ES2907452T3 - Supresión y reemplazo genético - Google Patents

Abstract

Un vector para la expresión de un agente de supresión para un gen que causa una enfermedad y/o un ácido nucleico de reemplazo que no es reconocido por el agente de supresión, en el que el vector comprende la región B conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra como SEQ ID NO:408, y opcionalmente al menos una de las regiones conservadas seleccionada de: (a) la región C conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:94; (b) la región F y G conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:97; y (c) la región A conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra como SEQ ID NO:403; en el que dicho vector es un vector de virus adenoasociado (AAV).

Description

DESCRIPCIÓN

Supresión y reemplazo genético

Campo de la invención

La invención se refiere a la supresión independiente de mutaciones y al reemplazo de genes mutantes causantes de enfermedades.

Antecedentes de la invención

Muchas enfermedades basadas en mutaciones son genéticamente más diversas de lo que se puede predecir a partir de la presentación clínica. Algunas enfermedades basadas en mutaciones son mendelianas e implican la herencia de un solo gen mutante, otras son poligénicas o multifactoriales e implican múltiples agresiones genéticas. En el caso de algunos trastornos mendelianos, muchas mutaciones diferentes dentro del mismo gen pueden dar lugar a una enfermedad o pueden predisponer a un individuo a ella. De manera similar, para algunos trastornos multifactoriales, muchas mutaciones diferentes dentro de uno o más genes pueden predisponer a un individuo a una enfermedad o pueden actuar de manera acumulativa con otras influencias genéticas y ambientales para dar lugar a una enfermedad. Esta heterogeneidad mutacional subyacente a las etiologías moleculares de muchas enfermedades representa una barrera significativa para el desarrollo de terapias para tales enfermedades. Además, las estrategias genéticas para suprimir y reemplazar una proteína mutante enfrentan muchos desafíos con respecto a la eficacia de la maquinaria utilizada para administrar y regular la expresión de los ácidos nucleicos supresores y de reemplazo in vivo. Por lo tanto, existe la necesidad de tratamientos eficaces independientes de mutaciones que consigan una supresión y un reemplazo eficaces.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones. Se relaciona con la supresión y el reemplazo de genes. En particular, la invención se refiere a la expresión mejorada de agentes de supresión para suprimir la expresión génica en una célula e in vivo y de ácidos nucleicos de reemplazo que no son inhibidos y/o son inhibidos parcialmente por el agente de supresión. Los vectores de expresión utilizados para expresar el agente o agentes de supresión y los ácidos nucleicos de reemplazo comprenden elementos reguladores para optimizar la expresión del agente o agentes de supresión y/o los ácidos nucleicos de reemplazo.

La invención incluye el uso de genes de reemplazo usando secuencias para potenciar la expresión de genes de reemplazo procedentes de vectores virales y no virales. En otro aspecto, la invención se refiere a la expresión potenciada de uno o más agentes de supresión y/o genes de reemplazo procedentes de vectores virales o no virales. En una realización adicional, la invención se refiere a la expresión mejorada de uno o más agentes de supresión y/o genes de reemplazo y/o genes que codifican factores neurotróficos procedentes de vectores virales y/o no virales.

En un aspecto, la invención se refiere al uso de secuencias conservadas de genes retinianos para potenciar la expresión de uno o más agentes de supresión y/o genes de reemplazo y/o genes que codifican factores neurotróficos. Se ha descubierto que el uso de tales secuencias conservadas da como resultado una expresión sorprendentemente eficaz. En un aspecto particular, la invención se relaciona con el uso de secuencias conservadas de genes retinianos para mejorar la expresión de uno o más agentes de supresión y/o genes de reemplazo y/o genes que codifican factores neurotróficos procedentes de vectores de virus adenoasociados (AAV). En otro aspecto, la invención proporciona vectores para la expresión de uno o más agentes de supresión y/o uno o más genes de reemplazo y/o genes que codifican factores neurotróficos usando secuencias reguladoras de uno o más genes retinianos y/o de uno o más genes no retinianos y/o que expresan de forma ubicua genes para mejorar la expresión desde los vectores.

En un aspecto, la invención proporciona vectores para expresar un agente de supresión para un gen que provoca una enfermedad y/o un ácido nucleico de reemplazo que no es reconocido o es parcialmente reconocido por el agente de supresión.

En una realización, el vector comprende una secuencia potenciadora, como, por ejemplo, una secuencia de SEQ ID NO:402-413.

En otra realización, el vector comprende al menos un elemento regulador seleccionado del grupo que consiste en un promotor, un relleno, un aislante, un silenciador, una secuencia de intrón, un elemento regulador postraduccional, un sitio de poliadenilación y un sitio de unión al factor de transcripción.

En otra realización, el vector comprende al menos una de las regiones conservadas A a I del gen de la rodopsina, como se representa por SEQ ID NO:92-99.

En otra realización, el vector comprende al menos una secuencia del sitio de unión al factor de transcripción seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:100-401, o variante funcional o equivalente de la misma.

El agente de supresión puede ser un ácido nucleico, proteína, uno o más aminoácidos, anticuerpo, aptámero o cualquier agente que pueda unirse e inhibir un ADN, ARN o proteína. En una realización, el agente de supresión es un ARNip seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35-67, 75, 77, 79, 81,83, 85 y 414-421.

El efector de supresión no reconoce al ácido nucleico de reemplazo o lo reconoce parcialmente, porque su secuencia se ha alterado de tal manera que no puede unirse o se une de manera menos eficaz al agente de supresión, pero aún codifica un producto génico normal o mejorado. En una realización, el ácido nucleico de reemplazo es un ARNip seleccionado del grupo que consiste en s Eq ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 68, 76, 78, 80, 82, 84 y 86.

En una realización, la invención proporciona vectores, tales como vectores virales, que comprenden un agente de supresión y/o un ácido nucleico de reemplazo. Por ejemplo, el vector comprende al menos una secuencia de nucleótidos del agente de supresión seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 , 29, 31, 33, 35-67, 75, 77, 79, 81, 83 y 85, y al menos una secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de reemplazo seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 68, 76, 78, 80, 82, 84 y 86.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden al menos un vector que comprende al menos una secuencia de nucleótidos del agente de supresión seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35-67, 75, 77, 79, 81, 83, 85 y 414-421, y al menos una secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de reemplazo seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 68, 76, 78, 80, 82, 84 y 86.

En una realización, el vector de la composición terapéutica comprende además un elemento regulador seleccionado del grupo que consiste en un potenciador, un promotor, un relleno, un aislante, un silenciador, un antirrepresor, una secuencia de intrón, un elemento regulador postraduccional, una señal de poliadenilación (por ejemplo, poli A mínimo), una región conservada A a I y un sitio de unión al factor de transcripción.

En otro aspecto, la invención proporciona una supresión y una sustitución junto con la provisión de un gen que codifica un factor o factores neurotróficos/neuroprotectores.

En otro aspecto, la invención proporciona células que comprenden los ácidos nucleicos y los vectores de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona animales transgénicos que comprenden los ácidos nucleicos y los vectores de la invención.

En otro aspecto más, la invención proporciona métodos para suprimir la expresión de un gen mutante y reemplazar la expresión del gen mutante con un ácido nucleico de reemplazo, comprendiendo dicho método administrar a un mamífero una composición terapéutica de la invención.

En otro aspecto más, la invención proporciona métodos para suprimir la expresión de un gen mutante y reemplazar la expresión del gen mutante con un ácido nucleico de reemplazo junto con un gen que codifica uno o más factores neurotróficos/neuroprotectores, comprendiendo dicho método administrar a un mamífero una composición terapéutica de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Los anteriores y otros objetos, características y ventajas de la presente invención, así como la propia invención, se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferidas cuando se lean junto con los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 ilustra construcciones de supresión y reemplazo RHO. La figura 1A es una representación esquemática de una construcción de supresor de RHO-EGFP shBB-EGFP (shQ1-EGFP y shNT-EGFP tienen el mismo formato). Los ARNhc se expresaron a partir del promotor H1 y EGFP procedentes del promotor temprano inmediato de CMV. La señal de poliadenilación de SV40 se localizó en el extremo 3' del gen EGFP. La figura 1B ilustra una construcción de supresión y reemplazo de dos componentes shBB-rBB (shQ1-rQ1 y shNT-rBB tienen el mismo formato). Los supresores se expresaron a partir de ADNc del promotor H1 y reemplazo de RHO a partir de un promotor de rodopsina de ratón (rhoP) de 1,7 kb. Se incluyeron señales de poliadenilación del gen RHO en el fragmento de 1829 pb. HGH int: intrón de la hormona del crecimiento humana. Para el cultivo de tejidos y los experimentos de explantes de retina, estas construcciones se mantuvieron en pEGFP-1 (A) o en un derivado sin promotor de CMV de pcDNA-3.1- (B) y, para los experimentos in vivo, en el vector AAV. Se indican los sitios de las enzimas de restricción utilizados para la clonación. Los promotores se separaron mediante fragmentos de ADN espaciador. Los números indican tamaños moleculares (pb) y las flechas indican la dirección de la transcripción.

La figura 2 ilustra la supresión de RHO en células HeLa. Las células HeLa se cotransfectaron transitoriamente tres veces por triplicado con ARNip de RHO de tipo salvaje y dirigidos a RHO (siB, siBB, siC, siCC, siQ1 o siQ2) o ARNip de control (siEGFP o siNT). Después de la transfección, se evaluaron los niveles de ARNm y de proteína RHO mediante RT-PCR en tiempo real (A), ELISA (A) e inmunocitoquímica marcada con Alexa Fluor 568 (B). Los núcleos celulares se contrastaron con DAPI. Las barras de error representan valores de DE.

La figura 3 ilustra el reemplazo de la expresión de RHO junto con la supresión en células HeLa. El reemplazo de la secuencia de RHO se generó con nucleótidos degenerados alterados en sitios diana de ARNip. Las células HeLa se cotransfectaron transitoriamente tres veces por triplicado con un vector de expresión de reemplazo de RHO (rBB, rCC o rQ1) y un ARNip dirigido a RHO (siBB, siCC o siQ1) o un ARNip no dirigido (siNT). Se evaluaron los niveles de ARNm de RHO de reemplazo mediante RT-PCR en tiempo real. Las barras de error representan valores de DE.

La figura 4 ilustra la supresión de RHO en explantes de retina. Retinas de ratón (n = 6), diseccionadas de cachorros recién nacidos NHR+/- rho-/-(ratones transgénicos que expresan un transgén de rodopsina humana NHR en un trasfondo de inactivación de rodopsina de ratón rho-/-), se sometieron a electroporación con una construcción que coexpresa un ARNhc dirigido a RHO o un ARNhc no dirigido y EGFP (shBB-EGFP, shQ1-EGFP o shNT-EGFP). Los explantes de control negativo no se sometieron a electroporación. Se disociaron cultivos organotípicos de dos semanas con tripsina y se analizaron mediante FACS. Los puntos rojos y azules (poblaciones derecha e izquierda respectivamente en cada uno de A1 y A2) representan poblaciones acotadas y no acotadas de explantes disociados. Se muestran diagramas de dispersión directa (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) e histogramas de fluorescencia EGFP de la población acotada de retinas no electroporadas (A1 y A2, EGFP-negativo) y electroporadas (A3 y A4, EGFP-positivo). El gráfico de barras indica los niveles de ARNm de RHO en células de explante de retina que expresan sNT-EGFP, sBB-EGFP y sQ1-EGFP, cuantificados mediante RT-PCR en tiempo real. Las barras de error representan valores de DE.

La figura 5 ilustra la supresión de RHO supresión en células de fotorreceptores in vivo. A ratones adultos transgénicos NHR+/- rho-/- se les inyectó subretinalmente 3 gl, 2x1012 vp/ml de AAV que coexpresa un ARNhc dirigido o no dirigido a RHO y EGFP (AAV-shBB-EGFP o AAV-shNT-EGFP). Las retinas se analizaron dos semanas después de la inyección. La expresión del ARNhc BB de 21 nucleótidos (nt), detectada mediante protección con RNasa en dos retinas transducidas, se representa en los carriles L1 y L2 (A). Las sondas de ARN de RHO se marcaron con P32-yATP, y el ARN protegido se separó en geles de acrilamida desnaturalizantes al 15 % (A). M: el marcador de tamaño indica 10, 20 y 30 nt. Las barras representan los niveles de ARNm de RHO en células clasificadas por FACS procedentes de retinas disociadas (n = 6) transducidas con AAV-shBB-EGFP o AAV-shNT-EGFP (B). Los niveles de supresión se determinaron mediante RT-PCR en tiempo real. Las barras de error representan valores de DE. Se muestra la inmunocitoquímica de rodopsina (marcada con Cy3) y la expresión de proteína EGFP en células de retinas disociadas, transducidas con AAV-shBB-EGFP (flechas) o AAV-shNT-EGFP (puntas de flecha) (C). Los núcleos celulares se contrastaron con DAPI.

La figura 6A-D ilustra la histología retiniana y el análisis ERG de ratones RHO-M. Se analizaron ratones de dos meses rho+/+ (tipo salvaje), rho+/-, NHR+/- rho-/- y RHO-M+/- rho-/- mediante histología retiniana y ERG (n=8). A, B y C: inmunocitoquímica de rodopsina (Cy3) que muestra un marcaje similar del segmento externo de bastones (ROS) en retinas rho+/+, NHR+/- rho-/- y RHO-M+/- rho-/-, respectivamente. Las capas nucleares se tiñeron con DAPI. D: respuestas de ERG representativas aisladas de bastones. ONL: capa nuclear externa. INL: capa nuclear interna. GCL: capa de células ganglionares.

La figura 6E ilustra la supresión mediada por ARNi de rodopsina humana en ratones RHO-M. A los ratones RHO-M se les inyectaron por vía subretiniana vectores AAV2/5 que portaban un supresor basado en ARNhc y un gen indicador EGFP. Los ratones se sacrificaron 14 días después de la inyección, se tomaron las retinas y las células retinianas se disociaron tal como en Palfi et al., 2006. La supresión mediada por ARNi se evaluó mediante ensayos de RT-PCR en tiempo real. Las células retinianas transducidas con AAV-shBB-EGFP, AAV-shCC-EGFP y AAV-shQ1 -EGFP frente a AAV-shNT-EGFP se clasificaron mediante FACS a partir de retinas de ratones RhoM adultos, 14 días después de la inyección subretiniana. Cabe destacar que AAV-shCC-EGFP suprime RHO menos en ratones RHO-M debido a la presencia de un desapareamiento de 2 pb en la rodopsina humana transgénica en animales RHO-M. Los niveles de expresión de rodopsina fueron shCC: 59,73 %; shBB: 8,77 %; shQ1: 20,6 % en comparación con el shNT de control no dirigido que se estableció como una expresión del 100 %.

La figura 6F ilustra la depresión de la respuesta ERG en ojos RHO-M que han recibido AAV-shBB-EGFP o AAV-shQ1 -EGFP en comparación con ojos inyectados subretinalmente con AAV-shNT-EGFP. El trazo superior en cada panel representa el ojo derecho que recibió el vector AAV-ARNhc dirigido, y el trazo inferior en cada panel representa el ojo izquierdo que recibió el vector AAV-shNT no dirigido de control. Por contraste, no se observó reducción/depresión de ERG en ratones RHO-M a los que se inyectó subretinalmente el vector AAV-shCC-EGFP.

La figura 7 ilustra la expresión de RHO de reemplazo in vivo. A ratones rho-/- de diez días de edad se les inyectó subretinalmente una mezcla 1:1 de 2 gl, 2x1012 vp/ml de dos vectores AAV, AAV-EGFP (también denominado AAV-CMV-EGFP) y AAV-shBB-rBB (también denominado AAV-BB8). La rodopsina, la proteína EGFP y los núcleos se detectaron mediante inmunocitoquímica marcada con Cy3, fluorescencia nativa y tinción con DAPI nuclear, respectivamente. Las imágenes de bajo aumento muestran una sección transversal de un ojo entero inyectado con puntas de flecha que indican el área transducida (A y B). Las micrografías de barrido láser de gran aumento muestran áreas transducidas (C y D) y no transducidas (E y F). INL: capa nuclear interna. GCL: capa de células ganglionares. ROS: segmentos externos de bastones. ONL: capa nuclear externa. La figura 7 proporciona pruebas de la expresión de la proteína rodopsina a partir de genes de reemplazo en secciones de retina obtenidas de ratones rho-/- inyectados subretinalmente con vectores de supresión y reemplazo AAV2/5.

La figura 8 ilustra la histología de las retinas Pro23His transducidas con AAV. A ratones recién nacidos Pro23His+/-rho+/- se les inyectó subretinalmente 1 gl, 2x1012 vp/ml de AAV-shBB-rBB o AAV-EGFP (n = 6). Diez días después de la transducción, los ojos se procesaron con cortes semidelgados y se tiñeron con azul de toluidina. Se tomaron aproximadamente 40 mediciones en tres capas por ojo del espesor (gm) de la capa nuclear externa (ONL). A: las barras representan el grosor de ONL, del meridiano central del ojo, de los valores del 15 % más bajo y más alto (p<0,01). B y C: imágenes representativas de las secciones inyectadas con AAV-shBB-rBB y AAV-EGFP (control) correspondientes a los valores de espesor de ONL más altos. Las flechas amarillas indican el grosor de ONL. INL: capa nuclear interna. GCL: capa de células ganglionares. Las barras de error representan valores de DE.

La figura 9 ilustra las construcciones de supresión y/o sustitución utilizadas para generar virus AAV2/5 recombinantes utilizando los procedimientos proporcionados en el ejemplo 1. Construcciones de supresión o reemplazo de RHO, pAAV-BB8, pAAV-BB9, pAAV-BB10, pAAV-BB11, pAAV-BB12, pAAV-BB13, pAAV-BB18, pAAV-BB26/Q26, pAAV-BB16, pAAV-BB24 y pAAV-BB27. También se proporcionan ilustraciones de algunas construcciones de control (pAAV-rho-EGFP y pAAV-CMV-EGFP). También se proporcionan construcciones de supresión con genes indicadores de EGFP (pAAV-shBB-EGFP, pAAV-shQ1-EGFP, pAAV-shCC-EGFP). Los supresores se expresaron a partir del ADNc del promotor H1 y de RHO de reemplazo a partir de secuencias de promotor de rodopsina de ratón de diferentes tamaños. HGH int: intrón de la hormona del crecimiento humano. CRX-NRL indica el elemento potenciador de SEQ ID NO:94. Se indican los sitios de las enzimas de restricción usados para la clonación. Los promotores se separaron mediante fragmentos de ADN espaciador. Los números indican tamaños moleculares (pb) y las flechas indican la dirección de la transcripción. En particular, cualquier combinación de los elementos y las regiones conservadas descritos y, de hecho, otros elementos que puedan modular la expresión génica, podrían usarse en la invención para ejercer control sobre la expresión de componentes de supresión y/o reemplazo.

La figura 10 ilustra una comparación de los niveles de expresión del transgén Rho-M frente a los obtenidos a partir de las construcciones de supresión y sustitución en AAV2/5 y representados en la figura 9, usando protección con RNasa. La figura 10 indica que las construcciones de supresión y reemplazo (véase la figura 9) introducidas en AAV2/5, AAV-BB8, AAV-BB10, AAV-BB11, AAV-BB12, AAY-BB13 y AAV-BB16 expresan el gen de reemplazo de la rodopsina humana en ARN extraído de 129 ratones de tipo salvaje inyectados subretinalmente con construcciones de supresión o reemplazo (los carriles con material procedente de ojos de ratón inyectados con AAV-BB8 están indicados por BB8, AAV-BB10 por BB10, AAV-BB11 por BB11, etc.; las construcciones de plásmidos utilizadas para generar vectores AAV están escritas en el formato pAAV como se presenta en la figura 9). BB8, BB10 y BB11 expresan rodopsina a niveles más bajos que BB12, BB13 y BB16.

La figura 11 proporciona un análisis comparativo de la expresión de rodopsina a partir de vectores de supresión y sustitución rAAV2/5 usando RT-PCR en tiempo real. La figura 11 ilustra los niveles de expresión de rodopsina de reemplazo en ARN extraído de 129 ratones de tipo salvaje inyectados subretinalmente con construcciones de supresión y/o reemplazo. Los niveles de expresión también se determinaron en ratones transgénicos Rho-M que expresan una construcción de reemplazo de rodopsina rCC y muestran una función retiniana normal. Las construcciones de supresión y reemplazo BB12, BB13, BB16 y BB18 se expresan aproximadamente en el mismo orden de magnitud que los niveles de transcrito de rodopsina de reemplazo en ratones Rho-M, lo que indica que las construcciones de reemplazo mejoradas con elementos potenciadores y regiones conservadas pueden expresar niveles suficientes de rodopsina para mantener una retina funcional in vivo (los carriles con material procedente de ojos de ratón inyectados con AAV-BB8 se indican con BB8, AAV-BB10 con BB10, AAV-BB11 con BB11, etc.)

La figura 12 ilustra la histología retiniana de retinas adultas de tipo salvaje a las que se les inyectó subretinalmente 2 ul de 2x1012 partículas/ml de diferentes vectores AAV de reemplazo de r Ho (véase la figura 9). Dos semanas después de la inyección, se extrajeron los ojos transducidos, se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se criocortaron (12 um). Posteriormente, las secciones se tiñeron con anticuerpo anti-RHO específico humano para visualizar la expresión del RHO de reemplazo utilizando el marcador Cy3 (rojo) en el anticuerpo secundario; los núcleos celulares se contrastaron con DAPI (azul). A: AAV-BB8, B: AAV-BB13, C: a Av -BB24, D: AAV-Q8, E: AAV-Q26, F: retina de ratón transgénico RhoM no inyectado que expresa RHO (control positivo). Las secciones indican diferentes niveles de expresión de RHO en las secciones. OS: segmentos externos de fotorreceptores; IS: segmentos internos de fotorreceptores; ONL: capa nuclear externa; INL: capa nuclear interna; GCL: capa de células ganglionares.

La figura 13 ilustra la histología retiniana de ratones transgénicos NHR adultos en un trasfondo rho-/-, que expresan, por lo tanto, la RHO humana normal, pero no la rho de ratón. Estos ratones fueron transducidos con una inyección subretiniana de 2 ul de 2x1012 partículas/ml de AAV-shQ1-EGFP (A) o AAV-shNT-EGFP (B). Dos semanas después de la inyección, se extrajeron los ojos, se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se criocortaron. AAV-shQ1-EGFP expresa ARNhc-Ql, que se dirige a RHO, mientras que AAV-shNT-EGFP expresa un ARNhc no dirigido (la figura 9 ilustra ejemplos de construcciones). Ambas construcciones expresan EGFP, lo cual permite el seguimiento de las poblaciones de células transducidas (verde). Las secciones se contrastaron con DAPI (azul) para marcar la posición de las capas nucleares. Es evidente una reducción significativa en el número de células de fotorreceptores en la parte transducida de la capa nuclear externa en las retinas inyectadas con AAV-shQ1-EGFP (A) en comparación con las retinas inyectadas con AAV-shNT-EGFP (B). IS: segmentos internos de los fotorreceptores; ONL: capa nuclear externa; INL: capa nuclear interna; GCL: capa de células ganglionares.

La figura 14A-C ilustra la histología retiniana de ratones transgénicos RHO-347 adultos que portan una mutación RHO dominante en un trasfondo rho+/+ de ratón que causa degeneración retiniana a los que se les inyectó subretinalmente 2 ul de 2x1012 partículas/ml de vectores AAV-shNT-EGFP (A) o AAV-shQ1-EGFP (B). Dos semanas después de la inyección, se extrajeron los ojos transducidos, se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se criocortaron (12 um). AAV-shQ1-EGFP expresa ARNhc-Ql-EGFP, que se dirige a Rh O, mientras que AAV-shNT-EGFP expresa un ARNhc no dirigido. Ambas construcciones expresan EGFP, lo cual permite el seguimiento de la parte transducida de la retina (verde). Las secciones se contrastaron con DAPI (azul) para indicar las posiciones de las capas nucleares. Es evidente una reducción significativa del número de células de fotorreceptores en la parte transducida de la capa nuclear externa en las retinas AAV-shNT-EGFP inyectadas o no inyectadas (C), debido a los efectos degenerativos del transgén RHO-347. Se detecta una capa nuclear externa significativamente conservada en las retinas transducidas con AAV-shQ1-EGFP, en las que ARNhc-Ql-EGFP suprime de manera eficaz el transcrito de RHO-347, lo que reduce la degeneración de la retina. Nótese que el ratón rho (expresado en estas retinas) es refractario a la supresión por ARNhc-Ql-EGFP debido a la presencia de cambios de nucleótidos en el sitio diana para la supresión de ARNip Q1. La supresión y el reemplazo utilizando la degeneración del código genético proporcionó un beneficio terapéutico a nivel histológico. La figura 14D proporciona pruebas de una mejora en el electrorretinograma (ERG) en ojos RHO-347 tratados con AAV-shQ1-EGFP frente a ojos tratados con AAV-shNT-EGFP. La figura 14D proporciona una respuesta de ERG máxima representativa de un ratón RHO-347, que contiene un transgén de rodopsina humana con una mutación en el codón 347, inyectado subretinalmente con construcciones AAV2/5. Este ratón RHO-347 normalmente muestra un fenotipo similar al RP autosómico dominante. El panel superior de la figura 14D es la respuesta del ojo derecho, que recibió una inyección de AAV-shQ1, un vector AAV2/5 que contiene ARNip supresor Q1 dirigido por un promotor H1 (shQ1) y un gen EGFP dirigido por CMV. El ojo izquierdo recibió un AAV-shNT, un AAV2/5 que contenía un ARNip que no realiza el transporte dirigido (control) dirigido por un promotor H1 (shNT) y un gen EGFP dirigido por CMV. Como puede verse en la figura 14D, la respuesta máxima es significativamente mayor en el ojo derecho tratado que en el ojo izquierdo de control, lo que indica que la supresión del transgén de rodopsina mutante conduce a cierto rescate a nivel de ERG.

La figura 15 ilustra ejemplos de construcciones que utilizan elementos de apertura de cromatina para optimizar la expresión. Los componentes utilizados para potenciar la expresión pueden clonarse en vectores, tales como vectores AAV. Los elementos para optimizar la expresión de un gen dado pueden combinarse con otros elementos de promotor, tales como el promotor de rodopsina y/o secuencias potenciadoras o, como alternativa, pueden usarse secuencias que modulan las estructuras de la cromatina y dirigen la expresión génica por sí solas para facilitar la optimización de la expresión de un gen diana.

La figura 16 muestra ejemplos de secuencias de elementos que pueden facilitar la modulación de estructuras de cromatina.

La figura 17 muestra las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de una serie de ejemplos de factores neurotróficos.

La figura 18 ilustra ejemplos de construcciones de supresión y reemplazo que contienen otros elementos genéticos que son beneficiosos para la supervivencia de las células de fotorreceptores. En el ejemplo, pAAV-BB18 se ha combinado con el factor neurotrófico GDNF, dirigido por un pequeño UCOE (elemento de apertura de la cromatina, A. Thrasher, resumen 36, 5° Congreso Anual de la Sociedad Británica de Terapia Génica, 2008), promotor). También se pueden usar otros factores neurotróficos como, por ejemplo, neurturina en combinación con cualquiera de las construcciones de supresión y reemplazo descritas. Además, también pueden combinarse otros genes beneficiosos, distintos de los factores neurotróficos, con las construcciones de supresión y reemplazo tales como, por ejemplo, un segundo elemento de supresión, un segundo elemento de reemplazo, VEGF y otros. En el ejemplo A, el elemento adicional, en este caso GDNF, se ubica junto con la construcción de supresión y reemplazo dentro de las dos secuencias de repetición terminales invertidas de a Av , ITR1 e ITR2. En el segundo ejemplo, B, el gen GDNF y su promotor no se ubican junto con los elementos de supresión y reemplazo dentro de ITR1 e ITR2, sino que se ubican dentro del esqueleto del plásmido utilizado para generar AAV. Dado que una pequeña proporción del esqueleto se encapsula durante la producción de AAV, esto daría como resultado una población mixta de AAV, en la que la mayoría contiene los elementos de supresión y reemplazo, y una minoría contiene los elementos GDNF. En este caso, también pueden combinarse otros genes beneficiosos, distintos de los factores neurotróficos, con construcciones de supresión y reemplazo tales como, por ejemplo, un segundo elemento de supresión, un segundo elemento de reemplazo, VEGF y otros.

Descripción detallada de la invención

La presente invención utiliza la supresión de genes eficaz junto con el reemplazo de genes para superar el desafío de la heterogeneidad mutacional. El agente de supresión no se dirige necesariamente a una mutación (aunque puede abarcar el sitio de una mutación), sino que es independiente de la mutación. La supresión puede implicar a uno o a ambos alelos de un gen endógeno. Junto con la supresión, se proporciona un gen de reemplazo que ha sido modificado de manera que el gen de reemplazo es refractario o parcialmente refractario a la supresión. La invención utiliza la degeneración del código genético para modificar el gen de reemplazo. La alteración de las bases “titubeantes” hace posible que los ácidos nucleicos de reemplazo escapen a la supresión al menos en parte, pero no cambia el producto proteico expresado a partir de los ácidos nucleicos de reemplazo. Como alternativa, los genes de reemplazo se modifican de tal manera que codifican aminoácidos alterados, pero siguen codificando una proteína funcional o parcialmente funcional que no conduce a una patología (por ejemplo, porque los cambios de aminoácidos son mutaciones silenciosas o polimorfismos). Sin embargo, se ha demostrado que se puede realizar un reemplazo usando ácidos nucleicos de rodopsina y se pueden usar otros genes o combinaciones de genes en la práctica de la invención. En particular, la invención se relaciona con la modulación y la optimización de los niveles de expresión de los agentes de supresión y/o ácidos nucleicos de reemplazo utilizando una o más de las regiones no traducidas (“untranslated regions”, UTR) de un gen, secuencias intrónicas, la degeneración del código genético y/o polimorfismos para alterar la secuencia de los ácidos nucleicos de reemplazo para que sean refractarios o parcialmente refractarios a la supresión.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para preparar y usar un agente de supresión y un ácido nucleico de reemplazo. El agente de supresión se une a una región codificadora de un ARN o ADN maduro que codifica un alelo mutante e inhibe la expresión del alelo mutante. El ácido nucleico de reemplazo codifica un alelo de tipo salvaje o que no causa enfermedad y comprende al menos un nucleótido degenerado/titubeantes que está alterado de modo que el ácido nucleico de reemplazo no se suprime, o solo se suprime parcialmente, por la supresión de uno o ambos. alelos de un gen.

La invención proporciona genes de reemplazo usando secuencias para potenciar la expresión de genes de reemplazo procedentes de vectores virales y no virales. En particular, la invención se refiere a la expresión mejorada de uno o más agentes de supresión y/o genes de reemplazo procedentes de vectores virales y no virales. La invención se refiere al uso de secuencias conservadas de genes retinianos para potenciar la expresión de uno o más agentes de supresión y/o genes de reemplazo. En un aspecto particular, la invención se refiere al uso de secuencias conservadas de genes retinianos para potenciar la expresión de uno o más agentes de supresión y/o genes de reemplazo procedentes de vectores de virus adenoasociados (AAV). En otro aspecto, la invención proporciona vectores para la expresión de uno o más agentes supresores y/o genes de reemplazo usando secuencias reguladoras procedentes de uno o más genes retinianos y/o genes no retinianos y/o genes que se expresan de forma ubicua, tales como los proporcionados en las siguientes tablas para potenciar la expresión de vectores virales y no virales.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un agente de supresión que se une a la región codificadora de un ARN o ADN maduro y/o inmaduro que codifica un alelo mutante para inhibir la expresión del alelo mutante y un ácido nucleico de reemplazo que codifica un alelo salvaje o un alelo que no causa enfermedad y comprende al menos un nucleótido degenerado/titubeante que está alterado de manera que el ácido nucleico de reemplazo no es suprimido, o solo es suprimido parcialmente, por el agente de supresión.

En otro aspecto más, la invención proporciona un kit que comprende un agente de supresión que suprime la expresión de un ARN o ADN maduro o inmaduro que codifica un alelo mutante y un ácido nucleico de reemplazo que codifica un alelo de tipo salvaje o que no causa enfermedad, que es no suprimido, o solo es parcialmente suprimido, por el agente de supresión y difiere del alelo mutante en al menos un nucleótido degenerado/titubeante.

La supresión se logra utilizando una amplia diversidad de herramientas moleculares, como, por ejemplo, el ARN de interferencia (ARNi), incluidos los ARN no codificadores, como el ARN de interferencia pequeño (ARNip), el ARN de horquilla corta (ARNhc), los microARN (miARN) u otras moléculas basadas en nucleótidos. En una realización, los ARNip del orden de 14-27 nucleótidos de longitud se utilizan para la supresión génica. Los ARNhc se pueden usar para expresar ARNip funcionales intracelularmente y para lograr la supresión in vitro e in vivo. Otras moléculas de supresión incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos sentido y antisentido (monocatenarios o bicatenarios), ribozimas, péptidos, ADNzimas, ácidos nucleicos peptídicos (ANP), oligonucleótidos formadores de triple hélice, anticuerpos y aptámeros y formas modificadas de los mismos dirigidas a secuencias en uno o más genes, transcritos de ARN o proteínas.

En una realización, la invención se refiere a uno o más vectores para suministrar un agente de supresión generado endógenamente, tal como, por ejemplo, un ARNbc en forma de horquilla corta (ARNhc) que puede procesarse intracelularmente para formar ARNip. El ARNbc puede administrarse local o sistémicamente. Los vectores de expresión se usan para generar ARNip funcionales en células y en animales que normalmente usan promotores de polimerasa III para dirigir la expresión, aunque también se usan promotores de polimerasa II. Por ejemplo, las estructuras de miARN se pueden usar para expresar ARN bicatenarios a partir de promotores de polimerasa II para permitir la expresión específica de tejido de ARN bicatenario o los promotores de polimerasa II se pueden yuxtaponer a las secuencias de ARNhc que se van a expresar.

Los agentes de supresión pueden modificarse para alterar la potencia del agente de supresión, la afinidad de la diana del agente de supresión, el perfil de seguridad del agente de supresión y/o la estabilidad del agente de supresión, por ejemplo, para hacerlos resistentes o parcialmente resistentes a degradación intracelular. Se pueden realizar modificaciones, tales como fosforotioatos, por ejemplo, en los oligonucleótidos para aumentar la resistencia a la degradación por nucleasas, la afinidad de unión y/o la captación. Además, la hidrofobización y la bioconjugación mejoran el transporte y la localización dirigida del ARNip (De Paula et al., ARN, 13(4):431-456, 2007) y los ARNip con nucleótidos de ribo-difluorotoluilo mantienen la actividad de silenciamiento génico (Xia et al., ASC Chem. Biol., 1(3): 176-183, 2006). Se han generado ARNip con oligorribonucleósidos unidos a amida que son más resistentes a la degradación de la nucleasa S1 (Iwase R. et al., 2006 Nucleic Acids Symp. Ser., 50: 175-176). Además, la modificación del ARNip en la posición 2'-azúcar y el enlace fosfodiéster confiere una estabilidad en suero mejorada sin pérdida de eficacia (Choung et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 342(3):919-926, 2006). En un estudio, los oligonucleótidos antisentido que contenían ácido 2'-desoxi-2'-fluoro-beta-D-arabinonucleico (FANA) obtuvieron mejores resultados que los oligonucleótidos de fosforotioato, los oligonucleótidos quiméricos 2'-O-metil-ARN/ADN y los ARNip en términos de potencia de supresión y resistencia a la degradación (Ferrari N. et al., 2006 Ann. NY Acad. Sci., 1082:91-102).

Las estrategias de supresión de ribozimas y antisentido han conducido a la reversión de un fenotipo tumoral al reducir la expresión de un producto génico o al escindir un transcrito mutante en el sitio de la mutación (Carter y Lemoine, Br.

J. Cáncer, 67(5):869-876, 1993; Lange et al., Leukemia, 6(11):1786-1794, 1993; Valera et al., J. Biol. Chem., 269(46):28543-28546, 1994; Dosaka-Akita et a l, Am. J. Clin. Pathol., 102(5):660-664, 1994; Feng et al., Cancer Res., 55(10):2024-2028, 1995; Quattrone et a l, Cancer Res., 55(1):90-95, 1995; Lewin et a l, Nat. Med., 4(8):967-971, 1998). Por ejemplo, se obtuvo una reversión neoplásica utilizando una ribozima dirigida a una mutación H-ras en células de carcinoma de vejiga (Feng et al., Cancer Res., 55(10):2024-2028, 1995). Las ribozimas también se han propuesto como un medio tanto para inhibir la expresión génica de un gen mutante como para corregir el mutante mediante cortes y empalmes en trans dirigidos (Sullenger y Cech, Nature, 371 (6498): 619-622, 1994; Jones et al., Nat. Med., 2(6):643-648, 1996). La actividad de la ribozima puede aumentarse mediante el uso, por ejemplo, de proteínas de unión a ácidos nucleicos no específicas u oligonucleótidos facilitadores (Herschlag et al., Embo J., 13(12):2913-2924, 1994; Jankowsky y Schwenzer, Nucleic Acids Res., 24(3):423-429,1996). Las ribozimas de dianas múltiples (conectadas o de pistola) se han sugerido como un medio para mejorar la eficiencia de las ribozimas para la supresión de genes (Ohkawa et al., Nucleic Acids Symp. Ser., (29):121-122, 1993).

También se han investigado estrategias de triple hélice para la supresión de genes específica de secuencia. En algunos casos, se ha descubierto que los oligonucleótidos formadores de tríplex se unen de una manera específica de secuencia (Postel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(18):8227-8231,1991; Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(2):504-508, 1992; Hardenbol y Van Dyke, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(7):2811-2816, 1996; Porumb et al., Cancer Res., 56(3):515-522, 1996). De manera similar, se ha demostrado que los ácidos nucleicos peptídicos inhiben la expresión génica (Hanvey et al., Antisense Res. Dev., 1 (4):307-317, 1991; Knudsen y Nielson, Nucleic Acids Res., 24(3):494-500, 1996; Taylor et al., Arch. Surg., 132(11):1177-1183, 1997). Las poliamidas que se unen al surco menor se pueden unir de una manera específica de secuencia a dianas de ADN y, por lo tanto, pueden representar moléculas pequeñas útiles para la supresión futura a nivel de ADN (Trauger et al., Chem. Biol., 3(5):369-377, 1996). Además, la supresión se ha obtenido por interferencia a nivel de proteína utilizando péptidos mutantes negativos dominantes y anticuerpos (Herskowitz, Nature, 329 (6136):219-222, 1987; Rimsky et al., Nature, 341(6241):453-456, 1989; Wright et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(9):3199-3203, 1989). En algunos casos, las estrategias de supresión han conducido a una reducción en los niveles de ARN sin una reducción concomitante en las proteínas, mientras que, en otros, las reducciones en el ARN se han reflejado en reducciones en la proteína.

La diversa gama de estrategias de supresión que se pueden emplear incluye el uso de aptámeros de ADN y/o ARN que se pueden seleccionar para dirigirse, por ejemplo, a una proteína de interés, tal como la rodopsina. En el caso de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), se han generado aptámeros anti-VEGF y se ha demostrado que proporcionan un beneficio clínico en algunos pacientes con AMD (Ulrich H., et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 9: 619-632, 2006). En la invención podría usarse la supresión y el reemplazo usando aptámeros para la supresión junto con un gen de reemplazo modificado y una proteína codificada que es refractaria o parcialmente refractaria a la supresión basada en aptámeros.

Pruebas recientes sugieren que el control de la expresión génica se produce de forma endógena en parte por la actividad de pequeños ARN no codificadores, de los cuales una amplia categoría se denominan microARN (miARN). Los miARN se expresan a partir de promotores de la polimerasa II, pero también se pueden expresar a partir de promotores de la polimerasa III. Los miARN se procesan intracelularmente a partir de transcritos más grandes para formar moléculas pequeñas de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Las estructuras de miARN se pueden usar para expresar pequeños ARN bicatenarios y, por lo tanto, se pueden usar para expresar los ARN bicatenarios de la presente invención.

La supresión dirigida a la secuencia de codificación tiene la ventaja de que dichas secuencias están presentes tanto en los ARN precursores como en los maduros, lo que permite que los efectores supresores se dirijan a todas las formas de ARN. También se puede usar en la invención una estrategia combinada que usa una serie de efectores de supresión dirigidos a múltiples dianas en un ARN o a múltiples ARN. Al igual que con la supresión, en la invención se pueden usar múltiples ácidos nucleicos de reemplazo. Para algunos trastornos, puede ser necesario bloquear completamente la expresión de un alelo de la enfermedad para prevenir los síntomas de la enfermedad, mientras que para otros pueden tolerarse niveles bajos de proteína mutante. Por lo tanto, la invención puede proporcionar una supresión parcial o completa.

En una realización de la invención, los supresores se dirigen a genes que están implicados en la regulación de otros genes. Por lo tanto, la supresión de estos genes puede conducir a la regulación positiva o negativa de otros genes.

En otra realización, la invención se refiere a la supresión de la expresión de genes mutados que dan lugar a un efecto o enfermedad dominante o perjudicial. Un efector de supresión puede dirigirse al alelo de la enfermedad o al alelo normal. En otra realización, el efector de supresión se dirige tanto al alelo de la enfermedad como al alelo normal.

En una realización de la invención, se proporciona un ácido nucleico de reemplazo que está alterado en una o más bases degeneradas o titubeantes del gen de tipo salvaje endógeno, pero que codifica los mismos aminoácidos que el tipo salvaje o un gen que no causa enfermedad. En otra realización, el ácido nucleico de reemplazo codifica un ácido nucleico de reemplazo beneficioso (por ejemplo, un producto más activo o estable que el codificado por el gen de tipo salvaje). El ácido nucleico de reemplazo proporciona la expresión de un producto proteico normal o que no causa enfermedad cuando se requiere para mejorar una patología asociada con niveles reducidos de proteína de tipo salvaje. El mismo ácido nucleico de reemplazo se puede usar junto con la supresión de muchas mutaciones de enfermedades diferentes dentro de un gen dado. Además, en la invención se pueden usar múltiples ácidos nucleicos de reemplazo.

Aunque la presente solicitud proporciona numerosos ejemplos de agentes de supresión y secuencias de ácido nucleico de reemplazo, estos son solo ejemplos y pueden determinarse otras secuencias de este tipo como se describe en este documento para las mismas dianas o para cualquier diana deseada. “Variante funcional” incluye cualquier variante de ácido nucleico u otro agente de supresión que pueda tener una o más sustituciones de ácido nucleico, pero que no tenga una función materialmente diferente o que aún pueda hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas (0,.2X SCC, SDS al 0,1 %) o que comparte al menos un 70 % de identidad, por ejemplo, un 80 %, tal como al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con el ácido nucleico indicado.

En otra realización de la invención, los efectores de supresión se dirigen a las regiones no traducidas (5'UTR o 3'UTR) de al menos un alelo de un gen. En otra realización de la invención, se proporcionan ácidos nucleicos de reemplazo que han sido alterados en el sitio de supresión, de manera que los ácidos nucleicos de reemplazo proporcionan una proteína funcional o parcialmente funcional y escapan o escapan parcialmente a la supresión por los supresores.

En otra realización de la invención, los efectores de supresión están dirigidos a secuencias intrónicas. En otra realización, se proporcionan ácidos nucleicos de reemplazo que han sido alterados en uno o más nucleótidos del sitio diana del intrón para que los transcritos procedentes de los ácidos nucleicos de reemplazo escapen o escapen parcialmente a la supresión por los supresores. En otra realización, el intrón dirigido completo puede no estar presente en los ácidos nucleicos de reemplazo.

En otra realización de la invención, los efectores de supresión se dirigen a sitios polimórficos y al menos un alelo del gen se suprime total o parcialmente. En otra realización, se proporcionan ácidos nucleicos de reemplazo para la variante polimórfica alternativa de manera que los ácidos nucleicos de reemplazo codifican una proteína funcional o parcialmente funcional y escapan o escapan parcialmente a la supresión por los supresores.

En otra realización de la invención, el agente de supresión y/o el ácido nucleico de reemplazo se expresa a partir de una o más secuencias de promotor. La invención proporciona secuencias de promotor que se ha demostrado que estimulan la expresión ubicua de nucleótidos y/o promotores que se ha demostrado que ejercen un control específico de tejido, temporal, inducible y/o cuantitativo de la expresión génica. La invención también proporciona secuencias potenciadoras (tabla 1) y/o elementos reguladores postraduccionales y/u otros elementos reguladores y/o elementos epigenéticos que proporcionan una expresión optimizada de los agentes de supresión y/o los ácidos nucleicos de reemplazo.

Tabla 1: Ejemplos de elementos potenciadores

En una realización particular, se emplean secuencias que influyen en la estructura de la cromatina, tales como, entre otras, aislantes, antirrepresores, moduladores que actúan en cis del posicionamiento de nucleosomas y/o elementos silenciadores, a veces denominados elementos epigenéticos, para modular la expresión de agentes de supresión y/o ácidos nucleicos de reemplazo. En la tabla 2 se proporcionan ejemplos de elementos epigenéticos, tales como secuencias aislantes y antirrepresoras. Está claro que las estructuras de cromatina influyen en la expresión génica, por ejemplo, las estructuras de cromatina influyen en la capacidad de la maquinaria transcripcional para acceder a elementos de promotor y/o potenciadores entre otros motivos de secuencia. Puede usarse la inclusión de secuencias que influyen en las estructuras de la cromatina en vectores virales y/o no virales y/o administradas junto con ácidos nucleicos de supresión y/o reemplazo para optimizar la expresión de cualquiera o ambos ácidos nucleicos supresores y de reemplazo. Además, pueden usarse entidades químicas que influyen en las estructuras de la cromatina para optimizar la expresión, tales como inhibidores de histona desacetilasa (HDAC) y/o inhibidores de ADN metil transferasa y/o inhibidores de histona metil transferasa. Dichas entidades pueden suministrarse en forma de ADN y/o ARN y/o proteína, entre otras formas. De manera similar, pueden usarse enzimas atrayentes y/o las enzimas de suministro (en forma de ADN y/o ARN y/o proteína) implicadas en la remodelación de la cromatina, tales como, pero no exclusivamente, histona acetil transferasas para los ácidos nucleicos que se expresarán y sus regiones reguladoras asociadas, para optimizar la expresión de los ácidos nucleicos de supresión y/o reemplazo.

Tabla 2: Ejemplos de elementos epigenéticos

En otra realización, la expresión de un agente de supresión y/o un ácido nucleico de reemplazo se optimiza para permitir una supresión eficaz junto con un reemplazo suficiente. En una realización adicional, los ácidos nucleicos de supresión y/o reemplazo se proporcionan con agentes que ayudan a la transfección de vectores, transducción y/o expresión de ácidos nucleicos de supresión y reemplazo.

La invención elude la necesidad de una terapia específica para cada mutación causante de enfermedad dentro de un gen dado. En particular, la invención tiene la ventaja de que se pueden usar los mismos agentes de supresión para suprimir muchas mutaciones en un gen. Esto es particularmente pertinente cuando cualquiera de un gran número de mutaciones dentro de un solo gen puede causar una patología de enfermedad. Las composiciones y los métodos de la invención permiten una mayor flexibilidad en la elección de la secuencia diana para la supresión de la expresión de un alelo de enfermedad. Además, las composiciones y métodos de la invención permiten una mayor flexibilidad en términos de controlar la expresión de la supresión y/o reemplazo de un gen concreto y/o un alelo concreto de un gen.

La supresión y el reemplazo pueden llevarse a cabo conjuntamente o por separado. La supresión y el reemplazo utilizando la degeneración del código genético pueden llevarse a cabo en tubos de ensayo, células, animales o plantas y pueden usarse para investigación experimental (por ejemplo, para el estudio del desarrollo o la expresión génica) o con fines terapéuticos. La supresión y el reemplazo pueden usarse junto con agentes para estimular la transfección celular o la transducción celular tales como, por ejemplo, lípidos y polímeros. La supresión y el reemplazo se pueden proporcionar a los consumidores en un kit.

Los agentes de supresión y sustitución de la invención pueden administrarse a una célula y/o tejido y/o animal y/o planta diana usando reactivos “desnudos”, tales como ADN, ARN, péptidos u otros reactivos. Como alternativa, se pueden usar vectores virales y no virales con o sin reactivos "desnudos".

En una realización, una o más construcciones de supresión y/o reemplazo pueden administrarse a una célula usando un virus recombinante AAV2/5; sin embargo, en la invención pueden usarse otros vectores virales y no virales, tales como otros serotipos de AAV, adenovirus, virus del herpes, SV40, VIH, SIV y otros vectores lentivirales, RSV y vectores no virales, que incluyen ADN desnudo, vectores de plásmidos, administración de genes guiada por péptidos, sistemas de administración de genes terplex, nanopartículas de fosfato de calcio, nanopartículas magnéticas, microgeles coloidales y/o el sistema de integrasa del bacteriófago phiC31, por ejemplo. Los componentes de supresión y reemplazo se pueden encontrar en vectores separados o se pueden incorporar en el mismo vector. Los vectores virales útiles en la invención incluyen, entre otros, los enumerados en la tabla 3. Los vectores no virales útiles en la invención incluyen, entre otros, los enumerados en la tabla 4. Los vectores no virales basados en lípidos catiónicos pueden incluir lípidos catiónicos basados en glicerol (por ejemplo, DOTMA, DOTAP, DMRIE, DOSPA), no basados en glicerol (por ejemplo, DOGS, DOTIM) y/o basados en colesterol (por ejemplo, BGTC, CTAP; Karmali P.P. y Chaudhuri A., 2006, Med. Res. Rev.). La administración de vectores virales y no virales puede ir acompañada de otras moléculas, tales como lípidos catiónicos y/o polímeros y/o detergentes y/o agentes para alterar el pH, como, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), para potenciar la captación celular de vectores y/o para potenciar la expresión de vectores y/o para evadir el sistema inmunitario. Por ejemplo, se han generado moléculas policatiónicas para facilitar la administración de genes que incluyen, entre otras, lípidos catiónicos, poliaminoácidos, copolímeros en bloque catiónicos, ciclodextrinas, entre otros. La pegilación de vectores con polietilenglicol (PEG) puede proteger a los vectores, por ejemplo, del entorno extracelular. Los vectores se pueden usar junto con agentes para evitar o minimizar las respuestas inmunitarias celulares, tales como PEG o como Polyplex con poli(L-lisina). La administración de los vectores puede realizarse usando metodologías físicas, tales como electroporación, nucleofección y/o iontoforesis, por sí solos o en combinación con moléculas para mejorar la entrega. Los vectores pueden usarse junto con agentes para estimular la expresión de componentes de supresión y/o reemplazo incorporados en vectores, por ejemplo, usando inhibidores de histona desacetilasa (HDAC) y/o inhibidores de ADN metil transferasa y/o inhibidores de histona metil transferasa, para modular las estructuras de cromatina, ayudando así a la expresión. Los inhibidores de HDAC incluyen, entre otros, ácidos grasos de cadena corta, tales como ácido valproico y butirato de sodio, cetonas, benzamidas, hidroxamatos cíclicos y no cíclicos, tales como ácidos suberoilanilidahidroxámico (SAHA), tricostatina A (TSA), péptidos cíclicos o tetrapéptidos, entre otros (Liu T. et al., 2006, Cancer Treatment Reviews, 32:157-165). Pueden usarse inhibidores de la ADN metil transferasa que incluyen, por ejemplo, 5-AC, decitabina y zebularina, para modular las estructuras de la cromatina. Además, los inhibidores de la histona metil transferasa pueden influir en los estados de la cromatina, por ejemplo, BIX-01294 (derivado de diazepin-quinazolin-amina). Además de las entidades químicas mencionadas anteriormente, se pueden usar inhibidores basados en ácidos nucleicos para suprimir la expresión de proteínas y/o ARN no codificadores implicados en la remodelación de la cromatina. En una realización de la invención, los vectores se optimizan para transducir específicamente uno o más tipos de células diana o uno o más tipos de tejido diana. Los vectores virales y/o no virales pueden modificarse para dirigirse a tipos de células específicos y/o para evitar la selección de algunos tipos de células. Por ejemplo, la inclusión de la cápsida del serotipo 5 de AAV en un virus híbrido AAV2/5 facilita la transducción de células de fotorreceptores. De manera similar, por ejemplo, los péptidos pueden incluirse en vectores virales para facilitar el transporte dirigido. Los vectores no virales sintéticos se pueden modificar para incluir ligandos que faciliten el transporte dirigido de los vectores a tipos específicos de células y/o tejidos, por ejemplo, el folato se puede conjugar con liposomas para dirigirse a las células tumorales que sobreexpresan el receptor de folato (Hattori Y. et al., 2005, Curr. Drug Delivery, 3: 243-252). En otra realización de la invención, los vectores de supresión y reemplazo están diseñados para optimizar la generación y/o la producción de vectores, por ejemplo, para optimizar la titulación viral y/o para optimizar el número o el tipo de nucleótidos incorporados en el vector o vectores. Por ejemplo, los genomas de los vectores pueden modificarse de modo que se puedan incorporar grandes transgenes en los vectores, por ejemplo, los vectores de adenovirus “gutless” (menos genes virales o ningún gen viral) tienen una mayor capacidad en términos de tamaño que las generaciones anteriores de vectores de adenovirus. Los componentes de los vectores pueden modificarse para optimizar la generación y la producción de vectores, por ejemplo, los genes implicados en la replicación de AAV pueden modificarse para optimizar la replicación y/o pueden usarse vectores de AAV autocomplementarios para optimizar las tasas de expresión transgénica. En una realización adicional, los vectores están diseñados para optimizar la supresión junto con el reemplazo, para permitir la expresión óptima de todos los componentes de un agente terapéutico. Por ejemplo, para optimizar la expresión de ambos elementos de supresión y reemplazo procedentes de un vector dado, se pueden incluir secuencias adicionales en el vector. Por ejemplo, la inclusión de nucleótidos para separar las ITR de AAV y las secuencias de ARNhc de un agente de supresión basado en ARNi puede dar como resultado la optimización de la expresión del componente de supresión. Los nucleótidos que codifican supresores y/o ácidos nucleicos de reemplazo pueden yuxtaponerse o separarse entre sí y/o pueden estar en la misma orientación o en orientaciones opuestas. Además, el supresor o los supresores pueden estar 5' y/o 3' con respecto a los ácidos nucleicos de reemplazo. Los nucleótidos que codifican supresores y/o ácidos nucleicos de reemplazo pueden yuxtaponerse a uno o más vectores que comprende nucleótidos o pueden separarse de dichos uno o más vectores que comprenden nucleótidos. Los nucleótidos que codifican supresores y/o ácidos nucleicos de reemplazo pueden clonarse dentro del esqueleto del plásmido utilizado para generar AAV y/o pueden clonarse entre las ITR de AAV y no dentro del esqueleto del plásmido y/o pueden clonarse en una combinación de estas posiciones. Se pueden incluir secuencias adicionales, como, por ejemplo, secuencias de relleno en los vectores para optimizar el diseño del vector. Además, pueden usarse múltiples supresores y/o ácidos nucleicos de reemplazo en un vector.

Tabla 3: Ejemplos de vectores virales

La lista proporcionada no es exhaustiva; otros vectores virales y derivados, naturales o sintetizados, podrían usarse en la invención.

Tabla 4: Ejemplos de vectores no virales o métodos de administración

La lista proporcionada no es exhaustiva. Otros vectores y derivados no virales, naturales o sintetizados, y otros métodos de administración podrían usarse con la invención.

En una realización, el ácido nucleico de reemplazo codifica la rodopsina, el colágeno 1A1, el colágeno 1A2, el colágeno 7A1 o la periferina de mamíferos. En otra realización, el ácido nucleico de reemplazo codifica una proteína que ha sido mutada para causar una retinitis pigmentosa autosómica o dominante ligada al cromosoma X, como las enumeradas en la tabla 5. Se pueden generar agentes de supresión y ácidos nucleicos de reemplazo para uno o más de estos genes, por ejemplo.

Tabla 5: Genes que se sabe que están implicados en la retinosis pigmentaria (tabla adaptada de RETNET) (http://www.sph.uth.tmc.edu/Retnet/)

En una realización de la invención, los agentes de supresión son ARNip o ARNhc que se dirigen a la rodopsina humana. En la tabla 6A se proporcionan ejemplos de ARNip y secuencias de rodopsina de reemplazo.

Tabla 6A: Ejemplos de secuencias de ARNip dirigidas a rodopsina humana y secuencias de rodopsina de reemplazo

Las secuencias de ARNip 1-17 se dirigen a la secuencia codificadora de la rodopsina humana. Las secuencias de ARNip 18 y 19 se dirigen a 5'UTR de la rodopsina humana. Las secuencias de ARNip 20-35 se dirigen a 3'UTR de la rodopsina humana. Las secuencias de ARNip 36-49 se dirigen a la secuencia intrónica de rodopsina humana. Se da la secuencia de la hebra sentido del ARNip. De modo notable, los ARNip también pueden dirigirse a una combinación de estos. Por ejemplo, un sitio diana del ARNip puede estar en la 5'UTR y el exón 1. O un sitio diana del ARNip puede estar en la región codificadora y un intrón. O un sitio diana del ARNip puede estar en un exón y la 3'UTR. La secuencia 50 de ARNip es un ejemplo de un ARNip que tiene un sitio diana que abarca el exón 3/intrón 3 del gen de la rodopsina humana. El sitio contiene un polimorfismo conocido en el intrón 3. Si este sitio se usara como diana del ARNip, el gen de reemplazo tendría la base de tipo salvaje en el sitio polimórfico, pero la degeneración del código genético podría usarse para cambiar otras bases en el sitio de reemplazo. El ARNip o los ARNip pueden comprender la totalidad o parte de la secuencia proporcionada. Las secuencias de ácidos nucleicos de rodopsina humana de reemplazo sobre la diana para la supresión mediada por ARNip se proporcionan para las secuencias de ARNip 1-17. Los ácidos nucleicos de reemplazo incluyen al menos uno o más nucleótidos alterados en posiciones degeneradas sobre el sitio diana del ARNip (resaltado en negrita). Por lo tanto, las secuencias de reemplazo en el presente documento proporcionan una de las múltiples opciones de reemplazo. Algunas construcciones de reemplazo contienen cambios de nucleótidos en la secuencia de codificación. Estas construcciones de reemplazo, aunque alteradas en la secuencia de nucleótidos, codifican los mismos aminoácidos que la proteína rodopsina de tipo salvaje. Otras construcciones de reemplazo están alteradas en sitios polimórficos silenciosos o no silenciosos. Estas construcciones de reemplazo codifican la proteína de tipo salvaje, con la función de tipo salvaje. Para los ARNip dirigidos a UTR o secuencias intrónicas, no se han sugerido construcciones de reemplazo porque el número de cambios de bases dentro del sitio no se limita a posiciones degeneradas (como es el caso de la secuencia que codifica aminoácidos).

Es notable que la supresión de un gen dado, tal como la rodopsina, puede evaluarse en una diversidad de especies animales. Las secuencias de ARNip proporcionadas en la tabla 6B representan ejemplos de secuencias de ARNi que son homólogas entre la rodopsina porcina y humana. En algunos modelos de animales transgénicos, la presencia del transgén humano permite la evaluación directa de secuencias que se dirigen al gen humano en ese modelo animal. En otros casos, las secuencias supresoras pueden elegirse para maximizar la homología entre el gen humano (por ejemplo, la rodopsina) y el gen endógeno en el animal que se está evaluando.

Tabla 6B: Ejemplos de secuencias de ARNip dirigidas a secuencias homólogas entre rodopsina humana y porcina

El ARNip se puede expresar en vectores miR usando promotores de polimerasa II. Para este propósito, se usa pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR de Invitrogen, en el que el gen miR-155 clonado se recombina para expresar el ARNip elegido. La hebra antisentido del ARNip se mantiene intacta, seguida de un bucle terminal modificado y la hebra sentido, que se modifica introduciendo una deleción de 2 nucleótidos centrales para formar un bucle interno. Véase el n.° de catálogo K4936-00, Block-IT, POLII, catálogo de kits de vectores de expresión de ARNi de miR, Invitrogen, página 7, para ver la figura que muestra la secuencia nativa de miR-155 y la secuencia convertida de siRNA-lacZ en forma de miR-lacZ.

Ejemplos de secuencias de miARN dirigidas a la rodopsina humana:

Oligos de miARN CC:

Hebra superior: 5’ -

TGCTGCTTCTTGTGCTGGACGGTGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCACC GTAGCACAAGAAG - 3’ (SEQ ID NO: 416)

Hebra inferior: 5’ -

CCTGCTTCTTGTGCTACGGTGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCACCGTC CAGCACAAGAAGC - 3’ (SEQ ID NO: 417)

Oligos de miARN Q1:

Hebra superior: 5'

TGCTGGTAGTAGTCGATTCCACACGAGTTTTGGCCACTGACTGACTCGTGT

GGTCGACTACTAC - 3’ (SEQ ID NO: 418)

Hebra inferior: 5' -CCTGGTAGTAGTCGACCACACGAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTCGTGTGG AATCGACTACTACC - 3’ (SEQ ID NO: 419)

Oligos de miARN BB:

Hebra superior: 5' -TGCTGGTAGAGCGTGAGGAAGTTGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCAA CTTTCACGCTCTAC - 3’ (SEQ ID NO: 420)

Hebra inferior: 5' -CCTGGTAGAGCGTGAAAGTTGATGTCAGTCAGTGGCCAAAACATCAACTT CCTCACGCTCTACC - 3’ (SEQ ID NO: 421)

En una realización de la invención, los agentes de supresión y los genes de reemplazo se expresan en células de fotorreceptores para aliviar la patología de la enfermedad. En una realización adicional, los ácidos nucleicos de reemplazo codifican un gen que, cuando muta, puede causar una degeneración retiniana distinta de la retinosis pigmentaria, por ejemplo, síndrome de Stargarts, glaucoma, distrofia de conos y bastones, distrofia corneal o degeneración macular relacionada con la edad (“age-related macular degeneration”, AMD) (tabla 5).

En otro aspecto, la invención proporciona células que expresan un efector de supresión, tal como un ARNbc, ya sea de forma transitoria o estable, para un uso experimental o terapéutico. En una realización, las células expresan un ARNip que se dirige a la rodopsina. En otra realización, las células expresan un ácido nucleico de reemplazo que expresa rodopsina que no es la diana del ARNip. En otra realización, las células comprenden un vector que codifica al menos uno o más ARNip. En otra realización, las células comprenden un vector que codifica un ácido nucleico de reemplazo. En una realización adicional, las células comprenden uno o más vectores que codifican uno o más ARNip y ácidos nucleicos de reemplazo.

En otro aspecto, la invención proporciona animales transgénicos no humanos y su uso experimental o terapéutico. En una realización, el animal transgénico es un modelo para la retinosis pigmentaria, por ejemplo, un animal con una mutación observada en seres humanos, tales como las mutaciones Pro23His o Pro347ser. En otra realización, el animal transgénico expresa un ARNbc que se dirige a la rodopsina humana. En otra realización, el animal transgénico expresa un transgén de un ácido nucleico de reemplazo que se ha alterado en una o más posiciones de titubeo de modo que escapa a la supresión.

Los agentes de supresión y los ácidos nucleicos de reemplazo de la invención se pueden administrar a células, tejidos, plantas y/o animales, ya sea por separado o juntos. En otro aspecto más, la administración del agente de supresión y/o el ácido nucleico de reemplazo puede ser sistémica o local. En otro aspecto más, la administración de un agente de supresión y un ácido nucleico de reemplazo puede usarse junto con agentes químicos y/o físicos para ayudar en la administración. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para suprimir la expresión de rodopsina en un animal mediante inyección intraocular (por ejemplo, subretiniana o intravítrea) de un agente de supresión en el animal. En otro aspecto, se usa la administración intraocular (por ejemplo, inyección subretiniana, intravítrea) para administrar un agente de supresión y/o un ácido nucleico de reemplazo a un animal. En otra realización, se usa una iontoforesis o una electroporación para administrar agentes de supresión y/o ácidos nucleicos de reemplazo. En otra realización, los agentes de supresión y/o los ácidos nucleicos de reemplazo se administran usando nanotecnología (Kawasaki y Player, Nanomedice, 1 (2):101-109, 2005; Silva, Surg. Neurol., 67(2):113-116, 2007; Andrieu-Solar et al., Mol. Vis., 12:1334-47, 2006) o bacterias (Daudel et al., Expert Rev. Vaccines, 6(1):97-110, 2007).

Los agentes de supresión y los ácidos nucleicos de reemplazo pueden combinarse de manera óptima con regiones conservadas A-I y/o sitios de unión de factores de transcripción identificados dentro de regiones conservadas A-I y/o con elementos potenciadores y/u otros elementos reguladores (véanse las tablas 1 y 2 anteriores y las tablas 9-12 a continuación).

En un aspecto de la invención, se proporciona un vector para la expresión de un agente de supresión para un gen que causa una enfermedad y/o un ácido nucleico de reemplazo que no es reconocido por el agente de supresión, en el que el vector comprende al menos una de las regiones conservadas seleccionado de: región B conservada del gen de rodopsina representada por SEQ ID NO:93; región C conservada del gen de la rodopsina representada por SEQ ID NO:94; regiones F y G conservadas del gen de la rodopsina representadas por SEQ ID NO:97; y región A conservada del gen de la rodopsina representada por SEQ ID NO:92.

En una realización particular, el vector comprende al menos una de las regiones conservadas seleccionadas de: la región B conservada del gen de la rodopsina representada por SEQ ID NO:93; la región C conservada del gen de la rodopsina representada por SEQ ID NO:94; las regiones F y G conservadas del gen de la rodopsina representadas por SEQ ID NO: ID NO:97; y la región A conservada del gen de la rodopsina representada por s Eq ID NO:92.

En una realización de la invención se contempla el uso de construcciones de supresión y reemplazo en combinación con uno o más factores para facilitar la supervivencia celular, la viabilidad celular y/o el funcionamiento celular. En relación con las neuronas, se pueden utilizar una serie de factores neurotróficos y/o neuroprotectores, entre otros, el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), neurturina, factor neurotrófico derivado ciliar (CNTF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), factor derivado del epitelio pigmentario (PEDG), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), hormona liberadora de tirotrofina (TRH) y factor de viabilidad de conos derivado de bastones (RDCVF), entre otros. Existen pruebas sustanciales en la bibliografía de que dichos factores pueden aumentar la viabilidad celular y/o la supervivencia celular para una gama de tipos de células. Por ejemplo, se ha demostrado que estos factores brindan efectos beneficiosos a una amplia gama de tipos de células neuronales, incluidos, por ejemplo, los fotorreceptores, cuando se administran en forma de proteína o de ADN (Buch et al., Mol. Ther., 2006, 14(5):700-709). El uso de GDNF para potenciar las terapias basadas en genes para la enfermedad recesiva se ha demostrado en ratones (Buch et al., Mol. Ther., 2006; 14(5):700-709). Los genes que codifican factores neurotróficos/neuroprotectores pueden expresarse a partir de promotores generales, tales como el promotor CBA (Buch et al., Mol. Ther., 2006, 14(5):700-709) o de promotores específicos de tejido. En las construcciones pueden incluirse secuencias para optimizar la expresión de factores neurotróficos/neuroprotectores, tales como las secuencias identificadas en las tablas 1,2, 9-13.

En la figura 17 se proporcionan secuencias de varios factores neurotróficos ejemplares. El ADN que codifica uno o más factores neurotróficos y/o neuroprotectores puede utilizarse junto con la supresión y el reemplazo. La figura 18 proporciona ejemplos de construcciones que incorporan secuencias de supresión y reemplazo junto con la secuencia que codifica un factor que estimula la viabilidad celular y/o el funcionamiento celular, tal como GDNF, neurturina, CNTF y/o RDCVF, entre otros, como se describe anteriormente. Se pueden usar métodos bien establecidos en la técnica que implican una digestión de restricción del ADN, el acoplamiento de ADN en plásmidos, la transformación bacteriana, la caracterización de colonias bacterianas transfectadas, la purificación de plásmidos y la secuenciación del ADN para clonar secuencias de supresión y reemplazo y neuroprotección/neurotróficas en vectores basados en ADN. En la figura 18 se proporcionan ejemplos del diseño de dichas construcciones.

Las construcciones que incorporan la supresión y el reemplazo y uno o más factores neurotróficos/neuroprotectores pueden administrarse usando vectores virales y/o no virales usando métodos conocidos en la técnica (Andrieu-Soler et al., Mil. Vis., 2006; 12:1334-1347). Se ha utilizado ADN desnudo, lípidos, polímeros, nanopartículas, electrotransferencia, entre otros métodos, para lograr la administración de genes/nucleótidos en células y animales. Por ejemplo, pueden usarse vectores lentivirales y/o vectores virales adenoasociados (AAV) para administrar construcciones que incorporen los 3 componentes definidos anteriormente (supresión, reemplazo y neurotrofismo/neuroprotección). Las construcciones de 3 componentes en algunos casos pueden requerir vectores que tengan una capacidad significativa en términos de tamaño de las inserciones de ADN. Se han caracterizado muchos vectores virales y no virales que pueden facilitar la incorporación de grandes fragmentos de ADN, incluidos, entre otros, vectores lentivirales y algunos de los serotipos virales adenoasociados. Por ejemplo, se ha demostrado que los vectores de la cápside 5 del serotipo 2 de AAV (AAV2/5) acomodan 8-9 kilobases de ADN (Alberto Aurrichio, Sociedad Británica de Terapia Génica, 2008). Uno o más componentes (supresión, reemplazo, neurotrofismo/neuroprotección) pueden clonarse, por ejemplo, en el caso de AAV, entre el ITRS de AAV, y uno o más componentes pueden clonarse en el esqueleto del plásmido usado para generar el AAV. La figura 18 proporciona elementos clave del diseño de la construcción (B). La utilización de secuencias del esqueleto del plásmido para transportar componentes de una construcción de múltiples componentes puede usarse para optimizar la población de vectores AAV generados usando ese plásmido. Además, en relación con la enfermedad ocular, es notable que existen pruebas significativas de que AAV2/5 transduce fotorreceptores de manera eficaz. Se contempla la generación de vectores AAV que portan secuencias de supresión y reemplazo junto con secuencias que codifican agentes neurotróficos y/o neuroprotectores. Si bien el AAV puede ser valioso como vector para administrar construcciones de 3 componentes para algunos tejidos diana, hay disponible una gama de vectores virales y no virales adicionales para este propósito, como los descritos anteriormente, y vectores que son bien conocidos en el Arte.

Si bien se contempla la utilización de un solo vector para administrar construcciones de 3 componentes que implican la supresión y el reemplazo y una secuencia neurotrófica/neuroprotectora a una célula, un tejido o un animal, también se contempla el uso de múltiples vectores en combinación para administrar los 3 componentes. La estrategia multivalente que implica la supresión, el reemplazo y la neuroprotección puede implicar el uso de 1 o más vectores para la administración. Además, los 3 componentes pueden administrarse usando una combinación de un vector o vectores que incorporan secuencias de ADN junto con ARN y/o ARNbc y/o una proteína. En la presente invención, se contempla la administración de una proteína, de ARN que codifica una proteína y/o de ADN que codifica una proteína, o una combinación de los mismos, para lograr la administración de los 3 componentes, la supresión, el reemplazo y la neuroprotección.

En otra realización de la invención, el tamaño del esqueleto del vector plasmídico de AAV aumenta o disminuye para aumentar la expresión del virus. Por ejemplo, se ha descrito en la técnica que aumentar el tamaño del esqueleto del virus AAV de manera que sea más grande que el inserto clonado dentro de ITSI e ITS2 favorece el encapsulamiento por AAV del inserto frente al encapsulamiento del esqueleto, lo que aumenta la expresión del ADN clonado dentro las regiones ITR (Bennet et al., Reversal of visual defects in animal models of LCA within weeks of treatment with an optimized AAV, Molecular Therapy, vol. 15, suplemento 1, s286).

En otra realización de la invención, el tamaño del esqueleto aumenta con un gen que es terapéuticamente beneficioso dirigido por un promotor. En esta realización, una parte del AAV encapsulado consiste en el esqueleto y, por lo tanto, una parte de las partículas de AAV expresarán el gen codificado dentro del esqueleto. En una realización, el gen terapéuticamente beneficioso clonado en el esqueleto es un factor neurotrófico, tal como GDNF, neurturina u otros.

Si bien la invención puede usarse para trastornos dominantes y/o poligénicos, también puede practicarse para trastornos recesivos. Por ejemplo, la técnica describe que cuando se trata el trastorno recesivo fenilcetonuria (PKU) con genes de reemplazo, la proteína endógena expresada a partir de genes mutantes interfiere con la proteína de los genes de reemplazo (descrito en una tesis presentada a la Universidad de Florida en cumplimiento parcial de los requisitos para el título de Doctora en Filosofía, por Catherine Elisabeth Charron, agosto de 2005 y titulada "Terapia génica para la fenilcetonuria: interferencia dominante-negativa en una enfermedad recesiva"). Por lo tanto, las construcciones de supresión y reemplazo pueden estar dirigidas a trastornos recesivos que, como la PKU, requieren de supresión y reemplazo.

La tecnología de supresión y reemplazo proporciona una estrategia que puede ser aplicable a una amplia gama de trastornos genéticos, que incluyen trastornos caracterizados por una patología recesiva, dominante, poligénica, multifactorial o dominante negativa. En una realización adicional de la invención, las regiones conservadas identificadas en la región de promotor de genes de rodopsina de mamíferos y/o elementos potenciadores y/u otros elementos reguladores y/o elementos epigenéticos tales como los enumerados en la tabla 5 pueden combinarse con supresores dirigidos a genes con mutaciones distintas de la rodopsina y proporcionar genes de reemplazo distintos de la rodopsina. La osteogénesis imperfecta, epidermólisis ampollosa, enfermedad de Alzheimer de aparición temprana autosómica dominante, poliquistosis renal autosómica dominante, síndrome de Rett, trastorno plaquetario familiar, diabetes insípida negativa dominante, distrofia macular de tipo Stargardt autosómica dominante, miopatía nemalínica, hipertensión arterial pulmonar familiar, cánceres relacionados con APC y p53 y varios otros trastornos (OMIM) pueden beneficiarse potencialmente de una estrategia terapéutica de supresión y reemplazo. Los trastornos de repetición de tripletes, 14 de los cuales se han caracterizado hasta la fecha, incluida la enfermedad de Huntington, la ataxia espinocerebelosa y la distrofia miotónica, pueden beneficiarse de una estrategia de supresión y reemplazo. Para cada trastorno, pueden usarse promotores del gen endógeno o promotores constitutivos o promotores de otros genes, o promotores inducibles para expresar el agente de supresión o el ácido nucleico de reemplazo.

En otra realización de la invención, los elementos de promotor y/o potenciadores y/u otros elementos reguladores y/o elementos epigenéticos pueden combinarse con otros promotores además de la rodopsina en combinación con elementos de supresión y/o sustitución. Por ejemplo, pero no exclusivamente, los elementos de promotor y potenciadores pueden combinarse con los promotores y/o genes COL1A1 y/o COL1A2 y/o COL7A1 y/o queratina 5 y/o queratina 14 y/o periferina y/o IMPDH1. Dependiendo del tejido al que se administra el agente de supresión y/o el ácido nucleico de reemplazo o que sea activo in vivo, se utilizan elementos reguladores específicos de tejido para potenciar la expresión del agente de supresión y/o el ácido nucleico de reemplazo.

Los supresores y/o ácidos nucleicos de reemplazo de la invención pueden dirigirse a suprimir y reemplazar un gen, en el que las mutaciones en el gen pueden dar lugar, predisponer o trabajar en combinación con otros factores genéticos y/o factores ambientales para causar una patología de enfermedad. Por ejemplo, en el caso de retinopatías dominantes, el gen de la rodopsina puede suprimirse y reemplazarse. Por ejemplo, pueden diseñarse ARNip dirigidos a RHO-(NM_000539.2) y proporcionarse comercialmente. Del mismo modo, se pueden diseñar y sintetizar ARNip de control, por ejemplo, dirigidos a EGFP (U57608) u otros genes indicadores u otros ARNip no dirigidos. Los ARNip se eligen para dirigirse a secuencias que difieren en al menos uno y preferiblemente en muchos más nucleótidos de cualquier gen conocido en las bases de datos humanas y de ratón (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, BLASTN2.2.6, Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25(17):3389-3402, 1997). Los ARNip se pueden clonar cadena abajo, por ejemplo, de los promotores de la polimerasa III, tales como los promotores H1 o U6, para generar ARN de horquilla corta (ARNhc; Brummelkamp et al., Science, 296:(5567):505-503, 2001). Como alternativa, los promotores de polimerasa II que dirigen la expresión en muchos o todos los tipos de células o tejidos, incluido el promotor de CMV, el promotor de ubiquitina y/o el promotor de p-actina, por ejemplo, pueden usarse para expresar ARNhc. Del mismo modo, pueden usarse promotores específicos de tejido, tales como el promotor de rodopsina, el promotor de periferina o el promotor de enolasa, entre otros, para expresar ARNhc. Las secuencias de ARNhc se pueden clonar en vectores con un gen indicador para facilitar el control de la expresión de los vectores, por ejemplo, los ARNhc se pueden clonar en pEGFP-1, entre otros plásmidos (BD Biosciences, Clontech, Palo Alto, CA). Los supresores pueden administrarse a células, tejidos y/o animales con o sin ácidos nucleicos de reemplazo.

Los ácidos nucleicos de reemplazo con cambios en la secuencia de nucleótidos sobre el sitio diana para la supresión mediada por ARNip, por ejemplo, en nucleótidos degenerativos, pueden generarse mediante mutagénesis dirigida por cebadores y clonarse en vectores, tales como pcDNA3.1-(Invitrogen). Los ácidos nucleicos de reemplazo también pueden modificarse en las UTR y/o en sitios polimórficos dentro del gen diana. Los promotores ubicuos, tales como el promotor de CMV y/o el promotor de ubiquitina y/o el promotor de p-actina, entre otros, pueden usarse para dirigir la expresión de ácidos nucleicos de reemplazo. Como alternativa, los promotores específicos de tejido, tales como el promotor de rodopsina, el promotor de periferina, el promotor de Col1A1, el promotor de Col1A2, el promotor de Col1A7, los promotores de queratina y/o el promotor de enolasa, entre otros, y/o promotores inducibles, tales como un promotor sensible a tetraciclina, pueden usarse para dirigir la expresión de ácidos nucleicos de reemplazo. Los ácidos nucleicos de rodopsina humana de reemplazo que se han alterado en la secuencia de nucleótidos en posiciones degeneradas sobre los sitios diana del ARNip, por ejemplo, los ácidos nucleicos de reemplazo para las secuencias de ARNip 1 -17, se proporcionan en la tabla 5. Los ácidos nucleicos de reemplazo se pueden administrar a células, tejidos o animales con o sin agentes supresores.

Supresión y reemplazo en células y tejidos

Los ácidos nucleicos de reemplazo dirigidos por promotores, tales como los ácidos nucleicos de rodopsina y los ARNip y/o ARNhc dirigidos a la rodopsina, se pueden cotransfectar en células, por ejemplo, células HeLa o Cos-7, entre otros tipos de células, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, 24 horas después de la transfección de agentes supresores y/o ácidos nucleicos de reemplazo, el ARN y las proteínas citoplásmicas pueden aislarse de las células usando metodologías bien establecidas. Además, la supresión y el reemplazo se pueden evaluar en tejidos. En el caso de genes retinianos, por ejemplo, se pueden preparar y mantener cultivos organotípicos de explantes retinianos de ratón o rata, por ejemplo, usando métodos conocidos en la técnica, y los agentes supresores y/o los ácidos nucleicos de reemplazo se pueden administrar a cultivos organotípicos. Por ejemplo, la electroporación se puede usar para administrar construcciones de ARNip y/o ARNhc y/o construcciones de ARNhc y ácidos nucleicos de reemplazo a explantes de retina como se describe en Palfi et al., Hum. Mutat., 27(3):260-268, 2006. Después de la electroporación de los explantes de retina, las retinas se pueden tratar con tripsina para acelerar la disociación de las células. Pueden identificarse subpoblaciones de células retinianas dentro de la población de células disociadas que tienen una característica particular, por ejemplo, que expresan un gen indicador, tal como EGFP. Un método de identificación que se puede invocar es FACS (Palfi et al., Hum. Mutat., 27(3):260-268, 2006). Los niveles de supresión y sustitución de un gen diana pueden evaluarse en poblaciones de células aisladas por FACS. Por ejemplo, la supresión y/o la supresión y el reemplazo pueden evaluarse en células positivas para EGFP electroporadas de explantes de retina.

Evaluación de la supresión y el reemplazo mediante ensayos de ARN

La supresión y el reemplazo se pueden evaluar en células, tejidos y/o animales mediante ensayos de ARN que incluyen ensayos de RT-PCR en tiempo real, transferencia Northern, hibridación de ARN in situ y/o de protección de RNasa. Los niveles de expresión de ARN de supresores y/o de genes endógenos y/o ácidos nucleicos de reemplazo pueden evaluarse mediante RT-PCR en tiempo real usando, por ejemplo, un sistema de PCR en tiempo real 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) y usando, por ejemplo, un kit QuantiTect SYBR Green RT-PCR (Qiagen Ltd). Los ensayos de RT-PCR se realizan usando niveles de expresión de controles constitutivos, tales como p-actina o GAPDH, por ejemplo, con fines comparativos. Los niveles de expresión de ARN se pueden evaluar utilizando conjuntos de cebadores dirigidos a los ácidos nucleicos de interés, incluidos supresores, genes diana y/o reemplazos, por ejemplo, se pueden usar los siguientes cebadores para evaluar los niveles de expresión de la rodopsina humana, pactina y GAPDH.

Tabla 7: Cebadores de PCR para medir la rodopsina, p-actina y GAPDH

La expresión de construcciones de reemplazo y/o ARNhc puede confirmarse, por ejemplo, mediante transferencia Northern. El ARN también puede detectarse mediante hibridaciones in situ utilizando sondas de ARN monocatenario que se han marcado, por ejemplo, con DIG. Para evaluar los niveles de expresión de los agentes de supresión y/o ácidos nucleicos de reemplazo y/o genes diana endógenos, se pueden realizar ensayos de protección de RNasa utilizando métodos conocidos en la técnica, como el descrito en el manual del kit de sonda y marcador Ambion mirVana™ (número de catálogo 1554) y el manual del kit de ensayo de protección de ribonucleasa Ambion RPAIII™ (número de catálogo 1414). Por ejemplo, pueden sintetizarse sondas de ARN de aproximadamente 15-25 nucleótidos de longitud específicas para transcritos, por ejemplo, de un gen diana endógeno y/o un supresor y/o un ácido nucleico de reemplazo. Por ejemplo, las sondas de ARN dirigidas a rodopsina de ratón y/o rodopsina humana y/o agentes de supresión dirigidos a rodopsina y/o ácidos nucleicos de reemplazo de rodopsina se pueden sintetizar por medio de empresas, tal como Sigma-Proligo o Ambion. Las sondas de ARN y los patrones de tamaño se pueden marcar para facilitar la visualización después de la separación de las muestras en geles de poliacrilamida desnaturalizantes. Por ejemplo, las sondas de ARN y el marcador de tamaño Decade™ (Ambion Inc) se pueden marcar en el extremo 5' con una P32-yATP (GE Healthcare) utilizando el kit de sonda y marcador mirVana™ según el protocolo del fabricante (Ambion Inc.). Los ensayos de protección de RNasa se pueden realizar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el kit de ensayo de protección de ribonucleasa RPA III™ y el protocolo del fabricante (Ambion Inc.).

La expresión de los supresores y/o ácidos nucleicos de reemplazo y/o genes endógenos puede llevarse a cabo y determinarse en células, tejidos y/o en animales usando, por ejemplo, los ensayos y las metodologías asociadas proporcionadas anteriormente.

Evaluación de la supresión y el reemplazo mediante ensayos de proteínas

La supresión y el reemplazo se pueden evaluar en células, tejidos y/o animales mediante ensayos de proteínas, incluidos ELISA, transferencia Western y ensayos de inmunocitoquímica. Los ELISA se pueden realizar para evaluar los niveles de supresión mediante la evaluación de los niveles de expresión de un gen endógeno diana y/o se pueden usar para evaluar los niveles de expresión de ácidos nucleicos de reemplazo; dichos ensayos de proteínas son bien conocidos en la técnica y se proporcionan métodos, por ejemplo, en Palfi etal., Hum. Mutat., 27(3):260-268, 2006. Por ejemplo, en el caso de los genes de la retina, tales como el gen de la rodopsina, el ELISA se realiza utilizando un anticuerpo primario de rodopsina que normalmente se utiliza en una forma diluida, por ejemplo, utilizando una dilución 1/10-1/10000 (pero puede estar fuera de este intervalo) de un anticuerpo para la proteína diana. Además, se puede realizar una transferencia Western para determinar las cantidades relativas de una proteína específica, por ejemplo, la rodopsina. Brevemente, las muestras de proteínas se separan usando SDS-PAGE y se transfieren a una membrana. La membrana se incuba con una proteína genérica (por ejemplo, proteínas de la leche) para que se una a los “lugares pegajosos" de la membrana. Se agrega un anticuerpo primario a una disolución que es capaz de unirse a su proteína específica y se agrega un conjugado de enzima-anticuerpo secundario, que reconoce el anticuerpo primario para encontrar ubicaciones a las que se une el anticuerpo primario.

Además de los ensayos de proteínas mencionados anteriormente, se pueden usar ensayos que utilizan anticuerpos junto con microscopía para evaluar los niveles de proteínas. Por ejemplo, en el caso de la rodopsina, se puede realizar una inmunocitoquímica (por ejemplo, usando una dilución 1/10-1:1000 de un anticuerpo primario de rodopsina) y una microscopía de fluorescencia, como se ha documentado en Kiang et al., 2005, Mol. Ther., 12(3):555-561, 2005. La inmunocitoquímica puede llevarse a cabo en células y/o tejidos. En el caso de la retina, se pueden poner en práctica diversos modos de cortes para evaluar secciones de retina. Por ejemplo, pueden usarse secciones congeladas, secciones sumergidas en agar y/o secciones sumergidas en resina. Para obtener cortes delgados, por ejemplo, de la retina, se pueden realizar una inclusión en EPON y cortes semidelgados utilizando métodos conocidos en la técnica, como los que se proporcionan en McNally et al., Hum. Mol. Genet., 11 (9):1005-1016, 2002. La inmunocitoquímica se puede usar para evaluar la supresión de un gen diana y/o la expresión de ácidos nucleicos de reemplazo. Además, los análisis histológicos se pueden usar para evaluar el efecto o efectos histológicos asociados con la administración de supresores y/o ácidos nucleicos de reemplazo. En modelos animales de degeneraciones retinianas, tales como los ratones rho-/-, rds, rodopsina Pro23His, rodopsina Pro2347Ser y otros, hay una degeneración de la capa de células de fotorreceptores con el tiempo. Pueden usarse análisis histológicos para evaluar si esta degeneración ha sido modulada después de la administración de agentes de supresión y/o ácidos nucleicos de reemplazo.

Administración de supresión y reemplazo

Tanto los vectores no virales como los virales pueden usarse en la invención para administrar los agentes de supresión y/o los ácidos nucleicos de reemplazo. Por ejemplo, en el caso de la retina, se ha descubierto previamente que el virus adenoasociado recombinante (AAV) y, más específicamente, AAV2/5, provoca una transducción eficaz de células de fotorreceptores. También se pueden usar otros serotipos de AAV para administrar a la retina, por ejemplo, AAV2/2 provoca una administración eficaz al epitelio pigmentario de la retina (RPE) al igual que AAV4. Los vectores de AAV se pueden generar usando protocolos con y sin un virus auxiliar. Por ejemplo, está bien documentado un protocolo sin virus auxiliar que utiliza una estrategia de transfección triple (Xiao et al., J. Virol., 72(3):2224-2232, 1998). Los módulos de expresión que portan elementos de supresión y/o reemplazo se pueden clonar en plásmidos, tales como pAAV-MCS proporcionados por Stratagene Inc. Los supresores y/o los ácidos nucleicos de reemplazo se clonan entre las repeticiones terminales invertidas de AAV2 y se transfectan en células 293 (Stratagene; ATACC n.° de catálogo CRL-1573) con otros dos plásmidos, de ahí el término transfección triple. Por ejemplo, el plásmido pRep2/Cap5 (Hildinger et al., J. Virol., 75(13):6199-6203, 2001) junto con el plásmido pHelper (Stratagene), por ejemplo, en una proporción de 1:1:2, se puede utilizar para generar vectores AAV2/5. El virus se puede generar utilizando una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, incluido el método descrito a continuación. Por ejemplo, para generar virus, se transfectaron cincuenta placas de 150 mm de células HEK293 confluentes (50 gg de ADN/placa) con polietileminina (Reed et al., J. Virol. Methods, 138(1-2):85-98, 2006). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, los lisados virales brutos se aclararon (Auricchio et al., 2001) y se purificaron con una centrifugación en gradiente de CsCl2 (Zolotukhin et al., Gene Ther., 6(6):973-985, 1999). La fracción que contenía AAV se dializó frente a PBS. Las titulaciones genómicas, las partículas virales (vp/ml), se determinaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando métodos conocidos en la técnica (Rohr et al., J. Virol. Methods, 106(1 ):81 -88, 2002). Se pueden generar AAV que contengan, por ejemplo, ARNhc dirigidos o ARNhc de control y/o ácidos nucleicos de reemplazo, tales como rodopsina y/o ácidos nucleicos indicadores, tales como EGFP y/o secuencias de relleno y/o secuencias que ayudan a la expresión de agentes de supresión y/o o ácidos nucleicos de reemplazo, tales como secuencias de promotor y/o potenciadoras y/u otras secuencias reguladoras y/o elementos epigenéticos.

Administración de vectores de supresión y reemplazo

Los modelos animales se pueden utilizar para reflejar los trastornos humanos. Por ejemplo, se han generado modelos animales de retinopatías humanas o que expresan un gen de la retina humana, por ejemplo, ratones rho-/-(Humphries etal., Nat. Genet., 15(2):216-219, 1997), ratones NHR /-(Olsson etal., Neuron, 9(5):815-830, 1992), ratones Pro23His (Olsson et al., Neuron, 9(5):815-830, 1992), ratones Pro347Ser (Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(20):11933-11938, 1998) y ratones RHO-M (ver más abajo). Los ratones normalmente se mantienen en condiciones de alojamiento libres de patógenos específicos (“specific pathogen free”, SPF) y en un entorno de luz controlada. Los agentes de supresión y/o los ácidos nucleicos de reemplazo de la invención pueden administrarse a animales de forma local y/o sistémica. La administración local puede incluir la inyección directa en los tejidos diana y/o en la proximidad del tejido diana, tal como se ha descrito en detalle en la técnica, por ejemplo, en Xiao et al. (ACS Chem. Biol., 1 (3):176-183, 2004) de vectores AAV dirigidos con ARNhc al cerebro para tratar la ataxia espinocerebelosa. En el caso de la retina, puede usarse una inyección subretiniana para administrar los agentes de supresión y/o ácidos nucleicos de reemplazo de acuerdo con el siguiente procedimiento. Por ejemplo, los ratones pueden anestesiarse mediante una inyección intraperitoneal de Domitor y Ketalar (10 y 50 pg/g de peso corporal, respectivamente). Se dilatan las pupilas con fenilefrina y, bajo analgesia local (ametocaína), se realiza una pequeña punción en la esclerótica. Se inserta una microaguja unida a una jeringa de 10 pl (Hamilton Company Europe) a través de la punción hasta el espacio subretiniano y se administran 1-3 pl de vector. Por ejemplo, en el caso de AAV, se administran 1-3 pl de 1012-14 vp/ml de la preparación del vector AAV en PBS. Puede aplicarse un anestésico inverso (antisedán, 50 pg/g de peso corporal) mediante una inyección intraperitoneal después de la administración. La temperatura corporal durante el procedimiento se mantiene mediante un dispositivo de calentamiento homeotérmico. Además, los ratones recién nacidos se pueden preparar para la inyección subretiniana de acuerdo con Matsuda y Cepko (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101 (1):16-22, 2004).

Ensayo de función

Para evaluar si la supresión y/o el reemplazo modulan la función de un tejido y/o tipo de célula diana, se pueden emplear uno o más ensayos que están bien descritos en la técnica anterior. En el caso de la retina, los ensayos funcionales incluyen, entre otros, electrofisiología, tal como electrorretinograma (ERG) de patrones, ERG de campo completo y potenciales evocados visuales. Además, se pueden realizar evaluaciones del campo visual, evaluaciones de la visión del color y pupilometría. Por ejemplo, la electrorretinografía se puede utilizar para evaluar la respuesta de la retina a la luz. Esto se puede realizar usando, por ejemplo, el siguiente procedimiento o un procedimiento adaptado. Los animales pueden adaptarse a la oscuridad durante la noche y prepararse para ERG bajo una luz roja tenue. Las pupilas se dilatan con ciclopentalato al 1 % y fenilefrina al 2,5 %. Los animales se anestesian con ketamina y xilazina (16 y 1,6 pg/10 g de peso corporal respectivamente) inyectadas por vía intraperitoneal. Se presentan destellos de luz homologados al animal, por ejemplo, un ratón, en un recipiente Ganzfeld. Las respuestas de ERG se registran simultáneamente en ambos ojos por medio de electrodos de lentes de contacto (Medical Workshop, Países Bajos) usando ametocaína al 1 % como anestesia tópica. Los electrodos de referencia y de tierra se colocan por vía subcutánea, aproximadamente a un mm del canto temporal y anterior a la cola, respectivamente. Las respuestas se analizan utilizando una unidad de electrofisiología RetiScan RetiPort (Roland Consulting Gmbh). El protocolo se basa en el aprobado por el Comité de Normas Clínicas Internacionales para la electrorretinografía humana. Las respuestas de bastones aisladas se registran utilizando un destello blanco tenue (-25 dB de intensidad máxima, siendo la intensidad máxima del destello de 3 candelas/m2/s) presentado en el estado adaptado a la oscuridad. Luego se registran las respuestas máximas combinadas de bastones-conos al destello de máxima intensidad. Tras una adaptación a la luz de 10 minutos a una iluminación de fondo de 30 candelas/m2, las respuestas de conos aisladas se registran con respecto al destello de máxima intensidad presentado inicialmente como un solo destello y posteriormente como parpadeos de 10 Hz. Las ondas A se miden desde la línea de base hasta el valle y las ondas b desde la línea de base (en el caso de respuestas de bastones aisladas) o desde la onda a hasta el valle.

Los agentes de la invención se administran en cantidades eficaces. Una cantidad eficaz es una dosificación del agente suficiente para proporcionar un resultado médicamente deseable. Una cantidad eficaz significa la cantidad necesaria para retrasar el inicio, inhibir el avance o detener por completo el inicio o el avance de la afección o enfermedad particular que se está tratando. Una cantidad eficaz puede ser una cantidad que reduzca uno o más signos o síntomas de la enfermedad. Cuando se administran a un sujeto, las cantidades eficaces dependerán, por supuesto, de la afección particular que se esté tratando; la gravedad de la afección; de parámetros individuales del paciente, incluidos la edad, la condición física, el tamaño y el peso, el tratamiento concurrente, la frecuencia del tratamiento y el modo de administración. Estos factores son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden abordarse sin más que la experimentación habitual.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden variar para obtener una cantidad de uno o más agentes que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, unas composiciones y un modo de administración concretos. El nivel de dosificación seleccionado depende de la actividad del agente concreto, la vía de administración, la gravedad de la afección que se está tratando, la condición y el historial médico previo del paciente que se está tratando. Sin embargo, está dentro de los conocimientos de la técnica comenzar las dosis de dichos uno o más agentes a niveles más bajos que los necesarios para lograr el esfuerzo terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se logre el efecto deseado.

Los agentes y las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar a un sujeto por cualquier vía adecuada. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar por vía oral, incluyendo por vía sublingual, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica y transdérmica (como polvos, ungüentos o gotas), bucal o nasal. El término administración "parenteral", como se usa en el presente documento, se refiere a modos de administración distintos que a través del tracto gastrointestinal, que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, intramamaria, intraocular, retrobulbar, intrapulmonar, intratecal, subcutánea e intraarticular. También se contempla la implantación quirúrgica, que incluye, por ejemplo, introducir una composición de la invención en el cuerpo, tal como, por ejemplo, en el cerebro, en la cavidad abdominal, debajo de la cápsula esplénica, en el cerebro o en la córnea.

Los agentes de la presente invención también se pueden administrar en forma de liposomas. Como se sabe en la técnica, los liposomas generalmente se derivan de fosfolípidos u otras sustancias lipídicas. Los liposomas están formados por cristales líquidos hidratados mono- o multilaminares que se encuentran dispersos en un medio acuoso. Puede usarse cualquier lípido no tóxico, fisiológicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. Las presentes composiciones en forma de liposomas pueden contener, además de un compuesto de la presente invención, estabilizantes, conservantes, excipientes y similares. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sintéticas. Los métodos para formar liposomas son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Prescott, ed., Methods in Cell Biology, volumen XIV, Academic Press, Nueva York, N.Y. (1976), p. 33 y siguientes.

Las formas de dosificación para la administración tópica de un agente de esta invención incluyen polvos, pulverizados, ungüentos e inhalantes como se describe en este documento. El agente se mezcla en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante, tampón o propelente necesario que pueda ser necesario. Las formulaciones oftálmicas, los ungüentos para los ojos, los polvos y las disoluciones también se contemplan dentro del alcance de esta invención.

Las composiciones farmacéuticas de la invención para la inyección parenteral comprenden disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles farmacéuticamente aceptables, así como polvos estériles para reconstituir en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso. Los ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos se puede asegurar mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como el monoestearato de aluminio y la gelatina.

En algunos casos, para prolongar el efecto del agente, es deseable frenar la absorción del fármaco incluido en una inyección subcutánea o intramuscular. Este resultado se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de materiales cristalinos o amorfos con poca solubilidad en agua. La velocidad de absorción del agente depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retrasada de un fármaco administrado por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el agente en un vehículo oleoso.

Las formas inyectables de liberación lenta (“depot”) se fabrican formando matrices de microcápsulas del agente en polímeros biodegradables, tales como poliláctida-poliglicólido. Dependiendo de la proporción de agente a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del agente. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de liberación lenta también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias o virus, o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes usar.

La invención proporciona métodos para la administración oral de una composición farmacéutica de la invención. Las formas de dosificación sólidas orales se describen generalmente en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042) en el capítulo 89. Las formas de dosificación sólidas para la administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos, trociscos o pastillas para chupar, sellos, granza y gránulos. Además, la encapsulación de liposomas o proteinoides puede usarse para formular las presentes composiciones (como, por ejemplo, las microesferas de proteinoides indicadas en la patente de EE. UU. n.° 4.925.673). La encapsulación liposomal puede incluir liposomas que se derivatizan con varios polímeros (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 5.013.556). En general, la formulación incluye un agente de la invención e ingredientes inertes que protegen contra la degradación en el estómago y que permiten la liberación del material biológicamente activo en el intestino.

En tales formas de dosificación sólidas, el agente se mezcla o se modifica químicamente para incluir al menos un excipiente o vehículo inerte farmacéuticamente aceptable. El excipiente o vehículo permite preferiblemente (a) la inhibición de la proteólisis y (b) la captación hacia el torrente sanguíneo desde el estómago o el intestino. En una realización más preferida, el excipiente o vehículo aumenta la captación del agente, la estabilidad general del agente y/o el tiempo de circulación del agente en el cuerpo. Los excipientes y vehículos incluyen, por ejemplo, citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o (a) cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, celulosa, dextranos modificados, manitol y ácido silícico, así como sales inorgánicas, tales como trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio, y diluyentes disponibles en el mercado, tales como FAST-FLO®, EMDEX®, STA-RX 1500®, EMCOMPRESS® y Av ICEL®, (b) ligantes, tales como, por ejemplo, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropiletilcelulosa, carboximetilcelulosa, gomas (por ejemplo, alginatos, goma arábiga), gelatina, polivinilpirrolidona y sacarosa, (c) humectantes, tales como glicerol, (d) agentes desintegrantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, determinados silicatos, carbonato de sodio, almidón, incluido el desintegrante comercial a base de almidón, EXPLOTAB®, almidón glicolato de sodio, AMBERLITE®, carboximetilcelulosa sodio, ultramilopectina, gelatina, cáscara de naranja, carboximetilcelulosa, esponja natural, bentonita, resinas de intercambio catiónico insolubles y gomas en polvo, tales como agar, karaya o tragacanto; (e) agentes que retrasan la disolución, tales como parafina, (f) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario y ácidos grasos, incluidos el ácido oleico, el ácido linoleico y el ácido linolénico, (g) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, tensioactivos detergentes aniónicos, que incluyen laurilsulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctilo sodio, y sulfonato de dioctilo sodio, detergentes catiónicos, tales como cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio, detergentes no iónicos que incluyen lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa; (h) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita, (i) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales, ceras, CARBOWAX® 4000, CERA DE CARBONO® 6000, laurilsulfato de magnesio y mezclas de los mismos; (j) deslizantes que mejoran las propiedades de fluidez del fármaco durante la formulación y ayudan a la reorganización durante la compresión que incluyen almidón, talco, sílice pirogénica y silicoaluminato hidratado. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma de dosificación también puede comprender agentes tamponantes.

También pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras, utilizando excipientes, tales como lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con revestimientos y cubiertas, tales como revestimientos entéricos y otros revestimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden contener agentes opacificantes y también pueden tener una composición que libera solo el principio activo o los principios activos, o preferentemente, en una parte del tracto intestinal, opcionalmente, de forma retrasada. Los ejemplos de materiales incluyen polímeros que tienen una solubilidad sensible al pH, tales como los materiales disponibles como EUDRAGIT® Los ejemplos de composiciones de inmersión que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras.

Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada, si procede, con uno o varios de los excipientes mencionados anteriormente.

Las formas de dosificación líquidas para la administración oral incluyen emulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles, ésteres de sorbitán de ácidos grasos y mezclas de los mismos.

Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, colorantes, aromatizantes y perfumantes. Se pueden formular composiciones orales y estas pueden contener además un producto comestible, tal como una bebida.

Las suspensiones, además de dichos uno o más agentes, pueden contener agentes de suspensión tales como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, tragacanto y mezclas de los mismos.

También se contempla en el presente documento la administración pulmonar de dichos uno o más agentes de la invención. Dichos uno o más agentes se administran a los pulmones de un mamífero mientras los inhala, estimulando así la capacidad de atravesar el revestimiento epitelial pulmonar hacia al torrente sanguíneo. Véase, Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7:565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) (acetato de leuprolida); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (suppl.5): s.143-146 (1989) (endotelina-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, 3:206-212 (1989) (a1-antitripsina); Smith et al., J. Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989) (a1-proteinasa); Oswein et al., “Aerosolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, marzo de 1990 (hormona de crecimiento humana recombinante); Debs et al., The Journal of Immunology, 140:3482-3488 (1988) (interferón-y y factor de necrosis tumoral a) y Platz et al., patente de EE. UU. n.° 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos).

Se contempla para su uso en la práctica de esta invención una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, incluidos, entre otros, nebulizadores, inhaladores dosimétricos e inhaladores de polvos, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica.

Algunos ejemplos específicos de dispositivos comercialmente disponibles adecuados para la práctica de la invención son el nebulizador ULTRAVENT®, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, MO; el nebulizador ACORN II®, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, CO.; el inhalador dosimétrico VENTOL®, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.; y el inhalador de polvos SPINHALER®, fabricado por Fisons Corp., Bedford, MA.

Todos estos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para la dispensación de un agente o agentes de la invención. Normalmente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado y puede implicar el uso de un material propelente apropiado, además de diluyentes, adyuvantes y/o vehículos útiles en la terapia.

La composición se prepara en forma de partículas, preferiblemente con un tamaño medio de partícula de menos de 10 gm, y lo más preferiblemente de 0,5 a 5 gm, para una administración más eficaz al pulmón distal.

Los vehículos incluyen carbohidratos, tales como trehalosa, manitol, xilitol, sacarosa, lactosa y sorbitol. Otros ingredientes para usar en formulaciones pueden incluir lípidos, tales como DPPC, DOPE, DSPC y DOPC, tensioactivos naturales o sintéticos, polietilenglicol (incluso aparte de su uso para derivatizar el propio inhibidor), dextranos, tales como ciclodextrano, sales biliares y otros potenciadores relacionados, celulosa y derivados de celulosa, y aminoácidos.

También se contempla el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión u otro tipo de vehículos.

Las formulaciones adecuadas para usar con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, normalmente comprenden un compuesto de la invención disuelto en agua a una concentración de aproximadamente 0,1 a 25 mg de proteína biológicamente activa por ml de disolución. La formulación también puede incluir un tampón y un azúcar sencillo (por ejemplo, para la estabilización de proteínas y la regulación de la presión osmótica). La formulación del nebulizador también puede contener un tensioactivo para reducir o prevenir la agregación inducida por tensión superficial de la composición de inhibidor provocada por la atomización de la disolución al formar el aerosol.

Las formulaciones para usar con un dispositivo inhalador dosimétrico generalmente comprenden un polvo finamente dividido que contiene el agente suspendido en un propelente con la ayuda de un tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este fin, tal como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono o un hidrocarburo, incluidos triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitán y lecitina de soja. El ácido oleico también puede ser útil como tensioactivo.

Las formulaciones para dispensar desde un dispositivo inhalador de polvos comprenden un polvo seco finamente dividido que contiene el agente y también pueden incluir un agente de carga, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa, manitol, trehalosa o xilitol, en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo, del 50 al 90 % en peso de la formulación.

También se contempla la administración nasal de dichos uno o más agentes y la composición de la invención. La administración nasal permite el paso del agente o composición hacia el torrente sanguíneo directamente después de administrar el producto terapéutico en la nariz, sin necesidad de depósito del producto en el pulmón. Las formulaciones para la administración nasal incluyen las que contienen dextrano o ciclodextrano. También se contempla la administración a través del transporte a través de otras membranas mucosas.

Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que se pueden preparar mezclando dichos uno o más agentes de la invención con excipientes o vehículos no irritantes adecuados, tales como manteca de cacao, polietilenglicol o cera para supositorios, que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal y, por lo tanto, se derriten en el recto o en la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.

Con el fin de facilitar la administración de dichos uno o más agentes a través de las membranas celulares y/o nucleares, se prefieren las composiciones con una hidrofobicidad relativamente alta. Dichos uno o más agentes se pueden modificar de una manera que aumente la hidrofobicidad, o dichos uno o más agentes se pueden encapsular en vehículos o disoluciones hidrófobos que dan como resultado una mayor hidrofobicidad.

La práctica de la invención se entenderá aún más plenamente a partir de los siguientes ejemplos, que se presentan en este documento únicamente a modo de ilustración y no deben interpretarse como limitantes de la invención de ningún modo.

Ejemplos

Ejemplo 1: ARNip dirigidos a rodopsina humana y ácidos nucleicos de reemplazo de rodopsina

Se sintetizaron ARNip dirigidos a la rodopsina humana y se evaluaron para la supresión mediada por ARNi (enumerados en la tabla 8). Posteriormente se diseñaron construcciones de supresión y reemplazo con supresores dirigidos a la secuencia de ARNm de rodopsina humana y genes de reemplazo de rodopsina que escapan a la supresión por el supresor debido a cambios sutiles en la secuencia. Estos cambios, aunque permitieron que los ácidos nucleicos de reemplazo escaparan a la supresión al menos en parte, no cambiaron el producto proteico expresado a partir de los genes de reemplazo. Se utilizaron ARN de horquilla corta (ARNhc) para demostrar la supresión in vivo (figura 1). La secuencia de las hebras sentido y antisentido de los ARNhc es la misma que la secuencia utilizada para los ARNip. Se incluye un bucle intermedio entre las hebras sentido y antisentido de la misma manera que Brummelkamp et al., Science, 296(5567):550-553, 2001. De manera notable, el número de nucleótidos y la composición de los nucleótidos en el bucle intermedio pueden variar. Dichas una o más construcciones se administraron utilizando un virus recombinante AAV2/5. Se puede usar ARNip no dirigido como control, por ejemplo, se puede usar un ARNip no dirigido que se dirige a un gen indicador EGFP, por ejemplo.

Los ARNip se diseñaron de acuerdo con el método de Elbashir et al., Nature, 411 (6836):494-498, 2001, o mediante el uso del algoritmo de diseño de ARNip HiPerformance (Qiagen Ltd. Crawley, Reino Unido). Las secuencias diana del ARNip diferían en al menos 4 nucleótidos de cualquier secuencia que no fuera de rodopsina en las bases de datos de ratón y humanas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast, BLAST2.2.6 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17):3389-3402, 1997). Inicialmente, siBB, siQ1 y un ARNip siNT no dirigido (5' UUCUCCGAACGUGUCACGU 3'; SEQ ID NO:75) o EGFP (U57608), siEGFP (nt 256-277) se clonaron cadena abajo del promotor H1 usando los sitios de restricción BglII/BamH1 y Hind III para generar ARNhc y posteriormente en pEGFP-1 (BD Biosciences, Clontech, Palo Alto, CA) usando los sitios EcoRi y Hind III para generar shBB-EGFP, shQl-EGFP y shNT-EGFP (figura 1A). El gen EGFP permitió monitorear la transducción viral. Seis secuencias de ARNip se dirigieron a la región codificadora de la rodopsina humana. Los ácidos nucleicos de reemplazo se clonaron en el plásmido pCDNA3.1 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). El promotor de CMV se reemplazó por el promotor de ubiquitina C humana (pUB6/V5-His, Invitrogen) o con un fragmento de 1,7 kb del promotor rho de ratón (rhoP). Se introdujeron alteraciones de secuencia en los ácidos nucleicos de reemplazo usando mutagénesis basada en PCR dirigida por cebador usando métodos conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos de reemplazo con alteraciones de secuencia sobre los sitios diana para siB, siBB, siC, siCC, siQ1 y siQ2 se denominaron rB, rBB, rC, rCC, rQ1 y rQ2. Los nucleótidos alterados en las secuencias de rodopsina de reemplazo están en posiciones titubeantes (resaltadas en negrita). Estos genes de reemplazo se diseñaron para evitar la supresión por los ARNip, pero siguen codificando proteína de tipo salvaje. La tabla 8 proporciona un ejemplo de reemplazo para cada sitio diana de ARNip; sin embargo, en cada caso hay varias secuencias de reemplazo posibles porque algunos aminoácidos tienen hasta seis codones y otros tienen cuatro o tres codones.

Supresión de RHO en células HeLa

La supresión mediada por ARNi de RHO se evaluó inicialmente en células HeLa. Se cotransfectaron ARNip dirigidos a RHO con RHO de tipo salvaje dirigido por el promotor de CMV. Las transfecciones se llevaron a cabo tres veces por cuadruplicado usando Lipofectamine 2000 para ayudar a las transfecciones (Gibco-BRL). Unas RT-PCR en tiempo real, realizadas en los ARN extraídos de las células transfectadas 24 horas después de la transfección, demostraron una supresión de hasta el 87 % (p<0,01, figura 2A) (consúltese la tabla 7 para conocer las secuencias de los cebadores). Se seleccionaron los ARNip siBB, siCC y siQ1 para su posterior análisis. Se cuantificaron niveles similares de supresión de la proteína rodopsina mediante ELISA (hasta un 88 %, p<0,01, figura 2A) y se demostraron mediante inmunocitoquímica 24 horas después de la transfección (figura 2B). Posteriormente, se generaron construcciones de RHO de reemplazo, rBB, rCC y rQ1, incorporando cambios de nucleótidos en posiciones degeneradas sobre los sitios diana para ARNip, siBB, siQ1 y siCC como se describió anteriormente y se muestra en la tabla 8. Las transfecciones se realizaron tres veces por cuadruplicado en células HeLa de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, como se describió anteriormente. Los resultados indicaron que las construcciones de RHO de reemplazo no fueron suprimidas por los ARNip correspondientes, por ejemplo, rBB por siBB (figura 3). Sin embargo, se obtuvieron niveles significativos de supresión con otros ARNip no correspondientes, por ejemplo, siQ1 suprimió a rBB y rCC (figura 3).

Supresión a largo plazo de RHO en explantes de retina

Para proporcionar una supresión de RHO a largo plazo, siBB y siQ1 se clonaron como ARNhc en un vector de expresión de EGFP (shBB-EGFP y shQ1-EGFP, figura 1A). Los plásmidos se sometieron a electroporación en explantes de retina de ratones recién nacidos NHR+/- rho-/- utilizando los métodos descritos en Matsuda y Cepko (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:16-22. Los ratones NHR+/- expresan el gen RHO humano de tipo salvaje y muestran un fenotipo de tipo salvaje. Las células de los explantes de retina (n = 6) se disociaron dos semanas después de la electroporación y las células positivas para EGFP se aislaron mediante FACS (figura 4A). Se realizó una RT-PCR en tiempo real sobre el ARN extraído de células aisladas con FACS positivas para EGFP usando los cebadores descritos en la tabla 8, y los resultados obtenidos en los explantes reflejaron los encontrados en las células HeLa. Los resultados indicaron que se logró una supresión de RHO superior al 85 % (p<0,001, figura 4B).

Supresión a largo plazo usando vectores de AAV

Se requerirá una expresión a largo plazo en terapias para una retinopatía progresiva, tal como la adRP. Para lograr la supresión a largo plazo in vivo, se introdujeron shBB-EGFP y el shNT-EGFP no dirigido en vectores AAV (AAV-shBB-EGFP y AAV-shNT-EGFP) (figura 1a). Los virus AAV2/5 recombinantes se generaron usando un sistema sin virus auxiliares. Los módulos de expresión se clonaron en pAAV-MCS (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.), entre las repeticiones terminales invertidas de AAV2 y se transfectaron en células HEK-293 (ATCC n.° CRL-1573) con pRep2/Cap5 y pHelper (Stratagene), en una proporción de 1:1:2. Se transfectaron cincuenta placas de 150 mm de células confluentes (50 gg de ADN/placa) con polietileminina. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, los lisados virales brutos se aclararon y purificaron mediante una centrifugación en gradiente de CsCL. Las fracciones que contenían AAV se dializaron frente a PBS. Se determinaron las titulaciones genómicas, es decir, las partículas virales (vp/ml), mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los AAV generados contenían las construcciones shBB-EGFP y shNT-EGFP (AAV-shBB-EGFP y AAV-shNT-EGFP, figura 1a).

El gen EGFP permitió controlar la transducción viral. Tres gl de AAV-shBB-EGFP (2x1012 vp/ml) o AAV-shNT-EGFP (3x1012 vp/ml) se inyectaron subretinalmente en ratones adultos NHR+/- rho-/-. Dos semanas después de la inyección, se sacrificaron dos animales y se demostró la expresión del shBB de 21 nucleótidos en dos retinas usando protección con RNasa (figura 5A). Las retinas se disociaron y las células positivas para EGFP se recogieron mediante FACS. La supresión mediada de RHO por ARNi, según lo evaluado por la RT-PCR en tiempo real (consúltese la tabla 8 para conocer las secuencias de los cebadores) dos semanas después de la inyección (n = 6), fue de aproximadamente el 90 % (p <0,001) en células de fotorreceptores transducidas con AAV-shBB-EGFP (figura 5B). Se disociaron cuatro retinas y se demostró una supresión significativa de la expresión de la proteína rodopsina in vivo en células transducidas positivas para EGFP por inmunocitoquímica (figura 5C).

Supresión en animales transgénicos

Se generó un ratón transgénico que expresa un gen RHO con la secuencia modificada (RHO-M). Se evaluó RHO-M+/- rho-/- a los dos meses de edad para el rescate de la patología retiniana presente en ratones rho-/- por histología (figura 6A-C) y ERG (figura 6D). El inmunomarcaje de rodopsina en los segmentos externos de bastones y el grosor de las capas nucleares externas fueron similares en ratones rho+/+ de tipo salvaje (figura 6A), NHR+/- rho-/- (figura 6B) y RHO-M+/- rho-/-(figura 6C). Además, las respuestas de ERG fueron similares en ratones de tipo salvaje rho+/+, rho+/-, NHR+/- rho-/- y RHO-M+/- rho-/-. Se observaron ondas b de ERG de respuestas de bastones aisladas de 500­ 700 gV en ratones de todos los genotipos (figura 6D). Las amplitudes y los tiempos de las respuestas combinadas de bastones y conos frente al destello de máxima intensidad presentado en el estado adaptado a la oscuridad, así como las respuestas de conos aisladas adaptadas a la luz tanto al destello único como a parpadeos de 10 Hz, fueron equivalentes en todos los genotipos examinados (datos no mostrados). Estos resultados validan el uso de la degeneración del código genético para diseñar genes RHO humanos con codones modificados que pueden proporcionar una proteína de rodopsina humana funcional.

Supresión administrada por AA Vy reemplazo de RHO humano in vivo

Habiendo establecido shBB y shQ1 como supresores potentes y rBB y rQ1 como refractarios a sus correspondientes supresores, shBB-rBB y shQ1-rQ1 se clonaron en vectores de AAV utilizando el sistema de triple plásmido detallado anteriormente y se generaron virus que contenían ambos elementos del producto terapéutico (AAV-shBB-rBB (también denominado AAV-BB8) y AAV-shQ1-rQ1 (también denominado AAV-Q1)) usando el método detallado anteriormente. Se inyectaron subretinalmente 3 pl de AAV-shBB-rBB en ratones adultos de tipo salvaje rho+/+ (n = 12) y se confirmó la expresión de ARNm de RHO de reemplazo por RT-PCR y protección de RNasa utilizando ARN extraído 10 días después de la inyección (datos no mostrados). Para demostrar que el rBB administrado por AAV se traduce en proteína, se inyectaron subretinalmente 2 pl de una mezcla 1:1 de AAV-shBB-rBB y AAV-CMV-EGFP en ratones rho-/- de 10 días de edad (n = 6). Dos semanas después de la inyección, se determinó la expresión de la proteína EGFP y la rodopsina mediante microscopía de fluorescencia. Se observó una marcada expresión de rodopsina, solapada con EGFP, en las áreas transducidas (figura 7).

Posteriormente, se inyectó subretinalmente 1 pl de AAV-shBB-rBB o AAV-shQ1-rQ1 en ratones recién nacidos Pro23His+/- rho+/- (n = 10) que presentan una degeneración retiniana que produce la pérdida completa de fotorreceptores a las dos semanas de edad. . En todos los animales, se inyectó un ojo con virus terapéutico (ya sea AAV-shBB-rBB o AAV-shQ1 -rQ1) y el otro con un virus de control (AAV-EGFP). La aparición temprana y la naturaleza rápida de la retinopatía en cachorros Pro23His jóvenes impidieron el uso de ERG como lectura para determinar el beneficio. Sin embargo, a los diez días de edad se evaluó la histología retiniana en secciones sumergidas en resina semidelgadas cortadas a intervalos de aproximadamente 50 pm a lo largo del meridiano central del ojo (n = 10). De cada sección se tomaron aproximadamente 40 mediciones de espesor de ONL. Dado que solo una parte de la retina se transduce con una sola inyección subretiniana de AAV (particularmente en cachorros recién nacidos), para identificar el área transducida, las mediciones de ONL se ordenaron por grosor y el 15 % de los valores más altos y más bajos se agruparon para el análisis. Los valores más bajos representan lecturas de ONL más delgadas, lo más probable es que correspondan a áreas periféricas de la retina y, por lo tanto, no muy cerca de los sitios de inyección. Los valores más altos representan lecturas de ONL más gruesas, lo más probable es que correspondan a áreas centrales de la retina y, por lo tanto, más cercanas a los sitios de inyección. Se observaron diferencias significativas en el grosor de ONL entre los ojos tratados con AAV-shBB-rBB- y AAV-EGFP. Se descubrió que la ONL de los ojos tratados era aproximadamente un 33 % (p<0,001) más gruesa que las partes homólogas inyectadas con control para los grupos de valores más altos (figura 8A-C). En las agrupaciones de valores más bajos se observó una diferencia de aproximadamente el 10 % (figura 8A). Estos datos proporcionan pruebas a nivel histológico de que el ARNi transportado por AAV2/5 junto con la provisión de un gen de reemplazo con codones modificados puede modular beneficiosamente la retinopatía en ratones Pro23His+/- rho-/-.

La supresión mediada por ARNi se evaluó en tejido retiniano después de una inyección subretiniana de vectores de AAV que expresan un supresor dirigido a la rodopsina (AAV-shBB-EGFP, AAV-shcC-EGFP y AAV-shQ1-EGFP) o un control no dirigido (AAV-shNT-EGFP). A ratones que expresan un gen de reemplazo de rodopsina humana (denominados ratones RHO-M y detallados en la sección sobre la supresión en animales transgénicos) se les inyectaron por vía subretiniana vectores AAV (AAV2/5), que contenían secuencias de ARNhc para BB, CC y Q1 y un gen indicador EGFP (AAV-shBB-EGFP, AAV-shCC-EGFP y AAV-shQ1-EGFP). La presencia del gen indicador Eg Fp permitió el aislamiento de la población de células retinianas que son positivas para EGFP y, por lo tanto, han recibido AAV utilizando FACS para aislar estas poblaciones celulares. Se evaluó la supresión mediada por ARNi transportado por AAV con cada supresor (BB, CC y Q1) usando RT-PCR en tiempo real en poblaciones celulares caracterizadas por FACS y se comparó con la supresión obtenida usando AAV con secuencias de ARNhc de control no dirigidas (AAV-shNT-EGFP). Se obtuvo una supresión significativa de rodopsina con los supresores BB y Q1, aunque se obtuvieron niveles significativamente más bajos de supresión con el supresor CC (figura 6E). El gen de reemplazo en ratones RHO-M estaba parcialmente protegido frente a la supresión debido a la presencia de dos desapareamientos de nucleótidos entre la secuencia supresora CC y el sitio diana para la supresión en el gen de reemplazo de rodopsina humana. El gen de reemplazo está parcialmente protegido frente a la supresión basada en ARNip CC por la introducción de dos cambios de nucleótidos en sitios degenerados en el gen de reemplazo. La figura 6F ilustra la depresión de la respuesta de ERG en ojos RHO-M que han recibido AAV-shBB-EGFP (panel 1) o AAV-shQ1-EGFP (panel 2) en comparación con ojos inyectados subretinalmente con AAV-shNT-EGFP. El trazo superior en cada panel representa el ojo derecho que recibió el vector AAV-ARNhc dirigido y el trazo inferior en cada panel representa el ojo izquierdo que recibió el vector AAV-shNT no dirigido de control. Por el contrario, no se observó reducción/depresión del ERG en ratones RHO-M a los que se les inyectó subretinalmente el vector AAV-shCC-EGFP (panel 3); esto probablemente se deba a los niveles reducidos de supresión de rodopsina observados con AAV-shCC-EGFP (consúltese la figura 6E anterior).

Ejemplo 2: Optimización de la expresión de agentes de supresión y ácidos nucleicos de reemplazo

La expresión de los vectores de supresión y/o de reemplazo se optimizó incluyendo en los vectores secuencias que potenciaban y/o modulaban los niveles de expresión a nivel de ARN y/o proteína. En la tabla 1 se proporciona una lista de ejemplos de elementos de secuencia, aunque los elementos de potenciación y/o modulación de la invención no son los únicos que aparecen en esta lista. Por ejemplo, uno o más de un promotor, un relleno, un aislante, un silenciador, una secuencia de remodelación de cromatina, una secuencia de intrón, una señal de poliadenilación, un elemento regulador postraduccional y un sitio de unión al factor de transcripción pueden incluirse en las construcciones de supresión y/o reemplazo para modular la expresión de los componentes de supresión y/o reemplazo relacionados con la invención.

Dichos elementos y derivados de los mismos se pueden usar para modular los niveles de expresión, la especificidad de tejido, el tiempo de expresión y/o la inducción de expresión. La tabla 9 proporciona algunos ejemplos de secuencias que se pueden usar para modular la expresión de las construcciones de supresión y/o reemplazo relacionadas con la invención. Las secuencias proporcionadas se encuentran dentro de regiones conservadas evaluadas mediante la comparación de secuencias de múltiples especies. En cualquier posición, un nucleótido puede no estar conservado entre todas las especies; las secuencias representan regiones en las que, en general, hay un alto grado de conservación. Dichas secuencias conservadas de cualquier especie, tal como de humano, ratón, rata, bacteria, virus y/o incluso una secuencia híbrida de más de una especie, podrían usarse en la invención.

Tabla 9: Ejemplos de secuencias potenciadoras

Ejemplo 3: Comparación de genes de rodopsina

Además de añadir elementos potenciadores y/o moduladores a los vectores de supresión y/o reemplazo, se estudió en detalle el promotor de rodopsina. Una comparación de los genes de rodopsina presentes en diferentes mamíferos dio como resultado la identificación de 9 regiones altamente conservadas en el gen de rodopsina (regiones conservadas A a I, secuencia 1, tabla 10). Las regiones A, B, C y D están en la región del promotor de rodopsina, la región conservada E está en el intrón 2 del gen, y las regiones conservadas F, G, H e I están en la región 3'.

La siguiente secuencia (secuencia 1; tabla 10) muestra las regiones conservadas dentro de la secuencia intrónica y exónica y 3' humanas del promotor de ratón. En particular, las secuencias conservadas en el promotor de ratón son casi las mismas en el promotor de rodopsina humana y se contempla que los promotores de rodopsina humanos u otros mamíferos y/o derivados y/o híbridos de los mismos puedan usarse en las construcciones de supresión y reemplazo. Además, se contempla que otros promotores podrían combinarse con algunas o todas las regiones conservadas A a I y usarse en construcciones de supresión y/o reemplazo, por ejemplo, se pueden usar otras secuencias de promotor retiniano.

Tabla 10: Regiones conservadas de rodopsina

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S ecuencia 1: Secuencia del p rom otor de rodopsina de ratón (m ayúsculas) que te rm ina en el s itio Xho I (resa ltado en negrita), segu ida de 5 'U TR de rodopsina hum ana, exones e in trones de rodopsina hum ana y la secuencia de la región 3' de rodopsina hum ana (m inúscu las). Las reg iones conservadas A-I están resa ltadas en negrita (SEQ ID NO:90).

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ctgaccccct gatctgattc gtgtccctta ígggcccaga gcgcíaagca aataacttcc

cccattccct ggaatttctt tgcccagctc tcctcagcgt gtggtccctc tgccccttcc

ccctcctccc agcaccaagc tctctccítc cccaaggcct cctcaaatcc ctctcccact

cctggttgcc ttcctagcta ccctctccct gtctaggggg gagtgcaccc tccttaggca

gtggggtctg tgctgaccgc ctgctgactg ccttgcaggt gaaattgccc tgtggtcctt

ggtggtcctg gccatcgagc ggtacgtggt ggtgtgtaag cccatgagca acttccgctt

cggggagaac catgccatca tgggcgttgc cttcacctgg gtcatggcgc tggcctgcgc

cgcaccccca ctcgccggct ggtccaggta atggcactga gcagaaggga agaagctccg ggggctcttt gtagggtcct ccagtcagga ctcaaaccca gtagtgtctg gttccaggca

cígaccttgt atgtctcctg gcccaaaígc ccactcaggg taggggtgta gggcagaaga

agaaacagac tctaatgttg ctacaagggc tggtcccatc tcctgagccc catgtcaaac región conservada E agaatccaag acatcccaac ccttcacctt ggctgtgccc ctaatcctca actaagctag

gcgcaaattc caatcctctt tggtctagta ccccgggggc agccccctct aacctígggc ctcagcagca ggggaggcca caccttccta gtgcaggtgg ccatattgtg gccccttgga

actgggtccc actcagcctc taggcgattg tctcctaatg gggctgagat gagactcagt

ggggacagtg gtttggacaa taggactggt gactctggtc cccagaggcc tcatgtccct

ctgtctccag aaaattccca ctctcacítc cctttcctcc ícagtcttgc tagggtccat

ttctacccct tgctgaattt gagcccaccc cctggacttt ttccccatct tctccaatct

ggcctagttc tatcctctgg aagcagagcc gctggacgct ctgggtttcc tgaggcccgt

ccactgtcac caatatcagg aaccattgcc acgtcctaat gacgtgcgct ggaagcctct

agtttccaga agctgcacaa agatccctta gatactctgt gtgtccatct ttggcctgga

aaatactctc acccíggggc taggaagacc tcggtttgta caaacttcct caaatgcaga

gcctgagggc tctccccacc tcctcaccaa ccctctgcgt ggcatagccc tagcctcagc

gggcagtgga tgctggggct gggcatgcag ggagaggctg ggtggtgtca tctggtaacg

cagccaccaa acaatgaagc gacactgatt ccacaaggtg catcígcatc cccatctgat

ccattccatc ctgtcaccca gccatgcaga cgtttatgat ccccttttcc agggagggaa

tgtgaagccc cagaaagggc cagcgctcgg cagccacctt ggctgttccc aagtccctca caggcagggt ctccctaccí gccígtcctc aggtacatcc ccgagggcct gcagtgctcg

tgtggaatcg actactacac gctcaagccg gaggtcaaca acgagtcttt tgtcatctac

atgttcgtgg tccacttcac catccccatg attatcatct ttttctgcta tgggcagctc

gtcttcaccg tcaaggaggt acgggccggg gggtgggcgg cctcacggct ctgagggtcc

agcccccagc atgcatctgc ggctcctgct ccctggagga gccatggtct ggacccgggt

cccgtgtcct gcaggccgct gcccagcagc aggagtcagc caccacacag aaggcagaga

aggaggtcac ccgcatggtc atcatcatgg tcatcgcttt cctgatctgc tgggtgccct

acgccagcgt ggcattctac atcttcaccc accagggctc caacttcggt cccatcttca

tgaccatccc agcgttcttt gccaagagcg ccgccatcta caaccctgtc atctatatca

tgatgaacaa gcaggtgcct actgcgggtg ggagggcccc agtgccccag gccacaggcg

ctgcctgcca aggacaagct actcccaggg caggggaggg gctccatcag ggttactggc

agcagtcttg ggtcagcagt cccaatgggg agtgtgtgag aaatgcagat tcctggcccc

actcagaact gctgaatctc agggtgggcc caggaacctg catttccagc aagccctcca

caggtggetc agatgctcac tcaggtggga gaagctccag tcagctagtt ctggaagccc

aatgtcaaag tcagaaggac ccaagtcggg aatgggatgg gccagtctcc ataaagctga

ataaggagct aaaaagtctt attctgaggg gtaaaggggt aaagggttcc tcggagaggt

acctccgagg ggtaaacagt tgggtaaaca gtctctgaag tcagctctgc cattttctag

ctgtatggcc ctgggcaagt caatttcctt ctctgtgctt tggtttcctc atccatagaa

aggtagaaag ggcaaaacac caaactcttg gattacaaga gataatttac agaacaccct

tggcacacag agggcaccat gaaatgtcac gggtgacaca gcccccttgt gctcagtccc

tggcatctct aggggtgagg agcgtctgcc tagcaggttc ccaccaggaa gctggatttg

agtggatggg gogctggaat cgtgaggggc agaagcaggc aaagggtcgg ggcgaacctc

actaacgtgc cagttccaag cacactgtgg gcagccctgg ccctgactca agcctcttgc

cttccagttc cggaactgca tgctcaccac catctgctgc ggcaagaacc cactgggtga

cgatgaggcc tctgctaccg tgtccaagac ggagacgagc caggtggccc cggcctaaga

cctgcctagg actctgtggc cgactatagg cgtctcccat cccctacacc ttcccccagc

cacagccatc ccaccaggag cagcgcctgt gcagaatgaa cgaagtcaca taggctectt región conservada F aatttttttt ttttttttaa gaaataatta atgaggctcc tcactcacct gggacagcct

gagaagggac atccaccaag acctactgat ctggagtccc acgttcccca aggccagcgg

gatgtgtgcc cctcctcqtc ccaactcatc tttcaggaac acgaggattc ttgc tttc tg

gaaaagtgtc ccagcttagg gataagtgtc tagcacagaa tggggcacac agtaggtgct región conservada G taataaatgc tggatggatg caggaaggaa tggaggaatg aatgggaagg gagaacatat

ctatcctctc agaccctcgc agcagcagca actcatactt ggctaatgat atggagcagt

tgtttttccc tccctgggcc tcactttctt ctcctataaa atggaaatcc cagatccctg

gtcctgccga cacgcagcta ctgagaagac caaaagaggt gtgtgtgtgt ctatgtgtgt

gtttcagcac tttgtaaata gcaagaagct gtacagattc tagttaatgt tgtgaataac

atcaattaat gtaactagtt aattactatg attatcacct cctgatagtg aacattttga

gattgggcat tcagatgatg gggtttcacc caaccttggg gcaggttttt aaaaattagc

taggcatcaa ggccagacca gggctggggg ttgggctgta ggcagggaca gtcacaggaa

tgcaggatgc agtcatcaga cctgaaaaaa caacactggg ggagggggac ggtgaaggcc

aagttcccaa tgagggtgag attgggcctg gggtctcacc cctagtgtgg ggccccaggt

cccgtgcctc cccttcccaa tgíggcctat ggagagacag gcctttctct cagcctctgg

aagccacctg ctcttttgct ctagcacctg ggtcccagca tctagagcat ggagcctcta

gaagccatgc tcacccgccc aca tttaa tt aacagctgag tccctgatgt eatccttact región conservada H cgaagagctt agaaacaaag agtgggaaat tccactgggc ctaccttcct tggggatgtt

catgggcccc agtttccagt ttcccttgcc agacaagccc atcttcagca gttgctagtc

cattctccat tctggagaat ctgctccaaa aagctggcca catctctgag gtgtcagaaí

taagctgcct cagfaactgc tcccccttct ccatataagc aaagccagaa gctctagctt

tacccagctc tgcctggaga ctaaggcaaa ttgggccatt aaaagctcag ctcctatgtt

ggtattaacg gtggtgggtt ttg ttg c ttt cacactctat ccacaggata gattgaaact región conservada I gccagcttcc acctgatccc tgaccctggg atggctggat tgagcaatga gcagagccaa

gcagcacaga gtcccctggg gctagaggtg gaggaggcag tcctgggaat gggaaaaacc

ccaactttgg ggtcatagag gcacaggtaa cccataaaac tgcaaacaag ctt

Las regiones conservadas A a I y algunas secuencias que flanquean las regiones (5' y 3') se combinaron (tabla 11, SEQ ID NO:92 a SEQ ID NO:99, secuencia 2). Esta secuencia se analizó usando MatInspector Release Professional 7.4. 1 para identificar otras regiones que puedan estar implicadas en el control transcripcional y/o traduccional de la expresión del gen de rodopsina (una pequeña porción de los resultados de Matinspector se presentan en la tabla 12). Esta tabla ilustra algunas secuencias dentro de las regiones conservadas A a I que se cree que están implicadas en la transcripción y/o traducción y/o estabilidad de la rodopsina. Algunas de estas secuencias, tales como el elemento de unión a CRX en la región conservada D y la caja TATA en la región G, son conocidas en la técnica. Otras, como la región de unión de CRX en E, no lo son. El conjunto completo de resultados de MatInspector se presenta en la tabla 13. Se identificaron 302 sitios de unión a la transcripción y/o secuencias reguladoras putativos y algunos están resaltados en negrita. Basándose en la naturaleza conservada de las regiones A a I y los importantes sitios de unión del factor de transcripción que se cree que están ubicados dentro de estas regiones, se generaron las construcciones en la figura 9. La construcción BB16 contiene las regiones conservadas A, B, C, D, F y G. Además, se insertó un elemento CRX-NRL artificial (a continuación) entre las regiones conservadas A y B. Los componentes del elemento potenciador CRX-NRL artificial incluyen el motivo CRX de la región conservada D, el motivo CRX de la región conservada E, y los sitios de unión a NRL están subrayados.

TTTCTGCAGCGGGGATTAATATGATTATGAACACCCCCAATCTCCCAGATG

CTGATTCAGCCAGGAGGTACC (SEQ ID NO:91)

Todas estas construcciones contienen sitios de unión a la transcripción identificados dentro de las regiones conservadas A a I.

Secuencia 2: Las regiones conservadas A a I en el gen de la rodopsina se destacan en negrita a continuación. Los nucleótidos de estas secuencias y una pequeña sección de la secuencia 5' y 3' que rodea a las regiones conservadas se han numerado del 1 al 1600. Esta secuencia se analizó con MatInspector y el sistema de numeración de nucleótidos de la secuencia 2 (1 -1600) se relaciona con el sistema de numeración de nucleótidos de la tabla 13.

Tabla 11 (las regiones conservadas están en negrita)

Tabla 12: Motivos de secuencia conservados en rodopsina

Ejemplo 4

Utilizando los datos de los ejemplos 2 y 3, se genera un conjunto de construcciones que contienen varios supresores de ARNhc y/o ácidos nucleicos de reemplazo de rodopsina mejorados con secuencias de promotor adicionales, que se sabe que se conservan entre especies de vertebrados, y diversas secuencias que se sabe que potencian la expresión al nivel del ARN y/o de proteína. Las figuras 9 y 16 representan esquemáticamente secuencias clonadas en construcciones de supresión y/o reemplazo. En particular, cualquier combinación de los elementos y las regiones conservadas descritas y, de hecho, otros elementos que pueden modular la expresión génica podrían usarse en la invención para controlar la expresión de los componentes de supresión y/o reemplazo.

Luego se usaron las construcciones de supresión y/o reemplazo (figura 9) para generar virus AAV2/5 recombinantes usando los procedimientos proporcionados en el ejemplo 1. Los vectores de supresión y/o reemplazo de AAV2/5 se evaluaron en 129 ratones de tipo salvaje (WT) para determinar los niveles de expresión de supresores y/o ácidos nucleicos de reemplazo a nivel de ARN y de proteína como se detalla en el ejemplo 1. La figura 10A ilustra una comparación utilizando un ensayo de protección de ARNasa de niveles de expresión de rodopsina humana desde el transgén RHO-M en ratones RHO-M (carril M) frente a la expresión de rodopsina obtenida a partir de las construcciones de supresión y reemplazo en rAAV2/5 inyectado subretinalmente en 129 ratones de tipo salvaje (carriles B8, B9, B11, B12, B13, B16, B8). La figura 10a ilustra que AAV-BB8, AAV-BB10, AAV-BB11, AAV-BB12, AAV-BB13 y AAV-BB16 expresan el gen de reemplazo de la rodopsina humana en el ARN extraído de 129 ratones de tipo salvaje inyectados subretinalmente con estas construcciones de supresión y/o reemplazo. . AAV-BB8, AAV-BB10 y AAV-BB11 expresan la rodopsina humana a niveles más bajos que Aa V-BB 12, AAV-BB 13 y AAV-BB16.

Se llevó a cabo una evaluación adicional de los vectores de supresión y reemplazo. La figura 11 proporciona un análisis comparativo de la expresión de la rodopsina humana a partir de vectores de supresión y reemplazo rAAV2/5 usando RT-PCR en tiempo real. La figura 11 ilustra los niveles de expresión de rodopsina de reemplazo en ARN extraído de 129 ratones de tipo salvaje inyectados subretinalmente con las construcciones de supresión y/o reemplazo. Los niveles de expresión también se determinaron en ratones transgénicos Rho-M que expresan una construcción de reemplazo de rodopsina denominada rCC y muestran una función retiniana normal. Los vectores de supresión y reemplazo AAV-BB12, AAV-BB13, AAV-BB16 y AAV-BB18 se expresan aproximadamente en el mismo orden de magnitud que los niveles de transcripción de rodopsina de reemplazo en ratones Rho-M, lo que indica que las construcciones de reemplazo mejoradas con elementos potenciadores y regiones conservadas puede expresar niveles suficientes de rodopsina para mantener una retina funcional in vivo.

La figura 12 ilustra la histología retiniana de retinas de ratón adulto de tipo salvaje inyectadas subretinalmente con 2 ul de 2x1012 partículas/ml de diferentes vectores AAV de rodopsina de supresión y reemplazo (véase la figura 9). Dos semanas después de la inyección de los vectores AAV, se extrajeron los ojos transducidos, se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se criocortaron (12 um). Posteriormente, las secciones se tiñeron con anticuerpo anti-RHO específico humano para visualizar la expresión de RHO de reemplazo utilizando el marcador Cy3 (rojo) en el anticuerpo secundario; los núcleos celulares se contrastaron con DAPI (azul). A: AAV-BB8, B: AAV-BB13, C: AAV-BB24, D: AAV-Q8, E: AAV-Q26, F: retina de ratón transgénico Rho-M no inyectado que expresa RHO (control positivo). Se obtuvieron pruebas claras de expresión de rodopsina humana a partir de vectores de supresión y reemplazo de AAV. Las secciones indican diferentes niveles de expresión de RHO humana a partir de los vectores de supresión y reemplazo de AAV en evaluación. OS: segmentos externos de fotorreceptores; IS: segmentos internos de fotorreceptores; ONL: capa nuclear externa; INL: capa nuclear interna; GCL: capa de células ganglionares.

Para explorar la eficacia del componente de supresión de la estrategia de supresión y reemplazo realizada mediante AAV, se generó una diversidad de vectores de supresión solamente con un gen indicador EGFP (véase la figura 9). Se transdujeron ratones transgénicos NHR adultos en un trasfondo rho-/-, que, por lo tanto, expresan RHO humana normal, pero no rho de ratón, mediante inyección subretiniana de 2 ul de 2x1012 partículas/ml de AAV-shQ1 -EGFP (A) o AAV-shNT-EGFP (B). Dos semanas después de la inyección, se extrajeron los ojos, se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se criocortaron (figura 13). AAV-shQ1-EGFP expresa ARNhc-Ql, que se dirige a RHO, mientras que AAV-shNT-EGFP expresa un ARNhc no dirigido (véase la figura 9 para las construcciones). Ambas construcciones expresan EGFP que permite el seguimiento de las poblaciones de células transducidas (verde). Las secciones se contrastaron con DAPI (azul) para marcar la posición de las capas nucleares. Fue evidente una reducción significativa en el número de células de fotorreceptores en la parte transducida de la capa nuclear externa en las retinas inyectadas con AAV-shQ1-EGFP (A) en comparación con las retinas inyectadas con AAV-shNT-EGFP (B) (figura 13). IS: segmentos internos de fotorreceptores; ONL: capa nuclear externa; INL: capa nuclear interna; GCL: capa de células ganglionares.

A ratones transgénicos RHO-347 adultos que portaban una mutación RHO dominante que causa una degeneración retiniana similar a la RP humana, se les inyectó subretinalmente 2 ul de 2x1012 partículas/ml de vectores AAV-shNT (A) o AAV-shQ1 (B) (figura 14A). Dos semanas después de la inyección, se extrajeron los ojos transducidos, se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se criocortaron (12 um). AAV-shQ1 expresa ARNhc-Ql, que se dirige a RHO, mientras que AAV-shNT expresa un ARNhc no dirigido. Ambas construcciones expresan EGFP que permite el seguimiento de la parte transducida de la retina (verde). Las secciones se contrastaron con DAPI (azul) para indicar las posiciones de las capas nucleares. Fue evidente una reducción significativa del número de células de fotorreceptores en la parte transducida de la capa nuclear externa en las retinas AAV-shNT inyectadas o no inyectadas (C) debido a los efectos degenerativos del transgén RHO-347 (figura 14A). Se detecta una capa nuclear externa significativamente conservada en las retinas transducidas con AAV-shQ1, en las que ARNhc-Q1 suprime de manera eficaz el transcrito de RHO-347, por lo que reduce la degeneración de la retina (figura 14A). Nótese que el gen de la rodopsina de ratón (expresado en estas retinas) fue refractario a la supresión por ARNhc-Ql debido a la presencia de cambios de nucleótidos en el sitio diana para la supresión basada en ARNip de Q1. La supresión de la rodopsina humana y el reemplazo utilizando la degeneración del código genético proporcionó un beneficio terapéutico a nivel histológico en ratones RHO-347.

Además, la figura 14D proporciona pruebas de una mejora en el electrorretinograma (ERG) en ojos RHO-347 tratados con AAV-shQ1-EGFP frente a ojos tratados con AAV-shNT-EGFP. En la figura 14D, se presenta una respuesta de ERG máxima representativa de un ratón RHO-347, que contiene un transgén de rodopsina humana con una mutación en el codón 347, inyectado subretinalmente con construcciones AAV2/5. Este ratón RHO-347 normalmente muestra un fenotipo similar al RP autosómico dominante. La figura superior es la respuesta del ojo derecho, que recibió una inyección de AAV-shQ1-EGFP, un vector AAV2/5 que contiene el supresor ARNip Q1 dirigido por un promotor H1 (shQ1) y un gen EGFP dirigido por CMV. El ojo izquierdo recibió un AAV-shNT-EGFP, un AAV2/5 que contenía un ARNip no dirigido (control) dirigido por un promotor H1 (shNT) y un gen EGFP dirigido por CMV. Como puede verse anteriormente, la respuesta máxima es significativamente mayor en el ojo derecho tratado que en el ojo izquierdo de control, lo que indica que la supresión del transgén de rodopsina mutante conduce a cierto rescate a nivel de ERG.

Ejemplo 5: Secuencias de diversos elementos diseñados para mejorar la expresión de construcciones de reemplazo

Como se describe, los elementos potenciadores, las regiones conservadas A a I y/o los sitios de unión del factor de transcripción y/u otros elementos reguladores y/o elementos epigenéticos pueden combinarse para mejorar la expresión de las construcciones de reemplazo (véanse las figuras 9 y 15 y las tablas 1,2, 9-13). Estos elementos se pueden usar en muchas combinaciones diferentes para lograr una expresión óptima, como se demuestra en los ejemplos proporcionados anteriormente. Los ejemplos adicionales incluyen, entre otros, una construcción que comprende un gen de rodopsina humana expresado a partir de un elemento de promotor compuesto que contiene el promotor de rodopsina de ratón de 484 pb junto con el potenciador de CMV, el elemento potenciador del promotor de rodopsina, la región B conservada del promotor de rodopsina y flanqueada en el extremo 3' del gen por un elemento regulador postranscripcional de marmota y una secuencia poli A mínima. Otro ejemplo es similar al anterior, pero en lugar del potenciador de CMV, contiene múltiplos de los sitios de unión a CRX y/o NRL.

Ejemplo 6: Utilización de factores neuroprotectores/neurotróficos junto con la supresión y el reemplazo

Como se describió anteriormente, existen pruebas en la técnica anterior de que los factores neurotróficos/neuroprotectores pueden mejorar la viabilidad celular y/o el funcionamiento celular, y las secuencias que codifican varios de estos factores se proporcionan en la figura 17. La figura 18 proporciona construcciones de supresión y reemplazo que contienen elementos genéticos que son beneficiosos para la supervivencia de las células neuronales. En el ejemplo, la construcción de supresión y reemplazo pAAV-BB18 (figura 9) se ha combinado con el gen que codifica el factor neurotrófico GDNF, dirigido por un pequeño promotor UCOE (elemento de apertura de la cromatina) (A. Thrasher, resumen 36, Sociedad Británica de Terapia Génica 5a Conferencia Anual, 2008). De forma notable, también se pueden usar otros factores neurotróficos y/o genes que codifican factores neurotróficos tales como, por ejemplo, neurturina, en combinación con cualquiera de las construcciones de supresión y reemplazo descritas. En el ejemplo A (figura 18), el elemento adicional, en este caso la secuencia que codifica GDNF, se ubica junto con la construcción de supresión y reemplazo dentro de las dos secuencias de repeticiones terminales invertidas de AAV, ITS1 e ITS2. En el segundo ejemplo, B (figura 18), el gen GDNF y su promotor no se ubican junto con los elementos de supresión y reemplazo dentro de ITS1 e ITS2, sino que se ubican dentro del esqueleto del plásmido utilizado para generar AAV. Dado que una pequeña proporción del esqueleto se encapsula durante la producción de AAV, esto da como resultado una población mixta de AAV, en la que la mayoría contiene los elementos de supresión, y una minoría contiene los elementos GDNF.

Los vectores AAV generados para contener los componentes de supresión, reemplazo y neurotróficos/neuroprotectores pueden inyectarse subretinalmente en ratones de tipo salvaje y/o en ratones con degeneraciones retinianas heredadas, tales como los ratones RHO-347 y Pro23His descritos en los ejemplos anteriores.

Tabla 14: Potenciadores

GAGCAT CTTACCGCCA

TTTATTCCCA TATTTGTTCT GTTTTTCTTG ATTTGGGTAT ACATTTAAAT GTTAATAAAA CAAAATGGTG GGGCAATCAT TTACATTTTT AGGGATATGT AATTACTAGT TCAGGTGTAT TGCCACAAGA CAAACATGTT AAGAAACTTT CCCGTTATTT ACGCTCTGTT CCTGTTAATC AACCTCTGGA TTACAAAATT TGTGAAAGAT TGACTGATAT TCTTAACTAT GTTGCTCCTT TTACGCTGTG TGGATATGCT GCTTTATAGC CTCTGTATCT AGCTATTGCT TCCCGTACGG CTTTCGTTTT CTCCTCCTTG TATAAATCCT GGTTGCTGTC TCTTTTAGAG GAGTTGTGGC CCGTTGTCCG TCAACGTGGC GTGGTGTGCT CTGTGTTTGC TGACGCAACC CCCACTGGCT GGGGCATTGC CACCACCTGT CAACTCCTTT CTGGGACTTT CGCTTTCCCC CTCCCGATCG CCACGGCAGA ACTCATCGCC GCCTGCCTTG CCCGCTGCTG GACAGGGGCT AGGTTGCTGG GCACTGATAA TTCCGTGGTG TTGTC

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, que son bien conocidas en la técnica.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1 Un vector para la expresión de un agente de supresión para un gen que causa una enfermedad y/o un ácido nucleico de reemplazo que no es reconocido por el agente de supresión, en el que el vector comprende la región B conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra como SEQ ID NO:408, y opcionalmente al menos una de las regiones conservadas seleccionada de:

   (a) la región C conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:94;

   (b) la región F y G conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:97; y

   (c) la región A conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra como SEQ ID NO:403;

   en el que dicho vector es un vector de virus adenoasociado (AAV).
2. 2. - El vector según la reivindicación 1, en el que el vector comprende además:

   (i) la región D conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:95; y/o

   (ii) al menos una de las regiones conservadas H e I del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en las SEQ ID NO:98 y 99, respectivamente.
3. 3. - El vector según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el vector comprende al menos una de cada una de las regiones conservadas B, A, C, D, E, F y G, H e I del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra como o que se muestra en SEQ ID NO:408, 403, 94, 95, 96, 97, 98 y 99.
4. 4. - El vector según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el vector comprende al menos una, pero no todas, de las siguientes regiones conservadas:

   (a) la región C conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:94;

   (b) la región F y G conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:97;

   (c) la región A conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra como SEQ ID NO:403;

   (d) la región D conservada del gen de la rodopsina que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:95; y

   (e) regiones conservadas H e I del gen de la rodopsina que consisten en las secuencias de nucleótidos que se muestran como SEQ ID NO:98 y 99.
5. 5. - El vector según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho vector no comprende todas las regiones conservadas A, C y D del gen de la rodopsina que consisten en la secuencia de nucleótidos que se muestran como o que se muestra en SEQ ID NO:403, 94 y 95.
6. 6. - El vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el vector comprende una o más secuencias para optimizar la supresión y/o el ácido nucleico de reemplazo, en el que dicha secuencia para optimizar la expresión es:

   (i) una secuencia potenciadora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:87-89, o

   (ii) una secuencia potenciadora seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:402-413.
7. 7. - El vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el vector comprende al menos una secuencia del sitio de unión al factor de transcripción seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:100-401.
8. 8. - El vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el vector comprende un elemento de apertura de la cromatina y/o una secuencia que codifica un factor neurotrófico o neuroprotector.
9. 9. - El vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el vector comprende al menos un agente de supresión y/o al menos un ácido nucleico de reemplazo.
10. 10. - El vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha enfermedad es una enfermedad del ojo.
11. 11. - El vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico de reemplazo codifica un gen de rodopsina.
12. 12. - Un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho vector comprende al menos un agente de supresión, en el que dicho agente de supresión comprende:

    (i) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:75, 77, 79, 81,83, 85, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420 y 421, o una variante funcional de la misma que puede hibridar en condiciones de hibridación rigurosas (0,2 SSC, SDS al 0,1 %) o que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO:75, 77, 79, 81,83, 85, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420 y 421;

    (ii) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1,3 , 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 y 33 , o una variante funcional del mismo que puede hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas (0,2 SSC, SDS al 0,1 %) o que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO:1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 y 33; o

    (iii) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:35-67, o una variante funcional de la misma que puede hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas (0,2 SSC, SDS al 0,1 %) o que comparte al menos el 70 % de la secuencia identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO:35-67.
13. 13. - Un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho vector comprende al menos un ácido nucleico de reemplazo, en el que dicho ácido nucleico de reemplazo comprende:

    (i) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, y 68, o una variante funcional de la misma que puede hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas (0,2 SSC, SDS al 0,1 %) o que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34; o

    (ii) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:76, 78, 80, 82, 84 y 86, o una variante funcional de la misma que puede hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas (0,2 SSC, SDS al 0,1 %), o que comparte al menos un 70 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO:76, 78, 80, 82, 84 y 86.
14. 14. - Una composición terapéutica que comprende al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. 15. - Una célula o un ratón transgénico, en el que dicha célula o ratón transgénico comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
16. 16. - Un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en medicina.
17. 17. - Un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para su uso en el tratamiento de enfermedades oculares.