CN108884445A - 肿瘤细胞悬浮培养物和相关方法 - Google Patents

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Abstract

提供用于及时和高效增殖来自患者的人类肿瘤细胞簇的基于悬浮液的细胞培养系统和培养基，和评估所述肿瘤细胞和所述患者对一种或多种治疗剂的潜在反应性的相关方法。

Description

肿瘤细胞悬浮培养物和相关方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.5119(e)要求2016年3月9日提交的PCT/CN2016/075947的优先权，所述专利以全文引用的方式并入。
技术领域
本公开的实施例涉及用于及时和高效增殖来自患者的人类肿瘤细胞簇的基于悬浮液的细胞培养系统和培养基，和评估肿瘤细胞和患者对一种或多种治疗剂的潜在反应性的相关方法。
背景技术
尽管不断努力以改进诊断和治疗，但是癌症在世界范围内仍然是死亡的主要原因。癌症的多样性或异质性呈现开发新疗法的障碍并且还使得难以鉴别可能的应答者。此外，许多癌症疗法受到原发性和获得性抗性的挑战，包括附加点突变和绕过治疗试剂的靶标的替代路径。
未来成功的疗法将可能依赖于引起肿瘤进展和转移性过程的事件的全面分析，连同可容易地被操纵以便精确评估化疗剂和组合的功效的相关模型体系的开发。作为一个实例，使用基质嵌入的、三维(3D)培养物的癌细胞的原代培养物日益用于研究癌症生物学和预测个体患者的化学敏感度。然而，这类基质嵌入的癌细胞原代培养物的条件目前尚未优化。此外，这类原代培养物可为费力的，并且包括潜在的低癌细胞活力、宿主细胞的污染和难以繁殖的结果，以及其它潜在的问题。
因此，有必要开发方法和组合物，通过所述方法和组合物，原代癌细胞可以3D方式与细胞系一样可行地和有效地以及以及时的方式培养。
发明内容
本公开的实施例涉及(一种或多种)培养基悬浮液，包含来自人类患者的人类肿瘤细胞簇的群体，其中培养基悬浮液在约14天内提供肿瘤细胞簇的至少约10％增殖。
在某些实施例中，培养基悬浮液在约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内提供人类肿瘤细胞簇的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％增殖。在一些实施例中，培养基悬浮液在约7天内提供人类肿瘤细胞簇的至少约20％-30％增殖。在某些实施例中，培养基悬浮液在约7天内提供人类肿瘤细胞簇的至少约60％增殖。
在某些实施例中，培养基悬浮液包含成分确定的培养基。在一些实施例中，培养基悬浮液为无血清或大体上无血清的。
在某些实施例中，培养基悬浮液包含或进一步包含选自DMEM/F-12、Wnt3A、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、胆固醇、B细胞活化因子(BAFF)和2-巯基乙醇中的一种或多种组分。在一些实施例中，培养基悬浮液包含选自DMEM/F-12、Wnt3A、bFGF、胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、胆固醇、B细胞活化因子(BAFF)和2-巯基乙醇的组分中的2、3、4、5、6、7、8或9种。在具体实施例中，培养基悬浮液包含DMEM/F-12、Wnt3A、bFGF、胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、胆固醇、B细胞活化因子(BAFF)和2-巯基乙醇。
在某些实施例中，培养基悬浮液包含或进一步包含选自烟碱酰胺、头蛋白、R-反应素-1、Y27632、成纤维细胞生长因子10(FGF10)和VO-OHpic中的一种或多种组分。在一些实施例中，培养基悬浮液包含选自烟碱酰胺、头蛋白、R-反应素-1、Y27632、FGF10和VO-OHpic的组分中的2、3、4、5或6种。在具体实施例中，培养基悬浮液包含烟碱酰胺、头蛋白、R-反应素-1、Y27632、FGF10和VO-OHpic。
在某些实施例中，培养基悬浮液包含或进一步包含选自表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、N2补充剂、B27、前列腺素E2(PGE-2)和N-乙酰基-L-半胱氨酸中的一种或多种组分。在某些实施例中，培养基悬浮液包含选自EGF、HGF、IGF、VEGF、PDGF、N2、B27、PGE2、N-乙酰基-L-半胱氨酸的组分中的2、3、4、5、6、7、8或9种。在具体实施例中，培养基悬浮液包含EGF、HGF、IGF、VEGF、PDGF、N2、B27、PGE2和N-乙酰基-L-半胱氨酸。
在某些实施例中，培养基悬浮液包含或进一步包含烟碱酰胺、头蛋白、R-反应素-1、Y27632、EGF、HGF、IGF、VEGF、PDGF、N2、B27、PGE2、N-乙酰基-L-半胱氨酸、FGF10和VO-OHpic。
在一些实施例中，培养基悬浮液不包含胞外基质组分，例如基质胶、胶原蛋白、层粘连蛋白或纤维结合蛋白。
在某些实施例中，培养基悬浮液包含为来自人类患者的肺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞或乳癌细胞的人类肿瘤细胞簇。在一些实施例中，培养基悬浮液包含为自异种移植有来自人类患者的人类肿瘤细胞和/或组织的免疫缺陷动物中分离的人类肿瘤细胞簇。在某些实施例中，培养基悬浮液包含为直接自从人类患者去除的肿瘤样品中分离的人类肿瘤细胞簇，所述肿瘤样品任选地选白手术样品、活检体、肋膜积液和腹水。
还包括使人类肿瘤细胞增殖的方法，包含从样品中获得人类肿瘤细胞的群体，和在如本文所描述的培养基悬浮液中培养人类肿瘤细胞簇的群体。一些方法包含在培养基悬浮液中培养人类肿瘤细胞簇持续约14天或更少。一些方法包含在培养基悬浮液中培养人类肿瘤细胞簇持续约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天或更少。具体方法包含在培养基悬浮液中培养人类肿瘤细胞簇持续约7天或更少。
还包括测试人类患者对治疗剂的反应性的方法，包含
获得或接收来自人类患者的肿瘤细胞簇的群体；
在根据前述权利要求中任一项所述的培养基悬浮液中培养肿瘤细胞簇的群体；
将治疗剂施用到培养基悬浮液；和
测量在肿瘤细胞的群体中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡，
其中肿瘤细胞增殖的降低和/或肿瘤细胞凋亡的诱导指示人类患者对治疗剂的反应性，并且其中缺乏肿瘤细胞增殖的降低和/或肿瘤细胞凋亡的诱导指示人类患者对治疗剂的抗性。
一些方法包含在与在培养基悬浮液中培养肿瘤细胞簇的群体的同一天施用治疗剂。
某些方法包含于在培养基悬浮液中培养肿瘤细胞簇的群体之后的至少一天施用治疗剂。具体方法包含于在培养基悬浮液中培养肿瘤细胞簇的群体之后的约或在约1、2、3、4、5、6或7天内施用治疗剂。
一些方法包含在施用治疗剂的约14天内测量在肿瘤细胞的群体中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡。一些方法包含在施用治疗剂的约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内测量在肿瘤细胞的群体中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡。特定方法包含在施用治疗剂的约7、6或5天内测量在肿瘤细胞的群体中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡。
在一些实施例中，测量肿瘤细胞增殖的步骤包含测量细胞增殖标志物。在一些实施例中，细胞增殖标志物选自3H-胸苷、溴脱氧尿苷(BrdU)、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(Edu)、Ki-67和增殖细胞核抗原(PCNA)中的一种或多种。
在某些实施例中，测量肿瘤细胞凋亡的步骤包含测量细胞凋亡标志物。在一些实施例中，细胞凋亡标志物选自荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)、半胱天冬酶活化、聚ADP核糖聚合酶(PARP)裂解、DRAQ5、DRAQ7和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP缺口末端标记(TUNEL)试验中的一种或多种。
附图说明
图1A-1D示出将肿瘤细胞簇成功地自以手术方式从患者去除的结肠/直肠肿瘤中分离，并且在成分确定的生长培养基中悬浮培养。
图2示出在短期悬浮培养时段期间肿瘤细胞增殖，如根据Edu掺入所测量(样品1来自图1A，样品2来自图1B，样品3来自图1C，并且样品4来自图1D)。
图3A-3B示出短期悬浮培养物(在约7天内)显示用于肿瘤细胞簇的最高细胞增殖标志物。图3A示出用于四个不同患者样品的增殖标志物，并且图3B示出用于一个示例性患者样品在一周过程内的增殖标志物。
图4示出在测试条件(参看图3B)下，肿瘤细胞簇的生长不完全由测试药物(舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、埃罗替尼(erlotinib)、克卓替尼(crizotinib)、奥沙利铂(oxaliplatin))抑制，这与源自患者的异种移植物(PDX)肿瘤对这些药物的反应一致。
具体实施方式
本公开的实施例涉及发现实现可靠和及时增殖原代人类肿瘤细胞簇(不论直接来源于患者，还是来源于源自患者的异种移植物(PDX))的成分确定的培养基和相关悬浮细胞培养物。悬浮细胞培养物可尤其用于评估患者肿瘤对一种或多种治疗剂的潜在反应性，并且提供在相对较短时间范围内(例如在小于从培养的时间起的一或两周内)鉴别用于患者的最佳医治方案的优点。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中也可使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是本文所描述某些优选的方法和材料。在本说明书中引用的全部出版物和参考文献，包括(但不限于)专利和专利申请，以全文引用的方式并入，如同特定地和独立地指示每个单独出版物或参考文献以引用的方式并入。出于本发明的目的，下文定义以下术语。
冠词“一个(种)(a/an)”在本文中用来指所述冠词的一个或多于一个(即，指至少一个)语法宾语。作为实例，“要素”意指一个要素或多于一个要素。
“约”意指量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。
贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则单词“包含(comprise/comprises/comprising)”应理解成暗示包括所陈述的步骤或要素或者步骤或要素的群组，但不排除任何其它步骤或要素或者步骤或要素的群组。“由……组成”意指包括并且限于短语“由……组成”之后的任何事物。因此，短语“由……组成”指示所列要素为需要或必需的，并且不可存在其它要素。“基本上由...组成”意指包括短语后所列的任何要素，并且限于其它要素，所述要素不干扰或有助于本公开中规定的所列要素的活性或作用。因此，短语“基本上由……组成”指示所列要素为需要或必需的，但其它要素是任选的并且可视其是否实质上影响所列要素的活性或作用而存在或不存在。
“分离”意指大体上或基本上不含在其天然状态下通常伴随的组分的材料。
术语“调节”包括通常与对照相比具有统计学上显著或生理学上显著量的“增加”或“增强”，以及“降低”或“减少”。“增加”或“增强”量通常为“统计学上显著”量，并且可包括为以下的增加：约或至少约1.2、1.4、1.6、1.8、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000倍，或约或至少约5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％，所述量由无组合物或对照组合物、样品或测试对象产生(包括全部整数和两者之间的范围)。“降低”或“减少”量通常为“统计学上显著”量，并且可包括为以下的降低：约或至少约1.2、1.4、1.6、1.8、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000倍，或约或至少约5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％，所述量由无组合物或对照组合物、样品或测试对象产生(包括全部整数和两者之间的范围)。
在某些实施例中，可具体限定在培养基或悬浮培养物中的肿瘤细胞簇的“纯度”。举例来说，相对于其它细胞类型例如非癌性宿主细胞或动物细胞(例如，用于源自异种移植的肿瘤细胞簇)，某些培养基或悬浮培养物可包含为约或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％(包括全部整数和两者之间的范围)纯度的肿瘤细胞簇。
“统计学上显著”意指结果不太可能偶然发生。统计显著性可通过本领域中已知的任何方法来测定。显著性的常用测量值包括p值，其为如果零假设为真那么所观测事件将发生的频率或机率。如果所获得的p值小于显著性水平，那么拒绝零假设。在简单情况下，显著性水平定义为p值为0.05或更小。
“大体上”或“基本上”意指几乎全部或完全例如95％或更大的一些给定量。
如上所述，某些实施例涉及培养基悬浮液，包含来自人类患者的肿瘤细胞簇的群体，其中培养基悬浮液在约14天内提供肿瘤细胞簇的至少约10％增殖。因此，在这些和相关实施例中，肿瘤细胞簇在悬浮培养物中生长，例如作为在悬浮液中的凝集块，而非作为贴壁培养物。
在一些实施例中，培养基悬浮液在约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内提供肿瘤细胞簇的约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％增殖(包括之间的全部组合、整数和范围)。
举例来说，任选地在约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内，或在约5-14、6-14、7-14、8-14、9-14、10-14、11-14、12-14或13-14天内，或在约5-13、6-13、7-13、8-13、9-13、10-13、11-13或12-13天内，或在约5-12、6-12、7-12、8-12、9-12、10-12或11-12天内，或在约5-11、6-11、7-11、8-11、9-11或10-11天内，或在约5-10、6-10、7-10、8-10或9-10天内，或在约5-9、6-9、7-9或8-9天内，或在约5-8、6-8或7-8天内，或在约5-7或6-7天内，或在约5-6天内，具体培养基悬浮液提供肿瘤细胞簇的约或至少约10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55、10-60、10-65、10-70、10-75、10-80、10-85、10-90、10-95或10-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-45、15-50、15-55、15-60、15-65、15-70、15-75、15-80、15-85、15-90、15-95或15-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约20-25、20-30、20-35、20-40、20-45、20-50、20-55、20-60、20-65、20-70、20-75、20-80、20-85、20-90、20-95或20-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约25-30、25-35、25-40、25-45、25-50、25-55、25-60、25-65、25-70、25-75、25-80、25-85、25-90、25-95或25-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约30-35、30-40、30-45、30-50、30-55、30-60、30-65、30-70、30-75、30-80、30-85、30-90、30-95或30-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约35-40、35-45、35-50、35-55、35-60、35-65、35-70、35-75、35-80、35-85、35-90、35-95或35-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约40-45、40-50、40-55、40-60、40-65、40-70、40-75、40-80、40-85、40-90、40-95或40-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约45-50、45-55、45-60、45-65、45-70、45-75、45-80、45-85、45-90、45-95或45-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约50-55、50-60、50-65、50-70、50-75、50-80、50-85、50-90、50-95或50-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约55-60、55-65、55-70、55-75、55-80、55-85、55-90、55-95或55-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约60-65、60-70、60-75、60-80、60-85、60-90、60-95或60-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约65-70、65-75、65-80、65-85、65-90、65-95或65-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约70-80、70-85、70-90、70-95或70-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约75-80、75-85、75-90、75-95或75-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约80-85、80-90、80-95或80-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约85-90、85-95或85-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约90-95或90-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约95-100％增殖，包括其全部组合。特定实施例在约7天内提供肿瘤细胞簇的至少约20-30％增殖，或在约7天内提供肿瘤细胞簇的至少约60％增殖。
在一些实施例中，肿瘤细胞簇的培养基悬浮液包含“成分确定的培养基”。在某些实施例中，“成分确定的培养基”为适用于人类或动物细胞的活体外或离体细胞培养的生长培养基，其中全部化学组分为已知的。在一些实施例中，成分确定的培养基为“无血清”或“大体上无血清”的，即培养基缺乏或大体上缺乏添加的血清，例如胎牛血清(FBS)或胎小牛血清(FCS)。
在一些实施例中，成分确定的培养基包含基础培养基如DMEM、F12、RPMI 1640或其组合例如DMEM/F12，所述基础培养基补充有额外组分，例如生长因子、抗氧化剂和/或能量源。因此，在具体实施例中，成分确定的培养基包含杜氏改良Eagle培养基(DMEM)、Ham营养混合液(F12)、RPMI 1640或DMEM/F12。在一些实施例中，培养基包含例如比率为约10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的DMEM/F12。
在某些实施例中，成分确定的培养基包含选自Wnt3A、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、胆固醇、B细胞活化因子(BAFF)和2-巯基乙醇中的一种或多种组分例如1、2、3、4、5、6、7或8种组分，包括前述的全部组合。具体实施例包含DMEM/F-12以及选自Wnt3A、bFGF、胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、胆固醇、B细胞活化因子(BAFF)和2-巯基乙醇中的一种或多种组分例如1、2、3、4、5、6、7或8种组分。特定实施例包含DMEM/F-12、Wnt3A、bFGF、胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、胆固醇、B细胞活化因子(BAFF)和2-巯基乙醇。
在某些实施例中，Wnt3A的浓度范围为约0.1-10,000或1-1000ng/ml，或约0.1-1000、1-1000、10-1000、20-1000、30-1000、40-1000、50-1000、60-1000、70-1000、80-1000、90-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000ng/ml，或约0.1-500、1-500、10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500、100-500、200-500、300-500、400-500ng/ml，或约0.1-400、1-400、10-400、20-400、30-400、50-400、40-400、60-400、70-400、80-400、90-400、100-400、200-400、300-400ng/ml，或约0.1-300、1-300、10-300、20-300、30-300、40-300、50-300、60-300、70-300、80-300、90-300、100-300、200-300ng/ml，或约0.1-200、1-200、10-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200ng/ml，或约0.1-150、1-150、10-150、20-150、30-150、40-150、50-150、60-150、70-150、80-150、90-150、100-150ng/ml，或约0.1-120、1-120、10-120、20-120、30-120、40-120、50-120、60-120、70-120、80-120、90-120、100-120ng/ml，或约0.1-100、1-100、10-100、20-100、30-100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100ng/ml。在具体实施例中，Wnt3A为人类或小鼠Wnt3A蛋白，例如重组人类或小鼠Wnt3A蛋白。
在某些实施例中，bFGF的浓度范围为约0.1-100或1-10ng/ml，或约0.1-100、0.2-100、0.3-100、0.4-100、0.5-100、0.6-100、0.7-100、0.8-100、0.9-100、1-100、2-100、3-100、4-100、5-100、10-100、50-100ng/ml，或约0.1-50、0.2-50、0.3-50、0.4-50、0.5-50、0.6-50、0.7-50、0.8-50、0.9-50、1-50、2-50、3-50、4-50、5-50、10-50ng/ml，或约0.1-10、0.2-10、0.3-10、0.4-10、0.5-10、0.6-10、0.7-10、0.8-10、0.9-10、1-10、2-10、3-10、4-10、5-10ng/ml，或约0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、0.5-5、0.6-5、0.7-5、0.8-5、0.9-5、1-5、2-5、3-5、4-5ng/ml。在具体实施例中，bFGF为人类或小鼠bFGF蛋白，例如重组人类或小鼠bFGF蛋白。
在某些实施例中，胰岛素的浓度范围为约0.1-10,000或1-1000或100-500μg/ml，或约0.1-1000、1-1000、10-1000、20-1000、30-1000、40-1000、50-1000、60-1000、70-1000、80-1000、90-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000μg/ml，或约0.1-500、1-500、10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500、100-500、200-500、300-500、400-500μg/ml，或约0.1-400、1-400、10-400、20-400、30-400、50-400、40-400、60-400、70-400、80-400、90-400、100-400、200-400、300-400μg/ml，或约0.1-300、1-300、10-300、20-300、30-300、40-300、50-300、60-300、70-300、80-300、90-300、100-300、200-300μg/ml，或约0.1-200、1-200、10-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200μg/ml。在具体实施例中，胰岛素为人类或小鼠胰岛素蛋白，例如重组人类或小鼠胰岛素蛋白。在一些实施例中，胰岛素为来自胰腺提取物的溶液或粉末，例如源自牛胰腺的粉末或溶液。
在某些实施例中，转铁蛋白的浓度范围为约0.1-10,000或1-1000或1-100μg/ml，或约0.1-1000、1-1000、10-1000、20-1000、30-1000、40-1000、50-1000、60-1000、70-1000、80-1000、90-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000μg/ml，或约0.1-500、1-500、10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500、100-500、200-500、300-500、400-500μg/ml，或约0.1-400、1-400、10-400、20-400、30-400、50-400、40-400、60-400、70-400、80-400、90-400、100-400、200-400、300-400μg/ml，或约0.1-300、1-300、10-300、20-300、30-300、40-300、50-300、60-300、70-300、80-300、90-300、100-300、200-300μg/ml，或约0.1-200、1-200、10-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200μg/ml，或约0.1-150、1-150、10-150、20-150、30-150、40-150、50-150、60-150、70-150、80-150、90-150、100-150μg/ml，或约0.1-120、1-120、10-120、20-120、30-120、40-120、50-120、60-120、70-120、80-120、90-120、100-120μg/ml，或约0.1-100、1-100、10-100、20-100、30-100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100μg/ml。
在某些实施例中，BSA的浓度为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50％或范围为约1-50％，或约5-50、10-50、15-50、20-50、25-50、30-50、35-50、40-50、45-50％，或约5-45、10-45、15-45、20-45、25-45、30-45、35-45、40-45％，或约5-40、10-40、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40％，或约5-35、10-35、15-35、20-35、25-35、30-35％，或约5-30、10-30、15-30、20-30、25-30％，或约5-25、10-25、15-25、20-25％，或约5-20、10-20、15-20％，或约5-15、10-15％，或约5-10％。
在某些实施例中，任选地相对于50X或100X或250X原料，胆固醇的浓度为约或范围为约处于约0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10X，或范围为约.01-10X或0.1-10X，或约0.1-10、0.2-10、0.3-10、0.4-10、0.5-10、0.6-10、0.7-10、0.8-10、0.9-10、1-10、2-10、5-10X，或约0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、0.5-5、0.6-5、0.7-5、0.8-5、0.9-5、1-5、2-5X，或约0.1-4、0.2-4、0.3-4、0.4-4、0.5-4、0.6-4、0.7-4、0.8-4、0.9-4、1-4、2-4X，或约0.1-3、0.2-3、0.3-3、0.4-3、0.5-3、0.6-3、0.7-3、0.8-3、0.9-3、1-3、2-3X，或约0.1-2、0.2-2、0.3-2、0.4-2、0.5-2、0.6-2、0.7-2、0.8-2、0.9-2、1-2X。胆固醇(250X)可商购自例如赛默飞世尔科学公司(ThermoFisher Scientific)。
在某些实施例中，BAFF的浓度范围为约0.1-10,000或1-1000ng/ml，或约0.1-1000、1-1000、10-1000、20-1000、30-1000、40-1000、50-1000、60-1000、70-1000、80-1000、90-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000ng/ml，或约0.1-500、1-500、10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500、100-500、200-500、300-500、400-500ng/ml，或约0.1-400、1-400、10-400、20-400、30-400、50-400、40-400、60-400、70-400、80-400、90-400、100-400、200-400、300-400ng/ml，或约0.1-300、1-300、10-300、20-300、30-300、40-300、50-300、60-300、70-300、80-300、90-300、100-300、200-300ng/ml，或约0.1-200、1-200、10-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200ng/ml，或约0.1-150、1-150、10-150、20-150、30-150、40-150、50-150、60-150、70-150、80-150、90-150、100-150ng/ml，或约0.1-120、1-120、10-120、20-120、30-120、40-120、50-120、60-120、70-120、80-120、90-120、100-120ng/ml，或约0.1-100、1-100、10-100、20-100、30-100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100ng/ml。在具体实施例中，BAFF为人类或小鼠BAFF蛋白，例如重组人类或小鼠BAFF蛋白。
在某些实施例中，2-巯基乙醇的浓度范围为约0.01-100或0.1-1mM，或约0.01-10、0.02-10、0.03-10、0.04-10、0.05-10、0.06-10、0.07-10、0.08-10、0.09-10、0.1-10、0.5-10、1-10，或5-10mM，或约0.01-5、0.02-5、0.03-5、0.04-5、0.05-5、0.06-5、0.07-5、0.08-5、0.09-5、0.1-5、0.5-5、1-5mM，或约0.01-2、0.02-2、0.03-2、0.04-2、0.05-2、0.06-2、0.07-2、0.08-2、0.09-2、0.1-2、0.5-2、1-2mM，或约0.01-1、0.02-1、0.03-1、0.04-1、0.05-1、0.06-1、0.07-1、0.08-1、0.09-1、0.1-1、0.5-1mM，或约0.01-0.5、0.02-0.5、0.03-0.5、0.04-0.5、0.05-0.5、0.06-0.5、0.07-0.5、0.08-0.5、0.09-0.5，或0.1-0.5mM，或约0.01-0.4、0.02-0.4、0.03-0.4、0.04-0.4、0.05-0.4、0.06-0.4、0.07-0.4、0.08-0.4、0.09-0.4，或0.1-0.4mM，或约0.01-0.3、0.02-0.3、0.03-0.3、0.04-0.3、0.05-0.3、0.06-0.3、0.07-0.3、0.08-0.3、0.09-0.3，或0.1-0.3mM，或约0.01-0.2、0.02-0.2、0.03-0.2、0.04-0.2、0.05-0.2、0.06-0.2、0.07-0.2、0.08-0.2、0.09-0.2，或0.1-0.2mM。
在某些实施例中，并且进一步对于以上组分，悬浮液培养基包含选自烟碱酰胺、头蛋白、R-反应素-1、Y27632、成纤维细胞生长因子10(FGF10)和VO-OHpic中的一种或多种组分例如1、2、3、4、5或6种组分，包括前述的全部组合。在一些实施例中，悬浮液培养基包含烟碱酰胺、头蛋白、R-反应素-1、Y27632、FGF10和VO-OHpic。
在某些实施例中，烟碱酰胺的浓度范围为约0.1-1000、0.5-1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000mM，或约0.1-500、0.5-500、1-500、5-500、10-500、50-500、100-500mM，或约0.1-100、0.5-100、1-100、5-100、10-100、50-100mM，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、10-50mM，或约0.1-40、0.5-40、1-40、5-40、10-40mM，或约0.1-30、0.5-30、1-30、5-30、10-30mM，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5-20、10-20mM，或约0.1-10、0.5-10、1-10、5-10mM，或约0.1-5、0.5-5、1-5mM，或约0.1-1或0.5-1mM。
在某些实施例中，头蛋白的浓度范围为约0.1-10,000或1-1000ng/ml，或约0.1-1000、1-1000、10-1000、20-1000、30-1000、40-1000、50-1000、60-1000、70-1000、80-1000、90-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000ng/ml，或约0.1-500、1-500、10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500、100-500、200-500、300-500、400-500ng/ml，或约0.1-400、1-400、10-400、20-400、30-400、50-400、40-400、60-400、70-400、80-400、90-400、100-400、200-400、300-400ng/ml，或约0.1-300、1-300、10-300、20-300、30-300、40-300、50-300、60-300、70-300、80-300、90-300、100-300、200-300ng/ml，或约0.1-200、1-200、10-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200ng/ml，或约0.1-150、1-150、10-150、20-150、30-150、40-150、50-150、60-150、70-150、80-150、90-150、100-150ng/ml，或约0.1-120、1-120、10-120、20-120、30-120、40-120、50-120、60-120、70-120、80-120、90-120、100-120ng/ml，或约0.1-100、1-100、10-100、20-100、30-100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100ng/ml。在具体实施例中，头蛋白为人类或小鼠头蛋白蛋白，例如重组人类或小鼠头蛋白蛋白。
在某些实施例中，R-反应素-1的浓度范围为约0.1-10,000或1-1000或100-1000ng/ml，或约0.1-10,000、1-10,000、10-10,000、20-10,000、30-10,000、40-10,000、50-10,000、60-10,000、70-10,000、80-10,000、90-10,000、100-10,000、200-10,000、300-10,000、400-10,000、500-10,000、1000-10,000、5000-10,000ng/ml，或约0.1-5000、1-5000、10-5000、20-5000、30-10,000、40-5000、50-5000、60-5000、70-5000、80-5000、90-5000、100-5000、200-5000、300-5000、400-5000、500-5000、1000-5000ng/ml，或约0.1-1000、1-1000、10-1000、20-1000、30-1000、40-1000、50-1000、60-1000、70-1000、80-1000、90-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000ng/ml，或约0.1-800、1-800、10-800、20-800、30-800、40-800、50-800、60-800、70-800、80-800、90-800、100-800、200-800、300-800、400-800、500-800、600-800、700-800ng/ml，或约0.1-700、1-700、10-700、20-700、30-700、40-700、50-700、60-700、70-700、80-700、90-700、100-700、200-700、300-700、400-700、500-700、600-700ng/ml，或约0.1-600、1-600、10-600、20-600、30-600、40-600、50-600、60-600、70-600、80-600、90-600、100-600、200-600、300-600、400-600、500-600ng/ml，或约0.1-500、1-500、10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500、100-500、200-500、300-500、400-500ng/ml。在具体实施例中，R-反应素-1为人类或小鼠R-反应素-1蛋白，例如重组人类或小鼠R-反应素-1蛋白。
在某些实施例中，Y27632的浓度范围为约0.1-1000、0.5-1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000μM，或约0.1-500、0.5-500、1-500、5-500、10-500、50-500、100-500μM，或约0.1-100、0.5-100、1-100、5-100、10-100、50-100μM，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、10-50μM，或约0.1-40、0.5-40、1-40、5-40、10-40μM，或约0.1-30、0.5-30、1-30、5-30、10-30μM，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5-20、10-20μM，或约0.1-10、0.5-10、1-10、5-10μM，或约0.1-5、0.5-5、1-5μM，或约0.1-1或0.5-1μM。
在某些实施例中，FGFl0的浓度范围为约0.1-10,000或1-1000ng/ml，或约0.1-1000、1-1000、10-1000、20-1000、30-1000、40-1000、50-1000、60-1000、70-1000、80-1000、90-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000ng/ml，或约0.1-500、1-500、10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500、100-500、200-500、300-500、400-500ng/ml，或约0.1-400、1-400、10-400、20-400、30-400、50-400、40-400、60-400、70-400、80-400、90-400、100-400、200-400、300-400ng/ml，或约0.1-300、1-300、10-300、20-300、30-300、40-300、50-300、60-300、70-300、80-300、90-300、100-300、200-300ng/ml，或约0.1-200、1-200、10-200、20-200、30-200、40-200、50-200、60-200、70-200、80-200、90-200、100-200ng/ml，或约0.1-150、1-150、10-150、20-150、30-150、40-150、50-150、60-150、70-150、80-150、90-150、100-150ng/ml，或约0.1-120、1-120、10-120、20-120、30-120、40-120、50-120、60-120、70-120、80-120、90-120、100-120ng/ml，或约0.1-100、1-100、10-100、20-100、30-100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100ng/ml。在具体实施例中，FGF10为人类或小鼠FGF10蛋白，例如重组人类或小鼠FGF10蛋白。
在某些实施例中，VO-OHpic的浓度范围为约0.01-100，或0.05-10，或0.1-10μM，或约0.01-10、0.02-10、0.03-10、0.04-10、0.05-10、0.06-10、0.07-10、0.08-10、0.09-10、0.1-10、0.5-10、1-10，或5-10μM，或约0.01-5、0.02-5、0.03-5、0.04-5、0.05-5、0.06-5、0.07-5、0.08-5、0.09-5、0.1-5、0.5-5、1-5μM，或约0.01-2、0.02-2、0.03-2、0.04-2、0.05-2、0.06-2、0.07-2、0.08-2、0.09-2、0.1-2、0.5-2、1-2μM，或约0.01-1、0.02-1、0.03-1、0.04-1、0.05-1、0.06-1、0.07-1、0.08-1、0.09-1、0.1-1、0.5-1μM，或约0.01-0.5、0.02-0.5、0.03-0.5、0.04-0.5、0.05-0.5、0.06-0.5、0.07-0.5、0.08-0.5、0.09-0.5，或0.1-0.5μM，或约0.01-0.4、0.02-0.4、0.03-0.4、0.04-0.4、0.05-0.4、0.06-0.4、0.07-0.4、0.08-0.4、0.09-0.4，或0.1-0.4μM，或约0.01-0.3、0.02-0.3、0.03-0.3、0.04-0.3、0.05-0.3、0.06-0.3、0.07-0.3、0.08-0.3、0.09-0.3或0.1-0.3μM，或约0.01-0.2、0.02-0.2、0.03-0.2、0.04-0.2、0.05-0.2、0.06-0.2、0.07-0.2、0.08-0.2、0.09-0.2或0.1-0.2μM。可商购的VO-OHpic的具体实例包括VO-OHpic三水合物。
在某些实施例中，并且进一步对于以上组分，悬浮液培养基包含选自表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、N2补充剂、B27、前列腺素E2(PGE-2)和N-乙酰基-L-半胱氨酸中的一种或多种组分例如1、2、3、4、5、6、7、8或9种组分，包括前述的全部组合。在具体实施例中，并且进一步对于以上组分，悬浮液培养基包含EGF、HGF、IGF、VEGF、PDGF、N2、B27、PGE2、N-乙酰基-L-半胱氨酸。
在某些实施例中，EGF的浓度范围为约0.1-1000或1-100ng/ml，或约0.1-1000、0.5-1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000ng/ml，或约0.1-500、0.5-500、1-500、5-500、10-500、50-500、100-500ng/ml，或约0.1-100、0.5-100、1-100、5-100、10-100、50-100ng/ml，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、10-50ng/ml，或约0.1-40、0.5-40、1-40、5-40、10-40ng/ml，或约0.1-30、0.5-30、1-30、5-30、10-30ng/ml，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5-20、10-20ng/ml，或约0.1-10、0.5-10、1-10、5-10ng/ml，或约0.1-5、0.5-5、1-5ng/ml，或约0.1-1或0.5-1ng/ml。在具体实施例中，EGF为人类或小鼠EGF蛋白，例如重组人类或小鼠EGF蛋白。
在某些实施例中，HGF的浓度范围为约0.1-1000或1-100ng/ml，或约0.1-1000、0.5-1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000ng/ml，或约0.1-500、0.5-500、1-500、5-500、10-500、50-500、100-500ng/ml，或约0.1-100、0.5-100、1-100、5-100、10-100、50-100ng/ml，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、10-50ng/ml，或约0.1-40、0.5-40、1-40、5-40、10-40ng/ml，或约0.1-30、0.5-30、1-30、5-30、10-30ng/ml，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5-20、10-20ng/ml，或约0.1-10、0.5-10、1-10、5-10ng/ml，或约0.1-5、0.5-5、1-5ng/ml，或约0.1-1或0.5-1ng/ml。在具体实施例中，HGF为人类或小鼠HGF蛋白，例如重组人类或小鼠HGF蛋白。
在某些实施例中，IGF的浓度范围为约0.1-1000或1-100ng/ml，或约0.1-1000、0.5-1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000ng/ml，或约0.1-500、0.5-500、1-500、5-500、10-500、50-500、100-500ng/ml，或约0.1-100、0.5-100、1-100、5-100、10-100、50-100ng/ml，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、10-50ng/ml，或约0.1-40、0.5-40、1-40、5-40、10-40ng/ml，或约0.1-30、0.5-30、1-30、5-30、10-30ng/ml，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5-20、10-20ng/ml，或约0.1-10、0.5-10、1-10、5-10ng/ml，或约0.1-5、0.5-5、1-5ng/ml，或约0.1-1或0.5-1ng/ml。在具体实施例中，IGF为人类或小鼠IGF蛋白，例如重组人类或小鼠IGF蛋白。
在某些实施例中，VEGF的浓度范围为约0.1-1000或1-100ng/ml，或约0.1-1000、0.5-1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000ng/ml，或约0.1-500、0.5-500、1-500、5-500、10-500、50-500、100-500ng/ml，或约0.1-100、0.5-100、1-100、5-100、10-100、50-100ng/ml，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、10-50ng/ml，或约0.1-40、0.5-40、1-40、5-40、10-40ng/ml，或约0.1-30、0.5-30、1-30、5-30、10-30ng/ml，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5-20、10-20ng/ml，或约0.1-10、0.5-10、1-10、5-10ng/ml，或约0.1-5、0.5-5、1-5ng/ml，或约0.1-1或0.5-1ng/ml。在具体实施例中，VEGF为人类或小鼠VEGF蛋白，例如重组人类或小鼠VEGF蛋白。
在某些实施例中，PDGF的浓度范围为约0.1-1000或1-100ng/ml，或约0.1-1000、0.5-1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000ng/ml，或约0.1-500、0.5-500、1-500、5-500、10-500、50-500、100-500ng/ml，或约0.1-100、0.5-100、1-100、5-100、10-100、50-100ng/ml，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、10-50ng/ml，或约0.1-40、0.5-40、1-40、5-40、10-40ng/ml，或约0.1-30、0.5-30、1-30、5-30、10-30ng/ml，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5-20、10-20ng/ml，或约0.1-10、0.5-10、1-10、5-10ng/ml，或约0.1-5、0.5-5、1-5ng/ml，或约0.1-1或0.5-1ng/ml。在具体实施例中，PDGF为人类或小鼠PDGF蛋白，例如重组人类或小鼠PDGF蛋白。
在某些实施例中，任选地相对于50X或100X原料，N2的浓度处于约0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10X，或范围为约.01-10X或0.1-10X，或约0.1-10、0.2-10、0.3-10、0.4-10、0.5-10、0.6-10、0.7-10、0.8-10、0.9-10、1-10、2-10、5-10X，或约0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、0.5-5、0.6-5、0.7-5、0.8-5、0.9-5、1-5、2-5X，或约0.1-4、0.2-4、0.3-4、0.4-4、0.5-4、0.6-4、0.7-4、0.8-4、0.9-4、1-4、2-4X，或约0.1-3、0.2-3、0.3-3、0.4-3、0.5-3、0.6-3、0.7-3、0.8-3、0.9-3、1-3、2-3X，或约0.1-2、0.2-2、0.3-2、0.4-2、0.5-2、0.6-2、0.7-2、0.8-2、0.9-2、1-2X。N2补充剂(100X)可商购自例如赛默飞世尔科学公司和干细胞技术公司(Stemcell Technologies)。
在某些实施例中，任选地相对于50X或100X原料，B27的浓度为约0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10X，或范围为约.01-10X或0.1-10X，或约0.1-10、0.2-10、0.3-10、0.4-10、0.5-10、0.6-10、0.7-10、0.8-10、0.9-10、1-10、2-10、5-10X，或约0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、0.5-5、0.6-5、0.7-5、0.8-5、0.9-5、1-5、2-5X，或约0.1-4、0.2-4、0.3-4、0.4-4、0.5-4、0.6-4、0.7-4、0.8-4、0.9-4、1-4、2-4X，或约0.1-3、0.2-3、0.3-3、0.4-3、0.5-3、0.6-3、0.7-3、0.8-3、0.9-3、1-3、2-3X，或约0.1-2、0.2-2、0.3-2、0.4-2、0.5-2、0.6-2、0.7-2、0.8-2、0.9-2、1-2X。补充剂(50X)可商购自例如赛默飞世尔科学公司。
在某些实施例中，PGE-2的浓度为约或范围为约0.1-1000、0.5-1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000nM，或约0.1-500、0.5-500、1-500、5-500、10-500、50-500、100-500nM，或约0.1-100、0.5-100、1-100、5-100、10-100、50-100nM，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、10-50nM，或约0.1-40、0.5-40、1-40、5-40、10-40nM，或约0.1-30、0.5-30、1-30、5-30、10-30nM，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5-20、10-20nM，或约0.1-10、0.5-10、1-10、5-10nM，或约0.1-5、0.5-5、1-5nM，或约0.1-1或0.5-1nM。
在某些实施例中，N-乙酰基-L-半胱氨酸的浓度范围为约0.1-100或0.1-10或0.5-10mM，或约0.1-100、0.2-100、0.3-100、0.4-100、0.5-100、0.6-100、0.7-100、0.8-100、0.9-100、1-100、2-100、3-100、4-100、5-100、10-100、50-100mM，或约0.1-50、0.2-50、0.3-50、0.4-50、0.5-50、0.6-50、0.7-50、0.8-50、0.9-50、1-50、2-50、3-50、4-50、5-50、10-50mM，或约0.1-10、0.2-10、0.3-10、0.4-10、0.5-10、0.6-10、0.7-10、0.8-10、0.9-10、1-10、2-10、3-10、4-10、5-10mM，或约0.1-5、0.2-5、0.3-5、0.4-5、0.5-5、0.6-5、0.7-5、0.8-5、0.9-5、1-5、2-5、3-5、4-5mM，或约0.1-2、0.2-2、0.3-2、0.4-2、0.5-2、0.6-2、0.7-2、0.8-2、0.9-2、1-2mM。
在具体实施例中，悬浮液培养基包含烟碱酰胺、头蛋白、R-反应素-1、Y27632、EGF、HGF、IGF、VEGF、PDGF、N2、B27、PGE2、N-乙酰基-L-半胱氨酸、FGF10和VO-OHpic。
在某些实施例中，培养基悬浮液不包括或以其他方式不包含胞外基质(ECM)组分。仅以说明方式，培养基悬浮液不包含胶原蛋白、基质胶、层粘连蛋白和/或纤维结合蛋白。
在一些实施例中，肿瘤细胞簇来自获得的人类患者，例如直接来源于人类患者的原代肿瘤细胞。在某些实施例中，肿瘤细胞簇自异种移植有肿瘤细胞的免疫缺陷动物中分离，即，肿瘤细胞为源自患者的异种移植物(PDX)。直接自患者中或间接经由PDX分离的肿瘤细胞簇的具体实例包括肺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞和乳癌细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞簇直接自从人类患者去除的肿瘤样品中分离，所述肿瘤样品的实例包括手术样品、活检体、肋膜积液和腹水。肿瘤细胞可从患者直接获得，或从医生或例如在患者的医疗保健和癌症医治中起作用的其它医疗保健提供者获得。
还包括使人类肿瘤细胞增殖的方法，包含从样品(例如，如本文所描述的)中获得人类肿瘤细胞簇的群体，和在如本文所描述的培养基悬浮液中培养人类肿瘤细胞簇的群体。在一些实施例中，人类肿瘤细胞簇在培养基悬浮液中培养持续约14天或更少，或持续约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天或更少，或持续约5-14、6-14、7-14、8-14、9-14、10-14、11-14、12-14或13-14天或更少，或持续约5-13、6-13、7-13、8-13、9-13、10-13、11-13或12-13天或更少，或持续约5-12、6-12、7-12、8-12、9-12、10-12或11-12天或更少，或持续约5-11、6-11、7-11、8-11、9-11或10-11天或更少，或约5-10、6-10、7-10、8-10或9-10天或更少，或持续约5-9、6-9、7-9或8-9天或更少，或持续约5-8、6-8或7-8天或更少，或持续约5-7或6-7天或更少。
在一些实施例中，方法在约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内提供肿瘤细胞簇的约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％增殖(包括之间的全部组合、整数和范围)。举例来说，任选地在培养的约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内，或在约5-14、6-14、7-14、8-14、9-14、10-14、11-14、12-14或13-14天内，或在约5-13、6-13、7-13、8-13、9-13、10-13、11-13或12-13天内，或在约5-12、6-12、7-12、8-12、9-12、10-12或11-12天内，或在约5-11、6-11、7-11、8-11、9-11或10-11天内，或在约5-10、6-10、7-10、8-10或9-10天内，或在约5-9、6-9、7-9或8-9天内，或在约5-8、6-8或7-8天内，或在约5-7或6-7天内，或在约5-6天内，某些方法提供肿瘤细胞簇的约或至少约10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55、10-60、10-65、10-70、10-75、10-80、10-85、10-90、10-95或10-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-45、15-50、15-55、15-60、15-65、15-70、15-75、15-80、15-85、15-90、15-95或15-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约20-25、20-30、20-35、20-40、20-45、20-50、20-55、20-60、20-65、20-70、20-75、20-80、20-85、20-90、20-95或20-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约25-30、25-35、25-40、25-45、25-50、25-55、25-60、25-65、25-70、25-75、25-80、25-85、25-90、25-95或25-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约30-35、30-40、30-45、30-50、30-55、30-60、30-65、30-70、30-75、30-80、30-85、30-90、30-95或30-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约35-40、35-45、35-50、35-55、35-60、35-65、35-70、35-75、35-80、35-85、35-90、35-95或35-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约40-45、40-50、40-55、40-60、40-65、40-70、40-75、40-80、40-85、40-90、40-95或40-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约45-50、45-55、45-60、45-65、45-70、45-75、45-80、45-85、45-90、45-95或45-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约50-55、50-60、50-65、50-70、50-75、50-80、50-85、50-90、50-95或50-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约55-60、55-65、55-70、55-75、55-80、55-85、55-90、55-95或55-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约60-65、60-70、60-75、60-80、60-85、60-90、60-95或60-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约65-70、65-75、65-80、65-85、65-90、65-95或65-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约70-80、70-85、70-90、70-95或70-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约75-80、75-85、75-90、75-95或75-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约80-85、80-90、80-95或80-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约85-90、85-95或85-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约90-95或90-100％增殖，或肿瘤细胞簇的约或至少约95-100％增殖，包括其全部组合。特定方法在约7天内提供肿瘤细胞簇的至少约20-30％增殖，或在约7天内提供肿瘤细胞簇的至少约60％增殖。
如上所述，本文所描述的悬浮液培养基和方法可尤其用于评估患者肿瘤对一种或多种治疗剂的潜在反应性，并且提供在相对较短时间范围内(例如在小于一或两周内)鉴别用于患者的最佳医治方案的优点。因此，某些实施例包括测试人类患者对治疗剂(例如，药物或候选药物)的反应性的方法，包含从人类患者中获得肿瘤细胞簇的群体；在如根据前述权利要求中任一项所述的培养基悬浮液中培养肿瘤细胞簇的群体；将治疗剂或药物施用到培养基悬浮液；和测量在肿瘤细胞的群体中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡。
在一些实施例中，肿瘤细胞增殖的降低(例如，统计学上显著降低)指示人类患者(即，在人类患者体内的肿瘤)对治疗剂的反应性，并且在一些实施例中，缺乏肿瘤细胞增殖的降低(例如，缺乏统计学上显著降低)指示人类患者(即，在人类患者体内的肿瘤)对治疗剂的抗性和可能的无反应性。在一些实施例中，肿瘤细胞凋亡的诱导(例如，统计学上显著增加)指示人类患者(即，在人类患者体内的肿瘤)对治疗剂的反应性。在具体实施例中，缺乏肿瘤细胞增殖的增加(例如，缺乏统计学上显著增加)指示人类患者(即，在人类患者体内的肿瘤)对治疗剂的抗性和可能的无反应性。在某些实施例中，肿瘤细胞增殖的降低和/或肿瘤细胞凋亡的诱导指示人类患者对治疗剂的反应性，并且缺乏肿瘤细胞增殖的降低指示人类患者对治疗剂的抗性或可能的无反应性。
在一些实施例中，测试反应性的方法包括在与在培养基悬浮液中培养肿瘤细胞簇的群体的同一天(例如，在相同时间或大体上相同时间时)施用治疗剂。某些实施例包括在培养基悬浮液中培养肿瘤细胞簇的群体的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时内施用治疗剂。还包括于在培养基悬浮液中培养肿瘤细胞簇的群体之后的约或在约1、2、3、4、5、6或7天内施用治疗剂的方法，包括于在培养基悬浮液中培养肿瘤细胞簇的群体之后的约或在约1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或2-7、2-6、2-5、2-4、2-3或3-7、3-6、3-5、3-4或4-7、4-6、4-5或5-7、5-6或6-7天内施用治疗剂的方法。
某些实施例包括在施用治疗剂的约14天内(例如在施用治疗剂的约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内)测量在肿瘤细胞的群体中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡的步骤。特定实施例包括以下步骤：在施用治疗剂的约5-14、6-14、7-14、8-14、9-14、10-14、11-14、12-14或13-14天内，或在约5-13、6-13、7-13、8-13、9-13、10-13、11-13或12-13天内，或在约5-12、6-12、7-12、8-12、9-12、10-12或11-12天内，或在约5-11、6-11、7-11、8-11、9-11或10-11天内，或在约5-10、6-10、7-10、8-10或9-10天内，或在约5-9、6-9、7-9或8-9天内，或在约5-8、6-8或7-8天内，或在约5-7或6-7天内，或在约5-6天内，测量在肿瘤细胞的群体中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡。
在某些实施例中，用于测试的治疗剂或药物为小分子。示例性小分子包括细胞毒性剂、化疗剂和抗血管生成剂，例如已经被考虑可用于医治各种癌症的那些。小分子的具体类别包括(但不限于)、烷化剂、抗代谢物、蒽环霉素(anthracyclines)、抗肿瘤抗生素、铂、I型拓扑异构酶抑制剂、II型拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱(vinca alkaloids)和紫杉烷(taxanes)。
小分子的具体实例包括苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、西仑吉肽(cilengitide)、洛莫司汀(l0mustine)(CCNU)、美法仑(melphalan)、丙卡巴肼(procarbazine)、噻替派(thiotepa)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、恩扎妥林(enzastaurin)、白消安(busulfan)、道诺霉素(daunorubicin)、小红莓(doxorubicin)、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)艾达霉素(idarubicin)、替莫唑胺(temozolomide)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博莱霉素(bleomycin)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂、喜树碱(camptothecins)、伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊甙(teniposide)、坦罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、CT52923和太平洋紫杉醇(paclitaxel)，和以上中的任一者的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。小分子的其它实例包括伊马替尼(imatinib)、克卓替尼、达沙替尼(dasatinib)、索拉非尼、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、凡塔蓝尼(vatalanib)、吉非替尼、埃罗替尼、AEE-788、二氯醋酸酯、他莫昔芬(tamoxifen)、法舒地尔(fasudil)、SB-681323和司马沙尼(semaxanib)(SU5416)(参看Chico等人，《自然评论药物发现(Nat Rev Drug Discov.)》8：829-909，2009)。
小分子的另外的实例包括烷化剂如噻替派、环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥、胆固醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放射菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮杂丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素(dactinomycin)、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、小红莓、表柔比星、依索比星、艾达霉素、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zombicin)；抗代谢物如甲胺喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如迪诺特宁(denopterin)、甲胺喋呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉宾(fludarabine)、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素如二甲睾酮、甲雄烷醇酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；胺基乙酰丙酸；安吖啶；倍思塔布(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；艾达曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙碱(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利铵醋酸盐(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(1entinan)；氯尼达明(lonidamine)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；喷司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐糖(sizofiran)；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙基胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolact0l)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；类紫杉醇，例如，太平洋紫杉醇(新泽西州普林斯顿的百时美施贵宝肿瘤学公司(Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，N.J.))和多西他赛(docetaxel)(法国安东尼的罗纳普朗克公司(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France))；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲胺喋呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺维本(navelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊甙；道诺霉素；氨基喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物如TargretinTM(贝瑟罗汀(bexarotene))，PanretinTM(亚利崔托宁(alitretinoin))；ONTAKTM(地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；和以上中的任一者的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。
还包括用以调节或抑制激素对癌症的作用的抗激素剂，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(法乐通(Fareston))；和抗雄激素，如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(1euprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和以上中的任一者的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施例中，治疗剂为抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段或其它多肽特异性结合到癌症相关的抗原，或癌症抗原，例如由测试的肿瘤细胞簇表达的癌症抗原。示例性癌症抗原包括细胞表面蛋白，如细胞表面受体。还作为癌症相关的抗原包括的是，结合到这类细胞表面蛋白或受体的配体。在具体实施例中，抗体或抗原结合片段特异性结合到细胞内癌症抗原。在一些实施例中，与癌症抗原相关的癌症为以下中的一种或多种：乳癌、转移性脑癌、前列腺癌、胃肠癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、鳞状细胞癌、CNS或脑癌、黑色素瘤、非黑色素瘤癌症、甲状腺癌、子宫内膜癌、上皮细胞肿瘤、骨癌或造血癌。
在具体实施例中，抗体或抗原结合片段或其它多肽特异性结合到至少一个癌症相关的抗原，或癌症抗原，如人类Her2/neu、Herl/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、α-胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40扁平细胞瘤抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白二硫键异构酶(PDI)、再生肝磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、路易斯-Y抗原、GD2(在神经外胚层源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖-3(GPC3)和/或间皮素。
在某些实施例中，抗体为治疗抗体，如抗癌治疗抗体，包括抗体如3F8、8H9、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿达木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠(afutuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、培化阿珠单抗(alacizumab(pegol))、阿玛西单抗(amatuximab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、巴韦西布(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、莫-比伐珠单抗(bivatuzumab(mertansine))、贝伦妥单抗维多汀(brentuximab vedotin)、莫-坎妥珠单抗(cantuzumab(mertansine))、拉坎妥珠单抗(cantuzumab(ravtansine))、卡罗单抗喷地肽(capromab(pendetide))、卡托莫西单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、泊西他珠单抗(citatuzumab(bogatox))、西妥木单抗(cixutumumab)、昔瓦土单抗(clivatuzumab(tetraxetan))、康纳木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛图单抗(dalotuzumab)、地莫单抗(detumomab)、德罗兹妥单抗(drozitumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依决洛单抗(edrecolomab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、埃文单抗(enavatuzumab)、恩司昔单抗(ensituximab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、伐吐珠单抗(farletuzumab)、FBTA05、非吉单抗(figitumumab)、弗兰托单抗(flanvotumab)、加利昔单抗(galiximab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、加尼图单抗(ganitumab)、吉妥单抗(奥唑米星)(gemtuzumab(ozogamicin))、吉瑞昔单抗(girentuximab)、格雷巴土木单抗维多汀(glembatumumab(vedotin))、替坦异贝莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依库克单抗(icrucumab)、伊戈伏单抗(igovomab)、拉-英达西单抗(indatuximab ravtansine)、英妥木单抗(intetumumab)、伊珠单抗奥唑米星(inotuzumab ozogamicin)、伊派利单抗(ipilimumab)(MDX-101)、伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、来沙木单抗(1exatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、莫-洛沃珠单抗(lorvotuzumab(mertansine))、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、玛帕单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、莫昔土莫单抗(moxetumomab(pasudotox))、他那可单抗(nacolomab(tafenatox))、他那莫单抗(naptumomab(estafenatox))、纳瑞特单抗(narnatumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、纳武单抗(nivolumab)、(有或没有放射性碘)、NR-LU-10、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥那组单抗(onartuzumab)、莫奥珠单抗(oportuzumab(monatox))、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕图单抗(patritumab)、派图单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、普托木单抗(pritumumab)、雷库图单抗(racotumomab)、雷德图单抗(radretumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、里乐木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗妥木单抗(robatumumab)、沙玛立珠单抗(samalizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、思图昔单抗(siltuximab)、嗒巴单抗(tabalumab)、帕他普莫单抗(taplitumomab(paptox))、替妥莫单抗(tenatumomab)、替普罗木单抗(teprotumumab)、TGN1412、替西木单抗(ticilimumab)、曲美单抗(tremelimumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、TNX-650、托西莫单抗(tositumomab)、TRBS07、曲妥珠单抗(trastuzumab)、西莫白介素单抗(tucotuzumab(celmoleukin))、乌布里图昔单抗(ublituximab)、乌瑞鲁单抗(urelumab)、维托珠单抗(veltuzumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥莫单抗(votumumab)和扎芦木单抗(zalutumumab)。还包括这些抗体的片段、变异体和衍生物。
某些实施例包括测试两种或更多种治疗剂的组合的反应性。因此，某些方法包括将两种或更多种治疗剂施用到培养基悬浮液，包括前述示例性治疗剂中的任两种或更多种的组合。
本领域中已知的任何多种方法可用于测量肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡。举例来说，某些测量肿瘤细胞增殖的方法包括测量一种或多种细胞增殖标志物。示例性细胞增殖标志物包括3H-胸苷、溴脱氧尿苷(BrdU)、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(Edu)、Ki-67和增殖细胞核抗原(PCNA)。因此，在某些实施例中，测量肿瘤细胞增殖的步骤包含测量细胞增殖标志物，其任选地选自3H-胸苷、BrdU、Edu、Ki-67和PCNA(包括其组合)中的一种或多种。
同样，本领域中已知的任何多种方法可用于测量肿瘤细胞凋亡。“凋亡”通常是指在多细胞生物体中发生的渐进式细胞死亡过程，包括导致特征细胞改变(例如，形态)和细胞死亡的生物化学事件。示例性改变包括起泡、细胞收缩、核断裂、染色质凝聚、染色体DNA断裂和全局mRNA衰减。某些测量肿瘤细胞凋亡的方法包括测量细胞凋亡标志物。示例性细胞凋亡标志物包括荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)、半胱天冬酶活化、聚ADP核糖聚合酶(PARP)裂解、DRAQ5、DRAQ7和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP缺口末端标记(TUNEL)试验。因此，在某些实施例中，测量肿瘤细胞凋亡的步骤包含测量细胞凋亡标志物，其任选地选自FLICA、PARP、DRAQ5、DRAQ7和TUNEL试验(包括其组合)中的一种或多种。
在某些方面中，这些反应性测试或方法在诊断实验室中执行，并且然后将结果提供给患者，或医生或在患者的医疗保健和癌症医治中起作用的其它医疗保健提供者。因此，具体实施例包括用于将肿瘤细胞簇反应性测试的结果提供给患者，或医生或者其它医疗保健提供者的方法。这些结果或数据可呈硬拷贝或纸质拷贝的形式，或电子形式，如计算机可读媒体。
实例
实例1
肿瘤细胞簇的分离和分析
在获得患者共识之后，来自结肠直肠癌患者的手术样本获自北京肿瘤医院(Beijing Tumor Hospital)。源自患者的异种移植物肿瘤样本获自接种有来自患者的手术肿瘤样本的Nod/SCID小鼠。
简单来说，小心地从肿瘤样本中去除非肿瘤组织和坏死部分。使用剪刀将肿瘤组织切成直径小于1mm的小碎片。剁碎的肿瘤部分转移到装载有磁性搅拌棒的无菌100ml三角玻璃烧瓶中。含有0.25U/ml释放酶DH的10-15ml分解培养基添加到剁碎的肿瘤组织中以开始酶分解。在适度搅拌下，酶混合物在37℃下培育1-2小时。部分消化的肿瘤细胞簇通过100μm细胞保持器过滤。滤液通过40μm细胞限制器再过滤。将保持在40μm细胞限制器上的肿瘤细胞簇收集，用HBSS洗涤两次，然后再悬浮于补充有细胞生长因子和小分子抑制剂的成分确定的生长培养基中。
对于离体药物敏感性试验，将肿瘤细胞簇在成分确定的生长培养基中回收，过夜。成分确定的生长培养基为具有烟碱酰胺、Wnt3A、头蛋白、R-反应素-1和Y27632的StemProhESC SFM补充剂。然后，将肿瘤细胞簇暴露于药物(例如，在2μM(C最大)下的多西他赛)持续24小时，随后将所述药物洗掉。在暴露于药物之后，肿瘤细胞簇用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(Edu)标记以评定肿瘤细胞增殖速率。在药物暴露之后的48小时标记开始并且持续96小时。在对照组中，肿瘤细胞簇在培养基改变的情况下不接收药物暴露，但是类似地用Edu标记。标记的肿瘤细胞簇解离成单一细胞并且固定。在4℃下，固定的细胞用含有0.2％Triton X-100的Hoechst 33342的PBS溶液染色，过夜。通过Click-iT反应来检测掺入的Edu，其中固定的细胞用含有1X Click-iT Edu反应缓冲液、CuSO4和叠氮化合物-共轭的Alexa Fluor染料的反应混合物在暗处培育。将染色的细胞用PBS洗涤，随后分布到黑色壁板中，用于图像采集和分析。
对于图像采集和分析，染色的肿瘤细胞通过高内涵筛选(HCS)平台(ThermoScientific Cellomics ArrayScan XTi HCS读取器)来成像。10X物镜用于采集图像。对每个孔成像二十五个视野，并且捕获多于3000个细胞用于分析。通过图像，由HCS读取器获得二个荧光信号。蓝色荧光信号记录用Hoechst 33342染色的核信号，并且绿色荧光信号检测在新合成DNA中掺入的Edu。Edu阳性亚群细胞百分比被计算为总细胞计数的百分比。在此离体试验中的抗药性截止点定义为在肿瘤细胞簇暴露于2μM多西他赛24小时时小于90％的Edu掺入抑制。
对于直接患者样品，图1A-1D示出，肿瘤细胞簇成功地自以手术方式从患者去除的结肠/直肠肿瘤中分离，并且在成分确定的生长培养基中悬浮培养。图2示出在短期悬浮培养时段期间肿瘤细胞增殖，如根据Edu掺入所测量(样品1来自图1A，样品2来自图1B，样品3来自图1C，并且样品4来自图1D)。
图3A-3B示出短期悬浮培养物(在约7天内)显示用于肿瘤细胞簇的最高细胞增殖标志物。图3A示出用于四个不同患者样品的增殖标志物，并且图3B示出用于一个示例性患者样品在一周过程内的增殖标志物。
图4示出在这些测试条件(参看图3B)下，肿瘤细胞簇的生长不完全由测试药物(舒尼替尼、索拉非尼、埃罗替尼、克卓替尼、奥沙利铂)抑制，这与源自患者的异种移植物(PDX)肿瘤对这些药物的反应一致。确认，用成分确定的培养基悬浮培养时，PDX扩增的肿瘤具有与自患者肿瘤组织中分离的那些肿瘤类似的形态。

Claims (35)

1.一种培养基悬浮液，其包含来自人类患者的人类肿瘤细胞簇的群体，其中所述培养基悬浮液在约14天内提供所述肿瘤细胞簇的至少约10％增殖。
2.根据权利要求1所述的培养基悬浮液，所述培养基悬浮液在约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内提供所述人类肿瘤细胞簇的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％增殖。
3.根据权利要求1或2所述的培养基悬浮液，所述培养基悬浮液在约7天内提供所述人类肿瘤细胞簇的至少约20％至30％增殖。
4.根据前述权利要求中任一项所述的培养基悬浮液，所述培养基悬浮液在约7天内提供所述人类肿瘤细胞簇的至少约60％增殖。
5.根据前述权利要求中任一项所述的培养基悬浮液，其包含成分确定的培养基。
6.根据前述权利要求中任一项所述的培养基悬浮液，所述培养基悬浮液为无血清的。
7.根据权利要求5或6所述的培养基悬浮液，其包含选自DMEM/F-12、Wnt3A、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、胆固醇、B细胞活化因子(BAFF)和2-巯基乙醇中的一种或多种组分。
8.根据权利要求7所述的培养基悬浮液，其包含选自DMEM/F-12、Wnt3A、bFGF、胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、胆固醇、B细胞活化因子(BAFF)和2-巯基乙醇的组分中的2、3、4、5、6、7、8或9种。
9.根据权利要求8所述的培养基悬浮液，其包含DMEM/F-12、Wnt3A、bFGF、胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、胆固醇、B细胞活化因子(BAFF)和2-巯基乙醇。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的培养基悬浮液，其包含选自烟碱酰胺、头蛋白、R-反应素-1、Y27632、成纤维细胞生长因子10(FGF10)和VO-OHpic中的一种或多种组分。
11.根据权利要求10所述的培养基悬浮液，其包含选自烟碱酰胺、头蛋白、R-反应素-1、Y27632、FGF10和VO-OHpic的组分中的2、3、4、5或6种。
12.根据权利要求11所述的培养基悬浮液，其包含烟碱酰胺、头蛋白、R-反应素-1、Y27632、FGF10和VO-OHpic。
13.根据权利要求7至12中任一项所述的培养基悬浮液，其包含选自表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、N2补充剂、B27、前列腺素E2(PGE-2)和N-乙酰基-L-半胱氨酸中的一种或多种组分。
14.根据权利要求13所述的培养基悬浮液，其包含选自EGF、HGF、IGF、VEGF、PDGF、N2、B27、PGE2、N-乙酰基-L-半胱氨酸的组分中的2、3、4、5、6、7、8或9种。
15.根据权利要求14所述的培养基悬浮液，其包含EGF、HGF、IGF、VEGF、PDGF、N2、B27、PGE2和N-乙酰基-L-半胱氨酸。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的培养基悬浮液，其包含烟碱酰胺、头蛋白、R-反应素-1、Y27632、EGF、HGF、IGF、VEGF、PDGF、N2、B27、PGE2、N-乙酰基-L-半胱氨酸、FGF10和VO-OHpic。
17.根据前述权利要求中任一项所述的培养基悬浮液，所述培养基悬浮液不包含胞外基质组分，任选地基质胶、胶原蛋白、层粘连蛋白或纤维结合蛋白。
18.根据前述权利要求中任一项所述的培养基悬浮液，其中所述人类肿瘤细胞簇为来自人类患者的肺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞或乳癌细胞。
19.根据前述权利要求中任一项所述的培养基悬浮液，其中所述人类肿瘤细胞簇自异种移植有来自人类患者的人类肿瘤细胞和/或组织的免疫缺陷动物中分离。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的培养基悬浮液，其中所述人类肿瘤细胞簇直接自从人类患者去除的肿瘤样品中分离，所述肿瘤样品任选地选自手术样品、活检体、肋膜积液和腹水。
21.一种使人类肿瘤细胞增殖的方法，其包含从样品中获得人类肿瘤细胞的群体，和在根据前述权利要求中任一项所述的培养基悬浮液中培养所述人类肿瘤细胞簇的群体。
22.根据权利要求21所述的方法，其包含在所述培养基悬浮液中培养所述人类肿瘤细胞簇持续约14天或更少。
23.根据权利要求22所述的方法，其包含在所述培养基悬浮液中培养所述人类肿瘤细胞簇持续约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天或更少。
24.根据权利要求23所述的方法，其包含在所述培养基悬浮液中培养所述人类肿瘤细胞簇持续约7天或更少。
25.一种测试人类患者对治疗剂的反应性的方法，其包含
获得或接收来自所述人类患者的肿瘤细胞簇的群体；
在根据前述权利要求中任一项所述的培养基悬浮液中培养所述肿瘤细胞簇的群体；
将所述治疗剂施用到所述培养基悬浮液；和
测量在所述肿瘤细胞的群体中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡，
其中肿瘤细胞增殖的降低和/或肿瘤细胞凋亡的诱导指示所述人类患者对所述治疗剂的反应性，并且其中缺乏肿瘤细胞增殖的降低和/或肿瘤细胞凋亡的诱导指示所述人类患者对所述治疗剂的抗性。
26.根据权利要求25所述的方法，其包含在与在所述培养基悬浮液中培养所述肿瘤细胞簇的群体的同一天施用所述治疗剂。
27.根据权利要求25所述的方法，其包含于在所述培养基悬浮液中培养所述肿瘤细胞簇的群体之后的至少一天施用所述治疗剂。
28.根据权利要求27所述的方法，其包含于在所述培养基悬浮液中培养所述肿瘤细胞簇的群体之后的约或在约1、2、3、4、5、6或7天内施用所述治疗剂。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包含在施用所述治疗剂的约14天内测量在所述肿瘤细胞的群体中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡。
30.根据权利要求29所述的方法，其包含在施用所述治疗剂的约14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内测量在所述肿瘤细胞的群体中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡。
31.根据权利要求30所述的方法，其包含在施用所述治疗剂的约7、6或5天内测量在所述肿瘤细胞的群体中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测量肿瘤细胞增殖的步骤包含测量细胞增殖标志物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞增殖标志物选自3H-胸苷、溴脱氧尿苷(BrdU)、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(Edu)、Ki-67和增殖细胞核抗原(PCNA)中的一种或多种。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测量肿瘤细胞凋亡的步骤包含测量细胞凋亡标志物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述细胞凋亡标志物选自荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)、半胱天冬酶活化、聚ADP核糖聚合酶(PARP)裂解、DRAQ5、DRAQ7和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP缺口末端标记(TUNEL)试验中的一种或多种。
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