ES2704677T3 - Suministro eficaz de genes grandes por vectores de AAV duales - Google Patents

Abstract

Un sistema de construcción dual para expresar la secuencia codificadora de un gen de interés en una célula hospedante, y dicha secuencia codificadora consiste en una porción del extremo 5' y una porción del extremo 3', y dicho sistema de construcción dual comprende: a) un primer plásmido que comprende, en la dirección 5'-3': - una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR) de AAV; - una secuencia de promotor; - la porción del extremo 5' de dicha secuencia codificadora, y dicha porción del extremo 5' está unida operablemente a dicho promotor y está bajo su control; - una secuencia de ácido nucleico de una señal donante de ruptura; y - una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR) de AAV; y b) un segundo plásmido que comprende, en la dirección 5'-3': - una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR) de AAV; - una secuencia de ácido nucleico de una señal aceptora de ruptura; - el extremo 3' de dicha secuencia codificadora; - una secuencia de ácido nucleico de señal de poliadenilación; y - una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR) de AAV, en el que dicho primer plásmido comprende además una secuencia de ácido nucleico de una región recombinogénica en la posición 5' del 3'-ITR de AAV de dicho primer plásmido y en la posición 3' de la secuencia de ácido nucleico de la señal donante de ruptura, y en el que dicho segundo plásmido comprende además la secuencia de ácido nucleico de la región recombinogénica en la posición 3' del 5'-ITR de AAV de dicho segundo plásmido y en la posición 5' de la secuencia de ácido nucleico de la señal aceptora de ruptura, en el que la región recombinogénica es una región recombinogénica del fago F1 que consiste en la secuencia: GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAA T (SEQ ID NO:3), o uno de sus fragmentos que mantiene la propiedad recombinogénica de SEQ ID NO:3, en el que, tras la introducción de dicho primer plásmido y dicho segundo plásmido en la célula hospedante, dicha secuencia codificadora se reconstituye por medio de las señales donante de ruptura y aceptora de ruptura.

Description

DESCRIPCIÓN

Suministro eficaz de genes grandes por vectores de AAV duales

Campo técnico

La presente invención se refiere a construcciones, vectores, células hospedantes relacionadas y composiciones farmacéuticas que permiten conseguir una terapia génica eficaz, en particular de genes mayores que 5Kb.

Antecedentes de la invención

La degeneraciones retinianas heredadas ("inherited retinal degeneration", IRD), con una prevalencia global total de 1/2.000 (1), son una importante causa de ceguera en todo el mundo. Entre las IRD más frecuentes y graves se encuentran la retinitis pigmentosa (RP), la amaurosis congénita de Leber ("Leber congenital amaurosis", LCA), y la enfermedad de Stargardt ("Stargardt disease", STGD), que casi siempre se heredan como trastornos monogénicos. La mayoría de las mutaciones que provocan IRD se producen en genes expresados en fotorreceptores ("photoreceptors", PR) neuronales, bastones y/o conos en la retina (2). En la actualidad no existe ninguna terapia disponible para estas enfermedades que producen ceguera.

La terapia génica es muy prometedora para el tratamiento las IRD. Entre los vectores de transferencia de genes disponibles, los más eficaces son los virus adenoasociados ("adeno-associated virus", AAV) pequeños para dirigirse a los PR y al epitelio pigmentario retiniano ("retinal pigment epithelium", RPE) (3-4) para el tratamiento a largo plazo tras una única administración subretiniana (3-4). En fechas recientes, los inventores y otros han demostrado que la administración subretiniana de AAV es bien tolerada y es eficaz para mejorar la visión en pacientes afectados por LCA de tipo 2, que es provocada por mutaciones en RPE65, un gen expresado en el RPE (5-9). Estos resultados son prometedores con respecto al tratamiento de otras formas de LCA y de IRD en general. La disponibilidad de vectores de serotipos de AAV, tales como AAV2/8, que se dirige con eficacia a los PR (10-14) y al RPE, apoya aún más esta estrategia. Sin embargo, una limitación importante del AAV es su capacidad de carga, que se cree que se limita a aproximadamente 5 kb, el tamaño del genoma vírico parental (15-19). Esto limita la aplicación de las estrategias de terapia génica con AAV para IRD habituales que están provocadas por mutaciones en genes cuya secuencia codificadora ("coding sequence", CDS) es mayor que 5 kb (denominados en la presente genes grandes). Estos incluyen:

La enfermedad de Stargardt (STGD; MIM#248200) es la forma más habitual de degeneración macular heredada provocada por mutaciones en el gen ABCA4 (CDS: 6822 pb), que codifica el transportador retiniano todo-trans localizado en el segmento externo del PR (20); el síndrome de Usher de tipo 1B (USH1B; MIM#276900) es la forma más grave de RP y sordera, y es provocado por mutaciones en el gen MYO7A (CDS: 6648 pb) (21) que codiFida el MYO7A no convencional, un motor basado en actina expresado en PR y RPE dentro de la retina (22-24).

La distrofia de conos-bastones de tipo 3, el fundus flavimaculatus, la degeneración macular relacionada con la edad de tipo 2, la distrofia retiniana grave de aparición temprana, y la retinitis pigmentosa de tipo 19 también están asociados con mutaciones en ABCA4 (enfermedades asociadas a ABCA4).

Se han investigados diversas estrategias para solucionar la limitación de la capacidad de carga del AAV. Varios grupos, incluyendo el de los inventores, han intentado "obligar a entrar" a genes grandes dentro de una de las muchas cápsidas de AAV disponibles desarrollando los denominados vectores sobredimensionados (25-27). Aunque la administración de vectores de AAV sobredimensionados logra niveles terapéuticamente importantes de expresión de transgenes en modelos de roedores y caninos de enfermedades humanas heredadas (27-30), que incluyen la retina de los modelos de ratón Abca4-/- y shaker 1 (sh1) de STGD y USH1B (27, 30), el mecanismo que subyace a la transducción mediada por AAV sobredimensionados sigue sin estar claro. Por contraste con lo que han propuesto originariamente los inventores y otros (25-27), los vectores de AAV sobredimensionados no contienen una población pura de genom as de gran tamaño intactos, sino una mezcla heterogénea de genom as en su mayoría truncados con una longitud de <5 kb (15-18). Tras la infección, se ha propuesto que el reensamblaje de estos genom as truncados en el núcleo de la célula diana sea un mecanismo para la transducción de vectores de AAV sobredimensionados (15-17, 31). Independientemente del mecanismo de transducción y de la eficacia in vivo, la heterogeneidad de los tamaños de los genom as de AAV sobredimensionados es una limitación importante para su aplicación en terapia génica humana.

Como alternativa, se ha aprovechado la capacidad inherente de los genom as de AAV para sufrir una concatemerización intermolecular (32) para transferir genes grandes in vivo dividiendo un módulo de expresión de un gen grande en dos mitades (con un tamaño <5 kb), cada una contenida en dos vectores de AAV distintos (duales) (33-35). En la estrategia de transruptura de AAV duales, se coloca una señal donante de ruptura ("splice donor", SD) en el extremo 3' de la mitad 5' del vector, y se coloca una señal aceptora de ruptura ("splice acceptor", SA) en el extremo 5' de la mitad 3' del vector. Tras la coinfección de la misma célula por los vectores de AAV duales y la concatemerización de cabeza a cola mediada por una repetición terminal invertida ("inverted terminal repeat", ITR) de las dos mitades, la transruptura provoca la producción de un ARNm maduro y la proteína de tamaño completo (33). La transruptura se ha empleado con éxito para expresar genes grandes en el músculo y la retina (36-37).

En particular, Reich et al. (37) han empleado la estrategia de transruptura con cápsidas de AAV2 y AAV5 y han demostrado que ambos vectores transducen el epitelio pigmentario de la retina y los fotorreceptores empleando el gen LacZ como gen indicador. Esta estrategia no ha sido empleada utilizando un gen terapéutico y/o grande.

Como alternativa, las dos mitades del módulo de expresión de un transgén grande contenidas en vectores de AAV duales pueden contener secuencias solapantes homólogas (en el extremo 3' de la mitad 5' del vector y en el extremo 5' de la mitad 3' del vector, solapamiento de AAV duales), que mediarán en la reconstitución de un único genoma grande mediante recombinación homóloga (34). Esta estrategia depende de las propiedades recombinogénicas de las secuencias solapantes del transgén (38). Una tercera estrategia de AAV duales (híbridos) se basa en añadir una región altamente recombinogénica procedente de un gen exógeno [concretamente, fosfatasa alcalina ("alkaline phosphatase", AP (35, 39)] al vector de transruptura. La región añadida se coloca cadena abajo de la señal SD en la mitad 5' del vector y cadena arriba de la señal Sa en la mitad 3' del vector para aumentar la recombinación entre los AAV duales. El documento US2010/003218 se dirige a un sistema de vector dual híbrido basado en AP. El documento demuestra la eficacia de transducción del vector dual híbrido basado en AP que expresa minidistrofina, pero no ofrece datos con respecto a la eficacia.

Lopes et al. (30) han estudiado una terapia génica retiniana con un ADNc grande de MYO7A empleando virus adenoasociados y han descubierto que la terapia de MYO7A con vectores individuales de AAV2 o a AV5 es eficaz hasta cierto punto, mientras que la estrategia de AAV2 dual demostró ser menos eficaz. Por tanto, siguen siendo necesarias construcciones y vectores que puedan emplearse para reconstituir la expresión de genes grandes para lograr una terapia génica eficaz.

Declaración de financiación

Esta invención se realizó con el apoyo de Italian Telethon Foundation (beca TGM11MT1 y fondos europeos). Italian Telethon Foundation tiene derechos en esta invención.

Los estudios sobre las estrategias de transruptura de AAV duales y de AP híbrida de AAV dual se realizaron con el apoyo del gobierno de EE. UU. con el n.° de contrato R24RY019861 otorgado por the National Eye Institute. El gobierno de EE. UU. tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Sumario de la invención

La terapia génica retiniana con vectores víricos adenoasociados (AAV) es segura y eficaz en seres humanos. Sin embargo, la capacidad de carga de AAV limitada a 5 kb impide que pueda aplicarse a terapias para enfermedades retinianas heredadas, tales como la enfermedad de Stargardt (STGD) o el síndrome de Usher de tipo 1B (USH1B), que son debidas a mutaciones de genes mayores que 5 kb. Puede que no sea fácil trasladar los métodos previos para la transferencia de genes grandes ensayados en la retina y basados en la encapsulación "forzada" de genes grandes en cápsidas de AAV (AAV sobredimensionados) al escenario clínico debido a la heterogeneidad del tamaño de los genom as del vector, lo cual representa un problema de seguridad.

Aprovechando la capacidad de AAV de sufrir una concatemerización intermolecular, los inventores han generado vectores de AAV duales que reconstituyen un gen grande mediante ruptura (transruptura), recombinación homóloga (solapamiento), o una combinación de los dos (híbridos).

Para determinar cuál es la estrategia basada en AAV que transduce con más eficacia genes grandes en la retina, los inventores compararon varias estrategias basadas en AAV entre sí en células HEK293 y en retina de ratón y de cerdo in vivo empleando EGFP, ABCA4 o MYO7A.

Los inventores han descubierto que los vectores de AAV de transruptura dual e híbridos, pero no los vectores de AAV solapantes, transducen con eficacia los fotorreceptores de ratón y cerdo, la principal diana celular para el tratamiento de las degeneraciones retinianas heredadas. Los niveles de transducción retiniana logrados por los AAV duales de transruptura dual o híbridos provocaron una mejora significativa del fenotipo de los modelos de ratón Abca4-/- y sh1 de STGD y USH1B. Los vectores de transruptura de AAV duales o híbridos son una estrategia atractiva para la terapia génica de enfermedades retinianas que requieren el suministro de genes grandes.

Por tanto, una realización de la presente invención es un sistema de construcción dual para expresar la secuencia codificadora de un gen de interés en una célula hospedante, y dicha secuencia codificadora consiste en una porción del extremo 5' y una porción del extremo 3', y dicho sistema de construcción dual comprende:

a) un primer plásmido que comprende, en la dirección 5'-3':

^o una secuencia de repetición terminal invertida 5' ("5'-inverted terminal repeat", 5'-ITR) de AAV;

^o una secuencia de promotor;

^o la porción del extremo 5' de dicha secuencia codificadora, y dicha porción del extremo 5' está unida operablemente a dicho promotor y está bajo su control;

^o una secuencia de ácido nucleico de una señal donante de ruptura; y

^o una secuencia de repetición terminal invertida 3' ("3'-inverted terminal repeat", 3'-ITR) de AAV; y

b) un segundo plásmido que comprende, en la dirección 5'-3':

^o una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR) de AAV;

^o una secuencia de ácido nucleico de una señal aceptora de ruptura;

^o el extremo 3' de dicha secuencia codificadora;

^o una secuencia de ácido nucleico de señal de poliadenilación; y

^o una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR) de AAV,

en el que dicho primer plásmido comprende además una secuencia de ácido nucleico de una región recombinogénica en la posición 5' del 3'-ITR de AAV de dicho primer plásmido y en la posición 3' de la secuencia de ácido nucleico de la señal donante de ruptura, y en el que dicho segundo plásmido comprende además la secuencia de ácido nucleico de la región recombinogénica en la posición 3' del 5'-ITR de AAV de dicho segundo plásmido y en la posición 5' de la secuencia de ácido nucleico de la señal aceptora de ruptura, en el que la región recombinogénica es una región recombinogénica del fago F1 que consiste en la secuencia:

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAA

T (SEQ ID NO:3), o uno de sus fragmentos, que mantiene la propiedad recombinogénica de SEQ ID NO:3 y en el que, tras la introducción de dicho primer plásmido y dicho segundo plásmido en la célula hospedante, dicha secuencia codificadora se reconstituye por medio de las señales donante de ruptura y aceptora de ruptura.

El sistema de construcción dual de la presente invención se aprovecha de modo ventajoso para reconstituir la expresión de genes grandes. Cuando se reconstituye la secuencia codificadora, puede producirse la expresión del gen.

La región recombinogénica también puede ser un fragmento de SEQ ID NO:3, y dicho fragmento mantiene las propiedades recombinogénicas de la secuencia de longitud completa. Preferiblemente, el fragmento presenta has 70 %, 75 %, 80%, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO:3.

También preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de la ITR se deriva del mismo serotipo de AAV o de serotipos diferentes.

Preferiblemente, la 3'-ITR del primer plásmido y la 5'-ITR del segundo plásmido provienen del mismo serotipo de AAV.

También más preferiblemente, la 5'-ITR y la 3'-ITR del primer plásmido y la 5'-ITR y la 3'-ITR del segundo plásmido, respectivamente, provienen de diferentes serotipos de AAV.

Preferiblemente, la 5'-ITR del primer plásmido y la 3'-ITR del segundo plásmido provienen de diferentes serotipos de AAV.

También preferiblemente, la secuencia codificadora se divide en la porción del extremo 5' y la porción del extremo 3' en una unión de exón-exón natural.

En una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico de la señal donante de ruptura consiste en la secuencia:

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACA GAGAAGACTCTTGCGTTTCT (SEQ ID No. 1).

En una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico de la señal aceptora de ruptura consiste en la secuencia:

GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (SEQ ID NO:2).

La señal aceptora de ruptura y la señal donante de ruptura también pueden ser elegidas por los expertos en la técnica entre las secuencias conocidas en la técnica.

A menudo se encuentran intrones espliceosómicos dentro de la secuencia de genes que codifican proteínas de eucariotas. Dentro del intrón son necesarios un sitio donante (extremo 5' del intrón), un sitio de ramificación (cerca del extremo 3' del intrón) y un sitio aceptor (extremo 3' del intrón) para la ruptura. El sitio donante de ruptura incluye una secuencia casi invariable GU en el extremo 5' del intrón, dentro de una región más grande y menos altamente conservada. El sitio aceptor de ruptura en el extremo 3' del intrón termina el intrón con una secuencia AG casi invariable. Cadena arriba (dirección 5') de AG existe una región rica en pirimidinas (C y U), o tramo de polipirimidina. Cadena arriba del tramo de polipirimidina está el punto de ramificación, que incluyen un nucleótido de adenina. En una realización preferida, el primer plásmido comprende adem ás al menos una secuencia potenciadora, unida operablemente a la secuencia codificadora. Los expertos en la técnica pueden seleccionar cualquier secuencia potenciadora adecuada.

Preferiblemente, la secuencia codificadora es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína capaz de corregir una enfermedad genética, en particular una degeneración retiniana heredada.

Aún más preferiblemente, la secuencia codificadora se selecciona del grupo que consiste en: ABCA4, MYO7A, CEP290, CDH23, EYS, USH2a, GPR98 o ALMS1.

Otra realización de la invención e s un sistema de vector vírico de virus adenoasociado (AAV) dual, que comprende: a) un primer vector vírico de AAV que contiene el primer plásmido que comprende, en la dirección 5'-3': una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR), una secuencia de promotor, la porción del extremo 5' de dicha secuencia codificadora, y dicha porción del extremo 5' está unida operablemente a dicho promotor y está bajo su control, una secuencia de ácido nucleico de una señal donante de ruptura, y una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR); y

b) un segundo vector vírico de AAV que contiene el segundo plásmido que comprende, en la dirección 5'-3': una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR), una secuencia de ácido nucleico de una señal aceptora de ruptura, el extremo 3' de dicha secuencia codificadora, una secuencia de ácido nucleico de señal de poliadenilación, y una de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR).

También preferiblemente, los vectores de virus adenoasociado (AAV) se seleccionan del mismo serotipo de AAV o de serotipos diferentes.

También preferiblemente, el virus adenoasociado se selecciona del serotipo 2, el serotipo 8, el serotipo 5, el serotipo 7 o el serotipo 9.

Otra realización de la invención es una célula hospedante que comprende el sistema de vector vírico dual según la invención.

Preferiblemente, la célula hospedante es una célula de mamífero, una célula humana, una célula retiniana, una célula madre no embrionaria.

Otra realización de la invención es el sistema de construcción dual de la invención, el sistema de vector vírico dual de la invención o la célula hospedante de la invención para un uso médico, preferiblemente para un uso en una terapia génica, también preferiblemente para el tratamiento y/o la prevención de una patología o una enfermedad caracterizada por una degeneración retiniana. Preferiblemente, la degeneración retiniana es heredada.

También preferiblemente, la patología o la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en retinitis pigmentosa, amaurosis congénita de Leber (LCA), enfermedad de Stargardt, enfermedad de Usher, síndrome de Alstrom, una enfermedad provocada por una mutación en el gen ABCA4 (también denominada enfermedad asociada a ABCA4). La distrofia de conos-bastones de tipo 3, el fundus flavimaculatus, la degeneración macular relacionada con la edad de tipo 2, la distrofia retiniana grave de aparición temprana, y la retinitis pigmentosa de tipo 19 son ejemplos de enfermedades provocadas por una mutación en el gen ABCA4 (enfermedades asociadas a ABCA4).

Otra realización de la invención es una composición farmacéutica que comprende el sistema de construcción dual de la invención, el sistema de vector vírico dual según la invención o la célula hospedante de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otra realización de la invención es un método para tratar y/o prevenir una patología o una enfermedad caracterizada por una degeneración retiniana, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz del sistema de construcción dual según se describe en la presente, el sistema de vector vírico dual según se describe en la presente o la célula hospedante según se describe en la presente.

Otra realización de la invención es un ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:3 para su uso como región recombinogénica.

Otra realización de la invención es un método in vitro para inducir la recombinación genética, que comprende usar la secuencia que consiste en SEQ ID NO:3 para su uso en un método para inducir la recombinación genética.

En la presente invención, el promotor preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en un promotor de citomegalovirus, un promotor de rodopsina, un promotor de rodopsina quinasa, un promotor de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores, un promotor de la distrofia macular viteliforme de tipo 2. Sin embargo, puede utilizarse cualquier promotor adecuado conocido en la técnica.

En la presente invención, la secuencia codificadora se divide en un primer y un segundo fragmento (la porción del extremo 5' y la porción del extremo 3') e una unión de exón-exón natural. Preferiblemente, cada fragmento de la secuencia codificadora no debe tener un tamaño mayor que 10 kb. Preferiblemente, cada porción del extremo 5' y cada porción del extremo 3' puede tener un tamaño de 4,5 Kb, 5 Kb, 5,5 Kb, 6 Kb, 6,5 Kb, 7 kb, 7,5 Kb, 8 Kb, 8,5 Kb, 9 Kb, 9,5 Kb o un tamaño menor.

Durante la pasada década, la terapia génica se ha aplicado al tratamiento de enfermedades en cientos de ensayos clínicos. Se han desarrollado diversas herramientas para transportar genes al interior de células humanas; entre estas, los virus modificados genéticamente, incluyendo los adenovirus, son, en la actualidad, la herramienta más popular para el suministro de genes. La mayoría de los sistemas contienen vectores que son capaces de alojar genes de interés y células auxiliares que pueden proporcionar las proteínas estructurales víricas y las enzimas para permitir la generación de partículas víricas infecciosas que contienen el vector. Los virus adenoasociados son una familia de virus que se diferencian en la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos, la estructura del genoma, la patogenicidad y la gama de hospedantes Esta diversidad proporciona la oportunidad de emplear virus con diferentes características biológicas para desarrollar diferentes aplicaciones terapéuticas. Al igual que con cualquier herramienta de suministro, la eficacia, la capacidad de dirigirse a ciertos tipos de tejidos o de células, la expresión del gen de interés, y la seguridad de los sistemas basados en adenovirus son importantes para la aplicación con éxito de la terapia génica. Se han dedicado esfuerzos significativos a estas áreas de investigación en los años recientes. S e han realizado diversas modificaciones en los vectores basados en virus adenoasociados y en las células auxiliares para alterar la expresión génica, el suministro a la diana, para mejorar las titulaciones víricas y para aumentar la seguridad. La presente invención representa una mejora en este proceso de diseño, ya que actúa para transportar con eficacia genes de interés dentro de dichos vectores víricos. Los virus son herramientas lógicas para el suministro de genes. S e replican dentro de las células y, por tanto, han desarrollado mecanismos para entrar en las células y emplear la maquinaria celular para expresar sus genes. El concepto de suministro de genes basado en virus consiste en modificar el virus de modo que pueda expresar el gen de interés. Dependiendo de la aplicación específica y del tipo de virus, la mayoría de los vectores víricos contienen mutaciones que dificultan su capacidad para replicarse libremente como virus de tipo salvaje en el hospedante. Se han modificado virus de varias familias diferentes para generar vectores víricos para el suministro de genes. Estos virus incluyen retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes simplex, picornavirus, y alfavirus. La presente invención preferiblemente emplea virus adenoasociados.

Un vector basado en virus adenoasociado ideal para el suministro de genes debe ser eficaz, específico de células, regulado y seguro. La eficacia del suministro es importante porque puede determinar la eficacia de la terapia. Los esfuerzos actuales están dirigidos a lograr una infección y expresión génica específica del tipo de célula con vectores víricos adenoasociados. Además, se están desarrollando vectores víricos adenoasociados para regular la expresión del gen de interés, puesto que la terapia puede requerir una expresión regulada o a largo plazo. La seguridad es una cuestión principal para el suministro de genes víricos, puesto que la mayoría de los virus son patógenos o tiene un potencial patogénico. Es importante que, durante el suministro de genes, el paciente no reciba sin querer un virus patogénico que tenga el potencial completo de replicación.

El virus adenoasociado (AAV) es un virus pequeño que infecta a seres humanos y a algunas otras especies de primates. En la actualidad, no se conoce que el AAV provoque enfermedades y, en consecuencia, el virus provoca una respuesta inmunológica muy suave. Los vectores de terapia génica que emplean AAV pueden infectar a células en división y quiescentes, y persisten en un estado extracromosómico sin integrarse en el genoma de la célula hospedante. Estas características hacen que el AAV sea un candidato muy atractivo para crear vectores víricos para la terapia génica y para la creación de modelos de enfermedad humanos isogénicos.

El AAV de tipo salvaje ha atraído un considerable interés a los investigadores de la terapia génica debido a una serie de características. La más importante es la aparente falta de patogenicidad del virus. También puede infectar a células que no están en división y tiene la capacidad de integrarse de modo estable en el genoma de la célula hospedante en un sitio específico (denominado AAVS1) en el cromosoma 19 humano. Esta característica hace que sea algo más predecible que los retrovirus, que presentan la amenaza de una inserción aleatoria y de mutagénesis, que a veces es seguida del desarrollo de un cáncer. El genoma de AAV se integra con muchísima frecuencia en el sitio mencionado, y las incorporaciones aleatorias en el genoma se producen con una frecuencia insignificante. Sin embargo, el desarrollo de AAV como vectores de terapia génica ha eliminado esta capacidad integradora por la eliminación de rep y cap del ADN del vector. El gen deseado, junto con un promotor para dirigir la transcripción del gen, se inserta entre las repeticiones terminales invertidas (ITR) que ayudan a la formación de concatámeros en el núcleo después de que el ADN monocatenario del vector haya sido convertido por los complejos de ADN polimerasa de la célula hospedante en ADN bicatenario. Los vectores de terapia génica basados en AAV forman concatámeros episómicos en el núcleo de la célula hospedante. En las células que no están en división, estos concatámeros permanecen intactos durante la vida de la célula hospedante. En las células en división, el ADN de AAV se pierde por la división celular, puesto que el ADN episómico no se replica junto con el ADN de la célula hospedante. Puede detectarse una integración aleatoria del ADN de AAV en el genoma del hospedante, pero esto sucede con una frecuencia muy baja. Los AAV también presentan una inmunogenicidad muy baja, que parece limitada a la generación de anticuerpos neutralizantes, y al mismo tiempo no inducen una respuesta citotóxica claramente definida. Esta característica, junto con la capacidad para infectar células quiescentes, justifica su dominio frente a los adenovirus como vectores para la terapia génica humana.

Genoma, transcriptoma y proteoma de AAV

El genoma de AAV está construido de ácido desoxirribonucleico monocatenario (ADNmc), de sentido positivo o negativo, que tiene una longitud de aproximadamente 4,7 kilobases. El genoma comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) en ambos extremos de la hebra de ADN, y dos marcos de lectura abierta ("open reading frames", ORF): rep y cap. El primero está compuesto de cuatro genes solapantes que codifican las proteínas Rep necesarias para el ciclo de vida de AAV, y el último contiene secuencias de nucleótidos solapantes de las proteínas de la cápsida VP1, VP2 y VP3, que interaccionan conjuntamente para formar una cápsida de simetría icosahédrica.

Secuencias de ITR

Las secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) comprenden 145 bases cada una. Se les dio este nombre debido a su simetría, que se demostró que era necesaria para una multiplicación eficaz del genoma del AAV. Otra propiedad de estas secuencias es su capacidad para formar una horquilla, que contribuye al denominado autocebado que permite la síntesis independiente de primasa de la segunda hebra de ADN. También se ha demostrado que las ITR son necesarias para la integración del ADN del AAV en el genoma de la célula hospedante (19° cromosoma en los seres humanos) y para ser rescatado de este, así como para la encapsidación eficaz del ADN del AAV combinado con la generación de partículas de AAV resistentes a la desoxirribonucleasa totalmente ensambladas.

Con respecto a la terapia génica, las ITR parecen ser las únicas secuencias necesarias en cis junto al gen terapéutico; los genes estructurales (cap) y de encapsidación (rep) pueden suministrarse en trans. Con esta suposición, se han establecido muchos métodos para la producción eficaz de vectores de AAV recombinantes (rAAV) que contienen un gen indicador o terapéutico. Sin embargo, también se ha publicado que las ITR no son los únicos elementos necesarios en cis para la replicación y la encapsidación eficaces. Unos pocos grupos de investigación han identificado una secuencia denominada elemento dependiente de Rep de acción en cis ("cis-acting Rep-dependent element", CARE) dentro de la secuencia codificadora del gen rep. Se ha demostrado que CARE aumenta la replicación y la encapsidación cuando está presente en cis.

En 2006 se habían descrito 11 serotipos de AAV, el último en 2004. Todos los serotipos conocidos pueden infectar células de múltiples tipos de tejidos diversos. La especificidad de tejido es determinada por el serotipo de la cápsida, y es probable que la pseudotipificación de los vectores de AAV para alterar su gama de tropismo sea importante para su uso en terapia. En la presente invención, se prefieren las iTr del serotipo 2 y del serotipo 5 de AVV.

Serotipo 2

El serotipo 2 (AAV2) es el que más se ha estudiado hasta la fecha. El AAV2 presenta un tropismo natural hacia músculos esqueléticos, neuronas, células del músculo liso vascular y hepatocitos.

Se han descrito tres receptores celulares para AAV2: el proteoglicano de sulfato de heparano ("heparan sulfate proteoglycan" HSPG), la integrina ayp ⁵ , y el receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos ("fibroblast growth factor receptor 1", FGFR-1). El primero funciona como receptor primario, mientras que los dos últimos tienen una actividad de correceptor y permiten al AAV entrar en la célula mediante endocitosis mediada por receptor. Estos resultados de estudios han sido disputados por Qiu, Handa, et al. El HSPG actúa como receptor principal, aunque su abundancia en la matriz extracelular puede captar partículas de AAV y alterar la eficacia de la infección.

Serotipo 2 y cáncer

Ciertos estudios han demostrado que el serotipo 2 del virus (AAV-2) aparentemente mata a las células del cáncer sin dañar a las células sanas. "Nuestros resultados sugieren que el virus adenoasociado de tipo 2, que infecta a la mayoría de la población, pero que no tiene efectos perjudiciales conocidos, mata a múltiples tipos de células del cáncer, aunque no produce ningún efecto sobre las células sanas", ha declarado Craig Meyers, profesor de inmunología y microbiología de the Penn State College of Medicine de Pensilvania. Esto puede conducir a un nuevo agente anticáncer.

Otros serotipos

Aunque AAV2 es el serotipo más popular en diversas investigaciones basadas en AAV, se ha demostrado que otros serotipos pueden ser más eficaces como vectores de suministro de genes. Por ejemplo, AAV6 parece ser mucho más eficaz para infectar células epiteliales de las vías respiratorias, AAV7 presenta una tasa de transducción muy alta de células del músculo esquelético murinas (de modo similar a AAV1 y AAV5), AAV8 es muy bueno para transducir hepatocitos, y AAV1 y 5 han demostrado ser muy eficaces en el suministro de genes a células epiteliales vasculares. En el cerebro, la mayoría de los serotipos de AAV muestran tropismo neuronal, mientras que AAV5 también transduce astrocitos. AAV6, un híbrido de AAV1 y AAV2, también muestra menor inmunogenicidad que AAV2.

Los serotipos pueden diferir con respecto a los receptores a los que se unen. Por ejemplo, la transducción de AAV4 y AAV5 puede ser inhibida por ácidos siálicos solubles (de diferentes formas para cada uno de estos serotipos), y se ha demostrado que AAV5 entra en las células a través del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas.

En la presente invención, los vehículos de suministro de la presente invención pueden administrarse a un paciente. Los expertos en la técnica podrán determinar las tasas de dosificación apropiadas. El término "administrar" incluye el suministro por medio de técnicas víricas o no víricas. Los mecanismos de suministro víricos incluyen, pero no se limitan a vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados (AAV), vectores de herpes virus, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, y vectores baculovíricos, etc., tal como se describió anteriormente. Los mecanismos de suministro no víricos incluyen la transfección mediada por lípidos, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, anfifilos faciales catiónicos ("cationic facial amphiphiles", CFA) y sus combinaciones.

El suministro de uno o más genes terapéuticos por un sistema de vector según la presente invención puede emplearse por sí solo o en combinación con otros tratamientos o componentes del tratamiento.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para tratar a un individuo mediante terapia génica, en la que la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del vector/construcción o célula hospedante de la presente invención que comprende uno o más transgenes terapéuticos y/o de diagnóstico transportables o una partícula vírica producida por estos u obtenida de estos. La composición farmacéutica puede utilizarse en seres humanos o en animales. Generalmente, un médico determinará la dosis real más adecuada para un sujeto individual, y esta variará según la edad, el peso y la respuesta del individuo concreto. La composición puede comprender opcionalmente un vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La elección del vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico se realizará tomando en cuenta la vía prevista de administración y la práctica farmacéutica convencional. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como vehículo, excipiente o diluyente (o adem ás de este) cualquier ligante, lubricante, agente suspensor, agente de revestimiento, agente solubilizante y otros agentes vehículo adecuados que puedan ayudar o aumentar la entrada del virus en el sitio diana (tal como, por ejemplo, un sistema de suministro de lípidos). Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante uno cualquiera o más de inhalación, en forma de un supositorio o pesario, por vía tópica en forma de una loción, disolución, crema, ungüento o polvos secantes, mediante el uso de un parche dérmico, por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes, tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos solos o mezclados con excipientes, o en forma de elixires, disoluciones o suspensiones que contienen agentes aromatizantes o colorantes, o pueden inyectarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía intracavernosa, intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para la administración parenteral, las composiciones pueden utilizarse del mejor modo en forma de una disolución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, las sales o los monosacáridos suficientes para que la disolución sea isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o pastillas para chupar que pueden formularse de modo convencional.

Los expertos en la técnica conocen los métodos convencionales para la incorporación de un polinucleótido o un vector en una célula hospedante, por ejemplo, transfección, lipofección, electroporación, microinyección, infección vírica, choque térmico, transformación después de la permeabilización química de una membrana o fusión celular.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "células hospedante o célula hospedante genéticamente modificada" se refiere a células hospedantes que han sido transducidas, transformadas o transfectadas con la construcción o con el vector previamente descrito.

Como ejemplos representativos de células hospedantes apropiadas se pueden citar células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, células fúngicas, tales como levaduras, células de insecto, tales como Sf9, células animales, tales como CHO o COS, células vegetales, etc. Se considera que la selección de un hospedante apropiado se encuentra dentro del alcance de los expertos en la técnica partiendo de las indicaciones de la presente. Preferiblemente, dicha célula hospedante es una célula animal, y lo más preferiblemente una célula humana. La invención proporciona adem ás una célula hospedante que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos en la presente. La célula hospedante puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, un ser humano. La célula hospedante puede ser una célula adherente o una célula suspendida, e s decir, una célula que crece en suspensión. En la técnica se conocen células hospedantes adecuadas e incluye, por ejemplo, DH5a, células de E. coli, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares.

La presente invención se ilustrará a continuación por medio de ejemplos no limitantes referidos a los siguientes dibujos.

Figura 1. Representación esquemática de estrategias basadas en AAVpara la transducción de genes grandes.

CDS: secuencia codificadora; pA: señal de poliadenilación; SD: señal donante de ruptura; SA: señal aceptora de ruptura; AP: región recombinogénica de la fosfatasa alcalina (39); AK: región recombinogénica del fago F1. Las líneas discontinuas muestran la ruptura que se produce entre SD y SA, y las líneas de puntos muestran las regiones solapantes disponibles para la recombinación homóloga. Los inventores descubrieron que puede utilizarse la transruptura dual y una AK híbrida para reconstituir la expresión de genes grandes con éxito. En particular, los vectores de transruptura dual y de AK híbrida, pero no los vectores solapantes y de AP híbrida, transducen con eficacia los fotorreceptores de ratón y de cerdo. Los plásmidos de vector de tamaño normal y de AAV sobredimensionado contienen módulos de expresión de longitud completa que incluyen el promotor, la CDS del transgén de longitud completa y la señal de poliadenilación (pA) (tabla 1). Los dos plásmidos de vector de AAV distintos (5' y 3') necesarios para generar vectores de AAV duales contienen el promotor seguido de la porción N-terminal de la CDS del transgén (plásmido 5') o la porción C-terminal de la CDS del transgén seguida de la señal de pA (plásmido 3', tabla 1). La estructura de todos los plásmidos se indica en la sección de materiales y métodos.

Figura 2. Los vectores de solapamiento de AAV duales, de transruptura y de AK híbrida transducen con eficacia genes grandes in vitro.

Transferencia Western de células HEK293 infectadas con vectores AAV2/2 que codifican EGFP (A y D), ABCA4 (B y E) y MYO7A (C y F). (A a C): Las flechas indican las proteínas de longitud completa, los microgramos de proteínas cargados se indican bajo cada carril, y la escalera de peso molecular se indica a la izquierda. (D a F): Cuantificación de las bandas de proteínas EGFP (D), ABCA4 (E) y MYO7A (F). La intensidad de las bandas de Eg FP, ABCA4 y MYO7A se dividió entre la intensidad de las bandas de tubulina (D) o filamina A (E-F). Los histogramas muestran la expresión de las proteínas como un porcentaje relativo a los vectores de transruptura ("trans-splicing", TS) de AAV duales, y el valor promedio se indica bajo la barra correspondiente. Barras de error: promedio ± e.e.p. (error estándar del promedio). (A-C): Las imágenes de la transferencia Western son representativas y las cuantificaciones se realizan a partir de n = 4 (A-B) o n = 3 (C) experimentos independientes. OZ: AAV sobredimensionado; OV: solapante de AAV dual; TS: transruptura de AAV dual; AP: AP híbrida de AAV dual; AK: AK híbrida de AAV dual; 5'+3': células coinfectadas con vectores de mitades 5' y 3'; 5': células control infectadas solo con la mitad 5' del vector; 3': células control infectadas solo con la mitad 3'; a-EGFP: anticuerpo anti-EGFP; a-3xflag: anticuerpo anti-3xflag; a-MYO7A: anticuerpo anti-MYO7A; a-p-tubulina: anticuerpo anti-p-tubulina; a-filamina A: anticuerpo antifilamina A. * valor p de a No VA <0,05; ** valor p de ANOVA < 0,001. (F): Los asteriscos mostrados en el panel inferior representan diferencias significativas con OZ y AP.

Figura 3. Los vectores solapantes de AAV dual transducen el RPE pero no los fotorreceptores en la retina de ratón y de cerdo.

Análisis de la transferencia Western de lisados retinianos de C57BL/6 (A) y de cerdo Large White (B) un mes después de la inyección de los vectores solapantes de AAV duales AAV2/8 que codifican los vectores ABCA4-3xflag (OV) o AAV2/8 que codifican EGFP de tamaño normal (EGFP) bajo el control del promotor de citomegalovirus ubicuo (CMV), los promotores de rodopsina (RHO) y de rodopsina quinasa (RHOK) específicos de PR, o el promotor de la distrofia macular viteliforme de tipo 2 (VMD2) específico de RPE. (A-B): Las flechas indican las proteínas de longitud completa, la escalera de peso molecular se indica a la izquierda y se cargaron 150 microgramos de proteínas en cada carril. S e muestra el número (n) y el porcentaje de retinas positivas a ABCA4 del total de retinas analizadas; a-3xflag: anticuerpo anti-3xflag; a-disferlina: anticuerpo anti-disferlina. (C): Análisis de la transferencia Western de copas oculares (panel izquierdo) y retinas (panel derecho) de C57/BL6 a los 3 m eses tras la inyección de los vectores solapantes AAV2/8 para MYO7A-HA (OV) bajo el control del promotor de beta-actina de pollo ubicuo (CBA) o del promotor de rodopsina (RHO) específico de fotorreceptores. La flecha indica las proteínas de longitud completa, la escalera de peso molecular se indica a la izquierda y se cargaron 100 microgramos de proteínas en cada carril. S e muestra el número (n) y el porcentaje de retinas positivas a MYO7A de las retinas totales analizadas. a-HA: anticuerpo anti-hemaglutinina (HA).

Figura 4. Los vectores de transruptura y de AK híbrida de AAV duales transducen con eficacia el RPE y los fotorreceptores.

Análisis de fluorescencia de criosecciones retinianas de ratones C57BL/6 un m es después de la inyección subretiniana de vectores AAV2/8 que codifican EGFP bajo el control del promotor de citomegalovirus ubicuo (CMV). En la figura se muestra la barra de escala (20 |jm). NS: AAV de tamaño normal; OZ: AAV sobredimensionado; TS: transruptura de AAV dual; AP: AP híbrida de AAV dual; AK: AK híbrida de AAV dual; RPE: epitelio pigmentario retiniano; ONL: capa nuclear externa.

Figura 5. Los vectores de transruptura y de AK híbridas de AAV duales transducen con eficacia los fotorreceptores de ratón y de cerdo.

(A): Análisis de fluorescencia de criosecciones retinianas de ratones C57BL/6 un mes después de la inyección subretiniana de vectores AAV2/8 que codifican EGFP bajo el control del promotor de rodopsina (RHO) específico de PR. En la figura se muestra la barra de escala (20 jm). (B): Análisis de fluorescencia de criosecciones retinianas de cerdos Large White un m es después de la inyección subretiniana de vectores AAV2/8 que codifican EGFP bajo el control del promotor RHO específico de PR. En la figura se muestra la barra de escala (50 jm). NS: AAV de tamaño normal; TS: transruptura de AAV dual; AK: AK híbrida de AAV dual; RPE: epitelio pigmentario retiniano; ONL: capa nuclear externa.

Figura 6: La administración subretiniana de vectores de transruptura y de AK híbrida de AAV duales produce niveles robustos, aunque variables, de expresión de ABCA4 en fotorreceptores de ratón.

(A) : Análisis de la transferencia Western de lisados retinianos de C57BL/6 un m es después de la inyección de vectores de transruptura de AAV duales (TS) y de AK híbrida de AAV duales (AK) que codifican ABCA4 bajo el control del promotor de rodopsina (RHO) específico de PR. La flecha indica las proteínas de longitud completa, la escalera de peso molecular se indica a la izquierda y se cargaron 150 microgramos de proteínas en cada carril. Se muestra el número (n) y el porcentaje de retinas positivas a ABCA4 de las retinas totales analizadas. 5'+3': retinas coinyectadas con vectores de mitades 5' y 3'; a-3xflag: anticuerpo anti-3xflag; a-disferlina: anticuerpo anti-disferlina. (B) : Análisis con microscopía inmunoelectrónica con un anticuerpo anti-HA de secciones retinianas de ratones Balb/C de tipo salvaje (WT; n = 3 ojos) y Abca4-/- inyectados con vectores de AK híbrida de AAV duales (AK- ABCA4; n = 5 ojos) o con AAV de tamaño normal y EGFP (EGFP, n = 3 ojos) como control. Los puntos negros representan el inmunomarcaje con oro de la proteína ABCA4-HA. En la figura se muestra la barra de escala (200 nm).

Figura 7. La inyección subretiniana de vectores de transruptura de AAV duales reduce la acumulación de granulos de lipofuscina en ratones Abca4-/-.

(A): Análisis con microscopía electrónica de transmisión de secciones retinianas de ratones Balb/c de tipo salvaje (WT) y Abca4-/- inyectados con vectores de AK híbrida de AAV duales (Abca4-/- AK-ABCA4) o con AAV de tamaño normal y EGFP (Abca4-/- EGFP) como control. Las flechas negras indican los gránulos de lipofuscina. En la figura se muestra la barra de escala (1,6 jm). (B): Cuantificación del número promedio de gránulos de lipofuscina contados en al menos 30 campos (25 jm 2) para cada muestra. WT: ratones Balb/c; Abca4-/- EGFP/5'/3': ratones Abca4-/- inyectados con AAV de tamaño normal y EGFP o con el vector de la mitad 5' o 3' de AK híbrida de AAV dual, como control; Abca4-/- AK-ABCA4: ratones inyectados con vectores de AK híbrida de AAV duales; Abca4-/- TS-ABCA4: ratones inyectados con vectores de transruptura de AAV duales. Se muestra el número (n) de ojos analizados. El valor promedio se indica bajo la barra correspondiente. Barras de error: promedio ± e.e.p. (error estándar del promedio). * p de ANOVA<0,05

Figura 8: Las inyecciones subretinianas de vectores de AK híbrida de AAV duales reducen el espesor del RPE de Abca4-/-.

(A): Fotografías representativas del análisis con microscopía electrónica de transmisión de secciones retinianas de ratones Balb/c de tipo salvaje (WT) y Abca4-/- inyectados con vectores de transruptura de AAV duales (TS-ABCA4) y de AK híbrida (AK-ABCA4) o con vectores de AAV de tamaño normal y EGFP (EGFP) y la mitad 5' o 3' de vectores de AK híbrida duales (5'/3') como control. Las líneas de puntos indican los bordes de las células del RPE. En la figura se muestra la barra de escala (3,8 jm). (B): Cuantificación del espesor promedio del RPE contado en al menos 30 campos para cada muestra. Se muestra el número (n) de ojos analizados. El valor promedio se indica bajo la barra correspondiente. Barras de error: promedio ± e.e.p. (error estándar del promedio). m.d.s.: WT: ± 716; TS-ABCA4: ± 698.

Figura 9. La administración subretiniana de vectores de transruptura y de AK híbrida de AAV duales produce una expresión robusta de MYO7A en ratones.

Análisis de la transferencia Western de copas oculares de C57BL/6 un m es después de la inyección de vectores de transruptura de AAV duales (TS) y de AK híbrida (AK) que codifican MYO7A-HA bajo el control del promotor de betaactina de pollo ubicuo (CBA). La flecha indica las proteínas de longitud completa, la escalera de peso molecular se indica a la izquierda y se cargaron 100 microgramos de proteínas en cada carril. S e muestra el número (n) y el porcentaje de copas oculares positivos a MYO7A de las retinas totales analizadas. 5'+3': ojos coinyectados con vectores de las mitades 5' y 3'; 5': ojos inyectados con vectores de la mitad 5'; 3': ojos inyectados con vectores de la mitad 3'; a-HA: anticuerpo anti-hemaglutinina (HA); a-disferlina: anticuerpo anti-disferlina.

Figura 10: La administración subretiniana de vectores de transruptura y de AK híbrida de AAV duales rescata la localización de los melanosomas en RPE de sh1-/-.

(A): Secciones retinianas semidelgadas representativas teñidas con tinte de tejidos epoxi de ojos de sh1+/+ y sh1+/-inyectados con AAV de tamaño normal y EGFP (EGFP, n = 4 ojos), y de ojos de sh1-/- inyectados con vectores de transruptura de AAV duales (TS-MY07A, n = 3 ojos), de AK híbrida (AK-MYO7A; n = 3 ojos) o vectores de la mitad 5' (5'TS/5'AK, n = 4 ojos), como control. En la figura se muestra la barra de escala (10 pm). (B): Cuantificación de la localización de los melanosomas en las vellosidades del RPE de ratones sh1 dos m eses después de la administración subretiniana de vectores de AAV duales. La cuantificación se muestra como el número promedio de melanosomas apicales/campo, y el valor promedio se indica bajo la barra correspondiente. Barras de error: promedio ± e.e.p. (error estándar del promedio). * p de ANOVA<0,05, ** p de ANOVA<0,001.

Figura 11. La administración subretiniana de vectores de transruptura y de AK híbrida de AAV duales reduce la acumulación de rodopsina en los cilios conectores de PR de sh1-/-.

Cuantificación del número de partículas de oro de rodopsina en los cilios conectores de PR de ratones sh1 dos m eses después de la administración subretiniana de vectores de AAV duales. La cuantificación se muestra como el número promedio de partículas de oro por longitud de cilios conectores (nm), y el valor promedio se indica bajo la barra correspondiente. Barras de error: promedio ± e.e.p. (error estándar del promedio).

Figura 12. Los vectores de transruptura y de AK híbrida de AAV duales transducen con eficacia el gen grande CEP290 in vitro.

Análisis de la transferencia Western de células HEK293 infectadas con vectores AAV2/2 que codifican CEP290 marcada en su C-terminal con el marcador de hemaglutinina (HA) (A-B). (A): La flecha indica la proteína de longitud completa, se cargaron 60 microgramos de proteína en cada carril, y la escalera de peso molecular se indica a la izquierda. (B): Cuantificación de las bandas de proteína CEP290. La intensidad de las bandas de CEP290 se dividió entre la intensidad de las bandas de filamina A. El histograma muestra la expresión de las proteínas como un porcentaje relativo a los vectores de transruptura (TS) de AAV duales, y el valor promedio se indica bajo la barra correspondiente. Barras de error: promedio ± e.e.p. (error estándar del promedio). La imagen de la transferencia Western es representativa y la cuantificación se realiza a partir de n = 5 experimentos independientes. OV: solapamiento de AAV duales; TS: transruptura de AAV duales; AK: AK híbrida de AAV dual; 5'+3': células coinfectadas con vectores de las mitades 5' y 3'; 3': células control infectadas solo con la mitad 3'; a-HA: anticuerpo anti-HA; a-filamina A: anticuerpo anti-filamina A.

Figura 13. Recuperación mejorada de la desensibilización a la luz en ratones de tres meses de edad Abca4-/-tratados con vectores de transruptura y de AK híbrida de AAV duales

Recuperación de la desensibilización a la luz en ratones Abca4-/- y Balb/c 6 sem anas después de la inyección. La onda b relativa es la proporción entre las amplitudes de onda b (pV) después y antes de la desensibilización, ambas evocadas por 1 cd s/m2. El tiempo (minutos) se refiere al tiempo después de la desensibilización. Se muestra el promedio de recuperación (%) a los 60 minutos. p de ANOVA Abca4-/- AK-ABCA4 frente Abca4-/- no inyectado/5':

0,05; p de ANOVA Abca4-/- TS-ABCA4 frente a Abca4-/- no inyectado/5': 0,009; p de ANOVA Abca4-/- AK-ABCA4 frente a WT: 0,002; p de ANOVA Abca4-/- TS-ABCA4 frente a WT: 0,02; p de ANOVA WT frente a Abca4-/- no inyectado/5': 0,00001. WT: ratones Balb/c (n = 4); Abca4-/- TS-ABCA4: ratones inyectados con vectores de transruptura de AAV duales (n = 5); Abca4-/- AK-ABCA4: ratones inyectados con vectores de AK híbrida de AAV duales (n = 5); Abca4-/- no inyectado/5': Abca4-/- ratones no inyectados (n = 2) o inyectados con la mitad 5' de vectores TS de AAV duales o de AK híbrida (n = 5). Los datos se muestran como promedio ± e.e.p. (error estándar del promedio). * p de ANOVA<0,05.

Figura 14. Los vectores de AK híbrida de AAV duales inducen una expresión de MYO7A más potente que los vectores de transruptura de AAV duales en fotorreceptores de sh1-/-.

Cuantificación de los niveles de MYO7A a partir de AAV duales en ojos de sh1-/- con relación a Myo7a endógena expresada en ojos de sh1+/+. Se inyectaron ojos de sh1-/- con vectores TS y de AK híbrida de AAV duales que codifican MYO7a bajo el control de los promotores de CBA (panel izquierdo) o RHO (panel derecho). Los histogramas muestran la expresión de la proteína MYO7A como un porcentaje relativo a Myo7a de sh1+/+; el valor promedio se indica bajo la barra correspondiente. La cuantificación se realiza mediante un análisis de la transferencia Western empleando el anticuerpo anti-MYO7A, y las mediciones de las intensidades de las bandas de MYO7A y Myo7a se normalizaron a la disferlina (los datos no se muestran). Barras de error: promedio ± d.e.p. (desviación estándar del promedio). La cuantificación es representativa de: i. panel izquierdo: n = 2 copas oculares de sh1+/+, y n = 5 o n = 1 copa ocular de sh1-/- tratadas con TS-MYO7A o AK-MYO7A, respectivamente; ii. panel derecho: n = 2 retinas de sh1+/+, y n = 1 o n = 3 retinas de sh1-/- tratadas con TS-MYO7A o AK-MYO7A, respectivamente. ** p del ensayo de la t de Student <0,001.

Figura 15. Los vectores de AAVde tamaño normal, de transruptura y de AK híbrida de AAV duales proporcionan la transducción más robusta tras una administración subretiniana en ratones.

Imágenes en vivo de la fluorescencia del fondo del ojo de C57BL/6 un m es después de la inyección subretiniana de vectores AAV2/8 que codifican EGFP. NZ: tamaño normal; OZ: AAV sobredimensionados; TS: transruptura de AAV dual; AP: AP híbrida de AAV dual; AK: AK híbrida de AAV dual. Cada panel muestra un ojo diferente.

Figura 16. Expresión robusta de ABCA4 y MYO7A después de la administración de vectores de transruptura y de AK híbrida de AAV duales a la retina de cerdos.

(a) Análisis de la transferencia Western de lisados retinianos de cerdos Large White 1 m es después de la inyección de vectores de transruptura (TS; n = 2) y de AK híbrida (AK; n = 3) de AAV2/8 duales que codifican ABCA4-3xflag, o de vectores AAV2/8 que codifican NS EGFP (neg), como control negativo, bajo el control del promotor de rodopsina (RHO) específico de fotorreceptores. (b) Análisis de la transferencia Western de lisados retinianos de cerdos Large White 1 m es después de la inyección de vectores de transruptura (TS: n = 5 RPE; n = 3 retinas) y de AK híbrida (AK: n = 5 RPE, n = 5 retinas) de AAV2/8 duales que codifican MYO7A-HA bajo el control del promotor de beta-actina de pollo ubicuo (CBA), o de la mitad 3' de AAV-MYO7AHA dual (neg), como control negativo. (a-b): Las flechas indican las proteínas de longitud completa, la escalera de peso molecular se indica a la izquierda y se cargaron 150-180 |jg de proteínas en cada carril. a-3xflag, anticuerpo anti-3xflag; a-HA, anticuerpo anti-hemaglutinina; a-disferlina, anticuerpo anti-disferlina.

Figura 17. Los vectores de AK híbrida de AAV duales con ITR heterólogas transducen genes grandes in vitro.

(a) Diseño de los vectores de AK híbrida de AAV duales con ITR2 y ITR5 heterólogas. (b) Análisis de la transferencia Western de células HEK293 infectadas con vectores de AK híbrida de AAV duales con ITR heterólogas que codifican ABCA4 (panel izquierdo) y MYO7A (panel derecho). Las flechas indican las proteínas de longitud completa, se cargaron 50 microgramos de proteína, y la escalera de peso molecular se indica a la izquierda. 5'+3': células coinfectadas con vectores de las mitades 5' y 3'; 5': células control infectadas solo con el vector de la mitad 5'; 3': células control infectadas solo con el vector de la mitad 3'; neg: células infectadas con vectores AAV2/8 que codifican EGFP. a-3xflag: anticuerpo anti-3xflag; a-MYO7A: anticuerpo anti-MYO7A; a-filamina: anticuerpo antifilamina A. (a) Prom: promotor; CDS: secuencia codificadora; pA: señal de poliadenilación; SD: señal donante de ruptura; SA: señal aceptora de ruptura; las líneas de puntos muestran las regiones solapantes disponibles para la recombinación homóloga, y las líneas discontinuas muestran la ruptura que se produce entre SD y SA. Se muestra la posición de las ITR2 y ITR5 heterólogas.

Descripción detallada de la invención

Materiales y métodos

Generación de plásmidos de vector de AAV

Los plásmidos utilizados para la producción del vector de AAV se derivaron de los plásmidos pZac2.1 (52) o pAAV2.1 (53) que contienen las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV de serotipo 2 (tabla 1).

Tabla 1 - Plásmidos para la producción del vector de AAV

N.B. CMV: promotor de citomegalovirus; CBA: beta-actina de pollo; RHO: promotor de rodopsina humano; RHOK: promotor de rodopsina quinasa humano; Vmd2: promotor de la distrofia macular viteliforme de tipo 2; EGFP: proteína fluorescente verde potenciada; ABCA4: módulo de unión a ATP humano, subfamilia A, miembro 4; MYO7A: miosina VIIA humana; SV40: señal de poliadenilación del virus de simio 40; BGH: señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina; 3xflag: marcador 3xflag; HA: marcador de hemaglutinina; AP: región recombinogénica de la fosfatasa alcalina; AK: región recombinogénica del fago F1; TS: transruptura; ITR5:2: plásmido con la ITR izquierda del AAV de serotipo 5 y la ITR derecha del AAV de serotipo 2; ITR2.5: plásmido con la ITR izquierda del AAV de serotipo 2 y la ITR derecha del AAV de serotipo 5. Cuando no se especifica, la ITR izquierda y derecha proceden del AAV de serotipo 2.

Los plásmidos de vector de AAV de tamaño normal y sobredimensionado contienen módulos de expresión de longitud completa que incluyen el promotor, la CDS del transgén de longitud completa y la señal de poliadenilación (pA) (tabla 1). Los dos plásmidos de vector de AAV distintos (5' y 3') necesarios para generar vectores de AAV duales contienen el promotor seguido de la porción N-terminal de la c Ds del transgén (plásmido 5') o la porción C-terminal de la CDS del transgén seguida de la señal de pA (plásmido 3', tabla 1). Los plásmidos de EGFP de tamaño normal se generaron clonando la CDS de EGFP del plásmido pAAV2.1-CMV-EGFP (720 pb) (53) en pZac2.1 (52); el EGFP sobredimensionado se generó a partir de pAAV2.1-CMV-EGFP (53) mediante la inserción de una secuencia de ADN de relleno de 3632 pb procedente de ABCA4 humana (NM_000350.2, pb 1960-5591) cadena arriba del promotor de CMV y una segunda secuencia de ADN de relleno de 3621 pb, compuesta de: ABCA4 murina (NM 007378.1, 1066-1 y 7124-6046 pb; 2145 pb totales) y harmonina humana (NM153676.3 131-1606 pb; 1476 pb totales), cadena abajo de la señal de pA (esta construcción se usa en los experimentos de la figura 1a, d, figura 4 y figura 15). Para generar los plásmidos de vector de AAV duales, la CDS de EGFP (720 pb) se dividió en dos construcciones: una que contiene la CDS N-terminal (PMID: 9759496, pb 1-393) y la otra que contiene la CDS C-terminal (PMID: 9759496, pb 394-720).

Los plásmidos de ABCA4 sobredimensionados contienen la CDS de ABCA4 humana de longitud completa (GeneNM_000350.2, pb 105-6926), mientras que los plásmidos de MYO7A sobredimensionados contienen la CDS de MYO7A humana de longitud completa procedente de la isoforma 1 (NM_000260.3, pb 273-6920). Para generar los plásmidos para los vectores de a Av o V, las CDS de ABCA4 y MYO7A s e dividieron en dos construcciones, una que contiene el N-terminal de CDS (ABCA4: NM_000350.2, pb 105-3588; MYO7A : NM_000350.2, pb 273-3782) y la otra que contiene el C-terminal de CDS (ABCA4: NM_000350.2, pb 2819-6926; MYO7A: NM_000350.2, pb 2913­ 6920). Por tanto, la región de homología compartida por los plásmidos de vector solapante es de 770 pb para ABCA4 y de 870 pb para MYO7A. Para generar los plásmidos para los vectores de a Av OV duales, la CDS de CEP290 humana se dividió en dos construcciones, una que contiene el N-terminal de CDS (CEP290: NM_025114, pb 345-4076) y la otra que contiene el C-terminal de CDS (CEP290: NM_025114, pb 3575-7784). Por tanto, la región de homología compartida por los plásmidos de vector solapante es de 502 pb.

Para generar plásmidos de vector de transruptura e híbridos, las CDS de ABCA4 y MYO7A se dividieron en una zona de unión exón-exón natural. ABCA4 se dividió entre los exones 19-20 (mitad 5': NM_000350.2, 105-3022 pb; mitad 3': NM_000350.2, pb 3023-6926) y MYO7A se dividió entre los exones 24-25 (mitad 5': NM_000350.2, pb 273­ 3380; mitad 3': NM_000350.2, pb 3381-6926). Las proteínas ABCA4 y MYO7A se marcaron en su C-terminal: ABCA4 con el marcador 3xflag (gactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgactacaaggatgacgatgacaag) o hemaglutinina (HA) tag (tatccgtatgatgtgccggattatgcg); MYO7A solo con el marcador HA. Para generar plásmidos de vector de transruptura e híbridos, la CDS de CEP290 se dividió en una zona de unión exón-exón natural: entre los exones 29-30 (mitad 5': NM_025114, 345-3805; mitad 3': NM_025114, 3806-7784). La proteína CEP290 se marcó en su C-terminal con el marcador hemaglutinina (HA). Las señales donante de ruptura (SD) y aceptora de ruptura (SA) contenidas en los plásmidos de vector de AAV dual de transruptura e híbrido son las siguientes:

5'GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCT TGCGTTTCT-3' (SD) SEQ ID NO:1;

5'GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG-3' (SA), SEQ ID NO:2.

La secuencia recombinogénica contenida en los plásmidos de vector de AP híbrida (presente en el primer y segundo plásmido) se deriva de los genes de la fosfatasa alcalina (AP) (NM_001632, pb 823-1100), tal como se ha descrito previamente (39). La secuencia recombinogénica contenida en los plásmidos de vector de Ak híbrida (presente en el primer y segundo plásmido) se deriva del genoma del fago F1 (n.° de registro de Gene Bank: J02448.1; pb 5850­ 5926).

La secuencia de AK es:

5'GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAA AT-3', SEQ ID NO:3.

El promotor de CMV es el que está contenido en pZac2.1 (52) o pAAV2.1-CMV-EGFP (53); el promotor de CBA ubicuo se deriva de pAAV2.1-CBA-EGFP (11); los promotores de RHO y RHOK humanos específicos de PR se derivan de pAAV2.1-RHO-EGFP y pAAV2.1RHOK-EGFP, respectivamente (10); el promotor de Vmd2 específico de RPE (NG_009033.1, 4870-5470 pb) se corresponde con el fragmento del promotor de EcoRI-Xcml previamente descrito (41) que fue amplificado por ADN genómico humano.

Para generar los vectores de AK híbrida de AAV duales con ITR heterólogas procedentes de AAV del serotipo 2 y 5 se intercambió la ITR2 izquierda de la mitad 5' del plásmido y la ITR2 derecha de la mitad 3' del plásmido por la ITR5 (según se muestra en la figura 17a). Los plásmidos para la producción de los vectores AAV2 con ITR heterólogas son los siguientes: pZac5:2-CMV-5'ABCA4-SD-AK, pZac2:5-AK-SD-3'ABCA4-3x/7ag, pAAV5:2-CBA-5'MYO7A-SD-AK y pAAV2:5-AK-SD-3'MYO7A-HA (tabla 1).

Secuencias:

Gen ABCA4

pZac2.1-CMV-ABCA4_5'AK

ITR2 izquierda

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGG GTTCCT (SEQ ID No. 4)

ITR5 izquierda

CTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGTGGCAGCTCAAAGAG CTGCCAGACGACGGCCCTCTGGCCGTCGCCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCG ACAGGGGGGAGAGTGCCACACTCTCAAGCAAGGGGGTTTTGTAAGCAGTGA (SEQ ID No. 5)

Potenciador de CMV

TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATT GGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATA TGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGAC (SEQ ID No. 6)

Promotor de CMV

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCG TTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACG TCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGT GGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGC CCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA CGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCG GTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCC ACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGT CGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATAT AAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGT (SEQ ID No. 7)

Intrón quim érico

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACA GAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTC TCTCCACAG (SEQ ID No. 8)

Abca4 5'

ATGGGCTTCGTGAGACAGATACAGCTTTTGCTCTGGAAGAACTGGACCCTGCGGAAAAGGCA AAAGATTCGCTTTGTGGTGGAACTCGTGTGGCCTTTATCTTTATTTCTGGTCTTGATCTGGT TAAGGAATGCCAACCCGCTCTACAGCCATCATGAATGCCATTTCCCCAACAAGGCGATGCCC TCAGCAGGAATGCTGCCGTGGCTCCAGGGGATCTTCTGCAATGTGAACAATCCCTGTTTTCA AAGCCCCACCCCAGGAGAATCTCCTGGAATTGTGTCAAACTATAACAACTCCATCTTGGCAA GGGTATATCGAGATTTTCAAGAACTCCTCATGAATGCACCAGAGAGCCAGCACCTTGGCCGT ATTTGGACAGAGCTACACATCTTGTCCCAATTCATGGACACCCTCCGGACTCACCCGGAGAG AATTGCAGGAAGAGGAATTCGAATAAGGGATATCTTGAAAGATGAAGAAACACTGACACTAT TTCTCATTAAAAACATCGGCCTGTCTGACTCAGTGGTCTACCTTCTGATCAACTCTCAAGTC CGTCCAGAGCAGTTCGCTCATGGAGTCCCGGACCTGGCGCTGAAGGACATCGCCTGCAGCGA GGCCCTCCTGGAGCGCTTCATCATCTTCAGCCAGAGACGCGGGGCAAAGACGGTGCGCTATG CCCTGTGCTCCCTCTCCCAGGGCACCCTACAGTGGATAGAAGACACTCTGTATGCCAACGTG GACTTCTTCAAGCTCTTCCGTGTGCTTCCCACACTCCTAGACAGCCGTTCTCAAGGTATCAA TCTGAGATCTTGGGGAGGAATATTATCTGATATGTCACCAAGAATTCAAGAGTTTATCCATC GGCCGAGTATGCAGGACTTGCTGTGGGTGACCAGGCCCCTCATGCAGAATGGTGGTCCAGAG ACCTTTACAAAGCTGATGGGCATCCTGTCTGACCTCCTGTGTGGCTACCCCGAGGGAGGTGG CTCTCGGGTGCTCTCCTTCAACTGGTATGAAGACAATAACTATAAGGCCTTTCTGGGGATTG ACTCCACAAGGAAGGATCCTATCTATTCTTATGACAGAAGAACAACATCCTTTTGTAATGCA TTGATCCAGAGCCTGGAGTCAAATCCTTTAACCAAAATCGCTTGGAGGGCGGCAAAGCCTTT GCTGATGGGAAAAATCCTGTACACTCCTGATTCACCTGCAGCACGAAGGATACTGAAGAATG C CAAC T CAAC T T T T GAAGAAC T G GAACAC G T T AG GAAG T T G G T CAAAG C C T G G GAAGAAG T A GGGCCCCAGATCTGGTACTTCTTTGACAACAGCACACAGATGAACATGATCAGAGATACCCT GGGGAACCCAACAGTAAAAGACTTTTTGAATAGGCAGCTTGGTGAAGAAGGTATTACTGCTG AAGCCATCCTAAACTTCCTCTACAAGGGCCCTCGGGAAAGCCAGGCTGACGACATGGCCAAC TTCGACTGGAGGGACATATTTAACATCACTGATCGCACCCTCCGCCTTGTCAATCAATACCT GGAGTGCTTGGTCCTGGATAAGTTTGAAAGCTACAATGATGAAACTCAGCTCACCCAACGTG CCCTCTCTCTACTGGAGGAAAACATGTTCTGGGCCGGAGTGGTATTCCCTGACATGTATCCC TGGACCAGCTCTCTACCACCCCACGTGAAGTATAAGATCCGAATGGACATAGACGTGGTGGA GAAAACCAATAAGATTAAAGACAGGTATTGGGATTCTGGTCCCAGAGCTGATCCCGTGGAAG ATTTCCGGTACATCTGGGGCGGGTTTGCCTATCTGCAGGACATGGTTGAACAGGGGATCACA AGGAGCCAGGTGCAGGCGGAGGCTCCAGTTGGAATCTACCTCCAGCAGATGCCCTACCCCTG CTTCGTGGACGATTCTTTCATGATCATCCTGAACCGCTGTTTCCCTATCTTCATGGTGCTGG CATGGATCTACTCTGTCTCCATGACTGTGAAGAGCATCGTCTTGGAGAAGGAGTTGCGACTG AAGGAGACCTTGAAAAATCAGGGTGTCTCCAATGCAGTGATTTGGTGTACCTGGTTCCTGGA CAGCTTCTCCATCATGTCGATGAGCATCTTCCTCCTGACGATATTCATCATGCATGGAAGAA TCCTACATTACAGCGACCCATTCATCCTCTTCCTGTTCTTGTTGGCTTTCTCCACTGCCACC ATCATGCTGTGCTTTCTGCTCAGCACCTTCTTCTCCAAGGCCAGTCTGGCAGCAGCCTGTAG TGGTGTCATCTATTTCACCCTCTACCTGCCACACATCCTGTGCTTCGCCTGGCAGGACCGCA TGACCGCTGAGCTGAAGAAGGCTGTGAGCTTACTGTCTCCGGTGGCATTTGGATTTGGCACT GAGTACCTGGTTCGCTTTGAAGAGCAAGGCCTGGGGCTGCAGTGGAGCAACATCGGGAACAG TCCCACGGAAGGGGACGAATTCAGCTTCCTGCTGTCCATGCAGATGATGCTCCTTGATGCTG CTGTCTATGGCTTACTCGCTTGGTACCTTGATCAGGTGTTTCCAGGAGACTATGGAACCCCA CTTCCTTGGTACTTTCTTCTACAAGAGTCGTATTGGCTTGGCGGTGAAGGGTGTTCAACCAG AGAAGAAAGAGCCCTGGAAAAGACCGAGCCCCTAACAGAGGAAACGGAGGATCCAGAGCACC CAGAAGGAATACACGACTCCTTCTTTGAACGTGAGCATCCAGGGTGGGTTCCTGGGGTATGC GTGAAGAATCTGGTAAAGATTTTTGAGCCCTGTGGCCGGCCAGCTGTGGACCGTCTGAACAT CACCTTCTACGAGAACCAGATCACCGCATTCCTGGGCCACAATGGAGCTGGGAAAACCACCA CCTT (SEQIDNo. 9)

Señal donante de ruptura

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACA GAGAAGACTCTTGCGTTTCT (SEQIDNo. 1)

AK

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGC GAATTTTAACAAAAT (SEQIDNo. 3)

ITR2 derecha (o 5' ITR2)

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGC GCGCAG (SEQIDNo. 10)

Secuencia de longitud completa de pZac2.1-CMV-ABCA4_5'AK

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGG GTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAG ATCTTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGC TATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCC AATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGT CATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCT GGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAAC GCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGG CAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGG CCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTA CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGAT AGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTT TGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAAT GGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGA TCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCT GACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTAT CAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGAC TCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACA GGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATA GGCTAGCCTCGAGAATTCACGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCGCCATGGGCT TCGTGAGACAGATACAGCTTTTGCTCTGGAAGAACTGGACCCTGCGGAAAAGGCAAAAGATT CGCTTTGTGGTGGAACTCGTGTGGCCTTTATCTTTATTTCTGGTCTTGATCTGGTTAAGGAA TGCCAACCCGCTCTACAGCCATCATGAATGCCATTTCCCCAACAAGGCGATGCCCTCAGCAG GAATGCTGCCGTGGCTCCAGGGGATCTTCTGCAATGTGAACAATCCCTGTTTTCAAAGCCCC ACCCCAGGAGAATCTCCTGGAATTGTGTCAAACTATAACAACTCCATCTTGGCAAGGGTATA TCGAGATTTTCAAGAACTCCTCATGAATGCACCAGAGAGCCAGCACCTTGGCCGTATTTGGA CAGAGCTACACATCTTGTCCCAATTCATGGACACCCTCCGGACTCACCCGGAGAGAATTGCA GGAAGAGGAATTCGAATAAGGGATATCTTGAAAGATGAAGAAACACTGACACTATTTCTCAT TAAAAACATCGGCCTGTCTGACTCAGTGGTCTACCTTCTGATCAACTCTCAAGTCCGTCCAG AGCAGTTCGCTCATGGAGTCCCGGACCTGGCGCTGAAGGACATCGCCTGCAGCGAGGCCCTC CTGGAGCGCTTCATCATCTTCAGCCAGAGACGCGGGGCAAAGACGGTGCGCTATGCCCTGTG CTCCCTCTCCCAGGGCACCCTACAGTGGATAGAAGACACTCTGTATGCCAACGTGGACTTCT TCAAGCTCTTCCGTGTGCTTCCCACACTCCTAGACAGCCGTTCTCAAGGTATCAATCTGAGA TCTTGGGGAGGAATATTATCTGATATGTCACCAAGAATTCAAGAGTTTATCCATCGGCCGAG TATGCAGGACTTGCTGTGGGTGACCAGGCCCCTCATGCAGAATGGTGGTCCAGAGACCTTTA CAAAGCTGATGGGCATCCTGTCTGACCTCCTGTGTGGCTACCCCGAGGGAGGTGGCTCTCGG GTGCTCTCCTTCAACTGGTATGAAGACAATAACTATAAGGCCTTTCTGGGGATTGACTCCAC AAGGAAGGATCCTATCTATTCTTATGACAGAAGAACAACATCCTTTTGTAATGCATTGATCC AGAGCCTGGAGTCAAATCCTTTAACCAAAATCGCTTGGAGGGCGGCAAAGCCTTTGCTGATG GGAAAAATCCTGTACACTCCTGATTCACCTGCAGCACGAAGGATACTGAAGAATGCCAACTC AAC T T T T GAAGAAC T G GAACAC G T T AGGAAG T T GG T CAAAG C C T G G GAAGAAG TAGGGCCCC AGATCTGGTACTTCTTTGACAACAGCACACAGATGAACATGATCAGAGATACCCTGGGGAAC CCAACAGTAAAAGACTTTTTGAATAGGCAGCTTGGTGAAGAAGGTATTACTGCTGAAGCCAT CCTAAACTTCCTCTACAAGGGCCCTCGGGAAAGCCAGGCTGACGACATGGCCAACTTCGACT GGAGGGACATATTTAACATCACTGATCGCACCCTCCGCCTTGTCAATCAATACCTGGAGTGC TTGGTCCTGGATAAGTTTGAAAGCTACAATGATGAAACTCAGCTCACCCAACGTGCCCTCTC TCTACTGGAGGAAAACATGTTCTGGGCCGGAGTGGTATTCCCTGACATGTATCCCTGGACCA GCTCTCTACCACCCCACGTGAAGTATAAGATCCGAATGGACATAGACGTGGTGGAGAAAACC AATAAGATTAAAGACAGGTATTGGGATTCTGGTCCCAGAGCTGATCCCGTGGAAGATTTCCG GTACATCTGGGGCGGGTTTGCCTATCTGCAGGACATGGTTGAACAGGGGATCACAAGGAGCC AGGTGCAGGCGGAGGCTCCAGTTGGAATCTACCTCCAGCAGATGCCCTACCCCTGCTTCGTG GACGATTCTTTCATGATCATCCTGAACCGCTGTTTCCCTATCTTCATGGTGCTGGCATGGAT CTACTCTGTCTCCATGACTGTGAAGAGCATCGTCTTGGAGAAGGAGTTGCGACTGAAGGAGA CCTTGAAAAATCAGGGTGTCTCCAATGCAGTGATTTGGTGTACCTGGTTCCTGGACAGCTTC TCCATCATGTCGATGAGCATCTTCCTCCTGACGATATTCATCATGCATGGAAGAATCCTACA TTACAGCGACCCATTCATCCTCTTCCTGTTCTTGTTGGCTTTCTCCACTGCCACCATCATGC TGTGCTTTCTGCTCAGCACCTTCTTCTCCAAGGCCAGTCTGGCAGCAGCCTGTAGTGGTGTC ATCTATTTCACCCTCTACCTGCCACACATCCTGTGCTTCGCCTGGCAGGACCGCATGACCGC TGAGCTGAAGAAGGCTGTGAGCTTACTGTCTCCGGTGGCATTTGGATTTGGCACTGAGTACC TGGTTCGCTTTGAAGAGCAAGGCCTGGGGCTGCAGTGGAGCAACATCGGGAACAGTCCCACG GAAGGGGACGAATTCAGCTTCCTGCTGTCCATGCAGATGATGCTCCTTGATGCTGCTGTCTA TGGCTTACTCGCTTGGTACCTTGATCAGGTGTTTCCAGGAGACTATGGAACCCCACTTCCTT GGTACTTTCTTCTACAAGAGTCGTATTGGCTTGGCGGTGAAGGGTGTTCAACCAGAGAAGAA AGAGCCCTGGAAAAGACCGAGCCCCTAACAGAGGAAACGGAGGATCCAGAGCACCCAGAAGG AATACACGACTCCTTCTTTGAACGTGAGCATCCAGGGTGGGTTCCTGGGGTATGCGTGAAGA ATCTGGTAAAGATTTTTGAGCCCTGTGGCCGGCCAGCTGTGGACCGTCTGAACATCACCTTC TACGAGAACCAGATCACCGCATTCCTGGGCCACAATGGAGCTGGGAAAACCACCACCTTGTA AGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAG AAGACTCTTGCGTTTCTGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATT TAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTT TCCAATTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCA CTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGC GAGCGAGCGCGCAG (S E Q ID N o .il)

pZac2.1-ABCA4_3'AK_SV40

ITR2 izquierda

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGG GTTCCT (SEQIDNo. 4)

AK

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGC GAATTTTAACAAAAT (SEQ ID No. 3)

Señal aceptora de ruptura

GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (SEQ ID NO:2)

Abca4_3'

GTCCATCCTGACGGGTCTGTTGCCACCAACCTCTGGGACTGTGCTCGTTGGGGGAAGGGACA TTGAAACCAGCCTGGATGCAGTCCGGCAGAGCCTTGGCATGTGTCCACAGCACAACATCCTG TTCCACCACCTCACGGTGGCTGAGCACATGCTGTTCTATGCCCAGCTGAAAGGAAAGTCCCA GGAGGAGGCCCAGCTGGAGATGGAAGCCATGTTGGAGGACACAGGCCTCCACCACAAGCGGA ATGAAGAGGCTCAGGACCTATCAGGTGGCATGCAGAGAAAGCTGTCGGTTGCCATTGCCTTT GTGGGAGATGCCAAGGTGGTGATTCTGGACGAACCCACCTCTGGGGTGGACCCTTACTCGAG ACGCTCAATCTGGGATCTGCTCCTGAAGTATCGCTCAGGCAGAACCATCATCATGTCCACTC ACCACATGGACGAGGCCGACCTCCTTGGGGACCGCATTGCCATCATTGCCCAGGGAAGGCTC TACTGCTCAGGCACCCCACTCTTCCTGAAGAACTGCTTTGGCACAGGCTTGTACTTAACCTT GGTGCGCAAGATGAAAAACATCCAGAGCCAAAGGAAAGGCAGTGAGGGGACCTGCAGCTGCT CGTCTAAGGGTTTCTCCACCACGTGTCCAGCCCACGTCGATGACCTAACTCCAGAACAAGTC CTGGATGGGGATGTAAATGAGCTGATGGATGTAGTTCTCCACCATGTTCCAGAGGCAAAGCT GGTGGAGTGCATTGGTCAAGAACTTATCTTCCTTCTTCCAAATAAGAACTTCAAGCACAGAG CATATGCCAGCCTTTTCAGAGAGCTGGAGGAGACGCTGGCTGACCTTGGTCTCAGCAGTTTT GGAATTTCTGACACTCCCCTGGAAGAGATTTTTCTGAAGGTCACGGAGGATTCTGATTCAGG ACCTCTGTTTGCGGGTGGCGCTCAGCAGAAAAGAGAAAACGTCAACCCCCGACACCCCTGCT TGGGTCCCAGAGAGAAGGCTGGACAGACACCCCAGGACTCCAATGTCTGCTCCCCAGGGGCG CCGGCTGCTCACCCAGAGGGCCAGCCTCCCCCAGAGCCAGAGTGCCCAGGCCCGCAGCTCAA CACGGGGACACAGCTGGTCCTCCAGCATGTGCAGGCGCTGCTGGTCAAGAGATTCCAACACA CCATCCGCAGCCACAAGGACTTCCTGGCGCAGATCGTGCTCCCGGCTACCTTTGTGTTTTTG GCTCTGATGCTTTCTATTGTTATCCCTCCTTTTGGCGAATACCCCGCTTTGACCCTTCACCC CTGGATATATGGGCAGCAGTACACCTTCTTCAGCATGGATGAACCAGGCAGTGAGCAGTTCA CGGTACTTGCAGACGTCCTCCTGAATAAGCCAGGCTTTGGCAACCGCTGCCTGAAGGAAGGG TGGCTTCCGGAGTACCCCTGTGGCAACTCAACACCCTGGAAGACTCCTTCTGTGTCCCCAAA CATCACCCAGCTGTTCCAGAAGCAGAAATGGACACAGGTCAACCCTTCACCATCCTGCAGGT GCAGCACCAGGGAGAAGCTCACCATGCTGCCAGAGTGCCCCGAGGGTGCCGGGGGCCTCCCG CCCCCCCAGAGAACACAGCGCAGCACGGAAATTCTACAAGACCTGACGGACAGGAACATCTC CGACTTCTTGGTAAAAACGTATCCTGCTCTTATAAGAAGCAGCTTAAAGAGCAAATTCTGGG TCAATGAACAGAGGTATGGAGGAATTTCCATTGGAGGAAAGCTCCCAGTCGTCCCCATCACG GGGGAAGCACTTGTTGGGTTTTTAAGCGACCTTGGCCGGATCATGAATGTGAGCGGGGGCCC TATCACTAGAGAGGCCTCTAAAGAAATACCTGATTTCCTTAAACATCTAGAAACTGAAGACA ACATTAAGGTGTGGTTTAATAACAAAGGCTGGCATGCCCTGGTCAGCTTTCTCAATGTGGCC CACAACGCCATCTTACGGGCCAGCCTGCCTAAGGACAGAAGCCCCGAGGAGTATGGAATCAC CGTCATTAGCCAACCCCTGAACCTGACCAAGGAGCAGCTCTCAGAGATTACAGTGCTGACCA CTTCAGTGGATGCTGTGGTTGCCATCTGCGTGATTTTCTCCATGTCCTTCGTCCCAGCCAGC TTTGTCCTTTATTTGATCCAGGAGCGGGTGAACAAATCCAAGCACCTCCAGTTTATCAGTGG AGTGAGCCCCACCACCTACTGGGTAACCAACTTCCTCTGGGACATCATGAATTATTCCGTGA GTGCTGGGCTGGTGGTGGGCATCTTCATCGGGTTTCAGAAGAAAGCCTACACTTCTCCAGAA AACCTTCCTGCCCTTGTGGCACTGCTCCTGCTGTATGGATGGGCGGTCATTCCCATGATGTA CCCAGCATCCTTCCTGTTTGATGTCCCCAGCACAGCCTATGTGGCTTTATCTTGTGCTAATC TGTTCATCGGCATCAACAGCAGTGCTATTACCTTCATCTTGGAATTATTTGAGAATAACCGG ACGCTGCTCAGGTTCAACGCCGTGCTGAGGAAGCTGCTCATTGTCTTCCCCCACTTCTGCCT GGGCCGGGGCCTCATTGACCTTGCACTGAGCCAGGCTGTGACAGATGTCTATGCCCGGTTTG GTGAGGAGCACTCTGCAAATCCGTTCCACTGGGACCTGATTGGGAAGAACCTGTTTGCCATG GTGGTGGAAGGGGTGGTGTACTTCCTCCTGACCCTGCTGGTCCAGCGCCACTTCTTCCTCTC CCAATGGATTGCCGAGCCCACTAAGGAGCCCATTGTTGATGAAGATGATGATGTGGCTGAAG AAAGACAAAGAATTATTACTGGTGGAAATAAAACTGACATCTTAAGGCTACATGAACTAACC AAGATTTATCCAGGCACCTCCAGCCCAGCAGTGGACAGGCTGTGTGTCGGAGTTCGCCCTGG AGAGTGCTTTGGCCTCCTGGGAGTGAATGGTGCCGGCAAAACAACCACATTCAAGATGCTCA CTGGGGACACCACAGTGACCTCAGGGGATGCCACCGTAGCAGGCAAGAGTATTTTAACCAAT ATTTCTGAAGTCCATCAAAATATGGGCTACTGTCCTCAGTTTGATGCAATCGATGAGCTGCT CACAGGACGAGAACATCTTTACCTTTATGCCCGGCTTCGAGGTGTACCAGCAGAAGAAATCG AAAAGGTTGCAAACTGGAGTATTAAGAGCCTGGGCCTGACTGTCTACGCCGACTGCCTGGCT GGCACGTACAGTGGGGGCAACAAGCGGAAACTCTCCACAGCCATCGCACTCATTGGCTGCCC ACCGCTGGTGCTGCTGGATGAGCCCACCACAGGGATGGACCCCCAGGCACGCCGCATGCTGT GGAACGTCATCGTGAGCATCATCAGAGAAGGGAGGGCTGTGGTCCTCACATCCCACAGCATG GAAGAATGTGAGGCACTGTGTACCCGGCTGGCCATCATGGTAAAGGGCGCCTTTCGATGTAT GGGCACCATTCAGCATCTCAAGTCCAAATTTGGAGATGGCTATATCGTCACAATGAAGATCA AATCCCCGAAGGACGACCTGCTTCCTGACCTGAACCCTGTGGAGCAGTTCTTCCAGGGGAAC TTCCCAGGCAGTGTGCAGAGGGAGAGGCACTACAACATGCTCCAGTTCCAGGTCTCCTCCTC CTCCCTGGCGAGGATCTTCCAGCTCCTCCTCTCCCACAAGGACAGCCTGCTCATCGAGGAGT ACTCAGTCACACAGACCACACTGGACCAGGTGTTTGTAAATTTTGCTAAACAGCAGACTGAA AGTCATGACCTCCCTCTGCACCCTCGAGCTGCTGGAGCCAGTCGACAAGCCCAGGACGACTA CAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGT GAGCGGCCGC (SEQIDNo. 12)

poliA de Sv40

T TCGAGCAGACATGATAAGATACAT T GAT GAGTTT GGACAAACCACAAC TAGAAT GCAGT GA AAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTG CAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGT GGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCTTCCT AGAGCATGGCTAC (SEQIDNo. 13)

ITR2 derecha

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGC GCGCAG (SEQIDNo. 10)

ITR5 derecha

TCACTGCTTACAAAACCCCCTTGCTTGAGAGTGTGGCACTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTC GCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGCGACGGCCAGAGGGCCGTCGTCTGGCAGCTCTTTGAGCT GCCACCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCGACAGGGGGGAGAG (SEQ ID No.

14)

Secuencia de longitud completa de pZac2.1-ABCA4_3'AK_SV40

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGG GTTCCTGGATCCGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACA AAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGAT AGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTCCATCCTGACGG GTCTGTTGCCACCAACCTCTGGGACTGTGCTCGTTGGGGGAAGGGACATTGAAACCAGCCTG GATGCAGTCCGGCAGAGCCTTGGCATGTGTCCACAGCACAACATCCTGTTCCACCACCTCAC GGTGGCTGAGCACATGCTGTTCTATGCCCAGCTGAAAGGAAAGTCCCAGGAGGAGGCCCAGC TGGAGATGGAAGCCATGTTGGAGGACACAGGCCTCCACCACAAGCGGAATGAAGAGGCTCAG GACCTATCAGGTGGCATGCAGAGAAAGCTGTCGGTTGCCATTGCCTTTGTGGGAGATGCCAA GGTGGTGATTCTGGACGAACCCACCTCTGGGGTGGACCCTTACTCGAGACGCTCAATCTGGG ATCTGCTCCTGAAGTATCGCTCAGGCAGAACCATCATCATGTCCACTCACCACATGGACGAG GCCGACCTCCTTGGGGACCGCATTGCCATCATTGCCCAGGGAAGGCTCTACTGCTCAGGCAC CCCACTCTTCCTGAAGAACTGCTTTGGCACAGGCTTGTACTTAACCTTGGTGCGCAAGATGA AAAACATCCAGAGCCAAAGGAAAGGCAGTGAGGGGACCTGCAGCTGCTCGTCTAAGGGTTTC TCCACCACGTGTCCAGCCCACGTCGATGACCTAACTCCAGAACAAGTCCTGGATGGGGATGT AAATGAGCTGATGGATGTAGTTCTCCACCATGTTCCAGAGGCAAAGCTGGTGGAGTGCATTG GTCAAGAACTTATCTTCCTTCTTCCAAATAAGAACTTCAAGCACAGAGCATATGCCAGCCTT TTCAGAGAGCTGGAGGAGACGCTGGCTGACCTTGGTCTCAGCAGTTTTGGAATTTCTGACAC TCCCCTGGAAGAGATTTTTCTGAAGGTCACGGAGGATTCTGATTCAGGACCTCTGTTTGCGG GTGGCGCTCAGCAGAAAAGAGAAAACGTCAACCCCCGACACCCCTGCTTGGGTCCCAGAGAG AAGGCTGGACAGACACCCCAGGACTCCAATGTCTGCTCCCCAGGGGCGCCGGCTGCTCACCC AGAGGGCCAGCCTCCCCCAGAGCCAGAGTGCCCAGGCCCGCAGCTCAACACGGGGACACAGC TGGTCCTCCAGCATGTGCAGGCGCTGCTGGTCAAGAGATTCCAACACACCATCCGCAGCCAC AAGGACTTCCTGGCGCAGATCGTGCTCCCGGCTACCTTTGTGTTTTTGGCTCTGATGCTTTC TATTGTTATCCCTCCTTTTGGCGAATACCCCGCTTTGACCCTTCACCCCTGGATATATGGGC AGCAGTACACCTTCTTCAGCATGGATGAACCAGGCAGTGAGCAGTTCACGGTACTTGCAGAC GTCCTCCTGAATAAGCCAGGCTTTGGCAACCGCTGCCTGAAGGAAGGGTGGCTTCCGGAGTA CCCCTGTGGCAACTCAACACCCTGGAAGACTCCTTCTGTGTCCCCAAACATCACCCAGCTGT TCCAGAAGCAGAAATGGACACAGGTCAACCCTTCACCATCCTGCAGGTGCAGCACCAGGGAG AAGCTCACCATGCTGCCAGAGTGCCCCGAGGGTGCCGGGGGCCTCCCGCCCCCCCAGAGAAC ACAGCGCAGCACGGAAATTCTACAAGACCTGACGGACAGGAACATCTCCGACTTCTTGGTAA AAACGTATCCTGCTCTTATAAGAAGCAGCTTAAAGAGCAAATTCTGGGTCAATGAACAGAGG TATGGAGGAATTTCCATTGGAGGAAAGCTCCCAGTCGTCCCCATCACGGGGGAAGCACTTGT TGGGTTTTTAAGCGACCTTGGCCGGATCATGAATGTGAGCGGGGGCCCTATCACTAGAGAGG CCTCTAAAGAAATACCTGATTTCCTTAAACATCTAGAAACTGAAGACAACATTAAGGTGTGG TTTAATAACAAAGGCTGGCATGCCCTGGTCAGCTTTCTCAATGTGGCCCACAACGCCATCTT ACGGGCCAGCCTGCCTAAGGACAGAAGCCCCGAGGAGTATGGAATCACCGTCATTAGCCAAC CCCTGAACCTGACCAAGGAGCAGCTCTCAGAGATTACAGTGCTGACCACTTCAGTGGATGCT GTGGTTGCCATCTGCGTGATTTTCTCCATGTCCTTCGTCCCAGCCAGCTTTGTCCTTTATTT GATCCAGGAGCGGGTGAACAAATCCAAGCACCTCCAGTTTATCAGTGGAGTGAGCCCCACCA CCTACTGGGTAACCAACTTCCTCTGGGACATCATGAATTATTCCGTGAGTGCTGGGCTGGTG GTGGGCATCTTCATCGGGTTTCAGAAGAAAGCCTACACTTCTCCAGAAAACCTTCCTGCCCT TGTGGCACTGCTCCTGCTGTATGGATGGGCGGTCATTCCCATGATGTACCCAGCATCCTTCC TGTTTGATGTCCCCAGCACAGCCTATGTGGCTTTATCTTGTGCTAATCTGTTCATCGGCATC AACAGCAGTGCTATTACCTTCATCTTGGAATTATTTGAGAATAACCGGACGCTGCTCAGGTT CAACGCCGTGCTGAGGAAGCTGCTCATTGTCTTCCCCCACTTCTGCCTGGGCCGGGGCCTCA TTGACCTTGCACTGAGCCAGGCTGTGACAGATGTCTATGCCCGGTTTGGTGAGGAGCACTCT GCAAATCCGTTCCACTGGGACCTGATTGGGAAGAACCTGTTTGCCATGGTGGTGGAAGGGGT GGTGTACTTCCTCCTGACCCTGCTGGTCCAGCGCCACTTCTTCCTCTCCCAATGGATTGCCG AGCCCACTAAGGAGCCCATTGTTGATGAAGATGATGATGTGGCTGAAGAAAGACAAAGAATT ATTACTGGTGGAAATAAAACTGACATCTTAAGGCTACATGAACTAACCAAGATTTATCCAGG CACCTCCAGCCCAGCAGTGGACAGGCTGTGTGTCGGAGTTCGCCCTGGAGAGTGCTTTGGCC TCCTGGGAGTGAATGGTGCCGGCAAAACAACCACATTCAAGATGCTCACTGGGGACACCACA GTGACCTCAGGGGATGCCACCGTAGCAGGCAAGAGTATTTTAACCAATATTTCTGAAGTCCA TCAAAATATGGGCTACTGTCCTCAGTTTGATGCAATCGATGAGCTGCTCACAGGACGAGAAC ATCTTTACCTTTATGCCCGGCTTCGAGGTGTACCAGCAGAAGAAATCGAAAAGGTTGCAAAC TGGAGTATTAAGAGCCTGGGCCTGACTGTCTACGCCGACTGCCTGGCTGGCACGTACAGTGG GGGCAACAAGCGGAAACTCTCCACAGCCATCGCACTCATTGGCTGCCCACCGCTGGTGCTGC TGGATGAGCCCACCACAGGGATGGACCCCCAGGCACGCCGCATGCTGTGGAACGTCATCGTG AGCATCATCAGAGAAGGGAGGGCTGTGGTCCTCACATCCCACAGCATGGAAGAATGTGAGGC ACTGTGTACCCGGCTGGCCATCATGGTAAAGGGCGCCTTTCGATGTATGGGCACCATTCAGC ATCTCAAGTCCAAATTTGGAGATGGCTATATCGTCACAATGAAGATCAAATCCCCGAAGGAC GACCTGCTTCCTGACCTGAACCCTGTGGAGCAGTTCTTCCAGGGGAACTTCCCAGGCAGTGT GCAGAGGGAGAGGCACTACAACATGCTCCAGTTCCAGGTCTCCTCCTCCTCCCTGGCGAGGA TCTTCCAGCTCCTCCTCTCCCACAAGGACAGCCTGCTCATCGAGGAGTACTCAGTCACACAG ACCACACTGGACCAGGTGTTTGTAAATTTTGCTAAACAGCAGACTGAAAGTCATGACCTCCC TCTGCACCCTCGAGCTGCTGGAGCCAGTCGACAAGCCCAGGACTGAGCGGCCGCTTCGAGCA GACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATG CTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAAC AAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTT TTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATG GCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAG TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCG ACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID No. 15)

pZac2.1-CMV-ABCA4_5'TS

Secuencia de longitud completa de pZac2.1-CMV-ABCA4_5'TS

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGG GTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAG ATCTTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGC TATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCC AATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGT CATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCT GGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAAC GCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGG CAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGG CCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTA CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGAT AGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTT TGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAAT GGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGA TCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCT GACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTAT CAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGAC TCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACA GGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATA GGCTAGCCTCGAGAATTCACGCGTGGTACCTCTAGAGTCGACCCGGGCGGCCGCCATGGGCT TCGTGAGACAGATACAGCTTTTGCTCTGGAAGAACTGGACCCTGCGGAAAAGGCAAAAGATT CGCTTTGTGGTGGAACTCGTGTGGCCTTTATCTTTATTTCTGGTCTTGATCTGGTTAAGGAA TGCCAACCCGCTCTACAGCCATCATGAATGCCATTTCCCCAACAAGGCGATGCCCTCAGCAG GAATGCTGCCGTGGCTCCAGGGGATCTTCTGCAATGTGAACAATCCCTGTTTTCAAAGCCCC ACCCCAGGAGAATCTCCTGGAATTGTGTCAAACTATAACAACTCCATCTTGGCAAGGGTATA TCGAGATTTTCAAGAACTCCTCATGAATGCACCAGAGAGCCAGCACCTTGGCCGTATTTGGA CAGAGCTACACATCTTGTCCCAATTCATGGACACCCTCCGGACTCACCCGGAGAGAATTGCA GGAAGAGGAATTCGAATAAGGGATATCTTGAAAGATGAAGAAACACTGACACTATTTCTCAT TAAAAACATCGGCCTGTCTGACTCAGTGGTCTACCTTCTGATCAACTCTCAAGTCCGTCCAG AGCAGTTCGCTCATGGAGTCCCGGACCTGGCGCTGAAGGACATCGCCTGCAGCGAGGCCCTC CTGGAGCGCTTCATCATCTTCAGCCAGAGACGCGGGGCAAAGACGGTGCGCTATGCCCTGTG CTCCCTCTCCCAGGGCACCCTACAGTGGATAGAAGACACTCTGTATGCCAACGTGGACTTCT TCAAGCTCTTCCGTGTGCTTCCCACACTCCTAGACAGCCGTTCTCAAGGTATCAATCTGAGA TCTTGGGGAGGAATATTATCTGATATGTCACCAAGAATTCAAGAGTTTATCCATCGGCCGAG TATGCAGGACTTGCTGTGGGTGACCAGGCCCCTCATGCAGAATGGTGGTCCAGAGACCTTTA CAAAGCTGATGGGCATCCTGTCTGACCTCCTGTGTGGCTACCCCGAGGGAGGTGGCTCTCGG GTGCTCTCCTTCAACTGGTATGAAGACAATAACTATAAGGCCTTTCTGGGGATTGACTCCAC AAGGAAGGATCCTATCTATTCTTATGACAGAAGAACAACATCCTTTTGTAATGCATTGATCC AGAGCCTGGAGTCAAATCCTTTAACCAAAATCGCTTGGAGGGCGGCAAAGCCTTTGCTGATG GGAAAAATCCTGTACACTCCTGATTCACCTGCAGCACGAAGGATACTGAAGAATGCCAACTC AAC T T T T GAAGAAC T G GAACAC G T T AGGAAG T T GG T CAAAG C C T G G GAAGAAG TAGGGCCCC AGATCTGGTACTTCTTTGACAACAGCACACAGATGAACATGATCAGAGATACCCTGGGGAAC CCAACAGTAAAAGACTTTTTGAATAGGCAGCTTGGTGAAGAAGGTATTACTGCTGAAGCCAT CCTAAACTTCCTCTACAAGGGCCCTCGGGAAAGCCAGGCTGACGACATGGCCAACTTCGACT GGAGGGACATATTTAACATCACTGATCGCACCCTCCGCCTTGTCAATCAATACCTGGAGTGC TTGGTCCTGGATAAGTTTGAAAGCTACAATGATGAAACTCAGCTCACCCAACGTGCCCTCTC TCTACTGGAGGAAAACATGTTCTGGGCCGGAGTGGTATTCCCTGACATGTATCCCTGGACCA GCTCTCTACCACCCCACGTGAAGTATAAGATCCGAATGGACATAGACGTGGTGGAGAAAACC AATAAGATTAAAGACAGGTATTGGGATTCTGGTCCCAGAGCTGATCCCGTGGAAGATTTCCG GTACATCTGGGGCGGGTTTGCCTATCTGCAGGACATGGTTGAACAGGGGATCACAAGGAGCC AGGTGCAGGCGGAGGCTCCAGTTGGAATCTACCTCCAGCAGATGCCCTACCCCTGCTTCGTG GACGATTCTTTCATGATCATCCTGAACCGCTGTTTCCCTATCTTCATGGTGCTGGCATGGAT CTACTCTGTCTCCATGACTGTGAAGAGCATCGTCTTGGAGAAGGAGTTGCGACTGAAGGAGA CCTTGAAAAATCAGGGTGTCTCCAATGCAGTGATTTGGTGTACCTGGTTCCTGGACAGCTTC TCCATCATGTCGATGAGCATCTTCCTCCTGACGATATTCATCATGCATGGAAGAATCCTACA TTACAGCGACCCATTCATCCTCTTCCTGTTCTTGTTGGCTTTCTCCACTGCCACCATCATGC TGTGCTTTCTGCTCAGCACCTTCTTCTCCAAGGCCAGTCTGGCAGCAGCCTGTAGTGGTGTC ATCTATTTCACCCTCTACCTGCCACACATCCTGTGCTTCGCCTGGCAGGACCGCATGACCGC TGAGCTGAAGAAGGCTGTGAGCTTACTGTCTCCGGTGGCATTTGGATTTGGCACTGAGTACC TGGTTCGCTTTGAAGAGCAAGGCCTGGGGCTGCAGTGGAGCAACATCGGGAACAGTCCCACG GAAGGGGACGAATTCAGCTTCCTGCTGTCCATGCAGATGATGCTCCTTGATGCTGCTGTCTA TGGCTTACTCGCTTGGTACCTTGATCAGGTGTTTCCAGGAGACTATGGAACCCCACTTCCTT GGTACTTTCTTCTACAAGAGTCGTATTGGCTTGGCGGTGAAGGGTGTTCAACCAGAGAAGAA AGAGCCCTGGAAAAGACCGAGCCCCTAACAGAGGAAACGGAGGATCCAGAGCACCCAGAAGG AATACACGACTCCTTCTTTGAACGTGAGCATCCAGGGTGGGTTCCTGGGGTATGCGTGAAGA ATCTGGTAAAGATTTTTGAGCCCTGTGGCCGGCCAGCTGTGGACCGTCTGAACATCACCTTC TACGAGAACCAGATCACCGCATTCCTGGGCCACAATGGAGCTGGGAAAACCACCACCTTGTA AGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAG AAGACTCTTGCGTTTCTCAATTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGC GCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGG GCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID No. 16)

pZac2.1-ABCA4_3'TS_SV40

Secuencia de longitud completa de pZac2.1-ABCA4_3'TS_SV40

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGG GTTCCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTCCA TCCTGACGGGTCTGTTGCCACCAACCTCTGGGACTGTGCTCGTTGGGGGAAGGGACATTGAA ACCAGCCTGGATGCAGTCCGGCAGAGCCTTGGCATGTGTCCACAGCACAACATCCTGTTCCA CCACCTCACGGTGGCTGAGCACATGCTGTTCTATGCCCAGCTGAAAGGAAAGTCCCAGGAGG AGGCCCAGCTGGAGATGGAAGCCATGTTGGAGGACACAGGCCTCCACCACAAGCGGAATGAA GAGGCTCAGGACCTATCAGGTGGCATGCAGAGAAAGCTGTCGGTTGCCATTGCCTTTGTGGG AGATGCCAAGGTGGTGATTCTGGACGAACCCACCTCTGGGGTGGACCCTTACTCGAGACGCT CAATCTGGGATCTGCTCCTGAAGTATCGCTCAGGCAGAACCATCATCATGTCCACTCACCAC ATGGACGAGGCCGACCTCCTTGGGGACCGCATTGCCATCATTGCCCAGGGAAGGCTCTACTG CTCAGGCACCCCACTCTTCCTGAAGAACTGCTTTGGCACAGGCTTGTACTTAACCTTGGTGC GCAAGATGAAAAACATCCAGAGCCAAAGGAAAGGCAGTGAGGGGACCTGCAGCTGCTCGTCT AAGGGTTTCTCCACCACGTGTCCAGCCCACGTCGATGACCTAACTCCAGAACAAGTCCTGGA TGGGGATGTAAATGAGCTGATGGATGTAGTTCTCCACCATGTTCCAGAGGCAAAGCTGGTGG AGTGCATTGGTCAAGAACTTATCTTCCTTCTTCCAAATAAGAACTTCAAGCACAGAGCATAT GCCAGCCTTTTCAGAGAGCTGGAGGAGACGCTGGCTGACCTTGGTCTCAGCAGTTTTGGAAT TTCTGACACTCCCCTGGAAGAGATTTTTCTGAAGGTCACGGAGGATTCTGATTCAGGACCTC TGTTTGCGGGTGGCGCTCAGCAGAAAAGAGAAAACGTCAACCCCCGACACCCCTGCTTGGGT CCCAGAGAGAAGGCTGGACAGACACCCCAGGACTCCAATGTCTGCTCCCCAGGGGCGCCGGC TGCTCACCCAGAGGGCCAGCCTCCCCCAGAGCCAGAGTGCCCAGGCCCGCAGCTCAACACGG GGACACAGCTGGTCCTCCAGCATGTGCAGGCGCTGCTGGTCAAGAGATTCCAACACACCATC CGCAGCCACAAGGACTTCCTGGCGCAGATCGTGCTCCCGGCTACCTTTGTGTTTTTGGCTCT GATGCTTTCTATTGTTATCCCTCCTTTTGGCGAATACCCCGCTTTGACCCTTCACCCCTGGA TATATGGGCAGCAGTACACCTTCTTCAGCATGGATGAACCAGGCAGTGAGCAGTTCACGGTA CTTGCAGACGTCCTCCTGAATAAGCCAGGCTTTGGCAACCGCTGCCTGAAGGAAGGGTGGCT TCCGGAGTACCCCTGTGGCAACTCAACACCCTGGAAGACTCCTTCTGTGTCCCCAAACATCA CCCAGCTGTTCCAGAAGCAGAAATGGACACAGGTCAACCCTTCACCATCCTGCAGGTGCAGC ACCAGGGAGAAGCTCACCATGCTGCCAGAGTGCCCCGAGGGTGCCGGGGGCCTCCCGCCCCC CCAGAGAACACAGCGCAGCACGGAAATTCTACAAGACCTGACGGACAGGAACATCTCCGACT TCTTGGTAAAAACGTATCCTGCTCTTATAAGAAGCAGCTTAAAGAGCAAATTCTGGGTCAAT GAACAGAGGTATGGAGGAATTTCCATTGGAGGAAAGCTCCCAGTCGTCCCCATCACGGGGGA AGCACTTGTTGGGTTTTTAAGCGACCTTGGCCGGATCATGAATGTGAGCGGGGGCCCTATCA CTAGAGAGGCCTCTAAAGAAATACCTGATTTCCTTAAACATCTAGAAACTGAAGACAACATT AAGGTGTGGTTTAATAACAAAGGCTGGCATGCCCTGGTCAGCTTTCTCAATGTGGCCCACAA CGCCATCTTACGGGCCAGCCTGCCTAAGGACAGAAGCCCCGAGGAGTATGGAATCACCGTCA TTAGCCAACCCCTGAACCTGACCAAGGAGCAGCTCTCAGAGATTACAGTGCTGACCACTTCA GTGGATGCTGTGGTTGCCATCTGCGTGATTTTCTCCATGTCCTTCGTCCCAGCCAGCTTTGT CCTTTATTTGATCCAGGAGCGGGTGAACAAATCCAAGCACCTCCAGTTTATCAGTGGAGTGA GCCCCACCACCTACTGGGTAACCAACTTCCTCTGGGACATCATGAATTATTCCGTGAGTGCT GGGCTGGTGGTGGGCATCTTCATCGGGTTTCAGAAGAAAGCCTACACTTCTCCAGAAAACCT TCCTGCCCTTGTGGCACTGCTCCTGCTGTATGGATGGGCGGTCATTCCCATGATGTACCCAG CATCCTTCCTGTTTGATGTCCCCAGCACAGCCTATGTGGCTTTATCTTGTGCTAATCTGTTC ATCGGCATCAACAGCAGTGCTATTACCTTCATCTTGGAATTATTTGAGAATAACCGGACGCT GCTCAGGTTCAACGCCGTGCTGAGGAAGCTGCTCATTGTCTTCCCCCACTTCTGCCTGGGCC GGGGCCTCATTGACCTTGCACTGAGCCAGGCTGTGACAGATGTCTATGCCCGGTTTGGTGAG GAGCACTCTGCAAATCCGTTCCACTGGGACCTGATTGGGAAGAACCTGTTTGCCATGGTGGT GGAAGGGGTGGTGTACTTCCTCCTGACCCTGCTGGTCCAGCGCCACTTCTTCCTCTCCCAAT GGATTGCCGAGCCCACTAAGGAGCCCATTGTTGATGAAGATGATGATGTGGCTGAAGAAAGA CAAAGAATTATTACTGGTGGAAATAAAACTGACATCTTAAGGCTACATGAACTAACCAAGAT TTATCCAGGCACCTCCAGCCCAGCAGTGGACAGGCTGTGTGTCGGAGTTCGCCCTGGAGAGT GCTTTGGCCTCCTGGGAGTGAATGGTGCCGGCAAAACAACCACATTCAAGATGCTCACTGGG GACACCACAGTGACCTCAGGGGATGCCACCGTAGCAGGCAAGAGTATTTTAACCAATATTTC TGAAGTCCATCAAAATATGGGCTACTGTCCTCAGTTTGATGCAATCGATGAGCTGCTCACAG GACGAGAACATCTTTACCTTTATGCCCGGCTTCGAGGTGTACCAGCAGAAGAAATCGAAAAG GTTGCAAACTGGAGTATTAAGAGCCTGGGCCTGACTGTCTACGCCGACTGCCTGGCTGGCAC GTACAGTGGGGGCAACAAGCGGAAACTCTCCACAGCCATCGCACTCATTGGCTGCCCACCGC TGGTGCTGCTGGATGAGCCCACCACAGGGATGGACCCCCAGGCACGCCGCATGCTGTGGAAC GTCATCGTGAGCATCATCAGAGAAGGGAGGGCTGTGGTCCTCACATCCCACAGCATGGAAGA ATGTGAGGCACTGTGTACCCGGCTGGCCATCATGGTAAAGGGCGCCTTTCGATGTATGGGCA CCATTCAGCATCTCAAGTCCAAATTTGGAGATGGCTATATCGTCACAATGAAGATCAAATCC CCGAAGGACGACCTGCTTCCTGACCTGAACCCTGTGGAGCAGTTCTTCCAGGGGAACTTCCC AGGCAGTGTGCAGAGGGAGAGGCACTACAACATGCTCCAGTTCCAGGTCTCCTCCTCCTCCC TGGCGAGGATCTTCCAGCTCCTCCTCTCCCACAAGGACAGCCTGCTCATCGAGGAGTACTCA GTCACACAGACCACACTGGACCAGGTGTTTGTAAATTTTGCTAAACAGCAGACTGAAAGTCA TGACCTCCCTCTGCACCCTCGAGCTGCTGGAGCCAGTCGACAAGCCCAGGACTGAGCGGCCG CTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG AAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCT GCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATG TGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCTTCC TAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTA GTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAA GGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID No. 17)

MYO7A

pAAV2.1 -CBA-MYO7A_5'AK

5' ITR2

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGC GCGCAG (SEQIDNo. 10)

ITR5 izquierda

CTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGTGGCAGCTCAAAGAG CTGCCAGACGACGGCCCTCTGGCCGTCGCCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCG ACAGGGGGGAGAGTGCCACACTCTCAAGCAAGGGGGTTTTGTAAGCAGTGA (SEQ ID No.

18)

Potenciador de CMV

GCTAGCGTGCCACCTGGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG GTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGC CTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTA ACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTT GGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAAT GGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATC TACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG (SEQ ID No. 19)

Promotor de CBA

TCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATT TTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCG CGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCA GCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCC CTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGG (SEQ ID No. 20)

Intrón de SV40

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACA GAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTC TCTCCACAG (SEQ ID No. 21)

CDS de 5'hMYO7A

ATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGATTGGGGCAGGAGTTCGA CGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTCCAGGTGGTGGATGATG AAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAAGCCTATGCACCCCACG TCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACGAGGCGGGCATCTTGCG CAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACGGGCTCCATCCTGGTGG CTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACATCCGCCAGTATACCAAC AAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACAACTGCTACTTCAACAT GAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCTGGGGCCGGGAAGACGG AGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCAGCACTCGTGGATTGAG CAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATGCCAAGACCATCCGCAA TGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAACAAGCGGGGCGCCATCG AGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTGTCGCCAGGCCCTGGAT GAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGCATGAGTGAGGATCAGAAGAAGAA GCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGTAACTGCATAACCTGTG AGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCATGAAGGTGCTCATGTTC ACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCCTGCACCTGGGCAACCT GCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTTCTCTTCTCCCCATCGC TGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGATGAGCTGCCTGACTAGC CGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCAGGGAACAGGCACTGGA CGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTGTGGATTGTGGACAAGA TCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTCTCGCAGGTCCATCGGC CTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTGAGCAGCTCTGCATCAA CTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTCAAGCTGGAGCAGGAGG AATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGACAACCAGGATGCCCTG GACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATGAGGAGAGCAAGTTCCC CAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCACAAGCTCAACGCCAACT ACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCATTTTGCAGGCATCGTC TACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGCATGGGGACATTATCCA GCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAGGCCGATGTCGCCATGG GCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAAGCGGTCACTGGAGCTG CTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCATCAAGCCCAATGAGTT CAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTGCGGTACTCAGGAATGA TGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAGCTTCGTAGAGTTTGTG GAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGCAGGGCGACCTCCGCGG GACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGACTGGCAGATAGGCAAAA CCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGAGCGGGACAAAGCCATC ACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAGACAGGTCTAACTTTCT GAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGTCACAACTGTAGGAAGA ACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCACCGCTCCCGGAAGCTG CACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGGCCCGCTGCCGCGCCTA TCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACCGTGCAGGCCTATGCCC GGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTATCTGTGGCGCCTCGAG GCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGATGAGCGCCAAGAAGGC CAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTGGCTCGTGAGGACGCTG AGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCTCCTGGAGCAGATGGAA AGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGATGTTTGGCTTCCTGGG GACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGCTTTGAGGACCTGGAGC GAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCCCCTGCCTGACGAGGAT GAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCTACTTCCAGGGGACAAC TACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTACCATGACGACGAGGGTG ACCAGCTG (SEQ ID N o. 22)

Señal donante de ruptura

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACA GAGAAGACTCTTGCGTTTCT (SEQ ID N o. 1)

AK

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGC GAATTTTAACAAAAT (SEQ ID N o. 3)

3'ITR2

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGG GTTCCT (SEQ ID N o. 4)

Secuencia completa de pAAV2.1-CBA-MYO7A_5'AK

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGG GTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAG ATCCTAATCGGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCGTGCCACCTGGTCGACATTGATTATTGACTA GTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTT ACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTC AATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGG ACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCC CCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATG GGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTG AGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTT ATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGC GGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCA GAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAA AGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCA AGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTC TTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGG TGTCCAGGCGGCCGCCATGGTGATTCTTCAGCAGGGGGACCATGTGTGGATGGACCTGAGAT TGGGGCAGGAGTTCGACGTGCCCATCGGGGCGGTGGTGAAGCTCTGCGACTCTGGGCAGGTC CAGGTGGTGGATGATGAAGACAATGAACACTGGATCTCTCCGCAGAACGCAACGCACATCAA GCCTATGCACCCCACGTCGGTCCACGGCGTGGAGGACATGATCCGCCTGGGGGACCTCAACG AGGCGGGCATCTTGCGCAACCTGCTTATCCGCTACCGGGACCACCTCATCTACACGTATACG GGCTCCATCCTGGTGGCTGTGAACCCCTACCAGCTGCTCTCCATCTACTCGCCAGAGCACAT CCGCCAGTATACCAACAAGAAGATTGGGGAGATGCCCCCCCACATCTTTGCCATTGCTGACA ACTGCTACTTCAACATGAAACGCAACAGCCGAGACCAGTGCTGCATCATCAGTGGGGAATCT GGGGCCGGGAAGACGGAGAGCACAAAGCTGATCCTGCAGTTCCTGGCAGCCATCAGTGGGCA GCACTCGTGGATTGAGCAGCAGGTCTTGGAGGCCACCCCCATTCTGGAAGCATTTGGGAATG CCAAGACCATCCGCAATGACAACTCAAGCCGTTTCGGAAAGTACATCGACATCCACTTCAAC AAGCGGGGCGCCATCGAGGGCGCGAAGATTGAGCAGTACCTGCTGGAAAAGTCACGTGTCTG TCGCCAGGCCCTGGATGAAAGGAACTACCACGTGTTCTACTGCATGCTGGAGGGCATGAGTG AGGATCAGAAGAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGGGT AACTGCATAACCTGTGAGGGCCGGGTGGACAGCCAGGAGTACGCCAACATCCGCTCCGCCAT GAAGGTGCTCATGTTCACTGACACCGAGAACTGGGAGATCTCGAAGCTCCTGGCTGCCATCC TGCACCTGGGCAACCTGCAGTATGAGGCACGCACATTTGAAAACCTGGATGCCTGTGAGGTT CTCTTCTCCCCATCGCTGGCCACAGCTGCATCCCTGCTTGAGGTGAACCCCCCAGACCTGAT GAGCTGCCTGACTAGCCGCACCCTCATCACCCGCGGGGAGACGGTGTCCACCCCACTGAGCA GGGAACAGGCACTGGACGTGCGCGACGCCTTCGTAAAGGGGATCTACGGGCGGCTGTTCGTG TGGATTGTGGACAAGATCAACGCAGCAATTTACAAGCCTCCCTCCCAGGATGTGAAGAACTC TCGCAGGTCCATCGGCCTCCTGGACATCTTTGGGTTTGAGAACTTTGCTGTGAACAGCTTTG AGCAGCTCTGCATCAACTTCGCCAATGAGCACCTGCAGCAGTTCTTTGTGCGGCACGTGTTC AAGCTGGAGCAGGAGGAATATGACCTGGAGAGCATTGACTGGCTGCACATCGAGTTCACTGA CAACCAGGATGCCCTGGACATGATTGCCAACAAGCCCATGAACATCATCTCCCTCATCGATG AGGAGAGCAAGTTCCCCAAGGGCACAGACACCACCATGTTACACAAGCTGAACTCCCAGCAC AAGCTCAACGCCAACTACATCCCCCCCAAGAACAACCATGAGACCCAGTTTGGCATCAACCA TTTTGCAGGCATCGTCTACTATGAGACCCAAGGCTTCCTGGAGAAGAACCGAGACACCCTGC ATGGGGACATTATCCAGCTGGTCCACTCCTCCAGGAACAAGTTCATCAAGCAGATCTTCCAG GCCGATGTCGCCATGGGCGCCGAGACCAGGAAGCGCTCGCCCACACTTAGCAGCCAGTTCAA GCGGTCACTGGAGCTGCTGATGCGCACGCTGGGTGCCTGCCAGCCCTTCTTTGTGCGATGCA TCAAGCCCAATGAGTTCAAGAAGCCCATGCTGTTCGACCGGCACCTGTGCGTGCGCCAGCTG CGGTACTCAGGAATGATGGAGACCATCCGAATCCGCCGAGCTGGCTACCCCATCCGCTACAG CTTCGTAGAGTTTGTGGAGCGGTACCGTGTGCTGCTGCCAGGTGTGAAGCCGGCCTACAAGC AGGGCGACCTCCGCGGGACTTGCCAGCGCATGGCTGAGGCTGTGCTGGGCACCCACGATGAC TGGCAGATAGGCAAAACCAAGATCTTTCTGAAGGACCACCATGACATGCTGCTGGAAGTGGA GCGGGACAAAGCCATCACCGACAGAGTCATCCTCCTTCAGAAAGTCATCCGGGGATTCAAAG ACAGGTCTAACTTTCTGAAGCTGAAGAACGCTGCCACACTGATCCAGAGGCACTGGCGGGGT CACAACTGTAGGAAGAACTACGGGCTGATGCGTCTGGGCTTCCTGCGGCTGCAGGCCCTGCA CCGCTCCCGGAAGCTGCACCAGCAGTACCGCCTGGCCCGCCAGCGCATCATCCAGTTCCAGG CCCGCTGCCGCGCCTATCTGGTGCGCAAGGCCTTCCGCCACCGCCTCTGGGCTGTGCTCACC GTGCAGGCCTATGCCCGGGGCATGATCGCCCGCAGGCTGCACCAACGCCTCAGGGCTGAGTA TCTGTGGCGCCTCGAGGCTGAGAAAATGCGGCTGGCGGAGGAAGAGAAGCTTCGGAAGGAGA TGAGCGCCAAGAAGGCCAAGGAGGAGGCCGAGCGCAAGCATCAGGAGCGCCTGGCCCAGCTG GCTCGTGAGGACGCTGAGCGGGAGCTGAAGGAGAAGGAGGCCGCTCGGCGGAAGAAGGAGCT CCTGGAGCAGATGGAAAGGGCCCGCCATGAGCCTGTCAATCACTCAGACATGGTGGACAAGA TGTTTGGCTTCCTGGGGACTTCAGGTGGCCTGCCAGGCCAGGAGGGCCAGGCACCTAGTGGC TTTGAGGACCTGGAGCGAGGGCGGAGGGAGATGGTGGAGGAGGACCTGGATGCAGCCCTGCC CCTGCCTGACGAGGATGAGGAGGACCTCTCTGAGTATAAATTTGCCAAGTTCGCGGCCACCT ACTTCCAGGGGACAACTACGCACTCCTACACCCGGCGGCCACTCAAACAGCCACTGCTCTAC CATGACGACGAGGGTGACCAGCTGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA ATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGGGATTTTGCCGATTTCG GCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATT AACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCCAATTGAAGGGCGAATTCCGATCTTCCTAGAGC ATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATG GAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGC CCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID No.

23)

pAAV2.1-MYO7A_3'AK_BGH

5' ITR2

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGC GCGCAG (SEQ ID No. 10)

AK

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGC GAAT TTTAACAAAAT (SEQ ID No. 3)

Señal aceptora de ruptura

GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (SEQ ID No. 1)

3'hMYO7A CDS

GCAGCCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTA CCACACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCC TGGGCAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTC CCCGAGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAA GTCCAAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCA ACAGCATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAAT GGCATCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCA CAACCCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTT TCGCCCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGC TACGCCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCC GCCCAGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACAT TCATGGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGC AACGCGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCT GTTTGACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGT GCGAGCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTC CGCAAAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCAT CTACCAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACC TGGCTGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGC CTCCTGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGA GAAGTGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTG ATGCCCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTC TCCAGGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGT GGCCGTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGT CCTTCCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGAGTGCCGTGTCTGGCTCTCACTGGGC TGCTCTGATCTTGGCTGTGCTGCGCCTCACTCAGGCTGGGCAGGACTGACCCCGGCGGGGCC CTGTTCTCCGTGTTGGTCCTGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCA CCATCAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGTAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTG GTCACCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCC CAACCCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGG ACCATGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACC AAGCAGCGTGGGGACTTCCCCACCGACTGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACC TCGTGAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCT TGCAGCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCC TATGACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCG AGGCAAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGC TCCTGGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTAC ATGGGCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAATGAGCTCACCGACCAGATCTTTGA GGGTCCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGA CCGACAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGC CTTTTCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCA CTGCCCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGA AGTACCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCAC AAGGTCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAA GGACTTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCT TTGTCAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTT CGACACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACT CACCTACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCA TGGCCGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAG TGCACGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGA CAAGTCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCC GGCAGGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGG AAGTCCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGG CTCAGCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTG CCATCAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCAT CCCTTCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAA CTTGGTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCC TGACTTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGC AAGTGA (SEQ ID No. 24)

poliA de BGH

GCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTT GACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATT GTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGAT TGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGA (SEQ ID No. 25)

3'ITR2

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGG GTTCCT (SEQIDNo. 4)

ITR5 derecha

TCACTGCTTACAAAACCCCCTTGCTTGAGAGTGTGGCACTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTC GCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGCGACGGCCAGAGGGCCGTCGTCTGGCAGCTCTTTGAGCT GCCACCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCGACAGGGGGGAGAG (SEQ ID No.

14)

Secuencia completa de pAAV2.1-MYO7A_3'AK_BGH

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGG GTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAG ATCGGAATTCGCCCTTTGATCAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGC TGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGC ATCTTTCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGCAG CCCTGGCGGTCTGGATCACCATCCTCCGCTTCATGGGGGACCTCCCTGAGCCCAAGTACCAC ACAGCCATGAGTGATGGCAGTGAGAAGATCCCTGTGATGACCAAGATTTATGAGACCCTGGG CAAGAAGACGTACAAGAGGGAGCTGCAGGCCCTGCAGGGCGAGGGCGAGGCCCAGCTCCCCG AGGGCCAGAAGAAGAGCAGTGTGAGGCACAAGCTGGTGCATTTGACTCTGAAAAAGAAGTCC AAGCTCACAGAGGAGGTGACCAAGAGGCTGCATGACGGGGAGTCCACAGTGCAGGGCAACAG CATGCTGGAGGACCGGCCCACCTCCAACCTGGAGAAGCTGCACTTCATCATCGGCAATGGCA TCCTGCGGCCAGCACTCCGGGACGAGATCTACTGCCAGATCAGCAAGCAGCTGACCCACAAC CCCTCCAAGAGCAGCTATGCCCGGGGCTGGATTCTCGTGTCTCTCTGCGTGGGCTGTTTCGC CCCCTCCGAGAAGTTTGTCAAGTACCTGCGGAACTTCATCCACGGGGGCCCGCCCGGCTACG CCCCGTACTGTGAGGAGCGCCTGAGAAGGACCTTTGTCAATGGGACACGGACACAGCCGCCC AGCTGGCTGGAGCTGCAGGCCACCAAGTCCAAGAAGCCAATCATGTTGCCCGTGACATTCAT GGATGGGACCACCAAGACCCTGCTGACGGACTCGGCAACCACGGCCAAGGAGCTCTGCAACG CGCTGGCCGACAAGATCTCTCTCAAGGACCGGTTCGGGTTCTCCCTCTACATTGCCCTGTTT GACAAGGTGTCCTCCCTGGGCAGCGGCAGTGACCACGTCATGGACGCCATCTCCCAGTGCGA GCAGTACGCCAAGGAGCAGGGCGCCCAGGAGCGCAACGCCCCCTGGAGGCTCTTCTTCCGCA AAGAGGTCTTCACGCCCTGGCACAGCCCCTCCGAGGACAACGTGGCCACCAACCTCATCTAC CAGCAGGTGGTGCGAGGAGTCAAGTTTGGGGAGTACAGGTGTGAGAAGGAGGACGACCTGGC TGAGCTGGCCTCCCAGCAGTACTTTGTAGACTATGGCTCTGAGATGATCCTGGAGCGCCTCC TGAACCTCGTGCCCACCTACATCCCCGACCGCGAGATCACGCCCCTGAAGACGCTGGAGAAG TGGGCCCAGCTGGCCATCGCCGCCCACAAGAAGGGGATTTATGCCCAGAGGAGAACTGATGC CCAGAAGGTCAAAGAGGATGTGGTCAGTTATGCCCGCTTCAAGTGGCCCTTGCTCTTCTCCA GGTTTTATGAAGCCTACAAATTCTCAGGCCCCAGTCTCCCCAAGAACGACGTCATCGTGGCC GTCAACTGGACGGGTGTGTACTTTGTGGATGAGCAGGAGCAGGTACTTCTGGAGCTGTCCTT CCCAGAGATCATGGCCGTGTCCAGCAGCAGGGAGTGCCGTGTCTGGCTCTCACTGGGCTGCT CTGATCTTGGCTGTGCTGCGCCTCACTCAGGCTGGGCAGGACTGACCCCGGCGGGGCCCTGT TCTCCGTGTTGGTCCTGCAGGGGAGCGAAAACGACGGCCCCCAGCTTCACGCTGGCCACCAT CAAGGGGGACGAATACACCTTCACCTCCAGTAATGCTGAGGACATTCGTGACCTGGTGGTCA CCTTCCTAGAGGGGCTCCGGAAGAGATCTAAGTATGTTGTGGCCCTGCAGGATAACCCCAAC CCCGCAGGCGAGGAGTCAGGCTTCCTCAGCTTTGCCAAGGGAGACCTCATCATCCTGGACCA TGACACGGGCGAGCAGGTCATGAACTCGGGCTGGGCCAACGGCATCAATGAGAGGACCAAGC AGCGTGGGGACTTCCCCACCGACTGTGTGTACGTCATGCCCACTGTCACCATGCCACCTCGT GAGATTGTGGCCCTGGTCACCATGACTCCCGATCAGAGGCAGGACGTTGTCCGGCTCTTGCA GCTGCGAACGGCGGAGCCCGAGGTGCGTGCCAAGCCCTACACGCTGGAGGAGTTTTCCTATG ACTACTTCAGGCCCCCACCCAAGCACACGCTGAGCCGTGTCATGGTGTCCAAGGCCCGAGGC AAGGACCGGCTGTGGAGCCACACGCGGGAACCGCTCAAGCAGGCGCTGCTCAAGAAGCTCCT GGGCAGTGAGGAGCTCTCGCAGGAGGCCTGCCTGGCCTTCATTGCTGTGCTCAAGTACATGG GCGACTACCCGTCCAAGAGGACACGCTCCGTCAATGAGCTCACCGACCAGATCTTTGAGGGT CCCCTGAAAGCCGAGCCCCTGAAGGACGAGGCATATGTGCAGATCCTGAAGCAGCTGACCGA CAACCACATCAGGTACAGCGAGGAGCGGGGTTGGGAGCTGCTCTGGCTGTGCACGGGCCTTT TCCCACCCAGCAACATCCTCCTGCCCCACGTGCAGCGCTTCCTGCAGTCCCGAAAGCACTGC CCACTCGCCATCGACTGCCTGCAACGGCTCCAGAAAGCCCTGAGAAACGGGTCCCGGAAGTA CCCTCCGCACCTGGTGGAGGTGGAGGCCATCCAGCACAAGACCACCCAGATTTTCCACAAGG TCTACTTCCCTGATGACACTGACGAGGCCTTCGAAGTGGAGTCCAGCACCAAGGCCAAGGAC TTCTGCCAGAACATCGCCACCAGGCTGCTCCTCAAGTCCTCAGAGGGATTCAGCCTCTTTGT CAAAATTGCAGACAAGGTCATCAGCGTTCCTGAGAATGACTTCTTCTTTGACTTTGTTCGAC ACTTGACAGACTGGATAAAGAAAGCTCGGCCCATCAAGGACGGAATTGTGCCCTCACTCACC TACCAGGTGTTCTTCATGAAGAAGCTGTGGACCACCACGGTGCCAGGGAAGGATCCCATGGC CGATTCCATCTTCCACTATTACCAGGAGTTGCCCAAGTATCTCCGAGGCTACCACAAGTGCA CGCGGGAGGAGGTGCTGCAGCTGGGGGCGCTGATCTACAGGGTCAAGTTCGAGGAGGACAAG TCCTACTTCCCCAGCATCCCCAAGCTGCTGCGGGAGCTGGTGCCCCAGGACCTTATCCGGCA GGTCTCACCTGATGACTGGAAGCGGTCCATCGTCGCCTACTTCAACAAGCACGCAGGGAAGT CCAAGGAGGAGGCCAAGCTGGCCTTCCTGAAGCTCATCTTCAAGTGGCCCACCTTTGGCTCA GCCTTCTTCGAGGTGAAGCAAACTACGGAGCCAAACTTCCCTGAGATCCTCCTAATTGCCAT CAACAAGTATGGGGTCAGCCTCATCGATCCCAAAACGAAGGATATCCTCACCACTCATCCCT TCACCAAGATCTCCAACTGGAGCAGCGGCAACACCTACTTCCACATCACCATTGGGAACTTG GTGCGCGGGAGCAAACTGCTCTGCGAGACGTCACTGGGCTACAAGATGGATGACCTCCTGAC TTCCTACATTAGCCAGATGCTCACAGCCATGAGCAAACAGCGGGGCTCCAGGAGCGGCAAGT GACCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTG CCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG TGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGT GTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAAT AGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGCAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAGAGCAT GGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGA GTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCC GACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG (SEQ ID No. 26)

pAAV2.1-CBA-MYO7A_5'TS

S ecu en cia com pleta

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^{p A A V 2 . 1} -MYO7A_3'TS_BGH

S e c u e n c i a c o m p l e t a

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28)

AP

GTGATCCTAGGTGGAGGCCGAAAGTACATGTTTCGCATGGGAACCCCAGACCCTGAGTACCC AGATGACTACAGCCAAGGTGGGACCAGGCTGGACGGGAAGAATCTGGTGCAGGAATGGCTGG CGAAGCGCCAGGGTGCCCGGTACGTGTGGAACCGCACTGAGCTCATGCAGGCTTCCCTGGAC CCGTCTGTGACCCATCTCATGGGTCTCTTTGAGCCTGGAGACATGAAATACGAGATCCACCG AGACTCCACACTGGACCCCTCCCTGATGGA (SEQ ID N o. 29)

Marcador 3Xflag

GAC TACAAAGACCAT GACGGTGATTATAAAGATCAT GACAT CGAC TACAAGGATGACGATGA CAAG (SEQ ID No. 30)

HA

ATGTATGATGTTCCTGATTATGCTAGCCTC (SEQ ID NO:31)

Para los fines de esta invención, una secuencia codificadora de ABCA4, MYO7A y CEP290, que preferiblemente se seleccionan respectivamente de las secuencias incluidas en la presente, o las secuencias que codifican la misma secuencia de aminoácidos debido a la degeneración del código genético, está unida funcionalmente a una secuencia de promotor capaz de regular su expresión en una célula retiniana de mamífero, en particular en células de fotorreceptores. Los promotores adecuados que pueden usarse según la invención incluyen el promotor de citomegalovirus, el promotor de rodopsina, el promotor de rodopsina quinasa, el promotor de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores, el promotor de la distrofia macular viteliforme de tipo ² , sus fragmentos y variantes, que conservan la actividad de promotor de la transcripción.

Los sistemas de suministro víricos incluyen, pero no se limitan a vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados (AAV), vectores de AAV pseudotipificados, vectores de herpes virus, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores baculovíricos. Los vectores de AAV pseudotipificados son los que contienen el genoma de un serotipo de AAV en la cápsida de un segundo serotipo de AAV; por ejemplo, un vector AAV2/8 contiene la cápsida de a Av ⁸ y el genoma de AAV2 (Auricchio et al. (2001), Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-3081). Dichos vectores también se conocen como vectores quiméricos. Otros ejemplos de sistemas de suministro incluyen los sistem as de suministro ex vivo, que incluyen, pero no se limitan a métodos de transfección de ADN, tales como electroporación, biolística de ADN, transfección mediada por lípidos, transfección mediada por ADN compactado.

La construcción de un vector de AAV puede realizarse siguiendo procedimientos y empleando técnicas que son conocidos por los expertos en la técnica. La teoría y la práctica para la construcción de un vector vírico adenoasociado y su uso en terapia se ilustra en varias publicaciones científicas y de patente (en la presente se incorpora la siguiente bibliografía como referencia: Flotte T.R., Adeno-associated virus-based gene therapy for inherited disorders, Pediatr Res, diciembre de 2005, 58(6):1143-1147; Goncalves M.A., Adeno-associated virus: from defective virus to effective vector, Virol J., ⁶ de mayo de 2005, 2:43; Surace E.M., Auricchio A., Adeno-associated viral vectors for retinal gene transfer, Prog Retin Eye Res., noviembre de 2003, 22(6):705-719; Mandel R.J., Manfredsson F.P., Foust K.D., Rising A., Reimsnider S., Nash K., Burger C., Recombinant adeno-associated viral vectors as therapeutic agents to treat neurological disorders, Mol Ther., marzo de 2006, 13(3):463-483).

Las formas de administración adecuadas de una composición farmacéutica que contiene vectores de AAV incluyen, pero no se limitan a disoluciones o suspensiones inyectables, lociones oculares y ungüentos oftálmicos. En una realización preferida, el vector de AAV se administra mediante inyección subretiniana, por ejemplo, mediante inyección en el espacio subretiniano, en la cámara anterior o en el espacio retrobulbar. Preferiblemente, los vectores víricos se administran mediante una estrategia subretiniana (según se describe en Bennicelli J., et al., Mol Ther., 22 de enero de 2008, Reversal of Blindness in Animal Models of Leber Congenital Amaurosis Using Optimized AAV2-mediated Gene Transfer).

La dosis del virus para su uso en terapia se determinará según el caso, y depende de la vía de administración, la gravedad de la enfermedad, las condiciones generales del paciente y otros parámetros clínicos. En general, las dosificaciones adecuadas variarán de ¹⁰⁸ a ^{1 0} 13vg (genomas de vector)/ojo.

Producción del vector de AAV

Se produjeron vectores de AAV por TIGEM AAV Vector Core mediante transfección triple de células HEK293, seguido de dos rondas de purificación con CsCl2 (54). Para cada preparación vírica se determinaron las titulaciones físicas [copias de genoma ("genome copies", GC)/ml] promediando la titulación obtenida mediante un análisis de transferencia por puntos (55) y mediante cuantificación con PCR empleando TaqMan (54) (Applied Biosystems, Carlsbad, CA).

Infección con AAV de células HEK293

Se mantuvieron células HEK293 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10 % y L-glutamina 2 mM (GIBCO, Invitrogen S.R.L., Milán, Italia). Las células se cultivaron en placas de seis pocillos a una densidad de 2*10® células/pocillo y se transfectaron 16 horas después con 1,3 |jg de plásmido auxiliar pDeltaF ⁶ que contiene los genes auxiliares Ad (56) usando el método del fosfato de calcio. Después de 5 horas, las células se lavaron una vez con DMEM y se incubaron con vectores AAV2/2 (m.o.i: 10 ⁵ GC/célula de cada vector; la coinfección 1:1 con vectores de AAV duales produjo 2x10 ⁵ GC totales/célula) en un volumen final de 700 jl de DMEM sin suero. Dos horas después se añadieron 2 ml de DMEM completo a las células. Las células se recolectaron 72 horas después de la infección para el análisis de la transferencia Western.

Modelos animales

Este estudio se realizó según la guía de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, la declaración de the Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research, y las leyes del Ministerio de Salud italiano para procedimientos con animales. Los ratones se alojaron en el vivario del Instituto de Genética y Biofísica (Nápoles, Italia) y se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad (exposición de 10-50 lux durante la fase de luz). Los ratones C57BL/6 y BALB/c se adquirieron en Harlan Italy SRL (Udino, Italia). Se generaron ratones Abca4-/- albinos mediante cruzamientos y retrocruzamientos sucesivos con ratones BALB/c (homocigóticos para Rpe65 Leu450) (57) y se mantuvieron endogámicos. El cruzamiento se realizó apareando ratones homocigóticos. Los ratones sh14626SB/4626SB pigmentados (denominados sh1-/-) se importaron de the Wellcome Trust Sanger Institute (Cambridge, Reino Unido, un amable obsequio de la doctora Karen Steel) y se retrocruzaron dos veces con ratones CBA/Ca adquiridos en Harlan Italy SRL (Udino, Italia) para obtener ratones sh1+/4626SB heterocigóticos (denominados sh1+/-) para expandir la colonia. Los ratones se mantuvieron endogámicos; el cruzamiento se realizó apareando hembras heterocigóticos con machos heterocigóticos. Los ratones sh1 pigmentados usados en este estudio estaban afectados por Usher 1B (sh1-/-) o no estaban afectados (sh1+/- y sh1+/+). Se realizó el genotipo para el alelo MYO7A4626SB mediante una análisis con PCR del ADN genómico (extraído de la punta de la cola del ratón), seguido de la secuenciación del ADN. Los cebadores utilizados para la amplificación con PCR fueron los siguientes: Fw1 (GTGGAGCTTGACATCTACTTGACC) y Rev3 (AGCTGACCCTCATGACTCTGC), que generan un producto de 712 pb que se secuenció con el cebador Fw1. Los cerdos hembra Large White usados en este estudio se registraron como animales de pura raza en LWHerd Book de la Asociación Nacional de Criadores de Cerdos italiana (Azienda Agricola Pasotti, Imola, Italia).

Inyección subretiniana de vectores de AAVen ratones y cerdos

Se anestesiaron ratones (de 4-5 sem anas de edad) con una inyección intraperitoneal de 2 ml/100 g de peso corporal de avertina [1,25 % en p/v de 2,2,2-tribromoetanol y 2,5 % en v/v de 2-metil-2-butanol (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)] (58), y después se administraron subretinianamente los vectores AAV2/8 mediante una estrategia transcoroidal transesclerótica, según describen Liang et al. (59). Todos los ojos se trataron con 1 pl de disolución de vector. Las dosis de AAV2/8 (GC/ojo) administradas varían a través de los diferentes experimentos con ratones, según se describe en la sección de "Resultados". S e añadió AAV2/1-CMV-tirosinasa humana (60) (dosis: 2x10 ⁸ GC/ojo) o AAV2/5-CMV-EGFP (que codifica EGFP de tamaño normal, dosis: 4x10 ⁸ GC/ojo) a la disolución del vector AAV2/8 que se administró subretinianamente a ratones albinos (Abca4-/- y BALB/c) (figura ⁶ B, 7-8) o sh1 pigmentados (figura 10-11), respectivamente. Esto permite marcar el RPE dentro de la parte transducida de la copa ocular, que después se diseccionó y se analizó (figura ⁶ B, 7-8, 10-11). La administración subretiniana de los vectores de AAV a la retina de los cerdos se realizó como se ha descrito previamente (11). Todos los ojos se trataron con 100 pl de la disolución del vector AAV2/8. La dosis de AAV2/8 fue de 1x10 ¹⁰ (figura 3B) o de 1x10 ¹¹ GC de cada vector/ojo (figura 5B y 16), y la coinyección de los vectores de AAV duales produjo una dosis total de 2x10 ¹⁰ GC/ojo o de 2x10 ¹¹ GC/ojo, respectivamente.

Análisis de la transferencia Western

Se lisaron muestras (células HEK293, retinas o copas oculares) para el análisis de la transferencia Western con tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, NP40 al 1 %, Na-desoxicolato al 0,5 %, EDTA 1 mM, pH 8,0, SDS al 0,1 %) para extraer las proteínas EGFP y MYO7A, o con tampón SIE (sacarosa 250 mM, imidazol 3 mM, pH 7,4, etanol al 1 %, y NP-40 al 1 %) para extraer la proteína ABCA4.

Las muestras de cerdo (las áreas tratadas de la retina, así como láminas de RPE completas) se lisaron con tampón RIPA para extraer la MYO7A de las láminas de RPE, y con tampón SIE para extraer mYo 7A y ABCA4 de las retinas.

Los tampones de lisis fueron suplementados con inhibidores de proteasas (comprimidos de cóctel de inhibidores Complete Protease, Roche, Milán, Italia) y fenilmetilsulfonilo 1 mM. Después de la lisis, las muestras de EGFP y MYO7A se desnaturalizaron a 99 °C durante 5 minutos en tampón de muestras 1X Laemli; las muestras de ABCA4 se desnaturalizaron a 37 °C durante 15 minutos en tampón de muestras 1X Laemli suplementado con urea 4 M. Los lisados se separaron mediante una electroforesis en gel de SDS al 7% (muestras de ABCA4 y MYO7A) o 12% (muestras de EGFP)-poliacrilamida. Los anticuerpos usados para las inmunotransferencias fueron los siguientes: anti-EGFP (sc-8334, Santa Cruz, Dallas, Texas, EE. UU., 1:500); anti-3xflag (A8592, Sigma-Aldrich, 1:1000); anti-Myo7a (policlonal, Primm Srl, Milán, Italia, 1:500) generado usando un péptido que se corresponde con los aminoácidos 941-1070 de la proteína MYO7A humana; anticuerpo anti-HA (PRB- ^{1 0 1} P- ^{2 0 0} , hA. ^{1 1} , Covance, Princeton, NJ, EE. UU., 1:2000); anti-p-tubulina (T5201,Sigma Aldrich, 1:10000); anti-filamina A (n.° de catálogo 4762, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU., 1:1000); anti-disferlina (disferlina, clon Ham1/7B6, MONX10795, Tebu-bio, Le Perray-en-Yveline, Francia, 1:500). La cuantificación de las bandas de EGFP, ABCA4 y MYO7A detectadas por la transferencia Western se realizó empleando el programa informático ImageJ (puede descargarse de modo gratuito en http://rsbweb.nih.gov/ij/). La expresión de ABCA4 y MYO7A se normalizó a filamina A o disferlina para los experimentos in vitro e in vivo, respectivamente. La expresión de EGFP se normalizó a ptubulina o pg de proteínas para los experimentos in vitro e in vivo, respectivamente. Se emplearon diferentes proteínas para la normalización basándose en la similitud de su peso molecular con el de diferentes productos transgénicos.

Fotografía del fondo del ojo

La formación de imágenes en vivo del fondo del ojo se realizó dilatando el ojo de C57BL/6 con una gota de tropicamida al 1 % (Visufarma, Roma, Italia) y la posterior estimulación del ojo con un destello de 300 W. Las fotografías del fondo del ojo se tomaron utilizando una cámara retiniana Topcon TRC-50IX conectada a una cámara digital Nikon D1H con dispositivo acoplado a carga (Topcon Medical System, Oakland, NJ, EE. UU.).

Histología, microscopía óptica y de fluorescencia

Para evaluar la expresión de EGFP en secciones histológicas, se enuclearon los ojos de ratones C57BL/6 o de cerdos Large White (11) un m es después de la inyección de AAV2/8. Los ojos de los ratones se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante la noche y se infiltraron con sacarosa al 30 % durante la noche; después la córnea y el cristalino se diseccionaron, y las copas oculares se introdujeron en un compuesto de temperatura de corte óptima ("optimal cutting temperature compound", matriz O.C.T., Kaltek, Padua, Italia). Los ojos de los cerdos se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 48 horas, se infiltraron con sacarosa al 10 % durante 4 horas, con sacarosa al 20 % durante 4 horas y, por último, con sacarosa al 30 % durante la noche. Después, la córnea, el cristalino y el cuerpo vítreo se diseccionaron y las porciones positivas a EGFP de las copas oculares se introdujeron en un compuesto de temperatura de corte óptima (matriz O.C.T., Kaltek). Se cortaron criosecciones en serie (espesor de 10 |jm) a lo largo del meridiano horizontal y se distribuyeron progresivamente sobre portaobjetos. Se capturaron fotografías de histología retiniana utilizando una cámara Zeiss Axiocam (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). Para analizar la localización de los melanosomas en el RPE de los ratones sh1 pigmentados, los ojos se enuclearon 2 m eses después de la inyección de AAV, se fijaron en glutaraldehído al 2 %-paraformaldehído al 2 % en tampón fosfato 0,1 M durante la noche, se enjuagaron en tampón fosfato 0,1 M, y se diseccionaron bajo un microscopio de fluorescencia. Las porciones positivas a EGFP de las copas oculares se introdujeron en Araldite 502/EMbed 812 (n.° de catálogo 13940, Araldite 502/EMbed 812 KIT, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EE. UU.). Se cortaron transversalmente secciones semidelgadas (0,5 jm ) en un ultratomo Leica Ultratome RM2235 (Leica Microsystems, Bannockburn, IL, EE. UU.), se montaron sobre portaobjetos, y se tiñeron con tinte de tejidos Epoxy (n.° de catálogo 14950, Electron Microscopy Sciences). Los melanosomas fueron contados por un operario con mascarilla que analiza 10 campos diferentes/ojo bajo un microscopio óptico con una magnificación de 100X. Las fotos retinianas se capturaron utilizando una cámara Zeiss Axiocam (Carl Zeiss).

Microscopía electrónica e inmunomarcaje con oro

Para los análisis con microscopía electrónica, se recolectaron los ojos de ratones Abca4-/- o sh1 a los 3 y 2 m eses después de la inyección con a Av , respectivamente. Los ojos se fijaron en glutaraldehído al 0,2 %-paraformaldehído al 2 % en tampón PHEM 0,1 M, pH 6,9 (PIPES 240 mM, HEPES 100 mM, MgCh ⁸ mM, EGTA 40 mM) durante 2 horas y después se enjuagaron en tampón PHEM 0,1 M. Después los ojos se diseccionaron bajo un microscopio óptico o de fluorescencia para seleccionar las porciones positivas a tirosinasa o EGFP de las copas oculares de ratones albinos (Abca4-/- y BALB/c) y sh1 pigmentados, respectivamente. La porción transducida de las copas oculares después se introdujo en gelatina al 12 %, se infusionó con sacarosa 2,3 M y se congeló en nitrógeno líquido. Se cortaron criosecciones (50 nm) empleando un Leica Ultramicrotome EM FC7 (Leica Microsystems) y se puso mucho cuidado para alinear longitudinalmente los cilios que conectan los PR. Las mediciones del espesor del RPE y los recuentos de los gránulos de lipofuscina en los ojos de Abca4-/- fueron realizadas por un operario con mascarilla (Roman Polishchuk) utilizando el programa informático iTEM (Olympus SYS, Hamburgo, Alemania). Brevemente, se midió el espesor de RPE en al menos 30 áreas diferentes a lo largo de la longitud del espécimen utilizando la herramienta "Arbitrary Line" del programa iTEM. S e empleó el módulo "Touch count" del programa iTEM para contar el número de gránulos de lipofuscina en las áreas de 25 jm ² distribuidas aleatoriamente a través de la capa de RPE. La densidad de los gránulos se expresó como el número de gránulos por 25 jm 2. Se realizó el inmunoanálisis de oro dirigido a ensayar la expresión de ABCA4-HA en muestras de Abca4-/- después de la administración del vector de AAV, incubando criosecciones sucesivamente con el anticuerpo monoclonal anti-HA (MMS-101P-50, Covance, 1:50), IgG antirratón de conejo, y proteína A conjugada con partículas de oro de 10 nm. Para cuantificar la localización de la rodopsina en los cilios conectores de Pr de sh1, se incubaron sucesivamente criosecciones de ratones sh1 con anticuerpo anti-rodopsina (1D4, ab5417, Abcam, Cambridge, Reino Unido, 1:100), IgG antirratón de conejo, y proteína A conjugada con partículas de oro ee 10 nm. La cuantificación de la densidad de oro de rodopsina en los cilios conectores fue realizada por un operario con mascarilla empleando el programa iTEM (Olympus SYS). Brevemente, se empleó el módulo "Touch count" del programa iTEM para contar el número de partículas de oro por cilio, que fue normalizado al perímetro del cilio (nm) que fue medido utilizando la herramienta "Closed polygon tool". La densidad del oro se expresó como partículas de oro/nm. Las criosecciones inmunomarcadas con oro se analizaron con un microscopio electrónico FEI Tecnai-12 (FEI, Eindhoven, Países Bajos) equipado con una cámara Veletta CCD para la adquisición de imágenes digitales.

Análisis electrofisiológicos

Para evaluar la recuperación de la desensibilización a la luz, los ojos se estimularon con 3 destellos de luz de 1 cd s/m ² y después se desensibilizaron mediante una exposición a luz constante (300 cd/m2) durante 3 minutos. Después los ojos se estimularon a lo largo del tiempo empleando el destello de predesensibilización (1 cd s/m2) a los 0, 5, 15, 30, 45 y 60 minutos después de la desensibilización. S e evaluó la recuperación de la actividad de los bastones calculando la proporción entre la onda b generada después de la desensibilización (en diferentes momentos) y la generada antes de la desensibilización. La recuperación de la desensibilización a la luz se evaluó en ratones de 2 m eses de edad Abca4-/- a las ⁶ sem anas después del tratamiento (figura 13).

Análisis estadístico

Los datos se presentan como promedio ± error estándar del promedio (e.e.p.). Unos valores de p estadísticos <0,05 se consideraron significativos. S e empleó un ANOVA de una vía con el procedimiento de comparación múltiple posthoc para comparar los datos mostrados en la figura 2 (p de ANOVA: A. 0,0002; B. 0,0015; C. 2x10'7), la figura ⁸ b (p de An OVA: 0,076) y la figura 11B (p de ANOVA: 0,5). Se contaron los gránulos de lipofuscina (figura 7B) y los melanosomas (figura 10B), los recuentos se analizaron mediante la desviación de un modelo lineal generalizado binomial negativo (61) (figura 7B: valor de p del análisis de la desviación 0,03794; figura 10B: valor de p del análisis de la desviación <<2x10'10). Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos determinadas con el procedimiento de comparación múltiple post-hoc se marcan con asteriscos en las figuras.

Resultados:

Generación de vectores de AAV de tamaño normal, sobredimensionados y duales

Los inventores generaron vectores sobredimensionados (OZ), de transruptura (TS) e híbridos de AAV duales que incluían las secuencias codificadoras del indicador de EGFP, de ABCA4-3xflag terapéutico o de MYO7A-HA. Los inventores también generaron vectores de transruptura (TS) e híbridos de AAV duales que incluían el CEP290 terapéutico marcado en su C-terminal con el marcador HA. Las secuencias recombinogénicas incluidas en los vectores híbridos de AAV duales se basan en una región previamente descrita del transgén de la fosfatasa alcalina (AP, AP híbrida de AAV duales) (39) o una secuencia de 77 pb procedente del genoma del fago F1 (AK, AK híbrida de AAV duales) que los inventores descubrieron que era recombinogénica en experimentos previos (Colella y Auricchio, datos no publicados). Los inventores también generaron vectores de solapamiento de AAV duales (OV) para ABCA4, MYO7A y CEP290. Los inventores no generaron vectores de AAV OV duales para el EGFP porque la eficacia de esta estrategia se basa en solapamientos específicos de transgén para la reconstitución (38) y, por tanto, no pueden extrapolarse de un gen a otro. En lugar de esto, para el EGFP los inventores generaron vectores de AAV individuales de tamaño normal ("normal size", NS) para comparar los niveles de la expresión del transgén de las diversas estrategias. Las construcciones generadas para la producción de todos los vectores de AAV empleados en este estudio se listan en la tabla ¹ , y en la figura ¹ se muestra una representación esquemática de las diversas estrategias.

Los inventores emplearon los vectores AAV2/2 para los experimentos in vitro, con los promotores de citomegalovirus ubicuo (CMV) o de beta-actina de pollo (CBA), que transducen con eficacia las células HEK293 (40). Además, puesto que el uso de ITR heterólogas procedentes de los serotipos 2 y 5 de AAV pueden aumentar el reensamblaje productivo de los vectores de AAV duales (51), los inventores también generaron vectores de AK de AAV duales con ITR heterólogas (figura 17a) que codifican ABCA4 y MYO7A. Los vectores de AAV con ITR heterólogas se encapsularon en cápsidas de AAV del serotipo 2 y se ensayaron in vitro .

En los experimentos realizados in vivo en la retina, los inventores emplearon vectores AAV2/8, que transducen con eficacia el RPE y los PR (10-12), pero apenas infectan a las células HEK293, y los promotores de CBA y CMV ubicuos (11), o los promotores de la distrofia macular viteliforme de tipo 2 específico de RPE (VMD2) (41) o de rodopsina específico de PR (RHO) y de rodopsina quinasa (RHOK) (10) (tabla 1).

Los vectores de AAV duales permiten conseguir unos altos niveles de transducción in vitro.

Los inventores inicialmente compararon la eficacia de las diversas estrategias con OZ, OV, TS y AP y AK híbridas de AAV duales para la transducción de genes grandes mediada por AAV in vitro infectando células HEK293 con los vectores AAV2/2 [multiplicidad de infección ("multiplicity of infection"), m.o.i.: 10 ⁵ copias del genoma (GC)/célula de cada vector] con promotores ubicuos (CMV para e Gf P, ABCA4-3xflag, y CEP290-HA, y CBA para MYO7A-HA).

Los lisados celulares se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos anti-EGFP (figura 2A), anti-3xflag (para detectar ABCA4-3xflag, figura 2B), anti-MYO7A (figura 2C) y anti-HA (para detectar CEP290-HA) (figura 12A). S e muestran transferencias Western representativas en las figuras 2A-C y 12A. Todas las estrategias produjeron la expresión de proteínas con el tamaño esperado. Tal como se había predicho, no se observaron bandas con el tamaño esperado cuando se emplea solo uno de los vectores de AAV duales para la infección (figura 2A-C y 12A). La cuantificación de la expresión del transgén (figura 2D-F) demuestra que la estrategia de la AP híbrida de AAV duales produjo los niveles más bajos de expresión del transgén, mientras que las estrategias de OV, TS y AK híbrida de AAV duales fueron más eficaces que la estrategia de AAV OZ. Las estrategias de TS y de AK híbrida de AAV duales confirman su capacidad para expresar con eficacia genes grandes también en el caso del CEP290 (figura 12B). Además, el uso de vectores de AK de AAV duales con ITR heterólogas produjo la expresión de las proteínas ABCA4 y MYO7A de longitud completa in vitro (figura 17).

Los vectores de TS y de AK híbrida de AAV duales, pero no los vectores de OV, transducen los fotorreceptores de ratón y de cerdo.

Después, los inventores evaluaron cada uno de los sistemas basados en AAV para la transducción de genes grandes en la retina de ratón. Para evaluar el AAV OV dual, que es específico de transgén, los inventores utilizaron los genes terapéuticos ABCA4 y MYO7A (figura 3). Los inventores emplearon EGFP para evaluar las estrategias de AAV OZ y de TS, AP y AK híbridas de AAV duales (figura 4). Un análisis de la transferencia Western de lisados retinianos, un m es después de la administración subretiniana en ratones C57BL/6 de los vectores de AAV OV duales (dosis de cada vector/ojo: 1,3x10 ⁹ GC), que codifican ABCA4-3xflag con el promotor de CMV ubicuo, reveló una robusta expresión de proteínas (figura 3A). Para determinar cuál es el tipo celular en la retina que expresa ABCA4, los inventores emplearon vectores de AAV OV duales que contenían los promotores de RHO y RHOK específicos de PR, o VMD2 específico de RPE (dosis de cada vector/ojo: 1x10 ⁹ GC). Los inventores detectaron la expresión de la proteína ABCA4 en retinas inyectada con VMD2, pero no en las que contenían los promotores de RHO y RHOK (figura 3A). Estos resultados también fueron confirmados en las retinas de cerdos Large White. La retina de cerdo es un excelente modelo para evaluar la eficacia de un vector debido a su tamaño, que es similar a la retina humana, y porque está enriquecida con conos que se concentran en una región similar a una banda, cuya densidad de conos es comparable a la de la mácula de primates (11). Los inventores inyectaron subretinianamente a cerdos Large White los vectores de AAV OV duales que codifican ABCA4-3xflag (dosis de cada vector/ojo: 1x10 ¹⁰ GC), y observaron la expresión de la proteína ABCA4 con el promotor de CMV pero no con el promotor de RHO (figura 3B). De modo similar, la administración subretiniana de los vectores de AAV Ov duales que codifican MYO7A-HA produjo una débil expresión de la proteína MYO7A en la retina de ratón con el promotor de CBA ubicuo (dosis de cada vector/ojo: 2,5x10 ⁹ GC) y no se detectó expresión con el promotor de RHO (dosis de cada vector/ojo: 3,2x10 ⁹ GC) (figura 3C). Globalmente, estos datos sugieren que la estrategia de AAV OV duales es más eficaz para la transferencia de genes grandes a RPE que a PR, que son la diana principal de la terapia génica para IRD, tales como STGD y USH1B.

Para descubrir una estrategia basada en AAV que transduzca con eficacia genes grandes a PR, los inventores evaluaron las propiedades de transducción retinianas de las estrategias de AAV OZ y de TS, AP y AK híbridas de AAV duales. Los inventores inicialmente emplearon EGFP, que permite localizar con facilidad la expresión de transgenes en los diversos tipos de células retinianas, incluyendo PR, así como para comparar de modo adecuado los niveles de transducción de transgenes grandes basada en AAV con los de un vector de AAV único de tamaño normal (NS). Se inyectaron subretinianamente ratones C57BL/6 con los vectores de AAV NS, y OZ y TS, y AP y AK híbridas de AAV duales (dosis de cada vector/ojo: 1,7x10 ⁹ GC), que codifican EGFP bajo el control transcripcional del promotor de CMV. Un m es después, las fotografías del fondo del ojo demostraron que se obtuvieron los niveles más altos de fluorescencia con las estrategias de AAV NS, y TS y AK híbrida de AAV duales (figura 15). El análisis con microscopio de fluorescencia de criosecciones retinianas demostró que pueden observarse niveles detectables de transducción de RPE o PR en 77 % (10/13) de las retinas inyectadas con los vectores de AAV NS y OZ, y 92 % (12/13) de las retinas inyectadas con los vectores de TS y AP y AK híbridas de AAV duales. La figura 4 muestra las retinas mejor transducidas para cada uno de estos grupos. Los niveles más robustos de transducción de PR se obtuvieron con las estrategias de AAV NS y TS y AK híbrida de AAV duales.

Los inventores después evaluaron los niveles de transducción específica de PR en ratones C57BL/6 tras la administración subretiniana de vectores de TS y de AK híbrida de AAV duales, que parecen ser los más prometedores para la reconstitución de genes grandes en PR, así como de vectores de AAV NS como comparación (dosis de cada vector/ojo: 2,4x10 ⁹ GC). Todos los vectores codifican EGFP bajo el control transcripcional del promotor de RHO específico de PR. Un m es después de la administración, las retinas se criocortaron y se analizaron con un microscopio de fluorescencia (figura 5A). Todas las estrategias produjeron niveles altos de transducción de PR, que parecen ser más constantes con el vector de AAV NS individual. Los inventores descubrieron transducción de PR en 100 % ( ⁶ / ⁶ ) de las retinas inyectadas con AAV NS, 60 % (9/15) de las retinas inyectadas con TS de AAV dual, y 71 % (10/14) de las retinas inyectadas con AK híbrida de AAV dual. La figura 5A muestra las retinas mejor transducidas para cada uno de estos grupos. Así, los inventores concluyeron que las estrategias de TS y de AK híbrida de AAV duales permiten conseguir una transducción eficaz de PR de ratón, aunque a niveles que son menores que los obtenidos con un AAV NS. Los inventores después confirmaron que la administración subretiniana de los vectores de TS y de AK híbrida de AAV duales (dosis de cada vector/ojo: 1x10 ¹¹ GC; retinas positivas a EGFP del total de inyectadas: 2/2 TS de AAV dual; 2/2 AK híbrida de AAV dual) transdujeron los PR de cerdos White Large (figura 5B).

Además, la administración subretiniana a la retina de cerdo de los vectores de TS y de AK híbrida de AAV duales (dosis de cada vector/ojo: 1x1011) produjo una expresión eficaz de ABCA4-3xflag de longitud completa específicamente en PR (figura 16a) y MYO7A-HA de longitud completa en RPE y PR (figura 16b). De modo interesante, los vectores de AK híbrida de AAV dual produjeron una expresión más constante de proteínas ABCA4 y MYO7A grandes en los PR, comparado con los vectores de TS de AAV duales (figura 16).

Los vectores de AAV duales mejoran el fenotipo retiniano de modelos de ratón de STGD y USH1B

Para comprender si los niveles de transducción de PR obtenidos con las estrategias de TS y de AK híbrida de AAV duales pueden ser terapéuticamente importantes, los inventores los investigaron en la retina de dos modelos de ratón de IRD, STGD y USH1B, provocadas por mutaciones en los genes grandes ABCA4 y MYO7A, respectivamente.

Aunque el modelo de ratón Abca4-/- no sufre una degeneración de PR grave (42), la ausencia del transportador retiniano todo-trans codificado por ABCA4 en los segm entos exteriores de los PR (43-44) provoca una acumulación de lipofuscina en los PR, así como en el RPE, como resultado de la fagocitosis de PR por el RPE (45). Como consecuencia, tanto el número de gránulos de lipofuscina en el RPE como el espesor de las células del RPE son mayores en ratones Abca4-/- que en ratones control (45). Además, el modelo de ratón Abca4-/- se caracteriza por una adaptación retrasada a la oscuridad (57, 62). Puesto que ABCA4 se expresa específicamente en los PR, los inventores generaron vectores de TS y de AK híbrida de AAV duales que codifican ABCA4-3xflag bajo el control transcripcional del promotor de RHO. Estos vectores se inyectaron subretinianamente en ratones C57BL/6 de tipo salvaje (dosis de cada vector/ojo: 3-5x10 ⁹ GC) y un m es después las retinas se lisaron y se analizaron mediante una transferencia Western con anticuerpos anti-3xflag. Ambas estrategias produjeron niveles robustos, pero variables de expresión de ABCA4-3xflag. Los niveles de expresión de ABCA4-3xflag fueron más constantes en retinas tratadas con los vectores de AK híbrida de AAV dual (figura ⁶ A). Estos resultados fueron confirmados en cerdos Large White (los datos no se muestran). Además, ratones de un m es de edad albinos Abca4-/- fueron inyectados subretinianamente con los vectores de AK híbrida de AAV dual RHO-ABCA4-HA (dosis de cada vector/ojo: 1-3x10 ⁹ GC). Tres m eses después se recolectaron los ojos y un análisis con microscopía inmunoelectrónica con anticuerpos anti-hemaglutinina (HA) de secciones retinianas confirmó que las inmunopartículas de oro estaban correctamente localizadas en los segm entos exteriores de los PR solo en los animales que fueron inyectados con la combinación de vectores de AK híbrida de AAV dual 5' y 3' (figura ⁶ B). Para evaluar la funcionalidad de la proteína ABCA4 expresada por los vectores duales, los inventores también realizaron una microscopía de transmisión de electrones para evaluar la presencia y el número de gránulos de lipofuscina en el RPE (figura 7) y el espesor del RPE (figura ⁸ ). Ambos fueron mayores en las retinas de los ratones Abca4-/- inyectados con los vectores control que en las retinas de controles de Balb/C de la misma edad de tipo salvaje, y se redujeron o normalizaron en los ojos inyectados con los vectores terapéuticos de TS o AK híbrida de AAV duales (figura 7B y ⁸ B). Además, la capacidad de los fotorreceptores de Abca4-/- para recuperarse de la desensibilización a la luz mejoró significativamente en las retinas tratadas con los vectores terapéuticos cuando se comparan con las retinas control (figura 13).

Los inventores después ensayaron los niveles de transducción en PR y la eficacia de la transferencia del gen MYO7A mediada por AAV duales en la retina de ratones sh1, el modelo de USH1B que se emplea con más frecuencia (23-24, 46-48). En ratones sh1, una deficiencia en la Myo7a motora provoca la localización incorrecta de los melanosomas del RPE (47), que no se introducen en las microvellosidades del RPE, y la acumulación de rodopsina en los cilios conectores de los PR (48). Puesto que MYO7A se expresa en RPE y PR (22-23), los inventores emplearon los vectores de TS y de AK híbrida de AAV duales que expresan MYO7A-HA bajo el control transcripcional del promotor de CBA ubicuo. Se inyectaron ratones de un m es de edad de tipo salvaje C57BL/6 con los vectores de AAV duales (dosis de cada vector/ojo: 1,7x10 ⁹ GC) y se evaluaron los lisados de la copa ocular un m es después empleando un análisis de la transferencia Western con anticuerpos anti-HA. Los resultados muestran unos niveles similares constantes y robustos de expresión de MYO7A en las retinas tratadas con ambas estrategias (figura 9). Aprovechando la capacidad del anticuerpo anti-MYO7A de los inventores para reconocer la MYO7A murina y humana, se compararon los niveles de MYO7A logrados tras la administración de los vectores de AAV duales a ojos de sh1-/- con los expresados endógenamente en los ojos de sh1+/+ (figura 14). S e emplearon los promotores de CBA (figura 14, panel izquierdo, dosis de cada vector/ojo: 1-6x10 ⁹ GC) y de RHO (figura 14, panel derecho, dosis de cada vector/ojo: 2x10 ⁹ GC) para distinguir la expresión de MYO7A lograda en PR y RPE de la de PR por sí solos: la primera es de aproximadamente 20 % (figura 14, panel izquierdo) y la última de aproximadamente 50 % de Myo7a endógena (figura 14, panel derecho). El análisis muestra además que los niveles de expresión de MYO7A logrados en PR por los vectores de AK híbrida de AAV dual son mayores que los obtenidos con los vectores de TS de AAV dual, a pesar de que el número de retinas transducidas es similar (TS-MYO7A: 3 retinas positivas de ⁸ inyectadas; AK-MYO7A: 4 retinas positivas de ⁸ tratadas; figura 14, panel derecho).

Para ensayar la capacidad de MYO7A expresada a partir de los vectores de AAV duales para rescatar los defectos de las retinas de sh1 - / - , los inventores después inyectaron subretinianamente los conjuntos de CBA de los vectores de TS y de AK híbrida de AAV duales (dosis de cada vector/ojo: 2,5x10 ⁹ GC) en ratones sh1 de un mes de edad. Los inventores evaluaron la localización de melanosomas en el RPE (figura 10) y de rodopsina (figura 11) mediante el análisis de una sección retiniana semidelgada y mediante microscopía inmunoelectrónica, respectivamente. A diferencia de los melanosom as de sh ¹ +/-, que no se ven afectados, los melanosom as de sh1-/- no se introducen en las microvellosidades del RPE después de la administración de los vectores control (cada mitad 5' individual de las estrategias de AAV duales, figura 10). El número de melanosomas del RPE localizados correctamente en posición apical mejoró significativamente después de la administración de los vectores de TS o de AK híbrida de AAV duales que codifican MYO7A (figura 10B). De modo notable, los inventores también descubrieron que la expresión de MYO7A mediada por los vectores de TS y de AK híbrida de AAV duales reduce la acumulación de rodopsina en los cilios conectores de PR de sh1-/- (figura 11).

Análisis:

Aunque la terapia génica mediada por AAV es eficaz en modelos animales y en pacientes con trastornos de ceguera heredados (5-9, 49), su aplicación a enfermedades que afectan a la retina y que requieren la transferencia de genes mayores que 5 kb (denominados genes grandes) es inhibida por la capacidad de carga limitada de AAV. Para solucionar este problema, los inventores compararon la eficacia de diversas estrategias basadas en AAV para la transducción de gen es grandes, que incluyen las estrategias de AAV OZ y OV, TS e híbridos de AAV duales in vitro y en la retina de ratón y de cerdo. En experimentos previos, los inventores seleccionaron una secuencia de 77 pb procedente del genoma del fago F1 que fue identificada por los inventores debido a sus propiedades recombinogénicas y se usó en la estrategia de híbrido dual (AK, AK híbrida de AAV dual).

Los resultados in vitro e in vivo de los inventores demostraron que el vector de AK híbrida de AAV dual, de modo sorprendente, tuvo una actuación mejor que el vector de AP híbrida de AAV dual, y que todas las estrategias de AAV dual que ensayaron los inventores (con la excepción de AP híbrida de AAV dual) tuvieron una actuación mejor que los vectores de AAV OZ en términos de niveles de transducción. Esto puede explicarse por el tamaño homogéneo de la población del genoma de AAV dual cuando se compara con los genomas de OZ, lo cual puede favorecer la generación de módulos de expresión de transgenes grandes transcripcionalmente activos.

La estrategia de AAV OV dual parece particularmente interesante cuando se compara con las estrategias de TS o AK híbrida, puesto que los vectores de AAV OV duales solo contienen secuencias que pertenecen al módulo de expresión del transgén terapéutico. Sin embargo, cuando los inventores administraron los vectores de AAV OV duales al espacio subretiniano de ratones y cerdos adultos, solo fueron capaces de detectar la expresión de la proteína ABCA4 grande cuando se emplean los promotores ubicuos específicos de RPE, pero no los promotores específicos de PR. Esto puede sugerir que la recombinación homóloga necesaria para la reconstitución de AAV OV duales es más eficaz en el RPE que en los PR. Esto resulta coherente con los niveles bajos de recombinación homóloga indicados en neuronas postmitóticas (50) y podría explicar, al menos en parte, la falta de transducción de MYO7A mediada por AAV OV duales indicada en fechas recientes por otros grupos (30). Los inventores concluyeron que la administración subretiniana de los vectores de AAV OV duales no debe usarse para la transferencia de genes grandes a los PR, aunque los inventores no pueden excluir que unas secuencias que sean más recombinogénicas que las incluidas en los vectores de ABCA4 y MYO7A de AAV duales de los inventores puedan permitir una recombinación homóloga eficaz en los PR.

Las estrategias de TS y de AK híbrida de AAV duales transducen con eficacia los PR de ratón y de cerdo, de manera diferente a lo observado por los inventores con los AAV OV duales. Esto resulta coherente con la conocimiento de que el mecanismo de reconstitución de genes grandes mediado por las estrategias de TS y de AK híbrida de AAV duales puede realizarse a través de la reunificación de cabeza a cola mediada por ITR (32, 35, 51), en lugar de a través de una recombinación homóloga.

Los niveles de transducción de PR de ratón logrados por los inventores con TS y AK híbrida de AAV duales son menores y menos constantes que con los vectores NS individuales. Sin embargo, el AAV dual puede ser eficaz para tratar trastornos de ceguera heredados que requieran unos niveles relativamente bajos de expresión transgénica, es decir, enfermedades heredadas como autosómicas recesivas. En efecto, los inventores han demostrado que la administración subretiniana de TS y AK híbrida de AAV duales mejora e incluso normaliza los defectos retinianos de dos modelos animales de enfermedades retinianas heredadas, s Tg D y USH1B, que son debidas a mutaciones en genes grandes y son dianas atractivas para la terapia génica.

El tamaño del genoma de los vectores de AAV duales es homogéneo, lo cual significa que los problemas de identidad y seguridad relacionados con su uso serán menos considerables que los relacionados con los vectores de AAV OZ, que presentan unos tamaños de genom as heterogéneos. Por contraste, los inventores no detectaron anomalías histológicas retinianas ni de ERG en los ratones que fueron seguidos hasta 1-2 m eses después de la administración del vector de AAV dual (los datos no se muestran).

En conclusión, los inventores han identificado una nueva secuencia recombinogénica (AK) que aumenta de modo notable la actuación del sistema de vector híbrido de AAV dual. De hecho han descubierto que los vectores de AAV duales son eficaces in vitro y en la retina in vivo. Aunque los vectores de AAV OV duales transducen con eficacia el RPE, no transducen los PR, mientras que las estrategias de TS y de AK híbrida de AAV duales dirigen con eficacia la reconstitución de genes grandes en ambos tipos de células. La administración de las estrategias de TS y de AK híbrida de AAV duales mejora el fenotipo retiniano de modelos de ratón de STGD y USH1B, proporcionando pruebas de la eficacia de estas estrategias para la terapia génica para estos y otros trastornos de ceguera que requieren la transferencia de genes grandes a los PR retinianos, así como al RPE. Estos descubrimientos ampliarán mucho la aplicación de los vectores de AAV para terapias génicas no solo a los ojos, sino también al músculo y a otros órganos y tejidos. Las enfermedades distintas a las IRD provocadas por genes defectuosos mayores que 5 kb incluyen, como ejemplos no limitantes, las distrofias musculares, las deficiencias en disferlina (distrofia muscular de cinturas de tipo 2B y miopatía de Miyoshi), la fibrosis quística, la hemofilia.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. - Un sistema de construcción dual para expresar la secuencia codificadora de un gen de interés en una célula hospedante, y dicha secuencia codificadora consiste en una porción del extremo 5' y una porción del extremo 3', y dicho sistema de construcción dual comprende:

a) un primer plásmido que comprende, en la dirección 5'-3':

- una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR) de AAV;

- una secuencia de promotor;

- la porción del extremo 5' de dicha secuencia codificadora, y dicha porción del extremo 5' está unida operablemente a dicho promotor y está bajo su control;

- una secuencia de ácido nucleico de una señal donante de ruptura; y

- una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR) de AAV; y

b) un segundo plásmido que comprende, en la dirección 5'-3':

- una secuencia de repetición terminal invertida 5' (5'-ITR) de AAV;

- una secuencia de ácido nucleico de una señal aceptora de ruptura;

- el extremo 3' de dicha secuencia codificadora;

- una secuencia de ácido nucleico de señal de poliadenilación; y

- una secuencia de repetición terminal invertida 3' (3'-ITR) de AAV,

en el que dicho primer plásmido comprende además una secuencia de ácido nucleico de una región recombinogénica en la posición 5' del 3'-ITR de AAV de dicho primer plásmido y en la posición 3' de la secuencia de ácido nucleico de la señal donante de ruptura, y en el que dicho segundo plásmido comprende además la secuencia de ácido nucleico de la región recombinogénica en la posición 3' del 5'-ITR de AAV de dicho segundo plásmido y en la posición 5' de la secuencia de ácido nucleico de la señal aceptora de ruptura, en el que la región recombinogénica es una región recombinogénica del fago F1 que consiste en la secuencia:

GGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAA

T (SEQ ID NO:3), o uno de sus fragmentos que mantiene la propiedad recombinogénica de SEQ ID NO:3, en el que, tras la introducción de dicho primer plásmido y dicho segundo plásmido en la célula hospedante, dicha secuencia codificadora se reconstituye por medio de las señales donante de ruptura y aceptora de ruptura.

2. - El sistema de construcción dual según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos de las ITR se deriva del mismo serotipo de AAV o de serotipos diferentes de AAV, preferiblemente la 3'-ITR del primer plásmido y la 5'-ITR del segundo plásmido proceden del mismo serotipo de AAV, preferiblemente la 5'-ITR y la 3'-ITR del primer plásmido y la 5'-ITR y la 3'-ITR del segundo plásmido proceden, respectivamente, de diferentes serotipos de AAV, preferiblemente la 5'-ITR del primer plásmido y la 3'-ITR del segundo plásmido proceden de diferentes serotipos de AAV.

3. - El sistema de construcción dual según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la secuencia de ácido nucleico de la señal donante de ruptura consiste en la secuencia:

GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTT GCGTTTCT (SEQ ID NO.1) y/o en el que la secuencia de ácido nucleico de la señal aceptora de ruptura consiste en la secuencia:

GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG (SEQ ID NO:2).

4. - El sistema de construcción dual según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la secuencia codificadora es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína capaz de corregir una degeneración retiniana heredada.

5. - El sistema de construcción dual según la reivindicación 4, en el que la secuencia codificadora se selecciona del grupo que consiste en: ABCA4, MYO7A, CEP290, CDH23, EYS, USH2a, GPR98 o ALMS1.

6. - Un sistema de vector vírico de virus adenoasociado (AAV) dual, que comprende:

a) un primer vector vírico de AAV que contiene el primer plásmido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y

b) un segundo vector vírico de AAV que contiene el segundo plásmido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. - El sistema de vector vírico de AAV dual según la reivindicación ⁶ , en el que los vectores de virus adenoasociado (AAV) se seleccionan del mismo serotipo de AAV o de serotipos diferentes de AAV, preferiblemente el virus adenoasociado se selecciona del serotipo 2, el serotipo ⁸ , el serotipo 5, el serotipo 7 o el serotipo 9.

⁸ . - Una célula hospedante que comprende el sistema de vector vírico dual según una cualquiera de las reivindicaciones ⁶ a 7.

9. - El sistema de construcción dual según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el sistema de vector vírico dual según una cualquiera de las reivindicaciones ⁶ a 7, o la célula hospedante según la reivindicación ⁸ , para un uso médico, preferiblemente para un uso en terapia génica.

10. - El sistema de construcción dual, el sistema de vector vírico dual, la célula hospedante según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una patología o una enfermedad caracterizada por una degeneración retiniana, preferiblemente la degeneración retiniana es heredada, preferiblemente la patología o la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en: retinitis pigmentosa, amaurosis congénita de Leber (LCA), enfermedad de Stargardt, enfermedad de Usher, síndrome de Alstrom, una enfermedad provocada por una mutación en el gen ABCA4.

11. - Una composición farmacéutica que comprende el sistema de construcción dual según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el sistema de vector vírico dual según una cualquiera de las reivindicaciones ⁶ a 7, o la célula hospedante según la reivindicación ⁸ , y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. - Un ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO:3, o uno de sus fragmentos, que mantiene la propiedad recombinogénica de SEQ ID NO:3 para su uso como región recombinogénica.

13. - Un método in vitro para inducir la recombinación genética, que comprende usar la secuencia que consiste en SEQ ID NO:3, o uno de sus fragmentos, que mantiene la propiedad recombinogénica de SEQ ID NO:3.

14. - La secuencia que consiste en SEQ ID NO:3, o uno de sus fragmentos, que mantiene la propiedad recombinogénica de SEQ ID NO:3 para su uso en un método de tratamiento, preferiblemente mediante terapia génica, en la que el método induce la recombinación genética.