CN112920999B - 一种体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基、细胞生长因子和添加剂，该培养基可大量扩增高质量高纯度的循环肿瘤细胞。本发明还提供了乳腺癌循环肿瘤细胞的分离富集方法，所述乳腺癌患者的外周血通过CellSearch外周血循环肿瘤细胞检测仪系统分离、富集和计数CTC；或应用CD326(EpCAM)标记的免疫磁珠特异性捕获乳腺癌外周血中的CTC。该方法操作简单、成本低廉、普适性广，能够快速有效地实现乳腺癌循环肿瘤细胞的扩增培养。
Description
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，特别涉及一种体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指由实体肿瘤上脱落下来进入血液或者淋巴系统的肿瘤细胞。CTCs数量与癌症发展进程和转移密切相关。大量临床研究表明，对CTCs数量进行跟踪监控有助于癌症早期诊断，预后判断和药效评估。
经过大量的临床研究，研究人员在许多恶性肿瘤(乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌等)中都发现了CTCs的存在。目前，临床上对肿瘤的检测有以下几种常规方法：影像学诊断、内窥镜检查和病理学诊断，与传统检测方法相比，CTC检测有两个明显优势：(1)CTCs检测是非侵入式的，医生或者研究人员只需要从患者体内抽取少量的外周血(几毫升左右)，这一过程是无创/微创的，而且没有任何副作用，同一患者能够反复多次采集，不需要通过对患者采取手术或者穿刺等侵入性方式来获取组织标本。(2)目前临床可及的影像学等检测手段的灵敏度和精准度有一定的限制，而CTCs能更早期地发现肿瘤的动态变化情况，有助于对肿瘤患者进行实时个体化的预后判断、复发风险预警和转移情况监控等。
目前，对CTCs的研究主要集中在早期筛查、辅助肿瘤分期、预后评估、个体化治疗策略制定，疗效及耐药监测、复发和转移预警等方面。现市面上可及的CTC分离及富集相关试剂盒，其主要原理是利用人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒，采用密度梯度离心法，从全血样本中分离出外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)，再通过偶联了抗人CD45单克隆抗体的免疫磁珠去除肿瘤病人PBMC细胞中的CD45+细胞，从而富集病人外周血标本的CTCs。
然而，一般情况下，循环肿瘤细胞在外周血中存在的频数是10-6-10-7，而既往传统用于富集和检测外周血中的肿瘤细胞的方法是磁珠分选后再予免疫细胞化学或免疫荧光染色等确认，这些方法很难检测到频度低达10-6的肿瘤细胞，流式细胞仪的敏感度最高可以达到10-3-10-4，但检测低频细胞易混杂非特异性细胞，造成假阳性，且流式分选压力后细胞活力相对较差。另外，不同的乳腺癌患者中的CTC存在较大的个体差异，同一患者不同时期的检测或不同操作者的检测都可能对CTC的检测结果造成很大的差异。因此，传统富集CTC的方法，得到的纯度不够高，难以准确定量且可重复性差。这些均是富集CTC并进行进一步体外生物学特性研究的“瓶颈”。现有的方法是针对于从外周血中提取出CTC，而CTC在外周血中含量较低，提取出符合实验要求数量CTC往往需要抽取大量患者的血液，大大降低临床可实践性。因此，迫切需要合适的CTC体外培养增殖方法，以利于体外培养CTC，用于后续的药物筛选等各种相关研究。
发明内容
由于CTC的生长环境是脱离原发肿瘤细胞外基质悬浮生长，且CTC本身具有癌干细胞样的分子表型，由于癌干细胞具有在悬浮状态下进行自我更新的能力，因此我们同时借鉴了癌干细胞的生长条件和CTC的生长环境，在体外通过建立悬浮培养的体系模拟CTC的生长环境，将新鲜分离出的CTC种于超低吸附的悬浮培养板(公司：康宁，纽约，货号：3815)中使细胞无法贴壁，并且整个的培养过程中始终处于悬浮状态，其他的培养条件同乳腺癌干细胞样细胞的条件相似，具体为，细胞培养环境为37℃，5％CO2。进一步，在体外成功培养和扩增新鲜分离的CTC，为了检测原发部位肿瘤细胞(PT)和该方法获取的CTC是相同来源的细胞，发明人收集1例病人的PT和配对CTC标本，通过miRNA芯片对CTC及PT进行miRNA表达谱鉴定，结果如图2所示，发现表达量前100的miRNA在CTC和PT中的表达基本相似，提示分离的CTC来源于PT。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的培养基，所述培养包括基础培养基、细胞生长因子和添加剂；所述基础培养基为DMEM-F12培养基；所述添加剂为B27。
优选地，述B27(50×)的浓度为1ml/50ml。
优选地，所述细胞生长因子包括EGF和FGF。
优选地，所述细胞生长因子EGF的浓度为20ng/ml；FGF的浓度为20ng/ml。
优选地，所述培养基还包括胎牛血清；
优选地，所述培养基还包括双抗。
本发明还提供一种体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的方法，所述方法包括：利用所述的培养基体外悬浮培养乳腺癌循环肿瘤细胞CTC。
优选地，将分离富集的乳腺癌循环肿瘤细胞CTC接种于超低吸附的悬浮培养皿，每3天更换一半培养体积的本发明所述的培养基，在培养基开始形成深色中央区之前将其传代。
优选地，所述传代的具体步骤如下：将培养的乳腺癌循环肿瘤细胞CTC重力沉降，去掉部分上清，加入胰蛋白酶-EDTA溶液，室温反应2分钟，以生成单细胞悬液，离心，弃去上清液，将细胞悬于新鲜的本发明所述的培养基中，然后在新的超低吸附的悬浮培养皿上重新接种CTC细胞。
优选地，所述乳腺癌循环肿瘤CTC来源于乳腺癌患者的外周血，具体采用如下方法从乳腺癌患者的外周血获得腺癌循环肿瘤细胞CTC：
所述乳腺癌患者的外周血通过CellSearch外周血循环肿瘤细胞检测仪系统分离、富集和计数CTC；或应用CD326(EpCAM)标记的免疫磁珠特异性捕获乳腺癌外周血中的CTC。
本发明的有益效果：本发明的培养基可大量扩增高质量高纯度的循环肿瘤细胞。本发明还提供了乳腺癌循环肿瘤细胞体外培养方法，该方法采用超低吸附的悬浮培养皿，将获得的乳腺癌循环肿瘤细胞接种于该悬浮培养皿成功培养和扩增新鲜分离的CTC，用抗细胞角蛋白抗体(10g/ml,ab41825,Abcam)免疫荧光染色法测定上皮细胞纯度，其纯度在95％以上。上述方法操作简单、成本低廉、普适性广，能够快速有效地实现乳腺癌循环肿瘤细胞体外扩增培养。
附图说明
图1为本发明在使用体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的培养基，在37℃，5％CO2，使用超低吸附的悬浮培养皿(康宁，纽约)条件下，培养14天的CTC细胞增殖成瘤效果示意图。
图2为本发明原发肿瘤细胞与体外扩增的CTC的miRNA表达谱。通过miRNA芯片对CTC及PT进行miRNA表达谱鉴定，发现表达量前100的miRNA在CTC和PT中的表达基本相似，提示分离的CTC来源于PT。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1分离、富集乳腺癌循环肿瘤CTC
选取150名转移性乳腺癌患者(根据统计分析估算样本量)，在治疗前分离同一患者的CTC。本发明可使用以下几种方法中的任意一种进行分离富集乳腺癌循环肿瘤细胞CTC：
具体方法如下：
(1)采用CellSearch外周血循环肿瘤细胞检测仪分离、富集和计数CTC：取7.5ml人乳腺癌外周血与6.5mldilution buffer混合，室温离心，将制备好的样本与CTC检测试剂盒(CELLSEARCH，Menarini Silicon Biosystems，货号：7900003)在CellTracksAutoPrep上运行，样本收集结束后，自动转移到CellTracks Analyzer系统自动摄像，最后人工阅片，计数符合判断标准的CTC。通过CellTracksAutoPrep运行profile kit可在体外直接富集CTC，或；
(2)免疫磁珠法(MACS)富集CTC:应用CD326(EpCAM)标记的免疫磁珠捕获人乳腺癌患者外周血中的上皮细胞，利用autoMACSTM Pro自动分选仪进行CD45阴性分选和CD326阳性分选，二次分选后获得CTCs；
在体外成功培养和扩增新鲜分离的CTC，用抗细胞角蛋白抗体(10g/ml,ab41825,Abcam)免疫荧光染色法测定上皮细胞纯度，其纯度在95％以上。一个细胞要被鉴定为CTC，必须满足以下两个标准:(i)免疫细胞化学对肿瘤特异性标记物的阳性染色(细胞角蛋白)和(ii)细胞病理学家审查后的阳性评分。本发明人应用CellSearchTM System外周血循环肿瘤细胞检测仪，成功建立体外扩增CTC的生长模型，成功解决了样本量的问题，保证了实验的顺利进行。
CellSearchTM System是外周血循环肿瘤细胞检测仪，应用该系统只需7.5ml的血液样本，即可从400多亿的血细胞中检测到单一的CTC，它采用的是一种可同铁微粒相结合的抗体(铁磁流体)，这种标记了上皮特异性标记物CD326(EpCAM)抗体的铁磁流体，与外周血中的CTCs有极强的特异性结合能力，结合后应用强力磁体将这些CTCs从血液样本中提取，提取出的CTC可以在体外直接进行相关的分子实验或用于细胞培养，仪器还可继续进行化学染色(包括DAPI、Anti-CD45和CK)后体外自动成像，最终准确识别和准确定量外周血中的CTCs。与传统分选和定量CTCs的方法比较，CellSearchTM System更加标准化、自动化、定量准确、可重复性强。目前，美国FDA批准CellSearchTM System用于临床预测转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的无进展存活率和总存活率，并指导临床治疗。本发明人已有CellSearchTM System外周血循环肿瘤细胞检测仪设备，并且掌握了各种操作方法，在此基础上成功进行了预实验包括基因芯片和实时定量PCR的检测。
实施例2
本实施例提供一种体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的培养基以及体外培养方法，培养基具体配方为：DMEM-F12培养基500ml(Gibco)中添加20％血清，
EGF 20ng/ml(Life Technologies,Inc.),
FGF20ng/ml(Life Technologies,Inc.)，
B2710 ml(Life Technologies,Inc.)，
1x抗生素/抗真菌(Life Technologies,Inc.)。
乳腺癌循环肿瘤CTC细胞体外培养方法，具体培养步骤如下：
将细胞以1×104个细胞/ml的浓度接种于超低吸附的悬浮培养皿中。每3天添加一半培养体积的体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的培养基。
在培养基开始形成深色中央区之前将其传代。
具体传代步骤如下：
用移液管将细胞和培养基转移到15mL离心管。
使细胞在室温下重力沉降10分钟。吸出上清液，但在离心管中保留约200μl。注意不要吸出CTC细胞。
向残余的CTC培养基中加入1mL胰蛋白酶-EDTA溶液，室温反应2分钟。每30秒上下移液一次，使CTC细胞重悬于胰蛋白酶溶液中。
用1000μl移液管将CTC细胞上下移液10-20次，以生成单细胞悬液。正常吸出细胞悬液，但在排出细胞时，将吸管尖端在管底略微倾斜。产生的剪切力可促进任何残余细胞聚集体的分解。进行肉眼检查，确认无大细胞聚集体残留。
测定细胞数量和活力。以300×g离心细胞5分钟。弃去上清液，将细胞以1×106个细胞/ml的浓度重悬于新鲜的体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的培养基中。
在新的超低吸附的悬浮培养皿上以1×104个细胞/ml的浓度重新接种细胞。
细胞于37℃，5％CO2环境下培养。利用CTC细胞不易贴壁的特点采用超低吸附的悬浮培养皿(康宁，纽约)进行培养。培养14天结果，如图1所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (3)
1.一种体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：利用培养基体外悬浮培养乳腺癌循环肿瘤细胞，于37℃、5％CO2环境下培养；
所述利用培养基体外悬浮培养乳腺癌循环肿瘤细胞，于37℃、5％CO2环境下培养；包括:将分离富集的乳腺癌循环肿瘤细胞接种于超低吸附的悬浮培养皿，每3天更换一半培养体积的所述的培养基，在培养基开始形成深色中央区之前将其传代；
所述培养基由DMEM-F12培养基、1×B27、20％胎牛血清、20ng/mL EGF、20ng/mL FGF和1×双抗组成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传代的具体步骤如下：将培养的乳腺癌循环肿瘤细胞重力沉降，去掉部分上清，加入胰蛋白酶-EDTA溶液，室温反应2分钟，以生成单细胞悬液，离心，弃去上清液，将细胞悬于新鲜的所述的培养基中，然后在新的超低吸附的悬浮培养皿上重新接种乳腺癌循环肿瘤细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳腺癌循环肿瘤细胞来源于乳腺癌患者的外周血，具体采用如下方法从乳腺癌患者的外周血获得乳腺癌循环肿瘤细胞：
所述乳腺癌患者的外周血通过CellSearch外周血循环肿瘤细胞检测仪系统进行分离、富集和计数乳腺癌循环肿瘤细胞；或应用CD326标记的免疫磁珠特异性捕获乳腺癌外周血中的乳腺癌循环肿瘤细胞。
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