CN105274058A - 具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株，该细胞株的命名为大鼠肝癌细胞Wrh-f2，于2015年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？C2015174。本发明同时提供了该细胞株的制备方法及其在制备移植性肝癌模型中的应用。本发明为了获得转移率较高的细胞，采用了改良的大鼠肝癌诱导方法，然后取生长良好的肿瘤组织采用直接细胞单层培养法进行原代培养，以获得大鼠肝癌细胞，然后利用Transwell小室筛选出高转移潜能的细胞，并用以制备移植性大鼠肝癌模型，将十分有利于分析肝脏肿瘤转移机理。另外，我们采用克隆化培养纯化细胞，选取生长良好的高转移潜能细胞进行了保藏，并通过一系列实验证明所筛选的Wrh-f2细胞株为肝癌细胞株，其具有良好的成瘤特性。

Description

具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物癌细胞株及其制备技术，具体的说是一种具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株及其制备方法和应用。

背景技术

随着肝癌相关研究的不断发展，作为临床前体内研究的基础，肝癌动物模型的建立也在不断进步。诱发性肝癌模型因能较好地模仿人肝癌过程仍是现在肝癌研究中应用的最为广泛的动物模型。然而，诱发性肝癌动物模型具有周期长(2~5个月)、成本高、成功率低、不易同时得到病程和肿块大小相对均一的模型等缺点，其应用过程中收到一定限制。而以移植的方法制作肝癌模型具有动物饲养简单、移植方法简便、移植成功率高、肿瘤生长快、患鼠生存期短、肿瘤生物学特性稳定而均一等优点。另一方面，在肝癌的治疗方面，长期以来手术切除仍被公认为肝癌根治的最好手段。但肝癌的术后复发和转移又直接影响了手术疗效，肝癌的转移复发已成为进一步延长肝癌病人生存、改善预后的主要障碍。因此，如果能建立一种具有高转移率的肝癌移植模型，就能对肝癌的转移复发机理进行更深层次的探究。

发明内容

本发明的目的就是提供一种具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株，该细胞株可用于制备具有高转移率的移植性大鼠肝癌模型，为肝癌细胞转移机理的研究提供了更为优质的模型来源。另外，本发明还提供了该细胞株的制备方法及其在制备大鼠肝癌模型中的应用。

本发明所提供的一种具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株，其命名为大鼠肝癌细胞Wrh-f2，于2015年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2015174，保藏地址：中国湖北省武汉市武汉大学。

本发明所述具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株的制备方法，其包括以下步骤：

（1）、取雄性Wistar大鼠，第1天按100mg/kg腹腔注射一次DEN；从第2天起，以每7天为一个循环单位，先连续五天给予含100ppm的NMOR饮水，任其自由饮用，然后连续两天给予无菌水，任其自由饮用；

（2）、第20周末，无菌条件下取肝脏肿瘤组织，切成0.5-1.0mm³大小的组织块，采用单层细胞培养法将组织块加入24孔板中进行培养，48h后半数换液，此后每3d换一次液；本步骤中所用培养基为含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基；

培养的第5d，肝癌细胞从组织块中爬出，培养的第14d行第1次传代，培养的第24d行第2次传代；

（3）、将培养24d的肝癌细胞所用培养基更换为无血清培养基并继续培养24h，然后使用胰酶进行消化，按1×10⁵个细胞/小室接种到成胶Transwell小室内，然后将小室放入24孔板，加入含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，37℃、5%CO₂条件下培养24h后，取出小室，可见24孔板底有肝癌细胞生长；

所述成胶Transwell小室是将Matrigel和DMEM以体积比1∶4混合后加至Transwell小室内制成人工基质膜而得；

（4）、将步骤（3）中24孔板的板底肝癌细胞收集后，加含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基继续培养，待肝癌细胞长满，扩大培养至50mL培养瓶中；

（5）、取扩大培养的肝癌细胞，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基稀释至1个细胞/200μL，然后按200μL/孔加入96孔板进行克隆化培养，7d后取生长良好的单克隆细胞株，即为高转移潜能的大鼠肝癌细胞株。

另外，本发明还提供了所述具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株在制备移植性肝癌模型中的应用。

该应用的实现方案是：选择体重为120-130g的雄性Wistar大鼠，将Wrh-f2细胞株做成细胞泥，每只大鼠肝包膜下接种0.04ml，然后饲养2周，得移植性大鼠肝癌模型。

本发明为了获得转移率较高的细胞，采用了改良的大鼠肝癌诱导方法，然后取生长良好的肿瘤组织采用直接细胞单层培养法进行原代培养，以获得大鼠肝癌细胞，然后利用Transwell小室筛选出高转移潜能的细胞，并用以制备移植性大鼠肝癌模型，将有十分利于分析肝脏肿瘤转移机理。另外，我们采用克隆化培养纯化细胞，选取生长良好的高转移潜能细胞进行了保藏，并通过一系列实验证明所筛选的Wrh-f2细胞株为肝癌细胞株，其具有良好的成瘤特性。

附图说明

图1是采用单层细胞培养法所培养的肝癌细胞第14d时生长状况。

图2是采用Transwell小室筛选方法筛选得到的高转移潜能肝癌细胞。

图3是培养得到的高转移潜能单克隆肝癌细胞株。

图4是倒置相差显微镜观察高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞形态。

图4中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图5是透射电镜观察高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞形态。

图5中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图6是高、低转移潜能肝癌细胞株染色体形态分析染色结果。

图6中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图7是流式细胞仪检测高、低转移潜能肝癌细胞株细胞周期结果。

图7中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图8是高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞爬片HE染色结果。

图8中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图9是高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞爬片AFP蛋白免疫组化染色结果。

图9中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图10是高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞爬片CK7蛋白免疫组化染色结果。

图10中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图11是高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞爬片CK8蛋白免疫组化染色结果。

图11中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图12是高、低转移潜能肝癌细胞株的迁移实验结果。

图12中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图13是高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞克隆形成率实验结果。

图13中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图14是高、低转移潜能肝癌细胞株分别裸鼠腋下接种1周后肿瘤生长状况。

图14中箭头所指为肿瘤生长的位置，1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图15是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于裸鼠腋下接种1周后肿瘤HE染色结果。

图15中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图16是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于裸鼠肝包膜下接种细胞2周后肿瘤生长及转移状况。

图16中箭头所指为肿瘤生长的位置，1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图17是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于裸鼠肝包膜下接种细胞2周后肝脏肿瘤HE染色结果。

图17中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图18是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于裸鼠肝包膜下接种细胞2周后肺脏肿瘤HE染色结果。

图18中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图19是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于大鼠腋下接种2周后肿瘤生长状况。

图19中箭头所指为肿瘤生长的位置，1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图20是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于大鼠腋下接种2周后肿瘤HE染色结果。

图20中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图21是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于大鼠肝包膜下接种细胞2周后肿瘤生长及转移状况。

图21中箭头所指为肿瘤生长的位置，1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图22是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于大鼠肝包膜下接种细胞2周后肝脏肿瘤HE染色结果。

图22中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

图23是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于大鼠肝包膜下接种细胞2周后肺脏肿瘤HE染色结果。

图23中：1为Wrh-f2，2为Wrh-s2。

具体实施方式

实施例1：高转移潜能肝癌细胞株Wrh-f2制备

本实施例所用雄性Wistar大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

本实施例所用DEN（diethylnitrosamine），中文名称为N-二乙基亚硝胺，购自Sigma公司；所用NMOR（Nnitrosomorpholine），中文名称为N-亚硝基吗啉，购自Sigma公司。

（一）肝癌细胞的制备

1、选取体重130~150g的雄性Wistar大鼠40只，第一天按100mg/kg腹腔注射一次DEN（生理盐水配制，浓度为10mg/mL），从第二天开始，给予含100ppm的NMOR饮水（灭菌自来水配制），任其自由饮用，每周连续用5天，而后2天改用无菌水饲喂，之后依此方式交替供给NMOR饮水和无菌水。

2、于20周末（即第140天末）无菌条件下取生长良好的肝脏肿瘤组织，切成0.5-1.0mm³大小的组织块，采用直接细胞单层培养法(即单层细胞培养法)将组织块加入24孔板中（10块/孔）进行培养；培养48h后半数换液，以后每3d换一次液；其所用培养基为含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养过程中温度条件为37℃,空气条件为5%CO₂。

培养过程中观察结果：第5d开始，肝癌细胞于从肝癌组织块中爬出；第14d，肝癌细胞覆盖孔底80%（见图1），行第1次传代；10d后（即培养的第24d）行第2次传代。

（二）高转移率肝癌细胞筛选

1、Matrigel基质胶（市购，批号2148589，BD）和高糖DMEM培养基（市购，批号10017241R，Corning）以体积比1∶4混合，按50μL/小室加至Transwell小室内制备人工基质膜，形成成胶Transwell小室。

2、取步骤（一）培养至第24d的肝癌细胞，将其培养基更换为无血清培养基，继续培养24h，然后采用0.25%胰酶消化1~5min，按1×10⁵个细胞/小室接种到成胶Transwell小室内，然后将小室放入24孔板；24孔板内加入含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，37℃、5%CO₂条件下培养24h；

取出Transwell小室，可见24孔板底部有少许肝癌细胞生长（见图2），这些细胞即为具有高转移潜能的肝癌细胞；收集这些具有高转移潜能的肝癌细胞，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM于24孔板中继续培养，待肝癌细胞长满，扩大培养至50mL培养瓶中,培养条件为37℃,5%CO₂。

本步同时做对比实验：将取出的Transwell小室移至另一孔内，此孔加含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，加盖后继续培养264h，继续培养过程中，每2d更换小室培养液(无血清培养液)和24孔板内条件培养液（含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基）；然后，吸去小室内液体，0.25%胰酶消化1~5min，收集的小室膜表面细胞为低转移潜能的肝癌细胞；收集这些低转移潜能的肝癌细胞，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基继续培养并进一步扩大培养，培养条件为37℃,5%CO₂。

（三）高、低转移潜能肝癌细胞克隆化培养：

取高转移潜能肝癌细胞（即步骤（二）中经扩大培养的高转移潜能的肝癌细胞），用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基将细胞稀释至1个细胞/200μL，然后按200μL/孔加入96孔板进行克隆化培养，培养条件为37℃,5%CO₂，7d后可见部分孔中出现单克隆（图3），多个克隆的孔弃去不用。

本步同时做对比试验：取低转移潜能肝癌细胞（即步骤（二）中经扩大培养的低转移潜能的肝癌细胞），用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基将细胞稀释至1个细胞/200μL，然后按200μL/孔加入96孔板进行克隆化培养，培养条件为37℃,5%CO₂，7d后可见部分孔中出现单克隆，多个克隆的孔弃去不用。

取生长良好的高转移潜能单克隆细胞株，命名为大鼠肝癌细胞Wrh-f2，移交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期为2015年10月21日，保藏编号为CCTCCC2015174；另外，取生长良好的低转移潜能单克隆细胞株，命名为Wrh-s2，Wrh-s2细胞株及其他细胞株留存。

实施例2：高转移潜能细胞株Wrh-f2生物学特性分析及与低转移潜能细胞株Wrh-s2对比：

1）细胞形态学观察：

用倒置相差显微镜观察两株细胞，结果如下：

①、显微镜下可见97%细胞为多边形细胞，3%为圆形细胞，未发现成纤维细胞，表明细胞形态较均一，符合肝癌细胞特点；

②、培养细胞见细胞核大，有多核细胞，异常核分裂相多见，其特征与病人肝癌组织相同(见图4)；

③、低密度时细胞呈克隆样生长，高密度时细胞呈重迭生长，肉眼可见呈小组织块样结构，细胞界限不清，说明细胞失去接触性抑制。

透射电镜观察两株细胞形态（见图5），图5显示：

①、两株细胞的细胞核大且形状不规则或轻度畸形，有的细胞可见多个大而明显的核仁，粗面内质网扩张，有颗粒融合和脱颗粒现象；

②、两株细胞的游离核糖体数量减少，线粒体大部分脊和少部分膜融合模糊不清或部分缺失粗面内质网轻度颗粒融合或脱颗粒，线粒体空泡化；

③、两株细胞不同之处：Wrh-s2细胞表面有大量细长突起（微绒毛）且可见线粒体髓样化，这说明Wrh-s2细胞分化程度较高，恶性度较低。

透射电镜观察结果表明Wrh-f2细胞分化程度较低，恶性度较高。

2）染色体形态学分析：

向两株细胞中加入终浓度为50μg/mL秋水仙素，继续培养3h，常规制备染色体，结果见图6，计数100个细胞观察细胞中期核分裂相及染色体众数。

经染色体核型分析发现Wrh-s2细胞株为超2倍体，众数为55；Wrh-f2细胞大部分核型为超4倍体，各细胞内部差异较大，众数为83。

核型分析表明：Wrh-f2细胞分化程度较低。

3）细胞DNA分析：

按现有常规操作方式，采用0.25%胰酶消化各组细胞，然后以75%乙醇固定，用流式细胞仪检测细胞周期（见图7）。

图7所示结果表明Wrh-f2细胞株为G1期细胞占主导，Wrh-s2细胞株与之差异不显著。

4）甲胎蛋白（α-fetoprotein,αFP或AFP）、细胞角蛋白（cytokeratin,CK）免疫组化染色：

按现有常规操作方式，取培养3d的细胞爬片，PBS冲洗，以冰丙酮固定8-10min，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定15-20min，取出晾干。

将制备的细胞爬片进行HE染色，结果见图8，图8所示结果表明细胞形态符合肝癌细胞特点。

将制备的细胞爬片用AFP和CK7、CK8抗体试剂盒行免疫组化染色，结果见图9、10、11，结果显示Wrh-f2、Wrh-s2细胞AFP均为阳性；Wrh-f2细胞CK7、CK8均为阳性，Wrh-s2细胞CK8为阳性。

上述实验结果表明两细胞均为肝癌细胞，且Wrh-f2具有肝干细胞特点，可能为胆管细胞性肝癌细胞。

5）细胞侵袭功能：

于实验前细胞饥饿24h后，0.25%胰酶消化细胞。于24孔板内加入含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，Transwell小室中分别加入2×10⁵个高、低转移潜能的肝癌细胞。培养20h，取出培养小室，PBS轻洗3次后，用95%乙醇固定10min，给予Transwell微孔膜吉姆萨染色，取下小室微孔膜反转贴于载玻片上，中性树胶封片，显微观察结果如图12。随机选择12个200倍显微视野，计数由小室迁移至微孔膜下的细胞数量，求得单个视野的平均穿膜细胞数。

统计结果显示，Wrh-f2平均穿膜细胞数为98±12，Wrh-s2平均穿膜细胞数为55±15，差异极显著，表明本发明所筛选出的Wrh-f2具有更高的迁移性。

6）细胞克隆形成率：

将Wrh-f2、Wrh-s2细胞稀释为100个细胞/孔，加入6孔板中，加入3mL含10%胎牛血清高糖DMEM培养基继续培养240h，计数集落中细胞数超过50个的克隆形成百分数。结果显示：Wrh-f2为78%，Wrh-s2为8%，两细胞克隆形成率差异极显著（见图13），表明本发明所筛选出的Wrh-f2具有更高的形成克隆的能力。

7）细胞成瘤性：

①、裸鼠皮下接种：5周龄裸鼠10只，雄性，将Wrh-f2、Wrh-s2细胞分别以2×10⁶个细胞给每只小鼠右侧腋下接种，观察肿瘤生长情况。

a、裸鼠接种细胞后7d，观察肿瘤生长状况（见图14），测量肿瘤体积（计算公式为V=长*宽²/2）分别为51mm³、5320mm³。

b、HE染色（见图15）可见多边形癌细胞，胞浆丰富，核为圆形或椭圆形，核仁明显，异型性明显，核分裂相多见；偶见瘤巨细胞，细胞呈索条状排列，有纤维分隔，间质血管丰富，与人肝癌形态一致，证实造模成功，2株细胞均具有成瘤性。

②、裸鼠肝包膜下接种：5周龄裸鼠10只，雄性，将2株细胞分别做成细胞泥，每只小鼠肝包膜下接种接种0.04ml，观察肿瘤生长情况。

a、2周后两组均可见肝脏肿瘤生长，而Wrh-f2组细胞出现明显肺转移（见图16）。

b、肝脏HE染色（见图17）可见多边形癌细胞，胞浆丰富，核为圆形或椭圆形，核仁明显，异型性明显，核分裂相多见；偶见瘤巨细胞，细胞呈索条状排列，有纤维分隔，间质血管丰富，与人肝癌形态一致。

c、Wrh-f2组肺脏细胞HE染色可见明显肝癌细胞浸润（见图18）。

③、大鼠皮下接种：120-130gWistar大鼠10只，雄性，将2株细胞分别以2×10⁶个细胞接种于大鼠右侧腋下，观察肿瘤生长情况及发展进程。

a、大鼠接种细胞后14d，测量肿瘤体积（计算公式为V=长*宽²/2）分别为0.52cm³、7.68cm³（见图19）。

b、HE染色（见图20）可见多边形癌细胞，胞浆丰富，核为圆形或椭圆形，核仁明显，异型性明显，核分裂相多见；偶见瘤巨细胞，细胞呈索条状排列，有纤维分隔，间质血管丰富，与人肝癌形态一致，证实造模成功，2株细胞均具有成瘤性。

④、大鼠肝包膜下接种：120-130gWistar大鼠10只，雄性，将2株细胞分别做成细胞泥，每只大鼠肝包膜下接种0.04ml。

a、2周后两组均可见肝脏肿瘤生长，Wrh-f2组细胞出现明显肺转移（见图21）。

b、肝脏HE染色（见图22）可见多边形癌细胞，胞浆丰富，核为圆形或椭圆形，核仁明显，异型性明显，核分裂相多见；偶见瘤巨细胞，细胞呈索条状排列，有纤维分隔，间质血管丰富，与人肝癌形态一致。

c、Wrh-f2组肺脏细胞HE染色可见明显肝癌细胞浸润（见图23）。

本步细胞成瘤性实验表明，筛选出的高、低转移潜能的肝癌细胞株均具有成瘤性，但本发明所要求保护的Wrh-f2细胞株具有更高的转移潜能。

总体而言，以上对两株细胞的生物学特性分析表明本发明所制备的Wrh-f2细胞株为肝癌细胞株，并具有良好的成瘤性和转移性。

实施例3移植性肝癌模型的建立

120-130gWistar大鼠20只，雄性，将2株细胞分别做成细胞泥，每只大鼠肝包膜下接种0.04ml，观察肝脏肿瘤生长情况和转移情况。

1）2周后，两组均可见肝脏肿瘤生长，且接种Wrh-f2细胞株大鼠70%出现肺转移，接种Wrh-s2细胞株大鼠10%出现肺转移。

2）肝脏HE染色可见多边形癌细胞，胞浆丰富，核为圆形或椭圆形，核仁明显，异型性明显，核分裂相多见；偶见瘤巨细胞，细胞呈索条状排列，有纤维分隔，间质血管丰富，与人肝癌形态一致。

3)Wrh-f2组肺脏细胞HE染色可见明显肝癌细胞浸润。

本步移植性肝癌模型的建立实验表明，筛选出的高、低转移潜能的肝癌细胞株均可获得肿瘤模型，但本发明所要求保护的Wrh-f2细胞株具有更高的转移潜能。

本发明采用肿瘤组织原代培养，Transwell分选，克隆化培养获得制备得到了高转移潜能大鼠肝癌细胞株。其中：一、用于原代培养的肿瘤组织取自诱发性肝癌大鼠，诱发性肝癌大鼠的制备采用了改良的诱导方法，可致动物产生高转移率肝细胞癌，与人肝癌转移复发率较高的情况相符合；二、采用人工基质膜侵袭、Transwell分选方法分离肝癌细胞，分离出了不同转移潜能的肝癌细胞；三、通过细胞单克隆技术获得不同转移潜能大鼠肝癌细胞株。本发明将以上方法组合应用，有助于高、低转移潜能细胞的获得，纯化，并且可将肿瘤细胞异质性降至最低限度，所建立的细胞株具有比较均一的转移潜能，能较好体现临床肝癌不同转移特性，可替代肿瘤动物模型进行肝癌转移、复发机理的研究，达到快速准确完成实验的目的。

Claims (3)

1.一种具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株，其特征是，该细胞株的命名为大鼠肝癌细胞Wrh-f2，于2015年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCC2015174。

2.权利要求1所述具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）、取雄性Wistar大鼠，第1天按100mg/kg腹腔注射一次DEN；从第2天起，以每7天为一个循环单位，先连续五天给予含100ppm的NMOR饮水，任其自由饮用，然后连续两天给予无菌水，任其自由饮用；

（2）、第20周末，无菌条件下取肝脏肿瘤组织，切成0.5-1.0mm³大小的组织块，采用单层细胞培养法将组织块加入24孔板中进行培养，48h后半数换液，此后每3d换一次液；本步骤中所用培养基为含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基；

培养的第5d，肝癌细胞从组织块中爬出，培养的第14d行第1次传代，培养的第24d行第2次传代；

（3）、将培养24d的肝癌细胞所用培养基更换为无血清培养基并继续培养24h，然后使用胰酶进行消化，按1×10⁵个细胞/小室接种到成胶Transwell小室内，然后将小室放入24孔板，加入含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，37℃、5%CO₂条件下培养24h后，取出小室，可见24孔板底有肝癌细胞生长；

所述成胶Transwell小室是将Matrigel和DMEM以体积比1∶4混合后加至Transwell小室内制成人工基质膜而得；

（4）、将步骤（3）中24孔板的板底肝癌细胞收集后，加含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基继续培养，待肝癌细胞长满，扩大培养至50mL培养瓶中；

（5）、取扩大培养的肝癌细胞，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基稀释至1个细胞/200μL，然后按200μL/孔加入96孔板进行克隆化培养，7d后取生长良好的单克隆细胞株，即为高转移潜能的大鼠肝癌细胞株。

3.权利要求1所述具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株在制备移植性肝癌模型中的应用。