JP2013208104A - 消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地、及びそれを用いた消化器系がん幹細胞の増殖方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
【解決手段】神経生存因子−1に加えて、トランスフェリン、インスリン、プトレシン、プロゲステロン、上皮成長因子(EGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(Basic FGF)、及び白血病抑制因子(LIF)を添加してなる無血清培地に、消化器系がん細胞試料から単離した細胞を浮遊培養し、消化器系がん幹細胞の細胞塊(Sphere)を形成させ、該細胞塊を単離し、細胞接着分子をコーティングした培養器を用いて前記無血清培地中で接着培養し、漸次無血清培地の一部を、新しい無血清培地で置換して培養を継続することにより、消化器系がん幹細胞を三月以上にわたり増殖させる。
【選択図】なし
Description
1.材料
本発明の無血清培地として、以下の成分A、B、及びCからなるものを作製した。
1−1 無血清培地
(1)成分A
DMEM/F12(シグマ−アルドリッチ社製社製) 86mL
1M Hepes(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 900μl
Antibiotic/antimycotic liquid (100倍濃度) 900μl
30% グルコース 1.7ml
(2)成分B
DMEM/F12培地(シグマ−アルドリッチ社製) 8.6ml
30 % グルコース(シグマ−アルドリッチ社製) 200μl
トランスフェリン(シグマ−アルドリッチ社製) 10 mg+H2O 200μl
インスリン(シグマ−アルドリッチ社製) 2.5mg+0.1N HCl 100μl(先にインスリンを溶解)+H2O 900μl(溶解後に加える) 計1ml
プトレシン(Alexis Biochemicals社製)19.33mg
0.3mM 亜セレン酸ナトリウム(シグマ−アルドリッチ社製) 10μl
2mM プロゲステロン(シグマ−アルドリッチ社製) 1μl
(3)成分C
200μg/ml ヒトEGF(シグマ−アルドリッチ社製) 10μl
4μg/ml Basic FGF(和光純薬工業社製)500μl
1mg/ml ヘパリン(シグマ−アルドリッチ社製) 200μl
10μg/mlLIF(ケミコン社製) 100μl
NSF−1(50倍濃度)(カンブレックス社製) 2ml(最終濃度;2%[w/v])
60mg/mlN−アセチルシステイン(N-acetylcysteine)(シグマ−アルドリッチ社製) 100μl
0.01% Poly-L-ornithine溶液をシャーレに表面が覆われる程度入れて、約30分間、室温で置いておく。その後その溶液は吸引して除き、PBSで1回洗浄し、1%ラミニン/PBS溶液で1晩(15〜18時間)、37℃のインキュベーターで保存した後、かかる溶液を捨てて、クリーンベンチ内にて室温で乾燥させる。その後使用までは4℃で保存した。使用直前にPBSを用いて一度洗浄した。
本発明の無血清培地を用いて、膵臓がん細胞株から膵臓がん幹細胞を単離し、長期培養できるかどうかを解析した。上記実施例1で作製した無血清培地を用いて、インキュベーター(37℃、5% CO2)で膵臓がん細胞株(YPK1〜5)をがん細胞が死滅しがん幹細胞が生存できる条件下、すなわち浮遊条件下で約1〜2週間培養を行った。なお、コントロールとして10%ウシ胎児血清(FBS;fetal bovine serum)を含むDMEM(以下、単に血清含有培地という)や3種類の無血清培地(DMEM/F12[シグマ−アルドリッチ社製]、RPMI1640[日研生物医学研究所社製]、STK2 ヒト間葉系幹細胞用無血清倍地[DSファーマバイオメディカル社製])を用いた。その結果、本発明の無血清培地を用いると、YPK1〜5いずれの膵臓がん細胞株においても、膵臓がん幹細胞からなる細胞塊(Sphere)の形成が認められた。図1には、YPK2細胞株で形成された細胞塊の例を示す。他方、血清含有培地を用いた場合、膵臓がん細胞は接着し、細胞塊は形成されなかった。また、上記3種類の無血清培地を用いて形成された細胞塊は、本発明の無血清を用いた場合と比べ形成効率が悪く、また大きさも小さい上に、かかる細胞塊を形成する細胞は約1週間の培養後死滅し始めた。これらの結果は、市販品等の従来知られている無血清培地では、膵臓がん細胞株から膵臓がん幹細胞の単離はできないが、本発明の無血清培地を用いると、膵臓がん細胞株から膵臓がん幹細胞を単離できることを示している。
次に上記実施例2の方法で単離した膵臓がん幹細胞が、長期培養した場合に安定に増殖できるかどうかを解析した。上記実施例2に示される方法で細胞塊を含む無血清培地を分離し、ラミニンをコートした培養シャーレに移した後、同体積量の上記実施例1で作製した新鮮な無血清培地を添加した。シャーレの底に少しずつ、膵臓がん幹細胞が付着し増加するのを顕微鏡で確認しながら1週間に一度無血清培地を半分吸引・破棄し、同体積量の上記実施例1で作製した新鮮な無血清培地を添加する操作を繰り返し行い、接着培養したところ、少なくとも三月間増殖培養できることが明らかとなった。一方、上記実施例1で作製した新鮮な無血清培地を添加する操作を行わなかった場合は、2週間程度しか膵臓がん幹細胞を培養することができなく、また、本発明の無血清培地を上記実施例1で作製した新鮮な無血清培地にすべて置換した場合は、1週間程度しか膵臓がん幹細胞を培養することができなかった。これらの結果は、膵臓がん幹細胞などのがん幹細胞が産生するサイトカインががん幹細胞の細胞増殖をサポートすることを示唆している。
次に、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞について、がん幹細胞マーカー因子として知られている3種類の因子(CD24、CD44、及びESA)の蛋白質の発現レベルが亢進しているかどうかをフローサイトメトリーにより解析した。上記実施例2で示した方法によりYPK2細胞株を用いて膵臓がん幹細胞からなる細胞塊を単離した後、抗ヒトCD24抗体、抗ヒトCD44抗体及び抗ヒトESA抗体を用いて免疫蛍光染色法を行い、BD Biosciences社製のFACS Aria IIIを用いて解析を行った(図2)。なお、コントロールとして血清含有培地を用いて培養したYPK2細胞株を用いた。その結果、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞は、血清含有培地を用いて培養した膵臓がん細胞と比べ、CD24陰性及びCD44陰性細胞の細胞数が減少するとともに(図2の中央図、Q4領域[37.4%]vs.図2の左図、Q4領域[87.1%])、CD24陽性及び/又はCD44陽性細胞の細胞数は増加していることが明らかとなった(図2の中央図、Q1〜3領域[36.3+2.76+23.6≒62.7%]vs.図2の左図、Q1〜3領域[0.585+0.793+11.5≒12.9%])。さらに本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞のCD24陽性及びCD44陽性細胞(図2の中央図、Q2領域の細胞)におけるESAの発現量は、血清含有培地を用いて培養した膵臓がん細胞のCD24陰性及びCD44陰性細胞(図2の左図、Q4領域の細胞)おけるESAの発現量と比べ、高いことが明らかとなった(図2の右図)。これらの結果は、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞には、がん幹細胞マーカー因子であるCD24、CD44、又はESA陽性を示す細胞が多く含まれていることを示している。
次に、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞について、腫瘍形成能を解析した。上記実施例2で示した方法によりYPK2細胞株を用いて膵臓がん幹細胞からなる細胞塊を単離した後、1000個を超免疫不全マウス(NRGマウス)(ジャクソン研究所)へ皮下移植した。なお、コントロールとして血清含有培地を用いて培養したYPK2細胞株を用いた。その結果、コントロールでは腫瘍形成はされなかったのに対し、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞を用いた場合、腫瘍形成が確認された(図3)。この結果は、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞などのがん幹細胞は、がん幹細胞の機能の1つである腫瘍形成能を有することが明らかとなった。
従来の肝がん細胞株を用いたがん幹細胞の単離は、がん幹細胞がある程度含まれている、HuH−7等の高分化型肝がん由来の細胞株を用いて行われている。他方、SK−HEP−1等の低分化型肝がん由来の細胞株には、がん幹細胞がほとんど含まれていないため(<0.5%, Chen, X. et al., J Hepatol., 2011, 55: 838-845)、がん幹細胞を単離することは困難とされていた。そこで、本発明の無血清培地を用いてSK−HEP−1細胞株から肝がん幹細胞を単離できるかどうかを解析した。
がん幹細胞は、がん細胞と比較して、抗がん剤などの薬剤に対して高い耐性能を有することが知られている。そこで、本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞が高い抗がん剤耐性能を有するかどうかを解析した。実施例6で示した方法によりSK−HEP−1細胞株を用いて肝がん幹細胞からなる細胞塊を単離した後、1.0x103個の細胞を96ウェルプレートに播種し、3日後に抗がん剤(5−FU、CDDP、又はNaB)を添加した。抗がん剤添加から24時間後にMTS試薬(CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay、Promega社製)を添加し、さらに2時間後に490 nmでの吸光度を測定し、生存率を評価した。なお、コントロールとして血清含有培地を用いて培養したSK−HEP−1細胞株を用いた。その結果、上記3種類の抗がん剤(5−FU、CDDP、及びNaB)いずれを用いた場合においても、肝がん幹細胞からなる細胞塊は、コントロールのSK−HEP−1肝がん細胞よりも生存率が高かった(図5)この結果は、本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞は、がん幹細胞に特徴的な抗がん剤などの薬剤に対して高い耐性能を有することを示している。
次に、本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞について、がん幹細胞マーカー因子として知られている4種類の因子(3種類のABCトランスポーター[ABCB1、ABCC1、及びABCG2]とALDH1A1)のmRNAの発現レベルが亢進しているかどうかを定量PCRにより解析した。また、がん細胞が浸潤や転移するときに、上皮細胞から間葉系の細胞に形質転換する現象(EMT)が知られているが、かかるEMTに関与する因子(TGFβ1)の発現レベルについてもあわせて解析した。実施例2で示した方法でSK−HEP−1肝がん細胞由来の肝がん幹細胞からなる細胞塊を単離した後、TRIzol Reagent(Life Technologies社製)とPureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification Kit(Life Technologies社製)を用いて全RNAを精製し、さらにPrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa Bio社製)を用いてcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として、LightCycler 480 Probe Master(Roche社製)及びLightCycler480 System II(Roche社製)を用いて定量PCRを行った。なお、コントロールとして血清含有培地を用いて培養したSK−HEP−1肝がん細胞株由来のRNAを用いて解析を行った。その結果、肝がん幹細胞からなる細胞塊は、SK−HEP−1肝がん細胞と比べ、ABCB1、ABCC1、ABCG2、ALDH1A1、及びTGFβ1のmRNAの発現量が亢進していることが明らかとなった(ABCB1;5.7倍、ABCC1;1.8倍、ABCG2;5.0倍、ALDH1A1;4.6倍、TGFβ1;3.0倍)(図6)。さらに、がん幹細胞マーカー因子として知られている2種類の因子(PROM1及びNANOG)やEMTに関与する4種類の因子(FN1、VIM、TWIST2、及びSNAI3)についても同様に解析したところ、肝がん幹細胞からなる細胞塊は、SK−HEP−1肝がん細胞と比べ、かかる6種類の因子全てのmRNAの発現量が亢進していることが明らかとなった(PROM1;6.6倍、NANOG;5.0倍、FN1;2.8倍、VIM;2.3倍、TWIST2;2.2倍、SNAI3;3.1倍)(図7)。これらの結果は、本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞は、がん幹細胞に特徴的ながん幹細胞マーカー因子が高発現していることを示しているとともに、EMT関連因子の発現レベルについても亢進が認められたことから、がん幹細胞はEMTにより形成された可能性も示唆している。
Claims (9)
- 血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、神経生存因子−1(NSF−1)を添加してなることを特徴とする消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地。
- トランスフェリン、インスリン、プトレシン、プロゲステロン、上皮成長因子(EGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(Basic FGF)、及び白血病抑制因子(LIF)をさらに添加してなることを特徴とする、請求項1記載の無血清培地。
- 亜セレン酸又はその塩、ヘパリン、及びN−アセチルシステインをさらに添加してなることを特徴とする、請求項1又は2記載の無血清培地。
- 血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地が、グルコース添加DMEM/F12であることを請求項1〜3のいずれか記載の無血清培地。
- 以下の工程(a)及び(b)を備えたことを特徴とする消化器系がん幹細胞の増殖方法。
(a)消化器系がん細胞を、請求項1〜4のいずれか記載の無血清培地中で浮遊培養し、消化器系がん幹細胞の細胞塊(Sphere)を形成させる工程;
(b)前記細胞塊を単離し、単離した細胞塊を、細胞接着分子をコーティングした培養器を用いて前記無血清培地中で接着培養することにより、消化器系がん幹細胞を増殖させる工程; - 細胞接着分子が、ラミニンであることを特徴とする請求項5記載の増殖方法。
- 工程(b)の後に、無血清培地の一部を、新しい無血清培地で置換して培養を継続する工程(C)を備えたことを特徴とする請求項5又は6記載の増殖方法。
- 少なくとも一月以上増殖し続けたことを特徴とする消化器系がん幹細胞の集団。
- 少なくとも三月以上増殖し続けたことを特徴とする請求項8記載の消化器系がん幹細胞の集団。
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