CN107653228A - 一种胃癌干细胞培养基及胃癌干细胞分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种胃癌干细胞培养基，它由基础培养基及添加物组成，其中，基础培养基为DME/F12，添加物及在基础培养基中的添加量分别为：B27 50‑150倍稀释、ITS 100倍稀释、Glutamax 2mM、非必需氨基酸0.1mM、表皮生长因子20‑40ng/ml、碱性成纤维生长因子10‑20ng/ml、β巯基乙醇0.1mM、葡萄糖3mg/ml、丙酮酸钠1mM、碳酸氢钠1mg/ml、乙酰半胱氨酸1mM、肝素4ug/ml。本发明还提供了所述培养基的用途及一种胃癌干细胞分离培养方法，本发明提供的培养基及分离培养方法，可以从胃癌细胞系中有效分离培养出胃癌干细胞，为全面研究胃癌的发病机制及侵袭转移打下良好的理论基础。

Description

一种胃癌干细胞培养基及胃癌干细胞分离培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种胃癌干细胞培养基及胃癌干细胞分离培养方法。
背景技术
肿瘤干细胞(cancer stem cells)是肿瘤基础研究领域的热点和难点问题。现代研究认为，肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新特性和分化为不同肿瘤细胞能力的一种细胞，被认为参与了肿瘤的发生、维持和进展等诸多过程。人们最初在急性髓系白血病中获得了肿瘤干细胞存在的证据，随着研究不断扩展，人们发现肿瘤干细胞存在于多种实体肿瘤中，如胃癌、结肠癌、前列腺癌等。
存在于胃癌中的肿瘤干细胞即胃癌干细胞(胃癌肿瘤干细胞，gastric cancerstem cell，GCSC)，随着干细胞和肿瘤研究的深入，GCSC已成为胃癌基础研究的热点，近年来研究报道GCSC可从胃癌细胞株、原发胃癌组织及患者外周血中被分离，涉及的胃癌细胞株有胃癌细胞株SNU-5(见王佳佳等，人胃癌CD90+干细胞可能影响胃癌的转移和患者的预后，中国肿瘤生物治疗杂志，2013,20:230-236)和胃癌细胞系SGC7901(吴丽霞等，胃癌细胞的无血清悬浮培养与初步鉴定，世界华人消化杂志，2014，1531-1536)等。
为了全面分析探索胃癌的发生发展，有必要扩展GCSC的来源细胞系，从更多的胃癌细胞系中分离出GCSC。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种可有效分离培养胃癌干细胞的培养基及分离培养方法。
本发明提供了一种胃癌干细胞培养基，它由基础培养基及添加物组成，其中，基础培养基为DME/F12，添加物及在基础培养基中的添加量分别为：B27 50-150倍稀释、ITS 100倍稀释、Glutamax 2mM、非必需氨基酸0.1mM、表皮细胞生长因子20-40ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子10-20ng/ml、β巯基乙醇0.1mM、葡萄糖3mg/ml、丙酮酸钠1mM、碳酸氢钠1mg/ml、乙酰半胱氨酸1mM、肝素4ug/ml。
其中，添加物及在基础培养基中的添加量分别为：B27 50倍稀释、ITS 100倍稀释、Glutamax 2mM、非必需氨基酸0.1mM、表皮细胞生长因子20ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml、β巯基乙醇0.1mM、葡萄糖3mg/ml、丙酮酸钠1mM、碳酸氢钠1mg/ml、乙酰半胱氨酸1mM、肝素4ug/ml。
其中，添加物还包括青霉素-链霉素，终浓度分别为青霉素100units/ml，链霉素100ug/ml。
其中，所述非必需氨基酸购自美国Life Technologies公司。
本发明还提供了上述培养基在分离培养胃癌干细胞中的用途。
其中，所述分离胃癌干细胞使用的细胞系为胃癌细胞系MKN74。
本发明还提供了一种胃癌干细胞的分离培养方法，步骤如下：
取胃癌细胞系，在上述方法制备的培养基中培养，既得胃癌干细胞。
其中，所述胃癌细胞系为MKN74细胞系。
其中，所述培养的方法为：每2天加培养基1次，每6天换培养基，
和/或，所述培养的时间为10-14天。
本发明还提供了上述方法获得的胃癌干细胞。
申请人经过大量的实验研究，筛选出本发明胃癌干细胞培养基，可以有效地从胃癌细胞系MKN74中分离培养出胃癌干细胞。经体外和体内鉴定确实得到有效分离获得了胃癌干细胞亚群，为全面研究胃癌的发病机制及侵袭转移打下良好的理论基础。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1.MKN74在含10％Gemini胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，呈贴壁、多角形生长。
图2.胃癌细胞系MKN74经本发明胃癌干细胞培养基培养，可呈细胞球生长。
图3.胃癌细胞系MKN74形成的细胞球经消化、冻存、复苏后，仍可继续形成细胞球生长。
图4.胃癌细胞系MKN74细胞球第一代移植瘤(A，B)，HE染色证实移植瘤为肿瘤组织(C)。
图5.胃癌细胞系MKN74细胞球第一代移植瘤原代培养后，在胃癌肿瘤干细胞培养基条件下，细胞球细胞可继续传代成球。
图6.胃癌细胞系MKN74细胞球第二代移植瘤。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明的实验试剂与仪器如下：
1、试剂：
DMEM/F12培养基：购自Hyclone，SH30023.01，美国。
EGF：购自Peprotech，AF-100-15，美国。
b-FGF：购自Peprotech，AF-100-18B，美国。
ITS：购自Life Technologies，41400-045，美国。
B27：购自Life Technologies，12587-010，美国。
葡萄糖：购自Sigma Aldrich，G5146，美国
丙酮酸钠：购自Hyclone，SH30239.01，美国。
非必需氨基酸：购自Life Technologies，11140-050，美国。
碳酸氢钠：购自Life Technologies，25080-094，美国。
β-巯基乙醇：购自Life Technologies，21985-023，美国。
Glutamax：购自Life Technologies，35050-061，美国。
乙酰半胱氨酸：购自Sigma Aldrich，V900429，美国。
青霉素-链霉素抗生素：购自Hyclone，SV30010，美国。
肝素：购自Sigma Aldrich，H3149，美国。
2、仪器：
超净工作台：购自海尔集团，HR40-IIA2，中国。
二氧化碳培养箱：购自Thermo Forma，3111，日本。
实施例1本发明培养基的制备
以DME/F12为基础培养基，添加如下成分(表1)，配制成胃癌干细胞培养基，具体如下：
表1.胃癌肿瘤干细胞培养基配方
按表1中终浓度配制即可，其中葡萄糖和肝素采用0.22um滤过除菌。
实施例2本发明培养基用于分离胃癌干细胞
1、胃癌干细胞的分离及体外鉴定
胃癌细胞系MKN74在含10％Gemi n i胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，呈紧密贴壁、多角形生长(图1)。
取胃癌细胞系MKN74培养于实施例1制备的胃癌干细胞培养基中，每2天加培养基1次，每6天换培养基。待大量细胞逐渐死亡，剩余少量细胞逐渐呈球形生长，且可连续传代成球(体外鉴定标准)(图2)，2周左右可稳定得到细胞球。细胞球消化为单细胞冻存后，复苏仍可继续形成细胞球(图3)。符合胃癌干细胞特性。培养细胞球使用的培养基均为实施例1制备的无血清培养基。
2、胃癌干细胞的体内鉴定
将形成的MKN74细胞球消化为单细胞后接种(细胞量60万)第一批裸鼠皮下可形成第一代移植瘤(图4A，B)，经HE染色鉴定为肿瘤组织(图4C)。
将第一代移植瘤剪碎、消化，利用实施例1制备的胃癌干细胞培养基原代培养10-14天后，又可形成胃癌细胞球，且可连续传代成球(图5)。将其接种于第二批裸鼠皮下，细胞量60万(右上部位)、6万(右下部位)、6千(左上部位)，可形成第二代移植瘤(图6)。
至此，完成胃癌肿瘤干细胞的体内连续成瘤实验(体内鉴定标准)。
肿瘤干细胞在无血清培养的条件下，具有呈细胞球生长的特性。目前，根据美国肿瘤研究协会专题讨论会意见，肿瘤干细胞的鉴定的金标准是体内连续移植成瘤实验，次之为体外连续成球实验[Clarke MF,Dick JE,Dirks PB,et al.Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions:AACR Workshop on cancerstem cells.Cancer Res.2006；66(19):9339-9344]。
因此，本发明通过标准的体外和体内鉴定实验均表明：使用本发明胃癌干细胞培养基，可从胃癌细胞系MKN74中有效筛选、分离获得胃癌干细胞。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1 本发明培养基对不同胃癌细胞系的分离效果检测
利用实施例1制备的胃癌干细胞培养基，分别对KATO III、MKN7、IM95m、MKN45胃癌细胞系进行培养，培养方法同实施例2，结果：
对KATO III、MKN7、MKN45培养后均无法形成细胞球，
对IM95m培养可形成细胞球，但形成的细胞球不稳定，多次传代后维持细胞球的能力不佳。
可见，本发明培养基可以特异性从胃癌细胞系MKN74中培养得到胃癌干细胞。
异质性是恶性肿瘤的特征之一，它对肿瘤的药物治疗是一个极大的挑战。如果能够获得多种途径来源的胃癌干细胞，如原代胃癌组织、外周血、细胞系，通过研究方法寻找它们的共同点，如共同高表达或低表达某些基因，可能就能发现真正影响胃癌干细胞生物学特性的少数关键基因，促进肿瘤领域的学术研究及临床治疗。
本发明用来筛选的5种细胞系，其中，KATOIII、MKN45为低分化，MKN7为高分化，MKN74和IM95m为中分化，但IM95m细胞系高表达HGF基因，与本发明不同。
本发明培养基从胃癌细胞系MKN74中培养得到胃癌干细胞，为胃癌干细胞的研究提供了细胞学基础；另外，本发明培养基的特异性，进一步表明了MKN74细胞系与其它胃癌细胞系具有差异，利用其分离培养的胃癌干细胞，可有助于肿瘤干细胞及胃癌的研究。
综上，本发明培养基，可以有效地分离培养出胃癌干细胞，为全面研究胃癌的发病机制及侵袭转移打下良好的理论基础。

Claims (10)

1.一种胃癌干细胞培养基，其特征在于：它由基础培养基及添加物组成，其中，基础培养基为DME/F12，添加物及在基础培养基中的添加量分别为：B27 50-150倍稀释、ITS 100倍稀释、Glutamax 2mM、非必需氨基酸0.1mM、表皮细胞生长因子20-40ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子10-20ng/ml、β巯基乙醇0.1mM、葡萄糖3mg/ml、丙酮酸钠1mM、碳酸氢钠1mg/ml、乙酰半胱氨酸1mM、肝素4ug/ml。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：添加物及在基础培养基中的添加量分别为：B27 50倍稀释、ITS 100倍稀释、Glutamax 2mM、非必需氨基酸0.1mM、表皮细胞生长因子20ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml、β巯基乙醇0.1mM、葡萄糖3mg/ml、丙酮酸钠1mM、碳酸氢钠1mg/ml、乙酰半胱氨酸1mM、肝素4ug/ml。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：添加物还包括青霉素-链霉素，终浓度分别为青霉素100units/ml，链霉素100ug/ml。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的培养基，其特征在于：所述非必需氨基酸购自美国Life Technologies公司。
5.权利要求1-4任意一项所述的培养基在分离培养胃癌干细胞中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述分离胃癌干细胞使用的细胞系为胃癌细胞系MKN74。
7.一种胃癌干细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤如下：
取胃癌细胞系，在权利要求1-4任意一项方法制备的培养基中培养，既得胃癌干细胞。
8.根据权利要求7所述的分离培养方法，其特征在于：所述胃癌细胞系为MKN74细胞系。
9.根据权利要求7所述的分离培养方法，其特征在于：所述培养的方法为：每2天加培养基1次，每6天换培养基，
和/或，所述培养的时间为10-14天。
10.权利要求7-9任意一项方法获得的胃癌干细胞。
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