JP2002539758A

JP2002539758A - ウイルス粒子の作製のための方法及び組成物

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Publication number: JP2002539758A
Application number: JP2000549750A
Authority: JP
Inventors: トーラン，クリストフ; イエ，パトリス; ペリコデ，ミッシェル; クラッツマン，ダビッド; サルツマン，ジャン−ルー
Original assignee: アベンティスファーマソシエテアノニム; ジュノポワティック
Priority date: 1998-05-18
Filing date: 1999-05-18
Publication date: 2002-11-26
Also published as: FR2778670B1; WO1999060144A1; AU762973B2; ATE473282T1; DE69942564D1; NZ508791A; EP1078094B1; US6489142B1; AU3829399A; FR2778670A1; EP1078094A1; CA2332639A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、in vitro、ex vivo、又はin vivoでの、レトロウイルス粒子を作製するための方法及び構築物に関する。それは、核酸を細胞内に導入するための、該方法及び構築物の使用にも関する。より詳細には、本発明は、少なくともＥ１及びＥ４領域の全て又は一部についての、１つ又は複数の欠陥組換えアデノウイルス（アデノウイルス／レトロウイルスキメラベクター）に組み込まれる、レトロウイルス粒子を構成するために必要とされる遺伝要素のセット全体を含む組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、バイオテクノロジーの領域に関する。より具体的には、本発明は、
in vitro、ex vivo、in vivoにおいてレトロウイルス粒子を作製するための方法
及び構築物に関する。本発明は、核酸を細胞に導入するための、そのような方法
及び構築物の使用にも関する。

【０００２】レトロウイルスは、現在、核酸を細胞に移入するためのベクターの主要な型の
一つである。それらは、例えば、in vitroもしくはex vivo（実験的研究、制御
の研究、組換えタンパク質の産生、耐性遺伝子又は毒性遺伝子の導入）又は直接
的にin vivo（動物病理学的モデルの確立、標識又はバイオアベイラビリティの
研究、産生細胞の移植又は精製されたウイルスの注入による治療的使用）におい
て、核酸を移入するために用いられている。

【０００３】従って、これらの全ての利用のため、レトロウイルスを作製し投与するために
利用可能な効率的な方法を有することが重要である。これに関して、従来の方法
は、パッケージング細胞系の使用に基づいている。そのような細胞系は、in vit
roで構築され、レトロウイルス粒子中の欠陥レトロウイルスベクターの構築及び
パッケージングにとって必要なタンパク質の全セットを発現する。そのような細
胞系の例は、細胞系ＰＳＩＣＲＩＰ〔Danos and Mulligan,PNAS(1988)85:6460〕
、ＰＡ３１７〔Miller and Buttimore,Mol.Cell.Biol.(1986)6:2895〕、又はＧ
Ｐ＋ＥｎｖＡＭ１２〔Markowitz et al.,Virology(1988)167:400〕である。しか
し、そのような細胞系の使用は、第一にそれらの構築に関して、第二にそれらの
使用に関して、いくつかの問題を示すことがある。

【０００４】例えば、そのような細胞系は、安定、即ち遺伝子の再編成又は発現の消失を起
こすことなく、継続的にレトロウイルス機能を発現しなければならない。さらに
、そのような細胞系は、レトロウイルスの潜在的な薬理学的使用との適合性を有
しなければならず、従って、免疫原性等をほとんど又は全くもたずに培養されう
る細胞から樹立されなければならない。

【０００５】さらに、用いられる細胞系は、複製能を有するウイルス（ＲＣＶ）を含まない
、相当に高いウイルス力価を産生することが重要である。従って、パッケージン
グ細胞系を用いたレトロウイルス調製の方法は、作製されるウイルス・ストック
及び用いられる細胞系の両方に関する品質管理を必ず含む。最後に、所望の適用
によっては、これらの作製法は、高レベルの隔離の下に実施されなければならな
いこともあり、そのような方法を産業的規模に拡張することはさらに困難になる
。

【０００６】これらの欠点を解決するため、特許出願ＷＯ９５／２２６１７は、レトロウイ
ルス・パッケージング細胞の使用を回避する、レトロウイルス粒子を作製するた
めの新規な概念を提唱した。この新規な概念は、レトロウイルス粒子を構成する
ために必要な遺伝要素の全セットを細胞に導入することにより、in vitro、ex v
ivo、又は直接的にin vivoで、標的細胞をレトロウイルス産生細胞へと形質転換
することからなる。この出願は、特に、異なる起源のプラスミド構築物又はウイ
ルスベクターを用いた、これらの遺伝要素の移入を提供する。実際、フェング（
Feng）ら〔Nature Biotechnology(1997)15:866〕は、レトロウイルス遺伝要素が
正確な配置で分配されている２つの第一世代組換えアデノウイルス（即ち、Ｅ１
領域に欠損を有する）を用いた、この新規な手法の特定の実施態様を記載してい
る。

【０００７】本願は、前記のレトロウイルス粒子作製法に対するさらなる改良、及び核酸を
移入するための使用を記載する。

【０００８】本願は、特に、in vitro、ex vivo又はin vivoで、レトロウイルス粒子を構成
するために必要な遺伝要素の全セットを、細胞へ輸送するための組換えアデノウ
イルスの使用に基づいている。前述の研究と比較すると、本願は、特定の型の組
換えアデノウイルスの使用及び／又はレトロウイルス遺伝要素の特定の分配に一
部基づいている。本願において証明されるように、本発明に係る方法及び構築物
は、高レベルのレトロウイルス粒子産生を得ることを可能にし、効率的であり、
in vitro、ex vivo及びin vivoにおける高められた安全性を示す。さらに、その
ようにして作製された欠陥組換えレトロウイルスは、感染性であり、高い効率で
核酸を細胞に移入することができる。

【０００９】従って、本発明の第一の主題は、少なくともＥ１領域及びＥ４領域の全部又は
一部に欠陥を有する一つ又はいくつかの組換えアデノウイルスに組み込まれた、
レトロウイルス粒子を構成するために必要な遺伝要素の全セットを含む組成物に
関する。

【００１０】本発明に関して、「レトロウイルス粒子を構成するために必要な遺伝要素」と
いう用語は、レトロウイルス粒子、即ちレトロウイルスのエンベロープをその表
面に発現し、その内部にはレトロウイルス複製周期を行うために必要な異なるタ
ンパク質及び逆転写されうる形態のゲノムが見出される物理的粒子を構築するた
めに必要かつ充分である、シス又はトランスの、コーディング配列及び制御配列
を含む核酸配列の全セットをさす。

【００１１】レトロウイルスのゲノムの組織は充分に理解されており、主に以下の要素、す
なわち： −特に転写開始点及び転写プロモーターとして作用するレトロウイルスゲノムの
両端に位置するＬＴＲ領域。このＬＴＲ領域は、より具体的にはＵ３、Ｒ及びＵ
５と名付けられた要素を含有する（例えば図５を参照のこと）。Ｕ５配列は、Ｕ
３配列と共にプロウイルス取り込みにおいて重要な役割を果たす。 −レトロウイルス・ゲノムのウイルス粒子へのパッケージングに関与するパッケ
ージング配列（Ｐｓｉ又はψ）。該パッケージング配列は、パッケージング効率
を改善することが報告されている、ｇａｇ遺伝子のいくつかの要素にわたる領域
をさらに含有しうる。 −それぞれコアタンパク質（ｇａｇ）、酵素（逆転写酵素、プロテアーゼ、イン
テグラーゼ）及びレトロウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）をコードする、ｇａｇ
、ｐｏｌ及びｅｎｖと名付けられた３つのコーディング領域、を含む。

【００１２】組換えレトロウイルス粒子を構築するためには、シスで作用する遺伝要素、即
ちＬＴＲ領域及びパッケージング配列を含み、ｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ
のコーディング領域（トランスに作用）の全部又は一部が欠失しているレトロウ
イルスベクターが、一般的に構築される。通常、そのようなレトロウイルスベク
ターは、目的の核酸（トランスジーン）も含む。レトロウイルス粒子を再構成す
ることができるように、レトロウイルスベクター中に存在しないか又は不活型で
あるコーディング領域がトランスに提供される（相補機能）。

【００１３】従って、本発明の特定の実施態様において、遺伝要素は、レトロウイルスベク
ター及びレトロウイルス相補機能（即ち、レトロウイルスベクター中の欠陥のあ
る機能、例えばｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ）をコードする核酸を含む。

【００１４】本発明のより具体的な実施態様において、遺伝要素は、 −レトロウイルスｇａｇタンパク質をコードする核酸、 −レトロウイルスｐｏｌタンパク質をコードする核酸、 −エンベロープ・タンパク質、例えばレトロウイルスｅｎｖタンパク質をコード
する核酸、並びに −２つのＬＴＲ領域の間にレトロウイルスパッケージング配列及び目的の核酸
配列を含む核酸を含む。

【００１５】本発明を実施するため、遺伝要素は、エコトロピック（ecotropic）ウイルス
及び／又はアンフォトロピック（amphotropic）ウイルスのような異なる型のレ
トロウイルスに由来しうる。特に、これらは、オンコウイルス科、レンチウイル
ス科又はスプーマウイルス科に属するレトロウイルスでありうる。オンコウイル
ス科において、特定の例は、ＭｏＭＬＶ、ＡＬＶ、ＢＬＶ又はＭＭＴＶのような
癌遺伝子を保持しないスローオンコウイルス（slow oncoviruses）、及び例えば
ＲＳＶのようなラピッドオンコウイルス（rapid oncoviruses）を含む。レンチ
ウイルス科において、特定の例は、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ又はＣＡＥＶを含む
。

【００１６】さらに、用いられる一つ又は複数のＬＴＲ領域は、完全なレトロウイルスＬＴ
Ｒ領域、又は逆転写後の完全なＬＴＲ領域の再構成を可能にするサブドメインの
いずれかでありうる。従って、用いられるＬＴＲ領域は、例えばＵ３及びＵ５の
ようなドメインの欠失を含みうる。本発明の特定の実施態様において、レトロウ
イルス・ベクターは、Ｕ３が欠失した５′ＬＴＲ及びＵ５が欠失した３′ＬＴＲ
を含む。この型の構築物の使用は、特に、構築工程中ベクターを安定化し組み換
えのリスクを低下させることを可能にする。遺伝要素は、当業者に既知の方法に
従い単離されたレトロウイルスから直接的に調製されてもよいし、かつ／又は人
工的に合成されてもよい。そのような要素は、実施例に記載されたように、培養
物中で増幅されうる。さらに、用いられる核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡでありうる
。

【００１７】好ましい変形において、遺伝要素は、レトロウイルスのｇａｇタンパク質及び
ｐｏｌタンパク質、並びにヒト細胞の感染を可能にするエンベロープタンパク質
をコードするようなものである。さらに好ましくは、ｇａｇタンパク質及びｐｏ
ｌタンパク質は、ＭｏＭＬＶ、ＡＬＶ、ＢＬＶ、ＭＭＴＶ及びＲＳＶの中から選
択されるレトロウイルスに由来するタンパク質であり、エンベロープタンパク質
は、Ａ４０７０、ＧＡＬＶ、ＲＤ１１４、ＶＳＶ−Ｇ又は狂犬病ウイルスから選
択されるウイルスに由来するタンパク質である。保存された生物学的活性を有す
るこれらのタンパク質の異型もしくは変異体、又は特にある種の細胞型に対する
特異性を与えることにより、レトロウイルス粒子の親和性を修飾することを可能
にするキメラ・タンパク質もしくはハイブリッド・タンパク質を用いることによ
っても、本発明が実施されうることが理解される。

【００１８】従って、特定の実施態様において、エンベロープタンパク質は、レトロウイル
ス粒子のヒト細胞への感染を可能にするウイルス又は細胞のタンパク質である。
それは、好ましくは、Ａ４０７０、ＧＡＬＶ、ＲＤ１１４、ＶＳＶ−Ｇ又は狂犬
病ウイルスのようなウイルスに由来するタンパク質である。好ましいｇａｇタン
パク質及びｐｏｌタンパク質は、ＭｏＭＬＶレトロウイルス由来のものである。

【００１９】本発明の特定の実施態様によると、遺伝要素は、レンチウイルス粒子の構成を
可能にするものであり、従って少なくとも一部は特にＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ又
はＣＡＥＶのようなレンチウイルスに由来する。レンチウイルスから調製された
組換えレトロウイルスの使用は、文献に記載されており、休止細胞への遺伝子移
入のためのいくつかの利点を提供する〔Poeschia et al.,Nature Medicine(1998
)4:354〕。本発明は、改善された条件下でレンチウイルスによる遺伝子移入を達
成するため、この特性を活用することを可能にする。

【００２０】一つ又は複数のアデノウイルスにおけるレトロウイルス遺伝要素の配置は、い
くつかの方法で達成されうる。

【００２１】従って、一つの変形実施態様において、本発明は、３つの別々の組換えアデノ
ウイルスに分配された、レトロウイルス粒子を構成するために必要な遺伝要素の
全セットを含む組成物に関する。

【００２２】この特定の実施態様において、本発明に係る組成物は、例えば、ゲノムに組み
込まれた、ｇａｇ及びｐｏｌをコードする一つ又は複数の核酸を含む第一の組換
えアデノウイルス；ゲノムに組み込まれた、エンベロープタンパク質をコードす
る核酸を含む第二の組換えアデノウイルス；並びにゲノムに組み込まれた、レト
ロウイルス・ベクターを含む第三の組換えアデノウイルスを含む。

【００２３】もう一つの好ましい変形実施態様において、本発明は、２つの別々の組換えア
デノウイルスに分配された、レトロウイルス粒子を構成するために必要な遺伝要
素の全セットを含む組成物に関する。これに関して、本発明に関連した特に好ま
しい組成物は、 −ゲノムに組み込まれた、レトロウイルスタンパク質ｇａｇ及びｐｏｌをコード
する一つ又はいくつかの核酸を含む第一の組換えアデノウイルス、並びに −ゲノムに組み込まれた、既に定義されたようなエンベロープ・タンパク質をコ
ードする核酸と、２つの完全なＬＴＲ領域又は逆転写後の完全なＬＴＲの再構成
を可能にするサブドメインの間にレトロウイルス・パッケージング配列及び目的
の核酸配列を含む核酸とを含む第二の組換えアデノウイルスを含む。

【００２４】そのような組成物の使用は、図１に一般的な方法で例示されている。実施例に
おいて示されたように、レトロウイルス遺伝要素のこの特定の分配は、効率的か
つ安全にトランスジーンを目的の細胞に移入することができる高力価の感染性レ
トロウイルス粒子を得ることを可能にする。

【００２５】これに関して、本願の特定の主題は、 −ゲノムに組み込まれた、レトロウイルス・タンパク質ｇａｇ及びｐｏｌをコー
ドする一つ又はいくつかの核酸を含むことを特徴とする、あらゆる欠陥組換えア
デノウイルス、並びに −ゲノムに組み込まれた、エンベロープ・タンパク質をコードする核酸と、２つ
の完全又は不完全なＬＴＲ領域の間にレトロウイルス・パッケージング配列及び
目的の核酸配列を含む核酸とを含むことを特徴とする、あらゆる欠陥組換えアデ
ノウイルスに関する。

【００２６】特に、そのようなアデノウイルスは、例えばＥ１（Ｅ１Ａ及び／又はＥ１Ｂ）
領域、Ｅ２領域及び／又はＥ４領域の全部又は一部を欠損していてもよい。

【００２７】本発明のさらなる特定の主題は、前記のような２つのアデノウイルスを含む組
成物に関する。

【００２８】もう一つの同等に好ましい本発明の変形実施態様は、単一の組換えアデノウイ
ルスに組み込まれた、レトロウイルス粒子を構成するために必要な遺伝要素の全
セットを含む組成物に関する。

【００２９】この実施態様の特別な利点は、特に、単一のアデノウイルスの使用による単純
化された実行に基づく。

【００３０】本発明に係る組成物は、レトロウイルスベクターの構造、特にその中の欠損レ
トロウイルス遺伝子に応じて、当業者により適合させられうることが理解される
。従って、用いられるベクターは、レトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅ
ｎｖのうちの一つ、二つ又は全部に欠陥を有していてもよい。場合に応じて、本
発明の組成物におけるアデノウイルスの組成及び分配は容易に適合させられうる
。しかし、好ましい実施態様においては、レトロウイルスベクターは、実施例に
例示されたように遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖの全セットに欠陥を有してお
り、組換えレンチウイルスを産生するよう適合させられる。

【００３１】本発明の組成物において、レトロウイルスタンパク質ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎ
ｖをコードする用いられる核酸は、一般的に、コーディング領域の５′に位置す
る転写プロモーター、及びコーディング領域の３′に位置する転写ターミネータ
ーを含む。用いられるプロモーターは、様々な性質、起源及び特性を有すること
ができる。プロモーターの選択は、実際、特に所望の使用及びトランスジーンに
依存する。従って、プロモーターは、構成的であっても制御されていてもよく、
強くても弱くてもよく、遍在的であっても組織／細胞特異的であってもよく、又
はさらに生理学的状態に特異的であっても病態生理学的状態に特異的であっても
よい（細胞分化状態又は細胞周期中の段階に依存した活性）。プロモーターは、
真核生物、原核生物、ウイルス、動物、植物、人工物、又はヒト等に由来するも
のでありうる。プロモーターの特定の例は、遺伝子ＰＧＫ、ＴＫ、ＧＨ、ＥＦ１
−α、ＡＰＯ、ＣＭＶ等のプロモーター、又はｐ５３、Ｅ２Ｆ又はｃＡＭＰのプ
ロモーターのような人工的プロモーターである。

【００３２】好ましくは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖの発現を調節するプロモーターは、強
力な構成プロモーターである。さらに、プロモーターは、発現効率を増加させる
ため「エンハンサー」領域を含んでいてもよい。ターミネーター領域の選択も、
文献に広く記載されている、特にＧＨ、ＳＶ４０、ＥＦ１−α等のターミネータ
ーの中から当業者により容易になされうる。最後に、ｇａｇ及びｐｏｌをコード
する核酸は、レトロウイルス・ゲノムの場合のように、単一のプロモーター及び
ターミネーターにより調節される２シストロン単位の形態で使用されることが多
い。

【００３３】前述のように、本発明の利点は、アデノウイルスにおけるレトロウイルス遺伝
要素の分配、及び／又は用いられるアデノウイルスの型から特に得られる。これ
に関して、既に強調されたように、本発明に関連して用いられるアデノウイルス
は、主に少なくともＥ１領域及びＥ４領域の全部又は一部に欠陥を有する。実施
例に例示されたように、レトロウイルス遺伝要素の有利な分配と共に、このアデ
ノウイルスの組織は、高い安全性及び効率をもたらす。さらに、用いられる組換
えアデノウイルスのゲノム構造は、特に既に例示されたような単一のアデノウイ
ルス又は２つのアデノウイルスの組み合わせの使用のような、レトロウイルス遺
伝要素の独創的かつ有利な分配の作製も可能にする。結果は、特に有利な様式で
、本発明に係る、この型のアデノウイルスの使用及び／又はレトロウイルス遺伝
要素の特定の分配の使用が、高力価の感染性レトロウイルス粒子及びトランスジ
ーンの長期安定性（３ヶ月超）を得ることを可能にすることを示している。これ
らの完全に有利な結果は、ウイルスＥ４領域の不在が、アデノウイルスベクター
に導入された配列の発現に負の効果を有すると記載されていたことを考えると、
驚くべきものである。さらに、提示された結果は、in vivoで、本発明に係る組
成物が、アデノウイルス単独の投与と比較して、形質導入された腫瘍細胞の数の
少なくとも１０〜５０倍の増加を誘導することを示している。従って、これらの
結果は、核酸を細胞に移入するための本発明の有利かつ驚くべき特性を確認する
ものである。

【００３４】従って、本発明を実施するために用いられるアデノウイルスは、有利には、少
なくともＥ１領域及びＥ４領域の全部又は一部に欠陥を有する。

【００３５】有利には、これらは、いわゆる第三世代欠陥組換えアデノウイルス、即ちＥ１
領域及びＥ４領域の全部又は一部に欠陥を有し、Ｅ３領域に欠陥を有していても
よい欠陥組換えアデノウイルスである。

【００３６】本発明の特定の変形は、以下の領域の全部又は機能的部分に影響を与える欠失
を保有するアデノウイルスの使用を含む。 −Ｅ１、Ｅ４及びＥ３ −Ｅ１、Ｅ４及びＥ２ −Ｅ１、Ｅ４、Ｅ２及びＥ３ −前記の領域及びアデノウイルス後期機能（Ｌ１〜Ｌ５）をコードする遺伝子の
全部又は一部、又はさらに −ウイルスの全コーディング領域

【００３７】アデノウイルスのゲノム構造は、文献に多く記載されている。これに関して、
アデノウイルスＡｄ５のゲノムは、完全に配列決定されており、データベースか
ら入手可能である（特にＧｅｎｅＢａｎｋＭ７３２６０を参照のこと）。同様に
、他のアデノウイルス・ゲノム（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２、イヌ・アデノウイ
ルスＣＡＶ−２等）の一部が配列決定されており、又は全部が配列決定されてい
るものすらある。さらに、欠陥組換えアデノウイルスの構築も、文献に記載され
ている。従って、例えば、出願ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７及
びＷＯ９６／２２３７８は、Ｅ１領域及びＥ４領域における異なる欠失を記載し
ている。同様に、出願ＷＯ９６／１００８８はＩｖａ２遺伝子における修飾を有
するベクターを記載しており、出願ＷＯ９４／２６９１４は動物アデノウイルス
を記載しており、出願ＷＯ９５／２９９９３はアデノウイルスＥ２領域における
欠失を記載している。

【００３８】有利には、本発明に関連して用いられる組換えアデノウイルスは、Ｅ１ａ領域
及びＥ１ｂ領域に影響を与える、ゲノムのＥ１領域における欠失を含む。特定の
例は、ヌクレオチド４５４〜３３２８、３８２〜３４４６又は３５７〜４０２０
（Ａｄ５ゲノムに関する）に影響を与える欠失により提供される。

【００３９】さらに、参照として本明細書に組み込まれる出願ＷＯ９５／０２６９７及びＷ
Ｏ９６／２２３７８に記載されたように、欠失３３４６６〜３５５３５又は３３
０９３〜３５５３５のようなＥ４領域における欠失は、優先的に、全オープンリ
ーディングフレーム、又はＥ４領域の一部のみ（例えばＯＲＦ６又はＯＲＦ３）
に影響を与える。

【００４０】後期機能（「最小」ベクター）又は全コーディング領域（「ガットレス（gutl
ess）」ベクター）をさらに欠失したアデノウイルスに関して、それらの構築は
、例えば、Parks et al.,PNAS(1996)93:13565及びLieber et al.,J.Virol.(1996
)70:8944により記載されている。

【００４１】レトロウイルス遺伝要素は、組換えアデノウイルス・ゲノムの異なる部位に挿
入されうる。それらは、欠失した配列を交換することにより、又は付加的に、Ｅ
１領域、Ｅ３領域又はＥ４領域に挿入されうる。それらは、ウイルス作製のため
シスで必要な配列（ＩＴＲ配列及びパッケージング配列）とは別に、他の部位に
挿入されてもよい。

【００４２】さらに、組換えアデノウイルスは、ヒト又は動物由来でありうる。ヒト由来の
アデノウイルスに関しては、Ｃ群のもの、特に２型（Ａｄ２）、５型（Ａｄ５）
のアデノウイルス、又は７型（Ａｄ７）もしくは１２型（Ａｄ１２）のアデノウ
イルスが優先的に特記されうる。動物由来のアデノウイルスの優先的な例は、イ
ヌ・アデノウイルス、特にアデノウイルスＣＡＶ２の全ての株である〔例えば、
マンハッタン（Manhattan）株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣＶＲ−８００）〕。
動物由来のその他のアデノウイルスは、参照として本明細書に組み込まれる出願
ＷＯ９４／２６９１４に特に与えられている。

【００４３】組換えアデノウイルスは、パッケージング細胞、即ち組換えアデノウイルスゲ
ノムにおける欠陥機能の一つ又はいくつかをトランスに相補することができる細
胞系において産生される。当業者に周知のパッケージング細胞の中の一例は、ア
デノウイルス・ゲノムの一部が取り込まれている細胞系２９３である。より具体
的には、細胞系２９３は、左側ＩＴＲ、パッケージング領域、Ｅ１ａ及びＥ１ｂ
を含むＥ１領域、ｐＩＸタンパク質をコードする領域、及びｐＩＶａ２タンパク
質をコードする領域の一部を含有する、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲ
ノムの左側末端（およそ１１〜１２％）を含有するヒト胚性腎臓細胞系である。
この細胞系は、Ｅ１領域に欠陥を有する、即ちＥ１領域の全部又は一部が欠失し
ている組換えアデノウイルスをトランスに相補することができ、高力価のウイル
ス・ストックを産生する。この細胞系は、許容温度（３２℃）で、温度感受性Ｅ
２変異をさらに含むウイルスのストックも産生しうる。Ｅ１領域を相補すること
ができる他の細胞系は、特にヒト肺癌細胞Ａ５４９（ＷＯ９４／２８１５２）又
はヒト網膜芽細胞〔Hum.Hen.Ther.(1996)215〕に基づき記載されている。さらに
、いくつかのアデノウイルス機能をトランスに相補することができる細胞系も記
載されている。特定の例は、Ｅ１領域及びＥ４領域を相補する細胞系〔Yeh et a
l.,J.Virol.(1996)70:559-565; Cancer Gen.Ther.(1995)2:322; Krougliak et a
l.,Hum.Gen.Ther.(1995)6:1575〕及びＥ１領域及びＥ２領域を相補する細胞系（
ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９５／２７０７１）、又は
特にそれが最小アデノウイルスの構築に関与する部位特異的リコンビナーゼ活性
も発現しているため、最小アデノウイルスを作製するために用いられうる、それ
らに由来する細胞系を含む。

【００４４】組換えアデノウイルスは、通常、ウイルスＤＮＡをパッケージング細胞に導入
し、約２又は３日後に細胞を溶解することにより作製される（アデノウイルス複
製周期は２４〜３６時間である）。その方法を実施するためには、導入されたウ
イルスＤＮＡが、細胞にトランスフェクトされた、細菌（ＷＯ９６／２５５０６
）又は酵母（ＷＯ９５／０３４００）中に構築されていてもよい完全な組換えウ
イルスゲノムでありうる。それは、パッケージング細胞に感染させるために用い
られる組換えウイルスであってもよい。ウイルスＤＮＡは、それぞれが、組換え
ウイルス・ゲノムの一部と、パッケージング細胞への導入後に異なる断片間の相
同的組み換えにより組換えウイルス・ゲノムの再構成を可能にする相同領域とを
有する断片の形態で導入されてもよい。

【００４５】細胞溶解後、組換えウイルス粒子は、塩化セシウム勾配遠心分離又はクロマト
グラフィーのような任意の既知の方法により単離されうる。別法は、参照として
本明細書に組み込まれる出願ＦＲ９６０８１６４に特に記載されている。

【００４６】本発明に係る組成物は、所望の適用（例えば、in vitro、ex vivo又はin vivo
）に応じて、当業者が容易に適合させうる様々な量の組換えアデノウイルスを含
みうる。

【００４７】一般的に、組成物は、およそ１０⁵〜１０¹⁵v.p.、好ましくは１０⁷〜１０¹²v.
p.の各々の組換えアデノウイルスを含む。

【００４８】 v.p.という用語は、組成物中に存在するウイルス粒子の数に相当する。

【００４９】さらに、本発明の組成物は、溶液、ゲル、粉末等のような、異なる形態であっ
てもよい。それらは、一般的には、例えば生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム
、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしく
は塩化マグネシウムなど、又はこれらの塩の混合物）のような、好ましくは無菌
の溶液、等張組成物又は乾燥組成物、特に場合により無菌の水又は生理学的血清
の添加により再生された溶液を形成しうる凍結乾燥物である。例えばヒドロゲル
のようなその他の賦形剤が用いられうる。そのようなヒドロゲルは、任意の生物
適合性、非毒性（ホモ又はヘテロ）重合体から調製されうる。そのような重合体
は、例えばＷＯ９３／０８８４５に記載されている。

【００５０】さらに、本発明の組成物は、ボトル、チューブ、アンプル、バッグ、シリンジ
、バルーン等のような任意の適当な型の装置に収納されうる。さらに、少なくと
も２つの型の組換えアデノウイルスを含む本発明の組成物において、少なくとも
２つの型の組換えアデノウイルスは、混合物として、又は個別に収納されうる。

【００５１】前記のように、本発明の組成物は、in vitro、ex vivo又はin vivoで用いられ
うる。

【００５２】 in vitro又はex vivoの使用のため、細胞は、前記のような組成物の存在下で
、適当な装置（プレート、ディッシュ、バッグ等）の中で単純にインキュベート
されうる。２つの型の組換えアデノウイルスを含む組成物に関して図１に示され
たように、細胞のインキュベーションは、２つのアデノウイルスによる細胞の感
染を引き起こし、その後、共感染した細胞は感染性レトロウイルス粒子を産生し
うる。この型の適用のため、特に実施例に示されたように、細胞１個当たり１０
v.p.と５０００v.p.の間、好ましくは１００v.p.と２０００v.p.の間の感染多重
度（ＭＯＩ）の組成物が用いられうる。

【００５３】これに関して、本発明は、同等に、前記のような組成物の存在下で細胞をイン
キュベートすることを含み、その後の産生されたレトロウイルスの回収及び／又
は精製を含んでもよい、in vitroでレトロウイルス粒子を作製する方法にも関す
る。この方法において用いられうる細胞は、アデノウイルスに対して許容性のあ
らゆる細胞型でありうる。これらは、特に哺乳動物、特にヒト由来の初代培養物
又は細胞系でありうる。ヒト由来の細胞（胚性腎臓細胞、Ａ５４９、網膜芽細胞
、ＨｅＬａ、ＫＢ等）の使用は、補体系に対する増強された耐性をレトロウイル
ス粒子に与えるため、特に有利である。実施例に示されたように、本発明の方法
は、パッケージング細胞系を用いることなく、高いレトロウイルス力価を得るこ
とを可能にする。

【００５４】 in vivo使用の場合、本発明の組成物は、局所、非経口、鼻腔内、静脈内、筋
肉内、皮下、眼内、経皮、腫瘍内などの経路による投与を考慮して製剤化されう
る。

【００５５】これに関して、本発明は、前記のような組成物を投与することを含む、in viv
oで核酸を移入するための方法にさらに関する。本発明は、例えば、病理学的モ
デルを確立するため、又は遺伝子制御の研究のため、動物において用いられうる
し、標識もしくは生物学的利用能の研究において、又は医学的な目的のためヒト
においても用いられうる。本発明は、感染性レトロウイルス粒子をin vivoで作
製するための、前記の組成物の使用にも関する。

【００５６】レトロウイルスベクターに挿入された目的の核酸（トランスジーン）に応じて
、本発明は、多数の適用において用いられうる。従って、本発明に関連した目的
の産物の中で、より具体的な例は、酵素、血液製剤、成長ホルモンのようなホル
モン、サイトカイン、リンフォカイン：インターロイキン、インターフェロン、
ＴＮＦ等（フランス特許第９２０３１２０号）、増殖因子、例えばＶＥＧＦも
しくはＦＧＦのような血管形成因子、神経伝達物質もしくはそれらの前駆体もし
くは合成酵素、栄養因子、特に神経変性疾患もしくは神経系外傷もしくは黄斑変
性の治療のための神経栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ
、ａＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン、又は骨増殖因子
（bone growth factor）、造血因子等、ジストロフィン又はミニジストロフィン
（minidystrophin）（フランス特許第９１１１９４７号）、血液凝固因子：第V
II因子、第VIII因子、第IX因子をコードする遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナ
ーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ｐ２１のような細胞周期に関与するタンパク質
、又はその他のキナーゼ依存性阻害タンパク質、Ｒｂ、Ｇａｓ−１、Ｇａｓ−６
、Ｇａｓ−３、Ｇａｄ４５、Ｇａｄ１５３、サイクリンＡ、Ｂ、Ｄ、又はさらに
平滑筋細胞増殖を阻害するＧＡＸタンパク質（再狭窄の治療）、アポトーシス誘
導タンパク質、又はｐ５３、Ｂａｘ、ＢｃｌＸ−ｓ、Ｂａｄ又はその他のあらゆ
るＢｃｌ２のアンタゴニスト及びＢｃｌＸ−１のようなその他の腫瘍抑制因子、
ヘモグロビンもしくはその他の輸送タンパク質の遺伝子、アポリポタンパク質Ａ
−Ｉ、Ａ−II、Ａ−IV、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−II、Ｃ−III、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、
Ｊ及びアポ（ａ）の中から選択されるアポリポタンパク質型の脂質代謝に関与す
るタンパク質の遺伝子、例えばリポタンパク質リパーゼ、肝性リパーゼ、コレス
テロールレシチンアシルトランスフェラーゼ、７−アルファ−コレステロールヒ
ドロキシラーゼ、ホスファチジル酸ホスファターゼのような代謝酵素、又はさら
にコレステロールエステル輸送タンパク質及びリン脂質輸送タンパク質のような
脂質輸送タンパク質、ＨＤＬ結合タンパク質、又はさらにＬＤＬ受容体、キロミ
クロン−レムナント受容体及びスカベンジャー受容体から選択される受容体など
を含む。

【００５７】目的の産物の中でも、免疫療法、例えば感染性疾患、腫瘍（抗ＲＡＳ抗体、抗
ｐ５３抗体又は抗ＧＡＰ抗体）、多発性硬化症のような自己免疫疾患の治療にお
いて用いるための、抗体、抗体単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）又は認識能を有するそ
の他の任意の抗体断片を指摘することが重要である。

【００５８】その他の目的のタンパク質の例は、これらに限定されないが、例えば抗ＨＩＶ
療法のための可溶性ＣＤ４受容体又は可溶性ＴＮＦ受容体、重症筋無力症の治療
のための可溶性アセチルコリン受容体のような可溶性受容体；酵素の阻害剤もし
くは基質であるペプチド、あるいは受容体をアゴニスト化もしくはアンタゴニス
ト化するペプチド又は例えば喘息、血栓症及び再狭窄のためのような接着タンパ
ク質であり、それらは合成タンパク質、キメラタンパク質又は短縮型タンパク質
でありうる。第一に重要なホルモンの中では、糖尿病症例におけるインシュリン
、成長ホルモン及びカルシトニンを特記することができる。

【００５９】核酸は、その標的細胞における発現が、遺伝子発現又は細胞ｍＲＮＡの転写の
調節を可能にする遺伝子又はアンチセンス配列でありうる。そのような配列は、
例えば、欧州特許第１４０３０８号に記載の方法に従い、標的細胞において細
胞ｍＲＮＡと相補的なＲＮＡに転写され、それによりそのタンパク質への翻訳を
遮断しうる。治療用遺伝子は、同等に、標的ＲＮＡを選択的に破壊することがで
きるリボザイムをコードする配列を含む（欧州特許第３２１２０１号）。

【００６０】核酸は、ヒト又は動物において免疫応答を誘発しうる抗原性ペプチドをコード
する一つ又はいくつかの遺伝子も含みうる。従って、この特定の実施態様におい
て、本発明は、特に微生物、ウイルス又は癌に対して、ヒト又は動物において用
いるためのワクチン又は免疫療法治療剤の作製を可能にする。特に、これらは、
エプスタイン・バー・ウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（欧州特許
第１８５５７３号）、偽狂犬病ウイルス（pseudo-rabies virus）、「シンシチ
ア形成ウイルス」、他のウイルス、又はさらにＭＡＧＥタンパク質のような腫瘍
特異的抗原（欧州特許第２５９２１２号）でありうる。

【００６１】核酸は、細胞に対して毒性の産物、特に条件的毒性（例えば、チミジンキナー
ゼ、シトシンデアミナーゼ等）もコードしうる。

【００６２】他の目的の遺伝子は、特に、マクシック（Mc Kusick）、Ｖ．Ａ．メンデリア
ン（V.A.Mendelian）〔ヒトにおける遺伝、常染色体優性表現型、常染色体劣性
表現型、及びＸ連鎖表現型の目録（Inheritance in man,catalogs of autosomal
dominant,autosomal recessive,and X-linked phenotypes）第８版、John Hopk
ins University Press（1988）〕及びスタンドバリーＪ．Ｂ．（Standbury,J.B.
）ら〔遺伝病の代謝的基礎（The metabolic basis of inherited disease）第５
版、McGraw-Hill（1983）〕により記載されている。目的の遺伝子は、アミノ酸
、脂質及びその他の細胞構成成分の代謝に関与するタンパク質を含む。

【００６３】最後に、核酸は、いくつかの目的の産物の産生を可能にする、ＩＲＥＳにより
隔離されていてもよい、いくつかのコーディング領域を含みうる。

【００６４】さらに、トランスジーンは、一般的に、前記のような当業者により選択されう
る転写プロモーター（５′に位置する）及び転写ターミネーター（３′に位置す
る）を含む。さらに、トランスジーンは、レトロウイルスベクター中に、ＬＴＲ
転写の方向と同一の方向で存在してもよいし、逆の方向で存在してもよい。最後
に、特定の実施態様において、本発明のアデノウイルスゲノムは、アデノウイル
ス相補機能と共に、プラスミドの形態で細胞に輸送されてもよい。

【００６５】本発明のその他の利点及び適用は、例示の目的のため与えられており本発明を
限定するものではない以下の実施例からさらに明らかとなろう。

【００６６】一般的な分子生物学の技術調製的プラスミドＤＮＡ抽出法、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心法
、アガロースゲル電気泳動法、ＤＮＡ断片の精製、フェノール−クロロホルムタ
ンパク質抽出法、エタノールまたはイソプロパノールによる生理食塩水媒体中で
のＤＮＡ沈殿法、Escherichia coli中での形質転換など、分子生物学で古典的に
用いられる方法は、当業者に周知であり、文献〔Maniatis T. et al., "Molecu
lar Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold S
pring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocol
s in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N. Y. 1987〕に詳細に記載さ
れる。

【００６７】ライゲーションでは、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法によるサイズに
従って分離し、キアゲン社が販売する「ＱＩＡクイックゲル抽出キット（QIAq
uick Gel Extraction Kit）」で精製し、その後Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラ
ブズ社（Biolabs））の存在下、供給業者の薦めに従って、インキュベートして
もよい。アルカリホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム社）を使用し、供
給業者の仕様書に従って、ＤＮＡ５′末端の脱リン酸化を実施してもよい。E. c
oli ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片（バイオラブズ社）を使用し、製造業者
の指導書に従って、５′突出末端のフィリング反応を行ってもよい。

【００６８】 Mikaelian and Sergeant（Nucleic Acids Research, 1992, 20: 376）が開発
した方法に従って、合成オリゴヌクレオチドを使用したin vitro での部位特異
的突然変異を実施してもよい。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社
）を使用し、製造業者の指導書に従って、いわゆるＰＣＲ法〔Polymerase-catal
ysed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., 1985, Science 230: 1350-1354〕
によるＤＮＡ断片の増幅を行ってもよい。Sanger et al.,(Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 1977, 74: 5463-5467)が記載する方法で、ヌクレオチド配列を確認し
てもよい。

【００６９】ＩＧＲＰ２細胞とＷ１６２細胞〔Weinberg, et al., PNAS (1983) 80: 5383〕
は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補足した最小イーグル培地（ＭＥＭ）中で
増殖させた。ヒト（ＡＴＴＣ−ＨＴＢ１７７）非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ４
６０およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３繊維芽細胞は、それぞれ１０％ＦＣＳを補足し
た、ダルベッコ変法培地およびＲＭＰＩ１６４０倍地中で増殖させた。細胞は全
て５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で培養した。

【００７０】実施例１．プロモーターの制御下、異なるレトロウイルス単位を運搬する３種の
プラスミドの構築この実施例は、レトロウイルスのバックグラウンド中に、（ｉ）レトロウイル
スエンベロープ４０７０Ａ、（ii）ＭｏＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌ蛋白質、および（
iii）ＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子、の発現カセットをそれぞれ含む３種のプラスミド
の構築を記載する。

【００７１】１．１．プラスミドｐＥＦ１ａ−Ｅｎｖの構築プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（Mizushima and Nagata, 1990, Nucl. Acids Res.
18: 5322）からのＥＦ−１ａ遺伝子のプロモーター／エンハンサーを含むＨｉ
ｎｄIII／Ｘｂａ１断片を、市販のプラスミドｐＳＩ（プロメガ社）のＨｉｎｄI
II部位およびＸｂａ１部位にクローン化して、プラスミドｐＳＩ−ＥＦ１ａを生
成した。

【００７２】鋳型であるプラスミドｐＳＶ−ｅｎｖＡＭ（T. Heidmann, CNRS URA 147から
贈与）と、以下に記載するオリゴヌクレオチド配列番号１および配列番号２とを
使用して、両栄養性ＭＬＶウイルスエンベロープ遺伝子４０７０Ａ（ｅｎｖ４０
７０Ａ）を含むＸｂａＩ／ＮｏｔＩ断片をＰＣＲで増幅した。

【００７３】

【化１】

【００７４】

【化２】

【００７５】増幅時に、オリゴヌクレオチド配列番号３および配列番号４を使用する中間的
ＰＣＲ反応により、アミノ酸配列を変えることなく、ｅｎｖ遺伝子に存在するＰ
ａｃＩ部位を除去させた。

【００７６】

【化３】

【００７７】ｅｎｖ４０７０Ａ遺伝子を含む増幅したＸｂａＩ／ＮｏｔＩ断片を、ｐＳＩ−
ＥＦ１ａのＸｂａＩ部位およびＮｏｔＩ部位にクローン化して、それによりＥＦ
−１ａプロモーターの制御下、ｅｎｖ４０７０Ａ遺伝子を含むプラスミドｐＥＦ
１ａ−Ｅｎｖを与え、ＳＶ４０ウイルスの後期ポリアデニル化シグナルが後に続
いた。このプラスミドのＥｎｖカセットを、図２Ｂに描写する。

【００７８】１．２．プラスミドｐＥＦ１ａ−ＧＰ＋の構築モロニー株ＭＬＶウイルスのｇａｇシストロンとｐｏｌシストロンの一部とを
含むｐＭＯＶ−３ΔＣｌａ（T. Heidmann, CNRS URA 147から贈与）のＸｍａＩ
／ＸｍａＩ断片を、ｐＳＩ−ＥＦ１ａ（１．１．節を参照）のＸｍａＩ部位にク
ローン化して、プラスミドｐＥＦ１ａ−ＧＰを作製した。鋳型であるプラスミドｐＭＯＶ−３ΔＣｌａと、以下に記載するオリゴヌクレ
オチド配列番号５および配列番号６とを使用して、ｇａｇシストロンの５′末端
を含むＥｃｏＲＩ／ＢｓｒＧＩ断片をＰＣＲで増幅した。

【００７９】

【化４】

【００８０】増幅したＥｃｏＲＩ／ＢｓｒＧＩ断片をｐＥＦ１ａ−ＧＰのＥｃｏＲＩ部位お
よびＢｓｒＧ１部位にクローン化して、プラスミドｐＥＦ１ａ−ＧＰａｕｇを生
成した。鋳型であるプラスミドｐＭＯＶ−３ΔＣｌａと、以下に記載するオリゴヌクレ
オチド配列番号７および配列番号８とを使用して、ｐｏｌシストロンの３′末端
を含むＸｍａＩ／ＮｏｔＩ断片をＰＣＲで増幅した。

【００８１】

【化５】

【００８２】増幅したＸｍａ１／ＮｏｔＩ断片を、ｐＥＦ１ａ−ＧＰａｕｇのＸｍａ１部位
およびＮｏｔＩ部位にクローン化して、それによりＥＦ−１ａプロモーターの制
御下、ｇａｇ−ｐｏｌシストロンを含むプラスミドｐＥＦ１ａ−ＧＰ＋を与え、
ＳＶ４０ウイルスの後期ポリアデニル化シグナルが後に続いた。このプラスミド
のＧＡＧ／ＰＯＬカセットを、図２Ｃに描写する。

【００８３】１．３．プラスミドｐＣＬＴＫＲｐＡの構築ＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子とそれのリーダー配列とを含むｐＸＬ３０２２のＢｓｔ
ＹＩ／ＮａｒＩ断片を、レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ（Miller and Rosma
n, 1989, Biotechniques 7: 980-990）のＢｃｌＩ部位およびＣｌａ１部位（適
合部位）にクローン化して、ｐＬＴＫを作製した。

【００８４】ｐＬＴＫのＳａｃＩ／ＳａｃＩ断片およびＳａｃＩ／ＮｈｅＩ断片を、ｈＣＭ
Ｖ−ＩＥ（−７３３／−１４）プロモーター／エンハンサーを含む、市販のプラ
スミドｐＣｌ（プロメガ社）のＳａｃ１部位およびＮｈｅ１部位にクローン化し
て、ｐＣＬＴＫを作製した。

【００８５】鋳型であるプラスミドｐＬＮＣＸと、以下に記載するオリゴヌクレオチド配列
番号９および配列番号１０とを使用して、Ｕ３配列の４分の３とＲ配列とを含む
Ｎｈｅ１／ＮｏｔＩをＰＣＲで増幅した。

【００８６】

【化６】

【００８７】増幅したＮｈｅ１／ＮｏｔＩ断片を、ｐＣＬＴＫのＮｈｅ１部位およびＮｏｔ
Ｉ部位にクローン化して、ｐＣＬＴＫＲを作製した。

【００８８】鋳型である市販のプラスミドｐｃＤＮＡ３（in vitro ゲン社）と、以下に記
載するオリゴヌクレオチド配列番号１１および配列番号１２とを使用して、ｂｇ
ｈ（ウシ成長ホルモン）遺伝子のポリアデニル化シグナルを含むＮｏｔＩ／Ｂａ
ｍＨＩ断片をＰＣＲで増幅した。

【００８９】

【化７】

【００９０】増幅したＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ断片を、ｐＣＬＴＫＲのＮｏｔＩ部位およびＢ
ａｍＨＩ部位にクローン化して、それによりレトロウイルスベクターのバックグ
ラウンド中にｔｋ遺伝子を含むｐＣＬＴＫＲｐＡを生成した。５′ＬＴＲでは、
Ｕ３配列をｈＣＭＶ／ＩＥプロモーター／エンハンサーに置換した。このハイブ
リットＬＴＲ（ｈＣＭＶ−Ｒ−Ｕ５）が機能的であることが報告されている（Na
viaux et al., 1996, J. Virol. 70: 5701-5705）。３′ＬＴＲでは、Ｕ５配列
が欠失し、ｂｇｈ遺伝子のポリアデニル化シグナルに置換されていた。得られた
カセットの構造を、図２Ａに示す。

【００９１】実施例２．E. coli技術（E. coli technology）により異なるレトロウイスル単
位を運搬する２種の「シャトル」プラスミドの構築この実施例は、E. coli技術（実施例３を参照）で、２種の組換えアデノウイ
ルスを構築するために使用する、いわゆる「シャトル」プラスミドの構築を記載
する。それらは、発現カセットＴｋおよびＥｎｖ（ｐＡｄＣＬＴＫＥＥ）ならび
にＧａｇ−Ｐｏｌ（ｐＡｄＥＧＰ）を含む。（図３）

【００９２】２．１．「シャトル」プラスミドｐＡｄＥＧＰの構築（図３）ＥＦ−１ａプロモーター（１．２．節を参照）の制御下、ｇａｇ−ｐｏｌシス
トロンを含む、ｐＥＦ１ａ−ＧＰ＋のＦｓｐＩ／ＦｓｐＩ断片を、ｐＸＬ３０４
８（ｋａｎａおよびＳａｃＢ選択遺伝子を運搬するプラスミド）の脱リン酸化し
たＥｃｏＲＶ部位にクローン化して、これによりＧａｇ−Ｐｏｌ発現カセットの
５′および３′それぞれに位置する、アデノウイルス５型の配列１〜３８２およ
び３４４６〜４２９６を含むプラスミドｐＡｄＥＧＰを生成した。

【００９３】２．２．「シャトル」プラスミドｐＡｄＣＬＴＫＥＥの構築（図４）レトロウイスルのバックグラウンド（１．３．節を参照）にＴＫカセットを含
むｐＣＬＴＫＲｐＡのＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片を、ｐＸＬ３０４８（ｋａｎａ
およびＳａｃＢ選択遺伝子を運搬するプラスミド；ＲＰＲ−ジーンセル社（RPR-
Gencell））のＢａｍＨＩ部位にクローン化して、プラスミドｐＡｄＬＴＫを生
成した。

【００９４】Ｅｎｖ発現カセット（１．１．節を参照）を含むｐＥＦ１ａ−ＥｎｖのＡｖｒ
II／ＥａｒＩ（クレノウで処理した）断片を、ｐＡｄＣＬＴＫのＳａｌＩ部位（
アルカリホスファターゼ、その後クレノウ断片で処理）にクローン化して、これ
によりＴＫ−ｅｎｖ発現カセットの５′および３′それぞれに位置する、アデノ
ウイルス５型の配列１〜３８２および３４４６〜４２９６を含むプラスミドｐＡ
ｄＣＬＴＫＥＥを生成した。ＴＫ発現カセットの３′に位置するＥｎｖ４０７０
Ａ発現カセットを、逆方向に転写した。

【００９５】実施例３．異なるレトロウイルス単位を運搬する２種のＥ１^-／Ｅ３^-／Ｅ４^-組
換えアデノウイルスベクターの構築この実施例は、E. coliでの二重組換え（double recombination）によりＴＫ
−Ｅｎｖ（ＡｄＴＫ／ＥＮＶ）およびＧａｇ−Ｐｏｌ（ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬ）発
現カセットをそれぞれ含む２種のＥ１^-／Ｅ３^-／Ｅ４^-組換えアデノウイルスベ
クターの構築を記載する。

【００９６】３．１．E. coli技術 E. coli技術により、E. coli ｐｏｌＡ変異体株での２回の連続的相同組換え
の後、改変されたアデノウイルス５型ゲノムおよび「シャトル」プラズマ（アデ
ノウイルスゲノムに組込まれたカセットを運搬する）から、感染性組換えアデノ
ウイルスゲノムの構築が可能となった。その方法は、Crouzet et al.(1997, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1414-1419)が詳細に記載する。

【００９７】３．２．組換えゲノムＡｄＧＡＧ／ＰＯＬおよびＡｄＴＫ／ＥＮＶの構築 E. coli技術で使用されるアデノウイルス５型ゲノムを、プラスミドｐＸＬ２
８１１にクローン化した（Crouzet et al., supra）。このゲノムは、ＰａｃＩ
断片上に運ばれ、領域Ｅ１（ΔＥ１：ＨｉｎｆＩ−ＢｇｌII欠失３８２〜３３２
８）、Ｅ３（ΔＥ３：Ｘｂａ１欠失２８５９２〜３０４７０）、およびＥ４（Δ
Ｅ４：ＳｓｐＩ−ＳｍａＩ欠失３３４２３〜３５３５６）での欠失を担った。

【００９８】 E. coli中での、「シャトル」プラスミドｐＡｄＥＧＰ（２．１節を参照）お
よびｐＸＬ２８１１間の相同組換えの後、ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬ組換えアデノウイ
ルスゲノムを構築した。Ｇａｇ−Ｐｏｌ発現カセットは、Ｅ１欠失に位置した。

【００９９】 E. coli中での、「シャトル」プラスミドｐＡｄＣＬＴＫＥＥ（２．２節を参
照）およびｐＸＬ２８１１間の相同組換えの後、ＡｄＴＫ／ＥＮＶ組換えアデノ
ウイルスゲノムを構築した。ＴＫ−ｅｎｖ発現カセットは、Ｅ１欠失に位置した
。

【０１００】２種の組換えＤＮＡ調製物を酵素的消化、その後０．７％アガロースゲルの電
気泳動で分析した。それらの塩基配列決定も行った（クローニング部位、ＰＣＲ
で増幅した配列など）。詳細には、ＴＫ、Ｅｎｖ、およびＧａｇ−Ｐｏｌ発現カ
セットがそれらのアデノウイルスのバックグラウンド中で損なわれていないこと
を立証するために、その制限酵素を選択した。

【０１０１】得られたバンドの数とサイズ、ならびに塩基配列決定した領域は、予期したプ
ロフィールと完全に一致した。２種のゲノムには、欠失および突然変異は観察さ
れなかった。これらの結果から、一方では２種のアデノウイルスゲノム構築物が
正しいことが、他方では修飾されたＬＴＲなどの組込まれたレトロウイルスの配
列が、E. coliでの構築時に内部の組換えを起こさないことが示され、それによ
りアデノウイルスのＤＮＡの遺伝的安定性が保証された。

【０１０２】実施例４．ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬおよびＡｄＴＫ／ＥＮＶウイルス保存株（presto
ck）の産生および特徴付けこの実施例は、２種の組換えアデノウイルスＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡ
Ｇ／ＰＯＬの産生、特徴付け、および力価測定を記載する。

【０１０３】４．１．ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬアデノウイルスの産生ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬのＤＮＡ（２０μg）をＰａｃＩ
で消化して、組換えアデノウイルスゲノムのみを含むＰａｃＩ断片を遊離させ、
その後エタノール中に沈殿させた。リポフェクトAMINE（Lipofect AMINE）（ギ
ブコＢＲＬ社）で、供給業者の指導書に従って、２種のＤＮＡをそれぞれアデノ
ウイルス蛋白質Ｅ１およびＥ４に、トランス相補する（trans-complementing）
細胞系２９３（ＩＧＲＰ２細胞；Yeh et al., 1996, J. Virol. 70: 559-565）
にトランスフェクトした。

【０１０４】細胞変性効果（細胞の剥離）の開始まで、細胞をカルチャー中に維持した。こ
の時点で、上清を除去して、新しいＩＧＲＰ２細胞の感染に使用する前に３回凍
結−解凍した。こうして、２種の組換えアデノウイルスを、１２穴培養プレート
（増幅１）、６穴培養プレート（増幅２）、および１０cm培養ディッシュ（増幅
３および４）で連続的に増幅した。各ウイルス毎に、約１５０mlの最終保存株を
、３５個の１０cmディッシュ（増幅４）から採取した。さらに３回凍結−解凍し
、その後−２０℃に保存した。

【０１０５】４．２．ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬウイルスの遺伝的安定性の
特徴付けこれは、細胞培養でのウイルスの増幅を利用して、ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡ
ｄＧＡＧ／ＰＯＬアデノウイルスゲノムの完全性を立証するために計画した。 Gluzman and Van Doren(1983, J. Virol. 45: 91-103)が記載した方法に従っ
て、各保存株の一部（２ml）を使用して、ウイルスのＤＮＡを精製した。精製し
たＤＮＡを酵素的消化、その後０．７％アガロースゲルの電気泳動で分析した。
制限酵素の選択により、詳細にはアデノウイルスのバックグラウンド中の３種発
現カセットＴＫ、Ｅｎｖ、およびＧａｇ−Ｐｏｌの完全性を確認することが可能
となった。

【０１０６】得られたバンドの数とサイズは、予測したプロフィールと完全に一致した。２
種のゲノムには欠失は観察されなかった。これらの結果から、２種のアデノウイ
ルスゲノムに組込まれたレトロウイルス配列が、これらのゲノムの安定性を変え
ないことが示された。

【０１０７】４．３．ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬウイルス保存株の力価測定得られた２種のウイルス保存株を、詳細には各ウイルスの産生性を評価するた
めに、２種の方法、（ｉ）抗ペントンモノクローナル抗体による免疫学的力価測
定（immunotitration）および（ii）高速液体クロマトグラフィーもしくはＨＰ
ＬＣ（F. Blanche, ＲＰＲ−ジーンセル社）で力価測定した。

【０１０８】免疫学的力価測定のため、６穴プレートに増殖させたＩＧＲＰ２細胞を、ウイ
ルス保存株の希釈物に感染させた。感染の４８時間後に、細胞を９０％メタノー
ル中に固定し、その後飽和させるためにＰＢＳ／５％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）中
で１時間インキュベートした。その後、細胞を１：１００希釈の抗ペントンモノ
クローナル抗体（バイオデザインインターナショナル社（Biodesign Internat
ional））とインキュベートして、洗浄し、その後１：５００希釈のペルオキシ
ダーゼ結合抗体（アマシャム社）で標識した。標識細胞を３，３′−ジアミノベ
ンジディン（ＤＡＢ）／Ｈ₂Ｏ₂で明らかにした。

【０１０９】免疫学的力価測定で測定したところ、感染性粒子（IP）の数は、ＡｄＴＫ／Ｅ
ＮＶで５．８×１０⁸IP／ml、ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬで３．３×１０⁸IP／mlであっ
た。ＨＰＬＣで測定したところ、ウイルス粒子（VP）の数は、ＡｄＴＫ／ＥＮＶ
で１．９×１０¹⁰VP/ml、ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬで１．３×１０¹⁰VP/mlであった。
VP/IP比は３３（ＡｄＴＫ／ＥＮＶ）および３９（ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬ）であっ
た。

【０１１０】そうして得られたウイルス価により、２種の保存株ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬおよび
ＡｄＴＫ／ＥＶＮの良好な産生性が実証された。この産生性のレベルは、その他
のＥ１およびＥ４欠損組換えアデノウイルスと同様であった。これらのデータか
ら、詳細にはレトロウイルス配列およびそれらの機能の存在が、アデノウイルス
配列およびウイルスの産生性に関するそれらの機能を妨げないことが示唆された
。

【０１１１】実施例５．ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬアデノウイルスのレトロ
ウイルス発現カセットの機能性この実施例は、アデノウイルスＡｄＴＫ／ＥＮＶのＴＫ発現カセットおよびＡ
ｄＧＡＧ／ＰＯＬのＧａｇ−Ｐｏｌ発現カセットの機能性の試験を記載する。Ｅ
ｎｖ発現カセットの機能性は、産生された組換えレトロウイルスで力価測定する
ことにより検査した（６．４．節を参照）。

【０１１２】５．１．ＴＫ発現カセットの機能性発現カセットの機能性を、３種の方法、（ｉ）ＴＫ＋ＲＮＡの定量、（ii）細
胞溶解産物中のＴＫ蛋白質の実証、および（iii）ＴＫ蛋白質を発現する細胞の
蛍光標識、で分析した。ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬに感染させた細胞、およびｔｋ遺伝
子を発現する組換えアデノウイルスに感染させた細胞が、各実験でそれぞれ陰性
対照および陽性対照の役割を担った。

【０１１３】Ｗ１６２細胞（ミドリザルの腎臓から得たＶｅｒｏ細胞由来細胞）のＡｄＴＫ
／ＥＮＶ（ＭＯＩ１０〜８３７IP）による感染の４８時間後に、ＲＮイージーキ
ット（ＲＮeasy kit）（キアゲン社）を使用し、供給業者の指導書に従って、総
ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ（１５μg）をナイロン膜に乗せ、その後 Maniatis T
. et al. ("Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor L
aboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982 )が記載したプロトコルに従って
、放射性標識したＴＫプローブでハイブリダイズさせた。

【０１１４】ＡｄＴＫ／ＥＮＶ感染Ｗ１６２細胞を、感染の４８時間後に回収し、その後溶
解してＴＫ蛋白質の存在下、ＥＬＩＳＡで検出した。

【０１１５】ＡｄＴＫ／ＥＮＶ感染Ｗ１６２細胞（ＭＯＩ５０〜２００IP）を感染の４８時
間後に回収し、４％ホルムアルデヒド中で３０分間固定して、その後０．２％ト
リトン中で１０分間溶解した。その後細胞を１：２５０希釈の抗ＴＫウサギＩｇ
Ｇ抗体（ｐＡｂＴＫ４１、ＲＰＲ−ジーンセル社）とインキュベートして、パワ
ーブロック（Power-Block）緩衝液１Ｘ（バイオゼネクス社（Biogenex））中で
洗浄して、その後１：２５０希釈の、ＦＩＴＣ結合ウサギ抗ＩｇＧ抗体（ジャク
ソンイムノリサーチラボラトリーズ社）で標識した。標識細胞をフローサイ
トメトリー（ＦＡＣＳ）で分析した。

【０１１６】結果から、ＴＫ＋ＲＮＡが転写されていることが示された。転写されたＴＫ＋
ＲＮＡの量は、ＡｄＴＫ／ＥＮＶアデノウイルス感染のＭＯＩに比例した。ＴＫ
蛋白質は、感染した細胞の溶解産物中に検出され、感染細胞の７０％〜９０％（
ＭＯＩによる）陽性に標識された。

【０１１７】同時にこれらのデータから、ＴＫ発現カセットが、転写レベルおよび翻訳レベ
ルの両者について機能的であることが明瞭に示された。

【０１１８】５．２．Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現カセットの機能性ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬ感染Ｗ１６２細胞上清中で、ｐｏｌシストロンにコードさ
れる転写酵素活性の存在を検査することにより、発現カセットの機能性を試験し
た。培養上清において、レトロウイルス粒子（成分がｇａｇシストロンにコード
される）中に酵素、逆転写酵素（ＲＴ）が存在する。そのため、逆転写酵素活性
の存在から、レトロウイルス粒子が存在すること、即ちｇａｇ蛋白質が存在する
ことが実証される。ＡｄＴＫ／ＥＮＶ感染Ｗ１６２細胞およびＧＰ＋ｅｎｖＡＭ
１２細胞〔レトロウイルス粒子産生マウス細胞系；（Markowitz et al., 1988,
Virology 167: 400-406）〕の上清が、それぞれ陰性対照および陽性対照の役割
を担った。

【０１１９】ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬ感染Ｗ１６２細胞（ＭＯＩ１０〜５００PI）からの上清の
一部（３０μl）を、感染の４８、７２、および９６時間後に採取して、Goff et
al.(1981, J. Virol. 38: 239-248)が記載したプロトコルに従って、逆転写酵
素検査（ＲＴ検査）に使用した。

【０１２０】ＲＴ検査では、ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬに感染した細胞の上清中に、逆転写酵素活
性が（それによりレトロウイルスが）存在することが実証された。レトロウイル
ス粒子の産生は、約２００PIというＭＯＩで最大であった（２回の独立した検査
の結果）。これらのデータから、Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現カセットが機能的であることが明瞭
に示された。

【０１２１】実施例６．ＡｄＴＫ／ＥＮＶ−ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬアデノウイルスによる共感染
後のin vitro での組換えレトロウイルス粒子の産生この実施例は、in vitro での感染性組換えレトロウイルス粒子の産生のため
に、ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬに同時感染（共感染）させた細
胞の使用を記載する。ウイルス粒子の産生の一般的概要を、図５に示す。

【０１２２】６．１．ＡｄＴＫ／ＥＮＶ−ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬアデノウイルスによる共感染これは、ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬおよびＡｄＴＫ／ＥＮＶ（ＭＯＩ５／５PI）に共
感染させたＷ１６２細胞の上清と、ＡｄＧＡＧ／ＰＯＬのみに感染させたＷ１６
２細胞の上清とで、逆転写酵素活性、即ちウイルス産生性を比較することにあっ
た。ＡｄＴＫ／ＥＮＶに感染したＷ１６２細胞の上清、およびＧＰ＋ｅｎｖＡＭ
１２細胞の上清が、それぞれ陰性対照および陽性対照の役割を担った。

【０１２３】各上清の一部（３０μl）を、感染の４８、７２、および９６時間後に採取し
て、ＲＴ検査に使用した。

【０１２４】共感染させた細胞とＡｄＧＡＧ／ＰＯＬ単独で感染させた細胞との間に、時間
を通した差異は見られず、一方ではＧａｇ−ＰｏｌレトロウイルスとＥｎｖレト
ロウイルスの機能の間に、他方ではアデノウイルスとレトロウイルスの機能の間
に、妨害作用が存在しないことが実証された。

【０１２５】６．２．レトロウイルス粒子産生の時間的推移Ｗ１６２細胞をＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬに共感染させた（
ＭＯＩ５／５PI）後、レトロウイルス粒子産生の時間的推移を試験した。

【０１２６】感染後１５日間に一定間隔で、上清の一部（３０μl）を採取して、ＲＴ検査
に使用した。各試料採取の２４時間前に、培地を入れ換えた。感染細胞は、継代
せずに培養を１５日間継続した。

【０１２７】結果を図６に示す。それらから、レトロウイルス粒子の産生が０日目〜４日目
の間に非常に急速に増加し、その後５日目〜１５日目の間に徐々に減少すること
が示された。最初の７日間は、ウイルス産生レベルが５０〜１００％の範囲であ
った。培養の１週間後に細胞が数層に発育し、膜融合により細胞から細胞へ移入
したウイルスが、上清に放出されず、ＲＴ検査で検出されなかったため、ウイル
ス産生性の過小評価を導いた可能性がある。

【０１２８】図７および表１は、アデノウイルスＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯ
Ｌによる感染のＭＯＩに従う、Ｗ１６２細胞でのレトロウイルス粒子産生レベル
を示す。表１に示すように、共感染したＷ１６２細胞の活性は、２００IP／細胞
までは、用いたＭＯＩにほぼ比例した。より高いＭＯＩ（３００および３５０IP
／細胞）では、ＲＴ活性はさらに上昇しなかった。そのため、２００というＭＯ
Ｉが、レトロウイルス粒子の産生に最適であると予測された。これに関係して、
結果から、本発明の系で測定されるＲＴ活性が、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２パッケー
ジング細胞の上清で同条件で測定したものより、３０倍程高くなることが示され
、レトロウイルス粒子の産生おける本発明の有利な側面が確認された（表１）。
その上、共感染させた細胞では、高いＲＴ活性が１週間を超えて持続しており、
ＲＴ活性が４８〜９６時間後に低下する先行技術の方法〔Vile et al., Br. Med
. Bull. 51 (1995) 〕に反することから、本発明の有利な特徴が実証された。

【０１２９】

【表１】

【０１３０】６．３．レトロウイルス粒子へのＴＫＲＮＡのパッケージング目的は、Ｗ１６２細胞をＡｄＧＡＧ／ＰＯＬおよびＡｄＴＫ／ＥＮＶに異なる
ＭＯＩで共感染させた後、産生されたウイルス粒子にパッケージングされたＴＫ
＋ＲＮＡを検出し、定量することであった。

【０１３１】感染の７２時間後に細胞上清を採取し、Murdoch et al.(1997, Gene Ther. 4:
744-749 )の方法に従って、ＲＮＡをレトロウイルス粒子から抽出した。ＲＮＡ
をナイロン膜に乗せて、その後Maniatis T. et al. ("Molecular Cloning, a La
boratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.
Y., 1982 )が記載したプロトコルに従って、放射性標識したＴＫプローブでハイ
ブリダイズさせた。

【０１３２】得られた結果は、図８に表すが、生成したウイルス粒子中のＴＫ＋ＲＮＡの存
在を実証している。パッケージングされたＴＫ＋ＲＮＡの量は、アデノウイルス
共感染のＭＯＩに比例した。

【０１３３】レトロウイルス粒子中のＴＫ＋ＲＮＡの存在から、パッケージングのメカニズ
ムが機能的で、ウイルス粒子が感染細胞の組換えゲノムを伝達し得ることが示さ
れた。

【０１３４】６．４．感染性組換えレトロウイルス粒子の力価測定目的は、Ｗ１６２細胞をＡｄＧＡＧ／ＰＯＬおよびＡｄＴＫ／ＥＮＶに共感染
させた後、産生された感染性レトロウイルス粒子の量を評価することであった。

【０１３５】共感染させた細胞の上清を、感染の４８時間後に採取した。上清の希釈物を、
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＮＩＨマウス尾部繊維芽細胞）に乗せた。感染の４８時間
後に、ＮＩＨ−３Ｔ３ＴＫ＋細胞を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で計
数した。細胞を回収して、４％ホルムアルデヒド中に３０分間固定し、その後０
．２％トリトン中で１０分間溶解した。細胞を１：２５０希釈の抗ＴＫウサギＩ
ｇＧ抗体（ｐＡｂＴＫ４１）とインキュベートし、パワーブロック緩衝液１Ｘ（
バイオゼネックス社）中で洗浄して、その後１：２５０希釈のビオチン結合ウサ
ギ抗ＩｇＧ抗体（シグマ社）で標識した。洗浄後、細胞を１：５００希釈のスト
レプトアビジン−ＦＩＴＣ（アマシャム社）と共に１時間インキュベートして、
フローサイトメトリーで分析した。

【０１３６】ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の平均レトロウイルス価は、１．３×１０⁵IU（感染単位
）／mlであった。これにより、産生された組換えレトロウイルスが機能的で（即
ち感染性があり）、ＴＫ発現カセットを標的細胞に伝達し得ることが示された。
計算したウイルス価により、感染性レトロウイルス粒子の産生性が、現在入手可
能なパッケージング細胞系のそれと同等であることが実証された。

【０１３７】実施例７．in vitro でのｔｋトランスジーンの存在と長期発現この実施例は、ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬに共感染させた細
胞のカルチャーにおいて、ＴＫレトロウイルスカセットの存在と長期発現を実証
するために計画した。非感染細胞及びＡｄＴＫ／ＥＮＶ感染細胞は、対照として
の役割を担った。２つの細胞型を感染させたすなわち：Ｗ１６２及びＮＩＨ−３
Ｔ３。

【０１３８】７．１．in vitro で感染させた細胞のゲノムに組込まれたＴＫレトロウイルス
カセットの存在これは、ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬに共感染させた後培養し
た細胞のゲノムで、ＴＫレトロウイルスカセットの存在を検査することを含んだ
。ｇａｇ−ｐｏｌシストロンが、特に、感染細胞のレトロウイルスゲノムの逆転
写および組込みに必要な、逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮ）を
コードすることを回想されたい。

【０１３９】培養細胞のゲノムＤＮＡを抽出して（ＮＩＨ−３Ｔ３：Ｄ１７およびＤ５０p.
i.；Ｗ１６２：Ｄ５２およびＤ９４p.i.）、その後「ＱＩＡアンプティッシュー
キット（QIAamp tissue kit）」（キアゲン社）を使用し、供給業者の指導書に
従って精製した。以下に記載するオリゴヌクレオチド配列番号１３（Ｕ３領域の
５′末端に相補的な配列に相当する）および配列番号１４（ｔｋ遺伝子の３′末
端に相補的な配列に相当する）と共に、ＰＣＲ反応の鋳型としてＤＮＡ（２μg
）を使用した。

【０１４０】

【化８】

【０１４１】これらのオリゴにクレオチドは、２６１０ｎｔ（１４４４ｎｔおよび１１６６
ｎｔの２つの断片に切断され得る（ＥｃｏＲＩ部位））を増幅するよう選択した
（図９を参照）。この断片を、０．７％アガロースゲル電気泳動で可視化した。全ての時点で、予期したプロフィール（サイズ＋ＥｃｏＲＩ消化）を備えるＰ
ＣＲ断片が、ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬに共感染したＮＩＨ−
３Ｔ３細胞およびＷ１６２細胞に存在した。この断片が、ｔｋ相補的プローブに
より特異的にハイブリダイズすることが確認された（サザンブロット分析）。我
々の実験では、ＮＩＨ−３Ｔ３のシグナルがより強かったことに留意されたい。
非感染細胞およびＡｄＴＫ／ＥＮＶのみに感染した細胞の培養では、断片が検出
されなかった。

【０１４２】これらのデータから、ＴＫ発現カセットが、産生された組換えレトロウイルス
を介して、ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬに共感染した細胞の存在
下で増殖した細胞に伝達されることが示された。この検査で用いた後期時点と、
対照培養でシグナルが存在しなかったことから、ＴＫカセットが細胞のゲノムに
組込まれたことが確認された。その上、ＰＣＲ断片を増殖し得ることで特徴付け
られる５′Ｕ３配列の存在から、逆転写の工程が完全であることが示された。

【０１４３】それゆえ、アデノウイルス−レトロウイルスキメラベクター（chimeric vecto
r）ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬによる細胞の共感染は、ＡｄＴ
Ｋ／ＥＮＶのみの感染とは異なり、蛋白質の長期発現に必要な段階であるＴＫ発
現カセットの組込みを可能にしている。

【０１４４】一組のオリゴヌクレオチド配列番号１５５′−ＧＣＴＣＧＴＣＣＧＧＧＡＴ
ＴＴＧＧＡＧＡＣＣＣ−３′（パッケージング配列の５′末端に相補的な配列）
と配列番号１４（図１０）を使用して、これらの結果を確認した。

【０１４５】７．２．培養で感染させた細胞でのガンシクロビル（ＧＣＶ）毒性の評価これは、ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬによる共感染の後培養し
た細胞での機能的ＴＫ蛋白質の存在についての検査であった。このために、ガン
シクロビル（ＧＣＶ）の存在下、細胞をインキュベートした。ＨＳＶ−１チミジ
ンキナーゼが、ガンシクロビルまたはアシクロビルなどのヌクレオシド類似体を
、ＤＮＡ合成を阻害することにより細胞分裂を停止させる毒剤に変換することを
回想されたい。

【０１４６】ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（Ｄ３１p.i.）およびＷ１６２細胞（Ｄ６９p.i.）を、適
切な濃度範囲（ＮＩＨ−３Ｔ３：０．１、１、５、および１０μM；Ｗ１６２：
１、５、１０、および１００μM）のガンシクロビル（ロッシュ社）の存在下、
３〜５日間インキュベートした。生存細胞を、キット「Cell Titer Aqueous One
Solution Cell Proliferation assay」（プロメガ社）を使用して、供給業者の
指導書に従って計数した。

【０１４７】得られた結果を図１１に表す。ガンシクロビル感受性が、ＡｄＴＫ／ＥＮＶお
よびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬに共感染させた細胞培養で観察された。平均で細胞の４
０％（ＮＩＨ−３Ｔ３）〜１８％（Ｗ１６２）が、ＧＣＶへの感受性を示した。
２種の細胞間のこの差は、ＰＣＲで増幅したＴＫ＋ＤＮＡ断片の量（ＮＩＨ−３
Ｔ３細胞の場合において、より高い）に関係する可能性がある（７．２節を参照
）。ガンシクロビル感受性細胞の数が、バイスタンダー効果により増加し得るこ
とに留意されたい（Fick, J. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:
11071-11075）。

【０１４８】これらのデータから、ＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬによる共感
染の後、培養された細胞のゲノムに組込まれたＴＫレトロウイルスカセットが、
機能的ＴＫ蛋白質をコードしていることが実証された。そのため、アデノウイル
ス−レトロウイルスキメラベクターＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄＧＡＧ／ＰＯＬ
による細胞の共感染は、ＡｄＴＫ／ＥＮＶのみによる細胞感染よりもＴＫ蛋白質
を長期間発現させた。

【０１４９】実施例８：in vivo での導入遺伝子の増幅レトロウイルスを産生して核酸を移入する、本発明の組成物の有効性を、腫瘍
細胞によりin vivo で確認した。

【０１５０】このために、ヒトがん腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ４６０を、in vitro で、アデノウ
イルスＡｄＴＫ／ＥＮＶとＡｄＧＡＧ／ＰＯＬ（各ウイルスでＭＯＩ１００IP／
細胞）とに、またはアデノウイルスＡｄＴＫ／ＥＮＶのみ（ＭＯＩ１００IP／細
胞）に共感染させた。フローサイトメトリー分析では、これらの感染条件が約２
５％のＴＫ陽性細胞を与えることが示された。感染の２０時間後に、４〜６週齢
の無胸腺ヌードマウス（ｎ＝４）の脇腹に、５×１０⁶個の細胞を皮下移植した
。感染の２３日後に動物を殺処分し、腫瘍を切除して、導入遺伝子の存在と存続
とを分析した。対照として、非感染細胞も移植した（ｎ＝２）。

【０１５１】導入遺伝子の存在（および増幅）は、腫瘍のＰＳＩ／ＴＫのＰＣＲ分析で実証
された。このために、ＱＩＡアンプブラッドキット（QIAamp blood kit）（キア
ゲン社）を使用して、総ＤＮＡを腫瘍（５０mg）から精製した。オリゴヌクレオ
チドＴＫ（配列番号１４）と、プライマーとして配列５′−ＧＣＴＣＧＴＣＣＧ
ＧＧＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＣＣ−３′（配列番号１６）のＰＳＩとを使用して、
総ＤＮＡ（２μg）でＰＣＲを実施し、ＴＫプロウイルスおよびＡｄＴＫ／ＥＮ
ＶＤＮＡから２０４１bpの断片を生成した。増幅は、変性温度９５℃で４５秒
間、アニーリング温度６５℃で４５秒間、さらに伸長温度７２℃で４分３０秒間
、の３５サイクルとして実施した。対照として、βアクチンコントロールアンプ
リマー（β-Actin Control Amplimer）（クロンテック社）を使用して、各ＤＮ
Ａ試料毎にＰＣＲを実施した。ＰＣＲ生成物は、１％アガロースゲルで臭化エチ
ジウム染色により明らかにした。

【０１５２】結果は図１２Ａに示すが、腫瘍がアデノウイルスＡｄＴＫ／ＥＮＶおよびＡｄ
ＧＡＧ／ＰＯＬに共感染した後発生した腫瘍（腫瘍Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪ）が、
ＡｄＴＫ／ＥＮＶのみを受けたもの（腫瘍Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦ）またはウイル
スを受けなかったもの（腫瘍ＡおよびＢ）よりも、ＴＫ遺伝子のコピーをより多
く含むことが示された。

【０１５３】増加した導入遺伝子のコピー数を、定量的スロットブロット分析で確認した。
こうして、ＰＳＩ／ＴＫのＰＣＲおよびβアクチンのＰＣＲからの各増幅生成物
（１μl）を、０．４MのＮａＯＨ＋２．２mMのＥＤＴＡ中で２分間９５℃に加熱
し、ハイボンドＮ⁺ナイロン膜（アマシャムライフサイエンス社）上へ移した。
ＤＮＡを固定して、膜を０．２５MのＮａＨ₂ＰＯ₄＋０．２５MのＮａ₂ＨＰＯ₄＋
７％ＳＤＳ中、６５℃で２時間プレハイブリダイズさせた後、同じ条件で一晩ハ
イブリダイズさせた。その後膜を、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃５分間
の２回、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃１５分間の２回、さらに０．１×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃３０分間の２回、により洗浄した。そのプロー
ブは、（α−³²Ｐ）−ｄＣＴＰで無作為に標識したＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子であっ
た。膜を、フジックスホスホリメージャー（Fujix Bas 1000 phosphorimager）
（富士フィルム社）で分析した。結果は図１２Ｂに表すが、ＡｄＴＫ／ＥＮＶの
みに感染した腫瘍と比較すると、ＴＫ遺伝子を含む腫瘍細胞数の１０〜５０倍の
増加を示した。

【０１５４】共感染した腫瘍細胞へのＴＫ遺伝子の組込みは、ＰＣＲ分析で確認された（図
１３のラインＧ〜Ｊ）が、ＴＫプロウイルスはＡｄＴＫ／ＥＮＶのみに感染した
細胞（図１３のライン１Ａ〜Ｆ）からは検出できなかった。

【０１５５】よって、これらの結果から、（ｉ）in vivo での本発明の有効性、（ii）本発
明の系による導入遺伝子の増幅、および（iii）in vivo での標的細胞の染色体
への導入遺伝子の組込み、が実証された。同時に、これらの結果から、核酸を細
胞へ移入すること、および感染性レトロウイルス粒子を産生することへの、本発
明の有利な側面が説明される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】２つのレトロウイルス／アデノウイルスキメラベクター＝アデトロウイルス（
adetrovirus）を含む本発明に係る組成物の使用の概略。

【図２Ａ】レトロウイルス相補機能（２Ｂ、２Ｃ）及びレトロウイルスベクター（２Ａ）
のための発現カセット。

【図２Ｂ】レトロウイルス相補機能（２Ｂ、２Ｃ）及びレトロウイルスベクター（２Ａ）
のための発現カセット。

【図２Ｃ】レトロウイルス相補機能（２Ｂ、２Ｃ）及びレトロウイルスベクター（２Ａ）
のための発現カセット。

【図３】シャトルプラスミドｐＡｄＥＧＰ。Ｅ．／Ｐ．−ＥＦ−１α：ＥＦ−１α遺伝
子のエンハンサー／プロモーター；ｐＡ：ポリアデニル化部位。

【図４】シャトルプラスミドｐＡｄＣＬＴＫＥＥ。Ｅ．／Ｐ．−ＣＭＶ：ＣＭＶエンハ
ンサー／プロモーター；ｐＡ：ポリアデニル化部位。

【図５】本発明の組成物を用いた感染性レトロウイルス粒子の作製のメカニズム。

【図６】ＡｄＴＫ／ＥＮＶ及びＡｄＧＡＧ／ＰＯＬによるＷ１６２細胞の共感染後のレ
トロウイルス粒子産生の時間経緯。

【図７】アデノウイルス感染のＭＯＩによるＷ１６２細胞におけるレトロウイルス粒子
産生

【図８】ウイルス粒子内にパッケージされたＴＫ＋ＲＮＡのスロットブロット定量。

【図９】ＰＣＲ及び酵素分解による、取り込まれたレトロウイルスＴＫ発現カセットの
存在の検出の方法。

【図１０】ＰＣＲ及び酵素分解による、取り込まれた、又は取り込まれていないレトロウ
イルスＴＫカセットの存在の検出の方法。

【図１１】産生されたＴＫレトロウイルスに感染した細胞のガンシクロビル感受性の証明
。

【図１２Ａ】 in vivo のＨ４６０腫瘍細胞におけるＴＫ遺伝子の増幅。ラインＭ：１ｋｂマ
ーカー（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ）；ライン−：ＤＮＡなし；ライン＋：ｐＬＴ
Ｋプラスミド。

【図１２Ｂ】 in vivo のＨ４６０腫瘍細胞におけるＴＫ遺伝子の増幅。ラインＭ：１ｋｂマ
ーカー（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ）；ライン−：ＤＮＡなし；ライン＋：ｐＬＴ
Ｋプラスミド。

【図１３】 in vivo のＨ４６０腫瘍細胞におけるＴＫプロウイルスの増幅。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者イエ，パトリスフランス国、エフ−75005 パリ、リュ・ラセペド 11ビス (72)発明者ペリコデ，ミッシェルフランス国、エフ−28320 エクローヌ、リュ・ドゥ・シャルトル 31 (72)発明者クラッツマン，ダビッドフランス国、エフ−75013 パリ、リュ・デュ・タージュ 11 (72)発明者サルツマン，ジャン−ルーフランス国、エフ−75005 パリ、リュ・クロード・ベルナール 70 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA09 CA20 DA02 DA03 EA02 EA04 FA02 FA06 GA11 GA13 HA13 HA14 HA17 4B065 AA91X AA93X AA95X AA97Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA05 BA30 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくともＥ１及びＥ４領域の全部又は一部を欠損する一つ
又は複数の組換えアデノウイルスに組み込まれている、レトロウイルス粒子を構
成するために必要な遺伝要素の全セットを含む組成物。
【請求項２】遺伝要素が、レトロウイルスベクター及びレトロウイルス相
補性の機能をコードする核酸を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】遺伝要素が、 −レトロウイルスｇａｇタンパク質をコードする核酸、 −レトロウイルスｐｏｌタンパク質をコードする核酸、 −エンベロープタンパク質をコードする核酸、並びに −２つのＬＴＲ領域の間にレトロウイルスパッケージング配列及び目的の核酸
配列を含む核酸を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項４】該遺伝要素が、同一の組換えアデノウイルスに組み込まれて
いる、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】該遺伝要素が、２つの組換えアデノウイルスに分配されてい
る、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】 −レトロウイルスのｇａｇ及びｐｏｌタンパク質をコードす
る一つ又はいくつかの核酸を、そのゲノムに組み込まれて含む、第一の組換えア
デノウイルス、 −エンベロープタンパク質をコードする核酸と、２つのＬＴＲ領域の間にレトロ
ウイルスパッケージング配列及び目的の核酸配列を含む核酸とを、そのゲノム
に組み込まれて含む第二の組換えアデノウイルスを含む、請求項５記載の組成物。
【請求項７】該遺伝要素が、３つの組換えアデノウイルスに分配されてい
る、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】ｇａｇ及びｐｏｌタンパク質が、ＭｏＭＬＶ、ＡＬＶ、ＢＬ
Ｖ、ＭＭＴＶ及びＲＳＶの中から選択されるレトロウイルスに由来するタンパク
質である、請求項３〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】エンベロープタンパク質が、レトロウイルス粒子のヒト細胞
への感染を可能にする、ウイルス又は細胞のタンパク質である、請求項３〜７の
いずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】エンベロープタンパク質が、ＧＡＬＶ、Ａ４０７０、ＲＤ
１１４、ＶＳＶ−Ｇ又は狂犬病ウイルスに由来するエンベロープタンパク質であ
る、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】一つ又は複数のＬＴＲ領域が、逆転写後の完全なレトロウ
イルスＬＴＲ領域、又は完全なＬＴＲの再構成を可能にするサブドメインである
、請求項３〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】５′ＬＴＲがＵ３ドメインを欠失しており、そして３′Ｌ
ＴＲがＵ５ドメインを欠失している、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】遺伝要素がレンチウイルス粒子の構成を可能にするもので
ある、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１４】一つ又は複数の組換えアデノウイルスが、領域Ｅ１、Ｅ４
及びＥ３の全部又は一部を欠損する、請求項１〜１３いずれか１項記載の組成物
。
【請求項１５】一つ又は複数の組換えアデノウイルスが、領域Ｅ１、Ｅ４
及びＥ２の全部又は一部に欠陥を有する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の
組成物。
【請求項１６】一つ又は複数の組換えアデノウイルスが、領域Ｅ１、Ｅ４
及びＥ２及びＥ３の全部又は一部に欠損を有する、請求項１〜１３のいずれか１
項記載の組成物。
【請求項１７】一つ又は複数の組換えアデノウイルスが、アデノウイルス
後期機能をコードする遺伝子の全部又は一部にさらに欠損を有する、請求項１４
〜１６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１８】一つ又は複数の組換えアデノウイルスが、ウイルスのあら
ゆるコーディング領域に欠損を有する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の組
成物。
【請求項１９】少なくとも領域Ｅ１及びＥ４の全部又は一部に欠損を有し
、レトロウイルスのｇａｇ及びｐｏｌタンパク質をコードする一つ又はいくつか
の核酸をそのゲノムに組み込まれて含む、組換えアデノウイルス。
【請求項２０】エンベロープタンパク質をコードする核酸と、２つの完全
又は不完全なＬＴＲ領域の間にレトロウイルスパッケージング配列及び目的の
核酸配列を含む核酸と、を含む欠損組換えアデノウイルス。
【請求項２１】請求項１９に記載の組換えアデノウイルスと請求項２０に
記載の組換えアデノウイルスとを含む組成物。
【請求項２２】 in vitro又はex vivoにおけるレトロウイルス粒子の作製
のための、請求項１〜１８又は２１のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項２３】 in vivoにおけるレトロウイルス粒子の作製を目的とする
産物の調製のための、請求項１〜１８又は２１のいずれか１項記載の組成物の使
用。
【請求項２４】 in vivoで核酸を細胞へ導入することを目的とする産生物
の調製のための、請求項１〜１８又は２１のいずれか１項記載の組成物により改
変された細胞。
【請求項２５】請求項１〜１８又は２１のいずれか１項記載の組成物の存
在下で細胞をインキュベートすることを含む、in vitroにおいてレトロウイルス
粒子を作製するための方法。
【請求項２６】細胞がヒト由来の細胞である、請求項２５記載の方法。