CN113348249A - 内蛋白及其用途 - Google Patents

内蛋白及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113348249A
CN113348249A CN201980081288.0A CN201980081288A CN113348249A CN 113348249 A CN113348249 A CN 113348249A CN 201980081288 A CN201980081288 A CN 201980081288A CN 113348249 A CN113348249 A CN 113348249A
Authority
CN
China
Prior art keywords
endoprotein
aav
seq
sequence
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980081288.0A
Other languages
English (en)
Inventor
A.奥里克奇奥
I.特拉帕尼
P.托纳贝内
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN113348249A publication Critical patent/CN113348249A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及允许有效基因疗法，特别是大于5Kb的基因的有效基因疗法的构建体、载体、相关宿主细胞和药物组合物。

Description

内蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及构建体、载体、相关宿主细胞和药物组合物，其允许有效基因疗法，特别是针对由编码序列(CDS)大于5Kb的基因的突变所引起的疾病的有效基因疗法。
背景技术
利用腺相关病毒(AAV)载体的基因治疗对于人而言是安全有效的。基于AAV的基因治疗产品近年来已在美国和欧洲得到批准用于遗传性代谢和致盲性疾病，而针对不同治疗领域的疾病的基于AAV的基因疗法方法的临床试验也在不断增加，所述疾病范围为眼科至血液病至肌骨骼和代谢疾病。
但是，AAV载体货物容量的限制阻止开发针对编码序列(CDS)大于5kb的基因(在本文中也称为大基因)的突变所引起的疾病的基于AAV的疗法。
大基因突变所引起的遗传疾病(列于下表1中)包括DMD基因突变引起的迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)、CFTR基因突变引起的囊性纤维化、F8基因突变引起的血友病A、DYSF基因突变引起的dysferlin病变(dysferlinopathies)、PKD基因突变引起的多囊肾疾病、ATP7B基因突变引起的威尔逊(Wilson)病、HTT基因突变引起的亨廷顿氏病、NPC1基因突变引起的C型尼曼-匹克氏症。
表1：大基因突变引起的遗传疾病
Figure BDA0003105985640000011
Figure BDA0003105985640000021
此外，一些遗传性视网膜变性(IRD)是由于下表2所列大基因突变所致。在欧洲和美国，3000人中约1人受到IRD的影响(58)。
最常见且最严重的IRD是色素性视网膜炎(RP)、利伯先天性黑矇(Lebercongenital amaurosis，LCA)和斯塔加特病(STGD)，它们通常以单基因病况遗传，全球总体流行率为1/2,000(1)，并且是世界范围内引起失明的主要原因。导致IRD的大多数突变都发生在视网膜中神经元感光器(PR)、视杆和/或视锥中表达的基因中(2)。
基因疗法在治疗IRD方面有广阔前景。首个用于遗传性失明形式的基于腺相关病毒(AAV)载体的基因治疗产品于2017年12月获得批准(3)。此外，许多其他基于AAV的产品目前正在临床开发中，以用于罕见和常见失明形式的基因治疗(4)。尽管目前已经公认AAV代表了迄今为止最有效的视网膜基因治疗载体(4，5)，但其有限的货物容量阻碍其用于治疗需要递送大小超过5kb的DNA序列的病症(6)，所述DNS序列不仅包括转基因，而且还包括其表达所必需的顺式调控元件。
下表2中汇总了大小超过5kb的疾病基因的示例。
表2：大小超过5kb的疾病基因
Figure BDA0003105985640000022
Figure BDA0003105985640000031
斯塔加特病(STGD；MIM#248200)是最常见形式的由ABCA4基因(CDS：6822bp)突变引起的遗传性黄斑变性，该基因编码位于PR外节的全反式视网膜转运蛋白(7)；IB型乌谢尔综合征(USH1B；MIM#276900)是最严重形式的RP和耳聋，是由编码非常规MYO7A的MYO7A基因(CDS：6648bp)突变引起的(8)，此MYO7A是在视网膜内PR和RPE这两者中表达的基于肌动蛋白的运动原(9-11)。
3型视锥-视杆营养不良、眼底黄色斑点症(fundus flavimaculatus)、2型年龄相关黄斑变性、早发性严重视网膜营养不良和19型色素性视网膜炎也与ABCA4突变相关(在本文中称为ABCA4相关疾病)。
本发明人和他人已经表明，可以通过使用双重(最多9kb)(6、12、13)或三重(最多14kb)(14)AAV载体来克服这一局限，每个载体均含有大转基因表达盒的编码序列(CDS)的片段。双重和三重AAV载体利用AAV基因组的连环化和重组来重构被多个AAV载体共同感染的细胞中的全长基因组。但是，对于作为大多数遗传性视网膜疾病的主要治疗靶标的感光器而言，使用双重AAV载体或三重AAV载体实现的转基因表达效率低于利用单个AAV载体实现的转基因表达效率(6、14、15)。这可能是由于有效转导所需的各种限制步骤，包括适当的DNA多联体形成、异质mRNA的稳定性以及跨载体接合处的剪接效率。
本发明人在W02014/170480以及Colella等人(15)中表明，双重AAV载体通过剪接(反式剪接)、同源重组(重叠)或这两者的组合(杂交)来重构大基因，进而发现双重反式剪接和杂交载体对于治疗遗传性视网膜变性特别有效。此外，Maddalena等人(14)展示了一种针对高达14kb的基因的三重AAV载体方法。但是，采用双重或三重AAV载体实现的转基因表达的效率低于用单一AAV载体实现的转基因表达效率(6、13、14)。这可能是由于有效转导所需的各种限制步骤所致，包括：正确的DNA多联体形成、异质mRNA的稳定性以及跨载体接合处的剪接效率。此外，三重AAV载体策略产生的基因表达水平低于治疗方法所需的阈值。
因此，仍然需要可用于重构大基因表达以进行有效基因治疗的构建体和载体。
本发明人现已发现，递送各自编码报道物或大治疗性蛋白质的片段中的一者、且两侧是短分裂型内蛋白的多个AAV载体，可在体外和体内这两者均实现蛋白质反式剪接和全长蛋白质重构。
内蛋白是在宿主蛋白内转录和翻译的遗传元件，它们在没有能量供应、外源宿主特异性蛋白酶或辅助因子的情况下以与蛋白内含子类似的方式自切除，而不会在蛋白质最终产物中留下氨基酸修饰(16、17、27、28)。内蛋白的活性是背景依赖性的，其连接接合处周围具有发生有效反式剪接所必需的某些肽序列(称为N-和C-外显蛋白(extein))，其中最重要的是作为C-外显蛋白中的第一残基的含有巯基或羟基的氨基酸(例如半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸)(18)。分裂型内蛋白是内蛋白的一个子集，其在两个宿主蛋白的末端处表达为两个分开的多肽，并且催化它们的反式剪接，从而产生单个较大的多肽(19)。包括分裂型内含子在内的内含子广泛用于生物技术应用中，包括蛋白质纯化和标记步骤(19、20)，以及重构广泛使用的CRISPR/Cas9基因组编辑核酸酶(21、22)。
在利用基于内蛋白的蛋白质剪接来重构包括因子VIII基因的治疗性基因的表达方面已做出数种尝试，其中证明了因子VIII的集囊藻(Synechocystis sp.，Ssp)DnaB内蛋白融合重链和轻链基因可引发细胞培养物中和动物模型中的VIII因子重构(23、24)。类似地，肌营养不良蛋白基因的高功能形式在体外和体内表达，其中将6.3-kb Becker型肌营养不良蛋白基因分裂到两个AAV载体上，并且将各一半融合以分裂从集囊藻PCC 6803(Ssp)DnaB内蛋白或海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus(Rma))DnaB内蛋白获得的内蛋白(25)。此外，分裂型内蛋白(即点状念珠藻(N.punctiforme))DnaE分裂型内蛋白)介导的蛋白质反式剪接策略据称可以从心脏细胞中的两个分开片段重构L型钙通道的大孔形成亚单位(26)。US 6,544,786进一步报道了使用分裂型内蛋白来递送肌营养不良蛋白小基因。
本发明人利用分裂型内蛋白的内在能力来介导蛋白质反式剪接，以将大的全长蛋白质片段化为两个或三个侧翼为分裂型内蛋白的多肽，然后再重构大的全长蛋白质，所述多肽的编码序列适合单一AAV载体。
因此，本发明通过向靶细胞提供两个或更多个所述大蛋白的片段来实现细胞大蛋白的重构，所述大蛋白的片段与分裂型内蛋白融合，以促进内蛋白介导的反式剪接并且重构功能性蛋白。
发明内容
本发明提供用于由于基因突变，特别是编码区超过5kb的基因突变引起的疾病的利用AAV载体的基因疗法。
基于单细胞生物体使用由分裂型内蛋白介导的蛋白质反式剪接进行蛋白质重构的发现，本发明人构建了多个AAV载体，每个载体均编码侧翼有短分裂型内蛋白的报道物或大治疗性蛋白质的片段中的一者，进而引发体内和体外的蛋白质反式剪接和全长蛋白质重构。
有利地，与本领域中已知的基于AAV的大蛋白方法相比，通过本发明对疾病蛋白实现的基于AAV的蛋白质反式剪接介导的重构提供了更高的靶蛋白表达量。这可能是由于克服了有效转导基于双重载体的系统所需的各种限制性步骤，包括：形成正确的DNA多联体、异质mRNA的稳定性以及跨载体接合处的剪接效率。
本发明提供了在细胞中表达编码序列的载体系统，所述编码序列由第一部分(CDS1)、第二部分(CDS2)和任选的第三部分(CDS3)组成，所述载体系统包括：
a)第一载体，所述第一载体包括：
-所述编码序列的所述第一部分(CDS1)，
-编码N-内蛋白的第一内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS1的3′末端；以及
b)第二载体，所述第二载体包括：
-所述编码序列的所述第二部分(CDS2)，
-编码C-内蛋白的第二内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS2的5’末端；
其中当将所述第一载体和第二载体插入细胞中时，通过蛋白质剪接来产生所述编码序列的所述蛋白质产物；
或者所述载体系统包括：
a′)第一载体，所述第一载体包括：
-所述编码序列的所述第一部分(CDS1)，
-编码第一N-内蛋白的第一内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS1的3’末端；以及
b′)第二载体，所述第二载体包括：
-所述编码序列的所述第二部分(CDS2)，
-编码第一C-内蛋白的第二内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS2的5’末端；
-编码第二N-内蛋白的第三内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS2的3′末端；以及
c′)第三载体，所述第三载体包括：
-所述编码序列的第三部分(CDS3)
-编码第二C-内蛋白的第四内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS3的5′末端
其中所述第一内蛋白核苷酸序列与所述第三内蛋白核苷酸序列不同，并且所述第二内蛋白序列与所述第四内蛋白核苷酸序列不同，其中当将所述第一载体、所述第二载体、所述第三载体插入细胞中时，通过蛋白质反式剪接来产生所述编码序列的所述蛋白质产物。
优选地，在所述载体系统中，所述第一内蛋白、所述第二内蛋白、所述第三内蛋白和所述第四内蛋白编码分裂型内蛋白，优选地，所述分裂型内蛋白的最大长度为150个氨基酸，更优选地，所述分裂型内蛋白是DnaE或DnaB内蛋白。
根据本发明，内蛋白是蛋白质的片段，其能够切除自身并且以称为蛋白质剪接的过程用肽键将剩余部分(外显蛋白)连接。片段称为“内蛋白”，代表内部蛋白序列，并且“外显蛋白”代表外部蛋白序列，其中上游外显蛋白称为“N-外显蛋白”并且下游外显蛋白称为“C-外显蛋白”，并且上游内蛋白称为“N-内蛋白”并且下游内蛋白称为“C-内蛋白”。
因此，在本发明的上下文中，N-内蛋白是位于第一多肽的N-末端(并与第一多肽融合)的内蛋白片段，并且C-内蛋白是位于第二多肽的C末端(并与第二多肽融合)的内蛋白片段，其中在表达两种多肽之后，两个内蛋白片段进行蛋白质反式剪接并且连接形成完整的内蛋白，并且将两个多肽连接在一起，其中当两个多肽形成全长蛋白质时重构所述全长蛋白质。
根据本发明，第一内蛋白序列是N-内蛋白序列并且第二内蛋白序列是C-内蛋白序列，其中所述N-内蛋白和所述C-内蛋白优选地源自相同的内蛋白或分裂型内蛋白基因。替代地，所述N-内蛋白和所述C-内蛋白源自两种不同的内蛋白基因，所述内蛋白基因能够自然进行反式剪接反应，或者经修饰以进行所述反式剪接反应。相应地，相同的基因可以来自相同的生物体或不同的生物体。例如，广泛使用的分裂型内蛋白源自不同生物体的DnaE基因。根据本发明，当将目的蛋白质的编码序列分裂为两个部分时，将N-内蛋白编码序列与编码目的蛋白质的N-末端部分的序列在框内融合；将C-内蛋白编码序列与编码目的序列的C-末端部分的序列在框内融合。表达两个前体融合蛋白之后，内蛋白经历自催化切除并且形成连接的外显蛋白，例如重构的目的蛋白质。
根据本发明，目的蛋白质的编码序列可以分裂为三个部分。相应地，第一内蛋白序列是N-内蛋白序列并且第二内蛋白序列是C-内蛋白序列，其中所述第一内蛋白编码序列在C端与编码目的蛋白质的N-部分的序列在框内融合，并且第二内蛋白编码序列与编码目的蛋白质中间部分的序列的N末端在框内融合。相应地，所述N-内蛋白和所述C-内蛋白优选地源自相同的内蛋白或分裂型内蛋白基因。替代地，所述N-内蛋白和所述C-内蛋白源自两种不同的内蛋白基因，所述内蛋白基因能够自然地进行反式剪接反应，或者经修饰以进行所述反式剪接反应。相应地，相同的基因可以来自相同的生物体或不同的生物体。在本发明的配置内，第三内蛋白是与编码目的蛋白质中间部分的C-末端的序列在框内融合的N-内蛋白编码序列，并且第四内蛋白是与编码目标蛋白质的C部分N末端的序列在框内融合的C-内蛋白编码序列。相应地，所述第三内蛋白和第四内蛋白优选地源自相同的内蛋白或分裂型内蛋白基因。替代地，所述N-内蛋白和所述C-内蛋白源自两种不同的内蛋白基因，所述内蛋白基因能够自然地进行反式剪接反应，或者经修饰以进行所述反式剪接反应。相应地，相同的基因可以来自相同的生物体或不同的生物体。在本发明的范围内，所述第一内蛋白和第二内蛋白以及所述第三内蛋白和第四内蛋白源自不同内蛋白基因，并且所述第一内蛋白选择性地与所述第二内蛋白接合，而所述第三内蛋白选择性地与所述第四内蛋白结合。
在本发明中，当将第一载体、第二载体和任选的第三载体插入细胞中时，形成至少两种融合蛋白或三种融合蛋白，并且当接触所述两种融合蛋白或三种融合蛋白时，产生所述编码序列的蛋白质产物。接触步骤在允许N-内蛋白与C-内蛋白结合的条件下进行。
在本发明中，当将所述第一载体、第二载体和第三载体插入细胞中时，产生三种独立的多肽，并且通过反式剪接产生全长蛋白质。三种AAV内蛋白载体形成的关键是使用不同的内蛋白，即DnaE和DnaB，它们不发生交叉反应，从而防止第一载体和第三载体产生的多肽之间发生不当反式剪接。
根据本发明的优选实施方案，在细胞中表达目的基因的编码序列的载体系统包括两种载体，每个载体包括侧翼有内蛋白序列的所述编码序列的一部分，其中所述编码序列的5′末端在3′末端处侧翼有N-内蛋白序列，并且目的基因的编码序列的3′末端侧翼有C-内蛋白的序列，使得当这两种载体在细胞中表达时，产生两种融合蛋白，并且由于自发的反式剪接反应而生成目的全长蛋白。
根据本发明的另一个优选实施方案，在细胞中表达目的基因的编码序列的载体系统包括三种载体，每种载体包括侧翼有内蛋白序列的所述编码序列的一部分，其中所述编码序列分为三个部分，使得所述编码序列的5′末端在3′末端处侧翼有第一N-内蛋白的序列；所述编码序列的中间部分在5′末端处侧翼有第一C-内蛋白，并且在3′末端处侧翼有第二N-内蛋白；所述编码序列的3′部分在5′末端处侧翼有第二C-内蛋白，使得当所有三种载体在细胞中表达时，产生三种融合蛋白，并且由于自发反式剪接反应而生成目的全长蛋白，其中所述第一N-内蛋白与所述第一C-内蛋白反应，并且所述第二N-内蛋白与所述第二C-内蛋白反应。
本发明的分裂型内蛋白可以由一个基因编码，所述基因然后经工程化改造以编码两个单独的内蛋白片段，例如分裂型内蛋白；替代地，天然存在的分裂型内蛋白由两个独立的基因编码；例如在蓝细菌中，DnaE，DNA聚合酶III的催化亚单位α被两个独立的基因dnaE-n和dnaE-c编码。本发明中优选的内蛋白是源自内蛋白蛋白质(例如小内蛋白)的内蛋白或通过反式剪接反应形成内蛋白的分裂型内蛋白，其长度为150aa或以下。
本发明的分裂型内蛋白可以与天然存在的内蛋白或SEQ ID No.1到14(同系物)100％、98％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％相同，其中所述内蛋白保留进行反式剪接反应的能力。保留反式剪接活性的天然存在或经修饰的内蛋白的片段或变体在本发明范围内的。
方便地，本发明的分裂型内蛋白可以源自自不同生物体分离的相同基因。优选的内蛋白基因是Dna B和DnaE。
在一个优选的实施方案中，本发明的内蛋白是源自来自蓝细菌的DnaE基因(例如DNA聚合酶III亚单位α)的分裂型内蛋白，包括点状念珠藻(Nostoc punctiforme，Npu)、集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803(Ssp)、费氏藻(Fischerella sp.)PCC 9605、单歧伪枝藻(Scytonema tolypothrichoides)、蓝细菌SW_9_47_5、泡沫节球藻(Nodulariaspumigena)、发状念珠藻(Nostoc flagelliforme)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)WH 8502、古巴拟色球藻(Chroococcidiopsis cubana)CCALA 043、红海束毛藻(Trichodesmium erythraeum)；优选地，本发明的内蛋白源自从点状念珠藻或集胞藻PCC6803分离的Dna E基因。
在另一个优选的实施方案中，本发明的内蛋白是源自来自蓝细菌的DnaB基因的分裂型内蛋白，包括例如(59)中描述的海洋红嗜热盐菌(R.marinus，Rma)、集胞藻PC6803(Ssp)、紫红紫菜(Porphyra purpurea)叶绿体(Ppu)。
优选地，
-所述第一内蛋白核苷酸序列编码选自由以下项构成的群组的内蛋白：SEQ.ID.No.1、3、5、7、9、11、13或其变体，或其片段或其同系物；
-所述第二内蛋白核苷酸序列编码选自由以下项构成的群组的内蛋白：SEQ.ID.No.2、4、6、8、10、12、14或其变体，或其片段或其同系物；
-所述第三内蛋白核苷酸序列编码选自由以下项构成的群组的内蛋白：SEQ.ID.No.1、3、5、7、9、11、13或其变体，或其片段或其同系物；
-所述第四内蛋白核苷酸序列编码选自由以下项构成的群组的内蛋白：SEQ.ID.No.2、4、6、8、10、12、14或其变体，或其片段或其同系物；
优选地，其中当所述第一内蛋白或所述第三内蛋白是SEQ.ID.No.1时，第二内蛋白或第四内蛋白是SEQ.ID 2；或者当所述第一内蛋白或第三内蛋白是SEQ ID 3时，所述第二内蛋白或第四内蛋白是SEQ ID 4；或者当第一内蛋白或第三内蛋白是SEQ ID5时，所述第二内蛋白或第四内蛋白是SEQ ID6；或者当所述第一内蛋白或第三内蛋白是SEQ ID 7时，所述第二内蛋白或第四内蛋白是SEQ ID 8；或者当所述第一内蛋白或第三内蛋白是SEQ ID 9时，所述第二内蛋白或第四内蛋白是SEQ ID 10；或者当所述第一内蛋白或第三内蛋白是SEQ ID11时，所述第二内蛋白或第四内蛋白是SEQ ID 12。
优选地，当所述第一内蛋白是SEQ ID 1并且所述第二内蛋白是SEQ ID 2时，所述第三内蛋白不是SEQ ID 1并且第四内蛋白不是SEQ ID 2；优选地，当所述第一内蛋白是SEQID 3并且所述第二是SEQ ID 4时，所述第三内蛋白不是SEQ ID 3并且所述第四内蛋白不是SEQ ID 4；优选地，当所述第一内蛋白是SEQ ID 5并且所述第二内蛋白是SEQ ID 6时，所述第三内蛋白不是SEQ ID 5并且所述第四内蛋白不是SEQ ID 6；优选地，当所述第一内蛋白是SEQ ID 7并且所述第二内蛋白是SEQ ID 8时，所述第三内蛋白不是SEQ ID 7并且所述第四内蛋白不是SEQ ID 8；优选地，当所述第一内蛋白是SEQ ID 9并且所述第二内蛋白是SEQID 10时，所述第三内蛋白不是SEQ ID 9并且所述第四内蛋白不是SEQ ID 10；优选地，当所述第一内蛋白是SEQ ID 11并且所述第二内蛋白是SEQ ID 12时，所述第三内蛋白不是SEQID 11并且所述第四内蛋白不是SEQ ID 12。
在一个具体的实施方案中，所述第一内蛋白是SEQ ID1，所述第二内蛋白是SEQID2，所述第三内蛋白是SEQ ID 3，并且所述第四内蛋白是SEQ ID 4；或者，所述第一内蛋白是SEQ ID 5，所述第二内蛋白是SEQ ID 6，所述第三内蛋白是SEQ ID 3，并且所述第四内蛋白是SEQ ID 4。
在一个优选的实施方案中，所述第一载体、第二载体和第三载体进一步包括启动子序列，所述启动子序列可操作地连接到所述编码序列的所述第一部分(CDS1)的5′末端部分，或者所述编码序列的所述第二部分(CDS2)的5′末端部分，或者所述编码序列的所述第三部分(CDS3)的5′末端部分。
优选的启动子是遍在的、人工的或组织特异性的启动子，包括保留转录启动子活性的其片段和变体。特别优选的启动子是感光器特异性启动子，包括感光器特异性人G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)、感光器间类视色素结合蛋白启动子(IRBP)、视紫红质启动子(RHO)、卵黄状黄斑营养不良2启动子(VMD2)、视紫红质激酶启动子(RK)；进一步特别优选的启动子是肌肉特异性启动子，包括MCK、MYODI；肝特异性启动子，包括甲状腺素结合球蛋白(TBG)、杂合肝特异性启动子(HLP)(67)；神经元特异性启动子，包括hSYN1、CaMKIIa；肾脏特异性启动子，包括Ksp-钙粘着蛋白16、NKCC2。根据本发明的遍在启动子是例如遍在巨细胞病毒(CMV)(32)和短CMV(33)启动子。本发明范围内的更优选的启动子是GRK1、TBG、CaMKIIa、Ksp-钙粘着蛋白16。
在一个更优选的实施方案中，所述第一载体、第二载体和第三载体进一步包括5′-末端重复(5′-TR)核苷酸序列和3′-末端重复(3′-TR)核苷酸序列，优选地，5′-TR是5′-反向末端重复(5′-ITR)核苷酸序列，并且3′-TR是3′-反向末端重复(3′-ITR)核苷酸序列。
在一个更优选的实施方案中，所述第一载体、第二载体和第三载体进一步包括聚腺苷酸化信号核苷酸序列。
在一个更优选的实施方案中，所述编码序列在如下位置处分裂为所述第一部分、所述第二部分和任选地所述第三部分，所述位置由不落入编码的蛋白质产物的结构域或功能域内的亲核氨基酸组成，其中所述亲核氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸。
优选地，所述第一载体、所述第二载体和所述第三载体中的至少一者进一步包括可操作地连接到所述编码序列的至少一个增强子或调节核苷酸序列。
优选的增强子或调节核苷酸序列是珠蛋白IgG嵌合内含子、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。
任选地，所述第一载体、所述第二载体和所述第三载体中的至少一者进一步包括至少一个降解信号，以降低重构内蛋白的稳定性。
优选地，所述降解信号是CL1降解决定子(degron)或PB29降解决定子。更优选地，所述降解信号是ecDHFR或其片段，优选地，ecDHFR降解信号是充当本文所述的内部降解决定子的DHFR变体。最优选地，所述片段保留ecDHFR的降解特性，优选地，功能为内部降解决定子的变体DHFR的特性，优选地，此片段是小ecDHFR，其中所述小ecDHFR是功能为内部降解决定子的变体。
优选地，所述编码序列对能够纠正病理状态或病症的蛋白质进行编码，优选地，所述病症是视网膜变性、代谢病症、血液病症、神经变性性病症、听力丧失、通道病、肺病、肌病、心脏病、肌营养不良。
进一步优选地，所述编码序列对能够纠正病理状态或病症的蛋白质进行编码，优选地，所述病症是视网膜变性，优选地，所述视网膜变性是遗传性的，优选地，所述病理或疾病选自由以下项构成的群组：色素性视网膜炎(RP)、利伯先天性黑矇(LCA)、斯塔加特病(Stargardt disease，STGD)、乌谢尔综合征(USH)、阿耳斯特雷姆综合征(Alstromsyndrome)、先天性静止性夜盲症(CSNB)、黄斑营养不良、隐性黄斑营养不良、由ABCA4基因中的突变引起的疾病。更优选地，所述编码序列是选自由以下项构成的群组的基因的编码序列：ABCA4、MYO7A、CEP290、CDH23、EYS、PCDH15、CACNA1、SNRNP200、RP1、PRPF8、RP1L1、ALMS1、USH2A、GPR98、HMCN1或其片段或其直系同源物或编码序列长度超过5kb的其小基因，即包括一个或多个外显子及此基因以与野生型基因片段相同的方式表达自身所必需的调控元件的最小基因片段。
更为优选地，所述编码序列对能够纠正肌营养不良的蛋白质进行编码，例如迪谢内肌营养不良、囊性纤维化、血友病A、威尔逊病、
苯丙酮尿症、dysferlin病变(dysferlinopathies)、雷特综合征(Rett′ssyndrome)、多囊肾病、C型尼曼-匹克氏症(Niemann-Pick type C)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)。
更优选地，所述编码序列是选自由以下项构成的群组的基因的编码序列：ABCA4、MYO7A、CEP290、CDH23、EYS、PCDH15、CACNA1、SNRNP200、RP1、PRPF8、RP1L1、ALMS1、USH2A、GPR98、HMCN1或其片段或其直系同源物或编码序列长度超过5kb的其小基因，即包括一个或多个及此基因以与野生型基因片段相同的方式表达自身所必需的控制区的最小基因片段。
进一步优选地，所述编码序列是选自由以下项构成的群组的基因的编码序列：DMD、CFTR、F8、ATP7B、PAH、DYSF、MECP2、PKD、NPC1、HTT或其片段或其直系同源物，或者编码序列的长度超过5kb的其小基因，即包括一个或多个以及使得所述基因以与野生型基因片段相同的方式表达自身所必需的调控元件的最小基因片段。
在本发明的特别优选的实施方案中，所述编码序列对所述ABCA4基因进行编码。优选地，所述编码序列在对应于所述ABCA4蛋白的aa Cys1150、Ser1168、Ser1090的核苷酸处分裂，并且分裂型内蛋白在分裂点处插入。
在另一个优选的实施方案中，所述编码序列对所述CEP290基因进行编码。优选地，所述编码序列在对应于aa Cys1076；Ser1275的核苷酸处分裂。更优选地，所述编码序列在对应于所述CEP290蛋白的aa Cys 929和1474；Ser 453和Cys 1474的核苷酸序列处分裂，并且两个分裂型内蛋白在分裂点处插入。
EGFP SEQ ID No.15
C-外显蛋白的第一个氨基酸在序列中高亮标示。分裂Cys.71(粗体)
Figure BDA0003105985640000131
ABCA4 SEQ ID No.16
C-外显蛋白的第一个氨基酸在序列中高亮标示。
分裂组1Cys.1150(粗体)
分裂组2Ser.1168(下划线)
分裂组3Ser.1090(斜体)
Figure BDA0003105985640000141
CEP290 SEQ ID No.17
c-外显蛋白的第一个氨基酸在序列中高亮标示。
分裂组1Cys.1076(粗体)
分裂组2-3Ser.1275(下划线)
分裂组4Cys.929和Cys.1474(斜体)
Figure BDA0003105985640000142
(双下划线)
Figure BDA0003105985640000151
F8 SEQ ID No.18
c-外显蛋白的第一个氨基酸在序列中高亮标示。分裂组1 Cys.1312(下划线)组分裂组2 Ser.984(粗体)
Figure BDA0003105985640000161
ecDHFRSEQ ID No.19
Figure BDA0003105985640000162
mini ecDHFRSEQ ID No.20
Figure BDA0003105985640000171
在一个优选的实施方案中，本发明的载体系统包括：
a)第一载体，所述第一载体在5′-3′方向上包括：
-5′-反向末端重复(5′-ITR)序列；
-启动子序列；
-编码序列的5′末端部分(CDS1)，所述5′末端部分可操作地连接到所述启动子并且处于所述启动子的控制下；
-编码N-内蛋白的第一内蛋白核苷酸序列；以及
-3′-反向末端重复(3′-ITR)序列；以及
b)第二载体，所述第二载体在5′-3′方向上包括：
-5′-反向末端重复(5′-ITR)序列；
-启动子序列；
-编码C-内蛋白的第二内蛋白核苷酸序列；
-所述编码序列的3′末端部分(CDS2)；以及
-3′-反向末端重复(3′-ITR)序列；
或者包括：
a′)第一载体，所述第一载体在5′-3′方向上包括：
-5′-反向末端重复(5′-ITR)序列；
-启动子序列；
-编码序列(CDS1′)的5′末端部分，所述5′末端部分可操作地连接到所述启动子并且处于所述启动子的控制下；
-编码第一N-内蛋白的第一内蛋白核苷酸序列；以及
-3′-反向末端重复(3′-ITR)序列；以及
b′)第二载体，所述第二载体在5′-3′方向上包括：
-5′-反向末端重复(5′-ITR)序列；
-启动子序列；
-编码第一C-内蛋白的第二内蛋白核苷酸序列；
-所述编码序列的第二部分(CDS2′)；以及
-编码第二N-内蛋白的第三内蛋白核苷酸序列；
-3′-反向末端重复(3′-ITR)序列；以及
c′)第三载体，所述第三载体在5′-3′方向上包括：
-5′-反向末端重复(5′-ITR)序列；
-启动子序列；
-编码第二C-内蛋白的第四内蛋白核苷酸序列；
-所述编码序列的所述第三部分(CDS3′)；以及
-3′反向末端重复(3′-ITR)序列。
优选地，所述第一载体、所述第二载体和所述第三载体载体独立地是病毒载体，优选地腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体，优选地，所述第一载体、所述第二载体和所述第三腺相关病毒(AAV)载体选自相同或不同的AAV血清型，优选地所述血清型选自血清型2、血清型8、血清型5、血清型7或血清型9、血清型7m8、血清型sh10；血清型2(quadY-F)。
本发明还提供了用如上定义的载体系统转化的宿主细胞。
优选地，所述载体系统或所述宿主细胞用于医疗用途，优选地，用于基因疗法中，优选地用于治疗和/或预防以视网膜变性、代谢病症、血液病症、神经变性性疾病、听力丧失、通道病、肺病、肌病、心脏病、肌营养不良为特征的病理或疾病。
优选地，所述视网膜变性是遗传性的，优选地，所述病理或疾病选自由以下项构成的群组：色素性视网膜炎(RP)、利伯先天性黑矇(LCA)、斯塔加特病(STGD)、乌谢尔综合征(USH)、阿耳斯特雷姆综合征、先天性静止性夜盲症(CSNB)、黄斑营养不良、隐性黄斑营养不良、由ABCA4基因中的突变引起的疾病。
优选地，所述载体系统或所述宿主细胞用于预防和/或治疗迪谢内肌营养不良、囊性纤维化、血友病A、威尔逊病、苯丙酮尿症、dysferlin病变、雷特综合征、多囊肾病、C型尼曼-匹克氏症、亨廷顿氏病。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明的载体系统或宿主细胞以及药学上可接受的载体。
发明详述
附图简述
图1：AAV内蛋白在体外和小鼠和猪视网膜中在如下的水平重构EGFP，所述水平高于双重AAV且高达用单一AAV所达到的水平。
(A)AAV内蛋白介导的蛋白质反式剪接的示意图。ITR：AAV2反向末端重复；CDS：编码序列；■：3xflag标签；PolyA：聚腺苷酸化信号。
(B)来自用全长或AAV内蛋白CMV-EGFP质粒转染的HEK293的裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。pEGFP：全长EGFP质粒；pAAV I+II：AAV-EGFP I+II内蛋白质粒；pAAV I：单一AAV-EGFP I内蛋白质粒；pAAV II：单一AAV-EGFP II内蛋白质粒；Neg：未转染的细胞。箭头表示全长EGFP蛋白(EGFP)、EGFP蛋白的N末端和C末端半部(分别为B和A)，以及从全长EGFP蛋白中切除的重构内蛋白(C)。WB表示n＝3个独立实验。
(C)来自用单一、内蛋白或双重AAV2/2-CMV-EGFP载体感染的HEK293的裂解物的WB分析。WB表示n＝5个独立实验。
(D)视网膜下注射AAV2/8-CMV-EGFP内蛋白载体的C57BL/6J小鼠的视网膜冷冻切片。比例尺：50μm。RPE：视网膜色素上皮；OS：外节；ONL：外核层。
(E-F)视网膜下注射单一、内蛋白或双重AAV2/8-GRK1-EGFP载体的C57BL/6J小鼠(E)或大白猪(F)的视网膜冷冻切片。比例尺：50μm(E)；200μm(F)。OS：外节；ONL：外核层。
(G)在培养的293天时，感染AAV2/2-GRK1-EGFP-内蛋白载体的视网膜类器官的荧光分析。比例尺：100μm。
图2：AAV内蛋白的优化允许大ABCA4和CEP290蛋白的正确重构。
(A-B)来自用不同组AAV-shCMV-ABCA4或-CEP290内蛋白质粒(分别为组1和组5)转染的HEK293的裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。图16示出所使用的各种组的示意图。WB表示n＝3个独立实验。
(C-D)用AAV-shCMV-ABCA4(C)或AAV-shCMV-CEP290(D)内蛋白质粒转染的HeLa细胞的免疫荧光分析的代表性图像。pABCA4(C)或pCEP290(D)：包括全长表达盒的质粒；pAAV内蛋白：AAV-内蛋白质粒(C中的组1或D中的组5)；I+II+III：AAV I+II+III内蛋白质粒；I+II：AAV I+II内蛋白质粒；I+III：AAV I+III内蛋白质粒；II+III：AAV II+III内蛋白质粒；I：单一AAV I内蛋白质粒；II：单一AAV II内蛋白质粒；III：单一AAV III内蛋白质粒；Neg：未转染的细胞。
细胞在C中针对3xFLAG和VAP-B(内质网标志物)和TGN46(转运高尔基氏体网络标志物)染色，或在D中针对乙酰化微管蛋白(微管标志物)染色。白色箭头指向在图18中以更高放大倍数示出的细胞。
图3：AAV内蛋白比双重AAV载体更有效地重构大ABCA4和CEP290蛋白。
用双重或内蛋白AAV2/2-shCMV-ABCA4(A)或-CEP290(B)载体感染的HEK293细胞的裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。
AAV内蛋白：AAV-ABCA4(组1，A)或-CEP290(组5，B)内蛋白载体；I+II+III：AAV I+II+III内蛋白载体；I+II：AAV I+II内蛋白载体；I+III：AAV I+III内蛋白载体；II+III：AAVII+III内蛋白向量；I：单一AAV I内蛋白载体；II：单一AAV II内蛋白载体；III：单一AAVIII内蛋白载体；双重AAV：双重AAV载体；Neg：AAV-EGFP载体。
(A)箭头表示全长ABCA4蛋白，并且A：源自AAV I的蛋白质产物；B：源自AAV II的蛋白质产物。*具有潜在不同翻译后修饰的蛋白质产物。
(B)箭头表示全长CEP290蛋白质，并且A：源自AAV II+III的蛋白质产物；B：源自AAV I+II的蛋白质产物；C：源自AAV II的蛋白质产物；D：源自AAV III的蛋白质产物；E：源自AAV I的蛋白质产物。WB表示n＝3个独立实验。
图4：AAV内蛋白以治疗水平重构小鼠、猪和人感光器中的大蛋白。
(A-C)对注射双重或内蛋白AAV2/8-GRK1-ABCA4(A，C)或-CEP290(B)载体(分别为组1和组5)的野生型小鼠(A，B)或大白猪(C)的视网膜裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。AAV内蛋白：AAV内蛋白载体；双重AAV：双重AAV载体；Neg：AAV-EGFP载体或PBS。
(D)对感染AAV2/2-GRK1-ABCA4内蛋白载体的人iPSC衍生3D视网膜类器官的裂解物进行的WB分析。AAV内蛋白：AAV-ABCA4内蛋白载体；Neg：未感染的类器官；-/-：源自STGD1患者的类器官。
(A，C，D)箭头表示全长ABCA4蛋白(ABCA4)，并且A：源自AAV I的蛋白质产物；B：源自AAV II的蛋白质产物。*具有潜在不同翻译后修饰的蛋白质产物。
(B)箭头表示全长CEP290蛋白(CEP290)；A：源自AAV II+III的蛋白质产物；并且D：源自AAV III的蛋白质产物。
图5：AAV内蛋白的视网膜下施用改善了遗传性视网膜变性小鼠模型的视网膜表型。
(A)用AAV内蛋白处理的Abca4-/-小鼠的RPE中由脂褐素所占据的平均面积的量化。每个点代表针对每只眼测得的平均值。每组脂褐素面积的平均值在图中示出。+/+或+/-：注射对照物的Abca4+/+或+/-眼(PBS)；-/-：注射阴性对照物的Abca-/-眼(AAV I ABCA4或AAV IIABCA4或PBS)的；-/-AAV内蛋白：注射AAV内蛋白载体(组1)的Abca4-/-眼。*ANOVA p值＜0.05；***ANOVA p值<0.001。
(B)来自野生型未注射小鼠以及视网膜下注射AAV2/8-GRK1-CEP290内蛋白载体(AAV内蛋白，组5)或注射阴性对照物(Neg；即AAV I+II或AAV II+III或PBS)的rd16小鼠的视网膜切片的代表性图像。比例尺：25μm。在每个图像中测得的ONL的厚度用垂直黑线表示。RPE：视网膜色素上皮；ONL：外核层；INL：内核层；GCL：神经节细胞层。
(C)来自野生型未注射小鼠以及视网膜下注射AAV2/8-GRK1-CEP290内蛋白载体(AAV内蛋白，组5)或注射阴性对照物(Neg；即AAV I+II或AAV II+III或PBS)的rd16小鼠的眼的代表性图像。白色圆圈限定瞳孔。
图6：蛋白质反式剪接介导的大蛋白质重构的示意图。
大基因的编码序列(CDS)分裂为两个半部(5′和3′)，侧翼有反向末端重复序列(ITR)，分别包装在两个AAV衣壳中。在对同一细胞进行共转导后，探索通过在蛋白质水平连接这两个半部来重构全长蛋白质表达的不同机制。5′-载体包括5′CDS、5′内蛋白(n-内蛋白)和降解决定子，而3′-载体包括3′CDS和3′内蛋白(c-内蛋白)；这两种载体均包括启动子和polyA。这两个半多肽的配对是通过内蛋白自我识别介导的；随后从宿主蛋白质中自我切除内蛋白导致全长蛋白质重建。降解决定子现在嵌入在切除内蛋白内，其迅速泛素化并且被蛋白酶体降解。
图7：从有和没有降解信号的AAV内蛋白载体的体外EGFP表达。
来自用含有ecDHFR(+)或不含ecDHFR(-)的AAV内蛋白质粒转染的HEK293细胞的裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。箭头表示全长EGFP蛋白(EGFP)，含有降解决定子(DnaE+ecDHFR)或不含此降解决定子(DnaE)的切除的内蛋白。
图8：从有和没有降解信号的AAV内蛋白载体的体外ABCA4表达。
来自用含有ecDHFR(+)或不含ecDHFR(-)的AAV内蛋白质粒转染的HEK293细胞的裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。箭头表示全长ABCA4蛋白(ABCA4)，含有降解决定子(DnaE+ecDHFR)或不含此降解决定子(DnaE)的切除的内蛋白。
图9：内蛋白DnaE-ecDHFR表达依赖于TMP。
来自用AAV_ABCA4内蛋白质粒转染并用增加剂量的Trimetrophin(1到50m)处理的HEK293细胞的裂解物的蛋白质印迹(WB)分析，所述质粒含有ecDHFR(pAAV内蛋白+ecDHFR)或不含ecDHFR(pAAV内蛋白)。箭头表示含有降解决定子(DnaE+ecDHFR)或不含降解决定子(DnaE)的切除的内蛋白。
图10：从有和没有降解信号的AAV内蛋白载体的体外EGFP表达。
来自用含有小ecDHFR(+)或不含小ecDHFR(-)的AAV内蛋白质粒转染的HEK293细胞的裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。箭头表示全长EGFP蛋白(EGFP)，含有降解决定子(DnaE+小ecDHFR)或不含此降解决定子(DnaE)的切除的内蛋白。
图11：从有和没有降解信号的AAV内蛋白载体的体外ABCA4表达。
来自用含有小ecDHFR(+)或不含小ecDHFR(-)的AAV内蛋白质粒转染的HEK293细胞的裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。箭头表示全长ABCA4蛋白(ABCA4)，含有降解决定子(DnaE+小ecDHFR)或不含此降解决定子(DnaE)的切除的内蛋白。
图12：用AAV I+II，但是非单一AAV I或AAV II内蛋白质粒转染的HEK293细胞中的EGFP荧光分析。
用全长或内蛋白CMV-EGFP质粒转染的HEK293细胞的荧光分析。pEGFP：包括全长EGFP表达盒的质粒；pAAV I+II：AAV I+II内蛋白质粒；pAAV I：单一AAV I内蛋白质粒；pAAVII：单一AAV II内蛋白质粒；Neg：未转染的细胞。比例尺：100μm。
图13：内蛋白相对于全长蛋白质在物种间变化。
来自感染AAV-CMV-EGFP(A)或AAV-GRK1-EGFP内蛋白载体(B-C)的HEK293细胞(A)、C57BL/6J小鼠(B)和大白猪视网膜(C)的裂解物的蛋白质印迹分析(WB)。AAV内蛋白：用AAV内蛋白载体感染的细胞(A)或注射的眼(B，C)；Neg：未感染的细胞(A)或注射PBS的眼(B，C)。箭头表示全长EGFP蛋白(EGFP)和切除的内蛋白(DnaE)。
图14：人iPSC衍生的3D视网膜类器官的表征。
(A)培养183天时视网膜类器官的光学显微术分析。
(B)使用针对成熟感光器标志物的抗体进行的免疫荧光分析。比例尺：100μm。
(C)感染AAV2/2-CMV-EGFP和AAV2/2-IRBP-DsRed载体的视网膜类器官的荧光分析。比例尺：100μm。
(D)在培养230天时，观测到从视网膜类器官表面突出的外节状结构。插图示出具有径向结构的外节(OS)状结构的存在。NR：神经视网膜；RPE：视网膜色素上皮。
(E)扫描电子显微术分析显示存在内节(IS)、连接纤毛(CC)和外节(OS)状结构。比例尺：4μm。
(F)电子显微术分析显示存在外界膜(*)、中心粒(C)、基体(BB)、连接纤毛(CC)和外节(OS)的草图。
插图示出OS中存在紊乱的膜盘。比例尺：500nm。
D：培养天数。
图15：相对于人3D视网膜类器官中的全长蛋白质的低内蛋白。
对感染AAV2/2-GRK1-EGFP内蛋白载体的人iPSC衍生3D视网膜类器官的裂解物进行的蛋白质印迹(WB)分析。AAV内蛋白：AAV内蛋白载体；Neg：未感染的类器官。箭头表示全长EGFP蛋白(EGFP)和切除的内蛋白(DnaE)。
图16：各组AAV-ABCA4和-CEP290内蛋白的示意图。
(A)AAV-ABCA4-内蛋白构建体。(组1-2以构建体为例)n-DnaE：来自Npu的DnaE的n-内蛋白；c-DnaE：来自Npu的DnaE的c-内蛋白；(组3)n-mDnaE：来自Npu(mNpu)的突变DnaE的n-内蛋白；c-mDnaE：来自mNpu的DnaE的c-内蛋白。
(B)AAV-CEP290-内蛋白构建体。(组1)n-DnaE：来自Npu的DnaE的n-内蛋白；c-DnaE：来自Npu的DnaE的c-内蛋白；shPolyA：短合成polyA；(组2)n-DnaE：来自mNpu的DnaE的n-内蛋白；c-DnaE：来自mNpu的DnaE的c-内蛋白；(组3)n-mDnaE：来自mNpu的DnaE的n-内蛋白；c-mDnaE：来自mNpu的DnaE的c-内蛋白；(组4)n-DnaE：来自Npu的DnaE的n-内蛋白；c-DnaE：AAV I和AAV II之间来自Npu的DnaE的c-内蛋白；n-DnaB：来自海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus，Rma)的DnaB的N-内蛋白；c-DnaB：AAV II和AAV III之间的来自Rma的DnaE的c-内蛋白；wpre：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。(组5)n-mDnaE：来自mNpu的DnaE的n-内蛋白；c-mDnaE：
Figure BDA0003105985640000241
和AAVII之间的来自mNpu的DnaE的c-内蛋白；n-DnaB：来自海洋红嗜热盐菌(Rma)的DnaB的n-内蛋白；c-DnaB：AAV II和AAV III之间的来自Rma的DnaE的c-内蛋白；wpre：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。(A-B)ITR：AAV2反向末端重复；：3xflag标签；启动子：体外实验用短CMV和体内实验用人G蛋白偶联受体(GRK1)启动子；PolyA：猿病毒40聚腺苷酸化信号(对于ABCA4，A)和牛生长激素聚腺苷酸化信号(对于CEP290，B)。每组的分裂点处的氨基酸在图中示出。每个AAV载体下示出所预测的蛋白质分子量。
图17：异源N-和C-内蛋白的组合在体外不导致可检测到的EGFP蛋白重构。
用全长或内蛋白AAV-CMV-EGFP质粒转染的HEK293细胞的荧光分析。N+C-DnaE：与来自DnaE的内蛋白融合的AAV I+II；N+C-DnaB：与来自DnaB的内蛋白融合AAV I+II；N+C-mDnaE：与来自mDnaE的分裂型内蛋白融合的AAV I+II；N-DnaE+C-DnaB：与来自DnaE的n-内蛋白融合的AAV I以及与来自DnaB的c-内蛋白融合的AAV II；N-DnaB+C-DnaE：与来自DnaB的n-内蛋白融合的AAV I以及与来自DnaE的c-内蛋白融合的AAV II；N-mDnaE+C-DnaB：与来自mDnaE的n-内蛋白融合的AAV I以及与来自DnaB的c-内蛋白融合的AAV II；N-DnaB+C-mDnaE：与DnaB的n-内蛋白融合的AAV I以及与来自mDnaE的c-内蛋白融合的AAV II；pEGFP：包括全长EGFP表达盒的质粒；Neg：未转染的细胞。比例尺：100μm。
图18：CEP290沿微管排列。
图2D中单细胞的放大倍数。用包括全长CEP290表达盒的质粒(pCEP290)或用CEP290内蛋白质粒(组5，pAAV I+II+III)转染的HeLa细胞的免疫荧光分析。针对3xFLAG和乙酰化微管蛋白(微管标志物)对细胞进行染色。比例尺：50μm。
来自用编码短CMV-ABCA4(组1，A)或-CEP290(组5，B)的全长或AAV内蛋白质粒转染的HEK293细胞的裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。
(A)pABCA4：全长ABCA4表达盒；组1：ABCA4(Cys.1150)-内蛋白质粒。
(B)pCEP290：全长CEP290表达盒；组5组：CEP290(Ser.453和Cys.1474)-内蛋白质粒。
Neg：AAV EGFP质粒。WB表示n＝3个独立实验。
图19：与具有全长表达盒的单一质粒转染相比，AAV内蛋白质粒进行的转染可以以较低的量重构ABCA4和CEP290蛋白。
来自用编码短CMV-ABCA4(A)或-CEP290(B)的全长或AAV内蛋白质粒转染的HEK293细胞的裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。(A)pABCA4：全长ABCA4表达盒；组1：ABCA4(Cys.1150)-内蛋白质粒。(B)pCEP290：全长CEP290表达盒；组5组：CEP290(Ser.453和Cys.1474)-内蛋白质粒。Neg：AAV EGFP质粒。WB表示n＝3个独立实验。
图20：AAV内蛋白载体的视网膜下递送导致ABCA4在小鼠视网膜中表达。
注射双重或内蛋白AAV2/8-GRK1-ABCA4载体(组1)的野生型小鼠的视网膜裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。AAV内蛋白：AAV内蛋白载体；双重AAV：双重AAV载体；Neg：AAV-EGFP载体。
图21：AAV内蛋白可重组约10％的内源性Abca4。
注射AAV2/8-GRK1-ABCA4内蛋白载体(组1)的Abca4+/-或Abca4-/-小鼠的视网膜裂解物的蛋白质印迹(WB)分析。mAbca4：Abca4+/-视网膜；AAV内蛋白：注射AAV内蛋白的视网膜；Neg：未注射的视网膜。在凝胶#2和#3上加载的来自Abca4+/-的视网膜裂解物是相同的。AAV内蛋白ABCA4表达相对于内源性的百分比图示在每个泳道下方。
图22：AAV内蛋白在人视网膜类器官中重构全长ABCA4蛋白。
对感染AAV2/2-GRK1-ABCA4内蛋白载体(组1)的人iPSC衍生3D视网膜类器官的裂解物进行的蛋白质印迹分析。AAV内蛋白：AAV内蛋白载体；Neg：未感染的类器官。-/-：源自STGD1患者的类器官；+/-：源自健康供体的类器官。
图23：AAV内蛋白载体的视网膜下施用导致脂褐素在Abca4-/-小鼠中的积累减少。
透射电子显微术分析的代表性图片示出注射有阴性对照物(Neg)或AAV内蛋白载体(组1)的野生型和Abca4-/-小鼠RPE中的脂褐素颗粒。白色箭头表示脂褐素颗粒；M：线粒体。
图24：小鼠中AAV内蛋白载体的视网膜下递送不修改ONL厚度。
视网膜下注射AAV内蛋白载体、无关AAV载体(AAV neg)或PBS的C57BL/6J小鼠眼的光谱域光学相干断层扫描图分析。黑色条表示注射AAV-ABCA4内蛋白载体(组1)及其相应对照物后6个月的眼；白色条表示注射AAV-CEP290内蛋白载体(组5)及其相应对照物后4.5个月的眼。数据表示为平均值±s.e.。平均值示出在相应的条形上方。
图25：AAV内蛋白载体可以递送全长野生型F8。
A)单一AAV B结构域删除变体3因子VIII(F8-V3)和AAV F8内蛋白载体的示意图。
F8基因的编码序列分为两个半部(5′和3′F8)，侧翼有反向末端重复序列(ITRF)，它们分别包装在两个AAV衣壳中。5′-载体包括5′F8和5′内蛋白(n-DnaE)，而3′-载体包括3′F8和3′内蛋白(c-DnaE)；这两种载体均包括HLP启动子和合成polyA。V3：变体3；SS：信号序列。
B)与单个超大AAV F8-V3不同，F8内蛋白被正确包装到具有限定载体基因组的AAV衣壳中。
使用HLP启动子特异性探针对载体基因组完整性的Southern印迹分析显示，超大AAV F8-V3中的截短产物在AAV F8内蛋白载体中不存在。Neg：阴性对照物。
AAV F8内蛋白载体在注射后8周时显示出对血友病A敲除小鼠的出血表型的轻微校正。
与注射PBS的对照组相比，在注射AAV F8内蛋白(两个分裂点)后8周对血友病A敲除小鼠血浆样品的aPTT分析显示出轻微的表型校正。aPTT：活化的部分促凝血酶原激酶时间。
基因疗法
在过去十年中，基因治疗已在数百项临床试验中应用于疾病的治疗。已经开发出各种工具来将基因递送到人细胞中；其中，经基因工程的病毒，包括腺相关病毒，是目前最流行的基因递送工具之一。大多数系统均包括能够容纳目的基因的载体以及能够提供病毒结构蛋白和酶以允许生成含有载体的传染性病毒颗粒的辅助细胞。腺相关病毒是核苷酸和氨基酸序列、基因组结构、致病性和宿主范围不同的病毒科。这种多样性为使用具有不同生物学特性的病毒开发不同治疗应用提供了机会。与任何递送工具一样，效率、靶向特定组织或细胞类型的能力、目的基因的表达以及基于腺相关病毒的系统的安全性对于基因治疗的成功应用而言至关重要。近年来，已在这些研究领域做出了众多努力。已经对基于腺相关病毒的载体和辅助细胞进行了各种修改，以改变基因表达、靶向递送、提高病毒滴度和增加安全性。本发明代表着此设计过程的改进，因为它用作为有效递送大小超过单一基于腺相关病毒的载体的货物限制的目的基因。病毒是基因递送的逻辑工具。它们在细胞内复制，因此进化出进入细胞并使用细胞机制来表达自身基因的机制。基于病毒的基因递送的概念是对病毒进行工程化，使其能够表达目的基因。根据具体应用和病毒类型，大多数病毒载体均含有突变，这些突变阻碍了其作为野生型病毒在宿主中自由复制的能力。来自几个不同科的病毒已被修饰以生成用于基因递送的病毒载体。这些病毒包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、小核糖核酸病毒和α病毒。本发明优选地使用腺相关病毒。因此，用于基因递送的基于病毒的载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、假型化AAV载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。
用于基因递送的理想的基于腺相关病毒的载体必须是高效的、细胞特异性的、受调控的且安全的。递送效率至关重要，因为它可以决定治疗的功效。目前的努力旨在通过腺相关病毒载体来实现细胞类型特异性感染和基因表达。此外，正在开发腺相关病毒载体来调控目的基因的表达，因为治疗可能需要长期或受调控的表达。安全性是病毒基因递送的主要问题，因为大多数病毒是病原体，或者具有致病潜力。
腺相关病毒(AAV)是一种小病毒，可感染人类和其他一些灵长类动物。目前尚不知道AAV会引起疾病，因此病毒会引起非常温和的免疫反应。使用AAV的基因治疗载体可以感染分裂细胞和休眠细胞，并且在不整合到宿主细胞基因组中的情况下持续处于染色体外状态。这些特性使AAV成为创建用于基因治疗的病毒载体以及创建等基因人疾病模型的非常有吸引力的候选者。
野生型AAV由于其许多特征而引起了基因治疗研究人员的极大兴趣。其中最主要的是此病毒明显缺乏致病性。它还可以感染非分裂细胞，并且能够在人第19号染色体的特定位点(指定为AAVS1)稳定整合到宿主细胞基因组中。此特征使其比逆转录病毒更为可预测，所述逆转录病毒存在随机插入和诱变的威胁，这有时继之以癌症的发展。AAV基因组最频繁地整合到所提及的位点，而随机整合到基因组中的频率可以忽略不计。但是，在AAV作为基因治疗载体的开发中，已经通过从载体DNA中去除rep和cap消除了这种整合能力。将所需基因与驱动基因转录的启动子一起插入反向末端重复(ITR)之间，所述反向末端重复有助于在单链载体DNA被宿主细胞DNA聚合酶复合物转化成双链后细胞核中的多联体形成。基于AAV的基因治疗载体在宿主细胞核中形成附加体多联体。在非分裂细胞中，这些多联体在宿主细胞的生命周期内保持完整。在分裂细胞中，AAV DNA通过细胞分裂而丢失，因为附加体DNA不与宿主细胞DNA一起复制。AAV DNA随机整合到宿主基因组中是可检测到的，但发生频率非常低。AAV还表现出非常低的免疫原性，似乎限于产生中和抗体，而它们不诱导明确限定的细胞毒素反应。此特征以及感染休眠细胞的能力表明，AAV作为人基因治疗载体优于腺病毒。
AAV基因组、转录物组和蛋白质组
AAV基因组由正链或负链的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)构建，其长度为约4.7千碱基。基因组包括位于DNA链两端的反向末端重复(ITR)以及两个开放阅读框(ORF)：rep和cap。前者由四个重叠基因组成，这些基因编码AAV生命周期所需的Rep蛋白，并且后者包括衣壳蛋白的重叠核苷酸序列：VP1、VP2和VP3，它们相互作用形成二十面体对称的衣壳。
ITR序列
反向末端重复(ITR)序列各自包括145个碱基。它们优于其对称性而如此命名，所述对称性已显示是有效扩增AAV基因组所必需的。这些序列的另一个特性是它们形成发夹的能力，这有助于所谓的自引发，其允许第二DNA链的不依赖引物酶的合成。还显示了ITR对于将AAV DNA整合到宿主细胞基因组(人第19号染色体)并从其中挽救出来以及AAV DNA的有效衣壳化与生成完全组装、具备脱氧核糖核酸酶抗性的AAV颗粒的组合两者所必需的。
关于基因治疗，ITR似乎是顺式在治疗基因附近所需的唯一序列：结构(cap)和包装(rep)基因可以反式递送。根据此假设，建立了许多方法来有效生成含有报道物或治疗基因的重组AAV(rAAV)载体。但是，还发表ITR并非有效复制和衣壳化顺式所需的唯一元件。一些研究小组已经识别出rep基因的编码序列内称为顺式作用Rep依赖元件(CARE)的序列。当以顺式存在时，显示CARE增强复制和衣壳化。
AAV血清型
迄今为止，已经识别并且分类了数十种不同的AAV变体(血清型)(60)。所有已知血清型均可以感染来自多种不同组织类型的细胞。组织特异性由衣壳血清型决定，并且对AAV载体的假型化以改变其向性范围可能对它们在治疗中的使用至关重要。假型化AAV载体是在第二AAV血清型的衣壳中含有AAV血清型基因组的载体；例如，AAV2/8载体含有AAV8衣壳和AAV 2基因组(61)。此类载体也称为嵌合载体。
血清型2
迄今为止，已经最广泛检查血清型2(AAV2)。AAV2对骨骼肌、神经元、血管平滑肌细胞和肝细胞具有天然的向性。已经描述了AAV2的这三种细胞受体：硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、avβ5整联蛋白和成纤维细胞生长因子受体1(FGFR-1)。第一个功能为主要受体，而后两个具有共受体活性，使AAV通过受体介导的内吞作用而进入细胞内。这些研究结果遭到Qiu、Handa等人的质疑。HSPG功能为主要受体，尽管其在细胞外基质中的丰度可清除AAV颗粒并损害感染效率。
研究显示了病毒的血清型2(AAV-2)显然杀死癌细胞而不伤害健康细胞。“我们的研究结果表明，已感染大多数群体但没有已知不良影响的2型腺相关病毒杀死多种类型的癌细胞，但对健康细胞没有影响，”美国宾州州立大学医学院免疫学和微生物学教授CraigMeyers认为。这可以导致一种新的抗癌剂。
其他血清型
尽管AAV2是各种基于AAV的研究中最常用的血清型，但已经表明其他血清型作为基因递送载体可能更有效。例如，AAV6在感染气道上皮细胞方面表现得更好；AAV7呈现出非常高的鼠骨骼肌细胞转导率(类似于AAV1和AAV5)；AAV8在转导肝细胞和感光器方面表现出色；并且已证明AAV1和5在基因递送到血管内皮细胞方面是非常有效的。在脑中，大多数AAV血清型显示神经元向性，而AAV5也转导星形胶质细胞。AAV6(AAV1和AAV2的杂交体)比AAV2显示更低的免疫原性。
血清型就其所结合的受体而言可以存在不同。例如，AAV4和AAV5的转导可以被可溶性唾液酸(这些中每种血清型的不同形式的)抑制，并且显示AAV5通过血小板衍生的生长因子受体而进入细胞。已被证明，在小动物模型中，新型AAV变体，如四重酪氨酸突变体或AAV 2/7m8从玻璃体转导外层视网膜(62，63)。另一种名为ShH1O的AAV突变体，一种在玻璃体内施用后具有改善的神经胶质向性的一种AAV6变体(64)。另一种对视网膜具有特别有利的向性的AAV突变体是AAV2(quad Y-F)(65)。
本发明的基因递送载体可以施用于患者。所述施用可以是“体内”施用或“离体”施用。熟练技术人员能够确定适当的剂量率。术语“施用”包括通过病毒或非病毒技术的递送。病毒递送机制包括但不限于上述的腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和杆状病毒载体等。
非病毒递送系统包括DNA转染例如电穿孔、脂质介导的转染、压缩DNA介导的转染；脂质体、免疫脂质体、lipofectin、阳离子表面两亲性物(CFA)及其组合。
通过根据本发明的载体系统对一种或多种治疗基因的递送可以单独使用或与其他治疗或治疗的组分组合使用。
药物组合物
本发明还提供用于通过基因治疗来治疗个体的药物组合物，其中所述组合物包括治疗有效量的本发明的载体/构建体或宿主细胞，所述载体/构建体或宿主细胞包括一种或多种可递送治疗性和/或诊断性转基因或者由其产生或获得的病毒颗粒。药物组合物可以用于人类或动物用途。通常，内科医生会确定最适合个体受试者的实际剂量，并且它因特定个体的年龄、体重和反应而异。组合物可以任选地包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。可以根据预期的施用途径和标准药学实践选择药物载体、赋形剂或稀释剂的选择。作为载体、赋形剂或稀释剂或者在载体、赋形剂或稀释剂外，药物组合物可以任何适当粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂以及可以帮助或增加病毒进入靶位点的其他载体试剂(例如脂质递送系统)。在适当情况下，药物组合物可以通过以下任何一种或多种方式来施用：吸入，以栓剂或子宫托的形式，局部以洗剂、溶液、霜剂、软膏或撒粉的形式；通过使用皮肤贴剂，口服，以含有赋形剂如淀粉或乳糖的片剂形式，或者采用单独或与赋形剂混合的胶囊或胚珠剂(ovules)，或者以含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液的形式；优选地，它们可以胃肠外注射，例如海绵体内、静脉内、肌肉内或皮下注射。对于胃肠外施用，组合物最好以无菌水溶液的形式使用，该水溶液可以含有其他物质，例如足够的盐或单糖以使溶液与血液等渗。对于经颊或舌下施用，组合物可以以常规方式配制的片剂或锭剂形式来施用。
优选的制剂是在结膜囊中或结膜下局部施用载体系统的情况下，优选地每天施用1到10次，优选地施用1天到6个月，优选地施用1天到30天。
优选的施用是前房施用、玻璃体内注射、视网膜下注射、眼球旁和/或眼球后注射、基质内角膜注射。
优选地，本发明的药物组合物用于局部眼部使用，因此是眼用组合物。
根据本发明的载体系统可以通过任何便利途径施用，但是优选的施用途径是局部施用到眼表，特别是局部施用到角膜。甚至更优选的途径是滴注到结膜囊中。
本发明的一个特定目的是载体系统用于生成眼用组合物的用途，所述眼用组合物局部施用于眼以用于医疗用途。
更一般地，本发明的一个优选实施方案是配制用于局部应用于眼部和/或眼部附件中的局部、浅表或受限区域的组合物，所述组合物包括载体系统，任选地与一种或多种药学上可接受的添加剂(例如稀释剂或载体)一起。
如本文所用，术语“媒介物”、“稀释剂”、“载体”和“添加剂”是可互换的。
本发明的眼用组合物可以是溶液、乳液或悬浮液(洗眼剂)、软膏、凝胶、气雾剂、雾剂或搽剂的形式，它们一起包括药学上可接受、眼耐受的并且与活性成分相容的眼科载体。
用于延迟释放的特定眼部施用途径也在本发明的范围内，例如，作为要定位在结膜囊或隐形眼镜中的眼可蚀性插入物或聚合物膜“储器”系统。
本发明的眼用组合物可以局部施用，例如，递送组合物并且直接接触眼和/或眼附件。
至少含有本发明载体系统的药物组合物可以通过任何常规技术制备，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，编辑：E.W.Martin，MackPublishing Company，第19版，Easton，Pa中所述。
在一个实施方案中，组合物配制成液体，其中载体系统可以是溶液或悬浮液。组合物可以配制成适于局部应用的任何液体形式，例如滴眼剂、人工泪液、洗眼剂或含有液体载体如纤维素醚(例如甲基纤维素)的隐形眼镜吸附剂。
优选地，液体是含水液体。进一步优选地，液体是无菌的。可以通过任何常规方法，例如过滤、辐射或加热或通过在无菌条件下进行制造工艺来赋予无菌性。
液体可以包括一种或多种亲脂载体。
在本发明的一个实施方案中，组合物配制成软膏。优选地，软膏中的一种载体可以是矿脂载体。
药学上可接受的媒介物通常可以是任何常规使用的药学上可接受的媒介物，其应根据具体的制剂、预期施用途径等进行选择。此外，药学上可接受的媒介物可以是FDA“非活性成分清单”中所收录的任何可接受的添加剂，所述清单可以例如通过互联网地址http：//www.fda.gov/cder/drug/iig/default.htm来获得。
至少一种药学上可接受的稀释剂或载体可以是缓冲剂。出于某些目的，通常期望的是，组合物包括缓冲剂，所述缓冲剂能够将溶液缓冲到5到9范围内的pH，例如pH 5到6、pH6到8，或者pH 7到7.5。
但是，在本发明的其他实施方案中，药物组合物可以完全不包括缓冲剂，或者仅包含微摩尔量的缓冲剂。缓冲剂可以例如选自由以下项构成的群组：TRIS、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐和三乙醇胺缓冲剂。因此，缓冲剂可以是K2HPO4、Na2HPO4或柠檬酸钠。
在一个优选的实施方案中，缓冲剂是TRIS缓冲剂。TRIS缓冲剂以各种其他名称已知，例如氨丁三醇，包括氨丁三醇USP、THAM、Trizma、缓血酸胺(Trisamine)、三羟甲基氨基甲烷(Tris amino)和氨丁三醇(trometamol)。名称TRIS涵盖所有上述名称。
此外，缓冲剂可以例如选自用于胃肠外使用的USP相容缓冲剂，特别是当药物制剂用于胃肠外使用时。例如，缓冲剂可以选自由以下项构成的群组：一元酸，例如乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甘油酸和乳酸；二元酸，例如乌头酸、己二酸、抗坏血酸、碳酸、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸；多元酸，例如柠檬酸和磷酸；以及碱，例如氨、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和TRIS。
组合物可以包括防腐剂，例如硫柳汞、氯丁醇、苯扎氯铵或氯己定；缓冲剂，例如磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐和柠檬酸盐；以及增稠剂，例如高分子量羧基乙烯基聚合物，例如以BFGoodrich Chemical Company公司商标Carbopol为品名出售的聚合物、羟甲基纤维素和聚乙烯醇，所有这些均符合现有技术。
在本发明的一些实施方案中，药学上可接受的添加剂包括稳定剂。稳定剂可以是例如去污剂、氨基酸、脂肪酸、聚合物、多元醇、金属离子、还原剂、螯合剂或抗氧化剂，但是任何其他适当的稳定剂也可以与本发明一起使用。例如，稳定剂可以选自由以下项构成的群组：泊洛沙姆、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、Brij、金属离子、氨基酸、聚乙二醇、Triton和抗坏血酸。
此外，稳定剂可以选自由以下项构成的群组中：氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、谷氨酸和天冬氨酸；表面活性剂，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆407；脂肪酸，例如磷脂酰胆碱乙醇胺和乙酰色氨酸；聚合物，例如聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮；多元醇，例如山梨糖醇、甘露醇、甘油、蔗糖、葡萄糖、丙二醇、乙二醇、乳糖、海藻糖；抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇和谷胱甘肽；还原剂，例如几种硫醇；螯合剂，例如EDTA盐、谷氨酸和天冬氨酸。
药学上可接受的添加剂可以包括选自由以下项构成的群组的一者或多者：等渗盐、高渗盐、低渗盐、缓冲剂和稳定剂。
在一个优选的实施方案中，存在其他药物赋形剂，例如防腐剂。在一个实施方案中，防腐剂是对羟基苯甲酸酯，例如但不限于对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
在本发明的一些实施方案中，药学上可接受的添加剂包括粘液溶解剂(例如N-乙酰半胱氨酸)、透明质酸、环糊精、石油。
可包括在本发明药物组合物中以促进和加速局部组合物经皮递送至眼或附件组织的示例性化合物包括但不限于醇(乙醇、丙醇和壬醇)、脂肪醇(月桂醇)、脂肪酸(戊酸、己酸和癸酸)、脂肪酸酯(肉豆蔻酸异丙酯和正己酸异丙酯)、烷基酯(乙酸乙酯和乙酸丁酯)、多元醇(丙二醇、丙二酮和己三醇)、亚砜(二甲基亚砜和癸基甲基亚砜)、酰胺(尿素、二甲基乙酰胺和吡咯烷酮衍生物)、表面活性剂(月桂基硫酸钠、十六烷基三甲基铵基溴化物、泊洛沙姆、司盘类(spans)、吐温类(tweens)、胆汁盐和卵磷脂)、萜烯(d-柠檬烯、α-松油醇(alpha-terpeneol)、1，8-桉油素和薄荷酮)和烷酮(正庚烷和正壬烷)。此外，局部施用的组合物可以包括表面粘附分子调节剂，包括但不限于钙粘蛋白拮抗剂、选择蛋白拮抗剂和整联蛋白拮抗剂。
此外，眼用溶液可以含有增稠剂，例如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，以改善药物在结膜囊中的保留。
在一个实施方案中，根据本发明使用的载体系统可以与眼用可接受的防腐剂、表面活性剂、粘度增强剂、渗透增强剂、缓冲剂、氯化钠和水组合以形成水性、无菌、眼用悬浮液或溶液。眼用溶液还可以包括眼用可接受的表面活性剂以帮助溶解载体系统。眼用溶液制剂可以通过将载体系统溶解在生理学上可接受的等渗水性缓冲剂中来制备。
为了制备无菌眼用软膏制剂，载体系统可以与防腐剂在适当载体中组合，例如矿物油、液体羊毛脂或白凡士林。无菌眼用凝胶制剂可以通过将载体系统悬浮在亲水性基质中来制备，该亲水性基质根据类似眼用制剂的发表配方由例如carbopol-940等的组合制备；可以加入防腐剂和张度剂。
优选地，本发明的制剂是用于眼部局部施用的水性、无刺激眼用组合物，所述组合物包括：用于局部治疗的治疗有效量的载体系统；以如下量存在的黄嘌呤衍生物，所述量介于所述组合物的水溶性衍生物的量至所述组合物的0.05％重量/体积，其在局部应用所述组合物后有效减少与载体系统相关的不适，所述黄嘌呤衍生物选自由茶碱、咖啡因、可可碱及其混合物构成的群组中；眼用防腐剂；以及缓冲剂，以提供等渗的水性无刺激性眼用组合物。
药物递送装置
在一个实施方案中，本发明包括由至少载体系统和药学上相容的聚合物组成的药物递送装置。例如，将组合物掺入或涂覆在所述聚合物上。组合物被聚合物化学结合或物理截留。聚合物是疏水的或亲水的。聚合物装置包括多个物理排列。聚合物装置的示例性物理形式包括但不限于膜、支架、室、球体、微球体、支架或其他结构。聚合物装置具有内表面和外表面。装置具有一个或多个内室。这些腔室包括一种或多种组合物。装置含有一种或多种化学可区分单体的聚合物。装置的亚单元或单体在体外或体内聚合。
在一个优选的实施方案中，本发明包括一种装置，所述装置包括聚合物以及掺入到所述聚合物之中或之上的生物活性组合物，其中所述组合物包括载体系统，并且其中将所述装置植入或注射到眼表组织、与眼表组织接触的附件组织、填充有液体的眼腔或附件腔、或者眼腔或附件腔中。
可以形成装置的示例性粘膜粘附性聚阴离子天然或半合成聚合物包括但不限于聚半乳糖醛酸、透明质酸、羧甲基直链淀粉、羧甲基壳多糖、硫酸软骨素、硫酸肝素和中聚糖(mesoglycan)。在一个实施方案中，装置包括生物相容性聚合物基质，其可以任选地全部或部分生物可降解。水凝胶是适当聚合物基质材料的一个示例。可以形成水凝胶的材料的示例包括聚乳酸、聚乙醇酸、PLGA聚合物、藻酸盐和藻酸盐衍生物、明胶、胶原蛋白、琼脂糖、天然和合成多糖、聚氯基酸例如多肽，特别是聚(赖氨酸)，聚酯例如聚羟基丁酸酯和聚-epsilon-己内酯，聚酸酐；聚磷嗪、聚乙烯醇、聚(氧化烯)，特别是聚(环氧乙烷)、聚(烯丙胺)(PAM)、聚(丙烯酸酯)、改性苯乙烯聚合物例如聚(4-氨基甲基苯乙烯)、pluronic多元醇、polyoxamer、聚(糖醛酸)，聚(乙烯基吡咯烷酮)以及上述物质的共聚物，包括接枝共聚物。在另一个实施方案中，支架可以由多种合成聚合物和天然存在的聚合物制成，例如但不限于胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、琼脂糖和富含层粘连蛋白的凝胶。
一种水凝胶优选材料是藻酸盐或改性藻酸盐材料。藻酸盐分子由(1-4)-连接的β-D-甘露糖醛酸(M单元)以及L-古洛糖醛酸(G单元)单体组成，它们沿聚合物链在比例和顺序分布上变化。藻酸盐多糖是聚电解质系统，对二价阳离子(例如Ca+2、Mg+2、Ba+2)具有强亲和力，并且在暴露于这些分子时形成稳定的水凝胶。
装置可以局部、经结膜下或在巩膜外间隙、皮下或导管内施用。具体来说，装置置于眼组织的表面上或正下方。替代地，装置置于在泪管或腺体内部。掺入聚合物之中或之上的组合物从装置中释放或扩散。
在一个实施方案中，将组合物掺入或涂覆到隐形眼镜或药物递送装置上，从所述隐形眼镜或药物递送装置中一种或多种分子从眼镜或装置扩散开或以时间受控的方式释放。在此实施方案中，隐形眼镜组合物保留在眼表上，例如如果必需采用所述眼镜以便进行视力矫正，或者隐形眼镜随时间推移而溶解，同时将组合物释放到紧密并置的组织中。类似地，在各种实施方案中，药物输送装置任选地是可生物降解的或永久的。
例如，将组合物掺入或涂覆到所述眼镜上。组合物被隐形眼镜聚合物化学结合或物理截留。替代地，颜色添加剂被聚合物组合物化学结合或物理截留，所述聚合物组合物以与治疗药物组合物相同的速率释放，使得颜色添加剂强度的变化表明仍保持结合或截留在聚合物中的治疗药物组合物的量或剂量的变化。替代地，或另外，将紫外线(UV)吸收剂化学结合或物理截留在隐形眼镜聚合物内。隐形眼镜聚合物是疏水的或亲水的。
用于制造具有递送本发明组合物的手段的疏水性眼镜的示例性材料包括但不限于阿美福康A(amefocon A)、阿昔福康A(amsilfocon A)、尔奎那福康A(aquilafocon A)、阿福康A(arfocon A)、开布福康A(cabufocon A)、开布福康B(cabufocon B)、卡布昔福康A(carbosilfocon A)、奎福康A(crilfocon A)、奎福康B(crilfocon B)、地美福康A(dimefoconA)、因伏福康A(enflufoconA)、因伏福康B(enflofocon B)、艾瑞福康A(erifocon A)、伏欧落福康A(flurofocon A)、伏昔福康A(flusilfocon A)、伏昔福康B(flusilfocon B)、伏昔福康C(flusilfocon C)、伏昔福康D(flusilfocon D)、伏昔福康E(flusilfocon E)、黑沙福康A(hexafocon A)、后佛福康A(hofocon A)、亥布福康A(hybufocon A)、依他必思伏欧落福康A(itabisfluorofocon A)、依他伏欧落福康A(itafluorofocon A)、依他福康A(itafocon A)、依他福康B(itafocon B)、可福康A(kolfocon A)、可福康B(kolfocon B)、可福康C(kolfocon C)、可福康D(kolfocon D)、落提福康A(lotifocon A)、落提福康B(lotifocon B)、落提福康C(lotifocon C)、美拉福康A(melafocon A)、米嘎福康A(migafocon A)、奈福康A(nefocon A)、奈福康B(nefocon B)、奈福康C(nefocon C)、央昔福康A(onsifocon A)、欧福康A(oprifocon A)、欧可昔伏福康A(oxyfluflocon A)、帕伏福康B(paflufocon B)、帕伏福康C(paflufocon C)、帕伏福康D(paflufocon D)、帕伏福康E(paflufocon E)、帕伏福康F(paflufocon F)、帕昔福康A(pasifocon A)、帕昔福康B(pasifocon B)、帕昔福康C(pasifocon C)、帕昔福康D(pasifocon D)、帕昔福康E(pasifocon E)、配迷福康A(pemufocon A)、包罗福康A(porofocon A)、包罗福康B(porofocon B)、落伏福康A(roflufocon A)、落伏福康B(roflufocon B)、落伏福康C(roflufocon C)、落伏福康D(roflufocon D)、落伏福康E(roflufocon E)、落昔福康A(rosilfocon A)、沙他福康A(satafocon A)、昔伏福康A(siflufocon A)、西拉福康A(silafocon A)、丝特若福康A(sterafocon A)、苏洛福康A(sulfocon A)、苏洛福康B(sulfocon B)、特拉福康A(telafocon A)、替昔福康A(tisilfocon A)、妥洛福康A(tolofocon A)、催福康A(trifocon A)、乌尼福康A(unifoconA)、维纳福康A(vinafocon A)及威洛福康A(wilofocon A)。用于制造具有递送本发明组合物的手段的亲水性眼镜的示例性材料包括但不限于：巴菲康A(abafilcon A)、阿考菲康A(acofilcon A)、阿考菲康B(acofilcon B)、阿克夸菲康A(acquafilcon A)、阿洛菲康A(alofilcon A)、阿尔法菲康A(alphafilcon A)、阿姆菲康A(amfilcon A)、阿替菲康A(astifilcon A)、阿拉菲康A(atlafilcon A)、巴拉菲康A(balafilcon A)、必思菲康A(bisfilcon A)、巴菲康A(bufilcon A)、库菲康A(comfilcon A)、克罗菲康A(crofilconA)、环菲康A(cyclofilcon A)、达菲康A(darfilcon A)、德他菲康A(deltafilcon A)、德他菲康B(deltafilcon B)、地莫费尔康A(dimefilcon A)、卓克斯菲康A(droxfilcon A)、依拉菲康A(elastofilcon A)、依匹昔菲康A(epsilfilconA)、艾司菲康A(esterifilcon A)、依他菲康A(etafilcon A)、福可菲康A(focofilcon A)、佳利富康A(galyfilcon A)、珍菲康A(genfilcon A)、戈伐菲康A(govafilcon A)、海菲康A(hefilcon A)、海菲康B(hefilconB)、海菲康C(hefilcon C)、海拉菲康A(hilafilcon A)、海拉菲康B(hilafilcon B)、海西菲康A(hioxifilcon A)、海西菲康B(hioxifilcon B)、海西菲康C(hioxifilcon C)、氢菲康A(hydrofilcon A)、利诺菲康A(lenefilcon A)、利克菲康A(licryfilcon A)、利克菲康B(licryfilcon B)、利多菲康A(lidofilcon A)、利多菲康B(lidofilcon B)、若他拉菲康A(lotrafilcon A)、若他拉菲康B(lotrafilcon B)、马菲康A(mafilcon A)、马沙菲康A(mesafilcon A)、美他菲康B(methafilcon B)、米帕菲康A(mipafilcon A)、奈弗康A(nelfilcon A)、奈曲福康A(netrafilcon A)、奥库菲康A(ocufilcon A)、奥库菲康B，C(ocufilcon B，C)、奥库菲康D(ocufilcon D)、奥库菲康E(ocufilcon E)、奥菲康A(ofilconA)、奥马菲康A(omafilcon A)、奥昔菲康A(oxyfilcon A)、喷他菲康A(pentafilcon A)、波菲尔康A(perfllcon A)、脓菲康A(pevafilcon A)、菲莫菲康A(phemfilcon A)、聚麦康(polymacon)、斯弗康A(senofilcon A)、西拉费尔康A(silafilcon A)、西欧可喜菲康A(siloxyfilcon A)、舒菲康A(surfilcon A)、替菲康A(tefilcon A)、四菲康A(tetrafilconA)、催菲康A(trilfilcon A)、维菲康A(vmcon A)、维菲康B(viflcon B)和赛洛菲康A(xylofilcon A)。
配制成凝胶或凝胶状物质、乳剂或粘性乳液的组合物在本发明的范围内。优选地，所述组合物包括至少一种胶凝组分、聚合物或其他适当试剂以提高组合物的粘度。可以使用本领域技术人员已知的任何胶凝组分，其对被治疗的区域没有不利影响并且适用于配制局部施用至皮肤、眼或粘膜的组合物和药物组合物。例如，胶凝组分可以选自由以下项构成的组：丙烯酸、卡波姆、羧基聚甲撑，B.F.Goodrich公司以商标Carbopol(例如Carbopol940)出售的此类材料、聚乙烯-聚丙二醇、BASF以商标泊洛沙姆(Poloxamer)出售的此类材料(如泊洛沙姆188)、纤维素衍生物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙烯纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、海藻酸-丙二醇酯、聚乙烯吡咯烷酮、veegum(硅酸铝镁)、Pemulen、Simulgel(例如Simulgel 600、Simulgel EG和simulgel NS)、Capigel、Colafax、聚维酮(plasdones)等及其混合物。
根据本发明的凝胶或凝胶状物质包括例如小于10％w/w的水，例如小于20％w/w的水，例如至少20％w/w的水，例如至少30％w/w的水，例如至少40％w/w的水，例如至少50％w/w的水，例如至少75％w/w的水，例如至少90％w/w的水，例如至少95％w/w的水。优选地，所述水是去离子水。
本发明的凝胶状物质包括水凝胶，在水或其他水性介质中以分散体形成的胶体凝胶。因此，在形成胶体之后形成水凝胶，其中分散相(胶体)与连续相(即水)结合以产生粘性胶冻状产物；例如，凝结的硅酸。水凝胶是通过化学或物理键合交联的三维亲水聚合物链网络。由于聚合物链的亲水性，水凝胶吸水并膨胀。膨胀过程与非交联亲水聚合物的溶解相同。根据定义，水至少占水凝胶总重量(或体积)的10％。
水凝胶的示例包括合成聚合物，例如聚羟基甲基丙烯酸乙酯，以及化学或物理交联的聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚氧化乙烯和水解聚丙烯腈。作为有机聚合物的水凝胶的示例包括共价或离子交联的基于多糖的水凝胶，例如藻酸盐、果胶、羧甲基纤维素、肝素、透明质酸盐的多价金属盐，以及来自几丁质、壳聚糖、支链淀粉、胶凝糖和黄原胶的水凝胶。我们实验中使用的特定水凝胶是纤维素化合物(即羟丙基甲基纤维素[HPMC])和高分子量透明质酸(HA)。
透明质酸是由各种身体组织产生的多糖。美国专利5,166,331讨论了纯化透明质酸的不同级分，以用作眼内液的替代品以及局部眼用药物载体。其他讨论透明质酸的眼用用途的美国专利申请包括序列号11/859,627；11/952,927；10/966,764；11/741,366；和11/039,192。眼内使用的大分子制剂是已知的。参见例如美国专利申请序列号11/370,301；11/364,687；60/721,600；11/116,698和60/567,423；11/695,527。各种活性剂的应用是高粘度透明质酸的并且是已知的。参见例如美国专利申请序列号10/966,764；11/091,977；11/354,415；60/519,237；60/530,062和11/695,527。
如WO2010048086中描述的持续释放制剂在本发明的范围内。
本领域技术人员熟知将多核苷酸或载体掺入宿主细胞的标准方法，例如转染、脂质转染、电穿孔、显微注射、病毒感染、热休克、膜的化学透化之后的转化或细胞融合。
如本文所用，术语“宿主细胞或经遗传工程化改造的宿主细胞”指已用前述构建体或载体转导、转化或转染的宿主细胞。
作为适当宿主细胞的代表性示例，可以列举细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，真菌细胞例如酵母，昆虫细胞例如Sf9，动物细胞例如CHO或COS，植物细胞等。根据本文的教导，适当宿主的选择视作在本领域技术人员的范围内。优选地，所述宿主细胞是动物细胞，最优选地，是人细胞。本发明进一步提供包括本文所述的任何重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体，例如人分离的细胞。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即在悬浮液中生长的细胞。适当的宿主细胞是本领域中已知的，并且包括例如DH5α、大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。
在离体基因治疗的情况下，宿主细胞可以是从患者分离的细胞，例如造血干细胞，其在引入转基因后重新引入到有此需要的所述患者中。
基于AAV的病毒递送系统
AAV载体的构建可以按照程序并且使用本领域中技术人员已知的技术进行。一些科学和专利出版物中阐述了腺相关病毒载体构建及其在治疗中的使用的理论和实践(以下参考书目通过引用并入本文中：Flotte TR.Adeno-associated virus-based genetherapy for inherited disorders.Pediatr Res.2005Dec；58(6)：1143-7；GoncalvesMA.Adeno-associated virus：from defective virus to effective vector，VirolJ.2005May 6；2：43；Surace EM，Auricchio A.Adeno-associated viral vectors forretinal gene transfer.Prog Retin Eye Res.2003Nov；22(6)：705-19；Mandel RJ，Manfredsson FP，Foust KD，Rising A，Reimsnider S，Nash K，Burger C.Recombinantadeno-associated viral vectors as therapeutic agents to treat neurologicaldisorders.Mol Ther.2006Mar；13(3)：463-83)。
含有AAV载体的药物组合物的适当施用形式包括但不限于可注射溶液或悬浮液、洗眼液和眼用软膏。在一个优选的实施方案中，AAV载体通过鞘内注射来施用。在一个特别优选的实施方案中，AAV载体以视网膜下注射的方式施用在前房或眼球后间隙以及玻璃体内。优选地，病毒载体通过视网膜下方法来递送(例如如Bennicelli J，et al MolTher.2008Jan 22；Reversal of Blindness in Animal Models of Leber CongenitalAmaurosis Using Optimized AAV2-mediated Gene Transfer中描述)。
用于治疗的病毒剂量应视具体情况而定，具体取决于施用途径、疾病的严重程度、患者的一般状况以及其他临床参数。一般而言，适当剂量范围为108到1013vg(载体基因组)/眼。
内蛋白
内蛋白是能够切除自身并且在称为蛋白质剪接的过程中用肽键连接剩余部分(外显蛋白)的蛋白质片段。该片段称为“内蛋白”，代表内部蛋白序列，并且“外显蛋白”代表外部蛋白序列，其中上游外显蛋白称为“N-外显蛋白”并且下游外显蛋白称为“C-外显蛋白”。蛋白质剪接过程的产物是两种稳定的蛋白质：成熟蛋白质和内蛋白。
内蛋白也可以作为由两个单独转录和翻译的基因所编码的两个片段存在，本文称为“分裂型内蛋白”。
本发明的内蛋白包括但不限于(66)中公开的New England Biolabs内蛋白数据库中列出的分裂型内蛋白。
可以通过首先去除归巢核酸内切酶结构域序列以产生小内蛋白，从内蛋白开始产生分裂型内蛋白。之后，所述小内蛋白可以在一个或多个位点处分裂，所述位点通过与已知晶体结构的内蛋白的蛋白质序列比对以产生分裂型内蛋白设计，根据本公开内容中包括的方案测定反式剪接活性。
通过基于合理设计的内蛋白序列的定点诱变或修饰，以及/或者通过使用功能选择、噬菌体展示和核糖体显示等方法的定向进化，可以进一步改善分裂型内蛋白的期望特性，包括活性、效率、通用性和稳定性。
分裂型内蛋白的一个示例是来源于DnaE的内蛋白，它是蓝藻细菌中DNA聚合酶III的催化亚单位a，由两个独立的基因dnaE-n和dnaE-c编码。由dnaE-n基因编码的内蛋白在本文中称为“N-内蛋白”。由dnaE-c基因编码的内蛋白在本文中称为“C-内蛋白”。通常，分裂型内蛋白的N-部分称为“N-内蛋白”，并且分裂型内蛋白的C-部分称为“C-内蛋白”。分裂型内蛋白自缔合并且催化反式蛋白质剪接活性(此处称为“反式剪接”)。
本发明的分裂型内蛋白的其它示例包括：来自点状念珠藻(Npu)的DnaE的内蛋白(27、28)，在下表3中表示为由Npu-DnaE-n核苷酸序列编码的SEQ.ID 1，以及由Npu-DnaE-c核苷酸序列编码的SEQ ID 2；来自海洋红嗜热盐菌(Rma)的DnaB的内蛋白(29)，在下表中表示为由Rma-DnaB-n核苷酸序列编码的SEQ ID 4以及由Rma-DnaB-c核苷酸序列编码的SEQID 5；突变N-和C-内蛋白，其中N-内蛋白是来自Npu的DnaE(SEQ.ID 5)并且C-内蛋白是来自集胞藻菌株PCC6803(Ssp(SEQ ID 6)，(30)；集胞藻菌株PCC6803 N-内蛋白和C-内蛋白分别作为SEQ.ID 13和14包括在下表中。也可以使用其他内蛋白系统。例如，已经描述了基于dnaE内蛋白、Cfa-N和Cfa-C内蛋白对的合成快速内蛋白(例如(31)和WO 2017/132580，它们通过引用并入本文中)。另外的内蛋白已在第8,394,604号美国专利中描述，其包括SspGyrB内蛋白、Ssp DnaX内蛋白、Ter DnaE3内蛋白、Ter ThyX内蛋白和Cne Prp8内蛋白。进一步在本发明中的内蛋白是WO2018071868中公开的内蛋白，其中第一对内蛋白列于下表中并命名为SEQ ID 9(N-内蛋白)和SEQ ID 10(C-内蛋白)；列出第二对内蛋白，例如SEQ ID 11和SEQ ID 12。
替代地，内蛋白系统可以是配体依赖性内蛋白，其在没有配体(例如，小分子，例如4-羟基他莫昔芬、肽、蛋白质、多核苷酸、氨基酸和核苷酸)的情况下不表现出蛋白质剪接活性或表现出最小的蛋白质剪接活性。配体依赖性内蛋白包括例如U.S.2014/0065711 A1中所描述的配体依赖性内蛋白，此专利申请通过引用并入本文中。
表3：本发明的分裂型内蛋白的实例
Figure BDA0003105985640000421
Figure BDA0003105985640000431
Figure BDA0003105985640000441
如本文所述，源自不同生物体的相同基因、保留反式剪接活性的内蛋白在本发明的范围内。作为一个非限制性示例，DNA-E分裂型内蛋白可以源自蓝细菌的DnaE基因(例如DNA聚合酶III亚单位α)的分裂型内蛋白，包括点状念珠菌(Npu)、集胞藻PCC6803(Ssp)、费氏藻PCC 9605、双歧藻属、单歧伪枝藻、蓝细菌SW_9_47_5、泡沫节球藻、发状念珠藻、瓦氏鳄球藻WH 8502、古巴拟色球藻CCALA 043、红海束毛藻。作为另一示例，DNA-B分裂型内蛋白可以源自来自蓝细菌的DnaB基因，包括例如(59)中描述的海洋红嗜热盐菌(Rma)、集胞藻PC6803(Ssp)、紫红紫菜叶绿体(Ppu)。
因此，本发明的分裂型内蛋白可以与天然存在的内蛋白100％、98％、80％、75％、70％、65％、50％相同，其中所述内蛋白保留进行反式剪接反应的能力。保留反式剪接活性的天然存在或经修饰的内蛋白的片段在本发明的范围内。
例如参见Npu(点状念珠藻)DnaE和集胞藻PCC6803 N-内蛋白之间的比对：
Figure BDA0003105985640000442
Figure BDA0003105985640000443
Figure BDA0003105985640000451
并且，Npu(点状念珠藻)DnaE和集胞藻PCC6803 C-内蛋白之间的比对：
Figure BDA0003105985640000452
Figure BDA0003105985640000453
因此，保留反式剪接活性的本发明内蛋白的分裂型内蛋白变体和片段也在本发明的范围内。
令人感兴趣的是，据报道内蛋白具有保证其剪接活性的保守功能特征。具体来说，已经鉴定出四个内蛋白基序(关于其共有序列，参见下文)：块A-H(Pietrokovski 1994和Perler 1997)和块N2和N4(Pietrokovski 1998)。内蛋白块A、N2、B、N4、F和G参与蛋白质剪接。块C、D、E、H位于核酸内切酶结构域中，从分裂型内蛋白中缺乏所述核酸内切酶结构域。因此，分裂型内蛋白保留对反式剪接活性必不可少的保守基序。(内蛋白数据库，公开于[Perler，F.B.(2002)，InBase，the Intein Database，Nucleic Acids Res.30，383-384]中)。
Figure BDA0003105985640000461
尽管无单一残基是不变的，但块A中的丝氨酸(Ser)和半胱氨酸(Cys)、块B中的组氨酸(His)、块G中的组氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)和丝氨酸(Ser)/半胱氨酸(Cys)/苏氨酸(Thr)是剪接基序中最保守的残基。
本发明的内蛋白的比对：
所有列出的N-内蛋白的CLUSTAL W比对：
Figure BDA0003105985640000462
Figure BDA0003105985640000471
列出的所有C-内蛋白的CLUSTAL 2.1多序列比对
Figure BDA0003105985640000472
总之，内蛋白活性是背景依赖的，其连接接合处周围具有发生有效反式剪接所必需的某些肽序列(称为N-和C-外显蛋白)，其中最重要的是作为C-外显蛋白中的第一残基的含有亲核巯基或羟基基团的氨基酸(例如半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸)。
本发明人已使用内蛋白介导的蛋白质反式剪接以在体内重构大蛋白质。由内蛋白基因序列编码的分裂型内蛋白作为前体多肽产生，通过它们的结构互补可以重新组装并且催化蛋白质反式剪接反应。
在蛋白质反式剪接的背景下，N-内蛋白基因与编码目的蛋白质N-末端部分的序列在框内融合；C-内蛋白基因与编码目的序列的C-末端部分的序列在框内融合。表达两个前体融合蛋白之后，内蛋白经历自催化切除并且形成连接的外显蛋白，例如重构的目的蛋白质。
因此，目的蛋白质的重构需要将所述蛋白质分成两个或三个片段，所述片段的编码序列分别克隆到AAV载体中，与N-或C-内蛋白融合并且处于启动子的控制下。考虑到作为C-外显蛋白中的第一个残基的接合点处的氨基酸要求(例如，含有亲核硫醇或羟基的氨基酸(即半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸)的存在)，并且考虑到保持关键蛋白质结构域的完整性以有利于每个内蛋白-多肽前体多肽和所得的重构蛋白质的正确蛋白质折叠和稳定性，选择每个蛋白质的分裂点。
特别值得注意的是，本发明人选择了两种目的蛋白质内的连接点：蛋白质ABCA4在氨基酸Cys1150、Ser1168、Ser1090处分裂，并且分裂型内蛋白在分裂点插入。CEP290蛋白在aa Cys1076、Ser1275、Cys929和1474；Ser 453和Cys 1474处分裂。
降解信号
受调控的蛋白质降解保护细胞免受错误折叠、聚集或其它方面异常的蛋白质的影响，并且也控制进化为体内短寿命的蛋白质的水平，并且主要由泛素(Ub)-蛋白酶体系统(UPS)和自噬-溶酶体途径介导，其中分子伴侣是这两个系统的一部分。
降解信号是蛋白质的特征，使其成为蛋白质降解途径的目标，从而降低其半衰期。具体地，N-降解决定子和C-降解决定子是降解信号，其主要决定因素分别是细胞蛋白质的N-末端和C-末端残基。N-降解决定子和C-降解决定子在不同程度上包括相邻的序列基序，以及还包括功能为多泛素化位点的内部赖氨酸残基。
在本发明的含义内，内部降解决定子定义为位于蛋白质序列内的降解信号，所述蛋白质序列既不在N-末端也不在C-末端，并且其功能必需元件不包括N-末端残基或C-末端残基并且介导蛋白质降解。
降解决定子途径包括多组蛋白水解系统，所述蛋白水解系统的统一特征是其能够识别含有N-或C-或内部-降解决定子的蛋白质，从而致使这些蛋白质被26S蛋白酶体或自噬降解。
大肠杆菌二氢叶酸还原酶(ecDHFR)是一种159个残基的酶，其催化二氢叶酸还原为四氢叶酸，一种原核初级代谢中的几个步骤必需的辅因子。许多DHFR抑制剂已开发为药物，并且一种此类抑制剂甲氧苄啶(TMP)以比抑制哺乳动物DHFR有力得多地抑制ecDHFR。此大治疗窗口使TMP在哺乳动物细胞中变得“生物沉默”。ecDHFR-TMP相互作用的特异性，以及TMP的商业可用性以及有吸引力的药理特性，使得此蛋白质-配体对对于开发为降解系统是理想的。(69)因此，蛋白质内的DHFR氨基酸序列，优选地ecDHFR氨基酸序列的存在功能为蛋白酶体系统的目标信号，导致蛋白质降解。在TMP存在下，所述蛋白质是稳定化的。
便利的是，Iwamoto等人开发的携带点突变的ecDHFR衍生的降解决定子信号包括三个氨基酸突变，R12Y、Y100I和G67S(69)，它们仅在置于N-末端或内部位置内时才赋予功能活性(例如融合蛋白的降解)。
鉴定最短活性肽的本发明人对ecDHFR衍生的降解决定子进行了进一步改进。便利的是，较短的序列允许在同一AAV载体中安装较长的编码序列。
在本发明中，ecDHFR衍生的降解决定子融合到内蛋白的N-末端，在此处它是无活性的。在蛋白质反式剪接时，降解决定子位于重构的内蛋白内并且介导其降解。
本发明的ecDHFR是WT ecDHFR、突变型DHFR、全长ecDHFR、较短的scDHFR。
DHFR的长度可以为105到159aa，其中缩短发生在C末端。
ecDHFR大肠杆菌衍生，野生型
核苷酸序列：(623nt)SEQ ID No.27
Figure BDA0003105985640000491
氨基酸序列：
159aa-WT SEQ ID No.28
Figure BDA0003105985640000492
ecDHFR大肠杆菌衍生，内部降解决定子突变体(159aa)
突变位置以粗体示出-SEQ ID No.29
Figure BDA0003105985640000501
ecDHFR大肠杆菌衍生，野生型，最小活性片段
核苷酸序列：SEQ ID No.30
Figure BDA0003105985640000502
氨基酸序列SEQ ID No.31
Figure BDA0003105985640000503
ecDHFR大肠杆菌衍生，内部降解决定子突变体pe，最小活性片段(104aa)
(突变位置以粗体示出)SEQ ID No.32
Figure BDA0003105985640000504
序列
本发明的编码序列可以可操作地连接到启动子序列，任选接着是内含子序列，能够调节其在哺乳动物细胞，优选地哺乳动物视网膜细胞，特别是感光器细胞，或肝细胞、肌肉细胞、心脏细胞、神经元细胞、肾细胞、内皮细胞中的表达。示例性启动子包括但不限于遍在、人工或组织特异性的启动子，包括其保留转录启动子活性的片段和变体，例如感光器特异性启动子，包括感光器特异性人G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)、感光器间类视色素结合蛋白启动子(IRBP)、视紫红质启动子(RHO)、卵黄状黄斑营养不良2启动子(VMD2)、视紫红质激酶启动子(RK)；肌肉特异性启动子，包括MCK、MYODI；肝特异性启动子，包括甲状腺素结合球蛋白(TBG)、杂合肝特异性启动子(HLP)(67)；神经元特异性启动子，包括hSYN1、CaMKIIa；肾脏特异性启动子，包括Ksp-钙粘着蛋白16、NKCC2。根据本发明的遍在启动子是例如遍在巨细胞病毒(CMV)(32)和短CMV(33)启动子。
任选地，启动子序列包括增强子序列，例如珠蛋白IgG嵌合内含子。
出于本发明的目的，EGFP(YP_009062989)、ABCA4和CEP290的编码序列在功能上连接到能够调节其在哺乳动物视网膜细胞，特别是在感光器细胞中的表达的启动子序列，所述编码序列优选地分别选自本文所附的序列，或者由于遗传密码的简并性而编码相同氨基酸序列的序列。
示例性聚腺苷酸化信号包括但不限于牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGHpA)、人β球蛋白聚腺苷酸化信号或短合成形式(68)、SV40聚腺苷酸化信号或其他天然或人工聚腺苷酸化信号。
本发明提供了降解信号的核苷酸序列以降低重构的内蛋白的稳定性的用途。便利地，可以重复一个或多个序列以保持最大效果。
根据本发明的适当降解信号包括：(i)短降解决定子CL1，一种C-末端去稳定化肽，其与错误折叠的蛋白质共享结构相似性，因此被泛素化系统识别，(ii)泛素，其在供体蛋白质的N-末端处的融合介导直接蛋白质降解或者通过N-末端规则途径降解两者，(iii)N-末端PB29降解决定子，此N-末端PB29降解决定子是一种长9个氨基酸的肽，其与CL1降解决定子类似，预计会折叠成由本文本文和(69)中所述的泛素化途径、变体ecDHFR及其片段的酶识别的结构，特别是携带点突变的ecDHFR衍生的降解决定子信号，所述点突变包括三个氨基酸突变R12Y、Y100I和G67S，它们仅当放置在N-末端或内部位置内时才赋予功能活性(例如，融合蛋白的降解)。
示例性降解信号在WO 201613932中进行了描述，此专利通过引用并入本文中。
本领域技术人员可以容易地理解，除了可以由实验室熟练技术人员人工创建的变体之外，还可以存在自然界中发现的蛋白质的许多变体序列。本发明的多核苷酸和多肽包括本文具体举例说明的多核苷酸和多肽，以及其任何天然变体，以及可以人工产生的任何变体，只要那些变体保留期望的功能活性即可。此外，除了多肽序列内的氨基酸取代、添加或缺失之外具有与本文示例说明的多肽相同的氨基酸序列的多肽也在本发明的范围内，只要这些变体多肽保留与本文具体例示的多肽基本相同的相关功能活性。例如，多肽内不影响多肽功能的保守氨基酸取代将在本发明的范围内。因此，本文公开的多肽应理解为包括上文所讨论的具体示例序列的变体和片段。本发明还包括编码本文公开的多肽的核苷酸序列。这些核苷酸序列可以由具有本文中提供的蛋白质和氨基酸序列知识的本领域技术人员容易地构建。如本领域技术人员所理解，遗传密码的简并性使技术人员能够构建编码特定多肽或蛋白质的多种核苷酸序列。特定核苷酸序列的选择可以取决于例如特定表达系统或宿主细胞的密码子选择。具有除了在主题多肽中具体例举的取代之外的氨基酸取代的多肽也包括在本发明的范围内。例如，非天然氨基酸可以替代本发明多肽的氨基酸，只要具有替代氨基酸的多肽保留与氨基酸未被取代的多肽基本相同的活性。非天然氨基酸的示例包括但不限于鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘酪氨酸、2，4-二氨基丁酸、a-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、τ-丁基甘氨酸、τ-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计者氨基酸，例如β-甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物。非天然氨基酸还包括具有衍生化侧基的氨基酸。此外，蛋白质中的任何氨基酸可以是D(右旋)形式或L(左旋)形式。氨基酸通常可以分为以下几类：非极性、不带电荷的极性、碱性和酸性。保守取代落入本发明的范围内，只要具有此取代的多肽仍保留与不具有此取代的多肽基本上相同的生物学活性即可，所述保守取代指具有一类氨基酸的多肽用相同类别的另一种氨基酸替换。表4提供了属于每类的氨基酸的示例的列表。
Figure BDA0003105985640000521
除了多核苷酸序列内的核苷酸取代、添加或缺失之外具有与本文示例的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核苷酸也在本发明的范围内，只要这些变体多核苷酸保留与本文具体举例说明的多核苷酸基本相同的相关功能活性即可(例如，它们编码的蛋白质具有与例示的多核苷酸的编码者相同的氨基酸序列或相同的功能活性)。因此，本文公开的多核苷酸应理解为包括上文所讨论的具体示例序列的变体和片段。
本发明还考虑如下的多核苷酸分子，其具有与本发明的多核苷酸序列足够同源的序列以允许在标准严格条件和标准方法(Maniatis，T.等人，1982)下与该序列杂交的序列。本文描述的多核苷酸也可以根据与本文举例说明的多核苷酸的更具体同一性和/或相似性范围来限定。序列同一性通常大于60％，优选地大于75％，更优选地大于80％，甚至更优选地大于90％，并且可以大于95％。序列与本文示例的序列相比的同一性和/或相似性可以是49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或以上。除非另有说明，如本文所用，两个序列的序列同一性和/或相似性百分比可以使用Karlin和Altschul(1990)的算法确定，如Karlin和Altschul(1993)中所述修改。此类算法已被整合到Altschul等人(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以使用NBLAST程序以得分＝100、字长＝12来进行BLAST搜索，以获得具有期望序列同一性百分比的序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用Gapped BLAST，如Altschul等人(1997)所述。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用相应程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。参阅NCBI/N1H网站。
本发明的质粒
Figure BDA0003105985640000541
Figure BDA0003105985640000551
Figure BDA0003105985640000561
EGFP
p915_pAAV2.l-TBG-5′EGFP内蛋白(SEQ ID No.33)
Figure BDA0003105985640000562
(seqA在序列的5′开头)
TBG启动子：粗体(seq B)
5′EGFP：下划线(seq C)
Figure BDA0003105985640000571
(seq D)
3xflag：斜体(seq E)
WPRE：斜体下划线(seq F)
Bgh PolyA：粗体下划线(seq G)
Figure BDA0003105985640000572
(seq H在序列的3′开头)
Figure BDA0003105985640000573
Figure BDA0003105985640000581
P917_pAAV2.1-TBG-3’EGFP内蛋白
5’ITR(seqA)
TBG启动子(seq B)
C-内蛋白Npu DnaE(seq I)SEQ ID No.34
Figure BDA0003105985640000582
3′EGFP(seq L)SEQ ID No.35
Figure BDA0003105985640000583
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p914_pAAV2.1-CMV-5′EGFP内蛋白
5′ITR(seqA)
CMV启动子(seq M)SEQ.36
Figure BDA0003105985640000591
5′EGFP(seq C)
N-内蛋白Npu DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p916_pAAV2.1-CMV-3′EGFP内蛋白
5′ITR(seqA)
CMV启动子(seq M)
C-内蛋白Npu DnaE(seq I)
3′EGFP(seq L)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p932_pAAV2.1-GRKl-5′EGFP内蛋白
5′ITR(seqA)
GRK1启动子(seq N)SEQ.37
Figure BDA0003105985640000601
5′EGFP(seq C)
N-内蛋白Npu DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p933_pAAV2.1-GRKl-3′EGFP内蛋白
5′ITR(seqA)
GRK1启动子(seq N)
C-内蛋白Npu DnaE(seq I)
3′EGFP(seq L)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p36 pAAV2.1-CMV-5′EGFP内蛋白_ecDHFR
5′ITR(seqA)
CMV启动子(seq M)
5′EGFP(seq C)
N-内蛋白Npu DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
ecDHFR(seq O)SEQ ID No.38
Figure BDA0003105985640000611
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p37 pAAV2.1-CMV-5′EGFP内蛋白_小ecDHFR
5′ITR(seqA)
CMV启动子(seq M)
5′EGFP(seq C)
N-内蛋白Npu DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
小ecDHFR(seq P)SEQ ID No.39
Figure BDA0003105985640000612
WPRE(seqF)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p902_pAAV2.1-CMV-5′EGFP内蛋白DnaB
5′ITR(seqA)
CMV启动子(seq M)
5′EGFP(seq C)
N-内蛋白RmaDnaB(seq Q)SEQ.ID No.40
Figure BDA0003105985640000621
N-内蛋白Npu DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p903_pAAV2.1-CMV-3′EGFP内蛋白DnaB
5′ITR(seqA)
CMV启动子(seq M)
C-内蛋白Rma DnaB(seq R)SEQ.ID No.41
Figure BDA0003105985640000622
3′EGFP(seq L)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1256_pAAV2.1-CMV-5′EGFP内蛋白mDnaE
5′ITR(seqA)
CMV启动子(seq M)
5′EGFP(seq C)
N-内蛋白mDnaE(seq S)SEQ ID No.42
Figure BDA0003105985640000623
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1257 pAAV2.1-CMV-3′EGFP内蛋白mDnaE
5′ITR(seqA)
CMV启动子(seq M)
C-内蛋白mDnaE(seq T)SEQ.43
Figure BDA0003105985640000631
3′EGFP(seq L)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
CEP290
p1005 pAAV2.1-CMV260-5′CEP290内蛋白(组1)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)SEQ ID No.44
Figure BDA0003105985640000632
5′CEP290：SEQ ID No.45
Figure BDA0003105985640000641
Figure BDA0003105985640000651
N-内蛋白DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
shPolyA(seq V)SEQ ID No.46
Figure BDA0003105985640000652
3′ITR(seq H)
p1093 pAAV2.1-CMV260-3′CEP290内蛋白(组1)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
3′CEP290：SEQ ID No.47
Figure BDA0003105985640000653
Figure BDA0003105985640000661
Figure BDA0003105985640000671
C-内蛋白DnaE(seq I)
3xflag(seq E)
shPolyA(seq V)
3′ITR(seq H)
p1065 pAAV2.1-CMV260-5′CEP290内蛋白(组2)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
5′CEP290：SEQ ID No.48
Figure BDA0003105985640000672
Figure BDA0003105985640000681
Figure BDA0003105985640000691
N-内蛋白DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1067pAAV2.1-CMV260-3′CEP290内蛋白(组2)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
3′CEP290：SEQ ID No.49
Figure BDA0003105985640000692
Figure BDA0003105985640000701
Figure BDA0003105985640000711
C-内蛋白DnaE(seq I)
3xflag(seq E)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1087 pAAV2.1-CMV260-5′CEP290内蛋白(组3)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
5′CEP290：SEQ ID No.50
Figure BDA0003105985640000712
Figure BDA0003105985640000721
N-内蛋白mDnaE(seq S)
3xflag(seq E)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1088 pAAV2.1-CMV260-3′CEP290内蛋白(组3)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
3′CEP290：SEQ ID No.51
Figure BDA0003105985640000731
Figure BDA0003105985640000741
C-内蛋白mDnaE(seq T)
3xflag(seq E)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1182 pAAV2.1-CMV260-5′CEP290内蛋白(组4)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
5′CEP290：SEQID No.52
Figure BDA0003105985640000751
N-内蛋白DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1183pAAV2.1-CMV260-CEP290体内蛋白(组4)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
C-内蛋白DnaE(seq I)
CEP290体：SEQ ID No.53
Figure BDA0003105985640000761
N-内蛋白Rma DnaB(seq Q)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1181pAAV2.1-CMV260-3′CEP290内蛋白(组4/组5)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
C-内蛋白Rma DnaB(seq R)
3′CEP290：SEQ ID No.54
Figure BDA0003105985640000771
Figure BDA0003105985640000781
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1179 pAAV2.1-CMV260-5′CEP290内蛋白(组5)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
5′CEP290：SEQ ID No.55
Figure BDA0003105985640000791
N-内蛋白mDnaE(seq S)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1180 pAAV2.1-CMV260-CEP290体内蛋白(组5)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
C-内蛋白mDnaE(seq T)
CEP290体：SEQ ID No.56
Figure BDA0003105985640000801
Figure BDA0003105985640000811
N-内蛋白RmaDnaB(seq Q)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1152pAAV2.1-GRKl-5′CEP290内蛋白(组5)
5′ITR(seqA)
GRK1启动子(seq N)
5′CEP290：SEQ ID No.57
Figure BDA0003105985640000812
Figure BDA0003105985640000821
N-内蛋白mDnaE(seq S)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1153 pAAV2.1-GRKl-CEP290体内蛋白(组5)
5′ITR(seqA)
GRK1启动子(seq N)
C-内蛋白mDnaE(seq T)
CEP290体：SEQ ID No.58
Figure BDA0003105985640000822
Figure BDA0003105985640000831
N-内蛋白RmaDnaB(seq Q)
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
p1156 pAAV2.1-GRKl-3′CEP290内蛋白(组5)
5′ITR(seqA)
GRK1启动子(seq N)
C-内蛋白Rma DnaB(seq R)
3′CEP290：SEQ ID No.59
Figure BDA0003105985640000841
Figure BDA0003105985640000851
3xflag(seq E)
WPRE(seq F)
Bgh PolyA(seq G)
3′ITR(seq H)
pzac-GRKl-5′ABCA4内蛋白(组1)SEQ ID No.60
5′ITR(seq A)
GRK1：粗体
5′ABCA4：下划线
N-内蛋白Npu DnaE：
Figure BDA0003105985640000852
3xflag：斜体
SV40：粗体下划线
3′ITR(seq H)
Figure BDA0003105985640000861
Figure BDA0003105985640000871
pzac-GRKl-3′ABCA4内蛋白(组1)SEQ.No.61
5′ITR(seq A)
GRK1：粗体
3′ABCA4：下划线
C-内蛋白Npu DnaE：
Figure BDA0003105985640000881
3xflag：斜体
SV40：粗体下划线
3′ITR(seq H)
Figure BDA0003105985640000882
Figure BDA0003105985640000891
pzac-CMV260-5′ABCA4内蛋白(组1)SEQ.No.62
5′ITR(seq A)
CMV260：粗体
5′ABCA4：下划线
N-内蛋白Npu DnaE：
Figure BDA0003105985640000901
3xflag：斜体
SV40：粗体下划线
3′ITR(seq H)
Figure BDA0003105985640000902
Figure BDA0003105985640000911
Figure BDA0003105985640000921
pzac-CMV260-3′ABCA4内蛋白(组1)SEQ.No.63
5′ITR(seq A)
CMV260：粗体
3′ABCA4：下划线
C-内蛋白Npu DnaE：
Figure BDA0003105985640000922
3xflag：斜体
SV40：粗体下划线
3′ITR(seq H)
Figure BDA0003105985640000923
Figure BDA0003105985640000931
Figure BDA0003105985640000941
p38 pAAV2.1-CMV260-5′ABCA4内蛋白_ecDHFR(组1)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
5′ABCA4(来自组1)
N-内蛋白Npu DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
ecDHFR(seq O)
WPRE(seq F)
SV40 PolyA(seq W)
3′ITR(seq H)
p39 pAAV2.1-CMV260-5′ABCA4内蛋白_小ecDHFR(组1)
5′ITR(seqA)
CMV260(seq U)
5′ABCA4(来自组1)
N-内蛋白Npu DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
小ecDHFR(seq P)
WPRE(seq F)
SV40 PolyA(seq W)
3′ITR(seq H)
p40 pAAV2.1-GRKl-5′ABCA4内蛋白_ecDHFR(组1)
5′ITR(seqA)
GRK1(seqN)
5′ABCA4(来自组1)
N-内蛋白Npu DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
ecDHFR(seq O)
WPRE(seq F)
SV40 PolyA(seq W)
3′ITR(seq H)
p41 pAAV2.1-GRKl-5’ABCA4内蛋白_小ecDHFR(组1)SEQ ID No.64
5′ITR(seq A)
GRK1：粗体
5′ABCA4：下划线
N-内蛋白Npu DnaE：
Figure BDA0003105985640000951
3xflag：斜体
小ecDHFR：粗下划线
SV40：粗体下划线
3′ITR(seq H)
Figure BDA0003105985640000961
Figure BDA0003105985640000971
pzac-CMV260-5′ABCA4内蛋白(组2)SEQ.ID No.65
5′ITR(seq A)
CMV260：粗体
5′ABCA4：下划线
N-内蛋白Npu DnaE：
Figure BDA0003105985640000981
3xflag：斜体
SV40：粗体下划线
3′ITR(seq H)
Figure BDA0003105985640000982
Figure BDA0003105985640000991
Figure BDA0003105985640001001
pzac-CMV260-3′ABCA4内蛋白(组2)SEQ.ID No.66
5′ITR(seq A)
CMV260：粗体
3′ABCA4：下划线
C-内蛋白Npu DnaE：
Figure BDA0003105985640001002
3xflag：斜体
SV40：粗体下划线
3′ITR(seq H)
Figure BDA0003105985640001003
Figure BDA0003105985640001011
Figure BDA0003105985640001021
pzac-CMV260-5′ABCA4内蛋白(组3)SEQ.No.67
5′ITR(seq A)
CMV260：粗体
5′ABCA4：下划线
N-内蛋白Npu DnaE：
Figure BDA0003105985640001022
3xflag：斜体
SV40：粗体下划线
3′ITR(seq H)
Figure BDA0003105985640001023
Figure BDA0003105985640001031
Figure BDA0003105985640001041
pzac-CMV260-3′ABCA4内蛋白(组3)SEQ.ID No.68
5′ITR(seq A)
CMV260：粗体
3′ABCA4：下划线
C-内蛋白Npu DnaE：
Figure BDA0003105985640001042
3xflag：斜体
SV40：粗体下划线
3′ITR(seq H)
Figure BDA0003105985640001043
Figure BDA0003105985640001051
Figure BDA0003105985640001061
p836(IRBP_DsRed)SEQ ID No.69
5′ITR(seq A)
IRBP粗体
WPRE：斜体下划线
DsRed：下划线
BghpA：粗体下划线
3′ITR(seq H)
Figure BDA0003105985640001062
Figure BDA0003105985640001071
p1232 pAAV2.1_HLP_5′F8内蛋白(组1)
5′ITR(seqA)
HLP启动子(seq J)SEQ.ID No.70
Figure BDA0003105985640001072
F8信号序列(seq K)SEQ ID No.71
Figure BDA0003105985640001073
5′F8：SEQ ID No.72
Figure BDA0003105985640001074
Figure BDA0003105985640001081
Figure BDA0003105985640001091
N-内蛋白Npu DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
shPolyA(seq V)
3′ITR(seq H)
p1389 pAAV2.1_HLP_3′F8内蛋白(组1)
5′ITR(seqA)
HLP启动子(seq J)
F8信号序列(seq K)
C-内蛋白Npu DnaE(seq I)
3′F8：SEQ ID No.73
Figure BDA0003105985640001092
Figure BDA0003105985640001101
3xflag(seq E)
shPolyA(seq V)
3′ITR(seq H)
p1207 pAAV2.1_HLP_5′F8内蛋白(组2)
5′ITR(seqA)
HLP启动子(seq J)
F8信号序列(seq K)
5′F8(组2)：SEQ ID No.74
Figure BDA0003105985640001111
Figure BDA0003105985640001121
N-内蛋白Npu DnaE(seq D)
3xflag(seq E)
shPolyA(seq V)
3′ITR(seq H)
p1388 pAAV2.1_HLP_3′F8内蛋白(组2)
5′ITR(seqA)
HLP启动子(seq J)
F8信号序列(seq K)
C-内蛋白Npu DnaE(seq I)
3′F8：SEQ ID No.75
Figure BDA0003105985640001131
Figure BDA0003105985640001141
3xflag(seq E)
shPolyA(seq V)
3′ITR(seq H)
现在将通过非限制性实施例来说明本发明。
材料和方法
AAV载体质粒的生成
用于AAV载体生成的质粒来源于含有AAV血清型2的ITR的pAAV2.1(36)或pZac(37)质粒。AAV内蛋白质粒的设计详见图1A和图S5。在氨基酸(a.a.)C71处分裂EGFP蛋白。在大细胞质结构域CD1(34，35)的a.a.C1150(组1)、a.a.S1168(组2)和a.a.C1090(组3)处分裂ABCA4蛋白。尽管a.a.C1150(组1)和S1168(组2)落在与已知ABCA4功能无关的区域内，C1090包括在跨越a.a.929到a.a.1148的ABCA4核苷酸结合域中。所有CEP290分裂点都落在卷曲螺旋结构域(36)内：当CEP290分裂成两个多肽时，这发生在a.a.C1076(组1)或S1275(组2-3)处，当将其分裂成三个多肽时，这发生于a.a.C929和C1474(组4)或a.a.S453和C1474(组5)处。
包含在质粒中的内蛋白是来自点状念珠菌(Npu)的DnaE的内蛋白(27，28)，或者是由分别来自Npu和集胞藻PCC6803(Ssp)的DnaE的突变型N-和C-内蛋白组成的内蛋白(30)，或者来自海洋红嗜热盐菌(Rma)的DnaB的内蛋白(29)。研究中使用的质粒在遍在的巨细胞病毒(CMV)(38)和短CMV(39)启动子或感光器特异性人G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)40启动子的控制下。编码EGFP和CEP290的质粒包括牛生长激素多聚腺苷酸化信号(bGHpA)，而编码ABCA4的质粒包括猿病毒40(SV40)多聚腺苷酸化信号。
AAV载体生成和表征
AAV载体由TIGEM AAV Vector Core通过HEK293细胞的三重转染产生，如前所述(14，41)。在包括或不包括内蛋白序列的AAV载体之间没有观察到载体产率的差异。
细胞的转染和AAV感染
如已经描述(14)，维持HEK293细胞并且使用磷酸钙方法(6孔板格式，1μg每种质粒/孔)转染。对于图S9中所描述的实验，使用了与1μg AAV内蛋白质粒中所包括的相同分子数相对应的编码全长基因的质粒量。每个孔中转染的DNA总量通过在需要时添加混杂质粒来保持相等。
使用Lipofectamine LTX(Invitrogen)转染用于图2C和2D中实验的HeLa细胞(24孔板格式，1或0.5μg的每种质粒/孔)。如已经描述，进行AAV感染(14)。
iPSC和视网膜分化培养
人诱导多能干细胞(iPSC)源自成纤维细胞，该成纤维细胞是使用(42)中所描述的方法从皮肤生检中培养的。STGD1细胞系携带ABCA4复合杂合变体c.4892T＞C和c.4539+2001G＞A，也如(43)中所描述，或者复合杂合变体c.[2919-？_3328+？del；4462T＞C]和c.5196+1137G＞A。c.[2919-？_3328+？del；4462T＞C]是由两个变异组成的等位基因。C.2919-？3328+？del构成外显子20、21和22的缺失以及内含子19和22的未知片段。此缺失与c.4462T＞C在顺式构造中找到。iPSC维持在经基质胶(#354277，
Figure BDA0003105985640001151
hESC-Qualified Matrix；Corning，NY)包被的6孔板上，所述板含有mTeSRTM培养基(#85850；Stem cell technologies)。使用0.5mM EDTA(#AM9260G；Ambion)使细胞在约80％汇合时传代2-6分钟。视网膜分化是基于先前描述的方案(44，45)的组合。简而言之，将iPSC接种在含有RevitaCell Supplement(#A-2644501；Gibco，ThermoFisher)和1％基质胶的V型底96孔板(9,000个细胞/孔)中以诱导聚集体形成。然后培养聚集体以生成3D视网膜类器官，如(46)中所述。
蛋白质印迹分析和ELISA
将样品(HEK293细胞、视网膜和视网膜类器官)在RIPA缓冲剂中裂解以提取EGFP、ABCA4和CEP290蛋白。裂解缓冲剂补充有蛋白酶抑制剂(完全蛋白酶抑制剂混合物片；罗氏，瑞士巴塞尔)和1mM苯甲基磺酰基。裂解后，ABCA4样品在1X Laemmli样品缓冲剂中在37℃下变性15分钟，该缓冲剂补充有2M尿素。EGFP和CEP290样品在1X Laemmli样品缓冲剂中在99℃下变性5分钟。用12％(对于EGFP样品)或6％(对于ABCA4和CEP290样品)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离裂解液。用于免疫印迹法的抗体如下：抗-3xflag(1：1000，A8592；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)，用于检测EGFP、ABCA4和CEP290蛋白；抗-ABCA4(1：500，LS-C87292；LifeSpan BioSciences，Inc，美国西雅图)，用于检测ABCA4；抗细丝蛋白A(1：1000，#4762；Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹弗斯)；抗α-肌动蛋白(1：1000，NB600-501；Novus Biological LLC，美国科罗拉多州利特尔顿(Littleton))，用于检测细丝蛋白A，β-肌动蛋白，用作体外实验中的加载对照物；抗Dysferlin(1：500，Dysferlin，克隆Ham1/7B6，MONX10795；Tebu-bio，法国勒佩雷伊夫林省(Le Perray-en-Yveline))，用于检测在体内实验中用作加载对照物的Dysferlin。使用ImageJ软件(可从http：//rsbweb.nih.gov/ij/免费下载)对通过蛋白质印迹检测到的EGFP、ABCA4和CEP290条带进行量化。
对于图21中所示的实验，来自注射了AAV内蛋白载体的Abca4-/-小鼠和对照同窝小鼠Abca4+/-小鼠的视网膜裂解物在30μl裂解缓冲剂中裂解，如上所述，并且将25或50μl裂解液分别使用抗ABCA4抗体(LS-C87292；表位保守性：人ABCA4为100％；鼠Abca4为86％)进行蛋白质印迹。然后将视网膜裂解物中ABCA4的量(通过使用ImageJ软件对条带强度进行定量测量)相对于加载在丙烯酰胺凝胶上的视网膜裂解物的体积标准化。对于图9中的实验，如图中报告，每天用增加剂量的甲氧苄啶(T7883，Sigma-Aldrich)处理HEK293细胞。
使用Max Discovery绿色荧光蛋白试剂盒ELISA(Bioo Scientific Corporation，美国得克萨斯奥斯丁)对细胞或小鼠和猪视网膜裂解物进行ELISA。
rAAV载体DNA的Southern印迹分析。
从1.5到6x1010个病毒颗粒(以GC测量)中提取DNA。为了消化未包装的基因组，在总体积300μl中将载体溶液与30μl DNase(Roche)一起在37℃下温育2小时，所述总体积含有50mM Tris，pH 7.5和1mM MgCl2。然后将DNase用50mM EDTA灭活，然后在50℃下与蛋白酶K和2.5％N-月桂基-sarcosil溶液一起温育1小时以裂解衣壳。用酚-氯仿提取DNA两次，并且用2个体积的100％乙醇和10％乙酸钠(3M)和1μl糖原(20μg)沉淀。如前所述进行碱性琼脂糖凝胶电泳(Sambrook，J.，and Russell，D.W.2001.Molecular cloning：a laboratorymanual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor，New York，USA.999pp)。通过用Smal对pF8-V3进行双重消化来产生标志物，以产生5102bp的条带。使用对HLP启动子具有特异性的探针。
活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)
通过眶后撤回将九份血液收集到一份缓冲的柠檬酸三钠0.109M(BD，FranklinLakes，NJ，USA)中。通过将样品以13000rpm离心15分钟来分离血浆。
在Coatron M4(Teco，Bünde，德国)上使用aPTT程序按照制造商手册测量aPTT。
免疫沉淀和液相色谱/质谱分析
将细胞接种在100mm板(1x107个细胞/板)中并且使用磷酸钙方法(20μg每种质粒/板)用AAV-EGFP或ABCA4内蛋白质粒在悬浮液中转染。转染后72小时收获细胞，并且根据制造商说明使用抗flag M2磁珠(M8823；Sigma-Aldrich)对EGFP和ABCA4蛋白进行免疫沉淀。通过在补充有4M尿素的样品缓冲剂中在37℃下温育15分钟，从珠洗脱蛋白质。然后将蛋白质上样在12％(对于EGFP)或6％(对于ABCA4)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上。将用考马斯蓝染色后切割的26条和30条蛋白条带(来自分别用AAV-EGFP和ABCA4内蛋白质粒独立转染2次和3次的HEK293细胞)用于蛋白质测序(Creative proteomics，美国纽约州雪梨市(Shirley))。简而言之，使用3个凝胶载玻片通过以下每种酶进行消化：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Glu-C、Arg-C、Asp-N和Lys-N。另外使用胃蛋白酶消化ABCA4。对所得肽进行鉴定，并且使用纳米级液相色谱联用串联质谱(nano LC-MS/MS)分析定量。使用PEAKS STUDIO 8.5分析获得的质谱数据。本发明人实现了对EGFP和ABCA4蛋白质的100％蛋白质序列覆盖。
动物模型
将动物圈养在TIGEM动物房(那不勒斯)内并且保持在光照/黑暗循环下12小时。C57BL/6J小鼠购自Envigo(意大利)。
通过与BALB/c小鼠(Rpe65 Leu450纯合子)的连续杂交和回交产生白化Abca4-/-小鼠并保持近交。BXD24/TyJ-Cep290rd16/J(称为rd16)小鼠从Jackson Laboratory(JAX原种#000031)引入。rd16小鼠携带897bp的框内缺失，包括外显子35-39(46)。通过将纯合雌性与纯合雄性杂交来维持小鼠。血友病小鼠B6；129S-F8tm1Kaz/J(称为F8tm1)从JacksonLaboratory(JAX原种#004424)引入。F8tm1小鼠具有新霉素抗性盒，替换293bp的序列，包括外显子16的3′末端处的7bp以及内含子16的5′末端处的286bp。通过将纯合雌性与半合子雄性杂交来维持小鼠集落。
本研究中使用的大白母猪(Azienda Agricola Pasotti，Imola，Italy)在意大利国家养猪者协会(Italian National Pig Breeders’Association)的LWHerd手册中注册为纯种，并且圈养在Centro di Biotecnologie A.O.R.N.Antonio Cardarelli(意大利那不勒斯)并且在光照/黑暗循环下保持12小时。
小鼠和猪中视网膜下注射AAV载体
本研究根据视觉和眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明(Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Useof Animals in Ophthalmic and Vision Research)以及意大利卫生部对动物程序的规定进行。对小鼠的所有操作均已于2015年3月6日获得意大利卫生部下公共卫生、动物健康、营养和食品安全部的批准。
小鼠和猪中的视网膜下注射如前所述(例如在14中所述)。向小鼠眼注射1μl或0.5μl(对于rd16幼崽)的载体溶液。如结果部分所述，AAV2/8剂量在不同小鼠实验中有所不同。用100μl AAV2/8载体溶液的2个相邻视网膜下泡向猪眼注射。AAV2/8剂量为2×10^11GC的每种载体/眼，因此两种AAV载体的共注射导致4x10^11GC/眼的总剂量。
组织学、光学和荧光显微术
为评估组织切片中的EGFP表达，如先前描述，将来自C57BL/6J小鼠和大白猪的视网膜类器官、眼进行固定并切片。在共焦LSM-700显微镜(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)下使用适当激发和检测设置分析用Vectashield与DAPI(Vector Lab Inc.，Peterborough，UK)封固的EGFP阳性冷冻切片，并且在40倍放大倍数下采集。由于红-绿色盲的流行，为了避免红色和绿色一起出现，原始图像的颜色已在图14中进行了修改。
为了评估注射AAV CEP290内蛋白载体的rd16小鼠中外核层的厚度，将眼固定在4％多聚甲醛(PFA)中过夜，然后在连续乙醇中脱水，然后嵌入石蜡块中。来自rd16小鼠(10μm)的连续横截面沿水平子午线(horizontal meridian)切割，逐渐分布在载玻片上，并用苏木精和伊红(H＆E)染色。然后，在显微镜(Leica Microsystems GmbH；DM5000)下分析切片并以20倍放大倍数下采集。对于每只眼，使用来自眼中央区域中切片的时间注射侧的一张图像进行分析。由针对基因型/治疗组遮蔽的操作员使用ImageJ软件的“freehand line”工具在每个图像中取ONL厚度的三个测量值。
免疫荧光分析
转染ABCA4或CEP290 AAV内蛋白质粒的HeLa细胞在转染后24小时在4％PFA中固定10分钟。细胞在封闭缓冲剂(PBS中的0.05％皂苷、0.5％BSA、50mM NH4Cl、0.02％NaN3，pH7.2)中封闭30分钟，然后如下温育：
-用抗FLAG M2抗体(F1804，Sigma-Aldrich)持续1小时以检测ABCA4蛋白；用抗VAP-B抗体[Antonella De Matteis实验室生产((47)]染色内质网，用TGN46(AHP-499，Serotech)染色转运高尔基氏体(Trans-Golgi)网络。在PBS中洗涤后，将细胞与二抗一起温育30分钟：山羊抗小鼠Alexa Fluor 568；山羊抗兔Alexa Fluor 488、驴抗羊Alexa Fluor633，分别针对抗FLAG、-VAP-B和-TGN46抗体。
-使用抗FLAG抗体(F7425，Sigma-Aldrich)过夜检测CEP290蛋白，并且使用抗乙酰化微管蛋白抗体(T6793，Sigma-Aldrich)来染色微管。在PBS中洗涤后，将细胞与适当二抗一起温育1小时：山羊抗兔Alexa Fluor 594和驴抗小鼠Alexa Fluor 488，分别针对抗FLAG和-Ac-微管蛋白抗体。
细胞核用DAPI染色。由于红-绿色盲的流行，为了避免红色和绿色一起出现，原始图像的颜色已在图2C-D和图18中进行了修改。
用于人视网膜类器官免疫荧光的抗体如下：
抗人视锥-抑制蛋白(CAR)(50，51)(1：10000，“光源建立者(Luminairefounders)”hCAR；Dr Cheryl M.Craft惠赠，Doheny Eye Institute，Los Angeles，CA，USA)；抗视蛋白，红/绿(1：200，AB5405；Merck Millipore，Darmstadt，Germania)；抗恢复蛋白(1：500，AB5585；Merck Millipore)；抗-CRX(A-9，1：250，sc377138；Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz Biotechnology，Dallas，Texas，USA)；抗视紫质(1D4，1：200，ab5417，Abeam，Cambridge，MA，USA)。
透射和扫描电子显微术分析
对于电子显微术(EM)分析，将AAV视网膜下注射后3个月的Abca4-/-小鼠在黑暗下适应过夜，然后收获眼。在0.1M PHEM缓冲剂pH 6.9中的2％戊二醛(GA)-2％PFA中将眼固定18小时，然后在0.1M PHEM缓冲剂中冲洗。然后在光学显微镜下解剖眼以选择视杯的颞注射区域。随后将这部分视杯嵌入12％明胶中，并注入2.3M蔗糖。将冷冻切片(60nm)在液氮中冷冻并使用Leica Ultramicrotome EM FC7(Leica Microsystems)切割。为避免数据归因于各个实验组的偏倚，由针对基因型/治疗组遮蔽的操作人员使用iTEM软件(Olympus SYS，德国汉堡)对视网膜色素上皮中脂褐素颗粒占据的面积进行了测量。使用iTEM软件的“Freehand polygon”工具在至少20个不同图像(25μm2面积)中测量每个视野中每个脂褐素颗粒的面积。
对于扫描电子显微术(SEM)分析，将视网膜类器官在GA中固定，用OsO4染色，在乙醇中脱水并使用临界点干燥程序干燥。然后将干燥样本封固到SEM样本柱上并且用薄的金层包被。分析样本的表面三维组织化，并且使用JEOL 6700F扫描电子显微镜(JEOL Ltd.，日本东京)来采集图像。
对于超微结构分析，将视网膜类器官用在0.2M PHEM缓冲剂pH 7.3中的2％PFA和1％GA的混合物固定过夜。固定后，如前所述对样本进行后固定。然后将它们脱水，嵌入环氧树脂中并在60℃下聚合72小时。在Leica EM UC7切片机上切割连续60nm薄切片。
使用配备有VELETTA CCD数码相机的FEI Tecnai-12电子显微镜(FEI，荷兰埃因霍温)来采集EM图像。
电生理记录和谱域光学相干断层扫描
如先前描述(14)进行功能和形态学分析。
瞳孔光响应
使用连接到电荷耦合装置NikonDlH数码相机的TRC-50IX视网膜相机(TopconBiomedical Systems，新泽西州奥克兰)，在黑暗条件下记录了来自rd16小鼠的瞳孔光响应。使小鼠暴露于10勒克斯光刺激约10秒，并且使用IMAGEnet软件(Topcon BiomedicalSystems)采集每个眼的一张照片。对于每个眼，将瞳孔直径相对于眼直径(从颞侧到鼻侧)标准化。
统计分析
进行单向ANOVA检验(参数检验)或Kruskal-Wallis秩和检验(非参数检验)以在因变量上确定两组或多组自变量之间是否存在统计学显著差异。P值如下：体外(p Kruskal-Wallis＝0.006036)，小鼠视网膜中(p ANOVA＝0.00585)和猪视网膜中(p Kruskal-Wallis＝0.009005)的EGFP蛋白定量的ELISA测定；图5A(p ANOVA＝0.00585)；图5B(p Kruskal-Wallis＝5.547E-5)；图5C(p ANOVA＝5.81E-10)；ERG分析(在对a-和b-波幅两者进行分析的所有亮度下，p ANOVA或p Kruskal-Wallis＞0.05)；图S14中的OCT分析(ABCA4的p ANOVA＝0.52，CEP290的p ANOVA＝0.965)。通过组均值之间的多重配对比较确定的组之间的统计显著差异如下：体外(单一AAV相对于双重AAV＝0.012；AAV内蛋白相对于双重AAV＝0.012；单一AAV相对于AAV内蛋白＝0.222)，在小鼠视网膜中(单一AAV相对于双重AAV＝0.0044；AAV内蛋白相对于双重AAV＝0.3754；单一AAV相对于AAV内蛋白＝0.0561)以及在猪视网膜中(单一AAV相对于双重AAV＝0.012；AAV内蛋白相对于双重AAV＝0.012；单一AAV相对于AAV内蛋白＝0.841)进行的EGFP蛋白定量的ELISA测定；图5A：+/+相对于-/-AAV内蛋白＝0.4530；+/-相对于-/-＝0.0002；图5B：野生型相对于rd16 AAV内蛋白＝0.00131；图5C：野生型相对于rd16 AAV内蛋白1E-07；野生型相对于rd16 neg＜1E-06。
实施例
实施例1：AAV-EGFP内蛋白在体外重构全长蛋白
本发明人测试了视网膜中内蛋白介导的蛋白质反式剪接的效率；生成两种AAV载体，每种载体分别编码与点状念珠菌[图1A中的Npu]的DnaE分裂型内蛋白的N末端和C末端半部融合的报道物EGFP蛋白的N末端或C末端半部。EGFP蛋白在氨基酸(a.a.)C71处分裂。每种AAV载体包括适当的调控元件(即启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号(bGHpA)和三重flag标签(3xflag)，以允许检测这两个半部以及全长重构EGFP蛋白(图1A)。
使用AAV-EGFP Dna E内蛋白质粒转染人胚胎肾293(HEK293)细胞并且评估单一N末端和C末端半部以及全长EGFP蛋白的产生。在与AAV-EGFP内蛋白质粒，而非与单一N末端和C末端AAV-EGFP内蛋白质粒共转染的细胞中检测到EGFP荧光，与用编码全长EGFP的单一AAV质粒转染的细胞中观察到的荧光相当，如图12所示。仅在两种AAV-EGFP内蛋白质粒的共转染后，通过对HEK293细胞裂解物的蛋白印迹(WB)分析证实预期大小(约28kDa)的反式剪接EGFP蛋白以及从成熟蛋白剪接出来的DnaE内蛋白(约17kDa)的存在，如图1B所示。此外，条带强度的量化表明，来自AAV内蛋白质粒的EGFP蛋白量是从单一AAV质粒观察到的EGFP蛋白量的76±37％(n＝3个独立实验)。为了限定蛋白质重构的准确性，从用AAV-EGFP内蛋白质粒转染的HEK293细胞中免疫纯化EGFP，并且进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析以限定其蛋白质序列。从此样品的蛋白水解消化中获得的3539种肽，其中的7个包括分裂点(表5)，覆盖了整个蛋白质，并证实了AAV内蛋白质粒重构的EGFP的氨基酸序列与野生型EGFP的氨基酸序列精确对应。
表5：包括EGFP分裂点的肽。
C＝半胱氨酸71
Figure BDA0003105985640001221
Figure BDA0003105985640001231
实施例2：AAV-EGFP内蛋白在体外比双重AAV载体更有效
为了确认来自AAV内蛋白载体的EGFP蛋白重构，使HEK293细胞感染AAV2/2-CMV-EGFP DnaE内蛋白或者包括相同表达盒的单一和双重AAV载体。感染复数(m.o.i)5x10^4个基因组拷贝(GC)/细胞的每个载体，这意味着假设双重载体经历完整的DNA或蛋白质重组，3个系统之间的相似剂量。为了精确量化EGFP量，在感染后72小时收获细胞裂解物。通过WB和酶联免疫吸附测定法(ELISA)两者来评估EGFP表达：使用AAV内蛋白载体获得的EGFP表达为使用单一AAV获得的表达的约一半(单一AAV＝0.735±0.2ng EGFP/μg总裂解物，n＝5个独立实验；AAV内蛋白＝0.403±0.04ng EGFP/μg总裂解物，n＝5个独立实验)并且比使用双重AAV载体获得的表达高10倍，如图1C所示(双重AAV＝0.046±0.01ng EGFP/μg总裂解物，n＝5个独立实验)。此外，通过WB量化相对于切除的内蛋白强度的全长EGFP的强度；发现它们的相对丰度为1：0.2(n＝6个独立实验，图13A)。
实施例3：AAV-EGFP内蛋白载体的视网膜下施用导致小鼠和猪视网膜两者中有效的全长蛋白质重构。
为了研究AAV内蛋白介导的反式剪接是否在视网膜中重构全长蛋白表达，对4周龄C57BL/6J小鼠视网膜下注射AAV2/8-CMV-EGFP Dna E内蛋白载体(每种载体的剂量/眼：5.8x10^9GC)。1个月后收获眼并通过显微术分析进行分析。在所有眼的视网膜色素上皮中，最重要的是，在感光器中检测到EGFP荧光(图1D)。为了在感光器中将来自AAV内蛋白的转基因表达与单一和双重AAV的转基因表达进行比较，在4周龄的C57BL/6J小鼠中视网膜下注射在感光器特异性人G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)启动子控制下编码EGFP的AAV2/8载体(每个载体/眼的剂量：5x10^9GC)。注射后的1个月收获眼，并且通过荧光显微术、ELISA或WB进行分析。
在注射了所有载体组的眼中的感光器细胞层中检测到EGFP荧光，如图1E中看到。通过ELISA对EGFP蛋白量的精确定量证实，AAV内蛋白重构的EGFP蛋白的效率低于单一AAV，但比双重AAV的效率高约3倍(单一AAV＝8.41±2.48ng EGFP/视网膜，n＝5个眼；AAV内蛋白＝3.72±0.85ng EGFP/视网膜，n＝7个眼；双重AAV＝1.38±0.43ng EGFP/视网膜，n＝7个眼)。WB条带强度定量后，全长EGFP与切除的内蛋白的相对量为1：3(被分析的n＝14个眼，图13B)。
之后，本发明人评估AAV内蛋白载体在转导猪视网膜中感光器方面的效率，所述猪视网膜由于其大小和结构而成为评估病毒载体转导的极佳临床前模型((48))。因此，向大白猪视网膜下注射单一、内蛋白和双重AAV2/8-GRK1-EGFP载体(每种载体/眼的剂量：2x10^11GC，通过两个相邻的视网膜下泡递送)。注射后的1个月收获眼，并且通过荧光显微术、ELISA或WB进行分析。值得注意的是，如通过EGFP荧光评估，AAV内蛋白介导的EGFP蛋白在感光器细胞层中的重构高于双重AAV介导的重构，并且与单一AAV载体无法区分(图1F)。视网膜裂解物中EGFP的精确定量证实，AAV内蛋白以如下的量将蛋白质重构，所述量类似于利用单一AAV所获得的量，并且比利用双重AAV载体获得的量高约3倍(单一AAV＝247.5±45.1ngEGFP/视网膜，n＝5个眼；AAV内蛋白＝227.0±15.7ng EGFP/视网膜，n＝5个眼；双重AAV＝82.3±9.6ng EGFP/视网膜，n＝5个眼)。WB条带强度定量后，全长EGFP与切除的内蛋白的相对量为1：2(n＝8个眼，图13C)。
实施例4：在3D人视网膜类器官中AAV介导的蛋白质反式剪接重构全长EGFP。
作为代表人视网膜的附加临床前模型，本发明人从人诱导的多能干细胞(iPSC)生成3D视网膜类器官((49，50))。六月龄类器官(图14A)包括由成熟感光器标志物染色的细胞，如图14B所示；通过具有感光器特异性启动子的AAV2载体，即AAV2/2CMV EGFP和AAV2/2IRBP DsRed载体成功转导类器官，如图14C通过荧光分析所示。光(图14D)和电子(图14E-F)显微术显示了感光器外节的芽的存在。与AAV-GRK1-EGFP内蛋白载体(每种载体/类器官的剂量：1×10^12GC)温育30天的9个月龄3D人视网膜类器官显示了EGFP荧光(图1G)。视网膜类器官裂解物的WB分析(图15)在条带强度量化后证实了比切除的内蛋白丰富约5倍的全长EGFP表达(n＝4个类器官)。
实施例5：内蛋白介导的大蛋白质反式剪接(有效AAV内蛋白介导的蛋白质反式剪接需要鉴定最佳ABCA4和CEP90分裂点)
为了测试蛋白质反式剪接是否可以开发成重构大治疗性蛋白质的机制，本发明人开发了AAV-ABCA4和-CEP290内蛋白载体。
ABCA4和CEP290分裂成两个(AAV I、AAV II)或三个(AAV I、AAV II、AAV III)片段，其编码序列分别克隆到单一AAV载体，与分裂型内蛋白N-末端和C-末端的编码序列融合，如图16所示。AAV内蛋白载体包括遍在的短CMV[(shCMV)，对于所有组]或GRK1启动子(对于ABCA4的组1以及对于CEP290的组5)。
选择每个蛋白质的分裂点，这考虑到有效蛋白质反式剪接的接合点处的氨基酸残基要求(18，51)，以及关键蛋白质结构域完整性的保持两者，这应有利于每个独立多肽，以及因此最终重构蛋白质的正确折叠和稳定性。还考虑了另外的分裂型内蛋白。产生蛋白质被分裂成3个多肽的CEP290组(组4和5，图16B)以允许包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件[WPRE，(52)]以增加转基因表达。为了防止AAV I和AAV III之间可以减少产生的全长蛋白质量的不需要的反式剪接，组4和组5在两个分裂接合处包括两种不同的分裂型内蛋白，具体地，来自海洋红嗜热盐菌的DnaB内蛋白以及野生型或突变型DnaE内蛋白，发明人显示它们不交叉反应(图17)。
本发明人比较了每组AAV内蛋白质粒在转染HEK293细胞后重构ABCA4和CEP290的能力。转染后72小时对细胞裂解物进行的WB分析表明，预期大小的全长ABCA4和CEP290蛋白(分别为约250kDa和约290kDa)由每组AAV内蛋白质粒重构，尽管效率不同(图2A-B)。发现了组1和组5对于ABCA4和CEP290蛋白质重构分别是最有效的，因此用于所有后续实验。
为了限定蛋白质重构的准确性，本发明人从用组1转染的HEK293细胞免疫纯化ABCA4并且进行LC-MS分析以限定其蛋白质序列。此样品的蛋白水解得到的3108种肽(其中的22个包括分裂点(表6))覆盖了整个蛋白质，并且证实由AAV内蛋白质粒重构的ABCA4的氨基酸序列与野生型ABCA4的氨基酸序列精确对应。由AAV内蛋白重构的ABCA4的氨基酸序列与野生型ABCA4的氨基酸序列相匹配。进行野生型ABCA4序列与从AAV内蛋白重构的ABCA4的液相色谱-质谱分析中鉴定的肽之间的比对。
表6：包括ABCA4分裂点的肽。
N.B.：C：半胱氨酸1150
Figure BDA0003105985640001261
Figure BDA0003105985640001271
然后，本发明人评估了不同的含有内蛋白的质粒的蛋白质产物的细胞内定位，将其与全长蛋白质的定位进行比较。已知全长ABCA4在培养细胞系中表达时定位于内质网(ER)(53，54)。发现来自组1的两个ABCA4多肽共定位于ER，而在转运高尔基氏体网络处发现无共定位(图2C)。在用这两种AAV内蛋白质粒共转染的细胞中以及在用编码全长ABCA4蛋白的质粒转染的细胞中观察到类似的定位，从而证实在细胞系中外源表达的ABCA4主要定位于ER中。
至于CEP290，据报道全长蛋白质显示混合分布模式，具有主要的点状和次要的纤丝状模式(55)。负责CEP290亚细胞靶向的结构域的剖析表明，N-末端结构域(a.a.1-362)由于其与膜相互作用的能力而将蛋白质靶向至泡状结构，而靠近CEP290的C-末端的区域(涵盖大部分蛋白质的肌球蛋白尾同源域)介导微管结合(a.a.580-2479)，并且当表达为截短形式时，具有突出的纤维状分布，与乙酰化微管蛋白(Ac-Tub)一致。与Drivas等人一致，对用AAV I、II或III内蛋白质粒单独转染或用AAV I+II、AAV I+III和AAV II+III共转染的HeLa细胞进行的免疫荧光分析表明，来自AAV I和AAV II的产物具有主要的点状模式，而来自AAV III(涵盖蛋白质肌球蛋白尾同源域)的产物呈现出纤维状模式，并且是唯一完全共定位到Ac-tub的产物(图2D)。因此，来自AAV I+II的产物具有主要的点状模式，而来自AAVI+III和AAV II+III的产物具有组合的微管纤丝状和点状模式。用三种AAV CEP290内蛋白质粒共转染的细胞显示主要的点状信号，部分沿微管排列，这与在用编码全长CEP290蛋白的质粒转染的细胞中观察到的信号相当(图2D和图18)。
然后，本发明人将用最佳AAV-ABCA4和-CEP290内蛋白质粒组获得的蛋白质量与从编码相应全长蛋白质的单一AAV质粒获得的蛋白质量进行比较。为此，HEK293细胞用相同等摩尔量的单一或AAV内蛋白质粒转染，并在转染后72小时通过WB分析细胞裂解物(图19)。条带强度的量化表明，来自AAV内蛋白质粒的ABCA4和CEP290表达分别为用相应单一AAV质粒观察到的表达的61±4％(n＝3个独立实验)和58±4％(n＝3个独立实验)。
实施例6：AAV内蛋白载体在体外和视网膜中介导大治疗蛋白的表达
发明人在体外和在小鼠和猪视网膜中比较AAV内蛋白介导的大蛋白重构的效率与双重AAV载体的效率。HEK293细胞用编码ABCA4(组1)或CEP290(组5)(m.o.i：5×10^4GC/细胞的每种载体)的AAV2/2双重或内蛋白载体感染，并且在72小时后通过WB来分析细胞裂解物。如图3A和3B所示，AAV-ABCA4和-CEP290内蛋白载体这两者比双重AAV载体更有效地介导大蛋白重构。如预期，除了全长蛋白质外，观察到来源于单一AAV内蛋白载体(在ABCA4和CEP290的情况下)或来源于AAV II和AAV III之间发生的反式剪接(在CEP290的情况下)的更短多肽(图3A和3B)。
此外，与双重载体(每个ABCA4载体/眼的剂量：3.3x10^9GC，每个CEP290载体/眼的剂量为1.1x10^9GC)相比，对4周龄的野生型小鼠视网膜下注射AAV-GRK1-ABCA4或-CEP290内蛋白(分别为组1和组5)。注射后4-7周处死动物，并且通过WB评估视网膜裂解物中的蛋白质表达。在10/11(91％)注射AAV-ABCA4内蛋白的眼(图4A和20)和5/10(50％)注射AAV-CEP290内蛋白的眼(图4B)中检测到全长蛋白质。相反，在分别注射ABCA4和CEP290双重AAV载体的5/9(56％)和0/5眼中，全长蛋白质表达是明显的。与体外观察到的类似，检测到源自单一AAV内蛋白载体(在ABCA4和CEP290两者的情况下)以及源自AAV II和AAV III之间发生的反式剪接(在CEP290的情况下)的多肽(图4A和4B)。
为了研究相对于内源物的由AAV内蛋白介导的蛋白质重构效率，向1-4月龄Abca4-/-小鼠视网膜下注射AAV-GRK1-ABCA4内蛋白载体(组1)(每种ABCA4载体/眼的剂量：5.5x10^9GC)。一个月后，使用识别鼠和人ABCA4的抗体通过WB来分析来自未受影响和注射AAV内蛋白的Abca4-/-小鼠的视网膜裂解物中的ABCA4表达(图21)。发现AAV内蛋白ABCA4表达为内源性ABCA4的8.6±1.3％。
为了确认临床相关猪视网膜中大蛋白的有效重构，向大白猪视网膜下注射AAV2/8-GRK1-ABCA4内蛋白(组1)或双重载体(每个载体/眼的剂量：2x10^11GC，通过两个相邻的视网膜下泡递送)，并且在注射后1个月通过WB对蛋白质表达进行分析。值得注意的是，发现AAV内蛋白比双重AAV载体更有效地重构全长ABCA4蛋白(图4C)。
最后，使来自健康个体或STGD1患者的iPSC的人视网膜类器官在培养121天[当感光器成熟开始时(20)]感染AAV2/2-GRK1-ABCA4内蛋白载体(组1)(每个载体/类器官的剂量：1x10^12GC)。在感染后20至40天之间裂解类器官并且通过WB进行分析。在所有感染的类器官中检测到预期大小的ABCA4(图4D和图22；分别来自正常对照物和STGD1类器官的n＝3和n＝4)。
实施例7：AAV内蛋白载体的视网膜下施用改善STGD1和LCA10小鼠模型的视网膜表型
为了确定用AAV内蛋白载体获得的感光器转导是否具有治疗相关性，在STGD1(Abca4-/-)和LCA10(rd16)小鼠模型的视网膜中对其进行测试。
向1个月龄Abca4-/-小鼠视网膜下注射AAV2/8-GRK1-ABCA4内蛋白载体(组1)(每个载体/眼的剂量：4.3-4.8x10^9GC)。三个月后收获眼，对视网膜超薄切片进行透射电子显微术分析以测量脂褐素的量，所述脂褐素积聚在Abca4-/-小鼠的视网膜色素上皮(RPE)中(56，57)。值得注意的是，RPE脂褐素积累在注射AAV内蛋白载体的Abca4-/-眼中显著减少，但在注射阴性对照物的眼中并未减少(p值＝0.0163；图5A和图23)。
平行地，向4-6天龄rd16小鼠视网膜下注射AAV2/8-GRK1-CEP290内蛋白载体(组5)(每个载体/眼的剂量：5.5x10^8GC)。注射后1个月进行的视网膜切片显微术分析表明，作为进行性视网膜变性的结果(55)，与野生型小鼠相比，rd16小鼠中外核层(ONL)的厚度(包括感光器核)显著降低(p值＝0.00048；图5B)。值得注意的是，注射AAV内蛋白载体的rd16视网膜的ONL厚度显著高于(约60％，p值＝0.00281)注射阴性对照物的rd16视网膜的(图5B)。因此，基于瞳孔光响应(PLR)的视网膜功能测试显示，注射AAV内蛋白载体的rd16小鼠的瞳孔收缩显著高于注射阴性对照物的rd16眼(约20％，p值＝0.00073)(图5C)。
此外，本发明人研究了AAV内蛋白载体在视网膜中的安全性。为此，向野生型C57BL/6J小鼠视网膜下注射AAV2/8-GRK1-ABCA4或-CEP290内蛋白载体(分别为组1和组5)(每个ABCA4载体的剂量：4.3x10^9GC；每个CEP290载体/眼的剂量：1.1x10^9GC)，并且分别在注射后6个月和4.5个月通过Ganzfeld视网膜电图(ERG)测量视网膜电活性。在这两项研究中，注射AAV内蛋白载体的小鼠眼(对于ABCA4和CEP290，分别为n＝14-15和n＝11)和注射阴性对照AAV载体(对于ABCA4和CEP290，分别为n＝8和n＝5)或PBS(对于ABCA4和CEP290，分别为n＝6-7和n＝6)的眼之间的a波幅和b波幅相似。类似地，通过光学相干断层扫描测量的ONL厚度在注射AAV内蛋白、阴性对照物和PBS的眼之间相似(图24)。
实施例8：安全的AAV内蛋白介导的大基因递送
尽管在注射AAV内蛋白的野生型小鼠中没有观察到明显的毒性迹象，但本发明人已经评估在反式剪接系统中包含降解决定子，其一旦嵌入切除的内蛋白中就会导致融合蛋白快速泛素化，随后引发蛋白酶体破坏(图6)。所描述的大多数降解决定子在N-末端或C-末端位置(即CL1、SMN、CIITA、ODC)处有功能，这些降解决定子不能与N-末端或C-末端内蛋白融合，因为会导致单一宿主蛋白降解，因此扣除需要参与蛋白质反式剪接(PTS)反应的多肽。因此，本发明人选择来自大肠杆菌的二氢叶酸还原酶(ecDHFR)的突变形式，其包括仅在N-末端或内部位置处赋予功能活性的三个氨基酸突变，R12Y、Y100I和G67S(69)。
为了测试ecDHFR在减少切除的内蛋白的量方面的效率，本发明人生成AAV载体，此载体编码与Npu DnaE和ecDHFR的N-末端半部融合的EGFP的N-末端半部(pAAV2.1-CMV-5′EGFP内蛋白ecDHFR)。因此，降解决定子将位于其应当无活性的C末端。使用AAV-EGFP-ecDHFR内蛋白质粒与载体II(编码与Npu DnaE的C末端半部融合的EGFP的C末端半部(pAAV2.1-CMV-3′EGFP内蛋白))的组合转染HEK293细胞并且评估全长EGFP蛋白和切除的内蛋白的产生。通过WB分析检测与AAV内蛋白相比具有相似蛋白质水平的反式剪接EGFP蛋白。此外，在共转染AAV-EGFP-ecDHFR内蛋白质粒后，HEK293细胞裂解物中切除的内蛋白的量显著减少(图7)。然后，本发明人决定将相同的策略应用于大ABCA4蛋白(pAAV2.1-CMV260-5′ABCA4内蛋白ecDHFR)。就EGFP而言，本发明人发现与AAV-ABCA4-内蛋白相比，来自AAV-ABCA4-ecDHFR内蛋白质粒的全长ABCA4的相似量(图8A)。重要的是，观察到切除的内蛋白的完全消除(图8B)。
为了证明本发明人在观察ecDHFR介导的DnaE降解，用甲氧苄啶(TMP)处理细胞。TMP是一种抗生素，其可以结合ecDHFR，进而防止蛋白质降解，从而允许融合蛋白逃脱降解(69)。用增加剂量的TMP对用AAV-ABCA4-ecDHFR内蛋白质粒共转染的HEK293细胞进行处理，并且发现DnaE内蛋白不再降解，TMP以剂量依赖性方式稳定ecDHFR，这意味着DnaE内蛋白的减少是由ecDHFR介导的(图9)。
在载体中(在内蛋白外)包含降解决定子的一个限制是AAV的克隆能力进一步降低，从而导致某些应用的AAV载体过大。事实上，ecDHFR的长度是159aa。因此，本发明人设计了较短105aa的ecDHFR变体，其保留据称对其在N-末端或内部位置处的活性至关重要的氨基酸。本发明人在EGFP和ABCA4内蛋白质粒两者(pAAV2.1-CMV-5′EGFP内蛋白_小ecDHFR；pAAV2.1-CMV260-5′ABCA4内蛋白_小cDHFR)中测试了这种小ecDHFR。在共转染AAV-EGFP-或ABCA4-小ecDHFR内蛋白质粒后，他们发现与AAV内蛋白质粒相比相似的全长蛋白表达(图10和11A)和DnaE内蛋白的显著减少(图10和11B)。
这些结果表明，PTS系统中包含ecDHFR或小ecDHFR介导选择性内蛋白降解，而不显著影响蛋白质反式剪接的功效和治疗性蛋白质生产。
实施例9：肝脏中内蛋白介导的蛋白质反式剪接
为了测试肝脏中内蛋白介导的蛋白质反式剪接的效率，生成两个AAV载体，所述AAV载体各自编码与来自点状念珠菌的DnaE分裂型内蛋白的N末端和C末端半部融合的报道物EGFP蛋白的N末端或C末端半部。
向5周龄C57/BL6小鼠眶后注射带有肝脏特异性人甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子的AAV2/8载体(每种载体/kg的剂量：5×1011GC)。注射后4周收获肝脏并裂解，以用抗3xflag抗体通过蛋白质印迹进行分析，以检测EGFP-3xflag和内蛋白-3xflag。EGFP条带强度的量化表明，AAV内蛋白比双重AAV更有效地转导肝脏，蛋白质含量高约6-7倍。
实施例10：AAV内蛋白载体可用于递送血友病A中受影响的大F8基因
在血友病A中发生突变的F8基因太大(约7kb)而无法由单一AAV以其野生型构象递送。由于这点，仅基因的B结构域缺失(BDD)构象适合于AAV基因治疗的背景。最近，已经将含有BDD-F8和短肝特异性启动子和polyA信号的5kb表达盒包装到AAV5中，并且显示出在小鼠和食蟹猴(70)以及HemA患者中产生治疗水平的FVIII(71)。但是，此载体的基因组稍微过大，并且作为异质截短基因组文库包装到AAV衣壳中，其在靶细胞中重构后会引发有效的转导。与正常大小相比，超大AAV载体的效率更低，并且具有异质截短基因组的产物的质量可阻碍其进一步向商业化开发。
为了克服有限的AAV货物能力，设计了一种蛋白质反式剪接策略，其中涉及两个独立的具有规则大小基因组的AAV载体，每个载体编码侧翼有分裂型Npu DnaE内蛋白的大FVIII蛋白质的2个半部之一。
野生型F8基因在B结构域中分裂成2个不同的分裂点，即组1和组2。产生了肝特异性杂合肝脏启动子(HLP)以及短合成polyA下的F8内蛋白载体(图25A)。如Southern印迹所示，载体基因组与其超大AAV BDD-F8对照物不同被适当包装到AAV衣壳中(图25B)。
为了确定该策略的治疗相关性，将AAV2/8F8内蛋白载体通过眶后输注(每种载体/动物的剂量：4-5x1011GC)全身注射到7-8周龄血友病A敲除小鼠中。注射后8周血浆的aPTT(活化部分促凝血酶原激酶时间)分析显示出血表型的轻微校正，尽管不在与超大单一AAVBDD-F8对照物相同的水平(图25C)。
参考文献
1.M.M.Sohocki，et al.Hum.Mutat.17，42-51(2001).
2.T.Dryja，in The Online Metabolic＆Molecular Bases of InheritedDiseases C.Scriver，
A.Beaudet，W.Sly，D.Valle，Eds.(McGraw-Hill，New York，NY，2001)，vol 4，pp.59035933.
3.FDA approves hereditary blindness gene therapy.Nat Biotechnol 36，6(2018).
4.I.Trapani，A.Auricchio，Trends Mol Med，(2018).
5.A.Auricchio，A.J.Smith，R.R.Ali，Hum Gene Ther 28，982-987(2017).
6.I.Trapani et aI.，EMBO Mol Med 6，194-211(2014).
7.R.Allikmets，Nat.Genet.17，122(1997).
8.J.M.Millan，et al.J.Ophthalmol.2011，417217(2011).
9.T.Hasson，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.US A 92，9815-9819(1995).
10.X.Liu，et al.Cell.Motil.Cytoskeleton 37，240-252(1997).
11.D.Gibbs，et al.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.51，1130-1135(2010).
12.D.Duan，Y.Yue，J.F.Engelhardt，Mol Ther 4，383-391(2001).
13.Z.Yan，Y.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 97，6716-6721(2000).
14.A.Maddalena et al.，Mol Ther26，524-541(2018).
15.P.Colella et al.，Gene Ther 21，450-456(2014).
16.O.Novikova，N.Topilina，M.Belfort，J Biol Chem 289，14490-14497(2014).
17.K.V.Mills，M.A.Johnson，F.B.Perler，J Biol Chem 289，14498-14505(2014).
18.N.H.Shah，et al.，J Am Chem Soc 135，5839-5847(2013).
19.Y.Li，Biotechnol Lett 37，2121-2137(2015).
20.N.H.Shah，T.W.Muir，Chem Sci 5，446-461(2014).
21.C.Schmelas，D.Grimm，Biotechnol J 13，e1700432(2018).
22.L.Villiger et al.，Nat Med 24，1519-1525(2018).
23.F.Zhu et al，Sci China Life，2010；
24.F.Zhu et al Sci China Life，2013
25.Li at al.，Hum Gene Ther，2008
26P.Subramanyam et al.，Proc Natl Acad Sci，2013
27.H.Iwai，S.Zuger，J.Jin，P.H.Tam，FEBS Lett 580，1853-1858(2006).
28.J.Zettler，V.Schutz，H.D.Mootz，FEBS Lett 583，909-914(2009).
29.J.Li，W.Sun，B.Wang，X.Xiao，X.Q.Liu，Hum Gene Ther 19，958-964(2008).
30.S.W.Lockless，T.W.Muir，Proc Natl Acad Sci U S A 106，10999-11004(2009).
31.Stevens et al.，J Am Chem Soc.2016Feb.24；138(7)：2162-5
32.S.J.Reich，et al.Hum.Gene.Ther.14，37-44(2003)
33.N.Esumi，et al.J.Biol.Chem.279，19064-19073(2004).
34.Y.Tsybovsky，K.Palczewski，Protein Expr Purif 97，50-60(2014).
35.S.Bungert，L.L.Molday，R.S.Molday，J Biol Chem 276，23539-23546(2001).
36.T.G.Drivas，E.L.Holzbaur，J.Bennett，J Clin Invest 123，4525-4539(2013).
37.G.Gao et al.，Hum Gene Ther 11，2079-2091(2000).
38.L.P.Pellissier et al.，Mol Ther Methods Clin Dev 1，14009(2014).
39.L.P.Pellissier et al.，Mol Ther Methods Clin Dev1，14009(2014).
40.S.C.Khani et al.，Invest Ophthalmol Vis Sci 48，3954-3961(2007).
41.M.Doria，A.Ferrara，A.Auricchio，Hum Gene Ther Methods 24，392-398(2013).
42.R.Sangermano et al.，Ophthalmology 123，1375-1385(2016)
43.R.Sangermano et al.，Ophthalmology 123，1375-1385(2016).
44.T.Nakano et al.，ell Stem Cell 10，771-785(2012).
45.X.Zhong et al.，Nat Commun 5，4047(2014).
46.X.Zhong et al.，Nat Commun 5，4047(2014).
47.M.Jansen et al.，Traffic 12，218-231(2011).
48.C.Mussolino et al.，Gene Ther 18，637-645(2011).
49.T.Nakano et al.，Cell Stem Cell 10，771-785(2012).
50.×.Zhong et al.，Nat Commun 5，4047(2014).
51.M.Cheriyan，S.H.Chan，F.Perler，J Mol Biol426，4018-4029(2014).
52.J.E.Donello，J.E.Loeb，T.J.Hope，J Virol 72，5085-5092(1998).
53.N.Zhang et al.，Hum Mol Genet 24，3220-3237(2015).
54.H.Sun，P.M.Smallwood，J.Nathans，Nat Genet 26，242-246(2000).
55.T.G.Drivas，E.L.Holzbaur，J.Bennett，J Clin lnvest 123，4525-4539(2013)
56.N.L.Mata et al.，Invest Ophthalmol Vis Sci 42，1685-1690(2001).
57.J.Weng et al.，Cell 98，13-23(1999).
58.Smith AJ et al.，Gene Ther.2012Feb；19(2)：154-61.
59.Liu×Q et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.1997Jul 22；94(15)：7851-6
60.Srivastava A，Curr Opin Virol.2016Dec；21：75-80.
61.Auricchio et al.(2001)Hum.Mol.Genet.10(26)：3075-81
62.Dalkara D et al.，Sci Transl Med.2013Jun 12；5(189)：189ra76.
63.Petrs-Silva H et al.，Mol Ther.2011Feb；19(2)：293-301.
64.Klimczak RR et al.，PLoS One.2009Oct 14；4(10)：e7467.
65.Hickey DG et al.，Gene Ther.2017Dec；24(12)：787-800.
66.Perler，F.B.(2002).InBase，the Intein Database.Nucleic Acids Res.30，383-384
67.Mclntosh J(2013).Blood 20Feb 2013，121(17)：3335-3344
68.Levitt N，(1989).Genes Dev.1989Jul；3(7)：1019-25
69.Iwamoto M et al.，Chem Biol.2010September 24；17(9)：981-988.
70.Bunting，S.，et al.，Gene Therapy with BMN 270 Results in TherapeuticLevels of FVIII in Mice and Primates and Normalization of Bleeding inHemophilic Mice.Mol Ther，2018.26(2)：p.496-509.
71.Rangarajan，S.，et al.，AAV5-Factor VIII Gene Transfer in SevereHemophilia A.N Engl J Med，2017.377(26)：p.2519-2530.

Claims (23)

1.一种在细胞中表达编码序列的载体系统，所述编码序列由第一部分(CDS1)、第二部分(CDS2)和任选的第三部分(CDS3)组成，所述载体系统包括：
a)第一载体，所述第一载体包括：
-所述编码序列的所述第一部分(CDS1)，
-编码N-内蛋白的第一内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS1的3’末端；以及
b)第二载体，所述第二载体包括：
-所述编码序列的所述第二部分(CDS2)，
-编码C-内蛋白的第二内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS2的5’末端；
其中当将所述第一载体和第二载体插入细胞中时，通过蛋白质剪接来产生所述编码序列的蛋白质产物；
或者所述载体系统包括：
a’)第一载体，所述第一载体包括：
-所述编码序列的所述第一部分(CDS1)，
-编码第一N-内蛋白的第一内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS1的3’末端；以及
b’)第二载体，所述第二载体包括：
-所述编码序列的所述第二部分(CDS2)，
-编码第一C-内蛋白的第二内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS2的5’末端；
-编码第二N-内蛋白的第三内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS2的3’末端；以及
c’)第三载体，所述第三载体包括：
-所述编码序列的所述第三部分(CDS3)
-编码第二C-内蛋白的第四内蛋白核苷酸序列，所述序列位于CDS3的5’末端，
其中所述第一内蛋白核苷酸序列与所述第三内蛋白核苷酸序列不同，并且所述第二内蛋白序列与所述第四内蛋白核苷酸序列不同，其中当将所述第一载体、所述第二载体、所述第三载体插入细胞中时，通过蛋白质剪接来产生所述编码序列的所述蛋白质产物。
2.根据权利要求1所述的载体系统，其中所述第一内蛋白、所述第二内蛋白、所述第三内蛋白和所述第四内蛋白编码分裂型内蛋白，优选地，所述分裂型内蛋白的最大长度为150个氨基酸，更优选地，所述分裂型内蛋白是DnaE或DnaB内蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的载体系统，其中
-所述第一内蛋白核苷酸序列编码选自由以下项构成的群组中的内蛋白：SEQIDNo1、3、5、7、9、11、13或其变体，或其片段或其同系物；
-所述第二内蛋白核苷酸序列编码选自由以下项构成的群组中的内蛋白：SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其变体，或其片段或其同系物；
-所述第三内蛋白核苷酸序列编码选自由以下项构成的群组中的内蛋白：SEQ ID No1、3、5、7、9、11、13或其变体，或其片段或其同系物；
-所述第四内蛋白核苷酸序列编码选自由以下项构成的群组中的内蛋白：SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其变体，或其片段或其同系物。
4.根据前述权利要求中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述第一载体、所述第二载体和所述第三载体进一步包括启动子序列，所述启动子序列可操作地连接到所述编码序列的所述第一部分(CDS1)或者所述编码序列的所述第二部分(CDS2)或者所述编码序列的所述第三部分(CDS3)的5’末端部分。
5.根据前述权利要求中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述第一载体、所述第二载体和所述第三载体进一步包括5’-末端重复(5’-TR)核苷酸序列和3'-末端重复(3’-TR)核苷酸序列，优选地所述5’-TR是5’-反向末端重复(5’-ITR)核苷酸序列，并且所述3’-TR是3’-反向末端重复(3’-ITR)核苷酸序列。
6.根据前述权利要求中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述第一载体、所述第二载体和所述第三载体进一步包括聚腺苷酸化信号核苷酸序列，并且/或者其中所述第一载体或所述第二载体或所述第三载体中的至少一者进一步包括编码降解信号的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的载体系统，其中所述降解信号选自由CL1、PB29、SMN、CIITA、ODc、ecDHFR或其片段构成的群组中。
8.根据前述权利要求中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述编码序列在如下位置处分裂为所述第一部分、所述第二部分和任选地所述第三部分，所述位置由不落入编码的蛋白质产物的结构域或功能域内的亲核氨基酸组成，其中所述亲核氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸。
9.根据前述权利要求中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述第一载体、所述第二载体和所述第三载体中的至少一者进一步包括可操作地连接到所述编码序列的至少一个增强子或调节核苷酸序列。
10.根据前述权利要求中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述编码序列编码能够纠正病理状态或病症的蛋白质，优选地，所述病症是视网膜变性、代谢病症、血液病症、神经变性性病症、听力丧失、通道病、肺病、肌病、心脏病。
11.根据前述权利要求中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述编码序列编码能够纠正病理状态或病症的蛋白质，优选地，所述病症是视网膜变性，优选地，所述视网膜变性是遗传性的，优选地，所述病理或疾病选自由以下项构成的群组：色素性视网膜炎(RP)、利伯先天性黑矇(LCA)、斯塔加特病(Stargardt disease,STGD)、乌谢尔综合征(USH)、阿耳斯特雷姆综合征(Alstrom syndrome)、先天性静止性夜盲症(CSNB)、黄斑营养不良、隐性黄斑营养不良、由ABCA4基因中的突变引起的疾病。
12.根据权利要求1到10中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述编码序列编码能够纠正迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)、囊性纤维化、血友病A、威尔逊病、苯丙酮尿症、dysferlin病变(dysferlinopathies)、雷特综合征(Rett’s syndrome)、多囊肾病、C型尼曼-匹克氏症(Niemann-Pick type C)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)的蛋白质。
13.根据权利要求1到11中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述编码序列是选自由以下项构成的群组的基因的编码序列：ABCA4、MYO7A、CEP290、CDH23、EYS、PCDH15、CACNA1、SNRNP200、RP1、PRPF8、RP1L1、ALMS1、USH2A、GPR98、HMCN1。
14.根据权利要求1到12中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述编码序列是选自由以下项构成的群组的基因的编码序列：DMD、CFTR、F8、ATP7B、PAH、DYSF、MECP2、PKD、NPC1HTT。
15.根据前述权利要求中的任一权利要求所述的载体系统，包括：
a)第一载体，所述第一载体在5’-3’方向上包括：
-5’-反向末端重复(5’-ITR)序列；
-启动子序列；
-编码序列的5’末端部分(CDS1)，所述5’末端部分可操作地连接到所述启动子并且处于所述启动子的控制下；
-编码N-内蛋白的第一内蛋白核苷酸序列；以及
-3’-反向末端重复(3’-ITR)序列；以及
b)第二载体，所述第二载体在5’-3’方向上包括：
-5’-反向末端重复(5’-ITR)序列；
-启动子序列；
-编码C-内蛋白的第二内蛋白核苷酸序列；
-所述编码序列的3’末端部分(CDS2)；以及
-3’-反向末端重复(3’-ITR)序列；
或者包括：
a’)第一载体，所述第一载体在5’-3’方向上包括：
-5’-反向末端重复(5’-ITR)序列；
-启动子序列；
-编码序列(CDS1’)的5’末端部分，所述5’末端部分可操作地连接到所述启动子并且处于所述启动子的控制下；
-编码第一N-内蛋白的第一内蛋白核苷酸序列；以及
-3’-反向末端重复(3’-ITR)序列；以及
b’)第二载体，所述第二载体在5’-3’方向上包括：
-5’-反向末端重复(5’-ITR)序列；
-启动子序列；
-编码第一C-内蛋白的第二内蛋白核苷酸序列；
-所述编码序列的第二部分(CDS2’)；以及
-编码第二N-内蛋白的第三内蛋白核苷酸序列；
-3’-反向末端重复(3’-ITR)序列；以及
c’)第三载体，所述第三载体在5’-3’方向上包括：
-5’-反向末端重复(5’-ITR)序列；
-启动子序列；
-编码第二C-内蛋白的第四内蛋白核苷酸序列；
-所述编码序列的第三部分(CDS3’)；以及
-3’-反向末端重复(3’-ITR)序列。
16.根据前述权利要求中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述编码序列编码ABCA4基因，优选地，所述编码序列在对应于所述ABCA4蛋白的aa Cys1150、Ser1168、Ser1090的核苷酸处分裂，并且分裂型内蛋白在所述分裂点处插入，或者所述编码序列编码CEP290基因，优选地，所述编码序列在对应于所述CEP290蛋白的aa Cys1076；Ser1275的核苷酸处分裂，优选地，编码所述CEP290基因的所述编码序列在对应于所述CEP290蛋白的aaCys 929和1474；Ser 453和Cys 1474的核苷酸序列处分裂.并且两个分裂型内蛋白在所述分裂点处插入。
17.根据前述权利要求中的任一权利要求所述的载体系统，其中所述第一载体、所述第二载体和所述第三载体独立地是病毒载体，优选地腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体，优选地，所述第一、所述第二和所述第三腺相关病毒(AAV)载体选自相同或不同的AAV血清型，优选地所述血清型选自血清型2、血清型8、血清型5、血清型7或血清型9、血清型7m8、血清型sh10；血清型2(quad Y-F)。
18.一种宿主细胞，所述宿主细胞用根据前述权利要求中的任一权利要求所述的载体系统转化。
19.根据权利要求1到17中的任一权利要求所述的载体系统或根据权利要求18所述的宿主细胞，用于医疗应用。
20.根据权利要求1到19中的任一权利要求所述的载体系统或根据权利要求18所述的宿主细胞，用于基因疗法中，优选地用于治疗和/或预防以视网膜变性、代谢病症、血液病症、神经变性性疾病、听力丧失、通道病、肺病、肌病、心脏病为特征的病理或疾病。
21.根据权利要求20使用的载体系统或宿主细胞，其中所述视网膜变性是遗传性的，优选地，所述病理或疾病选自由以下项构成的群组：色素性视网膜炎(RP)、利伯先天性黑矇(LCA)、斯塔加特病(STGD)、乌谢尔综合征(USH)、阿耳斯特雷姆综合征、先天性静止性夜盲症(CSNB)、黄斑营养不良、隐性黄斑营养不良、由ABCA4基因中的突变引起的疾病。
22.根据权利要求20使用的载体系统或宿主细胞，其用于预防和/或治疗迪谢内肌营养不良、囊性纤维化、血友病A、威尔逊病、苯丙酮尿症、dysferlin病变、雷特综合征、多囊肾病、C型尼曼-匹克氏症、亨廷顿氏病。
23.一种药物组合物，包括根据权利要求1到17中的任一权利要求所述的载体系统或根据权利要求18所述的宿主细胞以及药学上可接受的载体。
CN201980081288.0A 2018-10-15 2019-10-15 内蛋白及其用途 Pending CN113348249A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18200490.3 2018-10-15
EP18200490 2018-10-15
EP19169116 2019-04-12
EP19169116.1 2019-04-12
PCT/EP2019/078020 WO2020079034A2 (en) 2018-10-15 2019-10-15 Intein proteins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113348249A true CN113348249A (zh) 2021-09-03

Family

ID=68234008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980081288.0A Pending CN113348249A (zh) 2018-10-15 2019-10-15 内蛋白及其用途

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210371878A1 (zh)
EP (1) EP3867387A2 (zh)
JP (1) JP2022512718A (zh)
KR (1) KR20210104661A (zh)
CN (1) CN113348249A (zh)
AU (1) AU2019360372A1 (zh)
BR (1) BR112021007221A2 (zh)
CA (1) CA3116606A1 (zh)
IL (1) IL282362A (zh)
MX (1) MX2021004391A (zh)
SG (1) SG11202103886XA (zh)
WO (1) WO2020079034A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114854694A (zh) * 2022-04-29 2022-08-05 四川轻化工大学 一种高通量筛选新冠药物的荧光素酶互补体系及其构建方法与应用
WO2023070527A1 (zh) * 2021-10-29 2023-05-04 上海鑫湾生物科技有限公司 一种条件控制的可剪接嵌合抗原受体分子及其应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023512824A (ja) * 2020-02-07 2023-03-29 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 大型遺伝子ベクターならびにその送達および使用の方法
WO2021209574A1 (en) 2020-04-15 2021-10-21 Fondazione Telethon Constructs comprising inteins
WO2022056440A1 (en) * 2020-09-14 2022-03-17 President And Fellows Of Harvard College Dual-aav vector delivery of pcdh15 and uses thereof
EP4373949A2 (en) * 2021-07-23 2024-05-29 University of Washington Generation of large proteins by co-delivery of multiple vectors
WO2024097763A1 (en) * 2022-11-01 2024-05-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Intein-based sorting system and modular chimeric polypeptides
CN116925239A (zh) * 2023-07-17 2023-10-24 苏州星奥拓维生物技术有限公司 双载体系统表达Otof基因的组合物和方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013045632A1 (en) * 2011-09-28 2013-04-04 Era Biotech, S.A. Split inteins and uses thereof
CN105408352A (zh) * 2013-04-18 2016-03-16 泰莱托恩基金会 通过双重aav载体有效递送大基因
WO2016139321A1 (en) * 2015-03-03 2016-09-09 Fondazione Telethon Multiple vector system and uses thereof
WO2017132580A2 (en) * 2016-01-29 2017-08-03 The Trustees Of Princeton University Split inteins with exceptional splicing activity
CN107075491A (zh) * 2014-10-28 2017-08-18 谷万达公司 用于稳定反式剪接的内含肽修饰的蛋白酶的方法和组合物

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3919208A (en) 1973-10-09 1975-11-11 Yeda Res & Dev 7-(Cyanomethylaryl)acetamide-cephalosporin derivatives
US5166331A (en) 1983-10-10 1992-11-24 Fidia, S.P.A. Hyaluronics acid fractions, methods for the preparation thereof, and pharmaceutical compositions containing same
US6544786B1 (en) 1999-10-15 2003-04-08 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth Of Higher Education Method and vector for producing and transferring trans-spliced peptides
US8394604B2 (en) 2008-04-30 2013-03-12 Paul Xiang-Qin Liu Protein splicing using short terminal split inteins
US20100098772A1 (en) 2008-10-21 2010-04-22 Allergan, Inc. Drug delivery systems and methods for treating neovascularization
US9200045B2 (en) 2011-03-11 2015-12-01 President And Fellows Of Harvard College Small molecule-dependent inteins and uses thereof
KR102166277B1 (ko) 2013-04-12 2020-10-15 삼성전자주식회사 무선 통신 네트워크를 이용한 운전 지원 방법 및 장치와 그 시스템
NL2013235B1 (en) 2014-07-22 2016-08-16 Douwe Egberts Bv Pad for use in a machine for preparing at least one part of a single beverage serving, system including a machine and method for preparing at least one part of a single beverage serving with such a system.
CA2968112A1 (en) 2016-05-26 2017-11-26 Op-Hygiene Ip Gmbh Dispenser servicing in a multiple washroom facility
EP3472328A1 (en) * 2016-06-15 2019-04-24 Oxford University Innovation Limited Dual overlapping adeno-associated viral vector system for expressing abc4a
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013045632A1 (en) * 2011-09-28 2013-04-04 Era Biotech, S.A. Split inteins and uses thereof
CN105408352A (zh) * 2013-04-18 2016-03-16 泰莱托恩基金会 通过双重aav载体有效递送大基因
CN107075491A (zh) * 2014-10-28 2017-08-18 谷万达公司 用于稳定反式剪接的内含肽修饰的蛋白酶的方法和组合物
WO2016139321A1 (en) * 2015-03-03 2016-09-09 Fondazione Telethon Multiple vector system and uses thereof
WO2017132580A2 (en) * 2016-01-29 2017-08-03 The Trustees Of Princeton University Split inteins with exceptional splicing activity

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI ET AL.: "Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy", 《HUMAN GENE THERAPY》, vol. 19, no. 9, pages 958 - 964, XP055474496, DOI: 10.1089/hum.2008.009 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023070527A1 (zh) * 2021-10-29 2023-05-04 上海鑫湾生物科技有限公司 一种条件控制的可剪接嵌合抗原受体分子及其应用
CN114854694A (zh) * 2022-04-29 2022-08-05 四川轻化工大学 一种高通量筛选新冠药物的荧光素酶互补体系及其构建方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210104661A (ko) 2021-08-25
WO2020079034A3 (en) 2020-06-18
AU2019360372A1 (en) 2021-06-03
CA3116606A1 (en) 2020-04-23
IL282362A (en) 2021-06-30
US20210371878A1 (en) 2021-12-02
JP2022512718A (ja) 2022-02-07
SG11202103886XA (en) 2021-05-28
WO2020079034A2 (en) 2020-04-23
BR112021007221A2 (pt) 2021-08-10
EP3867387A2 (en) 2021-08-25
MX2021004391A (es) 2021-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113348249A (zh) 内蛋白及其用途
Dyka et al. Dual adeno-associated virus vectors result in efficient in vitro and in vivo expression of an oversized gene, MYO7A
KR102599909B1 (ko) 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법
EP2986635B1 (en) Effective delivery of large genes by dual aav vectors
US20200270635A1 (en) Modulatory polynucleotides
JP2020533959A (ja) Ａａｖを送達するための組成物および方法
JP7182873B2 (ja) 多重ベクターシステム及びその使用
JP2020518258A (ja) 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
AU2018261003A1 (en) Compositions and methods of treating Huntington&#39;s Disease
RU2723101C2 (ru) Вектор, способ лечения хороидермии, способ селективной экспрессии полинуклеотида
Akil Dual and triple AAV delivery of large therapeutic gene sequences into the inner ear
US20200392536A1 (en) Compositions and Methods for Treating Retinal Disorders
CA3080467A1 (en) Composition comprising raav containing soluble vegfr-1 variant cdna for treatment of macular degeneration
JP2022524434A (ja) Ｆｖｉｉｉ治療薬を発現するための非ウイルス性ｄｎａベクターおよびその使用
WO2023036966A1 (en) Dual recombinant aav8 vector system encoding isoform 5 of otoferlin and uses thereof
US20240067989A1 (en) Compositions and Methods for Treating Retinal Disorders
JP7287611B2 (ja) 改良型アデノ随伴ウイルスベクター
US20210290727A1 (en) MODULATION OF mTORCI ACTIVITY AND AUTOPHAGY VIA CIB2-RHEB INTERACTION
Tornabene LARGE GENE DELIVERY TO THE RETINA BY MULTIPLE AAV VECTORS
WO2024064608A2 (en) Best1 vectors and uses thereof
WO2024011203A2 (en) Ocular vectors and uses thereof
WO2023196938A2 (en) Compositions and methods for treating sensorineural hearing loss, vestibular dysfunction and vision loss using protocadherin 15 dual vector systems
WO2024068898A1 (en) Therapy by trans-splicing of opa1 pre-messenger rnas for the treatment of diseases associated with opa1 gene mutations
EP4262882A1 (en) Gene therapy for treating usher syndrome
EA046019B1 (ru) Композиции и способы лечения нарушений сетчатки

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination