KR20200101322A - 진핵 세포주 - Google Patents

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스테파노 콜로카
알프레도 니코시아
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노우스콤 아게
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Abstract

본 발명은 세포주, 세포주의 용도 및 세포주를 사용하여 감염성 바이러스 입자를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

진핵 세포주
본 발명은 세포주, 세포주의 용도 및 상기 세포주를 사용하여 감염성 바이러스 입자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
HIV, C형 간염, 말라리아, 결핵, 및 암과 같은 질환의 예방 또는 치료를 위해 신규 백신이 필요하다. 전임상 및 임상 증거는 T 세포 면역성(immunity), 특히, 이러한 질환의 클리어런스(clearance)에서 CD8+ T 세포의 역할을 뒷받침한다. 특정 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 한 가지 방법은 유전자 전달을 통해 세포 내에서 그 항원 및 적합한 병원체-유래 선천적 활성인자(activator)를 발현시키는 것이고; 유전적 또는 유전자 기반 백신은 생리적 항원 처리 및 주조직적합성 복합체(MHC) 부류 I 제시를 가담시켜 CD8+ T 세포 반응을 활성화시킨다. 복제-결함성 아데노바이러스 벡터는 필수 E1 영역을 항원을 위한 발현 카세트로 대체하여 유전적 백신에 광범위하게 사용되어왔다. Ad 벡터는 복제 및 비-복제 세포 둘 다를 감염시키고, 넓은 조직 향성(tropism)을 갖고, 이용가능한 팩키징 세포주에서 매우 효율적으로 번식하며, 확장가능하고 저렴한 생산 공정을 갖기 때문에 유전자 전달 시스템으로서 매력적이다. 실제로, Ad 기반 벡터는 폭스바이러스, 렌티바이러스, 알파바이러스, 및 동물 모델 및 인간 임상 시험에서의 네이키드(naked) DNA 기반의 다른 유전적 백신 벡터보다 더 강력한 항원 특이적 CD8+ T 세포를 유도한다. 그러나, 유전적 백신 담체로서 아데노바이러스 벡터의 성공적인 개발은 결국 그의 면역학적 잠재성뿐만 아니라 확장가능하고 재현가능한 생산 공정을 위한 세포 기질의 이용가능성에 의존할 것이다. 아데노바이러스 벡터는 생체내 표적 조직에서 뿐만 아니라 생산 공정 동안 보완(complementing) 세포주에서 아데노바이러스 벡터가 전달하는 높은 수준의 항원 단백질을 발현할 수 있다. 현재의 벡터 시스템에서, 전이유전자(transgene) 발현은 표적 조직에서 뿐만 아니라벡터 생산 공정 동안 팩키징 세포주에서 높은 수준의 전이유전자 발현을 가능하게하는 강력한 인간 사이토메갈로바이러스 즉각/조기 프로모터(HCMV 프로모터)에 의해 유도된다. 본 발명자들은 팩키징 세포주에서의 높은 전이유전자 발현이 아데노바이러스 복제를 방해할 수 있다는 것을 나타내는 몇가지 증거를 갖는다. 아데노바이러스 벡터 구제(rescue) 및 증식에 대한 본 발명자들의 광범위한 경험에 있어서, 본 발명자들은 감소된 벡터 수율에서부터 복제의 완전한 억제까지에 이르는 전이유전자 과발현에 의해 매개된 바이러스 복제에 대한 유해한 효과를 관찰하였다. 이외에, 벡터 복제의 방해는 재배열된 벡터 종의 선별 시 벡터 자체의 유전적 불안정성을 초래할 수 있다.
생산 공정 동안 아데노바이러스 벡터에 의해 운반된 전이유전자의 발현을 억제할 수 있는 세포주의 개발은 전이유전자 과발현의 부정적인 효과를 예방할 수 있다. 따라서, 시스템은 높은 수준의 TetR을 발현하는 세포주를 기반으로 하고 프로모터 TATA 박스 하류에 삽입된 TetR 결합 부위의 2개 이상의 카피와 함께 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터 또는 다른 강력한 프로모터, 예컨대 CASI 프로모터, CAG 프로모터, EF1α 프로모터의 제어 하에 전이유전자를 운반하는 Ad 벡터에 의한 것이다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 테트라사이클린 억제인자(tetracycline repressor)(Tet-R)가 세포 또는 부분적 세포 프로모터의 제어 하에서 발현되는 것인, 세포주를 제공한다.
두 번째 양태에서, 본 발명은 감염성 바이러스 입자를 생산하기 위한 본 발명의 첫 번째 양태에 따르는 세포주의 용도에 관한 것이다.
세 번째 양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 감염성 바이러스 입자를 생산하는 방법에 관한 것이다:
(i) 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유사체의 부재 하에서 감염성 바이러스 입자로 시험관내 조립할 수 있는 바이러스 게놈을 추가로 포함하는 본 발명의 첫 번째 양태의 세포주의 세포를 성장시키는 단계; 또는
(ii) 본 발명의 첫 번째 양태의 세포주의 세포를 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터로 감염시키는 단계; 및
(iii) 바이러스 입자를 회수하는 단계.
하기에서, 본 명세서에 포함된 도면의 내용이 설명된다. 이러한 맥락에서, 상기 및/또는 하기의 본 발명의 상세한 설명을 참조하기 바란다.
도 1: pneo/CAG-TetR의 다이어그램. Pneo/CAG-TetR는 테트라사이클린 억제인자 및 G419-내성 유전자를 위한 발현 카세트를 함유한다.
도 2: 클론 M9 및 M38에서의 SeAP 발현. 테트라사이클린의 존재 또는 부재 하에 클론(clone)을 플라스크 T25에 씨딩(seeding)하고 moi 30 (감염 다중도(multiplicity of infection))에서 ChAdETetOSeap으로 감염시켰다. 이후에, 감염 후 48시간 째에 테트라사이클린의 존재와 부재의 비를 계산함으로써 각각의 단일 클론에 대한 점수를 수득하였다. 클론 M9는 최적의 +/- tet 비를 나타냈다.
도 3: M9, M38 및 Hek293 세포에서의 AdTetO E1E2p7의 생산. M9, M38 및 HEK 293을 moi 100 (감염 다중도)에서 AdTetOE1/F78E2p7(발현의 TetR 매개된 제어 없이 성장할 수 없는 아데노벡터)로 감염시켰다. 클론 M9 및 M38은 최적의 생산성 값을 나타낸다.
도 4: M9 및 M38 세포에서의 TetR 단백질의 발현. TetR 발현을 TetR 항체를 사용하여 클론 M9 및 M38의 세포 용해물 상에서 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis) 에 의해 평가하였다. TetR은 M9 및 M38 세포 둘 모두에서 높은 수준으로 발현된다.
도 5: M9 세포에서의 ChAd 벡터의 구제 효율. 종(Species) C 및 E 아데노바이러스 벡터(ChAdN13 TPA4-T1Poly (도 5a) 및 ChAdE egfp (도 5b))의 구제 효율을 M9 세포에서 HEK-293과 비교하여 평가하였다. M9 및 HEK293 세포의 단일층을 preAd 플라스미드 DNA와 동시에 형질감염시켰다. 바이러스 생산을 형질감염 후 12일 째에 세포 용해물 상에서 QPCR에 의해 평가하였다. 결과는 형질감염시 M9 세포에서 아데노바이러스 벡터 생산의 더 높은 효율 입증한다.
도 6: ChAd C - 비너스(Venus) 및 ChAd E - EGFP 벡터의 생산성. 침팬지 Ad 벡터 ChAd C - 비너스(도 6a) 및 ChAd E - EGFP(도 6b)의 생산성을 HEK 293 및 293T 세포와 비교하여 M9 세포에서 평가하였다. 세포의 단일층을 ChAd와 동일한 감염 다중도를 사용하여 감염시켰다. 세포를 감염 후 72시간째에 수확(harvesting)하고 벡터 역가(titer)를 조 용해물(crude lysate) 내에서 QPCR에 의하여 평가하였다. 결과를 세포-특이적 생산성으로서 나타낸다.
도 7: FACS 분석에 의한 M9 및 T-Rex 세포에서의 전사 제어의 평가. 세포주를 T25 플라스크에서 씨딩하고 moi=100 vp/세포 (감염 다중도)를 사용하여 ChAd C TetO-비너스(VENUS)로 감염시켰다. 단일 세포 수준에서 충분한 양의 TetR의 발현은 비너스 리포터 유전자 발현을 차단(shut-off)해야한다. T-rex 세포의 26%에 비해, M9 세포의 3.8%가 측정가능한 형광 신호를 나타냈다. M9 세포주는 세포의 96.2%에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 반면, T-rex 세포의 74%가 효율적으로 발현을 제어하는 것으로 입증되었다.
도 8: M9(도 8a) 및 T-Rex(도 8b) 세포주에서의 ChAd 벡터 생산성. T-플라스크(10 ml의 배지에서 5e6 세포로 씨딩된 T25 플라스크)에 씨딩된 세포에서 분석을 수행하였다. 세포 단일층을 100 vp/세포의 감염 다중도를 사용하여 ChAd-C TetO-비너스로 감염시켰다. 현미경에 의해 완전한 CPE가 관찰되는 경우 세포를 수확하였다(감염 후 7일째). 벡터 생산성을 HCMV 프로모터 DNA 서열을 위해 설계된 프라이머 및 탐침(probe)으로 QPCR 방법에 의해 측정하였다.
도 9: 아데노바이러스 벡터 및 발현 카세트의 다이어그램. 아데노바이러스 벡터는 HCMV 프로모터와 TetO를 운반하고 발현 카세트는 TetO 서열을 포함한다.
도 10: HCMV-유도된 발현과 비교한 CAG 프로모터에 의해 유도된 TetR 발현. HCMV-TetR 293 세포는 HEK 293 세포에서 HCMV-TetR 발현 벡터를 형질감염 시킴으로써 최초로 개발되었다. TetR을 발현하는 클론을 G418 선별에 의하여 단리하였고 확장시켰다. TetR 발현을 계대(passage) 40에서 및 계대 60에서 웨스턴 블롯에 의하여 시험하였고 계대 60에서의 M9 세포 내 TetR 발현과 비교하였다. 총 세포 단백질을 3E+06 세포로부터 추출하였고, SDS-PAGE 상에서 분리하였고, 막으로 옮겼고 항-TetR 항체(항체 희석:1:1000, 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션(incubation))로 프로빙(probing)하였다. 결과는, HCMV 프로모터에 의해 유도된 TetR 발현은 세포 계대배양에 걸쳐 꾸준히 손실되는 반면 CAG 프로모터에 의해 유도된 TetR 발현은 과-계대(over-passaging)(p60)를 유지하는 것을 입증하였다.
도 11: 후성유전적(epigenetic) 메카니즘에 의한 HCMV 프로모터 사일런싱(silencing). HCMV-TetR 세포주에서 관찰된 TetR 발현의 점차적인 손실은 세포를 HDAC 억제제(벨리노스타트(Belinostat))에 노출시킴으로써 복귀시킬 수 있다. HCMV TetR 세포를 200 nM의 벨리노스타트(PXD101 - HDAC 억제제)의 존재 하에서 배양한 후, 세포를 수확하여 TetR 발현을 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 그러나 인간 CMV 프로모터의 재활성화는 일시적이고 TetR의 발현은 벨리노스타트의 부재 시 다시 손실된다.
하기에 본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 본원에 설명된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다(이들은 변할 수 있기 때문). 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하는 목적을 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 분야의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, 본원에 사용된 용어는 문헌 ["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)]에 설명된 바와 같이 정의된다.
본 명세서 및 하기의 청구범위 전체에서, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", 및 변형, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하는"은, 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는다는 것이 이해될 것이다. 하기의 단락에서, 본 발명의 상이한 양태는 더욱 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각각의 양태는 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수 있다. 특히, 선택적인 것, 바람직한 것 또는 유익한 것으로 나타낸 임의의 특징은 선택적인 것, 바람직한 것 또는 유익한 것으로 나타낸 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본 명세서의 본문 전반에 걸쳐서 몇몇 문헌이 인용된다. 본원에 인용된 각각의 문헌(모든 특허, 특허 출원, 과학적 출판물, 제조업자의 명세서, 설명서 등 포함)은, 상기든 하기든, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명때문에 그러한 개시를 선행할 자격이 없다는 승인으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 일부 문헌들은 "참조로 포함된" 것으로 특징지워진다. 그러한 포함된 참고문헌의 정의 또는 교시 내용(teaching)과 본 명세서에서 인용된 정의 또는 교시 내용 사이에 충돌이 있는 경우, 본 명세서의 내용이 우선한다.
하기에서, 본 발명의 요소가 설명될 것이다. 이러한 요소들은 구체적인 실시양태와 함께 나열되고; 그러나, 추가의 실시양태를 만들기 위해 임의의 방식으로 및 임의의 수로 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 다양하게 설명된 실시예 및 바람직한 실시양태는 본 발명을 명시적으로 설명된 실시양태만로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 설명은 명시적으로 설명된 실시양태와 개시된 및/또는 바람직한 요소의 임의의 수를 조합한 실시양태를 뒷받침하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본 출원에서 설명된 모든 요소의 순열 및 조합은 본 출원의 설명에 의해 개시되는 것으로 간주되어야 한다.
정의
하기에, 본 명세서에서 빈번하게 사용되는 용어의 일부 정의를 제공한다. 이러한 용어는, 그의 사용의 각 예에서, 본 명세서의 나머지 부분에서 각각 정의된 의미와 바람직한 의미를 가질 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 내용이 명확하게 달리 나타내지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다.
용어 "유전자를 발현한다" 또는 "단백질을 발현한다"는 mRNA 전사 후 암호화된 단백질로 mRNA의 번역 과정을 지칭하기 위해 본 발명의 맥락에서 사용된다. 발현 수준은 mRNA 및/또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. mRNA 수준에서 측정되는 경우 mRNA의 양은 적어도 세포에 존재하는 단백질의 양의 정량적 표시를 제공할 것이다. 대다수의 경우 모든 mRNA는 단백질로 번역될 것이므로, mRNA 양의 측정은 새롭게 생산된 단백질의 양을 정량화할 수 있게 한다. 단백질의 양은 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한 표지화(labelling)를 포함하는 당해 분야에 공지된 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다. 당해 분야 기술자는 단일 세포 기반에서 유전자의 발현을 정성적으로 및/또는 정량적으로 검출하는 몇 가지 방법을 알고 있다. 이러한 방법은 FISH, 세포내 염색(ICS) 및 단일 세포 RNA 서열분석을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "돌연변이"는 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 각각 핵산 서열 중 다른 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 중 아미노산으로 교환되는 것을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "결실"은 각각 핵산 서열로부터 뉴클레오타이드의 제거 및 아미노서열 중 아미노산의 제거를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "삽입"은 핵산 서열로의 뉴클레오타이드의 첨가 및 아미노산 서열로의 아미노산의 첨가를 지칭한다. 또한 치환은 삽입 및 결실 또는 그 반대의 연속적인 공정으로 여겨질 수 있다. 본 발명의 맥락에서 용어 치환은 핵산 서열의 뉴클레오타이드의 수 또는 아미노산 서열 중 아미노산의 수를 변화시키지 않는 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 변경에 사용된다.
본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "불멸의" 또는 "불멸화된(immortalized)"은 무한으로 분열하는 세포의 특성을 지칭한다. 불멸화된 세포는 "세포주"로 또한 지칭되는 세포의 집단으로 성장할 것이다. 바람직하게는, 그러한 세포주는 단리된 세포를 포함하거나 이로 구성된다. 바람직하게는, 그러한 세포주는 노화하지 않을 것이다. 바람직하게는, 그것은 또한 세포 배양 조건 하에서 세포자멸사에 진입하지 않을 것이다. 세포주가 전형적으로 클론 기원(clonal origin), 즉 모든 세포가 하나의 형질전환된 세포의 자손이지만, 세포주 내에 이종성(heterogeneity)이 있는 것이 일반적이다. 이는 체세포 분열 동안 일어날 수 있는 염색체 재배열, 염색체 복제, 또는 부적절한 염색체 분리에 기인한다. 이러한 사건은 형질전환된 세포에서 더욱 일반적이다. 용어 "형질전환된"은 세포주의 추가적인 특성, 즉, 무한 성장 이외의 것을 지칭한다. 이러한 특성은 비부착 성장(anchorage independent growth), 접촉-억제의 손실, 침입성, 및 다배수성(polyploidy)을 포함하는 종양 세포와 관련된 하나 이상의 것이다. 바람직하게는, 형질전환된 세포주는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 입자에 의해 형질전환된다.
용어 "세포주"는 하나 이상의 특성과 관련된 이종성을 나타내는 세포주를 지칭한다. 전형적으로, 이종성은 세포주의 세포의 후속 유사분열 주기 동안 유의하게 또는 전혀 변하지 않는다. 어떤 세포주가 이종성일 수 있는지와 관련된 특정 특성은 주어진 전이유전자, 바람직하게는 Tet-R 및/또는 배수성(ploidy)의 발현이다.
용어 "Tet-R"은 테트라사이클린 억제인자를 지칭하기 위해 본 발명의 맥락에서 사용된다.
용어 "TRE" 및 "TetO"은 Tet-R이 특이적으로 결합하는 DNA 요소를 지정하기 위하여 사용된다. 바람직하게는, TetO 서열은 서열번호 3(TCCCTATCAGTGATAGAGA)의 뉴클레오타이드 서열이다.
TetO가 유전자의 기본 프로모터로 또는 그 근처로 다수의 카피로 삽입되는 경우, Tet-R은 그 기본 프로모터로부터 전사의 억제인자로 작용할 수 있다. Tet-R 결합의 효과를 최대화하기 위하여 2개 이상의 TetO를 연속적으로 하나의 프로모터 내로 포함시키는 것이 종종 바람직하다. 바람직하게는, TetO의 2, 3, 4, 5, 6, 내지 적어도 7개의 카피는 하나의 프로모터 내로 연속적으로 포함된다.
용어 "이종 유전자"는 비자연적으로 발생하거나 유전자의 자연적 맥락으로부터 취해져서 꺼내져서 유전자가 자연적으로 발생하는 게놈 내의 상이한 위치로 또는 상이한 유기체 또는 게놈으로 삽입된 유전자를 지칭하기 위해 본 발명의 맥락에서 사용된다. 예를 들어, 아데노바이러스 게놈 내로 삽입되는 종양 항원을 암호화하는 인간 유전자는 아데노바이러스 게놈에 대하여 이종성이다.
용어 "독성"은 세포주의 증식을 억제하는 화합물의 활성을 지칭하기 위해 본 발명의 맥락에서 사용된다. 억제가 완성될 수 있는, 즉 개별 세포가 성장을 멈추거나, 세포자멸사로 가는 화합물 및 농도에 의존한다.
용어 "바이러스 입자"는 바이러스, 바람직하게는 재조합 바이러스 또는 핵산 서열을 포함하는 비리온(virion)을 지칭하기 위해 본 발명의 맥락에서 사용된다. 이러한 핵산 서열은 전체 또는 부분적 바이러스 게놈일 수 있다. 후자의 경우 바이러스 게놈은 바람직하게는 이종 유전자를 포함한다. 일부 바이러스 입자의 경우 바이러스 게놈의 매우 짧은 서열만이 바이러스 또는 비리온의 조립을 가능하게 하기 위해서 필요하다. 예를 들어, 아데노-관련 바이러스의 경우 주어진 길이(아데노-관련 바이러스의 경우 전형적으로 4.5 내지 5.3 kB)의 이종 핵산의 5' 내지 3'에 위치한 짧은(약 200 bp 길이) 반복 서열이 감염성 아데노-관련 바이러스의 조립을 가능하게 할 것이다. 바이러스 입자가 세포와 접촉할 때, 그 안에 함유된 핵산을 세포로 옮길 수 있는 경우, 본 발명의 의미에서 바이러스 입자는 "감염성"이다.
본 발명의 바람직한 세포주는 M9로 지칭되는 HEK293 유래 세포주이다. 이러한 세포주는 2017년 8월 9일에 영국, 솔즈베리 SP4 0JG, 포튼 다운, 배양물 수집소, 영국 공중 보건국(Public Health England, Culture Collections, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, United Kingdom)의 유럽 인증된 세포 배양물 수집소(European Collection of Authenticated Cell Cultures; ECACC)에 수탁 번호 17080901하에 기탁되었다. 기탁은 나우스콤(Nouscom) AG(스위스 CH-4051 바젤 바움링가세 18 소재(B
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umleingasse 18, Basel, CH-4051, Switzerland))를 대신하여 이루어졌다. 세포주는 조기 계대 인간 배아 신장 세포주 (호모사피엔스(Homo Sapiens))로부터 유래된다.
실시양태
하기에 본 발명의 상이한 양태가 더 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각각의 양태는 달리 명확하게 지시되지 않는 한 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직한 것 또는 유익한 것으로 나타낸 임의의 특징은 바람직한 것 또는 유익한 것으로 나타낸 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본 발명으로 이끄는 연구에서, 양호한 아데노바이러스 벡터 생산성이 본 발명에 따른 세포주에 의해 달성될 수 있다는 것이 놀랍게도 나타났다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 세포주로서, 테트라카이클린 억제인자(TetR)가 세포 또는 부분적 세포 프로모터의 제어 하에서 발현되는 것인 세포주를 제공한다. 본 발명은 또한 세포주로서, 테트라사이클린 억제인자(TetR)가 세포주의 세포의 적어도 70%로 발현되는 것인 세포주를 제공한다. 바람직하게는, 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 세포주(들) 내의 세포가 Tet-R을 발현한다. Tet-R을 발현하는 세포주(들) 내의 세포의 백분율은 단백질 또는 mRNA의 형광 염색 및 FACS 분석을 포함하는 당해 분야의 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
세포 당 유전자 발현의 수준은 정량적 폴리머라제 사슬 반응(quantitative polymerase chain reaction; QPCR), 바람직하게는 단일 세포 QPCR에 의해 측정될 수 있다. 정량적 폴리머라제 사슬 반응은 당해 분야 기술자에게 공지된 방법이다. 참고로, 문헌[Applied Biosystems QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System - Publication Part Number 4470050 Rev. A Revision Date March 2012]을 참조한다.
본 발명의 첫 번째 양태의 바람직한 실시양태에서, Tet-R은 적어도 103 단백질 분자/세포, 바람직하게는 적어도 104 단백질 분자/세포, 바람직하게는 적어도 105 단백질 분자/세포, 바람직하게는 적어도 106 단백질 분자/세포, 더욱 바람직하게는 적어도 107 단백질 분자/세포, 예컨대 103 내지 106, 104 내지 105 단백질 분자/세포의 수준으로 Tet-R 단백질을 발현하는 세포주의 세포에서 발현된다. 상응하게, Tet-R 단백질을 발현하는 세포주가 세포 당 103 내지 106, 더욱 바람직하게는 104 내지 105 mRNA 카피를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 첫 번째 양태의 바람직한 실시양태에서, 세포주는 이의 게놈에 안정적으로 통합된 테트라사이클린 억제인자(Tet-R)를 암호화하는 유전자를 포함한다. 바람직하게는, Tet-R을 암호화하는 유전자는 Tet-R을 발현하는 세포로만 안정적으로 통합된다. 바람직하게는, Tet-R을 암호화하는 유전자는 세포주의 세포의 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80% 또는 85%에 안정적으로 통합된다. 더욱 바람직하게는, 세포주 내 세포의 적어도 90%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 97%가 이의 게놈에 안정적으로 통합된 Tet-R을 암호화하는 유전자를 포함한다.
본 발명의 첫 번째 양태의 바람직한 실시양태에서, Tet-R의 발현은 시간에 따라 안정하다. 본 발명의 맥락에서 "시간"은 세포주의 세포 계대 수로 정의될 수 있다. 거기서, 10 계대는 약 30 내지 70일, 바람직하게는 40 내지 60일 및 더욱 바람직하게는 약 50일에 해당한다. 10일의 이러한 시간 프레임 내에서, 5 계대는 15 내지 35일, 바람직하게는 20 내지 30일 및 더욱 바람직하게는 25일에 해당할 수 있으나 꼭 그럴 필요는 없다. 10일의 시간 프레임 내에서, 1 계대는 3 내지 7일, 바람직하게는 4 내지 6일 및 더욱 바람직하게는 5일에 해당할 수 있으나 꼭 그럴 필요는 없다. 바람직하게는, 시간에 따른 안정은 적어도 40(또는 40 초과)계대 동안, 적어도 45(또는 45초과)계대 동안, 적어도 50(또는 50 초과)계대 동안, 적어도 60(또는 60초과)계대 동안 또는 적어도 75(또는 75 초과)계대 동안 안정함을 의미한다. 이 모든 실시양태에 대해서, 발현은 바람직하게는 100 계대 이하 동안 안정하다. 해당 일수는 상기 10, 5 및/또는 1일에 대하여 주어진 정의를 사용하여 이들 및 임의의 다른 계대 수에 대해 계산될 수 있다. 예를 들어, 40 계대는 120 내지 280일, 바람직하게는 160 내지 240일, 더욱 바람직하게는 200일에 해당하고; 45 계대는 135 내지 315일, 바람직하게는 180 내지 270일 및 더욱 바람직하게는 225일에 해당하고; 50 계대는 150 내지 350일, 바람직하게는 200 내지 300일 및 더욱 바람직하게는 250일에 해당하고; 60 계대는 180 내지 420일, 바람직하게는 240 내지 360일 및 더욱 바람직하게는 300일에 해당하고; 75 계대는 225 내지 525일, 바람직하게는 300 내지 450일 및 더욱 바람직하게는 375일에 해당하고; 100 계대는 300 내지 700일, 바람직하게는 400 내지 600일 및 더욱 바람직하게는 500일에 해당한다. 상한 실시양태는 그들의 우선 순위에 따라 하한과 조합된다. "시간"은 또한 계대와 독립적으로 일 수에 의해서만 정의될 수 있다. 이 경우, 계대 수와 관련하여 주어진 상기 범위는 실시양태로 적용된다(예를 들어, "120 내지 280일"은 "적어도 120 내지 280일"의 실시양태를 지칭하고, 이는 임의의 계대 수로 한정되지 않는다, 즉, 이는 40 계대 미만 또는 이상일 수 있고; 바람직한 범위는 이후 바람직한 실시양태를 대표한다). "안정한"은 본원에서 계대 10 내지 20 동안 평균 발현 수준의 50 %이하, 바람직하게는 25 %이하, 및 더욱 바람직하게는 10 %이하의 감소의 증가를 의미한다. 본 발명의 첫 번째 양태의 바람직한 실시양태에서, Tet-R은 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유사체의 존재 또는 부재하에 유전자의 프로모터 내에 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)를 포함하는 유전자의 전사를 억제한다. 예를 들어, 프로모터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 TetO를 포함한다.
본 발명의 첫 번째 양태의 바람직한 실시양태에서, Tet-R 유전자는 구성적 프로모터(constitutive promoter)의 제어 하에 있다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 구성적 프로모터는 EF1 알파 프로모터, PGK-1 프로모터, 유비퀴틴 B 프로모터, β-액틴 프로모터, EGR1 프로모터, HCMV 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 마우스 CMV 프로모터, CASI 프로모터 및 CAG 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, Tet-R 유전자는 CAG 프로모터의 제어 하에 있다. 프로모터는 바람직하게는 세포 또는 부분적 세포 프로모터이다. 세포 프로모터는 바람직하게는 진핵세포의 프로모터이다. 바람직하게는, 프로모터는 세포 프로모터 또는 부분적 세포 프로모터이다. 세포 프로모터의 예는 쥐, 랫트, 토끼, 기니 피그, 닭 및 특히 인간 프로모터이다. "부분적 세포 프로모터"는 하나 이상의 세포 프로모터(들)의 일부(들) 및 하나 이상의 비세포 프로모터(들)의 일부(들)를 포함하는 하이브리드 프로모터이다. 비세포 프로모터는 바람직하게는 바이러스 프로모터이다. 세포 및 비세포 부분은 프로모터 활성(관심 암호화 서열의 전사를 초래하는 활성)을 갖는 융합이다. 바람직한 세포 프로모터는 EF1 알파 프로모터, PGK-1 프로모터, 유비퀴틴 B 프로모터, β-액틴 프로모터 및 EGR1 프로모터이다. 바람직한 부분적 세포 프로모터는 CASI 프로모터(부분적 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 및 부분적 닭) 및 CAG 프로모터이다. CAG 프로모터(실시예의 M9 세포에서 사용되는 프로모터)가 가장 바람직하다. CAG 프로모터는 (C) 사이토메갈로바이러스 조기 인핸서(enhancer) 요소, (A) 프로모터, 닭 베타 엑틴 유전자의 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론, 및 (G) 토끼 베타 글로빈 유전자의 스플라이스(splice) 수용체를 포함한다.
Tet-R에 의해 억제될 수 있는, 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)를 포함하는 프로모터는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 세포, 부분적 세포, 바이러스 또는 부분적 바이러스(바이러스 프로모터의 일부 및 비바이러스 프로모터의 일부를 포함하는 하이브리드 프로모터) 프로모터일 수 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, Tet-R을 암호화하는 유전자는 진핵 (바람직하게는 포유동물)세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 본원에서, 용어 "코돈 최적화된"은 진핵(바람직하게는 포유동물) 세포에서의 발현을 위해 진핵(바람직하게는 포유동물) 세포에서 낮은 빈도를 갖는 코돈을, 동일한 아미노산으로 번역되지만 진핵(바람직하게는 포유동물) 세포에서 높은 빈도를 갖는 코돈으로 대체함으로써 번역 효율이 증가된 것을 의미한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 세포주는 추가로 이의 게놈 내에, 하나 이상의 IFN 유전자의 자극인자(stimulator), 바람직하게는 cGas 및 STING, 하나 이상의 JAK/STAT 전사 활성인자(activator) 및 하나 이상의 IFN-자극된 유전자(ISG), 바람직하게는 PKR, MX1, OAS1, APOBEC3G, TRIM5, ZAP, ISG15, ADAR, IFITM1/2/3, BST2, 및/또는 RSAD2로 이루어진 군으로부터 선택된 기능성 단백질의 발현을 감소시키거나 예방하는 돌연변이, 결실 또는 삽입을 추가로 포함한다.
본 발명의 첫 번째 실시양태의 바람직한 실시양태에서, 세포주는 선별 마커(selection marker)를 암호화하는 유전자를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 내성 유전자는 Tet-R을 암호화하는 유전자와 유전적으로 연결되어있다. 바람직한 실시양태에서, 선별 마커를 암호화하는 유전자는 Tet-R을 암호화하는 유전자에 유전적으로 연결된 G418, 하이그로마이신(hygromycin) B, 퓨로마이신(puromycin), 블라스티시딘(blasticidin), 또는 제오신(zeocin) 내성 유전자로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 선별 마커를 암호화하는 유전자는 Tet-R을 암호화하는 유전자에 유전적으로 연결된 G418 내성 유전자이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 세포주는 감염성 바이러스 입자의 형성을 위해 필요한 적어도 하나의 바이러스 유전자를 발현한다. 더욱 바람직하게는, 세포주가 재조합 아데노바이러스의 생산에 사용되는 경우, 적어도 하나의 바이러스 유전자는 E1 영역에서 암호화된 E1-A 및/또는 E1-B이다. 예를 들어, E1 영역은 인간 아데노바이러스 또는 유인원 아데노바이러스, 예를 들어 침팬지 Ad, 보노보(Bonobo) Ad, 또는 고릴라 Ad로부터 유래될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포주는 이의 게놈내에 서열번호 1 또는 2로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 동일한 E1-A 및/또는 E1-B 단백질을 암호화하는 이의 변이체를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 세포주의 세포는 형질전환된 세포이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 세포주의 세포는 인간 세포이다. 더욱 바람직하게는, 세포주의 세포는 인간 배아 신장 세포이다.
바람직한 실시양태에서, 세포주의 세포는 HEK293 세포, A549 세포, HeLa 세포, MRC5 세포, VERO 세포, DF-1 세포 또는 SK-OV-3 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 세포주는 ECACC에 수탁번호 1708091하에 기탁된 세포주이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 세포주는 감염성 바이러스 입자로 조립될 수 있는 바이러스 게놈을 추가로 포함하고 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)를 포함하는 프로모터의 제어 하에 적어도 하나의 이종 유전자를 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 바이러스 게놈은 헤르페스 바이러스 게놈, 개질된 백시니아 안카라(vaccinia Ankara) 게놈 및 아데노바이러스 게놈으로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈이다. 헤르페스 바이러스 게놈의 예는 HSV-1이다.
바람직한 실시양태에서, 이종 유전자는 세포에 독성이거나 바이러스 복제 사이클을 방해한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 이종 유전자는 자가 항원, 바이러스 유전자, 세포 기원의 유전자, 종양 관련 신생 항원의 조합을 암호화하는 합성 스트링(string) 및 신생 에피토프(neo-epitope)를 암호화하는 스트링으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 자가 항원은 HER2/neu, CEA, 헵캠(Hepcam), PSA, PSMA, 텔로머라제(Telomerase), gplOO, 멜란(Melan)-A/MART-1, Muc-1, NY-ES0-1, 서바이빈(Survivin), 스트로멜리신(Stromelysin) 3, 티로시나제(Tyrosinase), MAGE3, CML6S, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NYC0-5S, NY-BR-62, hKLP2 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 바이러스 유전자는 HCV E1-E2 단백질, 광견병(rabies) 당단백질, 및 HIV-1 GP 160으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 세포 기원의 유전자는 Tim-3, Her2 및 E2 F-1으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 두 번째 양태는 바이러스 입자를 생산하기 위한 본 발명의 첫 번째 양태에 따르는 세포주의 용도를 제공한다.
본 발명의 세 번째 양태는 하기의 단계를 포함하는 감염성 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공한다:
(i) 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유사체의 존재 또는 부재 하에서 시험관내에서 감염성 바이러스 입자로 조립될 수 있는 바이러스 게놈을 추가로 포함하는 본 발명의 첫 번째 양태의 세포주의 세포를 성장시키는 단계; 또는
(ii) 본 발명의 첫 번째 양태의 세포주의 세포를 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터로 감염시키는 단계; 및
(iii) 바이러스 입자를 회수하는 단계.
본 발명의 세 번째 실시양태의 바람직한 실시양태에서, 성장 단계 (i)은 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유사체가 부재하다.
본 발명은 특히 하기의 항목에 관한 것이다:
1. 테트라사이클린 억제인자(Tet-R)가 세포주의 세포의 적어도 70%에서 발현되는, 세포주.
2. 제1항목에 있어서, Tet-R이 세포당 적어도 1000 mRNA 카피 또는 Tet-R 단백질 분자의 수준으로 Tet-R을 발현하는 세포주의 세포에서 발현되는 것인, 세포주.
3. 제1항목 또는 제2항목에 있어서, 이의 게놈에 안정적으로 통합된 테트라사이클린 억제인자(Tet-R)를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포주.
4. 제1항목 내지 제3항목 중 어느 한 항목에 있어서,
(i) Tet-R이 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유사체의 존재 또는 부재 하에 유전자의 프로모터 내에 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)를 포함하는 유전자의 전사를 억제하고/하거나
(ii) Tet-R 유전자가 구성적 프로모터의 제어 하에 있고, 바람직하게는 구성적 프로모터가 EF1 알파 프로모터, PGK-1 프로모터, 유비퀴틴 B 프로모터, β-액틴 프로모터, EGR1 프로모터, HCMV 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 마우스 CMV 프로모터, CASI 프로모터 및 CAG 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 구성적 프로모터가 CAG 프로모터인 것인, 세포주.
5. 제1항목 내지 제4항목 중 어느 한 항목에 있어서, Tet-R을 암호화하는 유전자가 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 세포주.
6. 제1항목 내지 제5항목 중 어느 한 항목에 있어서, 이의 게놈 내에, 하나 이상의 IFN 유전자의 자극인자, 바람직하게는 cGas 및 STING, 하나 이상의 JAK/STAT 전사 활성인자 및 하나 이상의 IFN-자극된 유전자(ISG), 바람직하게는 PKR, MX1, OAS1, APOBEC3G, TRIM5, ZAP, ISG15, ADAR, IFITM1/2/3, BST2, 및/또는 RSAD2로 이루어진 군으로부터 선택된 기능성 단백질의 발현을 감소시키거나 예방하는 돌연변이, 결실 또는 삽입을 추가로 포함하는, 세포주.
7. 제1항목 내지 제6항목 중 어느 한 항목에 있어서, Tet-R을 암호화하는 유전자에 대해 유전적으로 연결된 선별 마커, 바람직하게는 G418, 하이그로마이신 B, 퓨로마이신, 블라스티시딘, 또는 제오신 내성 유전자를 암호화하는 유전자를 추가로 포함하는, 세포주.
8. 제1항목 내지 제7항목 중 어느 한 항목에 있어서, 세포주의 세포가 감염성 바이러스 입자의 형성에 필요한 적어도 하나의 바이러스 유전자를 발현하고, 바람직하게는 적어도 하나의 바이러스 유전자가 바람직하게는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자를 포함하는, E1으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 세포주.
9. 제1항목 내지 제8항목 중 어느 한 항목에 있어서, 세포주의 세포가 인간 세포, 바람직하게는 인간 배아 신장 세포인, 세포주.
10. 제8항목 또는 제9항목에 있어서, 세포주의 세포가 HEK293 세포, A549 세포, HeLa 세포, MRC5 세포, VERO 세포, DF-1 세포 또는 SK-OV-3 세포인, 세포주.
11. 제1항목 내지 제10항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세포주가 ECACC에 수탁번호 17080901하에 기탁되어있는, 세포주.
12. 제1항목 내지 제11항목 중 어느 한 항목에 있어서, 감염성 바이러스 입자로 조립될 수 있는 바이러스 게놈을 추가로 포함하고 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)를 포함하는 프로모터의 제어 하에서 적어도 하나의 이종 유전자를 포함하는 세포주로서, 바람직하게는
(i) 바이러스 게놈이 헤르페스 바이러스 게놈, 개질된 백시니아 안카라 게놈 및 아데노바이러스 게놈으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는, 바이러스 게놈이 아데노바이러스 게놈이고/이거나;
(ii) 이종 유전자가 세포에 독성인, 세포주.
13. 제12항목에 있어서, 이종 유전자가 자가 항원, 바이러스 유전자, 세포 기원의 유전자, 종양 관련 신생 항원의 조합을 암호화하는 합성 스트링 및 신생 에피토프를 암호화하는 스트링으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포주로서, 바람직하게는
(i) 자가 항원이 HER2/neu, CEA, 헵캠(Hepcam), PSA, PSMA, 텔로머라제, gplOO, 멜란(Melan)-A/MART-1, Muc-1, NY-ES0-1, 서바이빈, 스트로멜리신 3, 티로시나제, MAGE3, CML6S, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NYC0-5S, NY-BR-62, hKLP2 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택되고/되거나;
(ii) 바이러스 유전자가 HCV E1-E2 단백질, 광견병 당단백질, 및 HIV-1 GP 160으로 구성된 군으로부터 선택되고/되거나;
(iii) 세포 기원의 유전자가 Tim-3, Her2 및 E2 F-1으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 세포주.
14. 감염성 바이러스 입자를 생산하기 위한, 제1항목 내지 제13항목 중 어느 한 항목에 따르는 세포주의 용도.
15. 하기의 단계를 포함하는, 감염성 바이러스 입자를 생산하기 위한 방법:
(i) 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유사체의 존재 또는 부재 하에서 제12항목 또는 제13항목의 세포주의 세포를 시험관내에서 성장시키는 단계; 또는
(ii) 제1항목 내지 제11항목 중 어느 한 항목의 세포주의 세포를 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터로 감염시키는 단계; 및
(iii) 바이러스 입자를 회수하는 단계.
실시예
실시예 1: TetR을 발현하는 안정한 클론의 생성
HEK 293 세포를 DMEM, 10% 소 태아 혈청에 배양하였고 확장시켰다. 계대 30에서 세포를 T-75 세포 배양 플라스크에 플레이팅(plating)하였고 BsaX1에 의해 분해된 24 ㎍의 플라스미드 pneo/CAG-TetR로 형질감염시켰다. pneo/CAG-TetR은 테트라사이클린 억제인자 및 G418-내성 유전자에 대한 발현 카세트를 함유한다(도 1). 형질감염 후 48시간 째에, HEK 293 세포를 0.8 mg/ml의 G-418이 보충된 완전 DMEM에서 1:80의 비로 희석시켰다. G-418에 내성이 있는 단일의 단리된 클론을 표준 과정을 사용하여 선택하였고 24-웰 플레이트(well plate)에 옮겼다. 각각의 24-웰 플레이트를 사용하여 3개의 플레이트를 생성하였다: 그들 중 2개는 단일 클론의 스크리닝을 위해 사용하였고, 세 번째는 "마스터 플레이트"로 유지시켰다. 모든 클론을 1 ㎍/ml의 테트라사이클린의 존재 또는 부재 하에서 ChAdE TetOSeap로 2회 형질도입시켰다. 감염 후 48시간 째에 상청액을 제조업자의 설명서에 따라 화학발광(chemiluminescence) 분석(Phospha-Light kit, Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재(Foster City, CA))을 사용하여 분비된 알칼린 포스파타제 발현에 대해 평가하였다. 테트라사이클린의 존재/부재 하에 SEAP 발현 비를 계산하여 클론에 순위를 매겼다. 값은 전사 제어의 엄격성(stringency)의 측정값을 나타낸다: 값이 높을 수록 전사 제어가 더 엄격하다. 또한 최고의 클론을 아데노바이러스 벡터의 생산성에 대해 평가하였다. M9 클론이 사이클론 억제인자를 통한 발현을 제어하는 데 있어서 뿐만 아니라 아데노바이러스 벡터 생산의 높은 수준을 뒷받침하는 데 있어서 매우 효율적인 것으로 나타났다.
실시예 2: SeAp 분석에 의한 TetR 조절의 평가 - 클론 M9 및 M38의 비교
클론 M9 및 M38을 T25 플라스크에 3회 씨딩하였다. 세포 단일층이 80 내지 90%의 컨플루언스(confluence)(약 3E+06 세포/플라스크)에 도달하는 경우 하기와 같이 감염되었다. 컨디셔닝된 배지(conditioned medium)를 흡입하였고 5 ml의 신선 배지로 교체하였다. 세포를 이후 테트라사이클린(1 ㎍/ml)의 존재 하에 또는 부재 하에 30 입자/세포(vp/cell)의 감염 다중도(moi)를 사용하여 ChAdE TetOSeap로 감염시켰다. SeAp 발현을 플라스크당 50 ㎕의 상청액을 시험하여 감염 후 2일 째에 평가하였다. 각 플라스크로부터 수집된 상청액을 96-웰 플레이트의 웰 내로 옮겨서(50 ㎕/웰) 제조업자의 설명서에 따라 화학발광 분석(Phospha-Light kit, Applied Biosystems, 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에 의해 알칼린 포스파타제 활성에 대해 시험하였다. 신호를 Envision 2012 Multilabel 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 획득하였다. 전사 제어의 효율을 도 2에 기록된 바와 같이 테트라사이클린의 존재 및 부재 하에 수득된 SeAp 발현 값의 비를 계산하여 평가하였다. 테트라사이클린(Tet)의 존재 하의 SeAp 발현은 두 개의 클론에서 필적하며, 이는 전사 제어의 부재 시 M9에서 뿐만 아니라 M38 세포에서 HCMV 프로모터가 완전히 활성이라는 것을 나타낸다. 대조적으로, Tet가 배지에 존재하지 않고 TeR이 활성이며 프로모터에 결합한 경우, SeAP 활성은 M9 클론에서 약 5배 낮으며, 이는 M38과 비교하여 HCMV 프로모터의 더 강한 억제를 나타낸다.
실시예 3: M9 및 M38 세포에서의 아데노벡터 생산성의 평가
M9 및 M38 클론을 T25 플라스크에 2회 씨딩하였다. 세포가 80 내지 90% 컨플루언스에 도달하는 경우 100 vp/세포의 moi를 사용하여 AdTetOE1/F78E2p7로 감염시켰다. AdTetOE1/F78E2p7은 HEK293 세포에서 발현되는 경우 독성인 유전자를 운반하는 아데노바이러스 벡터이므로, 전사 제어 없이는 번식할 수 없다. HEK 293 세포를 대조군으로서 동시에 감염시켰다. 현미경에 의해 완전한 세포변성 효과가 보이는 경우(감염 후 4일 째), 세포 및 배지를 각 플라스크로부터 수확하였고 -80℃에서 동결시켰다. 3회의 냉동/해동(-80℃/37℃) 사이클에 의해 감염된 세포로부터 바이러스 벡터를 방출시켰다. 이후, 세포 용해물을 원심분리에 의해 정화시켰다. 아데노벡터 게놈 내에 존재하는 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터(HCMVp)의 특이적인 표적 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머 및 이중표지된 형광 탐침(FAM-TAMRA)과 함께 TaqMan 리포터-퀀처(reporter-quencher) 염료 화학(Biorad QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System)을 사용하는 소적(droplet) 디지털 폴리머라제 사슬 반응에 의해 정화된 상청액을 분석하였다. 바이러스 수율을 조 용해물에서 평가하였고 vp/세포로 특이적인 생산성으로서 표현하였다. 결과(도 3)는 클론 M9가 M38에 비해 더 높은 생산성을 가진다는 것과 모 HEK293 세포가 독성 유전자를 발현하는 아데노벡터의 생산을 뒷받침할 수 없는 것을 나타냈다. M9 세포에 의해 나타난 더 높은 생산성은 M38과 비교하여 M9의 더 우수한 전사 제어를 입증하는 도 2에 나타낸 결과와 일치한다. 추가로, HEK 293 세포는 독성 유전자를 발현하는 아데노바이러스 벡터의 복제를 뒷받침할 수 없다.
실시예 4: M9 및 M38 세포에서의 TetR 단백질 발현
클론 M9 및 M38에서 TetR의 생산을 세포 용해물을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 세포 단백질을 M9 및 M38 클론으로부터 추출하였고 소 혈청 알부민(BSA)로 만든 표준 곡선으로 Bio-Rad Protein Assay를 사용하여 정량화하였다. 45㎍의 단백질 추출물을 SDS 함유 로딩 완충제(loading buffer)의 존재 하에 100℃에서 변성시켰고 4 내지 12% Bis-Tris NuPAGE® 겔 상에 로딩시켰다. 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮겼고 1:1000으로 희석된 TetR 단일클론 항체(Clontech, cat. n° 631131)와 함께 인큐베이션하였다. 신호는 막을 1:3000으로 희석된 HRP(SIGMA, cat A9044)로 접합된 항-마우스 2차 항체와 함께 인큐베이션함으로써 나타났다. 도 4에 나타낸 바와 같이, TetR의 발현은 M38 세포에서 보다 M9에서 더 높았다.
실시예 5: M9 세포에서의 ChAd 벡터의 구제 효율
아데노바이러스 벡터 생산을 뒷받침하는데 있어서 M9 세포의 효율을 추가로 평가하기 위해, 본 발명자들은 DNA 형질감염에 의해 종 C 및 E 아데노바이러스 벡터의 구제 효율에 대해 모 HEK293과 비교하여 시험하였다(ChAdN13 TPA4-T1Poly - 도 5a 및 ChAdE egfp - 도 5b). 제조업자의 설명서에 따라 Lipofectamine® 2000 (Thermo Fisher Scientific cat. N° 11668-019)를 사용하여 M9 및 HEK293 세포를 T25 플라스크에서 배양하여 10 ㎍의 preAd 플라스미드 DNA와 동시에 형질감염시켰다. 아데노바이러스 벡터 구제 및 증폭을 형질감염 후 12일 째에 세포 용해물 상에서 QPCR에 의해 평가하였다. 분석에 사용된 프라이머는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터의 특이적인 표적 영역을 증폭하도록 설계되었고, 이중표지된 형광 탐침(FAM-TAMRA)을 앰플리콘 내에서 혼성화한다. 결과는 도 5에 나타나있고 종 C 및 종 E 아데노바이러스 벡터 둘다에 대해 형질감염 시 M9세포에서 아데노바이러스 벡터 생산의 더 높은 효율을 입증한다.
실시예 6: ChAd C-비너스 및 ChAd E-EGFP 벡터의 생산성
리포터 유전자를 운반하는 두 개의 상이한 침팬지 Ad 벡터- ChAdC-비너스 (도 6a) 및 ChAdE-EGFP (도 6b)의 생산성을 모 HEK 293 및 293T 세포와 비교하여 M9 세포에서 평가하였다. T25 플라스크 내 세포의 단일층을 ChAd 둘 모두에 대해 동일한 감염 다중도를 사용하여 감염시켰다. 완전한 세포변성 효과가 명백한 경우, 세포를 감염 후 72시간 째에 수확하였다. 3회의 냉동/해동(-80℃/37℃) 사이클에 의해 감염된 세포로부터 벡터를 방출시켰다. 이후 세포 용해물을 원심분리에 의해 정화하였고 벡터 역가(titer)를 정화된 세포 용해물에서 Real Time QPCR 에 의해 평가하였다. 사용된 프라이머는 아데노 게놈에 존재하는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 특이적인 표적 영역을 증폭하도록 설계되었다. 이중표지된 형광 탐침(FAM-TAMRA)을 앰플리콘 내에서 혼성화한다. 결과는 도 6에 나타나있다.
실시예 7: M9 및 T-Rex 세포에서의 전사 제어의 동종성 평가 - FACS 분석에 의한 단일 세포 수준에서의 비너스 리포터 유전자 발현.
세포주 내 전사 제어의 동종성은 아데노바이러스 벡터 생산 공정을 통해 발현을 제어하도록 설계된 세포주의 중요한 특징이다. 생산을 위해 사용된 세포주 내 단일 세포 수준에서의 이종 발현은 전사를 효율적으로 억제하지 않는 세포의 아집단(subpopulation)에서 재배열된 벡터 종의 선별을 초래할 수 있다. 전사 제어의 동종성을 Tet-R을 발현하는 상업적으로 이용가능한 T-Rex 세포 (Invitrogen, lot n° 1804535)와 비교하여 M9 세포에서 평가하였다. 세포를 T25 플라스크에서 씨딩하였고 moi=100 vp/세포를 사용하여 ChAdC-비너스로 감염시켰다. 감염 후 2일 째에, 플라스크로부터 세포를 떼어내었고 PBS 1X로 세척하였고 원심분리에의해 회수하였다. 세포 펠렛을 1.5E+06 세포/ml의 최종 세포 농도에서 1% 포름알데하이드, 2.5 mM EDTA 함유 PBS 1X에서 재현탁시켰다. 200 ㎕의 세포 현탁액(총 ~ 3e5 세포)를 96-웰 플레이트의 웰에 옮겼고 FACS에 의해 분석하였다. 도 7에 보고된 FACS 분석의 결과는 형광 신호가 M9 세포주의 3.8%에서 검출된 반면, T-Rex 세포의 26%가 양성으로 나타났다. 이러한 결과는 T-Rex(74%)와 비교하여 발현을 제어할 수 있는 더 높은 %의 세포(96.2%)로 M9 세포주가 더 동종이라는 것을 입증하였다.
실시예 8: M9 및 T-Rex 세포주에서의 ChAd 벡터 생산성.
T-REX 세포(Invitrogen, lot n° 1804535)와 비교하여 M9 세포에서 아데노바이러스 벡터의 세포 특이적 및 용적 생산성을 비교하기 위해, 세포주를 T25 플라스크에 씨딩하였다. 컨플루언스 근처에서 세포 단일층을 100 vp/세포의 moi를 사용하여 ChAdC-비너스로 감염시켰다. 현미경 관찰에 의해 완전한 CPE가 명백한 경우 세포를 수확하였다(감염 후 7일 째). 이후 벡터 생산성을 HCMV 프로모터의 서열 상에서 설계된 프라이머로 Real Time QPCR에 의해 측정하였고 이중 표지된 형광 탐침(FAM-TAMRA)을 앰플리콘 내에서 혼성화한다. 도 8에서의 결과는 T-Rex에서 보다 M9 세포에서 ChAdC-비너스의 더 높은 생산성을 나타냈다.
실시예 9: 웨스턴 블로팅에 의한 HCMV-TetR 및 M9 세포에서의 TetR 발현 분석.
세포 펠렛을 20 mM TRIS-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 10% Triton-X, Protease Inhibitor cocktail Roche cat. 11697498001에서 30분 동안 4℃에서 재현탁시켜 각 샘플의 3E+06 세포(도 10 참조)를 용해하였다. 인큐베이션 후, 정화를 위해 샘플을 4℃에서 30분 동안 14000 rpm으로 원심분리하였다. 총 단백질 농도를 제조업자의 설명서에 따라 Bio-Rad 단백질 분석에 의해 평가하였고 이후 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
45㎍의 단백질 추출물을 환원 조건 하에 4 내지 12% SDS-PAGE 상에서 분리하였고 이후 Dry Blot (iBlot Gel Transfer system, Invitrogen)에 의해 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 단백질을 옮긴 후, 막을 차단 완충제(PBS-Tween 0.1% 중 우유 5%)로 1시간 동안 실온에서 처리하였고 12시간 동안 +4℃에서 1:1000으로 희석된 항-TetR 단일클론 항체(클론 9G9 - Clontech Cat. N. # 631132)와 함께 인큐베이션하였다. 그 다음날, 막을 HRP-접합 토끼 항-마우스 IgG(SIGMA, cat. n. A9044)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후 제조업자 프로토콜에 따라 Pierce ECL 웨스턴 블롯팅 기질(Thermo Scientific, 미국 일리노이주, 록포드 소재)로 가시화하였다. 항-튜불린 항체를 대조군으로 사용하였고 결과를 정규화하였다. 도 10에 나타낸 결과는 HCMV 프로모터에 의해 유도된 TetR의 발현이 시간에 따라 감소한다는 것을 입증하며 이는 샘플 HEK293 p40 - hCMV TetR과 TetR 신호의 강한 감소를 나타내는 HEK293 p60 - hCMV TetR 사이의 비교에 의해 나타내졌다. 대조적으로, CAG 프로모터에 의해 유도된 TetR의 발현은 시간에 따라 감소하지 않았다.
실시예 10: HEK293 p60 - hCMV TetR 세포를 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제에 노출시킴에 의한 TetR 발현의 재활성화.
HEK293 hCMV TetR을 사일런싱시키는 HCMV의 메카니즘을 탐구하기 위해 계대 60의 세포를 HDAC 억제제의 존재 하에 배양하였다. 세포 배양 배지를 200 nM의 벨리노스타트(PXD202)로 보충한 후 도 11에 나타낸 바와 같이 상이한 시점에 수확하였다. 이전의 실시예에서 나타낸 바와 같이 TetR 발현을 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 결과는 TetR 발현이 벨리노스타트에 의해 재활성화될 수 있지만 발현에 대한 효과는 순간적일 뿐이라는 것을 명확하게 보여준다. 벨리노스타트가 더 오랜 노출 후 세포에 독성이기 때문에 그러한 재활성화는 실용적인 목적에는 적합하지 않다.
본 발명자들은 본 실험에 기반하여 hCMV-IE(바이러스 프로모터)가 DNA 메틸화와 관련되는 전사 사일런싱 하기가 더 용이하다고 추정한다. 대조적으로, CAG 프로모터(본 발명의 가장 바람직한 부분적 세포 프로모터)에 의해 유도된 TetR 발현은 세포 계대에 따라 안정하다. 본 발명자들은 이러한 놀라운 발견이 세포가 세포 또는 부분적 세포 프로모터보다 바이러스 프로모터를 사일런싱하기가 더 용이하기 때문이라고 생각한다.
기탁기관명 : 유럽 세포 배양물 수집소(ECACC)
수탁번호 : ECACC 17080901
수탁일자 : 20170809
SEQUENCE LISTING <110> Nouscom AG <120> EUKARYOTIC CELL LINE <130> IPA200292-DE <150> EP 17198339.8 <151> 2017-10-25 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4344 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360 gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420 cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480 tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540 tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600 aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc 660 tcctagccat tttgaaccac 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atctagcttt tagcttaatg accagacacc 2400 gtcctgagtg tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag cttgatctgc 2460 tggcgcagaa gtattccata gagcagctga ccacttactg gctgcagcca ggggatgatt 2520 ttgaggaggc tattagggta tatgcaaagg tggcacttag gccagattgc aagtacaaga 2580 tcagcaaact tgtaaatatc aggaattgtt gctacatttc tgggaacggg gccgaggtgg 2640 agatagatac ggaggatagg gtggccttta gatgtagcat gataaatatg tggccggggg 2700 tgcttggcat ggacggggtg gttattatga atgtaaggtt tactggcccc aattttagcg 2760 gtacggtttt cctggccaat accaacctta tcctacacgg tgtaagcttc tatgggttta 2820 acaatacctg tgtggaagcc tggaccgatg taagggttcg gggctgtgcc ttttactgct 2880 gctggaaggg ggtggtgtgt cgccccaaaa gcagggcttc aattaagaaa tgcctctttg 2940 aaaggtgtac cttgggtatc ctgtctgagg gtaactccag ggtgcgccac aatgtggcct 3000 ccgactgtgg ttgcttcatg ctagtgaaaa gcgtggctgt gattaagcat aacatggtat 3060 gtggcaactg cgaggacagg gcctctcaga tgctgacctg ctcggacggc aactgtcacc 3120 tgctgaagac cattcacgta gccagccact ctcgcaaggc ctggccagtg tttgagcata 3180 acatactgac ccgctgttcc ttgcatttgg gtaacaggag gggggtgttc ctaccttacc 3240 aatgcaattt gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc aaggtgaacc 3300 tgaacggggt gtttgacatg accatgaaga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc 3360 gcaccaggtg cagaccctgc gagtgtggcg gtaaacatat taggaaccag cctgtgatgc 3420 tggatgtgac cgaggagctg aggcccgatc acttggtgct ggcctgcacc cgcgctgagt 3480 ttggctctag cgatgaagat acagattgag gtactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggg 3540 tgggaaagaa tatataaggt gggggtctta tgtagttttg tatctgtttt gcagcagccg 3600 ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc 3660 gcatgccccc atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg ctccagcatt gatggtcgcc 3720 ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg 3780 agactgcagc ctccgccgcc gcttcagccg ctgcagccac cgcccgcggg attgtgactg 3840 actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg 3900 acaagttgac ggctcttttg gcacaattgg attctttgac ccgggaactt aatgtcgttt 3960 ctcagcagct gttggatctg cgccagcagg tttctgccct gaaggcttcc tcccctccca 4020 atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt 4080 cttgctgtct ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt 4140 cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat 4200 acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg 4260 gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt 4320 ctttcagtag caagctgatt gcca 4344 <210> 2 <211> 4273 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaggccaata tgataatgag gtgggcgggg 60 cgaggcgggg cgggtgacgt aggacgcgcg agtagggttg ggaggtgtgg cggaagtgtg 120 gcatttgcaa gtgggaggag ctgacatgca atcttccgtc gcggaaaatg tgacgttttt 180 gatgagcgcc gcctacctcc ggaagtgcca attttcgcgc gcttttcacc ggatatcgta 240 gtaattttgg gcgggaccat gtaagatttg gccattttcg cgcgaaaagt gaaacgggga 300 agtgaaaact gaataatagg gcgttagtca tagcgcgtaa tatttaccga gggccgaggg 360 actttgaccg attacgtgga ggactcgccc aggtgttttt tacgtgaatt tccgcgttcc 420 gggtcaaagt ctccgttttt attgtcgccg tcatctgacg cggagggtat ttaaacccgc 480 tgcgctccta aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc tccgctccgt 540 ttcggcgatc gaaaaatgag acatttagcc tgcactccgg gtcttttgtc cggccgggcg 600 gcgtccgagc ttttggacgc tttgctcaat gaggttctga gcgatgattt tccgtctact 660 acccacttta gcccacctac tcttcacgaa ctgtacgatc tggatgtact ggtggatgtg 720 aacgatccca acgaggaggc ggtttctacg ttttttcccg agtctgcgct tttggctgcc 780 caggagggat ttgacctaca cactccgccg ctgcctattt tagagtctcc gctgccggag 840 cccagtggta taccttatat gcctgaactg cttcccgaag tggtagacct gacctgccac 900 gagccgggct ttccgcccag cgacgatgag ggtgagcctt ttgctttaga ctatgctgag 960 atacctgggc tcggttgcag gtcttgtgca tatcatcaga gggttaccgg agaccccgag 1020 gttaagtgtt cgctgtgcta tatgaggctg acctcttcct ttatctacag taagtttttt 1080 tgtgtaggtg ggctttttgg gtaggtgggt tttgtggcag gacaggtgta aatgttgctt 1140 gtgttttttg tacctgcagg tccggtgtcc gagccagacc cggagcccga ccgcgatccc 1200 gagccggatc ccgagcctcc tcgcaggcca aggaaattac cttccatttt gtgcaagcct 1260 aagacacctg tgaggaccag cgaggcggac agcactgact ctggcacttc tacctctcct 1320 cctgaaattc acccagtggt tcctctgggt atacatagac ctgttgctgt tagagtttgc 1380 gggcgacgcc ctgcagtaga gtgcattgag gacttgctta acgatcccga gggacctttg 1440 gacttgagca ttaaacgccc taggcaataa accccaccta agtaataaac cccacctaag 1500 taataaactt taccgccctt ggttattgag atgacgccca atgtttgctt ttgaatgact 1560 tcatgtgtat aataaaagtg agtgtggtca taggtctctt gtttgtctgg gcggggttta 1620 agggtatata agtttctcgg ggctaaactt ggttacactt gaccccaatg gaggcgtggg 1680 ggtgcttgga ggagtttgcg gacgtgcgcc gtttgctgga cgagagctct agcaatacct 1740 atagtatttg gaggtatctg tggggctcta ctcaggccaa gttggtcttc agaattaagc 1800 aggattacaa gtgcgatttt gaagagcttt ttagttcctg tggtgagctt ttgcaatcct 1860 tgaatctggg ccaccaggct atcttccagg aaaaggttct ctcgactttg gatttttcca 1920 ctcccgggcg caccgccgct tgtgtggctt ttgtgtcttt tgtgcaagat aaatggagcg 1980 gggagaccca cctgagtcac ggctacgtgc tggatttcat ggcgatggct ctttggaggg 2040 cttacaacaa atggaagatt cagaaggaac tgtacggttc cgccctacgt cgtccacttc 2100 tgcagcggca ggggctgatg tttcccgacc atcgccagca tcagaatctg gaagacgagc 2160 gagcggagaa gatcagcttg agagccggcc tggaccctcc tcaggaggaa tgaatctccc 2220 gcaggtggtt gagctgtttc ccgaactgag acgggtcctg actatcaggg aggatggtca 2280 gtttgtgaag aagctgaaga gggatcgggg tgagggagat gatgaggcgg ctagcaattt 2340 agcttttagt ctgataactc gccaccgacc ggaatgtatt acctatcagc agattaagga 2400 gagttgtgcc aacgagctgg atcttttggg tcagaagtat agcatagaac agcttaccac 2460 ttactggctt cagcccgggg atgattggga agaggcgatt agggtgtatg caaaggtggc 2520 cctgcggccc gattgcaagt ataagattac taagttggtt aatattagaa actgctgcta 2580 tatttctgga aacggggccg aagtggagat agatactgag gacagggtgg ctattaggtg 2640 ttgcatgata aacatgtggc ccgggatact ggggatggat ggggtgatat ttatgaatgt 2700 gaggttcacg ggccccaact ttaatggtac ggtgttcatg ggcaacacca acttgctcct 2760 gcatggtgcg agtttctatg ggtttaacaa cacctgtata gaggcctgga ccgatgtaaa 2820 ggttcgaggt tgttcctttt atagctgttg gaaggcggtg gtgtgtcgcc ctaaaagcag 2880 gggttctgtg aagaaatgct tgtttgaaag gtgcacccta ggtatccttt ctgagggcaa 2940 ctccagggtg cgccataatg tggcttcgaa ctgcggttgc ttcatgcaag tgaagggggt 3000 gagcgttatc aagcataact cggtctgtgg aaactgcgag gatcgcgcct ctcagatgct 3060 gacctgcttt gatggcaact gtcacctgtt gaagaccatt catataagca gtcaccccag 3120 aaaggcctgg cccgtgtttg agcataacat tctgacccgc tgttccttgc atctgggggt 3180 caggaggggt atgttcctgc cttaccagtg taactttagc cacactaaaa tcctgctgga 3240 acccgagtgc atgactaagg tcagcctgaa tggtgtgttt gatgtgagtc tgaagatttg 3300 gaaggtgctg aggtatgatg agaccaggac caggtgccga ccctgcgagt gcggcggcaa 3360 gcacatgaga aatcagcctg tgatgttgga tgtgaccgag gagcttaggc ctgaccatct 3420 ggtgctggcc tgcaccaggg ccgagtttgg gtctagcgat gaggataccg attgaggtgg 3480 gtaaggtggg cgtggctagc agggtgggcg tgtataaatt gggggtctaa ggggtctctc 3540 tgtttgtctt gcaacagccg ccgccatgag cgacaccggc aacagctttg atggaagcat 3600 ctttagtccc tatctgacag tgcgcatgcc tcactgggcc ggagtgcgtc agaatgtgat 3660 gggttccaac gtggatggac gtcccgttct gccttcaaat tcgtctacta tggcctacgc 3720 gaccgtggga ggaactccgc tggacgccgc gacctccgcc gccgcctccg ccgccgccgc 3780 gaccgcgcgc agcatggcta cggaccttta cagctctttg gtggcgagca gcgcggcctc 3840 tcgcgcgtct gctcgggatg agaaactgac tgctctgctg cttaaactgg aagacttgac 3900 ccgggagctg ggtcaactga cccagcaggt ttccagcttg cgtgagagca gccttgcctc 3960 cccctaatgg cccataatat aaataaaagc cagtctgttt ggattaagca agtgtatgtt 4020 ctttatttaa ctctccgcgc gcggtaagcc cgggaccagc ggtctcggtc gtttagggtg 4080 cggtggattt tttccaacac gtggtacagg tggctctgga tgtttagata catgggcatg 4140 agtccatccc tggggtggag gtagcaccac tgcagagctt cgtgctcggg ggtggtgttg 4200 tatatgatcc agtcgtagca ggagcgctgg gcgtggtgct gaaaaatgtc cttaagcaag 4260 aggcttatag cta 4273 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tccctatcag tgatagaga 19

Claims (16)

  1. 세포주의 세포가 HEK293 세포이고, 테트라사이클린 억제인자(tetracycline repressor)(Tet-R)가 세포 또는 부분적 세포 프로모터의 제어 하에서 발현되는 것인, 세포주.
  2. 제1항에 있어서, 세포 프로모터가 진핵세포 프로모터이고 부분적 세포 프로모터가 하나 이상의 진핵세포 프로모터의 일부(들) 및 하나 이상의 비-세포, 바람직하게는 바이러스 프로모터의 일부를 포함하는 것인, 세포주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 테트라사이클린 억제인자(Tet-R)가 세포주의 적어도 90%의 세포에서 발현되는 것인, 세포주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 발현이 시간에 따라 안정한, 세포주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Tet-R이 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유사체의 존재 또는 부재 하에 유전자의 프로모터 내에 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터(Tetracycline Operator)(TetO)를 포함하는 유전자의 전사를 억제하는 것인, 세포주.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Tet-R 유전자가 구성적 프로모터(constitutive promoter)의 제어 하에 있고, 바람직하게는 구성적 프로모터가 EF1 알파 프로모터, PGK-1 프로모터, 유비퀴틴 B 프로모터, β-액틴 프로모터, EGR1 프로모터, CASI 프로모터 및 CAG 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 세포주.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Tet-R을 암호화하는 유전자가 진핵세포 내, 바람직하게는 포유동물 세포 내에서의 발현을 위해 최적화된 코돈인, 세포주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 이의 게놈 내에, 하나 이상의 IFN 유전자의 자극인자(stimulator), 바람직하게는 cGas 및 STING, 하나 이상의 JAK/STAT 전사 활성인자(activator) 및 하나 이상의 IFN-자극된 유전자(ISG), 바람직하게는 PKR, MX1, OAS1, APOBEC3G, TRIM5, ZAP, ISG15, ADAR, IFITM1/2/3, BST2, 및/또는 RSAD2로 이루어진 군으로부터 선택된 기능성 단백질의 발현을 감소시키거나 예방하는 돌연변이, 결실 또는 삽입; 및/또는
    (ii) Tet-R을 암호화하는 유전자에 대해 유전적으로 연결된 선별 마커(selection marker), 바람직하게는 G418, 하이그로마이신(hygromycin) B, 퓨로마이신(puromycin), 블라스티시딘(blasticidin), 또는 제오신(zeocin) 내성 유전자를 암호화하는 유전자;
    를 추가로 포함하는 세포주.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이의 게놈에 안정적으로 통합된 테트라사이클린 억제인자(Tet-R)를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포주.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주의 세포가 감염성 바이러스 입자의 형성에 필요한 적어도 하나의 바이러스 유전자를 발현하고, 바람직하게는 적어도 하나의 바이러스 유전자가 바람직하게는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자를 포함하는, E1으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 세포주.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 CAG 프로모터인 세포주.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 ECACC에 수탁번호 17080901하에 기탁되어 있는, 세포주.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 바이러스 입자로 조립될 수 있는 바이러스 게놈을 추가로 포함하고 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO)를 포함하는 프로모터의 제어 하에서 적어도 하나의 이종 유전자를 포함하는 세포주로서, 바람직하게는
    (i) 바이러스 게놈이 헤르페스 바이러스 게놈, 개질된 백시니아 안카라(vaccinia Ankara) 게놈 및 아데노바이러스 게놈으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는, 바이러스 게놈이 아데노바이러스 게놈이고/이거나;
    (i) 이종 유전자가 세포에 독성이거나 바이러스 복제 사이클을 방해하는 것인, 세포주.
  14. 제13항에 있어서, 이종 유전자가 자가 항원, 바이러스 유전자, 세포 기원의 유전자, 종양 관련 신생 항원의 조합을 암호화하는 합성 스트링(string) 및 신생 에피토프(neo-epitope)를 암호화하는 스트링으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포주로서, 바람직하게는
    (i) 자가 항원이 HER2/neu, CEA, 헵캠(Hepcam), PSA, PSMA, 텔로머라제(Telomerase), gplOO, 멜란(Melan)-A/MART-1, Muc-1, NY-ES0-1, 서바이빈(Survivin), 스트로멜리신(Stromelysin) 3, 티로시나제(Tyrosinase), MAGE3, CML6S, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NYC0-5S, NY-BR-62, hKLP2 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택되고/되거나;
    (ii) 바이러스 유전자가 HCV E1-E2 단백질, 광견병(rabies) 당단백질, 및 HIV-1 GP 160으로 구성된 군으로부터 선택되고/되거나;
    (iii) 세포 기원의 유전자가 Tim-3, Her2 및 E2 F-1으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 세포주.
  15. 감염성 바이러스 입자를 생산하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따르는 세포주의 용도.
  16. 하기의 단계를 포함하는, 감염성 바이러스 입자를 생산하기 위한 방법:
    (i) 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유사체의 존재 또는 부재 하에서 제13항 또는 제14항의 세포주의 세포를 시험관내에서 성장시키는 단계; 또는
    (ii) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 세포주의 세포를 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터로 감염시키는 단계; 및
    (iii) 바이러스 입자를 회수하는 단계.
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Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5464758A (en) * 1993-06-14 1995-11-07 Gossen; Manfred Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
AU746850B2 (en) * 1994-07-01 2002-05-02 Tet Systems Holding Gmbh & Co. Kg Tetracycline-regulated transcriptional modulaters
CA2244412A1 (en) * 1996-01-26 1997-07-31 Hsc Research And Development Limited Partnership Nucleic acids and proteins related to alzheimer's disease, and uses therefor
CN1880457B (zh) * 2001-10-11 2010-05-26 麦克公司 Ad6重组核酸
DE10360483B4 (de) * 2003-12-22 2007-11-15 Scil Proteins Gmbh Expressionsvektor und dessen Verwendung
PL1711518T3 (pl) * 2004-01-23 2010-06-30 St Di Richerche Di Biologia Molecolare P Angeletti S P A Nośniki szczepionek pochodzące od szympansich adenowirusów
JP2008518591A (ja) * 2004-11-02 2008-06-05 イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー 複製欠損アデノウイルスベクターの製造のためのアデノウイルスアンプリコンおよびプロデューサー細胞、その製造方法および用途
JP2008104357A (ja) 2005-02-09 2008-05-08 Banyu Pharmaceut Co Ltd ＴｅｔＲ発現非ヒトトランスジェニック動物及びその製造方法
EP1935978A4 (en) 2005-09-15 2009-01-07 Japan Science & Tech Agency METHOD FOR CONTROLLING DECOMPOSITION OF PROTEIN BY TETRACYCLIN ANTIBIOTICS
US20070122880A1 (en) * 2005-10-19 2007-05-31 Institut Curie Vector for the inducible expression of gene sequences
WO2007073513A2 (en) 2005-11-10 2007-06-28 Genvec, Inc. Method for propagating adenoviral vectors encoding inhibitory gene products
EP1969144A2 (en) * 2005-12-16 2008-09-17 The Uab Research Foundation Compositions and methods related to controlled gene expression using viral vectors
EP2294212A4 (en) * 2008-05-28 2011-09-14 Univ Oregon Health & Science METHODS OF IDENTIFYING GENE SILENT INHIBITORS IN MAMMALIAN CELLS
EP2195013B1 (en) * 2008-07-24 2011-11-02 NsGene A/S Therapeutic use of a growth factor, metrnl
AU2016244220B2 (en) * 2008-12-23 2018-05-17 Amgen Inc. Human CGRP receptor binding proteins
US8796440B2 (en) * 2009-08-31 2014-08-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Promote system for regulatable gene expression in mammalian cells
HUE030724T2 (en) * 2010-04-09 2017-06-28 Univ Utrecht Holding Bv Recombinant multimer influenza proteins
CN102311973A (zh) * 2010-07-05 2012-01-11 北京五加和分子医学研究所有限公司 一种新型miRNA和编码蛋白基因共表达载体
CN102344903B (zh) * 2010-07-29 2012-11-28 首都医科大学附属北京友谊医院 成体大鼠肝脏卵圆细胞系及其用途
US9109199B2 (en) * 2010-09-20 2015-08-18 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Methods to produce bunyavirus replicon particles
WO2012089231A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Okairòs Ag Paramyxovirus vaccines
CN102747096B (zh) * 2011-04-18 2015-04-08 中国医学科学院基础医学研究所 基因搜寻载体、随机基因突变调控方法及用途
EP2784155B1 (en) * 2011-11-24 2018-06-13 Viromed Co. Ltd. Adenovirus producing novel cell line and the use thereof
WO2014005643A1 (en) * 2012-07-05 2014-01-09 Okairos Ag Novel prime-boosting regimens involving immunogenic polypeptides encoded by polynucleotides
CN103820392A (zh) * 2012-11-18 2014-05-28 复旦大学附属华山医院 基于HepG2 HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系及其建立方法
AU2015221388A1 (en) * 2014-02-19 2016-08-04 Emergent Biosolutions Canada Inc. Methods of modulating an immune response
CN104212802B (zh) * 2014-09-25 2017-09-12 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途
GB2540786A (en) * 2015-07-28 2017-02-01 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Codon optimised tet repressor proteins
BR112018067565A2 (pt) * 2016-03-04 2019-02-05 Univ New York vetores de vírus que expressam múltiplos epítopos de antígenos associados a tumor para induzir imunidade antitumor
US11185555B2 (en) * 2016-04-11 2021-11-30 Noah James Harrison Method to kill pathogenic microbes in a patient
CN107058387B (zh) * 2017-04-13 2019-09-06 新乡医学院 一种适合hek293细胞的双顺反子表达载体及其制备方法、表达系统、应用
US20210246455A1 (en) 2017-05-16 2021-08-12 Cairn Biosciences, Inc. Multiplex assay

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