CN102344903B

CN102344903B - 成体大鼠肝脏卵圆细胞系及其用途

Info

Publication number: CN102344903B
Application number: CN2010102401075A
Authority: CN
Inventors: 王萍; 贾继东; 尤红; 马红; 丛敏; 刘天会; 唐淑珍
Original assignee: Beijing Friendship Hospital
Current assignee: Beijing Friendship Hospital
Priority date: 2010-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2030-07-29
Also published as: CN102344903A

Abstract

本发明公开了一种成体大鼠肝脏卵圆细胞系rHOC，该细胞系已于2010年7月23日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏登记编号为CGMCC No.4057。所述细胞具有以下生物学特性：细胞呈典型上皮细胞形态，具有较强的增殖能力但生长仍具有接触抑制与密度抑制现象，表达的肝脏前体细胞标志物：肝脏卵圆细胞标志物(OV-6)、Notch配基Delta样蛋白(Dlk)、甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和细胞角蛋白19(CK19)；细胞连续传代培养48个月已传至100代，仍然保持上述形态特点、生长和增殖特性以及免疫表型，其特性稳定、成分均一，是良好的肝脏前体细胞研究模型。

Description

成体大鼠肝脏卵圆细胞系及其用途

技术领域

本发明涉及一种成体大鼠肝脏卵圆细胞系，属于医学生物技术领域。

背景技术

尽管器官移植是目前临床上治疗终末期肝病较为安全、且行之有效的方法，然而供体肝脏短缺导致许多重症肝衰竭患者在等待肝源的过程中死去，因而细胞移植有望成为替代器官移植治疗终末期肝衰竭最值得期待的选择。由于成熟肝细胞很难在体外大量扩增培养而且在培养过程中其肝脏特异性功能逐渐丧失，严重限制了应用成熟肝细胞移植治疗肝脏疾病的开展。由于肝脏干/前体细胞(hepatic stem/progenitor cells)不仅具有较强的增殖能力，而且具有分化为具有功能的成熟肝细胞的能力，因此，应用肝干/前体细胞替代肝脏器官移植治疗肝脏疾病成为最值得期待的一种选择。

肝脏卵圆细胞在1956年由Farber(Cancer Res，1956，16(2)：142～148.)首次在乙硫氨酸和2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene，2-AAF)共同处理的大鼠肝组织中发现并命名，二十世纪八十年代由Thorgeirsson等(Cancer Res，1987，47(20)：5469～5475.Cancer Res，1989，49(6)：1541～1547.)证明为成体大鼠肝脏前体细胞，既往(Cancer Res，1988，48(2)：368～378.Hepatology，1997，25(2)：329～334.)通常依据不同类型的细胞密度具有差别的原理，采用密度梯度介质通过密度梯度离心的方法获得该细胞，但不可避免的混有少量细胞密度与之相近的细胞而造成细胞纯度不高的问题。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种特性稳定、成分均一的成体大鼠肝脏卵圆细胞系rHOC，它能够表达肝脏前体细胞的标志物；并能在体外条件下连续传代培养100代且持续表达肝脏前体细胞的标志物，是良好的肝脏前体细胞研究模型。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种成体大鼠肝脏卵圆细胞系的制备方法。

本发明要解决的第三个技术问题是提供所述成体大鼠肝脏卵圆细胞系rHOC在体内外定向诱导肝细胞中的应用，以及在制备生物人工肝中的应用。而且该细胞系还可以用于治疗肝脏遗传代谢性疾病、肝纤维化或肝硬化疾病的研究。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的成体大鼠肝脏卵圆细胞系rHOC经鉴定确定为成体大鼠肝脏卵圆细胞，定名为rHOC，已于2010年7月23日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，并证明存活，其保藏登记编号为CGMCC No.4057。保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。

所述成体大鼠肝脏卵圆细胞系rHOC具有以下生物学特性：

(1)细胞呈典型的上皮细胞形态，连续传代培养100代仍保持该形态特点；

(2)细胞具有较强的增殖能力，但生长存在接触抑制和密度抑制现象，连续传代培养100代仍保持该增殖和生长特性；

(3)细胞表达肝脏前体细胞标志物：肝脏卵圆细胞标志物(hepatic oval cell marker，OV-6，Santa Cruz)阳性率87.2％、Notch配基Delta样蛋白(delta drosophila homolog-like 1，Dlk，Abcam)阳性率99.1％、甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP，R&D)阳性率98％、白蛋白(albumin，ALB，Bethyl)阳性率96％、细胞角蛋白19(cytokeratin 19，CK19，R&D)阳性率92％，连续传代培养100代细胞仍保持上述免疫表型。

为解决上述第二个技术问题，本发明提供一种成体大鼠肝脏卵圆细胞系的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)用含0.1％乙硫氨酸(Sigma-Aldrich)的胆碱缺乏性饲料喂养大鼠6周；

(2)麻醉大鼠后无菌条件下行门静脉插管，并进行原位灌流以去除血细胞；

(3)切下肝组织，用含0.1％胶原酶(Sigma-Adlrich)溶液循环灌注以离散肝组织；

(4)将步骤(3)灌流后的肝组织置于120目铜网上剪碎组织并研磨以获得单细胞悬液；

(5)收集步骤(4)的单细胞悬液并于4℃条件下1500rpm离心5分钟以得到细胞沉淀；

(6)将步骤(5)的细胞沉淀重悬于蛋白酶E(Sigma-Adlrich)溶液中37℃孵育60分钟以去除肝细胞；

(7)加入等体积的含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM/F12培养基(Gibco)，混合均匀后经孔径20μm尼龙膜过滤；

(8)将滤液上样至1.35g/ml和1.70g/ml Percoll(Pharmacia)不连续密度梯度介质上，4℃条件下2000rpm离心20分钟；

(9)收集两层密度梯度介质间的细胞，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基洗3次，于4℃条件下1，500rpm离心5分钟，弃去上清液；

(10)将步骤(9)的细胞沉淀重悬于完全培养基[含10％胎牛血清、0.5U/ml胰岛素(Sigma-Adlrich)、1ng/ml表皮细胞生长因子(Epithelial growth factor，EGF，PeProTech)、0.5ng/ml干细胞生长因子(Stem cell factor，SCF，PeProTech)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM/F 12培养基]中，按2.5×10⁴/cm²接种细胞悬液于胶原包被的组织培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

(11)每隔2天更换新鲜的完全培养基一次；

(12)待细胞形成克隆后(约7～14天)，应用克隆环挑取上皮细胞克隆置于新的培养瓶中继续培养，即得成体大鼠肝脏卵圆细胞；

(13)待细胞长至90％汇合时应用胰蛋白酶溶液消化，常规传代培养。

本发明的优点是：本发明联合应用密度梯度离心和克隆环纯化的方法获得了纯度较高的肝脏卵圆细胞，该细胞呈典型上皮细胞形态，具有较强的增殖能力，但生长仍具有接触抑制与密度抑制现象，表达的肝脏前体细胞标志物：肝脏卵圆细胞标志物(OV-6)、Notch配基Delta样蛋白(Dlk)、甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和细胞角蛋白19(CK19)；细胞连续传代培养48个月已传至100代，仍然保持上述形态特点、生长和增殖特性以及免疫表型，不同于培养的成熟肝细胞既难于体外大量扩增且细胞功能逐渐丧失的特点，因此，该细胞是一种特性稳定、成分均一的成体大鼠肝脏前体细胞，是良好的肝脏前体细胞研究模型。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明

图1为相差显微镜下成体大鼠肝脏卵圆细胞的形态；

图2为成体大鼠肝脏卵圆细胞流式细胞检测鉴定结果；

图3为成体大鼠肝脏卵圆细胞荧光显微镜检测鉴定结果；

图4为成体大鼠肝脏卵圆细胞生长曲线；

图5为成体大鼠肝脏卵圆细胞染色体倍体分析结果；

图6为诱导分化后成体大鼠肝脏卵圆细胞糖原染色结果，

A：对照，B：丁酸钠；

图7为诱导分化后成体大鼠肝脏卵圆细胞白蛋白分泌结果；

图8为诱导分化后成体大鼠肝脏卵圆细胞氨代谢结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1：成体大鼠肝脏卵圆细胞分离、原代培养

一、实验材料和试剂

1.实验动物：150g SD大鼠；实验动物饲料：含0.1％乙硫氨酸(Sigma-Aldrich)的胆碱缺乏性大鼠饲料由北京实验动物中心制备。

2.灌流缓冲液：含20mM HEPES的D-Hank’s平衡盐溶液。

3.循环缓冲液：含0.1％胶原酶(Sigma-Adlrich)的Hank’s平衡盐溶液。

4.酶缓冲液：含0.1％胶原酶(Sigma-Adlrich)、0.1％蛋白酶E(Sigma-Adlrich)、0.025％胰蛋白酶(Sigma-Adlrich)、0.02％EDTA、0.004％DNase I(Sigma-Adlrich)的PBS溶液。

5.DMEM/F12液体培养基、胎牛血清均为Gibco公司产品

6.Percoll为Pharmacia公司产品

7.完全培养基：含10％胎牛血清、0.5U/ml胰岛素(Sigma-Adlrich)、1ng/ml表皮细胞生长因子(Epithelial growth factor，EGF，PeProTech)、0.5ng/ml干细胞生长因子(Stem cell factor，SCF，PeProTech)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基。

二、实验方法

1.喂养动物：应用含0.1％乙硫氨酸的胆碱缺乏性大鼠饲料喂养大鼠6周。

2.应用1％戊巴比妥钠麻醉大鼠，无菌条件下打开腹腔暴露门静脉，门静脉插管，用灌流缓冲液进行原位灌流，20ml/min灌流至肝脏苍白。

3.将肝组织切下，用50ml循环缓冲液循环灌流15分钟。

4.将肝组织放入120目铜网中，用剪刀将组织剪成小块，研磨组织并用循环缓冲液冲洗，收集滤液，4℃条件下1500rpm离心5分钟。

5.弃上清液，将细胞重悬于酶缓冲液中，37℃孵育60分钟。

6.加入等体积的含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，混合均匀后经孔径20μm尼龙膜过滤。

7.将滤液上样至1.35g/ml和1.70g/ml Percoll不连续密度梯度介质上，4℃条件下2000rpm离心20分钟。

8.收集两层密度梯度介质间的细胞，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基洗3次，每次用5ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，于4℃条件下1，500rpm离心5分钟，弃去上清液。

9.取0.2ml细胞悬液加入0.4ml台盼蓝染液混匀，分别计数活细胞数和死细胞数，并计算活细胞占总细胞的比例。

10.将细胞重悬于完全培养基中，按2.5×10⁴/cm²接种细胞悬液于胶原包被的组织培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

11.每隔2天更换新鲜的完全培养基一次。

12.待细胞形成克隆后(约7～14天)，应用克隆环挑取上皮细胞克隆置于新的培养瓶中继续培养，即得成体大鼠肝脏卵圆细胞。

三、实验结果：

如图1所示相差显微镜下，成体大鼠肝脏卵圆细胞呈铺路石样，为典型的上皮细胞形态。

实施例2：成体大鼠肝脏卵圆细胞的传代培养与冻存保种

一、试剂

1.胰蛋白酶溶液：含0.25％胰蛋白酶(Sigma-Adlrich)、0.02％EDTA的PBS.

2.冻存液：含10％DMSO、40％胎牛血清的DMEM/F12培养基。

二、实验方法：

1.待细胞生长至90％汇合时，弃去旧培养基，加入2ml PBS轻旋培养瓶浸洗细胞。

2.弃去PBS，再加入2mlPBS洗细胞一次。

3.弃去PBS，加入胰蛋白酶溶液使其刚好覆盖细胞，倒置相差显微镜下观察消化情况，待细胞突起回缩时迅速弃去消化液。

4.加入完全培养基2ml，以终止胰蛋白酶的作用，吸取瓶内培养基反复轻柔吹打细胞。

5.收集吹下的细胞置于15ml离心管中，混匀后取10μl细胞悬液计数。

6.其余细胞悬液于4℃条件下1,000rpm离心5分钟，弃去上清液。

7.将细胞沉淀打散，按计数结果用胚胎肝脏细胞完全培养基制备成1×10⁶/ml细胞悬液，部分细胞按1.0×10⁴/cm²接种于培养瓶中继续培养，部分细胞冻存保种。

8.用于冻存保种细胞于4℃条件下1,000rpm离心5分钟，弃去上清液，应用冻存液重悬细胞制备成2×10⁶/ml细胞悬液，按每管1ml分装至1.8ml冻存管中，于冻存管上注明细胞名称、细胞数和冻存日期。

获得的大鼠肝脏卵圆细胞rHOC已于2010年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记编号为CGMCC No.4057，建议分类命名为：成体大鼠肝脏卵圆细胞。

实施例3：成体大鼠肝脏卵圆细胞的鉴定

一、试剂

1.多聚甲醛固定液：含4％多聚甲醛的PBS

2.皂素破膜剂：含0.1％皂素的PBS

3.Triton X-100破膜剂：含0.3％Triton X-100的PBS

4.小鼠抗大鼠卵圆细胞标志物(hepatic oval cell marker，OV-6)抗体为美国Santa Cruz公司产品

5.兔抗人果蝇Notch配基Delta样蛋白(delta drosophila homolog-like 1，Dlk)抗体为美国Abcam公司产品

6.小鼠抗人甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)抗体为美国R&D公司产品

7.兔抗大鼠白蛋白(albumin，ALB)抗体为美国Bethyl公司产品

8.小鼠抗人细胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)抗体为美国R&D公司产品

9.Alexa Fluro488标记鸡抗兔IgG和Alexa Fluro594标记羊抗小鼠IgG为美国Molecular Probe公司产品

二、实验方法：

1.间接免疫荧光结合流式细胞仪测定细胞内抗原的表达

(1).取对数生长期成体大鼠肝脏卵圆细胞制备成单细胞悬液，按5×10⁵/管分装细胞于流式细胞仪专用管中。

(2).用PBS洗涤细胞三次，每次3ml。

(3).弃尽上清液后，加入500μl多聚甲醛固定液混匀后室温固定20分钟。

(4).用PBS洗涤细胞三次，每次3ml。

(5).弃尽上清液后，加入500μl皂素破膜剂混匀后室温孵育15分钟。

(6).1,000rpm离心5分钟，弃尽上清液后，加入500μl封闭用正常小鼠或兔血清混匀后室温孵育20分钟。

(7).1,000rpm离心5分钟，弃尽上清液后，加入10μl抗体(小鼠抗大鼠OV-6抗体或兔抗人Dlk抗体)混匀；对照细胞加入10μl PBS，室温孵育1小时。

(8).用皂素破膜剂洗涤细胞3次，每次3ml。

(9).1,000rpm离心5分钟，弃尽上清液后，加入5μl Alexa Fluro594标记羊抗小鼠IgG或Alexa Fluro488标记鸡抗兔IgG混匀，室温避光孵育30分钟。

(10).用皂素破膜剂洗涤细胞3次，每次3ml。

(11).弃尽上清液后，加入500μl PBS混匀。

(12).经400目铜网过滤后于BD FACSCalibur流式细胞仪测定分析阳性细胞比例。

2.间接免疫荧光结合荧光显微镜观察细胞内抗原的表达

(1).取对数生长期成体大鼠肝脏卵圆细胞，按2.5×10⁴/cm²接种于24孔板中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时。

(2).弃去上清液，用PBS浸洗细胞三次。

(3).弃尽上清液，加入500μl多聚甲醛固定液，室温固定20分钟。

(4).弃去上清液用PBS浸洗细胞三次，每次500μl PBS浸洗5分钟。

(5).弃尽上清液，加入500μl Triton X-100破膜剂，室温孵育5分钟。

(6).弃去上清液用PBS浸洗细胞三次，每次500μl PBS浸洗5分钟。

(7).弃尽上清液，加入200μl封闭用正常小鼠血清室温孵育20分钟，ALB染色用1％明胶进行封闭。

(8).弃去封闭液，加入200μl抗体[小鼠抗人AFP抗体(1∶400倍稀释)、兔抗大鼠ALB抗体(1∶400倍稀释)、小鼠抗人CK19抗体(1∶400倍稀释)]，于4℃孵育过夜。

(9).弃尽抗体，用PBS浸洗细胞三次，每次500μl PBS浸洗5分钟。

(10).弃尽上清液，加入200μl荧光素标记的相应二抗(Alexa Fluro488标记鸡抗兔IgG或Alexa Fluro594标记羊抗小鼠IgG，均为1∶200倍稀释)，室温避光孵育30分钟。

(11).弃去抗体，用PBS浸洗细胞三次，每次500μl PBS浸洗5分钟。

(12).于荧光显微镜下观察并拍照。

三、实验结果：

免疫荧光结合流式细胞仪分析显示(图2)，成体大鼠肝脏卵圆细胞肝脏前体细胞标志物OV6的阳性率87.2％，Dlk的阳性率99.1％；免疫荧光结合荧光显微镜分析显示(图3)，成体大鼠肝脏卵圆细胞肝脏前体细胞标志物AFP的阳性率98％、ALB的阳性率96％、CK19的阳性率92％。

实施例4：成体大鼠肝脏卵圆细胞的生长曲线

一、实验方法：

1.取对数生长期细胞经胰蛋白酶消化、计数后，按1×10⁴/孔接种于24孔板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2天换液一次。

2.连续8天每天消化3孔细胞进行计数，以各孔细胞数的平均值±标准差来表示细胞数。

3.以横坐标为培养天数，纵坐标为细胞数，绘制细胞的生长曲线。

二、实验结果：

体外培养的成体大鼠肝脏卵圆细胞生长存在接触抑制与密度抑制现象，图4为成体大鼠肝脏卵圆细胞的生长曲线，在接种后2～6天为增殖活跃的对数生长期。

实施例5：成体大鼠肝脏卵圆细胞的染色体倍体分析

一、试剂：

1.0.1％柠檬酸缓冲液：含0.1％柠檬酸的H₂O

2.碘化丙啶染液：含0.2mg/ml碘化丙啶的0.1％柠檬酸缓冲液

3.RNaseA溶液：含0.2mg/mlRNaseA的0.1％柠檬酸缓冲液

二、实验方法：

1.取对数生长期成体大鼠肝脏卵圆细胞一瓶，用胰蛋白酶溶液消化细胞制成单细胞悬液。

2.取5×10⁵细胞，用PBS洗涤细胞三次，每次用3ml PBS重悬细胞，1,000rpm离心5分钟，弃去上清液。

3.将250μl RNase A溶液和250μl碘化丙啶染液混匀后加入细胞沉淀中混匀。

4.室温避光孵育30分钟。

5.经400目铜网过滤后用BD FACSCalibur流式细胞仪测定，用BDCellQuest细胞获取分析软件收集1×10⁴细胞，用BD ModFit LT细胞周期分析软件分析染色体倍体。

三、实验结果：

体外培养的成体大鼠肝脏卵圆细胞经碘化丙啶染色后应用流式细胞仪分析其染色体倍数和细胞周期。成体大鼠肝脏卵圆细胞流式细胞分析结果如图5所示，成体大鼠肝脏卵圆细胞呈正常二倍体图形，未见异常倍体出现；细胞周期分析结果显示G0-G1期细胞占79.92％，G2-M期细胞占4.91％，S期细胞占15.17％，G2/G1期细胞占1.88％。

实施例6：诱导成体大鼠肝脏卵圆细胞分化为肝细胞

一、试剂：

1.诱导分化培养基：含0.75mM丁酸钠的完全培养基

2.无血清培养基：含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基。

3.卡诺固定液：酒精∶氯仿∶冰醋酸＝6∶3∶1

4.过碘酸溶液：含0.5％过碘酸的H₂O

5.Schiff试剂

6.氨代谢检测用培养基：含20mM氯化铵的完全培养基

二、实验方法：

1.诱导分化：

(1).取对数生长期的成体大鼠肝脏卵圆细胞制备成单细胞悬液，按2.5×10⁴/cm²接种于直径6cm培养皿中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。

(2).弃去旧培养基，PBS洗细胞一次，加入诱导分化培养基，继续培养3天，以完全培养基培养细胞为对照。

2.白蛋白分泌测定：

(1).取诱导分化细胞和对照细胞，弃去旧培养基，PBS洗细胞三次，加入无血清培养基，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时。

(2).收集培养上清液于OlympusAU640全自动生物化学分析仪上检测上清液中白蛋白含量。

3.糖原合成能力测定

(1).取诱导分化细胞和对照细胞，弃去旧培养基，PBS洗细胞三次。

(2).用卡诺固定液固定10分钟。

(3).蒸馏水洗三次。

(4).加入过碘酸溶液作用15分钟。

(5).加入Schiff试剂中30分钟至切片稍微变红。

(6).自来水淋洗小盖片2分钟至切片变红。

(7).用蒸馏水淋洗晾干，显微镜下观察并照相。

4.细胞氨代谢能力的测定

(2).加入氨代谢检测用培养基，于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养24小时。

(3).收集培养上清液于OlympusAU640全自动生物化学分析仪上检测上清液中尿素浓度。

三、实验结果：

糖原染色结果显示，对照细胞(图6A)内仅有呈淡粉色，而丁酸钠诱导后细胞内可见大量紫红色颗粒(图6B)。

成熟肝细胞能够向细胞外分泌白蛋白，如图7所示，丁酸钠诱导后成体大鼠肝脏卵圆细胞分泌白蛋白能力增强。

成熟肝细胞能够摄取血液中的NH₄ ⁺将其代谢为尿素，如图8所示，丁酸钠诱导后成体大鼠肝脏卵圆细胞获得了代谢NH₄ ⁺合成尿素的功能。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种成体大鼠肝脏卵圆细胞系rHOC，于2010年7月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.4057。

2.权利要求1所述的成体大鼠肝脏卵圆细胞系rHOC，其特征在于所述细胞具有以下生物学特性：

(3)细胞表达肝脏前体细胞标志物：肝脏卵圆细胞标志物、Notch配基Delta样蛋白、甲胎蛋白、白蛋白、细胞角蛋白19，连续传代培养100代细胞仍保持上述生物学特性。

3.权利要求1所述的成体大鼠肝脏卵圆细胞系rHOC在体外定向诱导肝细胞中的应用。

4.权利要求1所述的成体大鼠肝脏卵圆细胞系rHOC在制备生物人工肝中的应用。