo menos um sistema de vetor da presente invenção pode ser preparado por qualquer técnica convencional, e. como descrito em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editado por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19ª edição, Easton, Pa.

[00132] Em uma concretização, a composição é formulada de forma que seja um líquido, em que o sistema de vetor pode estar em solução ou em suspensão. A composição pode ser formulada em qualquer forma líquida adequada para aplicação tópica, como colírios, lágrimas artificiais, lavagens para os olhos ou adsorventes de lentes de contato compreendendo um transportador líquido, como um éter de celulose (por exemplo, metilcelulose).

[00133] De preferência, o líquido é um líquido aquoso. Além disso, é preferido que o líquido seja estéril. A esterilidade pode ser conferida por qualquer método convencional, por exemplo, filtração, irradiação ou aquecimento ou conduzindo o processo de fabricação em condições assépticas.

[00134] O líquido pode compreender um ou mais veículos lipofílicos.

[00135] Em uma concretização da presente invenção, a composição é formulada como uma pomada. De preferência, um transportador na pomada pode ser um transportador de vaselina.

[00136] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem, em geral, ser qualquer veículo farmaceuticamente aceitável usado, que deve ser selecionado de acordo com a formulação específica, via de administração pretendida, etc. Além disso, o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser qualquer aditivo aceito da "lista de ingredientes inativos" do FDA, que, por exemplo, está disponível no endereço da Internet: http://www.fda.gov/cder/drug/iig/default.htm.

[00137] Pelo menos um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um tampão. Para alguns fins, é frequentemente desejável que a composição compreenda um tampão, que seja capaz de tamponar uma solução a um pH na faixa de 5 a 9, por exemplo, pH 5 a 6, pH 6 a 8 ou pH 7 a 7,5. No entanto, em outras concretizações da invenção, a composição farmacêutica pode compreender nenhum tampão ou apenas quantidades micromolares de tampão. O tampão pode, por exemplo, ser selecionado a partir do grupo que consiste em tampão TRIS, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartarato, fosfato, citrato, borato, carbonato, glicinato, histidina, glicina, succinato e trietanolamina. Portanto, o tampão pode ser K2HP04, Na2HP04 ou citrato de sódio.

[00138] Em uma concretização preferida, o tampão é um tampão TRIS. O tampão TRIS é conhecido por vários outros nomes, por exemplo trometamina, incluindo trometamina USP, THAM, Trizma, Trisamina, Tris amino e trometamol. A designação TRIS cobre todas as designações acima mencionadas.

[00139] O tampão pode, além disso, por exemplo, ser selecionado a partir de tampões compatíveis com USP para uso parenteral, em particular, quando a formulação farmacêutica é para uso parenteral. Por exemplo, o tampão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácidos monobásicos, tais como acético, benzóico, glucônico, glicérico e láctico, ácidos dibásicos, tais como aconítico, adípico, ascórbico, carbônico, glutâmico, málico, succínico e tartárico, ácidos polibásicos, tais como como cítrico e fosfórico e bases como amônia, dietanolamina, glicina, trietanolamina e TRIS.

[00140] As composições podem conter conservantes, como timerosal, clorobutanol, cloreto de benzalcônio ou clorexidina, agentes tamponantes, como fosfatos, boratos, carbonatos e citratos e agentes espessantes, como polímeros de carboxivinil de alto peso molecular, como os vendidos sob o nome de Carbopol que é uma marca comercial da BF Goodrich Chemical Company, hidroximetilcelulose e álcool polivinílico, todos de acordo com o estado da técnica.

[00141] Em algumas concretizações da invenção, os aditivos farmaceuticamente aceitáveis compreendem um estabilizador. O estabilizador pode ser, por exemplo, um detergente, um aminoácido, um ácido graxo, um polímero, um álcool poli-hídrico, um íon metálico, um agente redutor, um agente quelante ou um antioxidante, no entanto, qualquer outro estabilizador adequado também pode ser usado com a presente invenção. Por exemplo, o estabilizador pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em poloxâmeros, Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-80, Brij, íons metálicos, aminoácidos, polietilenoglicol, Triton e ácido ascórbico. Além disso, o estabilizador pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em aminoácidos como glicina, alanina, arginina, leucina, ácido glutâmico e ácido aspártico, surfactantes como polissorbato 20, polissorbato 80 e poloxamer 407, ácidos graxos como fosfatidil colina etanolamina e acetiltriptofanato, polímeros como polietilenoglicol e polivinilpirrolidona, álcool poli- hídrico, como sorbitol, manitol, glicerina, sacarose, glicose, propilenoglicol, etilenoglicol, lactose e trealose, antioxidantes como ácido ascórbico, cisteína HCL, tioglicerol e tioglicerol, glutationa, agentes redutores como vários tióis, agentes quelantes como sais de EDTA, ácido glutâmico e ácido aspártico.

[00142] Os aditivos farmaceuticamente aceitáveis podem compreender um ou mais selecionados do grupo que consiste em sais isotônicos, sais hipertônicos, sais hipotônicos, tampões e estabilizadores.

[00143] Em concretizações preferidas, outros excipientes farmaceuticamente, tais como conservantes, estão presentes. Em uma concretização, o referido conservante é um parabeno, tal como, mas não se limitando a, para- hidroxibenzoato de metila ou para-hidroxibenzoato de propila.

[00144] Em algumas concretizações da invenção, os aditivos farmaceuticamente aceitáveis compreendem agentes mucolíticos (por exemplo, N-acetil cisteína), ácido hialurônico, ciclodextrina, petróleo.

[00145] Compostos exemplificativos que podem ser incorporados na composição farmacêutica da invenção para facilitar e agilizar a distribuição transdérmica de composições tópicas em tecidos oculares ou anexiais incluem, mas não estão limitados a, álcool (etanol, propanol e nonanol), álcool graxo (álcool laurílico), ácido graxo (ácido valérico, ácido capróico e ácido cáprico), éster de ácido graxo (miristato de isopropila e n-hexanoato de isopropila), éster alquílico (acetato de etila e acetato de butila), poliol (propilenoglicol, propanodiona e hexanotriol), sulfóxido (dimetilsulfóxido e decilmetilsulfóxido), amida (ureia, dimetilacetamida e derivados de pirrolidona), surfactante (lauril sulfato de sódio, brometo de cetiltrimetilamônio, polaxâmeros, spans, tweens, sais biliares e lecitina), terpeno (d-limoneno, alfa-8), cineol e mentona) e alcanona (N-heptano e N-nonano). Além disso, as composições administradas topicamente podem compreender agentes moduladores de moléculas de adesão de superfície, incluindo, mas não se limitando a, um antagonista da caderina, um antagonista da selectina e um antagonista da integrina. Além disso, a solução oftálmica pode conter um espessante, como hidroximetilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, metilcelulose, polivinilpirrolidona ou semelhantes, para melhorar a retenção do medicamento no saco conjuntival.

[00146] Em uma concretização, o sistema de vetor para uso de acordo com a invenção pode ser combinado com conservantes, surfactantes, intensificadores de viscosidade, intensificadores de penetração, tampões, cloreto de sódio e água oftalmologicamente aceitáveis para formar suspensões ou soluções aquosas, estéreis e oftálmicas. A solução oftálmica pode ainda incluir um tensoativo oftalmologicamente aceitável para auxiliar na dissolução do sistema de vetor. As formulações de soluções oftálmicas podem ser preparadas dissolvendo o sistema de vetor em um tampão aquoso isotônico fisiologicamente aceitável.

[00147] A fim de preparar formulações de pomadas oftálmicas estéreis, o sistema de vetor pode ser combinado com um conservante em um veículo apropriado, como óleo mineral, lanolina líquida ou vaselina branca. As formulações de gel oftálmico estéreis podem ser preparadas suspendendo o sistema Vector em uma base hidrofílica preparada a partir da combinação de, por exemplo, carbopol-940 ou semelhantes, de acordo com as formulações publicadas para preparações oftálmicas análogas; conservantes e agentes de tonicidade podem ser incorporados.

[00148] De preferência, a formulação da presente invenção é uma composição oftálmica aquosa, não irritante, para aplicação tópica no olho, compreendendo: uma quantidade terapeuticamente eficaz de um sistema de vetor para tratamento tópico; um derivado de xantina estando presente em uma quantidade entre a quantidade de derivado solúvel na água da referida composição e 0,05% em peso / volume da referida composição que é eficaz para reduzir o desconforto associado ao sistema de vetor após a aplicação tópica da referida composição, o derivado de xantina sendo selecionado do grupo que consiste em teofilina, cafeína, teobromina e suas misturas; um conservante oftálmico; e um tampão, para fornecer uma composição oftálmica isotônica, aquosa, não irritante. Dispositivos de distribuição de fármacos

[00149] Em uma concretização, a invenção compreende um dispositivo de distribuição de fármacos que consiste em pelo menos um sistema de vetor e um polímero farmaceuticamente compatível. Por exemplo, a composição é incorporada ou revestida no referido polímero. A composição está quimicamente ligada ou fisicamente aprisionada pelo polímero. O polímero é hidrofóbico ou hidrofílico. O dispositivo de polímero compreende vários arranjos físicos. Formas físicas exemplificativas do dispositivo de polímero incluem, mas não estão limitadas a uma pelúcula, uma armação, uma câmara, uma esfera, uma microesfera, um stent ou outra estrutura. O dispositivo de polímero possui superfícies internas e externas. O dispositivo possui uma ou mais câmaras internas. Essas câmaras contêm uma ou mais composições. O dispositivo contém polímeros de um ou mais monômeros quimicamente diferenciados. As subunidades ou monômeros do dispositivo polimerizam in vitro ou in vivo.

[00150] Em uma concretização preferida, a invenção compreende um dispositivo que compreende um polímero e uma composição bioativa incorporada no ou sobre o referido polímero, em que a referida composição inclui um sistema de vetor e em que o referido dispositivo é implantado ou injetado em um tecido da superfície ocular, um tecido anexial em contato com um tecido da superfície ocular, uma cavidade ocular ou anexial cheia de líquido ou uma cavidade ocular ou anexa.

[00151] Polímeros mucoadesivos polianiônicos naturais ou semissintéticos exemplificativos a partir dos quais o dispositivo pode ser formado incluem, mas não estão limitados a, ácido poligalacturônico, ácido hialurônico, carboximetilamilose, carboximetilquitina, sulfato de condroitina, sulfato de heparina e mesoglicano. Em uma concretização, o dispositivo compreende uma matriz de polímero biocompatível que pode, opcionalmente, ser biodegradável no todo ou em parte. Um hidrogel é um exemplo de um material de matriz de polímero adequado. Exemplos de materiais que podem formar hidrogéis incluem ácido polilático, ácido poliglicólico, polímeros PLGA, alginatos e derivados de alginato, gelatina, colágeno, agarose, polissacarídeos naturais e sintéticos, poliaminoácidos, tais como polipeptídeos, particularmente poli (lisina), poliésteres, tais como polihidroxibutirato e poli -. épsilon. - caprolactona, polianidridos; polifosfazinas, álcoois polivinílicos), poli (óxidos de alquileno) particularmente óxidos de polietileno), poli (alilaminas) (PAM), poli (acrilatos), polímeros de estireno modificados, tais como poli (4-aminometilestireno), polióis plurônicos, polioxâmeros, poli (ácidos urônicos), poli (vinilpirrolidona) e copolímeros dos anteriores, incluindo copolímeros de enxerto. Em outra concretização, as estruturas podem ser fabricadas a partir de uma variedade de polímeros sintéticos e polímeros de ocorrência natural, tais como, mas não se limitando a, colágeno, fibrina, ácido hialurônico, agarose e géis ricos em laminina.

[00152] Um material preferido para o hidrogel é alginato ou material de alginato modificado. As moléculas de alginato são constituídas por monômeros de ácido b-D- manurônico (unidades M) e ácido L-gulurônico (unidades G) que variam em proporção e distribuição sequencial ao longo da cadeia polimérica. Os polissacarídeos de alginato são sistemas polieletrólitos que têm uma forte afinidade para cátions divalentes (por exemplo, Ca+2, Mg+2, Ba+2) e formam hidrogéis estáveis quando expostos a essas moléculas.

[00153] O dispositivo é administrado topicamente, subconjuntivamente ou no espaço episcleral, subcutaneamente ou intraductalmente. Especificamente, o dispositivo é colocado sobre ou logo abaixo da superfície de um tecido ocular. Alternativamente, o dispositivo é colocado dentro de um canal lacrimal ou glândula. A composição incorporada no ou sobre o polímero é liberada ou se difunde do dispositivo.

[00154] Em uma concretização, a composição é incorporada ou revestida em uma lente de contato ou dispositivo de distribuição de medicamento, a partir do qual uma ou mais moléculas se difundem para longe da lente ou dispositivo ou são liberadas de uma maneira controlada temporalmente. Nesta modalidade, a composição das lentes de contato permanece na superfície ocular, p. e., se a lente é necessária para a correção da visão, ou a lente de contato se dissolve em função do tempo, liberando simultaneamente a composição em tecidos justapostos. Da mesma forma, o dispositivo de distribuição de drogas é opcionalmente biodegradável ou permanente em várias concretizações.

[00155] Por exemplo, a composição é incorporada ou revestida nas referidas lentes. A composição é quimicamente ligada ou fisicamente presa pelo polímero da lente de contato. Alternativamente, um aditivo de cor é quimicamente ligado ou fisicamente aprisionado pela composição de polímero que é liberada na mesma taxa que a composição de droga terapêutica, de modo que mudanças na intensidade do aditivo de cor indiquem mudanças na quantidade ou dose de composição de droga terapêutica restante ligado ou aprisionado no polímero. Alternativamente, ou além disso, um absorvedor de ultravioleta (UV) é quimicamente ligado ou fisicamente preso dentro do polímero da lente de contato. A lente de contato é hidrofóbica ou hidrofílica.

[00156] Os materiais exemplares usados para fabricar uma lente hidrofóbica com meios para distribuir as composições da invenção incluem, mas não estão limitados a, amefocon A, amsilfocon A, aquilafocon A, arfocon A, cabufocon A, cabufocon B, carbosilfocon A, crilfocon A, crilfocon B, dimefocon A, enflufocon A, enflofocon B, erifocon A, flurofocon A, flusilfocon A, flusilfocon B, flusilfocon C, flusilfocon D, flusilfocon E, hexafocon A, hofocon A, hybufocon A, itabisfluorofocon A, itafluorofocon A, itafocon A, itafocon B, kolfocon A, kolfocon B, kolfocon C, kolfocon D, lotifocon A, lotifocon B, lotifocon C, melafocon A, migafocon A, nefocon A, nefocon B, nefocon C, onsifocon A, oprifocon A, oxyfluflocon A, paflufocon B, paflufocon C, paflufocon D, paflufocon E, paflufocon F, pasifocon A, pasifocon B, pasifocon C, pasifocon D, pasifocon E, pemufocon A, porofocon A, porofocon B, roflufocon A, roflufocon B, roflufocon C, roflufocon D, roflufocon E, rosilfocon A, satafoconuf A, , silafocon A, sterafocon A, sulfocon A, sulfocon B, telafocon A, tisilfocon A, tolofocon A, trifocon

A, unifocon A, vinafocon A, e wilofocon A. Materiais exemplificativos usados para fabricar uma lente hidrofílica com meios para admistrar as composições da invenção inclui, mas não está limitada a, abafilcon A, acofilcon A, acofilcon B, acquafilcon A, alofilcon A, alphafilcon A, amfilcon A, astifilcon A, atlafilcon A, balafilcon A, bisfilcon A, bufilcon A, comfilcon A, crofilcon A, ciclofilcon A, darfilcon A, deltafilcon A, deltafilcon B, dimefilcon A, droxfilcon A, elastofilcon A, epsilfilcon A, esterifilcon A, etafilcon A, focofilcon A, galyfilcon A, genfilcon A, govafilcon A, hefilcon A, hefilcon B, hefilcon C, hilafilcon A, hilafilcon B, hioxifilcon A, hioxifilcon B, hioxifilcon A, hioxifilcon B, hioxifilcon hidrofilcon A, lenefilcon A, licrifilcon A, licrifilcon B, lidofilcon A, lidofilcon B, lotrafilcon A, lotrafilcon B, mafilcon A, mesafilcon A, metafilcon B, mipafilcon A, nelfilcon A, netrafilcon A, ocufilcon A, ocufilcon A, ocufilcon, ocufilcon D, ocufilcon E, ofilcon A, omafilcon A, oxyfilcon A, pentafilcon A, perfilcon A, pevafilcon A, phemfilcon A, polymacon, senofilcon A, silafilcon A, siloxifilcon A, surfilcon A, tefilcon A, tefilcon A, vifilcon A, vifilcon B e xilofilcon A.

[00157] Dentro do escopo da invenção estão composições formuladas como um gel ou substância semelhante a gel, creme ou emulsões viscosas. É preferido que as referidas composições compreendam pelo menos um componente gelificante, polímero ou outro agente adequado para aumentar a viscosidade da composição. Qualquer componente de gelificação conhecido por um técnico versado no assunto, que não tenha efeito prejudicial na área a ser tratada e seja aplicável na formulação de composições e composições farmacêuticas para administração tópica na pele, olhos ou mucosas, pode ser usado. Por exemplo, o componente de gelificação pode ser selecionado a partir do grupo de: ácidos acrílicos, carbômero, carboxipolimetileno, tais materiais vendidos por BF Goodrich sob a marca comercial Carbopol (por exemplo, Carbopol 940), polietileno-polipropilenoglicóis, tais materiais vendidos pela BASF sob a marca comercial Poloxamer (por exemplo, Poloxamer 188), um derivado de celulose, por exemplo, hidroxipropil celulose, hidroxietil celulose, hidroxietileno celulose, metil celulose, carboximetil celulose, ácido algínico-propilenoglicol éster, polivinilpirrolidona, veegum (silicato de alumínio e magnésio), Pemulen, Simulgel (tal comoulgel 600, Simulgel EG e simulgel NS), Capigel, Colafax, plasdones e semelhantes e suas misturas.

[00158] Um gel ou substância semelhante a gel de acordo com a presente invenção compreende, por exemplo, menos de 10% p / p de água, por exemplo, menos de 20% p / p de água, por exemplo, pelo menos 20% p / p de água, tal como pelo menos 30% p / p de água, por exemplo, pelo menos 40% p / p de água, tal como pelo menos 50% p / p de água, por exemplo, pelo menos 75% p / p de água, tal como pelo menos 90% p / p de água , por exemplo, pelo menos 95% p / p de água. De preferência, a referida água é água desionizada.

[00159] As substâncias semelhantes a gel da invenção incluem um hidrogel, um gel coloidal formado como uma dispersão em água ou outro meio aquoso. Assim, um hidrogel é formado após a formação de um coloide no qual uma fase dispersa (o coloide) se combinou com uma fase contínua (isto é, água) para produzir um produto viscoso semelhante a uma geleia; por exemplo, ácido silícico coagulado. Um hidrogel é uma rede tridimensional de cadeias poliméricas hidrofílicas que são reticuladas por meio de ligações químicas ou físicas. Devido à natureza hidrofílica das cadeias de polímero, os hidrogéis absorvem água e incham. O processo de intumescimento é o mesmo que a dissolução de polímeros hidrofílicos não reticulados. Por definição, a água constitui pelo menos 10% do peso total (ou volume) de um hidrogel.

[00160] Exemplos de hidrogéis incluem polímeros sintéticos, tais como polihidroxietil metacrilato e álcool polivinílico quimicamente ou fisicamente reticulado, poliacrilamida, poli (N-vinil pirrolidona), óxido de polietileno e poliacrilonitrila hidrolisada. Exemplos de hidrogéis que são polímeros orgânicos incluem hidrogéis à base de polissacarídeos covalentes ou reticulados ionicamente, como os sais de metal polivalente de alginato, pectina, carboximetilcelulose, heparina, hialuronato e hidrogéis de quitina, quitosana, pululano, gelano e xantano. Os hidrogéis particulares usados em nosso experimento foram um composto de celulose (isto é, hidroxipropilmetilcelulose [HPMC]) e um ácido hialurônico de alto peso molecular (HA). O ácido hialurônico é um polissacarídeo produzido por vários tecidos do corpo. A patente US 5,166,331 discute a purificação de diferentes frações de ácido hialurônico para uso como um substituto para fluidos intraoculares e como um carreador de fármaco oftálmico tópico. Outros pedidos de patente US que discutem os usos oculares do ácido hialurônico incluem os números de série US 11/859,627; US 11/952,927; US US 10/966,764; US 11/741,366; e US 11/039,192. As formulações de macromoléculas para uso intraocular são conhecidas. Ver, por exemplo, os pedidos de patente U.S. números de série US 11/370,301; US 11/364,687; Us 60/721,600; US 11/116,698 e US 60/567,423; US 11/695,527. O uso de vários agentes ativos é conhecido como ácido hialurônico de alta viscosidade. Ver, por exemplo, os números de série dos pedidos de patentes dos US 10/966,764; US 11/091,977; US 11/354,415; US 60/519,237; US 60/530,062 e US 11/695,527.

[00161] As formulações de liberação sustentada, conforme descrito no documento W0 2010/048086, estão dentro do escopo da invenção.

[00162] O técnico versado no assunto está bem ciente dos métodos padrão para incorporação de um polinucleotídeo ou vetor em uma célula hospedeira, por exemplo, transfecção, lipofecção, eletroporação, microinjeção, infecção viral, choque térmico, transformação após permeabilização química da membrana ou célula fusão.

[00163] Tal como aqui utilizado, o termo "célula hospedeira ou célula hospedeira geneticamente modificada" se refere a células hospedeiras que foram transduzidas, transformadas ou transfectadas com a construção ou com o vector descrito anteriormente.

[00164] Como exemplos representativos de células hospedeiras apropriadas, pode-se citar células bacterianas, como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, células fúngicas, como levedura, células de inseto, como Sf9, células animais, como CHO ou COS, células vegetais, etc. A seleção de um hospedeiro apropriado é considerada como estando dentro do escopo dos técnicos versados no assunto a partir dos ensinamentos deste relatório descritivo. De preferência, a referida célula hospedeira é uma célula animal e, mais preferencialmente, uma célula humana. A invenção fornece ainda uma célula hospedeira compreendendo qualquer um dos vetores de expressão recombinantes aqui descritos. A célula hospedeira pode ser uma célula cultivada ou uma célula primária, isto é, isolada diretamente de um organismo, por exemplo, um humano. A célula hospedeira pode ser uma célula aderente ou uma célula suspensa, ou seja, uma célula que cresce em suspensão. As células hospedeiras adequadas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, DH5a, células de E. coli, células de ovário de hamster chinês, células VERO de macaco, células COS, células HEK293 e semelhantes. No caso de terapia gênica ex vivo, uma célula hospedeira pode ser uma célula isolada de um paciente, por exemplo, células-tronco hematopoiéticas, que após a introdução do transgene é reintroduzida no referido paciente em necessidade. Sistemas de entrega viral baseados em AAV

[00165] A construção de um vetor AAV pode ser realizada seguindo procedimentos e usando técnicas que são conhecidas por um técnico versado no assunto. A teoria e prática para a construção de vetores virais adeno-associados e uso em terapia são ilustradas em várias publicações científicas e de patentes (a seguinte bibliografia é aqui incorporada por referência: Flotte TR. Terapia genética baseada em vírus adeno-associados para doenças hereditárias. Pediatr Res. 2005 Dec; 58 (6): 1143-7; Gonçalves MA. Vírus adeno-associado: de vírus defeituoso a vetor eficaz, Virol J. 6 de maio de 2005; 2: 43; Surace EM, Auricchio A. Adeno- associated viral vetores para transferência de gene retinal. Prog Retin Eye Res. 2003 Nov; 22 (6): 705-19; Mandel RJ, Manfredsson FP, Foust KD, Rising A, Reimsnider S, Nash K, Burger C. Vetores virais adeno-associados recombinantes como agentes terapêuticos para tratar distúrbios neurológicos. Mol Ther. 2006 Mar; 13 (3): 463-83).

[00166] As formas de administração adequadas de uma composição farmacêutica contendo vetores AAV incluem, mas não estão limitadas a, soluções ou suspensões injetáveis, loções para os olhos e pomada oftálmica. Em uma modalidade preferida, o vetor AAV é administrado por injeção intra- tecal. Em uma modalidade particularmente preferida, o vetor AAV é administrado por injeção sub-retiniana, na câmara anterior ou no espaço retrobulbar e intravítreo. De preferência, os vetores virais são entregues por meio de abordagem sub-retiniana (como descrito em Bennicelli J, et al Mol Ther. 2008, 22 de janeiro; Reversal of Blindness in Animal Models of Leber Congenital Amaurosis Using Optimized AAV2-mediaed Gene Transfer).

[00167] As doses de vírus para uso na terapia serão determinadas caso a caso, dependendo da via de administração, da gravidade da doença, do estado geral dos pacientes e de outros parâmetros clínicos. Em geral, as dosagens adequadas irão variar de 108 a 1013 vg (genomas de vetor) / olho.

Inteínas

[00168] Uma inteína é um segmento de uma proteína que é capaz de se extirpar e unir as porções restantes (as exteínas) com uma ligação peptídica em um processo conhecido como splicing de proteína. Os segmentos são chamados de "inteína" para a sequência de proteína interna e "exteína" para a sequência de proteína externa, com as exteínas a montante denominadas "N-exteínas" e as exteínas a jusante denominadas "C-exteínas". Os produtos do processo de splicing de proteínas são duas proteínas estáveis: a proteína madura e a inteína.

[00169] As inteínas também podem existir como dois fragmentos codificados por dois genes transcritos e traduzidos separadamente, aqui denominados "inteínas divididas".

[00170] Inteínas da presente invenção incluem, sem limitações, inteínas divididas listadas na base de dados New England Biolabs Inteína, divulgada em (66).

[00171] As inteínas divididas podem ser produzidas a partir das inteínas removendo primeiro a sequência do domínio da endonuclease homing para produzir uma mini inteína. A referida mini inteína pode então se dividir em um ou mais locais projetados através de alinhamentos de sequência de proteína com inteínas de estruturas cristalinas conhecidas para gerar inteínas divididas, testadas quanto à atividade de trans-splicing de acordo com os protocolos incluídos na presente divulgação.

[00172] As inteínas divididas podem ser ainda melhoradas em características desejáveis, incluindo atividade, eficiência, generalidade e estabilidade por meio de mutagênese direcionada ao local ou modificações das sequências de inteínas com base no projeto racional e / ou através da evolução direcionada usando métodos como seleção funcional, exibição de fago e exibição de ribossomo.

[00173] Um exemplo de inteínas divididas são as inteínas derivadas de DnaE que é a subunidade catalítica a da DNA polimerase III em cianobactérias, codificada por dois genes separados, dnaE-n e dnaE-c. A inteína codificada pelo gene dnaE-n é aqui referida como "N-inteína". A inteína codificada pelo gene dnaE-c é aqui referida como "C-inteína". Geralmente, a parte N de uma inteína dividida é referida como "N-inteína" e a parte C de uma inteína dividida é referida como "C-inteína". As inteínas divididas se autoassociam e catalisam a atividade de splicing da proteína em trans (aqui "trans splicing").

[00174] Outros exemplos de inteínas divididas da presente invenção compreendem inteínas de DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) (27, 28)), indicado na tabela 3 abaixo como SEQ ID 1 codificado pela sequência de nucleotídeos Npu- DnaE-n e SEQ. ID 2 codificado pela sequência de nucleotídeos Npu- DnaE-c; a inteína de DnaB de Rhodothermus marinus (Rma) (29) indicada na tabela abaixo como SEQ I D 4 codificada pela sequência de nucleotídeos Rma-DnaB-n e SEQ I D 5 codificada pela sequência de nucleotídeos Rma-DnaB-c; N- e C-inteínas mutadas em que a Nl nteína é de DnaE de Npu (SEQ. I Ds 5) e a Cl nteína é de espécie de Synechocystis cepa PCC6803 (Ssp (SEQ ID 6), respectivamente (30); a cepa de espécies de Synechocystis PCC6803 Ninteína e Cinteína estão incluídos como SEQ ID 13 e 14, respectivamente, na Tabela abaixo. Outros sistemas de inteína também podem ser usados. Por exemplo, um inteína rápido sintético com base no inteína dnaE, o inteína Cfa-N e Cfa-C par, foi descrito (por exemplo, (31) e em WO 2017/132580, incorporado neste documento por referência). Inteínas adicionais foram descritas na Patente US No. 8.394.604, incluindo Ssp GyrB inteína, Ssp DnaX inteína, Ter DnaE3, Ter ThyX inteína, e Cne Prp8 inteína. Outras inteínas dentro da presente invenção são as inteínas divulgadas em WO2018071868, em que o primeiro par de inteínas está listado na tabela abaixo e nomeado como SEQ ID 9 (Ninteina) e SEQ ID 10 (Cinteína); um segundo par de inteínas é listado, por exemplo, SEQ ID 11 e SEQ ID 12.

[00175] Alternativamente, O sistema de inteína pode ser um inteína dependente de ligante que exibe nenhuma ou mínima atividade de splicing de proteína na ausência de ligante (por exemplo, pequenas moléculas, tais como 4- hidroxitamoxifeno, peptídeos, proteínas, polinucleotídeos, aminoácidos e nucleotídeos). As inteínas dependentes de ligantes incluem, por exemplo, aquelas descritas no documento U.S. 2014/0065711 Al, aqui incorporado por referência. Tabela 3. Exemplos de inteínas divididas da presente invenção Inteína Sequência

[00176] Conforme descrito neste relatório descritivo, dentro do escopo da presente invenção estão inteínas originadas do mesmo gene de diferentes organismos, retendo a atividade de trans-splicing. Como um exemplo não limitativo, a inteína dividida de DNA-E pode ser derivada de inteínas divididas do gene DnaE (por exemplo, subunidade alfa da DNA polimerase III) de cianobactérias incluindo Nostoc punctiforme (Npu) Synechocystis sp. PCC6803 (Ssp), Fischerella sp. PCC 9605, Scytonema tolypothrichoides, Cyanobacteria bacterium SW_9_47_5, Nodularia spumigena, Nostoc flagelliforme, Crocosphaera watsonii WH 8502, Chroococcidiopsis cubana CCALA 043, Trichodesmium erythraeum. Como outro exemplo, o DNA-B ssplit inteína pode ser derivado do gene DnaB de cianobactérias incluindo R. marinus (Rma), Synechocystis sp. PC6803 (Ssp), Porphyra purpurea chloroplast (Ppu) que são descritos por exemplo em (59).

[00177] Portanto, as inteínas divididas da invenção podem ser 100% idênticas, 98%, 80%, 75%, 70%, 65% 50% idênticas às inteínas de ocorrência natural, em que as referidas inteínas retêm a capacidade de sofrer reações de trans-splicing. No escopo da presente invenção encontram-se fragmentos de inteínas de ocorrência natural ou modificadas que retêm a atividade de trans-splicing.

[00178] Ver, por exemplo, o alinhamento entre Npu (Nostoc puntiforme) DnaE e Synechocytis sp.

[00179] PCC6803 N-inteína: Pontuação Identidades Positivas Gaps

[00180] E o alinhamento entre Npu (Nostoc puntiforme) DnaE e Synechocytis sp.

[00181] PCC6803 C- Inteína: Pontuação Identidades Positivas Gaps

[00182] Portanto, dentro do escopo da presente invenção estão também variantes e fragmentos de inteínas divididas das inteínas da invenção que retêm a atividade de trans-splicing.

[00183] Curiosamente, foi relatado que inteínas conservaram recursos funcionais que garantem sua atividade de splicing. Em particular, quatro motivos inteína foram identificados (ver abaixo para sua sequência de consenso): Blocos A-H (Pietrokovski 1994 e Perler 1997) e Blocos N2 e N4 (Pietrokovski 1998). Os blocos de Inteína A, N2, B, N4, F e G estão envolvidos no splicing de proteínas. Os blocos C, D, E, H estão no domínio da endonuclease, que está ausente das inteínas divididas. Assim, inteínas divididas retêm motivos conservados que são essenciais para a atividade de trans-splicing. (Base de dados Inteína, divulgada em [Perler, F. B. (2002). InBase, the Inteína Database. Nucleic Acids Res. 30, 383-384.])

[00184] Embora nenhum resíduo seja invariante, o Ser e Cys no Bloco A, o His no Bloco B, o His, Asn e Ser / Cys / Thr no Bloco G são os resíduos mais conservados nos motifes de splicing.

[00185] Alinhamento das inteínas da presente invenção: Alinhamento CLUSTAL W de todas as N-inteínas listadas:

[00186] Alinhamento de sequência múltipla CLUSTAL 2.1 de todas as N-inteínas listadas:

[00187] Em resumo, a atividade da inteína é dependente do contexto, com certas sequências de peptídeos em torno de sua junção de ligação (chamadas de N- e C-exteínas) que são necessárias para que ocorra um trans-splicing eficiente, dos quais o mais importante é um aminoácido contendo um elemento nucleofílico grupo tiol ou hidroxila (isto é, Cys, Ser ou Thr) como primeiro resíduo na C-exteína.

[00188] Os presentes inventores usaram a transplicação de proteínas mediada por inteína a fim de reconstituir grandes proteínas in vivo. As inteínas divididas codificadas pelas sequências do gene da inteínaa são produzidas como polipeptídeos precursores, que por meio de sua complementação estrutural podem remontar e catalisar uma reação de trans splicing de proteína.

[00189] No contexto do trans-splicing da proteína, o gene N-inteína é fundido na estrutura com a sequência que codifica para a porção N-terminal da proteína de interesse; o gene C-inteína é fundido na estrutura com a sequência que codifica a porção C-terminal da sequência de interesse. Após a expressão das duas proteínas de fusão precursoras, as inteínas sofrem excisão autocatalítica e formam uma exteína ligada, por exemplo, a proteína reconstituída de interesse.

[00190] Portanto, a reconstituição de uma proteína de interesse requer a divisão da referida proteína em dois ou três fragmentos, cujas sequências codificantes são clonadas separadamente no vetor AAV, fundido a um N- ou C-Inteína e sob o controle de um promotor. Os pontos de divisão para cada proteína são selecionados levando em consideração a necessidade de aminoácidos no ponto de junção (por exemplo, a presença de um aminoácido contendo um tiol nucleofílico ou grupo hidroxila (ou seja, Cys, Ser ou Thr) como primeiro resíduo na C-exteína, como bem como a preservação da integridade dos domínios proteicos críticos de modo a favorecer o dobramento adequado da proteína e a estabilidade de cada polipeptídeo precursor do polipeptídeo inteína e a proteína reconstituída resultante.

[00191] Em particular, os presentes inventores selecionaram pontos de junção dentro de duas proteínas de interesse: a proteína ABCA4 é dividida no aminoácido Cysll50, Serll68, Ser 1090 e uma inteína dividida é inserida no ponto de divisão. A proteína CEP290 é dividida em aa Cysl076, Serl275, Cys 929 e 1474; Ser 453 e Cys 1474. Sinais de degradação

[00192] A degradação de proteína regulada protege as células de proteínas mal dobradas, agregadas ou de outra forma anormais, e, também controla os níveis de proteínas que evoluíram para uma vida curta in vivo e é amplamente mediada pelo sistema de proteassoma ubiquitina (Ub) (UPS) e por vias autofagia –lisossoma, com chaperones moleculares sendo uma parte de ambos os sistemas. Os sinais de degradação são características das proteínas que as tornam alvos das vias de degradação de proteínas, com o resultado da diminuição de sua meia-vida. Em particular, N-degrons e C- degrons são sinais de degradação cujos principais determinantes são, respectivamente, os resíduos N-terminal e C-terminal de proteínas celulares. N-degrons e C-degrons incluem, em extensões variáveis, motivos de sequência adjacentes e também resíduos de lisina internos que funcionam como locais de poliubiquitilação.

[00193] Dentro do significado da presente invenção, degrons internos são definidos como sinais de degradação localizados dentro de uma sequência de proteína nem no terminal N nem no terminal C e cujos elementos funcionalmente essenciais não incluem resíduos do terminal N ou resíduos do terminal C e mediar degradação de proteínas.

[00194] As vias de degrons compreendem conjuntos de sistemas proteolíticos cuja característica unificadora é a capacidade de reconhecer proteínas contendo N- ou C- ou degrons internos, causando assim a degradação dessas proteínas pelo proteassoma 26S ou autofagia.

[00195] O dihidrofolato redutase de E. coli (ecDHFR) é uma enzima de 159 resíduos que catalisa a redução do dihidrofolato a tetrahidrofolato, um cofator essencial para várias etapas do metabolismo procariótico primário. Numerosos inibidores de DHFR foram desenvolvidos como drogas, e um desses inibidores, trimetoprim (TMP), inibe ecDHFR muito mais potentemente do que DHFR de mamífero. Esta grande janela terapêutica torna o TMP "biologicamente silencioso" em células de mamíferos. A especificidade da interação ecDHFR-TMP, juntamente com a disponibilidade comercial e propriedades farmacológicas atrativas de TMP, torna este par proteína-ligante ideal para o desenvolvimento como um sistema de degradação. (69) Assim, a presença da sequência de aminoácidos DHFR, de preferência a sequência de aminoácidos ecDHFR, dentro de uma proteína, funciona como um sinal alvo para o sistema de proteassoma, resultando na degradação da proteína. Na presença de TMP, a referida proteína é estabilizada.

[00196] Convenientemente, sinais de degron derivados de ecDHFR transportando pontos de pontos desenvolvidos por Iwamoto et al. incluem três mutações de aminoácidos, R12Y, Y100I e G67S (69) que confere atividade funcional (por exemplo, degradação da proteína de fusão) apenas quando colocado no terminal N ou dentro de uma posição interna.

[00197] Melhorias adicionais ao degron derivado de ecDHFR foram feitas pelos presentes inventores que identificaram o peptídeo ativo mais curto. Convenientemente, uma sequência mais curta permite o ajuste de sequências de codificação mais longas dentro do mesmo vetor AAV.

[00198] Na presente invenção, o degron derivado de ecDHFR foi fundido ao N-terminal do Intein onde está inativo. Após a transplicação da proteína, o degron é localizado dentro do Intein reconstituído e medeia sua degradação. ecDHFR da presente invenção são WT ecDHFR, muta nt DH FR, ecDHFR de comprimento total, scDHFR mais curto.

[00199] DHFR pode ser de 105 a 159 aa de comprimento,

em que o encurtamento ocorre na extremidade C-terminal ecDHFR derivado de E. coli, tipo selvagem Sequência de nucleotídeo (623 nt) SEQ ID NO: 27

Sequência de aminoácido

Posições de mutações em negrito – SEQ ID NO: 29

Sequência de nucleotídeo: (SEQ ID NO: 30

Sequência de aminoácido SEQ ID NO: 31 ecDHFR derivado de E. coli, mutante pe degron interno, fragmento ativo mínimo (104 aa) Posições de mutações em negrito – SEQ ID NO: 32 Sequências

[00200] As sequências de codificação da invenção podem ser operativamente ligadas a uma sequência de promotor opcionalmente seguida por uma sequência de íntron, capaz de regular a sua expressão em uma célula mamária, de preferência uma célula retinal de mamífero, particularmente uma célula fotorreceptora, ou uma célula do fígado, uma célula muscular, uma célula cardíaca, uma célula neuronal, uma célula renal, uma célula endotelial. Promotores ilustrativos incluem, sem limitação, promotores ubíquos, artificiais ou específicos de tecido, incluindo fragmentos e variantes dos mesmos que retêm uma atividade de promotor de transcrição, tais como promotores específicos de fotorreceptores, incluindo receptor quinase 1 acoplado à proteína G humana específica de fotorreceptores (GRK1), Promotor da proteína de ligação ao retinoide interfotorreceptor (I RBP), promotor da rodopsina (RHO), promotor da distrofia macular viteliforme 2 (VM D2), promotor da rodopsina quinase (RK); promotores específicos do músculo, incluindo MCK, MYODI; promotores específicos do fígado, incluindo globulina de ligação à tiroxina (TBG), promotor híbrido específico do fígado (HLP) (67); promotores específicos de neurônios, incluindo hSYNl, CaM KIla; promotores específicos do rim, incluindo Ksp- caderinl6, N KCC2. Os promotores ubíquos de acordo com a presente invenção são, por exemplo, os promotores ubiquitous cytomegalovirus (CMV) (32) e CMV curtos (33).

[00201] Opcionalmente, a sequência promotora inclui uma sequência intensificadora, tal como o íntron quimérico de IgG de globina 0.

[00202] Para os fins desta invenção, uma sequência de codificação de EGFP (YP_009062989), ABCA4 e CEP290 que são preferencialmente selecionados respectivamente a partir das sequências aqui incluídas, ou sequências que codificam a mesma sequência de aminoácidos devido à degenerescência do código genético, é funcionalmente ligada a uma sequência promotora capaz de regular a sua expressão numa célula retinal de mamífero, particularmente em células fotorreceptoras.

[00203] Os sinais de poliadenilação ilustrativos incluem, sem limitações, o sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (bGHpA), o sinal de poliadenilação da beta globina humana ou uma versão sintética curta (68), o sinal de poliadenilação SV40 ou outro sinal de poliadenilação artificial ou de ocorrência natural.

[00204] A presente invenção proporciona a utilização de uma sequência de nucleótidos de um sinal de degradação de modo a diminuir a estabilidade da proteína inteína reconstituída. Convenientemente, uma ou mais sequências podem ser repetidas a fim de reter o efeito máximo.

[00205] Os sinais de degradação adequados, de acordo com a presente invenção incluem: (i) o degron CL1 curto, um peptídeo desestabilizador C-terminal que compartilha semelhanças estruturais com proteínas mal dobradas e é, portanto, reconhecido pelo sistema de ubiquitinação, (ii)

ubiquitina, cuja fusão no O N-terminal de uma proteína doadora medeia tanto a degradação direta da proteína quanto a degradação através da via de regra do N-end, (iii) o degron PB29 N-terminal que é um peptídeo de 9 aminoácidos de comprimento que, similarmente ao degron CL1, é previsto para dobrar em estruturas que são reconhecidas por enzimas da via de ubiquitinação, ecDHFR variante e fragmentos dos mesmos como aqui descrito e em (69), particularmente sinais degron derivados de ecDHFR transportando mutações pontuais que incluem três mutações aminoácidas, R12Y, Y100I e G67S conferindo funcional atividade (por exemplo, degradação da proteína de fusão) apenas quando colocado no terminal N ou dentro de uma posição interna.

[00206] Sinais de degradação exemplificativos são descritos no documento WO 2016/13932, o qual é aqui incorporado por referência.

[00207] Como os técnicos versados no assunto podem prontamente apreciar, pode haver uma série de sequências variantes de uma proteína encontrada na natureza, além daquelas variantes que podem ser criadas artificialmente pelo especialista em laboratório. Os polinucleotídeos e polipeptídeos da presente invenção abrangem aqueles especificamente exemplificados aqui, bem como quaisquer variantes naturais dos mesmos, bem como quaisquer variantes que possam ser criadas artificialmente, desde que essas variantes retenham a atividade funcional desejada. Além disso, dentro do escopo da presente invenção estão polipeptídeos que têm as mesmas sequências de aminoácidos de um polipeptídeo aqui exemplificado, exceto para substituições, adições ou deleções de aminoácidos na sequência do polipeptídeo, desde que estes polipeptídeos variantes retenham substancialmente as mesmas atividades funcionais relevantes como os polipeptídeos especificamente exemplificados aqui.

Por exemplo, as substituições conservativas de aminoácidos dentro de um polipeptídeo que não afetam a função do polipeptídeo estariam dentro do escopo da presente invenção.

Assim, os polipeptídeos divulgados neste documento devem ser entendidos como incluindo variantes e fragmentos, como discutido acima, das sequências especificamente exemplificadas.

A presente invenção inclui ainda sequências de nucleotídeos que codificam os polipeptídeos aqui divulgados.

Estas sequências de nucleotídeos podem ser facilmente construídas pelos técnicos versados no assunto tendo o conhecimento das sequências de proteínas e aminoácidos que são apresentadas aqui.

Como seria apreciado por um técnico versado no assunto, a degenerescência do código genético permite que o especialista construa uma variedade de sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo ou proteína particular.

A escolha de uma sequência de nucleotídeos particular pode depender, por exemplo, do uso de códons de um sistema de expressão particular ou célula hospedeira.

Os polipeptídeos com substituição de aminoácidos diferentes daqueles especificamente exemplificados nos polipeptídeos em questão também estão contemplados no escopo da presente invenção.

Por exemplo, aminoácidos não naturais podem ser substituídos pelos aminoácidos de um polipeptídeo da invenção, desde que o polipeptídeo possuindo aminoácidos substituídos retenha substancialmente a mesma atividade do polipeptídeo no qual os aminoácidos não foram substituídos.

Exemplos de aminoácidos não naturais incluem, mas não estão limitados a, ornitina, citrulina, hidroxiprolina, homoserina, fenilglicina, taurina, iodotirosina, ácido 2,4- diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4- aminobutírico, 2-amino ácido butírico, ácido g-amino butírico, ácido e-amino hexanóico, ácido 6-amino hexanóico, ácido 2-amino isobutílico, ácido 3-amino propiônico, norleucina, norvalina, sarcosina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t- butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, b-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de design, como b-metil aminoácidos, C-metil aminoácidos, N-metil aminoácidos e análogos de aminoácidos em geral.

Os aminoácidos não naturais também incluem aminoácidos com grupos laterais derivatizados.

Além disso, qualquer um dos aminoácidos na proteína pode ser da forma D (dextrógira) ou L (levógira). Os aminoácidos podem ser geralmente classificados nas seguintes classes: não polares, polares sem carga, básicos e ácidos.

As substituições conservativas em que um polipeptídeo com um aminoácido de uma classe é substituído por outro aminoácido da mesma classe caem dentro do escopo da presente invenção, desde que o polipeptídeo com a substituição ainda retenha substancialmente a mesma atividade biológica que um polipeptídeo que mantém não tem a substituição.

A Tabela 4 fornece uma lista de exemplos de aminoácidos pertencentes a cada classe.

Tabela 4. Lista de exemplos de aminoácidos pertencentes a cada classe Classe de aminoácidos Exemplos de aminoácidos Não-polar Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp Polar sem carga Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn Gln ácido Asp, Glu Básico Lys, arg, His

[00208] Também dentro do escopo da presente invenção estão polinucleotídeos que têm as mesmas sequências de nucleotídeos de um polinucleotídeo aqui exemplificado, exceto para substituições, adições ou deleções de nucleotídeos na sequência do polinucleotídeo, desde que esses polinucleotídeos variantes retenham substancialmente a mesma atividade funcional relevante como os polinucleotídeos especificamente exemplificados aqui (por exemplo, eles codificam uma proteína tendo a mesma sequência de aminoácidos ou a mesma atividade funcional que codificada pelo polinucleotídeo exemplificado). Assim, os polinucleotídeos aqui divulgados devem ser entendidos como incluindo variantes e fragmentos, como discutido acima, das sequências especificamente exemplificadas.

[00209] A presente invenção também contempla aquelas moléculas polinucleotídicas possuindo sequências que são suficientemente homólogas com as sequências polinucleotídicas da invenção de modo a permitir a hibridização com aquela sequência sob condições rigorosas padrão e métodos padrão (Maniatis, T. et al, 1982). Os polinucleotídeos descritos neste documento também podem ser definidos em termos de identidade mais particular e / ou intervalos de similaridade com aqueles exemplificados neste documento. A identidade de sequência será tipicamente maior do que 60%, preferencialmente maior do que 75%, mais preferencialmente maior do que 80%, ainda mais preferencialmente maior do que 90%, e pode ser maior do que 95%. A identidade e / ou semelhança de uma sequência pode ser 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% ou mais em comparação com uma sequência aqui exemplificada. A menos que especificado de outra forma, como aqui utilizado, a identidade de sequência percentual e / ou similaridade de duas sequências pode ser determinada usando o algoritmo de Karlin e Altschul (1990), modificado como em Karlin e Altschul (1993). Esse algoritmo é incorporado aos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al. (1990). As pesquisas BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências com a porcentagem de identidade de sequência desejada. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser usado como descrito em Altschul et al. (1997). Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (NBLAST e XBLAST) podem ser usados. Consulte o site do NCBI / N1H.

[00210] Plasmídeos da invenção

[00211] A presente invenção será agora ilustrada por meio de exemplos não limitativos.

MATERIAIS E MÉTODOS Geração de plasmídeos de vetor AAV

[00212] Os plasmídeos usados para a produção do vetor AAV derivados dos plasmídeos pAAV2.1 (36) ou pZac (37) que contêm as ITRs do sorotipo 2 de AAV. Os plasmídeos inteína AAV foram desenhados conforme detalhado na Figura 1A e na Figura S5. A proteína EGFP foi dividida no aminoácido (a.a.) C71. A proteína ABCA4 foi dividida no grande domínio citoplasmático CD1 (34, 35) em a.a. C1150 (Conjunto 1), a.a.

S1168 (Conjunto 2) e a.a. C1090 (Conjunto 3). Enquanto a.a. C1150 (Conjunto 1) e S1168 (Conjunto 2) estão dentro de regiões que não estão associadas a uma função ABCA4 conhecida, C1090 está incluído no domínio de ligação de nucleotídeo ABCA4 que se estende a partir de a. a.929 a a. a.1148. Todos os pontos de divisão do CEP290 caem nos domínios espiral-enrolada (36): quando o CEP290 foi dividido em dois polipeptídeos, isso ocorreu em qualquer um dos a.a. C1076 (Conjunto 1) ou S1275 (Conjunto 2-3), quando foi dividido em três polipeptídeos, este foi em a.a. C929 e C1474 (Conjunto 4) ou a.a. S453 e C1474 (Conjunto 5).

[00213] As inteínas incluídas nos plasmídeos foram o inteína de DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) (27, 28), ou uma inteína composta de N- e C-inteinas mutadas de DnaE de Npu e Synechocystis sp. cepa PCC6803 (Ssp), respectivamente (30), ou a inteína de DnaB de Rhodothermus marinus (Rma) (29). Os plasmídeos usados no estudo estavam sob o controle dos promotores do citomegalovírus ubíquo (CMV) (38) e do CMV curto (39) ou dos promotores da quinase 1 do receptor acoplado à proteína G humana específica de fotorreceptor (GRK1) 40. Os plasmídeos que codificam para EGFP e CEP290 incluem o sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (bGHpA), enquanto os plasmídeos que codificam para ABCA4 incluem o sinal de poliadenilação do vírus símio 40 (SV40). Produção e caracterização do vetor AAV

[00214] Os vetores AAV foram produzidos pelo TIGEM AAV Vector Core por transfecção tripla de células HEK293 como já descrito (14, 41). Não foram observadas diferenças nos rendimentos do vetor entre os vetores AAV incluindo ou não sequências de inteína. Transfecção e infecção de células AAV

[00215] As células HEK293 foram mantidas e transfectadas usando o método de fosfato de cálcio (1 µg de cada plasmídeo / poço em formato de placa de 6 poços) como já descrito (14). Para as experiências descritas na Figura S9, foi utilizada uma quantidade de plasmídeo que codifica para o gene de comprimento total correspondente ao mesmo número de moléculas contidas em 1 µg de plasmídeos inteína de AAV. A quantidade total de DNA transfectado em cada poço foi mantida igual pela adição de um plasmídeo codificado quando necessário. As células HeLa usadas para experiências nas Figuras 2C e 2D, foram transfectadas (1 ou 0,5 µg de cada plasmídeo / poço em formato de placa de 24 poços) usando Lipofectamina LTX (Invitrogen). As infecções por AAV foram realizadas conforme já descrito (14). iPSCs e cultura de diferenciação da retina

[00216] As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) foram derivadas de fibroblastos que foram cultivados a partir de biópsias de pele usando métodos descritos em (42). As linhagens celulares STGD1 transportam as variantes heterozigóticas do composto ABCA4 c.4892T> C e c.4539 + 2001G> A, também descritas em (43), ou as variantes heterozigóticas do composto c. [2919 -? _ 3328+? Del; 4462T> C] e c.5196 + 1137G> A. c. [2919 -? _ 3328+? del; 4462T> C] é um alelo que consiste em duas variações, c.2919-? 3328+? Del constitui uma deleção dos éxons 20, 21 e 22, bem como segmentos desconhecidos dos íntrons 19 e 22. Esta deleção foi encontrada em uma configuração c / <'> s com c.4462T> C. As iPSCs foram mantidas em matrigel (# 354277, Corning <®> Matrigel <®> hESC-Qualified Matrix; Corning, NY) revestidas com placas de 6 poços contendo meio mTeSR ™ (# 85850; tecnologias de células-tronco). As células foram passadas em cerca de 80% de confluência usando 0,5 mM de EDTA (# AM9260G; Ambion) durante 2-6 minutos. A diferenciação retiniana foi baseada em uma combinação de protocolos previamente descritos (44, 45). Resumidamente, os iPSCs foram semeados em placas de 96 poços com fundo em V (9.000 células / poço) contendo suplemento RevitaCell (# A-2644501; Gibco, ThermoFisher) e 1% de matrigel para induzir a formação de agregados. Os agregados foram então cultivados para gerar organoides retinais 3D, conforme relatado em (46). Análise de Western blot e ELISA

[00217] Amostras (células HEK293, retinas e organoides retinais) foram lisadas em tampão RIPA para extrair as proteínas EGFP, ABCA4 e CEP290. Os tampões de lise foram suplementados com inibidores de protease (comprimidos de coquetel de inibidor de protease completa; Roche, Basel, Suíça) e fenilmetilsulfonil 1 mM. Após a lise, as amostras ABCA4 foram desnaturadas a 37° C durante 15 minutos em tampão de amostra IX Laemmli suplementado com 2 M de ureia. As amostras EGFP e CEP290 foram desnaturadas a 99 ° C durante 5 minutos em tampão de amostra IX Laemmli. Os lisados foram separados por eletroforese em gel de SDS- poliacrilamida de 12% (para a amostra EGFP) ou 6% (para as amostras ABCA4 e CEP290). Os anticorpos usados para imunoblotting são os seguintes: anti-3xflag (1:1000, A8592;

Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) para detectar as proteínas EGFP, ABCA4 e CEP290; anti-ABCA4 (1: 500, LS- C87292; LifeSpan BioSciences, Inc. Seattle, EUA) para detectar ABCA4; anti-Filamin A (1: 1000, # 4762; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA); anti-b-Actina (1: 1000, NB600-501; Novus Biological LLC, Littleton, CO, EUA) para detectar Filamina A, b-Actina usada como controle de carga nos experimentos in vitro; anti-Dysferlin (1: 500, Dysferlin, clone Haml / 7B6, MONX10795; Tebu-bio, Le Perray- en-Yveline, França) para detectar Dysferlin usado como controle de carregamento em experimentos in vivo. A quantificação das bandas EGFP, ABCA4 e CEP290 detectadas por Westernblot foi realizada usando o software ImageJ (download gratuito está disponível em http://rsbweb.nih.gov/ijy).

[00218] Para os experimentos mostrados na Fig. 21, lisados retinais de ambos os camundongos Abca4 -/- injetados com vetores inteína AAV e camundongos de ninhada Abca4 +/- controle foram lisados em 30 01 de tampão de lise, como descrito acima, e 25 ou 5001 de lisado, respectivamente, foram usados para Western blot usando anticorpos anti-ABCA4 (LS-C87292; conservação de epítopo: 100% para ABCA4 humano; 86% para Abca4 murino). As quantidades de ABCA4 em lisados retinais, medidos por quantificação da intensidade das bandas usando o software ImageJ, foram então normalizadas para o volume de lisado retinal carregado no gel de acrilamida. Para as experiências na Fig. 9, as células HEK293 foram tratadas diariamente com uma dose aumentada de trimetoprim (T7883, Sigma-Aldrich), conforme relatado na figura.

[00219] O ELISA foi realizado em células ou em lisados retinais de camundongo e porco usando o kit ELISA Max Discovery Green Fluorescent Protein (Bioo Scientific Corporation, Austin, TX, EUA). Análises de Southern blot do DNA do vetor rAAV.

[00220] O DNA foi extraído de 1,5 a 6 x 10 <10> partículas virais (medidas como GC). Para digerir genomas não empacotados, a solução de vetor foi incubada com 30 pi de DNase (Roche) em um volume total de 300 ml, contendo Tris 50 mM, pH 7,5 e MgCl2 1 mM por 2 horas a 37° C. A DNase foi então inativada com EDTA 50 mM, seguido por incubação a 50 ° C por 1 hora com proteinase K e solução 2,5% / V-lauril- sarcosil para lisar os capsídeos. O DNA foi extraído duas vezes com fenol-clorofórmio e precipitado com 2 volumes de etanol 100% e 10% de acetato de sódio (3 M) e 1 01 de glicogênio (20 0g). A eletroforese em gel de agarose alcalina foi realizada como descrito anteriormente (Sambrook, J., e Russel, D.W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA. 999 pp). Os marcadores foram produzidos por dupla digestão do pF8-V3 com Smal, para produzir uma banda de 5102 bp. Foi usada uma sonda específica para o promotor HLP. Tempo de tromboplastina parcial ativado (aPTT)

[00221] Nove partes de sangue foram coletadas por retirada retro-orbital em uma parte de citrato trissódico tamponado 0,109 M (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA). O plasma sanguíneo foi isolado por centrifugação das amostras a 13000 rpm durante 15 minutos.

[00222] O aPTT foi medido em Coatron M4 (Teco, Biinde,

Alemanha) usando o programa aPTT seguindo o manual do fabricante. Análise de imunoprecipitação e cromatografia líquida / espectrometria de massa.

[00223] As células foram plaqueadas em placas de 100 mm (células / placas l x l07) e transfectadas em suspensão com plasmídeos AAV-EGFP ou intein ABCA4 usando o método de fosfato de cálcio (20 µg de cada plasmídeo / placa). As células foram colhidas 72 horas após a transfecção e ambas as proteínas EGFP e ABCA4 foram imunoprecipitadas usando esferas magnéticas anti-flag M2 (M8823; Sigma-Aldrich), de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas foram eluídas das contas por incubação durante 15 minutos em tampão de amostra suplementado com ureia 4 M a 37° C. As proteínas foram então carregadas em 12% (para EGFP) ou 6% (para ABCA4) eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Vinte e seis e trinta bandas de proteína (de células HEK293 transfectadas 2 e 3 vezes independentemente com plasmídeos AAV-EGFP e ABCA4 intein, respectivamente) cortadas após coloração com Coomassie Blue foram usadas para sequenciamento de proteínas (Creative proteomics, Shirley, NY). Resumidamente, 3 lâminas de gel foram usadas para digestão por cada uma das seguintes enzimas: Tripsina, Quimotripsina, Glu-C, Arg-C, Asp-N e Lys- N. A pepsina também foi usada para digerir ABCA4. Os peptídeos resultantes foram identificados e quantificados usando cromatografia líquida em nanoescala acoplada à análise de espectrometria de massa em tandem (nano LC-MS / MS). Os dados de espectrometria de massa obtidos foram analisados usando PEAKS STUDIO 8.5. Os inventores alcançaram

100% de cobertura de sequência de proteína para as proteínas EGFP e ABCA4. Modelos animais

[00224] Os animais foram alojados nas instalações de animais TIGEM (Nápoles) e mantidos sob um ciclo claro / escuro de 12 horas.

[00225] Camundongos C57BL / 6J foram adquiridos a Envigo (Itália). Camundongos Albino Abca4-/- foram gerados por meio de cruzamentos e retrocruzamentos sucessivos com camundongos BALB / c (homozigotos para Rpe65 Leu450) e mantidos consanguíneos. Camundongos BXD24/TyJ-Cep290rd16/J (referido como rdl6) foram importados do Laboratório Jackson (estoque JAX # 000031). O camundongo rdl6 carrega uma deleção in-frame de 897 bp abrangendo os éxons 35-39 (46). Os ratos foram mantidos cruzando fêmeas homozigóticas com machos homozigóticos. Os camundongos hemofílicos B6;129S-F8tmlKaz/J (referido como F8tml) foram importados do The Jackson Laboratory (estoque JAX # 004424). O camundongo F8tml tem um cassete de resistência à neomicina que substitui 293 pb da sequência, incluindo 7 pb na extremidade 3' do éxon 16 e 286 pb na extremidade 5' do íntron 16. A colônia de camundongos foi mantida cruzando fêmeas homozigotas com machos hemizigóticos.

[00226] As porcas fêmeas Large White (Azienda Agricola Pasotti, Imola, Itália) utilizadas neste estudo foram registradas como raça pura no Livro LWHerd da Associação Nacional de Criadores de Porcos da Itália e foram alojadas no Centro di Biotecnologie A.O.R.N. Antonio Cardarelli (Nápoles, Itália) e mantida sob um ciclo claro /

escuro de 12 horas. Injeção sub-retiniana de vetores AAV em camundongos e porcos

[00227] Este estudo foi realizado de acordo com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visão e com o regulamento do Ministério da Saúde italiano para procedimentos em animais. Todos os procedimentos em ratos foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano; Departamento de Saúde Pública, Saúde Animal, Nutrição e Segurança Alimentar em 6 de março de 2015.

[00228] As injeções sub-retinianas em camundongos e porcos foram realizadas conforme descrito anteriormente (por exemplo, em 14). Olhos de camundongo foram injetados com 1 pi ou 0,5 pi (para filhotes rdl6) de solução de vetor. As doses de AAV2 / 8 variaram em diferentes experimentos com camundongos, conforme descrito na seção Resultados. Olhos de porco foram injetados com 2 bolhas sub-retinianas adjacentes de 100 ml de solução de vetor AAV2/8. A dose de AAV2/8 foi de 2 x 1011 GC de cada vetor/olho, portanto, a co-injeção de dois vetores de AAV resultou em uma dose total de 4 x 1011 GC / olho. Histologia, Microscopia de luz e Fluorescência

[00229] Para avaliar a expressão de EGFP em cortes histológicos, organoides da retina, olhos de camundongos C57BL / 6J e porcos Large White foram fixados e seccionados como já descrito. Criosecções positivas para EGFP, montadas com Vectashield com DAPI (Vector Lab Inc., Peterborough, Reino Unido), foram analisadas sob o microscópio confocal LSM-700 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), usando excitação e configuração de detecção adequadas e adquiridas com ampliação de 40x. Devido à prevalência do daltonismo vermelho-verde, para evitar a presença de vermelho e verde, as cores juntas das imagens originais foram modificadas na Fig. 14.

[00230] Para avaliar a espessura da camada nuclear externa em camundongos rdl6 injetados com vetores intein AAV CEP290, os olhos foram fixados em paraformaldeído a 4% (PFA) durante a noite, seguido por desidratação em etanóis em série e, em seguida, incluídos em blocos de parafina. Cortes em série de camundongos rdl6 (22h) foram cortados ao longo do meridiano horizontal, progressivamente distribuídos em lâminas e corados com hematoxilina e eosina (H&E). Em seguida, os cortes foram analisados ao microscópio (Leica Microsystems GmbH; DM5000) e adquiridos com aumento de 20x. Para cada olho, uma imagem do lado temporal injetado de uma fatia na região central do olho foi usada para a análise. Três medidas da espessura do ONL foram feitas, em cada imagem, por um operador mascarado ao genótipo / grupo de tratamento, usando a ferramenta "freehand line" do software ImageJ. Análise de imunofluorescência

[00231] As células HeLa transfectadas com plasmídeos de intein ABCA4 ou CEP290 AAV foram fixadas 24 horas após a transfecção em PFA a 4% durante 10 minutos. As células foram bloqueadas em tampão de bloqueio (0,05% de saponina, 0,5% de BSA, 50 mM de NH4CI, 0,02% de Nal \ l3 em PBS, pH 7,2) por 30 minutos e depois incubadas da seguinte forma: - por 1 hora com anticorpo anti-FLAG M2 (F1804, Sigma-

Aldrich) para detectar proteínas ABCA4; com anticorpo anti- VAP-B [produzido no laboratório Antonella De Matteis ((47)], para corar o retículo endoplasmático e com TGN46 (AHP-499, Serotech) para corar a rede Trans-Golgi. Após lavagem em PBS, as células foram incubadas com anticorpos secundários por 30 min: cabra anti-rato Alexa Fluor 568; cabra anti- coelho Alexa Fluor 488, burro anti-ovelha Alexa Fluor 633 dirigido contra anticorpos anti-FLAG, -VAP-B e -TGN46, respectivamente. - durante a noite com anticorpos anti Anticorpo-FLAG (F7425, Sigma-Aldrich) para detectar proteínas CEP290 e com anticorpo anti-tubulina acetilada (T6793, Sigma-Aldrich) para corar os microtúbulos. Após lavagem em PBS, as células foram incubadas com anticorpos secundários apropriados por 1 hora: Alexa Fluor 594 de cabra anti-coelho e Alexa Fluor 488 de burro anti-rato, dirigidos contra o anticorpo anti- FLAG e -Ac-Tubulina, respectivamente.

[00232] Os núcleos foram corados com DAPI. Devido à prevalência do daltonismo vermelho-verde, para evitar a presença de vermelho e verde, as cores juntas das imagens originais foram modificadas na Fig.2 C-D e na Fig. 18.

[00233] Os anticorpos usados para imunofluorescência de organóides retinais humanos são os seguintes: anti-cone- arrestina humana (CAR) (50, 51) (1: 10000, 'Luminaire founders' hCAR; presente do Dr. Cheryl M. Craft, Doheny Eye Institute, Los Angeles, CA, EUA); anti-Opsin, Red / Green (1: 200, AB5405; Merck Millipore, Darmstadt, Germania); anti-Recoverin (1: 500, AB5585; Merck Millipore); anti-CRX (A-9, 1: 250, sc377138; Santa Cruz Biotechnology, Dallas,

Texas, EUA); anti-rodopsina (1D4, 1: 200, ab5417, Abeam, Cambridge, MA, EUA). Análises de transmissão e microscopia eletrônica de varredura

[00234] Para análises de microscopia eletrônica (EM), camundongos Abca4-/- de 3 meses após a injeção sub-retiniana de AAV foram adaptados ao escuro durante a noite e, em seguida, os olhos foram colhidos. Os olhos foram fixados em glutaraldeído a 0,2% (GA) - PFA a 2% em tampão PHEM 0,1 M pH 6,9 por 18 horas e depois enxaguados em tampão PHEM 0,1 M. Os olhos foram então dissecados sob um microscópio de luz para selecionar a área injetada temporal das oculares. Esta porção das oculares foi subsequentemente embebida em gelatina a 12%, infundida com 2,3 M. de sacarose. As criosseções (60 nm) foram congeladas em nitrogênio líquido e cortadas usando um Ultramicrotome EM FC7 da Leica (Leica Microsystems). Para evitar viés na atribuição de dados aos vários grupos experimentais, as medições da área ocupada por grânulos de lipofuscina no epitélio pigmentar da retina foram realizadas por um operador mascarado para o genótipo / grupo de tratamento usando o software iTEM (Olympus SYS, Hamburgo, Alemanha) A área de cada grânulo de lipofuscina em cada campo foi medida em pelo menos 20 imagens diferentes (áreas de 25 µm2) usando a ferramenta 'Free hand polygon' do software iTEM. Para análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV), os organoides retinais foram fixados em GA, corados com Os04, desidratados em etanol e secos usando procedimento de secagem em ponto crítico. Os espécimes secos foram então montados em um esboço de espécime SEM e revestidos com uma fina camada de ouro. A organização tridimensional da superfície das amostras foi analisada e as imagens foram adquiridas usando o microscópio eletrônico de varredura JEOL 6700F (JEOL Ltd., Tóquio, Japão).

[00235] Para análise de ultraestrutura, os organoides da retina foram fixados durante a noite com uma mistura de PFA a 2% e GA a 1% em tampão PHEM 0,2 M, pH 7,3. Após a fixação, os espécimes foram fixados posteriormente conforme descrito anteriormente. Em seguida, foram desidratados, incluídos em resina epóxi e polimerizados a 60° C por 72 horas. Seções seriadas finas de 60 nm foram cortadas no micrótomo Leica EM UC7.

[00236] As imagens EM foram adquiridas usando um microscópio eletrônico FEI Tecnai-12 equipado com uma câmera digital VELETTA CCD (FEI, Eindhoven, Holanda). Registros eletrofisiológicos e tomografia de coerência óptica de domínio espectral

[00237] As análises funcional e morfológica foram realizadas conforme já descrito (14). Respostas à luz pupilar

[00238] As respostas à luz pupilar de camundongos rdl6 foram registradas no escuro usando a câmera retinal TRC-50IX conectada a uma câmera digital NikonDlH com dispositivo de carga acoplada (Topcon Biomedical Systems, Oakland, NJ). Os camundongos foram expostos a estímulos de luz de 10 lux por aproximadamente 10 segundos e uma imagem por olho foi adquirida usando o software IMAGEnet (Topcon Biomedical Systems). Para cada olho, o diâmetro da pupila foi normalizado para o diâmetro do olho (do lado temporal para o nasal). Análise estatística

[00239] O teste ANOVA de uma via (teste paramétrico) ou o teste de soma de postos de Kruskal-Wallis (teste não paramétrico) foram realizados para determinar se havia diferenças estatisticamente significativas entre dois ou mais grupos de uma variável independente em uma variável dependente. Os valores P são os seguintes: ensaio ELISA para quantificação de proteína EGFP in vitro (p Kruskal-Wallis = 0,006036), na retina de camundongo (p ANOVA = 0,00585) e na retina de porco (p Kruskal-Wallis = 0,009005); Figura 5A (p ANOVA = 0,00585); Figura 5B (p Kruskal-Wallis = 5,547E-5); Figura 5C (p ANOVA = 5,81E-10); Análises ERG (p ANOVA ou p Kruskal-Wallis> 0,05 em todas as luminâncias analisadas para as amplitudes das ondas a e b); Análise de OCT na Fig. 14 (p ANOVA = 0,52 para ABCA4 e p ANOVA = 0,965 para CEP290). As diferenças estatisticamente significativas entre os grupos determinadas com a comparação múltipla de pares entre as médias dos grupos são as seguintes: Ensaio ELISA para quantificação da proteína EGFP in vitro (AAV único versus AAV duplo = 0,012; AAV inteína versus AAV duplo = 0,012; AAV único versus AAV inteína = 0,222), na retina de camundongo (AAV único versus AAV duplo = 0,0044; AAV inteína versus duplo AAV = 0,3754; AAV único versus AAV inteína = 0,0561) e na retina de porco (AAV único versus AAV duplo = 0,012; inteína versus AAV duplo = 0,012; AAV único versus AAV inteína = 0,841); Figura 5A: + / + versus - / - AAV inteína = 0,4530; + / + versus - / - = 0,0002; Figura 5B: tipo selvagem versus rdl6 AAV inteína = 0,00131; Figura 5C: tipo selvagem versus rdl6 AAV inteína IE-07; tipo selvagem versus rdl6 neg <IE-06.

EXEMPLOS Exemplo 1. AAV-EGFP inteína reconstitui a proteína de comprimento total in vitro

[00240] Os presentes inventores testaram a eficiência do trans-splicing da proteína mediada por inteína na retina; dois vetores AAV foram gerados, cada um codificando a metade N- ou C-terminal da proteína repórter EGFP fundida às metades N- e C- terminais da DnaE split-intein de Nostoc punctiforme [Npu Fig. 1A], respectivamente. A proteína EGFP foi dividida no aminoácido (a.a.) C71. Cada vetor AAV incluiu elementos reguladores apropriados (ou seja, o promotor e o sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (bGHpA) e um marcador triplo (3xflag) para permitir a detecção de ambas as metades, bem como da proteína EGFP reconstituída de comprimento total (Fig. 1A).

[00241] Os plasmídeos AAV-EGFP Dna E inteína foram usados para transfectar células de rim embrionário humano 293 (HEK293) e avaliar a produção de metades N- e C-terminais simples, bem como da proteína EGFP de comprimento total. A fluorescência de EGFP, comparável à observada em células transfectadas com um único plasmídeo AAV que codifica EGFP de comprimento total, foi detectada em células co- transfectadas com os plasmídeos inteína AAV-EGFP, mas não com o único AAV-EGFP de terminal N e C plasmídeos inteína, como mostrado na Fig. 12. A presença de proteína EGFP trans- dividida do tamanho esperado (~ 28 kDa) junto com DnaE inteína (~ 17 kDa) dividida da proteína madura foi confirmada por Western blot (WB) análise de lisados de células HEK293 apenas após co-transfecção de ambos os plasmídeos de inteína AAV-EGFP, como mostrado na Fig.

IB.

Além disso, a quantificação da intensidade das bandas mostrou que as quantidades de proteína EGFP dos plasmídeos inteína AAV foram 76 ± 37% (n = 3 experiências independentes) daquelas observadas a partir de um único plasmídeo AAV.

Para definir a precisão da reconstituição de proteína, EGFP foi imunopurificado a partir de células HEK293 transfectadas com os plasmídeos inteína AAV-EGFP e análise por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) foi realizada para definir sua sequência de proteína.

Os 3539 peptídeos obtidos da digestão proteolítica desta amostra, 7 dos quais incluíam o ponto de divisão (Tabela 5), cobriram a proteína inteira e confirmaram que a sequência de aminoácidos de EGFP reconstituída por plasmídeos inteína de AAV corresponde precisamente àquela de EGFP de tipo selvagem.

Tabela 5. Peptídeos que incluem o ponto de divisão de EGFP.

C = Cisteína 71 Sequência peptídica Comprimento 7

22

16

Exemplo 2. AAV-EGFP inteína são mais eficientes do que os vetores AAV duplos in vitro

[00242] Para confirmar a reconstituição da proteína EGFP dos vetores inteína AAV, células HEK293 foram infectadas com inteína AAV2 / 2-CMV-EGFP DnaE ou com vetores AAV simples e duplos que incluíram o mesmo cassete de expressão. Multiplicidade de infecção (m.o.i), 5 x 104 cópias do genoma (GC) / célula de cada vetor, o que significa uma dose semelhante entre os 3 sistemas, assumindo que os vetores duplos sofrem recombinação completa do DNA ou proteína. A fim de quantificar precisamente as quantidades de EGFP, os lisados celulares foram colhidos setenta e duas horas após a infecção. A expressão de EGFP foi avaliada por WB e ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA): a expressão de EGFP obtida com vetores intein AAV foi cerca de metade daquela alcançada com um único AAV (AAV único = 0,735 ± 0,2 ng EGFP / pg lisado total, n = 5 experimentos independentes; AAV intein = 0,403 ± 0,04 ng EGFP / pg lisado total, n = 5 experimentos independentes) e 10 vezes maior do que o obtido com vetores AAV duplos, como mostrado na Fig. 1C (duplo AAV = 0,046 ± 0,01 ng EGFP / pg lisado total, n = 5 experiências independentes). Além disso, a intensidade de EGFP de comprimento total em relação à da inteína excisada foi quantificada por WB; sua abundância relativa foi encontrada em 1: 0,2 (n = 6 experimentos independentes, Fig. 13A). Exemplo 3. A administração sub-retinal de vetores inteína AAV-EGFP resulta na reconstituição eficiente de proteínas de comprimento total na retina de camundongo e porco

[00243] Para investigar se o trans-splicing mediado pela inteína AAV reconstitui a expressão da proteína de comprimento total na retina, camundongos C57BL / 6J de 4 semanas de idade foram injetados sub-retinalmente com vetores de inteína AAV2 / 8-CMV-EGFP Dna E (dose de cada vetor / olho: 5,8 x 109 GC). Os olhos foram colhidos 1 mês depois e analisados por análise de microscopia. A fluorescência de EGFP foi detectada em todos os olhos no epitélio pigmentar da retina e, mais importante, nos fotorreceptores (Fig. ID). Para comparar a expressão do transgene de AAV inteína àquela de AAV único e duplo em fotorreceptores, os vetores AAV2 / 8 que codificam EGFP sob o controle do promotor da quinase 1 do receptor acoplado à proteína G humana específico do fotorreceptor (GRK1) foram injetados sub-retinariamente em 4- camundongos C57BL / 6J de uma semana de idade (dose de cada vetor / olho: 5c10 <L> 9 GC). Os olhos foram coletados 1 mês após a injeção e analisados por microscopia de fluorescência, ELISA ou WB.

[00244] A fluorescência EGFP foi detectada na camada de células fotorreceptoras em olhos injetados com todos os conjuntos de vetores, como visto na Fig. IE. A quantificação precisa das quantidades de proteína EGFP por ELISA confirmou que AAV inteína reconstituiu a proteína EGFP de forma menos eficiente do que um único AAV e cerca de 3 vezes mais eficiente do que AAV duplo (AAV único = 8,41 ± 2,48 ng EGFP / retina, n = 5 olhos; AAV intein = 3,72 ± 0,85 ng EGFP / retina, n = 7 olhos; AAV duplo = 1,38 ± 0,43 ng EGFP / retina, n = 7 olhos). As quantidades relativas de EGFP de comprimento total para inteína excisada após a quantificação das intensidades da banda WB foram 1: 3 (n = 14 olhos analisados, Fig. 13B).

[00245] Os inventores então avaliaram a eficiência dos vetores inteína AAV na transdução de fotorreceptores na retina de porco, que é um excelente modelo pré-clínico para avaliar a transdução de vetor viral, devido ao seu tamanho e arquitetura ((48). Assim, porcos Large White foram injetados sub-retinalmente com vetores AAV2 / 8-GRK1-EGFP simples e duplos (dose de cada vetor / olho: 2 x 1011 GC, entregue através de duas bolhas sub-retinianas adjacentes). Os olhos foram colhidos 1 mês após a injeção e analisados por qualquer microscopia de fluorescência, ELISA ou WB. Notavelmente, a reconstituição da proteína EGFP mediada por inteína AAV na camada de células fotorreceptoras foi maior do que a mediada por AAV duplo e indistinguível de vetores AAV únicos, conforme avaliado por fluorescência de EGFP (Fig. IF). Quantificação precisa de EGFP em lisados retinais confirmou que inteína de AAV reconstitui a proteína em quantidades que são semelhantes às alcançadas com um único

AAV e cerca de 3 vezes maior do que aquelas obtidas com vetores de AAV duplos (AAV único AV = 247,5 ± 45,1 ng EGFP / retina, n = 5 olhos; AAV intein = 227,0 ± 15,7 ng EGFP / retina, n = 5 olhos; AAV duplo = 82,3 ± 9,6 ng EGFP / retina, n = 5 olhos). A quantidade relativa de EGFP de comprimento total para inteína excisada após a quantificação das intensidades da banda WB foi de 1: 2 (n = 8 olhos, Fig. 13C). Exemplo 4. EGFP de comprimento total é reconstituído por trans-splicing de proteína mediado por AAV em organoides retinais humanos 3D.

[00246] Como um modelo pré-clínico adicional representativo da retina humana, os inventores geraram organoides retinais 3D ((49, 50) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Organoides de seis meses de idade (Fig. 14A) continham células coradas por células maduras marcadores de fotorreceptor, como mostrado na Fig. 14B; os organoides foram transduzidos com sucesso por vetores AAV2 com um promotor específico de fotorreceptor, nomeadamente AAV2 / 2 CMV EGFP e vetores AAV2 / 2 IRBP DsRed, como mostrado na Fig. 14C por análise de fluorescência. (Fig. 14D) e microscopias eletrônicas (Fig. 14E-F) mostram a presença de botões de segmentos externos de fotorreceptores. Organoides retinais humanos 3D de nove meses de idade incubados por 30 dias com vetores inteína AAV-GRK1-EGFP (dose de cada vetor / organoide: 1 x 1012 GC) mostram fluorescência de EGFP (Fig. 1G). A análise de WB de lisados organoides da retina (Fig. 15) confirma a expressão de EGFP de comprimento total que era cerca de 5 vezes mais abundante do que inteína extirpada após a intensidade de banda quantificação (n = 4 organoides). Exemplo 5. Trans-Splicing mediado por inteína de proteínas grandes (a identificação de pontos de divisão ABCA4 e CEP90 ideais é necessária para um eficiente trans-splicing de proteína mediada por inteína AAV)

[00247] Para testar se o trans-splicing da proteína pode ser desenvolvido como um mecanismo para reconstituir grandes proteínas terapêuticas, os inventores desenvolveram os vetores inteína AAV-ABCA4 e -CEP290. ABCA4 e CEP290 foram divididos em dois (AAV I, AAV II) ou três (AAV I, AAV II, AAV III) fragmentos cujas sequências de codificação foram clonadas separadamente em vetores de AAV únicos, fundidos com as sequências de codificação das inteínas divididas N - e C-terminais como mostrado na Fig. 16. Os vetores inteína de AAV incluíram o ubíquo CMV curto [(shCMV), para todos os conjuntos] ou o promotor GRK1 (conjunto 1 para ABCA4 e conjunto 5 para CEP290). Os pontos de divisão para cada proteína foram selecionados levando em consideração os requisitos de resíduos de aminoácidos nos pontos de junção para o trans-splicing eficiente da proteína 18, 51), bem como a preservação da integridade dos domínios críticos da proteína, o que deve favorecer o dobramento adequado e a estabilidade de cada polipeptídeo independente e, portanto, da proteína reconstituída final. Também foram consideradas inteínas divididas adicionais. Os conjuntos CEP290 nos quais a proteína foi dividida em 3 polipeptídeos (conjuntos 4 e 5, Fig. 16B) foram gerados para permitir a inclusão do Elemento Regulador Pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota [WPRE, (52)] para aumentar a expressão do transgene. Para evitar o trans-splicing indesejado entre AAV I e AAV III, que poderia reduzir a quantidade de proteína de comprimento total gerada, os conjuntos 4 e 5 incluíram duas inteínas divididas diferentes nas duas junções de divisão, especificamente DnaB intein de Rhodothermus marinus e qualquer tipo ou uma inteína DnaE mutada que os inventores mostram que não apresentam reação cruzada (Fig. 17).

[00248] Os inventores compararam a capacidade de cada conjunto de plasmídeos inteína de AAV para reconstituir ABCA4 e CEP290 após a transfecção de células HEK293. A análise de WB de lisados celulares 72 horas após a transfecção mostrou que as proteínas ABCA4 e CEP290 de comprimento total do tamanho esperado (~ 250 kDa e ~ 290 kDa, respectivamente) foram reconstituídas a partir de cada conjunto de plasmídeos inteína AAV, embora com eficiência variável (Fig. 2A-B). Os conjuntos 1 e 5 foram considerados os mais eficientes para a reconstituição das proteínas ABCA4 e CEP290, respectivamente, e, portanto, usados em todos os experimentos subsequentes.

[00249] Para definir a precisão da reconstituição de proteína, os inventores imunopurificaram ABCA4 de células HEK293 transfectadas com o conjunto 1 e realizaram análise de LC-MS para definir sua sequência de proteína. Os 3108 peptídeos obtidos da digestão proteolítica desta amostra, 22 dos quais incluíam o ponto de divisão (Tabela 6), cobriram a proteína inteira e confirmaram que a sequência de aminoácidos de ABCA4 reconstituída por plasmídeos inteína de AAV corresponde precisamente àquela de ABCA4 de tipo selvagem. A sequência de aminoácidos de ABCA4 reconstituída por AAV inteína corresponde à de ABCA4 de tipo selvagem.

Foi realizado o alinhamento entre a sequência ABCA4 de tipo selvagem e os peptídeos identificados na análise por cromatografia líquida-espectrometria de massa de ABCA4 reconstituído a partir de inteínas de AAV.

Tabela 6. Peptídeos que incluem o ponto de divisão ABCA4. N.B.: C: Cisteína 1150 Sequência peptídica Comprimento 6

8

9

10

11

12

13

13

[00250] Os inventores avaliaram então a localização intracelular dos produtos proteicos dos diferentes plasmídeos contendo inteína, comparando-os com a localização da proteína de comprimento total. O ABCA4 de comprimento total é conhecido por se localizar no retículo endoplasmático (ER) quando expresso em linhas de células em cultura (53, 54). Os dois polipeptídeos ABCA4 do conjunto 1 foram encontrados para co-localizar no ER, enquanto nenhuma co- localização foi encontrada na rede Trans-Golgi (Fig. 2C). Uma localização semelhante foi observada em células co- transfectadas com ambos os plasmídeos inteína AAV, bem como em células transfectadas com um plasmídeo que codifica para a proteína ABCA4 de comprimento total, confirmando assim a localização predominante no ER de ABCA4 exogenamente expresso em linhagens celulares).

[00251] Quanto ao CEP290, foi relatado que a proteína de comprimento total mostra um padrão de distribuição misto com um padrão predominante pontilhado e um padrão fibrilar menor (55). A dissecção dos domínios responsáveis pelo direcionamento subcelular de CEP290 mostrou que o domínio N- terminal (aa 1-362) direciona a proteína para estruturas vesiculares graças à sua capacidade de interagir com membranas, enquanto uma região próxima ao terminal C de CEP290, abrangendo muito do domínio de homologia da cauda da miosina da proteína, medeia a ligação dos microtúbulos (aa 580-2479) e quando expressa como forma truncada tem uma distribuição fibrilar proeminente coincidente com a tubulina acetilada (Ac-Tub)). De acordo com Drivas et al., A análise de imunofluorescência em células HeLa transfectadas com plasmídeos AAV I, II ou III intein individualmente ou co- transfectadas com AAV l + ll, AAV l + lll e AAV ll + lll mostrou que os produtos de AAV I e AAV II tem um padrão de puntiformes predominante, enquanto o de AAV III (abrangendo o domínio de homologia da cauda da miosina da proteína) mostra um padrão fibrilar e é o único a co-localizar completamente para Ac-tub (Fig. 2D). Assim, os produtos de AAV l + ll têm um padrão de pontilhado predominante, enquanto aqueles de AAV l + lll e AAV ll + lll têm um padrão combinado de fibrilar e pontilhado de microtúbulos. As células co- transfectadas com os três plasmídeos AAV CEP290 intein mostraram um sinal pontilhado predominante parcialmente alinhado ao longo dos microtúbulos que é comparável ao sinal observado nas células transfectadas com um plasmídeo que codifica para a proteína CEP290 de comprimento total (Fig. 2D e Fig. 18).

[00252] Os presentes inventores compararam então a quantidade de proteína obtida com o melhor conjunto de plasmídeos inteína AAV-ABCA4 e -CEP290 com aqueles obtidos a partir de um único plasmídeo AAV que codifica a proteína de comprimento total correspondente. Para este objetivo, as células HEK293 foram transfectadas com as mesmas quantidades equimolares do plasmídeo inteína AAV ou único e 72 horas após a transfecção, os lisados celulares foram analisados por WB (Fig. 19). A quantificação da intensidade das bandas mostrou que a expressão de ABCA4 e CEP290 a partir de plasmídeos inteína AAV foi de 61 ± 4% (n = 3 experimentos independentes) e 58 ± 4% (n = 3 experimentos independentes) daquela observada com os plasmídeos AAV únicos correspondentes, respectivamente. Exemplo 6. Os vetores inteína AAV medeiam a expressão de grandes proteínas terapêuticas in vitro e na retina

[00253] Os inventores compararam a eficiência da reconstituição de grande proteína mediada por inteína de AAV com a de vetores AAV duplos tanto in vitro quanto na retina de camundongo e porco. As células HEK293 foram infectadas com vetores AAV2 / 2 dual ou inteína que codificam para ABCA4 (conjunto 1) ou CEP290 (conjunto 5) (moi: 5x 10 <L> 4 GC / célula de cada vetor) e lisados celulares foram analisados 72 horas mais tarde por WB. Como mostrado nas Figuras 3A e 3B, os vetores inteína AAV-ABCA4 e -CEP290 mediaram a reconstituição de proteínas grandes de forma mais eficiente do que os vetores AAV duplos. Como esperado, além de proteínas de comprimento total, polipeptídeos mais curtos derivados de qualquer um dos vetores inteína AAV (no caso de ABCA4 e CEP290) ou de trans-splicing ocorrendo entre AAV II e AAV III (no caso de CEP290) foram observados (Fig. 3A e

3B).

[00254] Além disso, camundongos de tipo selvagem com 4 semanas de idade foram injetados sub-retinalmente com AAV- GRK1-ABCA4 ou - CEP290 inteína (conjunto 1 e 5, respectivamente) em comparação com vetores duplos (dose de cada vetor / olho ABCA4: 3,3 x 109 GC, dose de cada vetor / olho CEP290: 1,1 x 109 GC). Os animais foram sacrificados 4- 7 semanas após a injeção e a expressão da proteína em lisados retinais foi avaliada por WB. Proteínas de comprimento total foram detectadas em 10/11 (91%) de olhos injetados com inteína AAV-ABCA4 (Fig. 4A e 20) e em 5/10 (50%) de olhos injetados com inteína AAV-CEP290 (Fig. 4B) Por outro lado, a expressão da proteína de comprimento total foi evidente em 5/9 (56%) e em 0/5 olhos injetados com os vetores AAV duplos ABCA4 e CEP290, respectivamente. Similarmente ao que foi observado in vitro, polipeptídeos derivados dos vetores inteína AAV únicos (no caso de ABCA4 e CEP290) e de trans- splicing ocorrendo entre AAV II e AAV III (no caso de CEP290) foram detectados (Fig. 4A e 4B).

[00255] Para investigar a eficiência da reconstituição de proteína mediada por AAV inteína em relação ao endógeno, camundongos Abca4-/- de 1 - 4 meses de idade foram injetados sub-retinalmente com vetores inteína AAV- GRK1-ABCA4 (conjunto 1) (dose de cada vetor ABCA4 / olho: 5,5 x 109 GC). Um mês depois, a expressão de ABCA4 em lisados retinais de camundongos Abca4-/- não afetados e injetados com inteína AAV foi analisada por WB usando um anticorpo que reconhece ABCA4 humano e murino (Fig. 21). A expressão de AAV inteína ABCA4 foi de 8,6 ± 1,3% de ABCA4 endógeno.

[00256] Para confirmar a reconstituição eficiente de proteínas grandes na retina de porco clinicamente relevante, porcos Large White foram injetados sub-retinalmente com AAV2 / 8-GRK1-ABCA4 intein (conjunto 1) ou vetores duplos (dose de cada vetor / olho: 2x 1011 GC, entregue através de duas bolhas sub-retinais adjacentes) e a expressão da proteína após a injeção de 1 mês foi analisada por WB. Notavelmente, descobriu-se que inteína de AAV reconstitui a proteína ABCA4 de comprimento total de forma mais eficiente do que os vetores AAV duplos (Fig. 4C).

[00257] Por último, organoides retinais humanos de iPSCs de indivíduos saudáveis ou pacientes STGD1 em 121 dias de cultura [quando a maturação do fotorreceptor começa (20) foram infectados com vetores inteína AAV2/2- GRK1-ABCA4 (conjunto 1) (dose de cada vetor / organoide: 1c10 <L> 12 GC). Os organoides foram lisados entre 20 e 40 dias após a infecção e analisados por WB. ABCA4 do tamanho esperado foi detectado em todos os organoides infectados (Fig. 4D e Fig. 22; n = 3 e n = 4 do controle normal e organoides STGD1, respectivamente). Exemplo 7. A administração sub-retinal de vetores inteína AAV melhora o fenótipo retinal de modelos de camundongos STGD1 e LCA10

[00258] Para determinar se a transdução de fotorreceptores obtida com vetores inteína AAV poderia ser terapeuticamente relevante, eles foram testados na retina de modelos de camundongo de STGD1 (Abca4-/-) e LCA10 (rdl6).

[00259] Camundongos Abca4-/- de um mês de idade foram injetados sub-retinalmente com vetores inteína AAV2/8-GRK1-

ABCA4 (conjunto 1) (dose de cada vetor / olho: 4,3 - 4,8 x 109 GC). Três meses depois, os olhos foram colhidos e a análise de microscopia eletrônica de transmissão de cortes ultrafinos da retina foi realizada para medir as quantidades de lipofuscina, que se acumula no epitélio pigmentado da retina (RPE) de camundongos Abca4-/- (56, 57). Notavelmente, o acúmulo de lipofuscina RPE foi significativamente reduzido nos olhos Abca4 </> injetados com vetores inteína AAV, mas não em olhos injetados de controle negativo (valor de p = 0,0163; Fig. 5A e Fig. 23).

[00260] Em paralelo, camundongos rdl6 de 4-6 dias de idade foram injetados sub-retinalmente com vetores inteína AAV2 8-GRK1-CEP290 (conjunto 5) (dose de cada vetor / olho: 5,5 x 108 GC). A análise microscópica de seções retinais 1 mês após a injeção mostrou que a espessura da camada nuclear externa (ONL), que inclui núcleos de fotorreceptores, foi significativamente reduzida em camundongos rdl6 em comparação com camundongos do tipo selvagem (valor p = 0,00048; Fig. 5B), como resultado da degeneração retinal progressiva (55) Notavelmente, a espessura ONL nas retinas rdl6 injetadas com vetores inteína AAV foi significativamente maior (cerca de 60%, valor de p = 0,00281) do que a das retinas rdl6 injetadas de controle negativo (Fig. 5B). Consequentemente, os testes de função retinal com base nas respostas à luz pupilar (PLR) mostraram uma constrição pupilar significativamente maior (cerca de 20%, valor p = 0,00073) em camundongos rdl6 injetados com vetores inteína AAV do que em olhos rdl6 injetados com controle negativo (Fig. 5C).

[00261] Além disso, os inventores investigaram a segurança dos vetores inteína AAV na retina. Para este objetivo, camundongos C57BL / 6J de tipo selvagem foram injetados sub-retinalmente com vetores inteína AAV2/8-GRK1- ABCA4 ou - CEP290 (conjunto 1 e 5, respectivamente) (dose de cada vetor / olho ABCA4: 4,3 x 109 GC; dose de cada vetor / olho CEP290: 1,1 x 109 GC) e a atividade elétrica da retina foi medida por eletrorretinograma de Ganzfeld (ERG) 6 e 4,5 meses após a injeção, respectivamente. Em ambos os estudos, as amplitudes das ondas a e b foram semelhantes entre olhos de camundongos que foram injetados com vetores intein AAV (n = 14-15 en = ll, para ABCA4 e CEP290, respectivamente) e olhos injetados com vetores AAV de controle negativo (n = 8 en = 5 para ABCA4 e CEP290, respectivamente) ou PBS (n = 6- 7 e n = 6, para ABCA4 e CEP290, respectivamente). Da mesma forma, a espessura do ONL medido por tomografia de coerência óptica foi semelhante entre AAV inteina-, controle negativo- e olhos injetados com PBS (Fig. 24). Exemplo 8. Administração segura de grande gene mediada por inteína AAV

[00262] Embora nenhum sinal evidente de toxicidade tenha sido observado em camundongos de tipo selvagem injetados com inteína AAV, os inventores avaliaram a inclusão no sistema de trans-splicing de um degron que, uma vez incorporado no a inteína excisada leva a proteína fundida a uma rápida ubiquitinação e subsequente destruição do proteassoma (Fig. 6). A maioria dos degrons descritos são funcionais na posição N- ou C-terminal (ou seja, CL1, SMN, CIITA, ODC), esses degrons não podem ser fundidos com N- ou

C- inteína porque levarão à degradação da proteína hospedeira única, portanto subtração de polipeptídeos que precisam estar envolvidos na reação de Trans-Splicing de Proteína (PTS). Portanto, os inventores escolheram a forma mutada da di-hidrofolato redutase de E. coli (ecDHFR) que inclui três mutações de aminoácidos, R12Y, Y100I e G67S (69) que conferem atividade funcional apenas na posição N- ou interna.

[00263] Para testar a eficiência do ecDHFR na redução da quantidade da inteína excisada, os inventores geraram um vetor AAV que codifica a metade N-terminal do EGFP fundido com a metade N-terminal do Npu DnaE e ecDHFR (pAAV2.1-CMV- 5 'EGFP intein_ecDHFR). Assim, o degron estará na extremidade C-terminal onde deveria estar inativo. AAV-EGFP-ecDHFR intein plasmídeo em combinação com o vetor II (que codifica para a metade C-terminal de EGFP fundido à metade C-terminal de Npu DnaE (pAAV2.1-CMV-3 'EGFP intein)) foram usados para transfectar células HEK293 e avaliar a produção da proteína EGFP de comprimento total e inteína excisada. A proteína EGFP transplicada com níveis de proteína semelhantes em comparação com AAV inteína, foi detectada por análise de WB. Além disso, a quantidade de inteína excisada foi consideravelmente reduzida em lisados de células HEK293 após co-transfecção de plasmídeos de inteína AAV-EGFP-ecDHFR (Fig. 7). Então, os inventores decidiram aplicar a mesma estratégia à grande proteína ABCA4 (pAAV2.1-CMV260-5'ABCA4 inteina_ecDHFR). Quanto a EGFP, eles encontraram uma quantidade semelhante de ABCA4 de comprimento total de plasmídeos de inteína AAV-ABCA4-ecDHFR em comparação com AAV-ABCA4-inteína (Fig. 8A). É importante notar que foi observada uma abolição completa da inteína excisada (Fig. 8B).

[00264] Para provar que os inventores estão observando uma degradação de DnaE mediada por ecDHFR, as células foram tratadas com trimetoprima (TMP). O TMP é um antibiótico que pode se ligar ao ecDHFR evitando que a proteína seja degradada, o que permite que a proteína de fusão escape da degradação (69). Células HEK293 co- transfectadas com plasmídeos de inteína AAV-ABCA4-ecDHFR foram tratadas com dose aumentada de TMP e descobriram que a inteína DnaE não é mais degradada, a TMP estabiliza o ecDHFR de uma maneira dependente da dose, o que significa que a redução da inteína DnaE é mediada pelo ecDHFR (Fig. 9).

[00265] Uma limitação de incluir um degron em um vetor (além de inteínas) é que a capacidade de clonagem de AAV é ainda mais reduzida, resultando em vetores AAV de tamanho grande para alguma aplicação. Na verdade, o ecDHFR tem 159aa de comprimento. Assim, os inventores projetaram uma variante de ecDHFR mais curta de 105aa que retém o aminoácido relatado como crucial para sua atividade na posição N ou interna. Os inventores testaram este mini ecDHFR em ambos os plasmídeos EGFP e ABCA4 inteína (pAAV2.1-CMV-5 'EGFP inteína_mini ecDHFR; pAAV2.1-CMV260- 5' ABCA4 inteína_mini cDHFR). Após a co-transfecção de qualquer plasmídeo AAV-EGFP- ou ABCA4- mini ecDHFR inteina, eles encontraram expressão de proteína de comprimento total semelhante em comparação com os plasmídeos inteína AAV (Fig.10 e 11A) e uma forte redução do inteína DnaE (Fig.10 e 11B).

[00266] Estes resultados sugeriram que a inclusão de ecDHFR ou mini ecDHFR no sistema PTS medeia a degradação seletiva de inteína sem afetar significativamente a eficácia do trans-splicing da proteína e da produção de proteína terapêutica. Exemplo 9. Trans-splicing de proteína mediada por Inteína no fígado

[00267] Para testar a eficiência do trans-splicing da proteína mediada por inteína no fígado, dois vetores AAV, cada um codificando a metade N- ou C-terminal da proteína EGFP repórter fundida às metades N- e C- terminais do DnaE split-inteina de Nostoc punctiforme foram gerados.

[00268] Camundongos C57/BL6 de 5 semanas de idade foram injetados retro-orbitalmente com vetores AAV2/8 com o promotor de globulina de ligação de tiroxina humana específico do fígado (TBG) (dose de cada vetor / kg: 5 x 1011 GC). Os fígados foram colhidos 4 semanas após a injeção e lisados para análise por Western blot com anticorpo anti- 3xflag para detectar EGFP-3xflag e intein-3xflag. A quantificação da intensidade das bandas de EGFP mostrou que a inteína de AAV transduz o fígado de forma mais eficiente do que AAV duplo com quantidade de proteína cerca de 6 - 7 vezes maior. Exemplo 10. Os vetores inteína AAV podem ser usados para entregar o grande gene F8 afetado na hemofilia A

[00269] O gene F8, mutado na hemofilia A, é muito grande (cerca de 7 kb) para ser entregue por um único AAV em sua conformação de tipo selvagem. Por causa disso, apenas conformações de domínio B deletado (BDD) do gene foram adaptadas no contexto da terapia gênica de AAV. Recentemente, um cassete de expressão de 5 kb incluindo um BDD-F8 e um promotor específico do fígado curto e um sinal poliA foi empacotado em AAV5 e mostrou resultar em níveis terapêuticos de FVIII em camundongos e macacos cynomolgus (70), bem como em pacientes HemA (71). No entanto, o genoma deste vetor é ligeiramente superdimensionado e é empacotado em capsídeos de AAV como uma biblioteca de genomas truncados heterogêneos, que após a reconstituição em células alvo resultam em transdução eficaz. A eficiência de vetores AAV de tamanho grande é menor em comparação com o tamanho normal e a qualidade de tal produto com genomas truncados heterogêneos pode impedir seu desenvolvimento posterior para a comercialização.

[00270] Para superar a capacidade de carga limitada de AAV, uma estratégia de trans-splicing de proteína envolvendo dois vetores separados de AAV com genomas de tamanho regular, cada um codificando uma das 2 metades da grande proteína FVIII flanqueada pelas inteínas Npu DnaE divididas foi projetada.

[00271] O gene F8 de tipo selvagem foi dividido em 2 pontos de divisão diferentes no domínio B, a saber, conjunto 1 e conjunto 2. Os vetores de inteína F8 sob o promotor de fígado híbrido específico do fígado (HLP) juntamente com uma poliA sintética curta foram produzidos (Fig. 25A). Os genomas do vetor foram devidamente empacotados em capsídeos AAV, ao contrário de seu controle AAV BDD-F8 de tamanho grande, como mostrado por Southern blot (Fig. 25B).

[00272] Para determinar a relevância terapêutica da estratégia, os vetores intein AAV2 / 8 F8 foram injetados sistemicamente via infusão retro-orbital (dose de cada vetor / animal: 4-5 x 1011 GC) em hemofilia de 7-8 semanas de idade de um camundongo de nocaute. A análise de aPTT (tempo de tromboplastina parcial ativada) do plasma sanguíneo 8 semanas após a injeção mostrou leve correção do fenótipo de sangramento, embora não nos mesmos níveis que o controle AAV BDD-F8 único de tamanho grande (Fig. 25C).

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Claims (23)

REIVINDICAÇÕES

1. Sistema de vetor para expressar uma sequência de codificação em uma célula caracterizado pelo fato de que a referida sequência de codificação consistindo em uma primeira porção (CDS1), uma segunda porção (CDS2) e, opcionalmente, uma terceira porção (CDS3), o referido sistema de vetor compreendendo: a) um primeiro vetor compreendendo: - a referida primeira porção da referida sequência de codificação (CDS1), - uma primeira sequência de nucleotídeos de inteína que codifica para uma N-lnteína, estando a referida sequência localizada na extremidade 3' da CDS1; e b) um segundo vetor compreendendo: - a referida segunda porção da referida sequência de codificação (CDS2), - uma segunda sequência de nucleotídeos de inteína que codifica para um C-lnteína, estando a referida sequência localizada na extremidade 5' da CDS2; em que, quando o primeiro vetor e o segundo vetor são inseridos em uma célula, o produto de proteína da sequência de codificação é produzido por processamento de proteína; ou o referido sistema de vetor compreendendo: a') um primeiro vetor compreendendo: - a referida primeira porção da referida sequência de codificação (CDS1), - uma primeira sequência de nucleotídeos de inteína que codifica para um primeiro N-lnteína, estando a referida sequência localizada na extremidade 3' da CDS1; e b') um segundo vetor compreendendo: - a referida segunda porção da referida sequência de codificação (CDS2), - uma segunda sequência de nucleotídeos de inteína que codifica para um primeiro C-lnteína, estando a referida sequência localizada na extremidade 5' da CDS2; - uma terceira sequência de nucleotídeos de inteína que codifica para um segundo N-lnteína, estando a referida sequência localizada na extremidade 3' da CDS2; e c') um terceiro vetor compreendendo: - a dita a terceira porção da referida sequência de codificação (CDS3); - uma quarta sequência de nucleotídeos da inteína que codifica para um segundo C-lnteína, a referida sequência sendo localizada na extremidade 5' da CDS3, em que a primeira sequência de nucleotídeos de inteína é diferente da terceira sequência de nucleotídeos de inteína e a segunda sequência de nucleotídeos de inteína é diferente da quarta sequência de nucleotídeos de inteína, em que quando o primeiro vetor, o segundo vetor, o terceiro vetor são inseridos em uma célula, o produto da proteína da sequência de codificação é produzida por processamento de proteínas.

2. Sistema de vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira inteína, a segunda inteína, a terceira inteína e a quarta inteína codificam para uma inteína dividida, de preferência, a referida inteína dividida tem um comprimento máximo de 150 aminoácidos, mais preferencialmente, a referida inteína dividida é um inteína

DnaE ou DnaB. 3- Sistema de vetor, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que - a primeira sequência de nucleotídeos de inteína codifica para uma inteína selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID No 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou uma variante desta ou um fragmento desta ou um homólogo desta; - a segunda sequência de nucleotídeos inteína codifica para uma inteína selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ. ID No 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou sua variante ou um seu fragmento ou um seu homólogo; - a terceira sequência de nucleotídeos de inteína codifica para uma inteína selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID Nol, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou uma variante desta ou um fragmento desta ou um homólogo desta; - a quarta sequência de nucleotídeos de inteína codifica para uma inteína selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID No2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou uma variante desta ou um fragmento desta ou um homólogo desta.

4. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro vetor, o segundo vetor e o terceiro vetor compreendem ainda uma sequência de promotor operacionalmente ligada à porção extremidade 5' da referida primeira porção da sequência de codificação (CDS1) ou da referida segunda porção da sequência de codificação (CDS2) ou da referida terceira porção da sequência de codificação (CDS3).

5. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o primeiro vetor, o segundo vetor e o terceiro vetor compreendem ainda uma sequência de nucleotídeos de repetição do terminal 5' (5'-TR) e uma sequência de nucleotídeos de repetição do terminal 3' (3'-TR), de preferência, a 5'-TR é uma sequência de nucleotídeo de repetição terminal(5'-ITR) invertida 5' e a 3'-TR é uma sequência de nucleotídeo de repetição de terminal (3'-ITR) invertido 3'.

6. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro vetor, o segundo vetor e o terceiro vetor compreendem ainda uma sequência de nucleotídeos de sinal de poliadenilação e / ou em que pelo menos um do primeiro vetor ou do segundo vetor ou do terceiro vetor compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica para um sinal de degradação.

7. Sistema de vetor, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o sinal de degradação é selecionado a partir do grupo que consiste em CL1, PB29, SMN, CIITA, ODc, ecDHFR ou um fragmento do mesmo.

8. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação é dividida na primeira porção, na segunda porção e, opcionalmente, na terceira porção, em uma posição que consiste em um aminoácido nucleófilo que não se enquadra em um domínio estrutural ou um domínio funcional do produto de proteína codificado, em que o aminoácido nucleófilo é selecionado de serina, treonina ou cisteína.

9. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre o primeiro vetor, o segundo vetor e o terceiro vetor compreende ainda pelo menos um intensificador ou sequência de nucleotídeos reguladora, operacionalmente, ligada à sequência de codificação.

10. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação codifica uma proteína capaz de corrigir um estado ou distúrbio patológico, de preferência, o distúrbio é uma degeneração retinal, um distúrbio metabólico, um distúrbio hematológico, um distúrbio neurodegenerativo, perda de audição, canelopatia, doença pulmonar, miopatia, doença cardíaca.

11. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação codifica uma proteína capaz de corrigir um estado patológico ou distúrbio, de preferência, o distúrbio é uma degeneração retinal, de preferência, a degeneração retinal é hereditária, de preferência, a patologia ou doença é selecionados do grupo que consiste em: retinite pigmentosa (RP), amaurose congênita de Leber (LCA), doença de Stargardt (STGD), doença de Usher (USH), síndrome de Alstrom, cegueira noturna congênita estacionária (CSNB), distrofia macular, distrofia macular oculta, uma doença causada por uma mutação no gene ABCA4.

12. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação codifica uma proteína capaz de corrigir distrofia muscular de Duchenne, fibrose cística, hemofilia A, doença de Wilson, fenilcetonúria,

disferlinopatias, síndrome de Rett, doença renal policística, Niemann-Pique tipo C, doença de Huntington.

13. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação é a sequência de codificação de um gene selecionado do grupo que consiste em: ABCA4, MY07A, CEP290, CDH23, EYS, PCDH15, CACNA1, SNRNP200, RP1, PRPF8, RP1L1, ALMS1, USH2A, GPR98, HMCN1.

14. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação é a sequência de codificação de um gene selecionado do grupo que consiste em: DMD, CFTR, F8, ATP7B, PAH, DYSF, MECP2, PKD, NPC1 HTT.

15. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende: a) um primeiro vetor compreendendo em uma direção 5'- 3': - uma sequência de repetição terminal invertida 5'(5'- ITR); - uma sequência promotora; - uma porção da extremidade 5' de uma sequência de codificação (CDS1), a referida porção da extremidade 5' estando operacionalmente ligada a e sob o controle do referido promotor; - uma primeira sequência de nucleotídeos inteína que codifica para um N-lntein; e - uma sequência de repetição terminal invertida 3'(3'- ITR); e b) um segundo vetor compreendendo na direção 5'-3': - uma sequência de repetição terminal invertida 5'(5'- ITR); - uma sequência promotora; - uma segunda sequência de nucleotídeos inteína que codifica para um C-lntein; - uma porção extremidade 3' da sequência de codificação (CDS2); e - uma sequência de repetição terminal invertida 3'(3'- ITR); ou compreendendo: a') um primeiro vetor compreendendo em uma direção 5'- 3': - uma sequência de repetição terminal invertida 5'(5'- ITR); - uma sequência promotora; - uma porção da extremidade 5' de uma sequência de codificação (CDS1'), a referida porção da extremidade 5' estando operacionalmente ligada a e sob o controle do referido promotor; - uma primeira sequência de nucleotídeos inteína que codifica para um primeiro N-lntein; e - uma sequência de repetição terminal invertida 3' (3'- ITR); e b') um segundo vetor compreendendo na direção 5'-3': - uma sequência de repetição terminal invertida 5' (5'- ITR); - uma sequência promotora; - uma segunda sequência de nucleotídeos inteína que codifica para um primeiro C-lntein; - uma segunda porção da sequência de codificação (CDS2'); e - uma terceira sequência de nucleotídeos inteína que codifica para uma segunda N-inteína; - uma sequência de repetição terminal invertida 3' (3'- ITR); e c') um terceiro vetor compreendendo na direção 5'-3': - uma sequência de repetição terminal invertida 5' (5'- ITR); - uma sequência promotora; - uma quarta sequência de nucleotídeos inteína que codifica para um segundo C-lntein; - a terceira porção da sequência de codificação (CDS3 '); e - uma sequência de repetição terminal invertida 3' (3'- ITR).

16. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação codifica o gene ABCA4, de preferência, a referida sequência de codificação é dividida em um nucleotídeo correspondente a aa Cysll50, Serll68, Ser 1090 da proteína ABCA4, e uma inteína dividida é inserida no ponto de divisão ou a sequência de codificação codifica o gene CEP290, de preferência, a referida sequência de codificação é dividida em um nucleotídeo correspondente a aa Cysl076; Serl275 da proteína CEP290, de preferência, a sequência de codificação que codifica o gene CEP290 é dividida em uma sequência de nucleotídeos correspondente a aa Cys 929 e 1474; Ser 453 e Cys 1474 da referida proteína CEP290, e duas inteínas divididas são inseridas nos pontos de divisão.

17. Sistema de vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro, segundo e terceiro vetor são independentemente um vetor viral, de preferência, um vetor adeno viral ou vetor viral adeno-associado (AAV), de preferência, o referido primeiro, segundo e terceiro vetores virais adeno-associados (AAV) são selecionados a partir do mesmo ou de diferentes sorotipos de AAV, de preferência, o serotipo é selecionado a partir do serotipo 2, serotipo 8, serotipo 5, serotipo 7 ou serotipo 9, serotipo 7m8, serotipo shlO; serotipo 2 (quad Y-F).

18. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que é transformada com o sistema de vetor conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

19. Sistema de vetor, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 17 ou célula hospedeira, conforme definido pela reivindicação 18 caracterizado pelo fato de que é para uso médico.

20. Sistema de vetor, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 19, ou célula hospedeira, conforme definido pela reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia gênica, de preferência, para uso no tratamento e / ou prevenção de uma patologia ou doença compreendendo uma degeneração retinal, distúrbio metabólico, um distúrbio hematológico, um distúrbio neurodegenerativo, perda auditiva, canelopatia, doença pulmonar, miopatia,

doença cardíaca.

21. Sistema de vetor ou célula hospedeira, acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a degeneração retinal é hereditária, de preferência, a patologia ou doença é selecionada do grupo que consiste em: retinite pigmentosa (RP), amaurose congênita de Leber (LCA), doença de Stargardt (STGD), doença de Usher (USH), síndrome de Alstrom, cegueira noturna congênita estacionária (CSNB), distrofia macular, distrofia macular oculta, uma doença causada por uma mutação no gene ABCA4.

22. Sistema de vetor ou célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção e / ou tratamento da distrofia muscular de Duchenne, fibrose cística, hemofilia A, doença de Wilson, Fenilcetonúria, disferlinopatias, síndrome de Rett, Doença renal policística, Niemann -Pique tipo C, doença de Huntington.

23. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o sistema de vetor conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 17 ou a célula hospedeira conforme definido pela reivindicação 18 e veículo farmaceuticamente aceitável.

Promotor Promotor

Petição 870210034448, de 15/04/2021, pág. 194/229 Tradução

Proteína Trans-processamento 1/35

Figura 1 Inteína excisada Comprimento total da proteína

AAV único AAV inteína AAV duplo α-β actina α-β actina

AAV duplo AAV inteína AAV único

Figura 1 (continuação)

inteína duplo único

AAV

AAV

AAV Figura 1 (continuação)

Conjunto Conjunto Conjunto 1 2 3

Conjunto Conjunto Conjunto Conjunto Conjunto 1 2 3 4 5

Figura 2 pAAV inteína

Figura 2 (continuação)

pAAV inteína

Figura 2 (continuação)

AAV AAV inteína duplo AAV inteína

AAV duplo Figura 3

AAV AAV inteína duplo Disferlina Retina inteira

AAV AAV inteína duplo Disferlina Retina inteira Figura 4

AAV AAV inteína duplo Disferlina

AAV inteína Organoide inteiro (-/-) Figura 4 (continuação)

Área de grânulos lipofuscina (nm2/25µm2)

AAV inteína

Figura 5

AAV inteína Tipo selvagem

Espessura ONL

Figura 5 (continuação)

AAV inteína Tipo selvagem

Diâmetro da pupila/olho (média ±DP)

Olhos (n)

Figura 5 (continuação)

Tradução Tradução

C-inteína N-inteína

C-polipeptídeo N-polipeptídeo

Proteína precursora

Proteína trans- processamento

Comprimento total da proteína Inteína excisada

Proteassoma

Inteína degradada

Figura 6 pAAV inteína

Figura 7 pAAV inteína pAAV inteína α-calnexina α-Actina

Figura 8 pAAV inteína + ecDHFR

Trimetropina: pAAV inteína α-Actina

Figura 9 pAAV inteína α-Actina

Figura 10 pAAV inteína pAAV inteína α-Calnexina α-Actina

Figura 11

Campo Brilhante

Figura 12

AAV inteína α-β-actina

AAV inteína α-β-actina

Retina inteira pAAV inteína α-β-actina

Figura 13

Figura 14

AAV inteína α-β-actina

Organoide inteiro

Figura 15

Promotor Promotor

Petição 870210034448, de 15/04/2021, pág. 216/229 Conjunto 1

Promotor Promotor

Conjunto 23/35

2

Figura 16 Promotor Promotor

Conjunto 3

Promotor Promotor

Conjunto

Petição 870210034448, de 15/04/2021, pág. 217/229 1 Promotor Promotor

Conjunto 2

Promotor Promotor

Conjunto 3 24/35

Promotor Promotor

Figura 16 (continuação) Conjunto 4

Promotor Promotor

Conjunto 5

Campo Campo Campo Brilhante Brilhante Brilhante

Figura 17

Fusão Ac-tubulina

Figura 18

Figura 19

Avv Avv Avv inteína Avv duplo inteína duplo α-Disferlina α-Disferlina

Retina inteira Retina inteira

Avv Avv Avv Avv duplo inteína inteína duplo α-Disferlina α-Disferlina

Retina inteira Retina inteira

Avv Avv inteína Avv Avv duplo duplo inteína α-Disferlina α-Disferlina

Retina inteira Retina inteira

Avv Avv Avv inteína duplo inteín a α-Disferlina α-Disferlina

Retina inteira Retina inteira

Avv inteína α-Disferlina

Retina inteira

Figura 20

AAV inteína

1/6 de retina 5/6 de retina

Figura 21

AAV AAV inteína inteína Organoide inteiro (-/- Organoide inteiro (-/-) )

AAV AAV inteína inteína Organoide inteiro (-/-) Organoide inteiro (-/-) Figura 22

Tipo selvagem

AAV inteína

Figura 23

Espessura ONL (µm)

AAV neg AAV inteína Olhos (n)

Figura 24

Petição 870210034448, de 15/04/2021, pág. 226/229 Promotor HLP

PoliA sintética

Promotor HLP 33/35

Promotor HLP

Figura 25 PoliA sintética PoliA sintética

Figura 25 (continuação)

8 semanas pós injeção

Figura 25 (continuação)