JP2001517452A - 機能的スプライス・ドナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位を含むレトロウイルスベクター - Google Patents

機能的スプライス・ドナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位を含むレトロウイルスベクター

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Abstract

(57)【要約】 レトロウイルスベクターを開示する。このレトロウイルスベクターは、機能的スプライシング供与部位及び機能的スプライシング受容部位を含み、機能的スプライシング供与部位及び機能的スプライシング受容部位が、目的の第1のヌクレオチド配列(NOI)に隣接しており、機能的スプライシング供与部位が、機能的スプライシング受容部位の上流にあり、レトロウイルスベクターがレトロウイルスプロベクターに由来するものであり、レトロウイルスプロベクターが機能的スプライシング供与部位を生成することができる第1のヌクレオチド配列(NS)と、機能的スプライシング受容部位を生成することができる第2のNSとを含み、第1のNSが第2のNSの下流にあって、前記レトロウイルスベクターが前記レトロウイルスプロベクターの逆転写の結果として形成されるレトロウイルスベクター。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ベクターに関するものである。
【０００２】 特に本発明は、レトロウイルス粒子において遺伝子物質をパッケージングし発
現する新規な系に関するものである。
【０００３】 本発明は、より具体的には、目的のヌクレオチド配列（以下「NOI」と略称す る）または複数のNOIをも、1または複数の標的部位にデリバリーできるレトロウ
イルス粒子を発現できる新規な系に関するものである。
【０００４】 加えて本発明は、特に、遺伝子治療において有用な新規なレトロウイルスベク
ターに関するものである。
【０００５】 遺伝子治療は、1箇所または複数の、例えば標的細胞のような標的部位におけ る1または複数のヌクレオチド配列の付加、置換、欠失、補充、操作等の1つまた
は複数を含み得る。標的部位が標的細胞である場合には、この細胞は組織または
器官の一部であり得る。遺伝子治療についての一般的な教示は、Molecular Biol
ogy (Ed Robert Meyers, Pub VCH, 例えば556-558頁)に見られる。
【０００６】 別の例を挙げると、遺伝子治療は、例えば遺伝子のようなヌクレオチド配列を
欠陥遺伝子の交換や補足に用いることができるようにすること、例えば遺伝子の
ような病原性ヌクレオチド配列またはその発現産物を除去することができるよう
にすること、例えばより多くの好ましい表現型を生成するために遺伝子のような
ヌクレオチド配列またはその発現産物を付加、あるいは導入すること、例えば選
択を行う(即ち形質転換された細胞等を形質転換されていない細胞から選択する)
ために遺伝子のようなヌクレオチド配列またはその発現産物を付加あるいは導入
できるようにすること、分子レベルで細胞を操作して、例えば癌(Schmidt-Wolf 及びSchmidt-Wolf, 1994, Annals of Hematology 69;273-279)、または免疫疾患
、循環器（心血管）障害、神経疾患や、炎症性疾患または感染症のような他の疾
病等の疾病状態を処置、治療、または予防できるようにすること、及び例えば遺
伝子ワクチン接種のような免疫応答を誘発するために抗原を操作及び／または導
入できるようにすることのいずれか1つまたは複数を達成する手段となり得る。
【０００７】 近年、レトロウイルスを遺伝子治療に用いることが提案されてきた。レトロウ
イルスは、基本的に溶解性ウイルスと異なる生活環を有するRNAウイルスである 。この点から言えば、レトロウイルスは中間体DNAを介して複製を行う感染性物 質である。レトロウイルスが細胞に感染すると、そのゲノムは逆転写酵素によっ
てDNA形態に変換される。このDNAコピーは、新たなRNAゲノム、及び感染性ウイ ルス粒子の構築に必要な、ウイルスにコードされたタンパク質を生成するための
鋳型となる。
【０００８】 多種のレトロウイルスが存在し、その例としては、マウス白血病ウイルス(MLV
)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、マウス乳癌ウ
イルス(MMTV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、藤浪肉腫ウイルス(FuSV)、モロニー マウス白血病ウイルス(Mo-MLV)、FBRマウス骨肉種ウイルス(FBR MSV)、モロニー
マウス肉腫ウイルス(Mo-MSV)、アベルソンマウス白血病ウイルス(A-MLV)、トリ 骨髄球腫症ウイルス29(MC29)、及びトリ赤芽球症ウイルス(AEV)等が挙げられる 。
【０００９】 レトロウイルスの詳細なリストは、Coffinら("Retrovirus" 1997 Cold Spring
Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-76
3)に見ることができる。
【００１０】 いくつかのレトロウイルスのゲノム構造の詳細が知られている。その例として
、HIVについての詳細は、NCBI Genbank(ゲノム受託番号AF033819)から知ること ができる。
【００１１】 本質的に、全ての野生型レトロウイルスは、必須のビリオンタンパク質をコー
ドする3つの主要なコードドメイン、gag、pol、envを有するが、レトロウイルス
は大きく2つのカテゴリー、即ち「単純型(simple)」と「複雑型(complex)」とに
分けられる。これらのカテゴリは、そのゲノムの構成によって区別できる。単純
型レトロウイルスは、通常基本的な情報のみしか有していない。これに対して複
雑型レトロウイルスは、複数のスプライシングされたメッセージに由来する他の
調節タンパク質もコードしている。
【００１２】 レトロウイルスはさらに7つの群に分類することができる。そのなかの5群は、
発癌性のレトロウイルスである。他の2群はレンチウイスル及び泡沫状ウイルス である。これらのレトロウイルスの概説は、"Retroviruses" (1997 Cold Spring
Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughe, HE Varmus pp 1-25)に
示されている。
【００１３】 ヒトT細胞白血病ウイルス−ウシ白血病ウイルス群(HTLV-BLV)を除く全ての発 癌性のメンバーは、単純型レトロウイルスである。HTLV、BLV及びレンチウイル ス及び泡沫状ウイルスは複雑型レトロウイルスである。もっとも良く研究されて
いる発癌性レトロウイルスとしては、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、マウス乳癌ウ イルス(MMTV)及びマウス白血病ウイルス(MLV)及びヒトT細胞白血病ウイルス(HTL
V)等が挙げられる。
【００１４】 レンチウイルス群はさらに、「霊長類レンチウイルス」と「非霊長類レンチウ
イルス」に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト後天
性免疫不全症候群(AIDS)の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス(HIV)、及びサ ル免疫不全ウイルス(SIV)等が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群としては 、プロトタイプの「遅発性ウイルス」であるビスナ／マエディウイルス(VMV)や 、類縁のヤギ関節炎−脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、及
び最近の文献に記載されたネコ免疫不全ウイルス(FIV)及びウシ免疫不全ウイル ス(BIV)等が挙げられる。
【００１５】 レンチウイルス科と他のタイプのレトロウイルスとを区別するのは、レンチウ
イルスが分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染する能力を有している点である(Lew
isら 1992 EMBO. J 11: 3053-3058; Lewis及びEmerman 1994 J. Virol. 68: 510
-516)。これに対してMLVのような他のレトロウイルスは、例えば筋肉、脳、肺及
び肝臓の組織を形成する細胞のような非分裂細胞に感染することができない。
【００１６】 感染のプロセスにおいて、レトロウイルスは最初に特定の細胞表面受容体に付
着する。感受性を有する宿主細胞中に入ると、レトロウイルスRNAゲノムは、親 ウイルスに保持されている、ウイルスがコードする逆転写酵素によりDNAにコピ ーされる。このDNAは宿主細胞の核に送り込まれ、そこで宿主のゲノムに組み込 まれる。この段階のウイルスは通常プロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、
細胞分裂の間に宿主の染色体中で安定であり、他の細胞タンパク質と同様に転写
される。プロウイルスは、さらに多くのウイルスを生成するのに必要なタンパク
質及びパッケージング機構をコードしており、作り出されたプロウイルスは、「
発芽」とも呼ばれるプロセスによって細胞から放出され得る。
【００１７】 前述したように、各レトロウイルスのゲノムは、ビリオンタンパク質及び酵素
をコードする、gag、pol及びenvと称する遺伝子を有する。プロウイルスでは、 これらの遺伝子の両側に、長い末端反復配列(LTR)と呼ばれる領域が隣接してい る。このLTRがプロウイルスの組み込み及び転写をもたらす。LTRは、エンハンサ
ー−プロモーター配列としての役目も果たす。つまり、LTRはウイルス遺伝子の 発現を調節し得る。レトロウイルスRNAのキャプシドによる包入はウイルスのゲ ノムの5'末端にあるpsi配列によって生ずる。
【００１８】 LTR自体は、U3、R、及びU5と呼ばれる3つのエレメントに分けられる同一の配 列である。U3はRNAの3'末端に独特の配列に由来する。RはRNAの両端において反 復する配列に由来し、U5はRNAの5'末端に独特の配列に由来する。3つのエレメン
トのサイズは、異なるレトロウイルスの間でかなりばらつきがある。
【００１９】 理解を容易にするために、レトロウイルスゲノムのRNA及びDNA形態の一般的な
構成(その通りのスケールではない)を、以下に簡単に示す。ここでは、LTRの基 本的特徴及びgag、pol及びenvの相対的位置を示す。
【００２０】
【化１】
【００２１】 上の図に示すように、感染性レトロウイルスRNAゲノムの基本的な分子の構成 は、(5') R - U5 - gag, pol, env - U3-R (3')である。欠陥レトロウイルスベ クターでは、ゲノムのgag、pol及びenvを欠いているか、またはそれが機能して いないことがある。RNAの両端のR領域は反復配列である。U5及びU3は、それぞれ
RNAゲノムの5'末端及び3'末端で独特の配列を表す。
【００２２】 ビリオンRNAの二本鎖DNAへの逆転写は細胞質内で生じ、鋳型分子の5'末端から
3'末端への逆転写酵素の2回のジャンプを伴う。このジャンプの結果、ビリオンR
NAの5'末端及び3'末端に位置する配列の複製が生ずる。次にこれらの配列が、ウ
イルスDNAの両端にタンデムに融合し、R、U5、及びU3領域を含む長い末端反復配
列(LTR)を形成する。逆転写が終了すると、ウイルスDNAは核内に転位し、そこで
前組み込み複合体(PIC)と称するレトロウイルスゲノムの線状のコピーが、ビリ オンインテグラーゼにより染色体DNAにランダムに挿入され、安定したプロウイ ルスを形成する。宿主の細胞ゲノムへの組み込みが可能な部位の数は非常に多く
、非常に広く分布している。
【００２３】 プロウイルスの転写は、ウイルスのLTRの非コード配列により大部分調節され る。転写開始部位は、(上に示すように)左側LTRにおけるU3とRとの境界にあり、
ポリ(A)付加(終結)部位は、(上に示すように)右側LTRにおけるRとU5との境界に ある。U3はプロウイルスの転写調節エレメントの殆どを含み、転写調節エレメン
トとしては、細胞、場合によってはウイルス転写活性化因子タンパク質に応答す
るプロモーター及び複数のエンハンサー配列が含まれる。いくつかのレトロウイ
ルスは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質をコードするtat、rev、tax及 びrexのような遺伝子のいずれか1つまたは複数を有する。
【００２４】 プロウイルスDNAの転写により、完全長ウイルスRNAゲノム、及びRNAプロセシ ングによって作られるゲノム下サイズ(sub-genomic-sized)のRNA分子が再生成さ
れる。一般に、あらゆるRNA産物がウイルスタンパク質生成のための鋳型となる 。RNA産物の発現は、RNA転写物のスプライシングと、翻訳時のリボソームフレー
ムシフトが組み合わさることによって達成される。
【００２５】 RNAスプライシングは、介在RNA配列、即ち「イントロン」RNA配列が取り除か れ、残りの「エキソン」配列が連結されて翻訳のための連続したリーディングフ
レームが作られるプロセスである。レトロウイルスDNAの最初の転写物はいくつ かの形態で修飾され、細胞mRNAによく似ている。しかし、全てのイントロンが効
率的にスプライシングされる多くの細胞のmRNAとは異なり、新たに合成されたレ
トロウイルスRNAは、2つの集団に分けられなければならない。一方の集団は、ス
プライシングされないでゲノムRNAとしての役目を果たすものであり、他方の集 団はスプライシングされてゲノム下サイズのRNAとなるものである。
【００２６】 完全長のスプライシングされていないレトロウイルスRNA転写物は、2つの機能
を果たす。即ち、それらの転写物は(1) gag及びpol遺伝子産物をコードするとと
もに、(2) ゲノムRNAとして子孫のビリオン粒子にパッケージングされる。ゲノ ム下サイズのRNA分子は、他のウイルス遺伝子産物のmRNAとなる。スプライシン グされたレトロウイルスの転写物はいずれも5'LTRのU5領域にわたる第1のエキソ
ンを有している。最後のエキソンは、そのサイズは異なっているとしても、3' L
TRがコードするU3及びR領域を常に有している。RNA構造の他の部分の構成は、ス
プライシング事象の数及び選択的スプライシング部位の選択による。
【００２７】 単純型レトロウイルスでは、新たに合成されたレトロウイルスRNAの一方の集 団はスプライシングされずにゲノムRNA及びgag及びpolのmRNAとなる。他方の集 団はスプライシングされて、ゲノムRNAの5'部分を下流の遺伝子、最も一般的に はenvに融合させる。スプライシングは、gagの上流に位置するスプライス・ドナ
ー部位と、polの3'末端の近傍に位置するスプライス・アクセプター部位とを用 いて行われる。スプライシングで取り除かれる、スプライス・ドナー部位とスプ
ライス・アクセプター部位との間にあるイントロンはgag及びpol遺伝子を含む。
このスプライシングにより、エンベロープ(Env)タンパク質のmRNAが形成される 。一般に、スプライス・ドナー部位はgagの上流にあるが、ASLVのようないくつ かのウイルスでは、数個のコドンをgag遺伝子中に配置させており、Gagと共通の
アミノ末端の数個のアミノ酸残基を含む一次Env翻訳産物を生ずる。このEnvタン
パク質は、膜結合ポリリボソーム上で合成され、細胞の小胞輸送により原形質膜
に輸送され、そこでウイルス粒子に取り込まれる。
【００２８】 複雑型レトロウイルスは1回スプライシングされた転写物と複数回スプライシ ングされた転写物の両方を生成し、これらの転写物はenv遺伝子産物のみならず 、それらのウイルスに独特な調節タンパク質及びアクセサリータンパク質のセッ
トもコードしている。レンチウイルス、特にHIVのような複雑型レトロウイルス は、レトロウイルスの感染の際に起こり得る選択的スプライシングの複雑さを明
らかに示す例となる。例えば、HIV-1は一次ゲノム転写物から、準最適のスプラ イシングにより30種以上の異なるmRNAを生成することができることが現在知られ
ている。競合するスプライス・アクセプター部位を破壊する変異がスプライシン
グパターンのシフトを生じさせ得、ウイルスの感染力に影響を及ぼし得ることか
ら、この選択プロセスは調節されていると考えられる(Purcell及びMartin 1993
J Virol 67: 6365-6378)。
【００２９】 完全長RNAとゲノム下サイズのRNAの相対的な比率は、感染細胞により異なり、
これらの転写物のレベルの調節は、レトロウイルス遺伝子の発現における調節ス
テップである可能性がある。レトロウイルス遺伝子の発現のためには、スプライ
シングされたRNAとスプライシングされていないRNAの両方が細胞質に輸送されな
ければならず、効率的なレトロウイルス遺伝子の発現のために、スプライシング
されたRNAとスプライシングされていないRNAの適切な比率が維持されなければな
らない。別の種類のレトロウイルスは、この問題に対して独特の解決法を進化さ
せた。完全長の1回スプライシングされるRNAのみを用いる単純型レトロウイルス
は、可変的に効率的なスプライシング部位を使用するか、あるいは部分的にしか
明らかになっていないいくつかのcis作用エレメントをウイルスのゲノムに導入 することによって、それらの種の細胞質での比率を調節している。1回スプライ シングされるRNAと複数回スプライシングされるRNAの両方の合成を誘導する複雑
型レトロウイルスは、例えばHIV-1のrevやHTLV-1のrexのようなアクセサリー遺 伝子の1つのタンパク質産物とRNA上の配列との相互作用を介して、ゲノム下サイ
ズの種々のゲノムRNA種の輸送とおそらくスプライシングの調節を行っている。
【００３０】 構造遺伝子gag、pol及びenv自体についてもう少し詳しく述べると、gagはウイ
ルスの内部構造タンパク質をコードする。Gagは、タンパク分解によって、成熟 タンパク質MA(マトリックス)、CA(キャプシド)、及びNC(ヌクレオキャプシド)に
分解される。pol遺伝子は逆転写酵素(RT)をコードする。逆転写酵素は、DNAポリ
メラーゼと、関連RNアーゼ活性及びインテグラーゼ(IN)とを含み、ゲノムの複製
を媒介する。env遺伝子は、ビリオンの表面(SU)糖タンパク質及び膜貫通(TM)タ ンパク質をコードし、これらは細胞受容体タンパク質と特異的に相互作用する複
合体を形成する。この相互作用が最終的にウイルス膜と細胞膜との融合をもたら
す。
【００３１】 Envタンパク質は、ウイルス粒子を被覆するウイルスタンパク質であり、ウイ ルスの標的細胞への移入を可能とすることに関して必要不可欠な役割を果たす。
レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質複合体は、2種のポリペプチド、即 ち外部の糖鎖をもつ親水性ポリペプチド(SU)と膜貫通タンパク質(TM)とを含む。
この両者がビリオンの表面上にオリゴマーの「ノブ部(knob)」または「ノブ付き
スパイク部(knobbed spike)」を形成する。両ポリペプチドは、env遺伝子により
コードされ、細胞表面への輸送の間にタンパク分解によって切断されるポリタン
パク質前駆体の形に合成される。切断前のEnvタンパク質は受容体に結合できる が、切断自体は、ウイルスの宿主細胞への侵入に必要なタンパク質の融合能を活
性化するために必要である。通常は、SUタンパク質とTMタンパク質の両方におい
て複数の部位でグリコシル化されている。しかし、例えばMLVのようないくつか のウイルスでは、TMはグリコシル化されていない。
【００３２】 SUタンパク質及びTMタンパク質は、エンベロープを有するウイルス粒子の組立
てのために必ずしも必要ではないが、両タンパク質は侵入プロセスにおいて必要
不可欠な役目を果たす。これに関して、SUドメインは、標的細胞上の受容体分子
、多くの場合は特異的な受容体分子に結合する。この結合によりTMタンパク質の
膜融合誘導能が活性化された後、ウイルスの膜と細胞膜の融合が起こると考えら
れている。いくつかのウイルス、特にMLVでは、TMの原形質内にある尾部の短い 部分が除去される切断が、該タンパク質の完全な融合活性を表出させる際に重要
な役割を果たしていると考えられる(Brodyら 1994 J Virol 68: 4620-4627; Rei
nら 1994 J Virol 68: 1773-1781)。TMの膜貫通セグメントから離れた位置にあ る、原形質内のこの「尾部」はウイルス膜の内側に残り、異なる種類のレトロウ
イルスによって長さが著しく異なる。
【００３３】 従って、SU/受容体相互作用の特異性により、レトロウイルスの宿主の範囲及 び組織向性が確定され得る。場合によっては、この特異性が組換えレトロウイル
スベクターの形質導入能を制限し得る。ここで形質導入とは、ウイルスベクター
を用いて非ウイルス遺伝子を標的細胞にデリバリーするプロセスである。このた
め、多くの遺伝子治療実験ではMLVが用いられてきた。4070Aと称するエンベロー
プタンパク質を有する特定のMLVは、両種指向性ウイルスとして知られており、 そのエンベロープタンパク質がヒト及びマウスに保存されているリン酸輸送タン
パク質と「ドッキング」するため、ヒト細胞にも感染することができる。この輸
送体はいたるところに遍在しているので、これらのウイルスは多くのタイプの細
胞に感染し得る。しかし場合によっては、特に安全性の点から、限定された細胞
を特異的に標的にすることが有益なこともある。このため、いくつかのグループ
は、マウス自己向性レトロウイルス(mouse ecotropic retrovirus)を製造し、通
常はマウス細胞のみに感染するその両種指向性の近縁種とは異なり、特定のヒト
細胞に特異的に感染するようにした。Envタンパク質の断片を、エリスロポエチ ンのセグメントで置換することにより、例えば赤血球前駆体のような、その表面
上にエリスロポエチン受容体を発現するヒト細胞に特異的に結合する組換えレト
ロウイルスが生成された(Maulik及びPatel 1997 "Molecular Biotechnology; Th
erapeutic Applications and Strategies" 1997 Wiley-Liss Inc. pp45)。
【００３４】 gag、pol、及びenvに加えて、複雑型レトロウイルスは、アクセサリータンパ ク質、即ち補助タンパク質をコードする「アクセサリー」遺伝子も有している。
アクセサリータンパク質、即ち補助タンパク質は、通常の複製される遺伝子、即
ち構造遺伝子、gag、pol、及びenvによってコードされるものに加えて、アクセ サリー遺伝子によってコードされるタンパク質として定義される。これらのアク
セサリータンパク質は、tat、rev、tax及びrexによってコードされるタンパク質
のような遺伝子発現の調節に関与するタンパク質とは明らかに異なるものである
。アクセサリー遺伝子の例としては、vif、vpr、vpx、vpu及びnefの1種以上が挙
げられる。これらのアクセサリー遺伝子は、例えばHIVにおいて見られる (例え ば"Retrobviruses" Ed. Coffinら Pub. CSHL 1997の802及び803頁を参照)。必須
ではないアクセサリータンパク質は特別な細胞タイプにおいて機能し得、細胞タ
ンパク質により提供される機能と少なくとも部分的に重複している機能を与える
。通常、アクセサリー遺伝子はpolとenvの間、LTRのU3領域を含むenvの下流側の
近傍、またはenv及び相互の重複部分に位置する。
【００３５】 複雑型レトロウイルスは、細胞の転写制御因子とともにウイルスによってコー
ドされた転写活性化因子を用いる調節機構を進化させてきた。これらのトランス
作用性ウイルスタンパク質は、LTRによって指令されるRNAの転写の活性化因子と
しての役目を果たす。レンチウイルスの転写トランス活性化因子は、ウイルスの
tat遺伝子によってコードされる。TatはTARと称する安定なステムループRNA二次
構造に結合し、この構造の機能の1つは、転写をトランス活性化するためにTatを
最適と思われる位置に置くことである。
【００３６】 前述のように、特にNOIまたは複数のNOIを1または複数の目的の部位に移送す るためのデリバリーシステム(デリバリービヒクルまたはデリバリーベクターと も称する)としてレトロウイルスを用いることが提案されてきた。この移送は、i
n vitro、ex vivo、in vivoあるいはこれらの組み合わせにおいて生じ得る。こ のようにレトロウイルスを用いる場合、レトロウイルスは通常レトロウイルスベ
クターまたは組換えレトロウイルスベクターと呼ばれる。レトロウイルスベクタ
ーは、レトロウイルスの生活環のいくつかの側面、例えば受容体の使用、逆転写
、RNAパッケージング等を研究することを目的として開発されてきた(Miller, 19
92 Curr Top Microbiol Immunol 158:1-24に概説されている)。
【００３７】 遺伝子治療で使用するための典型的な組換えレトロウイルスベクターでは、ga
g、pol及びenvタンパク質コード領域のいずれか1つまたは複数の少なくとも一部
分をウイルスから除去し得る。これによりレトロウイルスは複製欠陥を有するも
のとなる。そのゲノムを宿主ゲノムに組み込むことができるが、修飾されたウイ
ルスゲノムは構造タンパク質を欠いているためにそれ自体では増殖することがで
きないウイルスを生成するために、除去された部分をNOIによって置換すること もできる。宿主のゲノムに組み入れられるとNOIの発現が起こり、例えば治療上 及び／または診断上の効果が得られる。すなわち、NOIを目的の部位に移送する ことは、通常、NOIを組換えウイルスベクターに組み込み、その修飾されたウイ ルスベクターをビリオンコートのなかにパッケージングし、目的の部位、例えば
標的細胞や標的細胞の集団の形質導入を可能とすることによって達成される。
【００３８】 パッケージングまたはヘルパー細胞系及び組換えベクターを組み合わせて用い
ることによって、例えばその後に目的の部位の形質導入を行うために、多量のレ
トロウイルスベクターを増殖させ、単離すること(例えば適切な力価のレトロウ イルスベクターを調製すること)が可能である。
【００３９】 ある場合には、増殖と単離においてレトロウイルスのgag、pol及びenv遺伝子 を単離し、それを宿主細胞に個別に導入して、「パッケージング細胞系」を生成
することが必要なことがある。このパッケージング細胞系は、レトロウイルスDN
Aのパッケージングに必要なタンパク質を産生するが、psi領域を欠いているため
DNAを封入することはできない。しかし、NOI及びpsi領域を有する組換えベクタ ーをこのパッケージング細胞系に導入すると、ヘルパータンパク質がpsiポジテ ィブな組換えベクターをパッケージングして組換えウイルス系を生成することが
できる。これを利用して細胞に形質導入し、NOIを細胞のゲノムに導入すること ができる。この組換えウイルスは、ウイルスタンパク質を作るために必要な全て
のゲノム遺伝子を欠いており、1回だけ形質導入することができ、増殖はできな い。単回のみの標的細胞の形質導入が可能なこれらのウイルスベクターは複製欠
陥ベクターとして知られている。従って、有害である可能性のあるレトロウイル
スを発生させることなく、NOIが宿主／標的細胞のゲノムに導入される。使用で きるパッケージング系の概要は、"Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbour L
aboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 449)に記載されて
いる。
【００４０】 レトロウイルスパッケージング細胞系の設計は、特に、初期の設計で頻繁に生
じたヘルパーウイルスの自発的生成の問題に対処するために発展してきた。組換
えは相同性により大きく促進されるので、ベクターゲノムとヘルパーゲノムとの
間の相同性を小さくするか、あるいはなくすことにより、ヘルパーウイルスの生
成の問題が起こることは少なくなった。さらに最近では、gag、pol及びenvウイ ルスコード領域が別々の発現プラスミドに含まれ、それぞれを個別にパッケージ
ング細胞系にトランスフェクトするため、野生型ウイルスを発生させるために3 種の組換え事象が必要なパッケージング細胞が開発された。これによって、複製
‐コンピテントウイルスの発生の可能性が小さくなる。この方法は3プラスミド トランスフェクション法と称されることもある(Soneokaら、1995 Nucl. Acids R
es. 23: 628-633)。
【００４１】 ベクターが開発されれば、一過性トランスフェクションを用いてベクターの発
生を測定することもできる。この点、一過性トランスフェクションにより安定な
ベクター生成細胞系を生成するのにより長い時間をかけなくて済み、またベクタ
ーまたはレトロウイルスパッケージング要素が細胞に対して毒性である場合に用
いることができる。レトロウイルスベクターにを生成するために通常用いられる
要素には、Gag/Polタンパク質をコードするプラスミド、Envタンパク質をコード
するプラスミド、及びNOIを含むプラスミドが含まれる。ベクターの製造では、 これらの要素のうち1または複数の要素の、他の必要な要素を含む細胞への一過 性トランスフェクションを行う。有害な遺伝子、または細胞周期のインヒビター
のような宿主細胞の複製を阻害する遺伝子またはアポトーシスを誘導する遺伝子
をベクターがコードしている場合、安定なベクター生成細胞系を生成することが
困難なことがあるが、一過性トランスフェクションを用いることにより、細胞が
死滅する前にベクターを生成することができる。また、安定なベクター生成細胞
系で得られるレベルに匹敵するベクター力価レベルを生成する細胞系が、一過性
感染を用いて開発された(Pearら 1993, Proc Natl Acad Sci 90:8392-8396)。
【００４２】 安定なHIVをベースにしたパッケージング細胞を生成することを困難にするよ うな毒性がいくつかのHIVタンパク質に存在するため、HIVベクターは、通常はベ
クターとヘルパーウイルスの一過性トランスフェクションにより製造される。HI
VのEnvタンパク質を水疱性口内炎ウイルス(VSV)のEnvタンパク質で置換すること
も行われている。一過性トランスフェクションによりHIV/VSV-Gベクターが5×10 5 (濃縮後108)の力価で生成されるので、VSVのEnvタンパク質を挿入することによ
りベクターの濃縮が容易になる(Naldiniら、1996 Science 272: 263-267)。従っ
て、HIVベクターの一過性トランスフェクションにより高い力価のベクターを生 成するための有用な方法が得られる(Yeeら、1994 PNAS. 91: 9564-9568)。 ベクターの力価に関して、in vitroの培養で得られる導入粒子の力価(通常は1
08粒子/ml以下)や、ウイルスの濃縮・精製のための従来の生化学的及び物理化学
的技術に対する多くのエンベロープを有するウイルスの感受性により、レトロウ
イルスベクターの実用上の使用はかなり限定されたものであった。
【００４３】 例えば、レトロウイルスベクターの濃縮のためのいくつかの方法が開発されて
おり、遠心分離を用いる方法(Fekete及びCepko 1993 Mol Cell Biol 13: 2604-2
613)、中空糸繊維を用いる濾過(Paulら 1993 Hum Gene Ther 4: 609-615)、及び
接線フロー濾過(Kotaniら 1994 Hum Gene Ther 5: 19-28)等が挙げられる。ウイ
ルスの力価を20倍に高めることは可能であるが、レトロウイルスのEnvタンパク 質が比較的脆弱であるためレトロウイルスベクターを濃縮する能力が限定され、
ウイルスの濃縮では、通常感染性ビリオンを少量しか回収できない。この問題は
、レトロウイルスのEnvタンパク質を、上述のようにより高い収率でより効果的 なベクターの濃縮を可能とする、より安定なVSV-Gタンパク質で置換することに より克服することができるが、VSV-Gタンパク質が細胞に対して極めて有害であ るという欠点がある。
【００４４】 107 cfu/mlのヘルパーウイルスを含まないベクターの力価は、現在入手できる
ベクターで得ることができるが、実験は多くの場合これより非常に小さい力価の
ベクターストックで行うことができる。しかし、実用上の理由から、特に多数の
細胞に感染させなければならない場合には高い力価のウイルスが望ましい。さら
に、高い力価は、ある細胞のタイプを大きな割合で形質導入するための必要条件
である。例えば、ヒト造血前駆細胞への感染頻度はベクターの力価によって大き
く左右され、有用な感染頻度は非常に高い力価のストックを用いた場合しか得ら
れない(Hock及びMiller 1986 Nature 320: 275-277; Hogge及びHumphries 1987
Blood 69: 611-617)。このような場合、低いウイルス力価を補償するためには、
単に細胞をより多量のウイルスに露出するだけでは不十分である。逆に、効率的
な形質導入を促進するために、感染性ベクタービリオンの濃度が重要である場合
がある。
【００４５】 遺伝子デリバリーにおいて使用するための高い力価のベクターを生成すること
も試みられている。例えば、異なるベクターの設計を比較することは、高い力価
のウイルスの生成に必要な必須エレメントを確定するのに有用であることが判明
している。異なるレトロウイルスベクターの設計についての初期の研究から、ML
Vの殆ど全ての内部タンパク質コード領域を、ベクターの感染性を失わせること なく取り除くことが可能であることが示されている(Millerら 1983 Proc Natl A
cad Sci 80: 4709-4713)。これらの初期のベクターは、envコード領域の3'末端 の小部分のみを有していた。その後の研究で、全てのenv遺伝子コード配列を、 ベクターの力価をさらに低下させることなく取り除くことが可能であることがわ
かった(Miller及びRosman 1989 Biotechnique 7: 980-990; Morgenstern及びLan
d 1990 Nucleic Acids Res 18: 3587-3596)。ベクターが透過するために必要な のは、プラス及びマイナス鎖DNAプライミングに必要なセグメント及びウイルスR
NAのビリオンへの選択的パッケージングに必要な領域(psi部位; Mannら1983 Cel
l 33: 153-159)を含む、ウイルスのLTR及びLTRに隣接する短い領域のみであると
考えられた。それにも関わらず、これらの初期のベクターで得られたウイルスの
力価は、親ヘルパーウイルスの力価の約10分の1に過ぎなかった。
【００４６】 別の実験により、gag遺伝子の5'末端の配列を保持することによりウイルスベ クターの力価を有意に高められること、及びこれがウイルスRNAのビリオンへの パッケージング効率の増加によるものであることが示された(Armentanoら 1987
J Virol 61: 1647-1650; Benderら1987 J Virol 61: 1639-1646; Adam及びMille
r 1988 J Virol 62: 3802-3806)。この効果は、ベクターのgag領域からのウイル
スタンパク質の合成によるものではない。gagのリーディングフレームの破壊、 あるいはgagコドンの終始コドンへの変異はベクターの力価に影響を与えなかっ たからである(Benderら1987 ibid)。これらの実験により、MLVにおけるゲノムRN
Aの効率的なパッケージングに必要な配列が、遺伝子欠失分析により前に確定さ れたpsiシグナルより大きいことが立証された(Mannら 1983 上出)。高い力価(10 6 から>107)を得るためには、psiプラスと称するこのより大きいシグナルをレト ロウイルスベクターに含めることが重要であることが分かった。現在、このシグ
ナルは、スプライス・ドナー部位の上流からgag開始コドンの下流にわたってい ることが示されている(Benderら 1987 上出)。この位置にあるために、スプライ
シングされたenv発現転写物ではこのシグナルは除去される。これにより、ウイ ルスの生活環のための3つの必須遺伝子を含む完全長転写物のみのパッケージン グが確保される。
【００４７】 ベクターの力価を高めることを目的としてレトロウイルスベクターを操作する
ことに加えて、レトロウイルスベクターは、形質導入された細胞において特定の
NOI(通常はマーカータンパク質)の生成を誘導するようにも設計されている。既 に述べたように、最も一般的なレトロウイルスベクターの設計では、レトロウイ
ルスの配列を1または複数のNOIで置換することにより、複製欠陥ベクターを生成
する。最も単純な方法は、レトロウイルス5'LTRにおけるプロモーターを用いてN
OIをコードするcDNAの発現を調節したり、あるいはLTRのエンハンサー/プロモー
ターを改変して組織特異的発現、または誘導能をもたらすものであった。あるい
は、プロモーターの選択においてより高い柔軟性を許容する内部プロモーターを
用いることにより単一のコード領域を発現させるものであった。
【００４８】 目的の遺伝子発現のためのこれらの方法は、ベクターで形質導入した細胞の選
択を容易にするヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(h
prt) (Millerら 1983 Proc Natl Acad Sci 80: 4709-4713)の場合と同様に、NOI
が選択マーカーであるとき最も容易に実現されるものであった。ベクターが選択
マーカーでないNOIを含む場合、別のプラスミド上に存在する選択マーカーを同 時トランスフェクトすることにより、ベクターをパッケージング細胞に導入する
ことができる。この方法は、1種類のタンパク質が最終的な標的細胞で発現され 、選択マーカーが有し得る毒性または抗原性が回避される点で、遺伝子治療にお
いて非常に有益である。しかし、挿入された遺伝子が選択できないとき、この方
法は、高力価ベクターストックを生成する細胞を生成するのが一層困難になると
いう点で不利である。加えて、ベクターの力価を決定するのが通常より困難にな
る。
【００４９】 2種以上のタンパク質を発現するレトロウイルスベクターの設計に用いられる 現在の方法は、3つの一般的な方法に基づくものである。それらは、(i) 1つのプ
ロモーターから転写され、選択的にスプライシングされたmRNAからの異なるタン
パク質の発現、(ii) 異なるcDNAの転写を誘導するための5' LTRにおけるプロモ ーター及び内部プロモーターの使用、及び(iii) 単一mRNA、またはオープンリー
ディングフレームからその後発現され得る融合タンパク質のいずれかからの複数
のコード領域の翻訳を可能とするための内部リボソーム侵入部位(IRES)の使用で
ある。
【００５０】 内部プロモーターを有するベクターは、複数の遺伝子を発現するために広く用
いられてきた。内部プロモーターにより、遺伝子発現を誘導するためのウイルス
LTR以外のプロモーター／エンハンサーの組み合わせを開発することが可能とな る。複数の内部プロモーターをレトロウイルスベクターに含めることができ、そ
れぞれ自身のプロモーターから少なくとも3種の異なるcDNAを発現できることが 判明している(Overellら 1988 Mol Cell Biol 8: 1803-1808)。
【００５１】 現在、様々な哺乳動物細胞においてNOIを発現するために用いることができる 多くのそのような修飾組換えレトロウイルスベクターが存在するが、このような
レトロウイルスベクターの殆どは、非分裂細胞には形質導入ができないマウスオ
ンコレトロウイルスのような単純型レトロウイルスに由来するものである。
【００５２】 例えば、選択的スプライシングを利用してウイルスLTR SV(X)からの遺伝子を 発現する広く用いられているベクター(Cepkoら1984 Cell 37: 1053-1062)は、選
択マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有する。この
タイプのベクターのモデルは親ウイルスのMO-MLVであり、このMO-MLVでは、Gag 及びGag-Polタンパク質が完全長ウイルスmRNAから翻訳され、Envタンパク質はス
プライシングされたmRNAから作られる。このベクターによりコードされるタンパ
ク質の1つは完全長RNAから翻訳され、5'LTR近傍のスプライス・ドナー部位を、 第2の遺伝子の直ぐ上流にあるスプライス・アクセプター部位とを結合するスプ ライシングによって、そこから第2の遺伝子産物が翻訳され得るRNAが生成される
。この方法の1つの欠点は、スプライシングされた遺伝子のイントロンに外来配 列が挿入されることである。これはスプライシングされたRNAとスプライシング されないRNAの比率に影響を及ぼし得、あるいは第2の遺伝子産物をコードするス
プライシングされたRNAの生成を妨げる選択的スプライス・アクセプター部位を 与え得る(Krmanら 1987 Proc Natl Acad Sci 84: 2150-2154)。これらの影響は 予測不可能であることから、コードされた遺伝子の生成に影響を与え得る。
【００５３】 他の改変レトロウイルスベクターは、スプライシング能について2つの種類に 分けることができる。
【００５４】 改変レトロウイルスベクターの第1の種類は、pBABEベクター(Morgensternら 1
990 Nucleic Acid Research 18: 3587-3596)に代表されるものであり、ウイルス
の転写物のスプライシングを阻害するスプライス・ドナー部位内に(GTからGCへ の)変異を有する。このようなスプライシングの阻害は、2つの理由から有益であ
る。第一に、この阻害により、全てのウイルス転写物がパッケージングシグナル
を有し、従って全てが産生細胞にパッケージングされ得ることが確保される。第
二に、この阻害により、ウイルスのスプライス・ドナー部位と挿入された遺伝子
のクリプティックスプライス・アクセプター部位となり得る部位との間での異常
なスプライシングが起こるのを防ぐことができる。
【００５５】 改変レトロウイルスベクターの第2の種類は、N2(Millerら 1989 Biotechnique
s 7: 980-990)及びより最近のMFG(Dranoffら1993 Proc Natl Acad Sci 19: 3979
-3986)に代表されるものであり、機能的イントロンを有する。両ベクターは、パ
ッケージングシグナル内に見出される通常のスプライス・ドナー部位を用いてい
る。しかし、両ベクターのそれぞれのスプライス・アクセプター部位(SA)は異な
っている。N2では、SAは「伸長された」パッケージングシグナル内にある(Bende
rら1987 ibid)。MFGでは、天然のSA(pol内に見出される、図1参照)が用いられて
いる。両ベクターについて、スプライシングが形質導入された細胞における遺伝
子の発現を著しく高めることが示されている(Millerら 1989 上出; Krallら1996
Gene Therapy 3: 37-48)。このような観察は、一般にスプライシングがmRNAの 翻訳を促進し得るという従来の知見を支持するものである(Leeら1981 Nature 29
4: 228-232; Lewisら 1986 Mol Cell Biol 6: 1998-2010; Chapmanら1991 Nucle
ic Acids Res 19: 3979-3986)。この理由として有力なものの1つは、転写スプラ
イシングに関与するのと同じ機構が核からの転写物の搬出にも働いている可能性
があるということである。
【００５６】 上述の改変レトロウイルスベクターとは異なり、非分裂細胞に感染し得るレト
ロウイルスのレンチウイルス系では、選択的スプライシングについての研究は殆
どない(Naldiniら 1996 Science 272: 263-267)。現在までに文献に記載された レンチウイルスベクターは、HIV-1由来のもの(Kimら1997 J Virol 72: 811-816)
、及びFIVに由来するもの(Poeschlaら 1998 Nat Med 4: 354-357)のみである。 これらのベクターは、やはりウイルス由来のスプライス・ドナー部位及び受容部
位配列を有するものである(Naldiniら 1996 上記)。
【００５７】 遺伝子デリバリー用の高力価のベクターを生成するためのいくつかの異なる方
法では、(i) アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)、ヘルペスウイルス、 及びポックスウイルスのような欠陥ウイルスベクター、及び(ii) 改変レトロウ イルスベクターの設計を利用する。
【００５８】 このアデノウイルスは、RNA中間体を介さない二本鎖の線状DNAウイルスである
。50種以上の異なるヒト血清型のアデノウイルスが存在し、遺伝子配列の相同性
に基づいて6つの亜群に分けられる。アデノウイルスの自然における標的は気道 及び消化管の上皮であり、一般に軽度の症状を呈するのみである。血清型2及び5
(95％の配列同一性を有する)がアデノウイルスベクター系において最も一般的に
用いられ、若齢者の通常上気道への感染を伴う。
【００５９】 アデノウイルスは、エンベロープを有しておらず、正20面体である。典型的な
アデノウイルスとしては、140 nmのキャプシド形成したDNAウイルスがある。ウ イルスの20面体の対称的な構造は、152個のキャプソメア、240個のヘキソン、及
び12個のペントンからなる。この粒子のコアは、36kbの線状二重鎖DNAを有し、 このDNAは、DNA複製のためのプライマーとして作用する末端タンパク質(TP)と 5
'末端で共有結合している。このDNAは、逆方向末端反復配列(ITR)を有し、その 長さは血清型によって異なる。
【００６０】 アデノウイルスの細胞への侵入は一連の独立した事象を伴う。まずウイルスの
繊維(37nm)と細胞上の繊維受容体との間の相互作用を介してウイルスの細胞への
付着が起こる。この受容体は最近、Ad2/5血清型について同定され、CAR(コクサ ッキー及びアデノ受容体、Tomkoら(1997 Proc Natl Acad Sci 94: 3352-2258)と
命名された。細胞のαvβ3及びαvβ5インテグリンを介したウイルスのエンドソ
ームへのインターナリゼーションは、ペントンをベースにしたキャプシドタンパ
ク質におけるウイルスのRGD配列によって媒介される(Wickhamら1993 Cell 73: 3
09-319)。インターナリゼーションの後、エンドソームは、エンドソーム溶解と して知られるプロセスにより破壊される。このエンドソーム溶解は、細胞のαv β5インテグリンによって優先的に促進される事象であると考えられる(Wickham ら1994 J Cell Biol 127: 257-264)。さらに、Ad5繊維ノブ部は、ヒト上皮細胞 及びBリンパ芽球を含む一定の細胞タイプの表面において、高い親和性をもってM
HCクラス1α2ドメインに結合することが最近示された(Hongら 1997 EMBO 16: 22
94-2306)。
【００６１】 その後、ウイルスは核内に転位し、そこで初期領域の活性化が起こり、その直
後にDNA複製及び後期領域の活性化が起こる。アデノウイルスDNAの転写、複製、
パッケージングには、宿主とウイルス両方の機能的タンパク質機構が必要である
。
【００６２】 ウイルスの遺伝子の発現は、初期段階(E)と後期段階(L)に分けることができる
。後期段階は、ウイルスDNA複製の開始によって定義される。アデノウイルスの 構造タンパク質は、通常後期段階において合成される。殆どの血清型について、
アデノウイルスの感染後、感染細胞で宿主の細胞のmRNA及びタンパク質の合成が
阻害される。アデノウイルス2及びアデノウイルス5でのアデノウイルス溶解サイ
クルは非常に効率的で、感染した細胞当たり約10,000個のビリオンが生ずるとと
もに、ビリオンに導入されない過剰なウイルスタンパク質及びDNAが合成される 。初期のアデノウイルスの転写は、複雑な相互に関係する生化学的事象の連続で
あるが、DNA複製の開始前にウイルスRNAの合成が行われることが必要不可欠であ
る。
【００６３】 以下の概略図はアデノウイルスのゲノムの図であり、初期及び後期の遺伝子転
写の相対的方向及び位置を示している。
【００６４】
【化２】
【００６５】 アデノウイルスゲノムの構成は全てのアデノウイルス群において類似しており
、研究された各血清型について特定の機能は一般的に同一の位置にある。初期の
細胞質メッセンジャーRNAは、ウイルスDNA上の4つの確定された連続していない 領域に対して相補的である。これらの領域は、E1〜E4と称する。この初期の転写
物は、中間初期(E1a)、後期初期(Elb、E2a、E2b、E3及びE4)、及び中間領域の配
列に分類されている。
【００６６】 これらの初期遺伝子は感染の約6〜8時間後に発現され、遺伝子ブロックE1〜4 における7つのプロモーターから誘導される。
【００６７】 E1a領域は、ウイルス及び細胞遺伝子の転写トランス活性化とともに、他の配 列の転写抑制に関与する。このE1a遺伝子は、他の初期アデノウイルスメッセン ジャーRNAの全てに対する重要な調節機能を発揮する。正常な組織では、領域E1b
、E2a、E2b、E3、またはE4を効率的に転写するために活性E1a産物が必要である 。しかし、E1a機能はバイパスされ得る。細胞は、E1a様の機能を与えるように操
作することが可能であり、あるいはそのような機能を天然に有し得る。このウイ
ルスは、E1a機能をバイパスするように操作することもできる。ウイルスパッケ ージングシグナルはE1aエンハンサー(194-358nt)と重複している。
【００６８】 E1b領域は、ウイルス及び細胞の代謝、及び宿主のタンパク質の遮断に影響を 与える。この領域には、完全長ウイルスDNAのパッケージングに必要で、ウイル スの熱安定性のために重要なpIXタンパク質をコードする遺伝子(3525-4088 nt) も含まれている。E1b領域は、感染の後期のウイルスにおける事象の正常な進行 に必要である。E1b産物は、宿主の核において作用する。E1b配列内で生じた変異
体は、アデノウイルス感染の後期に通常観察される宿主の細胞輸送の阻害の障害
とともに、後期のウイルスのmRNAの蓄積の低下を示す。E1bは、ウイルスの後期 の遺伝子産物のためにプロセシング及び輸送がシフトするように宿主細胞の機能
を変化させるために必要である。これらの産物によって、ウイルスのパッケージ
ング及びビリオンの放出が生ずる。E1bは、アポトーシスを防ぐ19 kDタンパク質
を生成する。E1bは、p53に結合する55 kDのタンパク質も生成する。アデノウイ ルス及びその複製に関する概説については、WO 96/17053を参照されたい。
【００６９】 E2領域は、72 kDaのDNA結合タンパク質、DNAポリメラーゼ、及びDNA合成を開 始させるためのタンパク質プライミングに必要な55 kDaの末端タンパク質(TP)の
80kDaの前駆体をコードしており、必要不可欠な領域である。
【００７０】 19 kDaのタンパク質(gp19K)はE3領域内にコードされており、ウイルスに対す る宿主の免疫応答の変調に関係していた。このタンパク質の発現は、感染の第1 期の間にTNFαに応答してアップレギュレートされ、その後このタンパク質はMHC
クラスI抗原に結合して、その上皮表面への遊走を防止し、これにより細胞障害 性Tリンパ球によるアデノウイルス感染細胞の認識を低下させる。このE3領域はi
n vitroでの実験では不要であり、1.9 kbのXbaI断片を除くことにより除去する ことができる。
【００７１】 E4領域は、宿主のタンパク質合成の低下及びウイルスのDNA複製の増大に関係 する。
【００７２】 後期遺伝子には5つのファミリーがあり、これらは全て主要な後期プロモータ ーから開始される。この後期遺伝子の発現には、RNAスプライシングに関与する 非常に複雑な転写後調節機構が関与する。繊維タンパク質は、L5領域内にコード
されている。アデノウイルスゲノムには、Ad5においては103 bpでDNA複製に必要
な逆方向反復配列が隣接している。感染後30〜40時間で、ウイルスの生成は完了
する。
【００７３】 アデノウイルスは、遺伝子導入のためのベクターとして用いるために、E2、E3
及びE4プロモーターの誘導のための重要なE1遺伝子を除くことによって変換する
ことができる。E1複製欠陥ウイルスは、ヒト胎児腎細胞系293のようなE1ポリペ プチドをトランスで提供する細胞系において増殖させることができる。治療用遺
伝子または遺伝子群を、E1遺伝子と置き換わるように組換えるによって挿入する
ことができる。この遺伝子の発現は、E1プロモーターあるいは異種プロモーター
のいずれかによって駆動される。
【００７４】 さらに弱毒化されたアデノウイルスベクターも、E4オープンリーディングフレ
ーム(ORF)の一部または全体を除くことによって開発されている。しかし、第二 世代のベクターのなかには、DNAが維持されているようであるとしても、長期間 の遺伝子発現ができないものがあるようである。従って、1つまたは複数のE4のO
RFの機能は、ウイルスが有する少なくともあるウイルスプロモーターからの遺伝
子発現を高めるものであり得る。
【００７５】 より強い欠陥を有するウイルスを生成するための別の方法は、ウイルスの複製
に必要な末端反復配列のみを完全に維持しながらウイルスの「中身（重要部分）
を除去する(gut)」ことである。「中身を除去した」または「中身を除去してい ない」ウイルスは、293細胞系で第一世代のヘルパーウイルスにより高力価で増 殖させることができるが、ヘルパーウイルスから「中身を除去した」ベクターを
分離することが困難であった。
【００７６】 複製‐コンピテントアデノウイルスも遺伝子治療に用いることができる。例え
ば、E1A遺伝子を、腫瘍特異的プロモーターの調節下で第一世代のウイルスに挿 入することができる。理論上、このウイルスを腫瘍に注射すると、このウイルス
は腫瘍において特異的に複製し得るが、周囲の正常な組織では複製できない。こ
のタイプのベクターは、腫瘍細胞を溶解により直接殺すための、あるいはガンシ
クロビルで処置した後感染細胞及び傍観細胞を殺すことができる単純ヘルペスウ
イルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV tk)のような「自殺遺伝子」をデリバリーす
るためのいずれかの目的で用いることができる。あるいは、E1bのみが欠損して いるアデノウイルスは、フェーズ1の臨床試験における抗腫瘍的処置のために特 に用いられている。E1bによってコードされるポリペプチドは、p53により媒介さ
れるアポトーシスを遮断し、細胞がウイルスの感染に応答して自死に至るのを防
止することができる。従って、正常な非腫瘍性細胞では、E1bが欠損している場 合、ウイルスはアポトーシスを遮断することができず、感染性ウイルスを作り出
し拡散させることができない。p53を欠損する腫瘍細胞では、E1b欠陥ウイルスが
増殖し、p53を欠く腫瘍細胞の近くまで拡散することができるが、正常な細胞に 達することはできない。同様に、このタイプのベクターも、HSV tkのような治療
用遺伝子のデリバリーのために用いることができる。
【００７７】 アデノウイルスは遺伝子デリバリー用のベクターとして、以下の理由で他の遺
伝子治療用ベクター系より優れている。
【００７８】 アデノウイルスは、ヒト及びヒト以外を起源とする広い範囲の細胞タイプにお
いてin vino及びin vitroの形質導入が可能な、エンベロープの無い二本鎖DNAウ
イルスである。これらの細胞としては、気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細
胞、滑膜細胞、一次乳房上皮細胞、及びニューロンのような有糸分裂後終末分化
細胞等が挙げられる(但し、単球等のようないくつかのリンパ球はおそらく重要 な例外である)。
【００７９】 アデノウイルスベクターは非分裂細胞への形質導入も可能である。このことは
、肺上皮の患部細胞の代謝回転速度が遅くなる嚢胞性線維症のような疾病におい
て非常に重要である。実際に、アデノウイルスを利用して成人の嚢胞性線維症の
成人患者の肺に嚢胞性線維症輸送体(CFTR)を導入する試みがいくつか進行中であ
る。
【００８０】 アデノウイルスは、遺伝子治療及び異種遺伝子の発現のためのベクターとして
用いられてきた。この大形(36 kb)のゲノムは、最大8kbの外来インサートDNAを 組み込むことができ、補完的な細胞系において効率的に複製して最大1012の非常
に高い力価を生成することができる。従ってアデノウイルスは一次非複製可能細
胞における遺伝子の発現の研究に最適な系の一つである。
【００８１】 アデノウイルスのゲノムからのウイルス遺伝子または外来遺伝子の発現には複
製細胞は不要である。アデノウイルスベクターは、受容体媒介エンドサイトーシ
スにより細胞内に入る。一旦細胞の内部に入ると、アデノウイルスベクターが宿
主染色体に組み込まれることは殆ど無い。そのかわり、アデノウイルスベクター
は、宿主の核で線状ゲノムとして(宿主のゲノムからは独立して)エピソームとし
て機能する。従って、組換えアデノウイルスを用いることにより宿主ゲノムへの
ランダムな組み込みに関連する問題が軽減される。
【００８２】 ヒトの悪性腫瘍はアデノウイルス感染とは関連しない。弱毒化アデノウイルス
株が開発され、生ワクチンとしてヒトにおいて用いられてきた。
【００８３】 しかし、現在のアデノウイルスベクターにはin vivoでの治療上の使用のため にはいくつかの限界がある。このような限界としては、(i) 一過性の遺伝子発現
、即ちアデノウイルスベクターは一般にエピソームの状態にとどまり、複製しな
いため子孫に継代されないこと、(ii) 複製ができないため、標的細胞の増殖に よってベクターが希釈されること、(iii) アデノウイルスタンパク質に対して免
疫応答が誘発されるので、低いレベルであってもアデノウイルスのタンパク質を
発現する細胞は破壊されること、及び(iv) in vivoデリバリーによってベクター
が取り込まれたり、デリバリーされた遺伝子が標的細胞の一部でしか発現されな
いため、有効な治療係数を達成できないこと等が挙げられる。
【００８４】 アデノウイルスの特徴をレトロウイルス／レンチウイルスの遺伝的な安定性と
組み合わせることができるならば、実質的に、アデノウイルスを標的細胞への形
質導入を行うために用いて、安定に近傍の細胞に感染し得る一過性のレトロウイ
ルスを産生する細胞となるようにすることができる。
【００８５】 本発明は、新規なレトロウイルスベクターを提供することを目的とする。
【００８６】 特に、本発明は、1または複数の所望の標的部位においてNOIまたは複数のNOI を効率的に発現させることができる新規なレトロウイルスベクターを提供するこ
とを目的とする。
【００８７】 本発明はまた、in vivoでの使用のための安全な特徴を有しており、1または複
数の所望の標的部位においてNOIまたは複数のNOIを効率的に発現させることがで
きるベクタービリオンを高い力価で調製するための新規な系を提供することを目
的とする。
【００８８】 本発明の第1の形態によれば、機能的スプライス・ドナー部位(functional spl
ice donor site)及び機能的スプライス・アクセプター部位(functional splice
acceptor site)を含むレトロウイルスベクターであって、機能的スプライス・ド
ナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位が、目的の第1のヌクレオチ ド配列(NOI)に隣接しており、機能的スプライス・ドナー部位が、機能的スプラ イス・アクセプター部位の上流にあり、該レトロウイルスベクターがレトロウイ
ルスプロベクターに由来するものであり、レトロウイルスプロベクターが機能的
スプライス・ドナー部位を生成することができる第1のヌクレオチド配列(NS)と 、機能的スプライス・アクセプター部位を生成することができる第2のNSとを含 み、第1のNSが第2のNSの下流にあって、前記レトロウイルスベクターが前記レト
ロウイルスプロベクターの逆転写の結果として形成されるレトロウイルスベクタ
ーが提供される。
【００８９】 本発明の第2の形態によれば、レトロウイルスプロベクターがレトロウイルス パッケージングシグナルを含み、第2のNSがレトロウイルスパッケージングシグ ナルの下流に位置し、それによりスプライシングが一次標的部位で防止されるレ
トロウイルスベクターが提供される。
【００９０】 本発明の第3の形態によれば、第2のNSが第1のNOIの下流に位置し、それにより
第1のNOIが一次標的部位で発現され得るレトロウイルスベクターが提供される。
【００９１】 本発明の第4の形態によれば、第2のNSが複数のクローニング部位の上流に位置
し、それにより1または複数の追加のNOIが挿入され得るレトロウイルスベクター
が提供される。
【００９２】 本発明の第5の形態によれば、第2のNSが免疫学的分子またはその一部をコード
するヌクレオチド配列であるレトロウイルスベクターが提供される。
【００９３】 本発明の第6の形態によれば、免疫学的分子が免疫グロブリンであるレトロウ イルスベクターが提供される。
【００９４】 本発明の第7の形態によれば、第2のNSが免疫グロブリンの重鎖の可変領域をコ
ードするヌクレオチド配列であるレトロウイルスベクターが提供される。
【００９５】 本発明の第8の形態によれば、機能的イントロンをさらに含むレトロウイルス ベクターが提供される。
【００９６】 本発明の第9の形態によれば、前記機能的イントロンが所望の標的部位におい てNOIの少なくとも1つの発現を抑制できるように配置されているレトロウイルス
ベクターが提供される。
【００９７】 本発明の第10の形態によれば、前記標的部位が細胞であるレトロウイルスベク
ターが提供される。
【００９８】 本発明の第11の形態によれば、前記ベクターまたはプロベクターがマウスオン
コレトロウイルスまたはレンチウイルスから誘導され得るものであるレトロウイ
ルスベクターが提供される。
【００９９】 本発明の第12の形態によれば、前記ベクターがMMLV、MSV、MMTV、HIV-1または
EIAVから誘導され得るものであるレトロウイルスベクターが提供される。
【０１００】 本発明の第13の形態によれば、レトロウイルスベクターが組み込まれたプロウ
イルスであるレトロウイルスベクターが提供される。
【０１０１】 本発明の第14の形態によれば、レトロウイルスベクターから得ることができる
レトロウイルス粒子が提供される。
【０１０２】 本発明の第15の形態によれば、レトロウイルスベクターでトランスフェクトま
たは形質導入された細胞が提供される。
【０１０３】 本発明の第16の形態によれば、医薬で使用するためのレトロウイルスベクター
またはウイルス粒子または細胞が提供される。
【０１０４】 本発明の第17の形態によれば、1または複数のNOIをそれを必要とする標的部位
にデリバリーするための医薬組成物を製造するためのレトロウイルスベクターま
たはウイルス粒子または細胞が提供される。
【０１０５】 本発明の第18の形態によれば、レトロウイルスベクターもしくはウイルス粒子
により、または細胞の使用により細胞をトランスフェクトまたは形質導入するこ
とを含む方法が提供される。
【０１０６】 本発明の第19の形態によれば、レトロウイルスベクターまたはウイルス粒子ま
たは細胞のためのデリバリー系であって、NOIまたは複数のNOIを第1の標的細胞 にデリバリーするための1または複数の非レトロウイルス発現ベクター、アデノ ウイルスもしくはプラスミドまたはそれらの組み合わせと、NOIまたは複数のNOI
を第2の標的細胞にデリバリーするためのレトロウイルスベクターとを含むデリ バリー系が提供される。
【０１０７】 本発明の第20の形態によれば、レトロウイルスプロベクターが提供される。 本発明の第21の形態によれば、所望の標的細胞内で1または複数のNOIの発現を
抑制するための機能的イントロンの使用が提供される。
【０１０８】 本発明の第22の形態によれば、第1のNSをレトロウイルスプロベクターの3'末 端からレトロウイルスベクターの5'末端にデリバリーするための逆転写酵素の使
用が提供される。
【０１０９】 本発明の第23の形態によれば、in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッ ドウイルスベクター系であって、二次ウイルスベクターをコードする1または複 数の一次ウイルスベクターを含み、一次ベクターまたはベクター群が第1の標的 細胞に感染し、そのなかで二次ウイルスベクターを発現することができ、二次ベ
クターが二次標的細胞の形質導入を行うことができる前記ハイブリッドウイルス
ベクター系が提供される。
【０１１０】 本発明の第24の形態によれば、ハイブリッドウイルスベクター系であって、一
次ベクターがアデノウイルスベクターから得ることができるもの、あるいはそれ
をベースにしたものであり、及び／または二次ベクターがレトロウイルスベクタ
ー、好ましくはレンチウイルスベクターから得ることができるもの、あるいはそ
れをベースにしたものである前記ハイブリッドウイルスベクター系が提供される
。
【０１１１】 本発明の第25の形態によれば、前記レンチウイルスベクターが、スプリット‐
イントロン(split-intron)構造を有するか、またはそれをデリバリーすることが
できるハイブリッドウイルスベクター系が提供される。
【０１１２】 本発明の第26の形態によれば、レンチウイルスベクター系であって、レンチウ
イルスベクターが、スプリット‐イントロン構造を有するか、またはそれをデリ
バリーすることができる前記レンチウイルスベクター系が提供される。
【０１１３】 本発明の第27の形態によれば、アデノウイルスベクター系であって、アデノウ
イルスベクターが、スプリット‐イントロン構造を有するか、またはそれをデリ
バリーすることができる前記アデノウイルスベクター系が提供される。
【０１１４】 本発明の第28の形態によれば、pElsp1A、pCI-Neo、pE1RevE、pE1HORSE3.1、pE
1PEGASUS4、pCI-Rab、pE1Rabとして提示されるもののなかの1つまたは複数をベ ースとするか、またはそれから得られるベクターまたはプラスミドが提供される
。
【０１１５】 本発明の第29の形態によれば、標的細胞においてNOIを差別的に発現し得るレ トロウイルスベクターが提供される。
【０１１６】 本発明の別の形態として、in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッドウ イルスベクター系があり、このベクター系は二次ウイルスベクターをコードする
一次ウイルスベクターを含み、一次ベクターは第1の標的細胞に感染し、そのな かで二次ウイルスベクターを発現することができ、二次ベクターは二次標的細胞
の形質導入を行うことができ、一次ベクターはアデノウイルスベクターから得る
ことができるもの、あるいはそれをベースにしたものであり、二次ウイルスベク
ターはレトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターから得るこ
とができるもの、あるいはそれをベースにしたものである。
【０１１７】 本発明の別の形態として、in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッドウ イルスベクター系があり、このベクター系は、二次ウイルスベクターをコードす
る一次ウイルスベクターを含み、一次ベクターは第1の標的細胞に感染し、その なかで二次ウイルスベクターを発現することができ、二次ベクターは二次標的細
胞の形質導入を行うことができ、一次ベクターはアデノウイルスベクターから得
ることができるもの、あるいはそれをベースにしたものであり、二次ウイルスベ
クターはレトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターから得る
ことができるもの、あるいはそれをベースにしたものであり、前記ベクター系は
機能的スプライス・ドナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位を含み
、機能的スプライス・ドナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位は目
的の第1のヌクレオチド配列(NOI)に隣接しており、機能的スプライス・ドナー部
位は機能的スプライス・アクセプター部位の上流にあり、レトロウイルスベクタ
ーはレトロウイルスプロベクターに由来するものであり、レトロウイルスプロベ
クターは機能的スプライス・ドナー部位を生成することができる第1のヌクレオ チド配列(NS)と、機能的スプライス・アクセプター部位を生成することができる
第2のNSとを含み、第1のNSは第2のNSの下流にあって、前記レトロウイルスベク ターは前記レトロウイルスプロベクターの逆転写の結果として形成されるもので
ある。
【０１１８】 好ましくは、前記レトロウイルスプロベクターは第2のヌクレオチド配列の上 流にある第3のNSを含み、第3のNSが非機能的スプライス・ドナー部位を生成する
ことができるものである。
【０１１９】 好ましくは、前記レトロウイルスベクターはさらに第2のNOIを含み、第2のNOI
が機能的スプライス・アクセプター部位の下流にあるものである。
【０１２０】 好ましくは、前記レトロウイルスプロベクターは第2のNOIを含み、第2のNOIが
第2のヌクレオチド配列の下流にあるものである。
【０１２１】 好ましくは、前記第2のNOIまたはその発現産物が治療剤または診断剤であるか
またはそれらを含むものである。
【０１２２】 好ましくは、前記第1のNOIまたはその発現産物が、1または複数の選択性を与 える剤(例えばマーカーエレメント)、ウイルスの必須エレメントもしくはその一
部、またはそれらの組み合わせを含むものである。
【０１２３】 好ましくは、前記第1のNSがレトロウイルスプロベクターの3'末端またはその 近傍にあり、好ましくは、この3'末端がU3領域及びR領域を含み、かつ好ましく は、前記第1のNSがU3領域とR領域との間に位置するものである。
【０１２４】 好ましくは、前記レトロウイルスプロベクターのU3領域及び／または第1のNS が第3のNOIであるNSを含み、前記NOIが1または複数の転写調節エレメント、コー
ド配列またはその一部であるものである。
【０１２５】 好ましくは、第1のNSはウイルスから得ることができるものである。
【０１２６】 好ましくは、第1のNSはイントロンまたはその一部である。
【０１２７】 好ましくは、前記イントロンは、SV40ウイルスの小形のtイントロンから得る ことができるものである。
【０１２８】 好ましくは、ベクターの構成要素は調節されている。本発明のある好ましい形
態においては、ベクターの構成要素は低酸素状態(hypoxia)により調節されてい る。
【０１２９】 本発明の別の好ましい形態においては、前記ベクターの構成要素が、テトラサ
イクリン・オン／オフ系により調節される。
【０１３０】 このように本発明は、レトロウイルスベクターを利用するデリバリー系を提供
する。
【０１３１】 本発明のデリバリー系のレトロウイルスベクターは、第1のNOIに隣接する機能
的スプライス・ドナー部位(FSDS)及び機能的スプライス・アクセプター部位(FSA
S)を含む。このレトロウイルスベクターは、複数のNOIを含み得るレトロウイル スプロベクターの逆転写の結果、形成される。
【０１３２】 FSDSがFSASの上流に位置している場合には、介在配列はスプライシング可能で
ある。一般に、スプライシングにより、介在、即ち「イントロン」RNA配列が除 かれ、残りの「エキソンの」配列が連結して翻訳のための連続した配列が得られ
る。
【０１３３】 このスプライシングプロセスは、以下のように図解することができる。
【０１３４】
【化３】
【０１３５】 この図でYはスプライシングの結果取り除かれる介在配列を表す。
【０１３６】 レトロウイルスベクターの天然のスプライシング形態を図27aに示す。公知の ベクターのスプライシング形態を図27bに示す。本発明によるスプライシング形 態を図27cに示す。
【０１３７】 本発明によれば、FSDSがFSASの下流にある場合にはスプライシングは生じ得な
い。
【０１３８】 同様に、FSDSが非機能的スプライス・ドナー部位(NFSDS)である場合、及び／ またはFSASが非機能的受容部位(NFAS)である場合には、スプライシングは生じ得
ない。
【０１３９】 NFSDSの一例としては、スプライシング機構がFSDSを認識できなくなるように 変異したFSDSがある。
【０１４０】 本発明によれば、各NSは、任意の適切なヌクレオチド配列であり得る。例えば
、各配列は独立したDNAまたはRNAであり得、合成により作製されたもの、組換え
DNA技術を用いて作製されたもの、天然の起源から単離されたもの、あるいはこ れらを組み合わせたものであり得る。この配列はセンス配列またはアンチセンス
配列であり得る。また、互いに直接または間接的に連結され得る複数の配列、あ
るいはそれらを組み合わせた複数の配列が存在し得る。
【０１４１】 本発明によれば、各NOIは任意の適切なヌクレオチド配列であり得る。例えば 、各配列は独立したDNAまたはRNAであり得、合成により作製されたもの、組換え
DNA技術を用いて作製されたもの、天然の起源から単離されたもの、あるいはこ れらを組み合わせたものであり得る。この配列はセンス配列またはアンチセンス
配列であり得る。また、互いに直接または間接的に連結され得る複数の配列、あ
るいはそれらを組み合わせた複数の配列が存在し得る。
【０１４２】 第1のNOIは、レトロウイルスベクターにおいて用いることに成功している以下
の選択マーカー、即ちそれぞれG418及びハイグロマイシンに対する耐性を与える
細菌性ネオマイシン及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Pal
merら 1987 Proc Natl Acad Sci 84: 1055-1059; Yangら 1987 Mol Cell Biol 7
: 3923-3928)、メトトレキセートに対する耐性を与える変異体マウスジヒドロ葉
酸レダクターゼ遺伝子(dhfr)(Millerら 1985 Mol Cell Biol 5: 431-437)、マイ
コフェノール酸、キサンチン及びアミノプテリンを含む培地での細胞の増殖を可
能とする細菌性gpt遺伝子(Mannら 1983 Cell 33: 153-159)、ヒスチジンを含ま ないがヒスチジノールを含む培地での細胞の増殖を可能とする細菌性hisD遺伝子
(Danos及びMulligan 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 6460-6464)、様々な薬剤に 対する耐性を与える多剤耐性遺伝子(mdr)(Guildら 1988 Proc Natl Acad Sci 85
: 1595-1599; Pastanら1988 Proc Natl Acad Sci 85: 4486-4490)、及びピュー ロマイシンまたはフレオマイシンに対する耐性を与える細菌性遺伝子(Morgenste
rn及びLand 1990 Nucleic Acid Res 18: 3587-3596)のなかの1つまたは複数を含
み得る。
【０１４３】 これらのマーカーは全て優性な選択マーカーであり、これらの遺伝子を発現す
る殆どの細胞の化学的選択を可能とする。βガラクトシダーゼもまた強力なマー
カーとみなしうる。βガラクトシダーゼを発現する細胞は、蛍光活性化セルソー
ターを用いて選択することができる。実際、どの細胞表面タンパク質も、そのタ
ンパク質を作っていない細胞に対する選択マーカーとなりうる。該タンパク質を
発現する細胞は、該タンパク質に対する蛍光抗体および細胞選別器を用いて選択
することができる。ベクターに使用されてきた他の選択マーカーにはhprtおよび
HSV チミジンキナーゼが含まれる。これらは、ヒポキサンチン、アメトプテリン
およびチミジンを含む培地における細胞の増殖を可能とするものである。
【０１４４】 第１のNOIは、例えばレトロウイルスのパッケージング部位などの非コード配 列、または第２のNOIをプロベクター中で非機能性とする非センス配列であって 、該ベクターのスプライシングによって除去された時には第２のNOIが機能性発 現によって発現される非センス配列を含むことができるであろう。
【０１４５】 第１のNOIはまた、Envタンパク質をコードするenv遺伝子等のウイルスの必須 要素をコードしていてもよく、これは産生系の複雑さを減じることができる。例
えば、アデノウイルスベクターにおいては、これはレトロウイルスベクターゲノ
ムおよびエンベロープが同一プロモーターの制御下にある１つのアデノウイルス
ベクター内に配置されることを可能とし、その結果より単純な系を提供し、かつ
アデノウイルスベクター内に付加的配列を入れるためのより大きいキャパシティ
(capacity)を残す。１つの態様においては、これらの付加的配列はgag-pol カセ
ット自体でありうる。このように、１個のアデノウイルスベクター内にレトロウ
イルスベクター粒子を作製することができるのである。以前の研究(Fengら, 199
7, Nature Biotechnology 15: 866)では、複数のアデノウイルスベクターを使用
しなければならなかった。
【０１４６】 レトロウイルス構成要素がenvヌクレオチド配列を含んでいるならば、場合に より、該配列の全部または一部を、例えば4070Aと称する両種指向性Envタンパク
質、またはインフルエンザ赤血球凝集素(HA)、または水疱性口内炎ウイルスG (V
SV-G) タンパク質等の他のenv核酸配列の全部または一部と置換することができ る。env遺伝子の異種env遺伝子との置換は、擬似タイピング(pseudotyping)と呼
ばれる技法または戦略の１例である。擬似タイピングは新しい現象ではなく、こ
の例はWO-A-98/05759, WO-A-98/05754, WO-A-97/17457, WO-A-96/09400, WO-A-9
1/00047およびMebatsionら, 1997 Cell 90, 841-847に見いだすことができる。
【０１４７】 １つの好ましい態様においては、本発明のレトロウイルスベクターは擬似タイ
ピング(pseudotyped)されている。このことについて、擬似タイピングは１つ以 上の利点を付与することができる。例えば、これらのベクターを用いた場合、HI
Vに基づくベクターのenv遺伝子産物は、レンチウイルスベクターがCD4と呼ばれ るタンパク質を発現する細胞にのみ感染するように感染を制限するであろう。し
かし、これらのベクター内のenv遺伝子が他のRNAウイルス由来のenv配列に置換 されていたならば、これらのベクターはより広い感染スペクトルを持つことがで
きる(VermaおよびSomia, 1997, Nature 389:239-242)。例えば、研究者はVSV由 来の糖タンパク質を用いてHIVに基づくベクターを擬似タイピングした(Vermaお よびSomia, 1997, 同じ箇所）。
【０１４８】 さらに別の態様においては、Envタンパク質は突然変異した、または工学的に 作製されたEnvタンパク質、等の改変Envタンパク質であってよい。改変はターゲ
ッティング能力を導入するように、または毒性を減少させるように、または他の
目的のために実施または選択することができる(Valsesia-Wittmanら，1996, J.
Virol 70: 2056-64; Nilsonら，1996, Gene Therapy 3: 280-6; Fieldingら，19
98, Blood 9: 1802およびそこに引用されている文献）。
【０１４９】 適切な第２のNOIコード配列は、治療用および／または診断用のコード配列を 含む。これらの配列には、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、工学的
に作製された免疫グロブリン様分子、１本鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫
共刺激(co-stimulatory)分子、免疫調節分子、アンチセンスRNA、標的タンパク 質のトランスドミナント(transdominant)陰性突然変異体、毒素、条件付き毒素 、抗原、腫瘍抑制タンパク質および増殖因子、膜タンパク質、血管作用性タンパ
ク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、およびそれらの
誘導体（例えば、関連するリポーターグループを伴うもの）をコードする配列が
含まれるが、それらだけに限定されない。第２のNOIに含まれる場合、このよう なコード配列は典型的には適切なプロモーターに機能しうる形で連結されること
ができる。このプロモーターは、リボザイムの発現を駆動するプロモーター、ま
たは異なる１もしくは複数のプロモーターであってよい。
【０１５０】 第２のNOIコード配列は、融合タンパク質、またはコード配列の１セグメント をコードするものであってよい。
【０１５１】 本発明のレトロウイルスベクターは、癌の治療のため、プロドラッグ活性化酵
素等の第２のNOIを腫瘍部位に送達するために用いることができる。各症例にお いて、個体（患者など）の治療に適切なプロドラッグが適切なプロドラッグ活性
化酵素と組み合わせて用いられる。適切なプロドラッグがベクターと共に投与さ
れる。プロドラッグの例は、リン酸エトポシド（アルカリ性フォスファターゼと
共に、Senterら，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 4842-4846); 5-フルオロ シトシン（シトシンデアミナーゼと共に、Mullenら，1994, Cancer Res 54: 150
3-1506); ドキソルビシン-N-p-ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン
-V-アミダーゼと共に、Kerrら，1990, Cancer Immunol. Immunother. 31: 202-2
06); パラ-N-ビス(2-クロロエチル）アミノベンゾイルグルタメート（カルボキ シペプチダーゼG2と共に）；セファロスポリンナイトロジェンマスタードカルバ
メート（βラクタマーゼと共に）；SR4233 (P450レダクターゼと共に）；ガンシ
クロビル（HSV チミジンキナーゼと共に、Borrelliら，1988, Proc. Natl. Acad
. Sci. 85: 7572-7576); マスタードプロドラッグ（ニトロレダクターゼと共に
、Friedlosら，1997, J. Med. Chem. 40: 1270-1275)およびシクロホスファミド
(P450 と共に、Chenら，1996, Cancer Res. 56:1331-1340)を含む。
【０１５２】 本発明のベクターは、ウイルス性または非ウイルス性ベクターによって標的部
位に送達することができる。 当技術分野で周知のように、ベクターとはある実在物を１つの環境から他の環
境へ運ぶことを可能とする、または容易にする道具である。例えば、遺伝子組換
え技法に用いられているいくつかのベクターは、DNAの１セグメント（異種DNAセ
グメント、異種cDNAセグメント、等）が標的細胞中に導入されることを可能とす
る。場合により、いったん標的細胞に入った後、ベクターは該細胞内で異種DNA を維持するのに役立ちうる。またはDNA複製の単位として作用しうる。遺伝子組 換え技法に用いられているベクターの例は、プラスミド、染色体、人工染色体ま
たはウイルスを含む。
【０１５３】 非ウイルス性送達系はDNAトランスフェクション法を含むが、これだけに限定 されない。本発明においては、トランスフェクションは、遺伝子を標的哺乳動物
細胞に送達するために非ウイルス性ベクターを用いる方法を含む。
【０１５４】 典型的なトランスフェクション法はエレクトロポレーション、DNAバイオリス ティクス法（biolistics）、脂質媒介トランスフェクション、コンパクト化(com
pacted) DNA媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポ フェクチン、カチオン性作用物質媒介トランスフェクション、カチオン性表面両
親媒性物質(CFA)(Nature Biotechnology, 1996, 14:556) およびこれらの組合せ
を含む。
【０１５５】 ウイルス性送達系は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AVV)ベ クター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルス
ベクター、バキュロウイルスベクターを含むが、これらだけに限定されない。ベ
クターの他の例は、ex vivo 送達系を含む。これらの系はエレクトロポレーショ
ン、DNAバイオリスティクス法（biolistics）、脂質媒介トランスフェクション 、コンパクト化DNA媒介トランスフェクション等のDNAトランスフェクション法を
含むが、これらだけに限定されない。
【０１５６】 本発明のベクター送達系は、二次ベクターをin vivoで作製するのに必要な遺 伝子をコードする、in vitroで作製された一次ベクターから成ることができる。 一次ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイル
スまたはポックスウイルスベクター等の種々の異なるウイルスベクターであって
よい。または、一次ウイルスベクターが複数である場合は、起源を異にするウイ
ルスベクターの混合物であってよい。いずれの場合にも、好ましくは、一次ウイ
ルスベクターは独立複製が不可能であるという点で欠陥性である。したがって、
それらは標的細胞に入ってそこに二次ベクター配列を送達することはできるが、
複製してさらなる標的細胞に感染を続行することはできない。
【０１５７】 ハイブリッドウイルスベクター系が二次ベクターをコードする２個以上の一次
ベクターを含む場合は、一次標的細胞集団をトランスフェクションまたは形質導
入するのに一次ベクターの両方または３個全部が、通常は同時に用いられる。
【０１５８】 好ましくは、二次ウイルスベクターの全ての構成要素をコードする１個の一次
ウイルスベクターが存在する。
【０１５９】 好ましい１または複数の一次ウイルスベクターはアデノウイルスベクターであ
る。 本発明に用いるアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス由来であって
も、または通常ヒトに感染しないアデノウイルスに由来するものであってもよい
。好ましくは、上記ベクターはアデノウイルス２型もしくは５型（Ad2またはAd5
)、またはマウスアデノウイルス、またはCELOウイルス(Cottonら，1993, J. Vir
ol 67: 3777-3785) 等のトリアデノウイルスに由来するものである。上記ベクタ
ーは複製能のあるアデノウイルスベクターであってよいが、より好ましくは欠陥
アデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは該ウイルスの複製に
必要な１以上の構成要素を欠失させることによって欠陥ウイルスとすることがで
きる。典型的には、各アデノウイルスベクターはE1領域に少なくとも１つの欠失
を含む。感染性アデノウイルスベクター粒子を作製するためには、E1遺伝子を含
むAd5 左部分のコピーが組み込まれたヒト胚繊維芽細胞系（ヒト293細胞系など ）中でウイルスを継代(passage)させることによって上記欠失を補完することが できる。異種DNAをこのようなベクターに挿入するためのキャパシティは、約7 k
bまである。したがって、このようなベクターは、それぞれがレトロウイルス二 次ベクターの構築に必須な転写ユニットの１つを含む３個の個々の組換えベクタ
ーからなる本発明の系を構築するのに有用である。
【０１６０】 他のアデノウイルス遺伝子にさらなる欠失を有する別のアデノウイルスベクタ
ーが当技術分野で公知であり、これらのベクターもまた本発明に用いるのに適切
である。これらの第二世代アデノウイルスベクターのいくつかは、免疫原性の低
下を示す（例えば、E1 + E2 欠失、Gorzigliaら，1996, J. Virol. 70: 4173-41
78; E1 + E4欠失、Yehら，1996, J. Virol. 70: 559-565)。欠失の拡大は、ベク
ターに複数の遺伝子を導入するための付加的なクローニングキャパシティを提供
するのに役立つ。例えば、25 kbの欠失が記述されており(Lieberら，1996, J. V
irol. 70: 8944-8960)、また35 kbを超える異種DNAの導入を可能とする、全ウイ
ルス遺伝子を欠失させたクローニングベクターが報告されている(Fisher ら，19
96, Virology 217: 11-22)。このようなベクターを用いて、レトロウイルス二次
ベクターを構築するための２または３個の転写ユニットをコードする本発明のア
デノウイルス一次ベクターを作製することができる。
【０１６１】 二次ウイルスベクターは好ましくはレトロウイルスベクターである。二次ベク
ターは、欠陥ウイルスベクター粒子の一次標的細胞内におけるアセンブリーおよ
びパッケージングに必須の遺伝子の発現によって生成される。それは独立複製が
不可能であるという点で欠陥性である。したがって、二次レトロウイルスベクタ
ーはいったん二次標的細胞を形質導入したのち、複製によってさらなる標的細胞
に広がっていくことはできない。
【０１６２】 「レトロウイルスベクター」という用語は、典型的には、感染可能であるがそ
れ自身では複製できないレトロウイルス核酸を含む。したがってレトロウイルス
ベクターは複製に欠陥がある。典型的には、レトロウイルスベクターは標的細胞
に送達すべき、好ましくは非レトロウイルス起源の１つ以上のNOIを含む。レト ロウイルスベクターはまた、機能性スプライス・ドナー部位(FSDS)が機能性スプ
ライス・アクセプター部位(FSAS)の上流にある場合、任意の介在配列がスプライ
シングされうるように、FSDSおよびFSASを含むことができる。レトロウイルスベ
クターはさらに、非レトロウイルス性配列を含むことができる。例えば、レトロ
ウイルスベクターがプロウイルスとして標的細胞中にいったん組み込まれたなら
ば、NOIの発現に影響を及ぼすことができるU3領域内の非レトロウイルス性制御 配列などである。レトロウイルスベクターはただ１つのレトロウイルスに由来す
る要素を含む必要はない。したがって、本発明によれば、レトロウイルスベクタ
ーは２つ以上の異なるレトロウイルスまたは他の供給源から誘導しうる要素をも
つことが可能である。
【０１６３】 「レトロウイルスプロベクター」という用語は、典型的には、上に記述するレ
トロウイルスベクターゲノムであるが、機能性スプライス・ドナー部位(FSDS)を
もたらすことができる第１の核酸配列(NS)および機能性スプライス・アクセプタ
ー部位(FSAS)をもたらすことができる第２のNSを含む該ゲノムを含む。ここで、
第１のNSおよび第２のNSに関連するスプライシングが起こり得ないように、第１
のNSは第２のNSの下流にある。レトロウイルスプロベクターが逆転写されると、
レトロウイルスベクターが形成される。
【０１６４】 「レトロウイルスベクター粒子」という用語は、パッケージされたレトロウイ
ルスベクターを意味し、これは好ましくは標的細胞に結合し、そこに入ることが
可能である。ベクターの所ですでに論じたように、この粒子の構成要素は、野生
型レトロウイルスに関しては改変してもよい。例えば、該粒子のタンパク質性外
被中のEnvタンパク質を、それらタンパク質のターゲッティング特性を変更する ため、または他の所望の機能を達成するため、遺伝子的に改変することができる
。
【０１６５】 本発明のこの態様のレトロウイルスベクターは、MMLV、MSVまたはMMTV等のマ ウスオンコレトロウイルスから誘導することができる；または、HIV-1、EIAV等 のレンチウイルスから誘導することができる；または、別のレトロウイルスから
誘導することができる。
【０１６６】 本発明のレトロウイルスベクターを改変して、レトロウイルスの天然のスプラ
イス・ドナー部位を非機能性にすることができる。 「改変」という用語は、天然のスプライス・ドナー部位をサイレント化させる
、つまり除去することを含む。スプライス・ドナー部位を除去したベクター、例
えばMLVに基づくベクター等が当技術分野で公知である。そのようなベクターの １例はpBABE (Morgensternら, 1990, 同じ箇所）である。
【０１６７】 二次ベクターは、一次ベクターのDNA中にコードされている、レトロウイルス ベクター作製に必須の遺伝子の発現によって作製することができる。そのような
遺伝子は、レトロウイルス由来のgag-pol 遺伝子、エンベロープを有するウイル
ス(enveloped virus)由来のenv遺伝子、および１つ以上の治療用または診断用NO
Iを含む欠陥性レトロウイルスベクターを含むことができる。この欠陥性レトロ ウイルスベクターは一般に、逆転写を可能とする配列、5'長末端反復(LTR)の少 なくとも一部、3'LTR の少なくとも一部、およびパッケージングシグナルを含む
。
【０１６８】 二次ベクターを複製欠陥ベクターとしたい場合は、該二次ベクターを複数の転
写ユニットによってコードすることができる。そしてこれらのユニットは１個ま
たは２個以上のアデノウイルス一次ベクターまたは他の一次ベクター中に配置す
ることができる。したがって、二次ベクターゲノムをコードする転写ユニット、
gag-pol遺伝子をコードする転写ユニットおよびenv遺伝子をコードする転写ユニ
ットが存在する。または、これらのうち２個以上を組み合わせることができる。
例えば、gag-pol遺伝子およびenv遺伝子、またはenv遺伝子および上記ゲノムを コードする核酸配列を１個の転写ユニット中に組み合わせることができる。これ
を達成する方法は当技術分野で公知である。
【０１６９】 本明細書に記述する転写ユニットとは、コード配列および該コード配列の他の
コード配列とは独立した発現を達成するためのシグナルを含む核酸の領域である
。したがって、各転写ユニットは一般に少なくとも、プロモーター、エンハンサ
ーおよびポリアデニル化シグナルを含む。
【０１７０】 「プロモーター」という用語は、当技術分野の通常の意味（例えば、Jacob-Mo
nodの遺伝子発現理論におけるRNAポリメラーゼ結合部位）において用いられる。 「エンハンサー」という用語は、転写開始複合体の他のタンパク質構成要素に
結合し、その結果、関連するプロモーターによって指令される転写の開始を容易
にするDNA配列を含む。
【０１７１】 二次ベクターをコードする転写ユニットのプロモーターおよびエンハンサーは
、二次ウイルスベクター作製条件下の一次標的細胞中で、好ましくは強力に活性
であるか、または強く誘導されることが可能である。プロモーターおよび／また
はエンハンサーは構成的に効果的なものであるか、またはその活性が組織によっ
て、もしくは時間的に制限されているものであってよい。組織によって制限され
る適切なプロモーター／エンハンサーの例は、MUC1遺伝子、CEA遺伝子または5T4
抗原遺伝子由来のプロモーター／エンハンサー等、腫瘍細胞中で高度に活性なプ
ロモーター／エンハンサーである。時間的に制限されているプロモーター／エン
ハンサーの例は、低酸素応答エレメントまたはgrp78もしくはgrp94遺伝子のプロ
モーター／エンハンサー等、虚血および／または低酸素に応答するプロモーター
／エンハンサーである。好ましいプロモーター-エンハンサーの組合せの１例は 、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)主要前初期(MIE)プロモーター／エンハンサ ーの組合せである。
【０１７２】 他の好ましい付加的構成要素は、１または複数のNOIの効率的な発現を可能と する実在物を含む。
【０１７３】 本発明の１つの好ましい態様においては、二次ベクター構成要素の発現は低酸
素または虚血によって調節される。これに関連して、低酸素は広い範囲の異なる
細胞型において遺伝子発現の強力なレギュレーターであり、そして例えば低酸素
誘導性因子１(HIF-1; WangおよびSemenza, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:4
30)等の低酸素が誘導する転写因子の活性の誘導によって作用する。該転写因子 は種々の遺伝子プロモーター上の対応するDNA認識部位、すなわち低酸素応答エ レメント(HRE) に結合する。Dachsら(1997, Nature Med. 5:515)は、マウスのホ
スホグリセレートキナーゼ１（PGK-1)遺伝子（Firthら，1994 Proc. Natl. Acad
. Sci. 91:6496-6500)由来のHREの多量体形態を用いて、ヒト繊維肉腫細胞によ る低酸素に応答したマーカーおよび治療遺伝子の両方のin vitro発現および該腫
瘍内におけるin vivo発現を調節した（Dachsら、同書）。または、腫瘍の虚血性
領域には顕著なグルコース剥奪も存在するという事実を利用して、異種遺伝子発
現を腫瘍中で特異的に活性化することができる。grp78 遺伝子プロモーターの末
端切断型632塩基対配列（これはグルコース剥奪によって特異的に活性化される ことが公知である）もまた、マウス腫瘍においてin vivoでリポーター遺伝子の 高レベル発現を駆動し得ることが示された（Gazitら，1995, Cancer Res. 55:16
60)。
【０１７４】 このような構成要素の発現を調節する別の方法は、GossenおよびBujard (1992
, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:5547) が記述するテトラサイクリンオン／オフ系
を、Yoshidaら(1997, Biochem. Biophys. Res. Comm. 230: 426)がレトロウイル
スgal、polおよびVSV-G タンパク質の作製について記述しているように用いるこ
とである。通常、この調節系は本発明においてもプロベクターゲノムの作製を制
御するために使用されている。この系は、テトラサイクリンの不在下ではアデノ
ウイルスベクターからベクター構成要素が全く発現されないことを保証する。
【０１７５】 ハイブリッドウイルスベクター系に組み込むことができる安全性特徴を以下に
記述する。１以上のそのような特徴が存在しうる。
【０１７６】 二次ベクターは、独立複製が可能な感染性ウイルスが生じるような組換えの可
能性を排除する１以上の特徴がそこに組み込まれているという点で、in vivoに おける使用についても有利である。そのような特徴は以前に刊行された研究には
含まれていなかった（Fengら, 1997, 同書）。特に、以下に記述する３つの構成
要素からなるレトロウイルスベクターの構築は、Fengら（同書）には記載されて
いない。
【０１７７】 第１に、相同領域を欠失させることによって、二次ベクターの構成要素をコー
ドする配列間の配列相同性を回避することができる。相同領域は遺伝子の組換え
を引き起こす。特定の実施形態においては、二次レトロウイルスベクターを構築
するのに３個の転写ユニットが用いられる。第１の転写ユニットは、非レトロウ
イルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にあるレトロウイルスgag-po
l遺伝子を含む。第２の転写ユニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよ びエンハンサーの制御下にあるレトロウイルスenv遺伝子を含む。第３の転写ユ ニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にある
欠陥性レトロウイルスゲノムを含む。天然のレトロウイルスゲノムにおいては、
パッケージングシグナルは、適切に機能するためにはgag配列の一部を必要とす るように配置されている。レトロウイルスベクター系を天然のレトロウイルスか
ら構築する場合、通常、パッケージングシグナル（gag遺伝子の一部を含む）は ベクターゲノム中に残る。しかし、本発明においては上記欠陥性レトロウイルス
ゲノムは、第１の転写ユニット中のgag配列と相同な配列を含まない、最小限の パッケージングシグナルを含む。また、例えばモロニーマウス白血病ウイルス(M
MLV)などのレトロウイルスにおいては、polコード配列の3'末端とenvコード配列
の5'末端の間にはオーバーラップする小さい領域がある。第１および第２転写ユ
ニットの間のこれに対応する相同領域は、polコード配列の3'末端またはenvコー
ド配列の5'末端を、コドン使用法を変えるがコードされたタンパク質のアミノ酸
配列を変えないように変更することによって除去することができる。
【０１７８】 第２に、envおよびgag-pol構成要素の間の相同領域が回避されるように、レト
ロウイルスゲノムを別のレトロウイルスまたはエンベロープを有する別のウイル
スのEnvタンパク質を用いて擬似タイピングすることによって、複製可能な二次 ウイルスベクターの可能性を回避することができる。
【０１７９】 特定の実施形態においては、レトロウイルスベクターは以下の３つの構成要素
から構築される。すなわち、第１の転写ユニットは非レトロウイルス性プロモー
ターおよびエンハンサーの制御下にあるレトロウイルスgag-pol遺伝子を含む。 第２の転写ユニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの
制御下にある、エンベロープを有する別のウイルス由来のenv遺伝子を含む。第 ３の転写ユニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの制
御下にある欠陥性レトロウイルスゲノムを含む。上記欠陥性レトロウイルスゲノ
ムは、第１の転写ユニット中のgag配列と相同な配列を含まない、最小限のパッ ケージングシグナルを含む。
【０１８０】 第３に、特定の方法で構築した２つの転写ユニットを用いることによって、複
製可能なレトロウイルスの可能性を排除することができる。第１の転写ユニット
は、一次標的細胞中で活性なプロモーター-エンハンサー（例えば、hCMVプロモ ーター-エンハンサーまたは組織に限定されるプロモーター-エンハンサー）の制
御下にあるgag-polコード領域を含む。第２の転写ユニットは、レトロウイルス 粒子中にパッケージングされうるレトロウイルスゲノムRNAをコードする。第２ の転写ユニットはパッケージング、組み込みおよび逆転写に必要なレトロウイル
ス配列を含み、かつまたエンベロープを有するウイルスのEnvタンパク質をコー ドする配列および１以上の治療遺伝子をコードする配列を含む。
【０１８１】 この例においては、envおよびNOIコード配列の転写は、Envタンパク質が一次 標的細胞で優先的に産生され、他方NOI発現産物は二次標的細胞中で優先的に産 生されるように工夫されている。
【０１８２】 適切なイントロンスプライシング配置を実施例５に後述し、また図17および27
cに示す。本発明においては、一次ベクターによって一次標的細胞に送達される レトロウイルスゲノム配列中で、スプライス・ドナー部位はスプライス・アクセ
プター部位の下流に位置する。したがって、一次標的細胞においてはスプライシ
ングは起こらないか、または低頻度でしか起こらず、そしてEnvタンパク質が優 先的に発現される。しかし、いったんベクターゲノムが逆転写および二次標的細
胞への組み込みというプロセスを経たならば、機能性スプライス供与配列が5'LT
Rに、すなわち、機能性スプライス受容配列の上流に位置する。スプライシング が起こってenv配列が切除され、NOIの転写産物が産生される。
【０１８３】 この例の第２の配置においては、下記のようにNOIの発現は二次標的細胞に限 定され、一次標的細胞で発現されることを阻止されている。この配置を実施例６
に後述し、また図18に示す。ここでは、プロモーター-エンハンサー、コード配 列の5'末端を含むNOIの第１断片、および天然の、または人工的に誘導した、も しくは誘導可能なスプライス供与配列が、レトロウイルスゲノム構築物の3'末端
に、Ｒ領域の上流に挿入されている。コード領域を完成させるのに必要な全ての
配列を含むNOIの第２断片は、上記レトロウイルスゲノム構築物中でパッケージ ングシグナルの下流に位置する天然の、または人工的に誘導した、もしくは誘導
可能なスプライス受容配列の下流に配置されている。逆転写およびレトロウイル
スゲノムの二次標的細胞への組み込みの結果、プロモーター、NOIの5'断片およ び機能性スプライス供与配列は、機能性スプライス受容配列およびNOIの3'末端 の上流に位置する。次に、プロモーターからの転写およびスプライシングが二次
標的細胞中でNOIの翻訳を可能とする。
【０１８４】 好ましい実施形態においては、本発明のハイブリッドウイルスベクター系はレ
トロウイルス二次ベクターをコードする１または複数のアデノウイルス一次ベク
ターから成る。
【０１８５】 本発明の好ましい実施形態は、アデノウイルスおよび他のウイルスベクターに
付随する主要な問題の１つ、すなわち、そのようなベクターからの遺伝子発現は
一過性であるという問題と取り組んでいる。一次標的細胞から生成されるレトロ
ウイルス粒子は二次標的細胞の形質導入を達成することができ、そしてレトロウ
イルスベクターゲノムの宿主細胞ゲノムへの組み込みにより、二次標的細胞にお
ける遺伝子発現は安定に維持される。二次標的細胞は重大な量のウイルスタンパ
ク質抗原を発現することはなく、したがってアデノウイルスベクターによって形
質導入された細胞よりも免疫原性が低い。
【０１８６】 レトロウイルスベクターを二次ベクターとして使用することは有利である。な
ぜなら、それは例えば急速に分裂する細胞を標的にすることを可能とすることに
よって、ある程度細胞の区別を可能とするからである。さらに、レトロウイルス
の組み込みは、増殖する標的細胞における安定な発現を含めて、標的組織中にお
ける治療遺伝子の安定な発現を可能とする。
【０１８７】 本発明の新規なレトロウイルスベクター設計を使用することは、遺伝子発現を
一次または二次標的部位に限定できるという点でも有利である。この方法におい
ては、１または複数のNOIを二次標的部位で優先的に発現させることができ、ま た一次標的部位では少ししか発現させないか、あるいは生物学的に有意なレベル
で発現させないことができる。その結果、NOIの考えうる毒性または抗原性を回 避することができる。
【０１８８】 好ましくは、一次ウイルスベクターは特定の１または複数の細胞型の形質導入
を優先的に行う。 より好ましくは、一次ベクターは特定の細胞を標的とするように、天然のウイ
ルスと較べて変更された組織親和性をもつ標的設定されたベクターである。
【０１８９】 「標的設定されたベクター」という用語は、必ずしも「標的部位」または「標
的細胞」という用語と結びついているわけではない。
【０１９０】 「標的部位」とは、天然のものであれ標的設定されたものであれベクターがト
ランスフェクションまたは形質導入できる部位をいう。 「一次標的部位」とは、天然のものであれ標的設定されたものであれベクター
がトランスフェクションまたは形質導入できる第１の部位をいう。 「二次標的部位」とは、天然のものであれ標的設定されたものであれベクター
がトランスフェクションまたは形質導入できる第２の部位をいう。
【０１９１】 「標的細胞」とは、単に、天然のものであれ標的設定されたものであれベクタ
ーがトランスフェクションまたは形質導入できる細胞をいう。 「一次標的細胞」とは、天然のものであれ標的設定されたものであれベクター
がトランスフェクションまたは形質導入できる第１の細胞をいう。 「二次標的細胞」とは、天然のものであれ標的設定されたものであれベクター
がトランスフェクションまたは形質導入できる第２の細胞をいう。
【０１９２】 本発明による好ましいアデノウイルス一次ベクターもまた、好ましくは、組織
親和性が野生型アデノウイルスの組織親和性から変更されている標的設定された
ベクターである。アデノウイルスベクターを改変して、例えば以下の文献に記載
されているような標的設定されたアデノウイルスベクターを作製することができ
る。すなわち、Krasnykhら，1996, J. Virol. 70: 6839-6846; Wickhamら，1996
, J. Virol. 70: 6831-6838; Stevensonら，1997, J. Virol. 71: 4782-4790; W
ickhamら，1995, Gene Therapy 2: 750-756; Douglasら，1997, Neuromuscul. D
isord. 7:284-298; Wickhamら，1996, Nature Biotechnology 14: 1570-1573で ある。
【０１９３】 本発明のベクター系の一次標的細胞は、造血細胞（単球、マクロファージ、リ
ンパ球、顆粒球、またはこれらの前駆細胞を含む）；内皮細胞；腫瘍細胞；間質
細胞；星状細胞または神経膠細胞；筋肉細胞；および上皮細胞を含む。 したがって、二次ウイルスベクターを生成することができる本発明の一次標的
細胞は、上記の細胞型のうち任意のものであってよい。
【０１９４】 好ましい実施形態においては、本発明による一次標的細胞は、レトロウイルス
gag-pol遺伝子のための第１の転写ユニットおよびパッケージング可能な欠陥性 レトロウイルスゲノムを生成することができる第２の転写ユニットを含む欠陥性
アデノウイルスベクターによって形質導入された単球またはマクロファージであ
る。この場合、少なくとも第２の転写ユニットは好ましくは、身体内の病態部位
、例えば虚血性部位または固形腫瘍の微小環境、等において優先的に活性なプロ
モーター-エンハンサーの制御下にある。
【０１９５】 特に好ましい実施形態においては、第２の転写ユニットは、ゲノムが二次標的
細胞に挿入されると、ウイルスの必須エレメント（ウイルスenv遺伝子など）の 発現を減少させ、かつ治療用および／または診断用NOIの効率的発現を可能とす るのに役立つイントロンが生成されるように構築される。
【０１９６】 パッケージング細胞は、治療すべき個体の身体内のin vivoパッケージング細 胞であってもよいし、または組織培養細胞系などのin vitroで培養された細胞で
あってよい。適切な細胞系はマウス繊維芽細胞由来細胞系またはヒト細胞系、等
の哺乳動物細胞を含む。好ましくは、パッケージング細胞系は、例えばHEK293、
293-T、TE671、HT1080等のヒト細胞系である。
【０１９７】 または、パッケージング細胞は治療すべき個体に由来する細胞、例えば単球、
マクロファージ、血液細胞または繊維芽細胞、等であってもよい。細胞を個体か
ら単離し、パッケージングおよびベクター構成要素をex vivoで投与し、次にこ の自己由来のパッケージング細胞を再投与することができる。または、上記パッ
ケージングおよびベクター構成要素をパッケージング細胞にin vivoで投与する ことができる。レトロウイルスパッケージングおよびベクター構成要素を個体の
細胞に導入する方法は、当技術分野で公知である。例えば、１つの方法は、レト
ロウイルスベクター粒子を作製するのに必要な異なるDNA配列、例えばenvコード
配列、gag-polコード配列および欠陥性レトロウイルスゲノムを一過性三重トラ ンスフェクションによって同時に細胞に導入するものである(LandauおよびLittm
an, 1992, J. Virol. 66, 5110; Soneokaら，1995, Nucleic Acids Res. 23: 62
8-633)。
【０１９８】 二次ウイルスベクターもまた標的設定されたベクターであることができる。レ
トロウイルスベクターについては、これはEnvタンパク質を改変することによっ て達成できる。レトロウイルス二次ベクターのEnvタンパク質は、非毒性エンベ ロープであるか、または一次標的細胞内で非毒性量産生されるエンベロープ、例
えば、MMLV両種指向性エンベロープまたは改変された両種指向性エンベロープ、
等である必要がある。このような場合の安全性特徴は、好ましくは、レトロウイ
ルス構成要素間の領域または配列相同性の欠失である。
【０１９９】 好ましくは、エンベロープはヒト細胞の形質導入を可能とするエンベロープで
ある。適切なenv遺伝子の例は、VSV-G、4070A env等のMLV 両種指向性env、RD11
4 ネコ白血病ウイルスenvまたはインフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素(HA
)遺伝子を含むが、これらだけに限定されない。Envタンパク質は、限定された数
のヒト細胞型の上に存在する受容体に結合可能なタンパク質であってよく、これ
はターゲッティング部分を含む工学的に作製されたエンベロープであってよい。
envおよびgag-polコード配列は、選択されたパッケージング細胞系中で活性なプ
ロモーターおよび場合によりエンハンサーから転写される。そして、転写ユニッ
トはポリアデニル化シグナルによって終了する。例えば、パッケージング細胞が
ヒト細胞である場合、適切なプロモーター-エンハンサーの組合せはヒトサイト メガロウイルス主要前初期(hCMV-MIE)遺伝子由来のものであり、SV40ウイルス由
来のポリアデニル化シグナルを用いることができる。他の適切なプロモーターお
よびポリアデニル化シグナルも当技術分野で公知である。
【０２００】 二次標的細胞集団は、一次標的細胞集団と同一であってよい。例えば、本発明
の一次ベクターを腫瘍細胞へ送達することは、さらなるベクター粒子の複製およ
び生成をもたらし、これらの粒子はさらなる腫瘍細胞を形質導入することができ
る。
【０２０１】 または、二次標的細胞集団は一次標的細胞集団と異なっていてもよい。この場
合、一次標的細胞は治療を受けた個体の体内における内在性工場の役割を果たし
て、二次標的細胞を形質導入することができるさらなるベクター粒子を生成する
。例えば、一次標的細胞集団は一次ベクターによってin vivoまたはex vivoで形
質導入された造血細胞であってよい。次に、この一次標的細胞は身体内の部位、
例えば腫瘍などに送達されるか、またはそこへ移動し、二次ベクター粒子を生成
する。この粒子は、例えば、固形腫瘍内の有糸分裂的に活性な腫瘍細胞を形質導
入することができる。
【０２０２】 本発明によるレトロウイルスベクター粒子はまた、ゆっくりと分裂する、そし
てMLV等の非レンチウイルスでは効率的に形質導入できない細胞も形質導入する ことができる。ゆっくりと分裂する細胞は、ある種の腫瘍細胞を含めて、約３〜
４日ごとに１回分裂する。腫瘍は急速に分裂する細胞を含むが、ある腫瘍細胞、
特に腫瘍の中心に存在する細胞は、たまにしか分裂しない。または、標的細胞は
細胞分裂をすることができる、増殖を抑制された細胞（例えば腫瘍塊の中心部に
位置する細胞、等）または幹細胞（例えば造血幹細胞またはCD34陽性細胞、等）
であってよい。さらにまた、標的細胞は単球前駆体、CD33陽性細胞、または骨髄
系細胞前駆体、等の分化細胞の前駆体であってよい。さらにまた、標的細胞は神
経細胞、星状細胞、神経膠細胞、小神経膠細胞、マクロファージ、単球、上皮細
胞、内皮細胞、肝細胞、精母細胞、精子細胞、または精子などの分化細胞であっ
てよい。標的細胞はヒト個体から単離した後in vitroで形質導入してもよいし、
またはin vivoで直接形質導入してもよい。
【０２０３】 本発明は、治療用タンパク質の作用が必要とされる部位またはその近傍におい
て高力価の欠陥性レトロウイルスベクター粒子の局在化したin vivo生成を可能 とし、その結果、二次標的細胞の効率的形質導入を達成する。これは欠陥性アデ
ノウイルスベクターまたは欠陥性レトロウイルスベクターを単独で用いるよりも
一層効率的である。
【０２０４】 本発明はまた、分裂しない細胞およびゆっくりと分裂する細胞中におけるレト
ロウイルスベクター、例えばMMLVに基づくベクター等のin vivo生成を可能とす る。これまで、MMLVに基づくレトロウイルスベクターを生成することは急速に分
裂する細胞、例えばin vitroで増殖する、組織培養に適合させた細胞、またはin vivoで急速に分裂する腫瘍細胞、等においてのみ可能であった。レトロウイル スベクターを生成することができる細胞型の拡大は、固形腫瘍の細胞（その多く
はゆっくりと分裂する）に遺伝子を送達するうえで、また内皮細胞や種々の造血
系統細胞等の非分裂細胞を治療用タンパク質産物の内在性工場として使用するう
えで、有利である。
【０２０５】 本発明のベクター系による１以上の治療遺伝子の送達は、単独で用いることも
、または他の治療もしくは治療構成要素と組み合わせて用いることもできる。
【０２０６】 例えば、本発明のレトロウイルスベクターを用いて、WO-A-98/05635にリスト アップされた障害の治療に有用な１以上のNOIを送達することができる。参照を 容易にするため、該リストの一部をここに掲げる：癌、炎症または炎症性疾患、
皮膚科学的障害、熱、心臓血管作用、出血、血液凝固および急性期応答、悪液質
、食欲不振、急性感染、HIV感染、ショック状態、移植片体宿主反応、自己免疫 疾患、再灌流傷害、髄膜炎、偏頭痛およびアスピリン依存性抗血栓症；腫瘍の増
殖、浸潤および拡大、血管新生、転移、悪性腹水および悪性胸膜滲出；脳虚血、
虚血性心臓疾患、変形性関節症、慢性関節リウマチ、骨粗しょう症、喘息、多発
硬化、神経退化、アルツハイマー病、アテローム硬化、卒中、脈管炎、クローン
(Crohn)病および潰瘍性大腸炎；歯周炎、歯肉炎；乾癬、アトピー性皮膚炎、慢 性潰瘍、表皮水疱症；角膜潰、網膜症および外科創傷治癒；鼻炎、アレルギー性
結膜炎、湿疹、アナフィラキシー；再狭窄、うっ血性心不全、子宮内膜症、アテ
ローム硬化または内部硬化(endosclerosis)。
【０２０７】 さらに、あるいは上記の代わりに、本発明のレトロウイルスベクターを用いて
、WO-A-98/07859にリストアップされている障害の治療に有用な１以上のNOIを送
達することができる。参照を容易にするため、該リストの一部をここに掲げる：
サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制または免疫刺激活性（例えば
、ヒト免疫不全ウイルスの感染を含む免疫不全の治療；リンパ球増殖の調節；癌
および多数の自己免疫疾患の治療；および移植片拒絶の阻止または腫瘍免疫の誘
導のため）；造血の調節、例えば、骨髄系またはリンパ系疾患の治療など；例え
ば、傷の治癒、火傷、潰瘍および歯周疾患および神経退化の治療、などのための
骨、軟骨、腱、靱帯および神経組織の増殖促進；卵胞刺激ホルモンの抑制または
活性化（受胎能の調節）；走化性／ケモキネシス活性（例えば、特定の細胞型を
損傷または感染部位に移動させるため）；うっ血性および血栓崩壊性活性（例え
ば、血友病および卒中の治療のため）；抗炎症活性（例えば、敗血症性ショック
またはクローン病の治療のため）；抗菌剤として；代謝または行動の変調剤；鎮
痛薬として；特定の欠乏障害の治療；ヒトまたは獣医学における例えば乾癬の治
療。
【０２０８】 さらに、あるいは上記の代わりに、本発明のレトロウイルスベクターを用い
て、WO-A-98/09985にリストアップされている障害の治療に有用な１以上のNOIを
送達することができる。参照を容易にするため、該リストの一部をここに掲げる
：マクロファージ阻害および／またはＴ細胞阻害活性およびその結果としての抗
炎症活性；抗免疫活性、すなわち、細胞性および／または体液性免疫応答（炎症
を伴わない応答を含む）に対する抑制作用；マクロファージおよびＴ細胞の細胞
外マトリックスおよびフィブロネクチンに付着する能力、ならびにＴ細胞におけ
るアップレギュレーションされたfas受容体発現の阻害；望ましくない免疫応答 および関節炎（慢性関節リウマチを含む）を含む炎症、過敏症、アレルギー性反
応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患および他の自己免疫疾患に
関連する炎症、アテローム硬化、動脈硬化、アテローム硬化性心臓疾患、再灌流
傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群または他の心肺疾患
に関連する炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎および他の消化管の疾患、肝繊維症
、肝硬変または他の肝臓疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他
の腎臓および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽頭疾患、皮膚炎または他の皮膚
疾患、歯周疾患または他の歯科疾患、精巣炎または精巣精巣上体炎、不妊症、精
巣外傷または他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣性流産、子
癇、子癇前症および他の免疫および／または炎症関連産婦人科疾患、後部ブドウ
膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜
炎、視神経炎、眼内炎症、例えば、網膜炎または嚢胞状黄斑浮腫、交感性眼炎、
強膜炎、色素性網膜炎に関連する炎症、変性眼底疾患の免疫および炎症構成要素
、眼外傷、感染によって引き起こされる眼の炎症、増殖性ガラス体網膜症、急性
虚血性眼ニューロパシー、過剰瘢痕（例えば、緑内障濾過手術後の）の炎症構成
要素、眼移植に対する免疫および／または炎症反応ならびに他の免疫および炎症
関連眼疾患、中枢神経系(CNS)もしくは他の器官における免疫および／または炎 症の抑制が有益と思われる自己免疫疾患または異常または障害に関連する炎症、
パーキンソン病、パーキンソン病の治療に由来する合併症および／または副作用
、AIDS関連痴呆症候群、HIV関連脳障害、ドヴィック(Devic) 病、シドナム(Syde
nham)舞踏病、アルツハイマー病および他の退行性疾患、CNSの症状または障害に
関連する炎症、卒中、ポリオ後症の炎症構成要素、精神障害、脊髄炎、脳炎、亜
急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性ニューロパシー、亜急性ニューロパシー、慢
性ニューロパシー、ギラン-バレー(Guillain-Barre)症候群、シドナム舞踏病、 重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症、ハンチントン病、筋萎縮側索硬化の免疫お
よび炎症構成要素、CNS圧迫またはCNS外傷またはCNS感染の炎症構成要素、筋萎 縮およびジストロフィーの炎症構成要素、ならびに中枢および末梢神経系の免疫
および炎症関連疾患、症状または障害、外傷後炎症、敗血症ショック、感染性疾
患、外科手術、骨髄移植の炎症性合併症または副作用、または他の移植合併症お
よび／または副作用、遺伝子療法の炎症性および／または免疫合併症および副作
用（例えば、ウイルス担体の感染によるものなど）、またはAIDSに関連する炎症
の抑制；体液性および／または細胞性免疫応答の抑制または阻害；単球またはリ
ンパ球の量を減らすことによる単球または白血球増殖性疾患（例えば白血病）治
療または軽減；天然または人工の細胞、組織および器官（角膜、骨髄、臓器、レ
ンズ、ペースメーカー、天然または人工の皮膚組織など）を移植する場合に、移
植片拒絶を阻止および／または治療するため。
【０２０９】 本発明によれば、さらに、治療用NOIが二次標的細胞集団中で優先的に発現さ れ、一次標的細胞中では少ししか発現されないか、または生物学的に重大なレベ
ルでは発現されないように、治療用NOIの産生を制御する方法が提供される。
【０２１０】 本発明はまた、個体を遺伝子療法によって治療するための医薬組成物を提供す
る。該組成物は、治療上有効量の、送達可能な１以上の治療用および／または診
断用NOIを含む本発明のレトロウイルスベクター、または該ベクターによって生 成される、もしくはそれから得られるウイルス粒子を含む。この医薬組成物はヒ
トまたは動物に用いることができる。典型的には、医師が個々の被験者に実際に
最も適する用量を決定する。その量は特定個体の年齢、体重および応答によって
変動する。
【０２１１】 該組成物は場合により製薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバ
ントを含むことができる。製薬用担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与
経路および標準的な製薬上の慣例に鑑みて選択することができる。該医薬組成物
は、担体、賦形剤または希釈剤として、またはそれらのほかに、任意の適切な結
合剤、潤沢剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤、および標的部位へのウイルスの侵入
を助ける、または増大させることができる他の担体（例えば、脂質送達系）を含
むことができる。
【０２１２】 適切な場合は、上記医薬組成物は吸入により；座薬またはペッサリーの形で；
ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形で局所的に；皮膚パッチの
使用により；デンプンまたはラクトース等の賦形剤を含む錠剤の形、または単独
もしくは賦形剤と混合したカプセルもしくはオビュール(ovule)の形、または矯 味剤もしくは着色剤を含むエリキシル、溶液もしくは懸濁液の形で経口的に投与
するか、または非経口的に（例えば、海綿状構造内、静脈内、筋肉内または皮下
に）注射することができる。非経口投与のためには、該組成物は他の物質（例え
ば、溶液を血液と等張性とするのに十分な塩または単糖）を含んでいてもよい滅
菌水性溶液の形で最も良好に使用される。奥歯と頬の間または舌下に投与するた
めには、該組成物は通常の方法で製剤化できる錠剤またはロゼンジの形で投与す
ることができる。
【０２１３】 本発明のさらなる態様においては、in vivo遺伝子送達のための一般的な意味 における（すなわち、上に規定した本発明の第１の態様に必ずしも限定されない
）ハイブリッドウイルスベクター系が提供される。この系は、二次ウイルスベク
ターをコードする１以上の一次ウイルスベクターを含んでおり、該一次ベクター
は一次標的細胞に感染して二次ウイルスベクターを発現することが可能であり、
該二次ベクターは二次標的細胞の形質導入をすることができる。
【０２１４】 この特定の実施形態においては、本発明の遺伝子ベクターはこのように標的細
胞細胞内で欠陥性の感染性粒子を生成することができる、遺伝子送達のためのハ
イブリッドウイルスベクター系である。したがって、本発明の遺伝子ベクターは
、二次ベクターをin vivoで生成するために必要な遺伝子をコードする、in vitr
oで作製された一次ベクターを含む。使用にあっては、二次ベクターは二次標的 細胞に挿入するための１個以上の選択された遺伝子を担持する。該選択された遺
伝子は、１以上のマーカー遺伝子および／または治療遺伝子であることができる
。マーカー遺伝子は選択可能なおよび／または検出可能なタンパク質をコードす
る。
【０２１５】 本発明のこの特定の態様に関するさらなる態様を以下に記述する。これらの教
示は本発明のこれまでに記述した態様にも適用される。
【０２１６】 別な態様において、本発明は一次ウイルスベクターに感染していて、そして感
染性二次ウイルスベクター粒子を生成することができる標的細胞を提供する。
【０２１７】 さらに別の態様において、本発明は本明細書に記載のハイブリッドウイルスベ
クター系または一次ウイルスベクターに感染した標的細胞を投与することを含む
、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を治療する方法を提供する。
【０２１８】 一次ウイルスベクターは種々の異なるウイルスベクター、例えばレトロウイル
ス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはポックスウイルスベクター等であ
ってよい。または、一次ウイルスベクターが複数の場合は、それらはウイルス起
源の異なるベクターの混合物であってよい。いずれの場合にも、好ましくは、一
次ウイルスベクターは独立複製が不可能であるという点で欠陥性である。したが
って、それらは標的細胞に入ってそこに二次ベクター配列を送達することはでき
るが、複製してさらなる標的細胞に感染を続行することはできない。
【０２１９】 ハイブリッドウイルスベクター系が二次ベクターをコードする２個以上の一次
ベクターを含む場合は、一次標的細胞集団に感染するのに一次ベクターの両方ま
たは３個全部が、通常は同時に用いられる。好ましくは、１個の一次ウイルスベ
クターが二次ウイルスベクターの全ての構成要素をコードする。
【０２２０】 好ましい１または複数の一次ウイルスベクターはアデノウイルスベクターであ
る。アデノウイルスベクターは、in vitro培養物から得ることができる力価の点
で、他のウイルスベクターと比較して重大な利点を有する。アデノウイルス粒子
はまた、エンベロープを有するウイルスの粒子と較べて比較的安定であり、この
ためより容易に精製し、保存することができる。しかし、欠陥性アデノウイルス
ベクターからの遺伝子発現は一過性にすぎないため、現在のアデノウイルスベク
ターはin vivo治療用途について重大な限定を被っている。ベクターゲノムが複 製しないため、標的細胞増殖はベクターの希釈をもたらす。また、たとえ低レベ
ルでもアデノウイルスタンパク質を発現する細胞はアデノウイルスタンパク質に
対して起こる免疫応答によって破壊される。
【０２２１】 二次ウイルスベクターは好ましくはレトロウイルスベクターである。二次ベク
ターは、欠陥ウイルスベクター粒子の一次標的細胞内における集合およびパッケ
ージングに必須の遺伝子の発現によって生成される。それは独立複製が不可能で
あるという点で欠陥性である。したがって、二次レトロウイルスベクターはいっ
たん二次標的細胞を形質導入したのち、複製によってさらなる標的細胞に広がっ
ていくことはできない。
【０２２２】 二次ベクターは、一次ベクターのDNA中にコードされている、レトロウイルス ベクター作製に必須の遺伝子の発現によって作製することができる。そのような
遺伝子は、レトロウイルス由来のgag-pol 遺伝子、エンベロープを有するウイル
ス由来のエンベロープ遺伝子、および１つ以上の治療用NOIを含む欠陥性レトロ ウイルスゲノムを含むことができる。この欠陥性レトロウイルスゲノムは一般に
、逆転写を可能とする配列、5'長末端反復(LTR)の少なくとも一部、3'LTR の少 なくとも一部、およびパッケージングシグナルを含む。
【０２２３】 重要なことに、二次ベクターもまた、独立複製が可能な感染性ウイルスが生じ
るような組換えの可能性を排除する１以上の安全性特徴が組み込まれているとい
う点で、in vivo 使用にとって安全である。
【０２２４】 二次ベクターが複製欠陥性であることを確実にするため、複数の転写ユニット
によって二次ベクターをコードすることができる。そして、これらのユニットを
１個または２個以上のアデノウイルスまたは他の一次ベクター中に配置すること
ができる。したがって、二次ベクターゲノムをコードする転写ユニット、gag-po
l遺伝子をコードする転写ユニットおよびenv遺伝子をコードする転写ユニットが
存在する。または、これらユニットの２個以上を組み合わせることができる。例
えば、gag-polおよびenv遺伝子をコードする核酸配列、またはenv遺伝子および ゲノムをコードする核酸配列を１個の転写ユニットに組み合せることができる。
これを達成する方法は当技術分野で公知である。
【０２２５】 本明細書に記述する転写ユニットとは、コード配列および該コード配列の他の
コード配列から独立した発現を達成するためのシグナルを含む核酸の領域である
。したがって、各転写ユニットは一般に少なくともプロモーター、エンハンサー
およびポリアデニル化シグナルを含む。二次ベクターをコードする転写ユニット
のプロモーターおよびエンハンサーは、二次ウイルスベクター作製条件下の一次
標的細胞中で、好ましくは強力に活性であるか、または強力に誘導されることが
可能である。プロモーターおよび／またはエンハンサーは構成的に効果的なもの
であるか、またはその活性が組織によって、もしくは時間的に制限されているも
のであってよい。組織によって制限される適切なプロモーター／エンハンサーの
例は、MUC1遺伝子、CEA遺伝子または5T4抗原遺伝子由来のプロモーター／エンハ
ンサー等、腫瘍細胞中で高度に活性なプロモーター／エンハンサーである。時間
的に制限されているプロモーター／エンハンサーの例は、低酸素応答エレメント
またはgrp78もしくはgrp94遺伝子のプロモーター／エンハンサー等、虚血および
／または低酸素に応答するプロモーター／エンハンサーである。好ましいプロモ
ーター-エンハンサーの組合せの１例は、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)主要 前初期(MIE)プロモーター／エンハンサーの組合せである。
【０２２６】 二次ベクター構成要素の低酸素または虚血によって調節される発現は、特定の
状況下で特に有用である。低酸素は広い範囲の異なる細胞型において遺伝子発現
の強力な調節物であり、そして例えば低酸素誘導性因子１(HIF-1; WangおよびSe
menza, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:430)等の低酸素が誘導する転写
因子の活性の誘導によって作用する。該転写因子は種々の遺伝子プロモーター上
の同族体DNA認識部位、すなわち低酸素応答エレメント(HRE) に結合する。Dachs
ら(1997, Nature Med. 5:515)は、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼ１（PGK
-1)遺伝子（Firthら，1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6496-6500) 由来
のHREの多量体形態を用いて、ヒト繊維肉腫細胞による低酸素に応答したマーカ ーおよび治療遺伝子の両方のin vitro発現および固形腫瘍内におけるin vivo発 現を調節した（Dachsら、同書）。または、腫瘍の虚血性領域には顕著なグルコ ース剥奪も存在するという事実を利用して、異種遺伝子発現を腫瘍中で特異的に
活性化することができる。grp78 遺伝子プロモーターの末端切断型632塩基対配 列（これはグルコース剥奪によって特異的に活性化されることが公知である）も
また、マウス腫瘍においてin vivoでリポーター遺伝子の高レベル発現を引き出 しうることが示された（Gazit, G. ら，1995, Cancer Res. 55:1660)。
【０２２７】 ハイブリッドウイルスベクター系に組み込むことができる安全性特徴を以下に
記述する。そのような特徴は系の中に１つ以上存在しうる。
【０２２８】 第１に、相同領域を欠失させることによって、二次ベクターの構成要素をコー
ドする配列間の配列相同性を回避することができる。相同領域は遺伝子の組換え
を引き起こす。特定の実施形態においては、二次レトロウイルスベクターを構築
するのに３個の転写ユニットが用いられる。第１の転写ユニットは、非レトロウ
イルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にあるレトロウイルスgag-po
l遺伝子を含む。第２の転写ユニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよ びエンハンサーの制御下にあるレトロウイルスenv遺伝子を含む。第３の転写ユ ニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にある
欠陥性レトロウイルスゲノムを含む。天然のレトロウイルスゲノムにおいては、
パッケージングシグナルは、適切に機能するためにはgag配列の一部を必要とす るように配置されている。したがってレトロウイルスベクター系を天然のレトロ
ウイルスから構築する場合、通常、パッケージングシグナル（gag遺伝子の一部 を含む）はベクターゲノム中に残る。しかし、本発明においては上記欠陥性レト
ロウイルスゲノムは、第１の転写ユニット中のgag配列と相同な配列を含まない 、最小限のパッケージングシグナルを含む。また、例えばモロニーマウス白血病
ウイルス(MMLV)などのレトロウイルスにおいては、polコード配列の3'末端とenv
コード配列の5'末端の間にはオーバーラップする小さい領域がある。第１および
第２転写ユニットの間のこれに対応する相同領域は、polコード配列の3'末端ま たはenvコード配列の5'末端を、コドン使用法を変えるがコードされたタンパク 質のアミノ酸配列を変えないように変更することによって除去することができる
。
【０２２９】 第２に、envおよびgag-pol構成要素の間の相同領域が回避されるように、１つ
のレトロウイルスのゲノムを別のレトロウイルスまたはエンベロープを有する別
のウイルスのエンベロープタンパク質を用いて疑似タイピングすることによって
、複製可能な二次ウイルスベクターの可能性を回避することができる。特定の実
施形態においては、レトロウイルスベクターは以下の３つの構成要素から構築さ
れる。すなわち、第１の転写ユニットは非レトロウイルス性プロモーターおよび
エンハンサーの制御下にあるレトロウイルスgag-pol遺伝子を含む。第２の転写 ユニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にあ
る、エンベロープを有する別のウイルス由来のenv遺伝子を含む。第３の転写ユ ニットは、非レトロウイルス性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にある
欠陥性レトロウイルスゲノムを含む。上記欠陥性レトロウイルスゲノムは、第１
の転写ユニット中のgag配列と相同な配列を含まない、最小限のパッケージング シグナルを含む。
【０２３０】 疑似タイピングは、例えば、HIVまたはウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)などの レンチウイルスに基づくレトロウイルスゲノムを必要とし、そしてエンベロープ
タンパク質は、例えば、4070Aと称する両種指向性エンベロープタンパク質であ ってよい。または、レトロウイルスゲノムはMMLVに基づくものであって、そして
エンベロープタンパク質は一次標的細胞内で非毒性量で産生されうる、別のウイ
ルス由来のタンパク質（インルエンザ赤血球凝集素または水疱性口内炎ウイルス
Ｇタンパク質、等）であってよい。あるいはまた、エンベロープタンパク質は突
然変異体エンベロープタンパク質または遺伝子操作されたエンベロープタンパク
質、等のような改変されたエンベロープタンパク質であってもよい。改変は、標
的能力を導入するように、または毒性を減少させるように、または別の目的に合
わせて実施または選択することができる。
【０２３１】 第３に、特定の方法で構築した２つの転写ユニットを用いることによって、複
製可能なレトロウイルスの可能性を排除することができる。第１の転写ユニット
は、一次標的細胞中で活性なプロモーター-エンハンサー（例えば、hCMVプロモ ーター-エンハンサーまたは組織に限定されるプロモーター-エンハンサー）の制
御下にあるgag-polコード領域を含む。第２の転写ユニットは、レトロウイルス 粒子中にパッケージングされうるレトロウイルスゲノムRNAをコードする。第２ の転写ユニットはパッケージング、組み込みおよび逆転写に必要なレトロウイル
ス配列を含み、かつまたエンベロープを有するウイルスのenvタンパク質をコー ドする配列および１以上の治療遺伝子をコードする配列を含む。
【０２３２】 好ましい実施形態においては、本発明のハイブリッドウイルスベクター系はレ
トロウイルス二次ベクターをコードする１または複数のアデノウイルス一次ベク
ターを含んでなる。本発明に用いるアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイ
ルス由来であっても、または通常ヒトに感染しないアデノウイルスに由来するも
のであってもよい。好ましくは、上記ベクターはアデノウイルス２型もしくは５
型（Ad2またはAd5)、またはマウスアデノウイルス、またはCELOウイルス(Cotton
ら，1993, J. Virol 67: 3777-3785) 等のトリアデノウイルスに由来するもので
ある。上記ベクターは複製可能のアデノウイルスベクターであってよいが、より
好ましくは欠陥性アデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは該
ウイルスの複製に必要な１以上の構成要素を欠失させることによって欠陥性とす
ることができる。典型的には、各アデノウイルスベクターはE1領域に少なくとも
１つの欠失を含む。感染性アデノウイルスベクター粒子を作製するためには、E1
遺伝子を含むAd5 左部分のコピーが組み込まれたヒト胚繊維芽細胞系（ヒト293 細胞系など）中でウイルスを継代させることによって上記欠失を補完することが
できる。異種DNAをこのようなベクターに挿入する場合のキャパシティは、約７k
bまである。したがって、このようなベクターは、それぞれがレトロウイルス二 次ベクターの構築に必須な転写ユニットの１つを含む３個の組換えベクターから
なる本発明の系を構築するのに有用である。
【０２３３】 他のアデノウイルス遺伝子にさらなる欠失を有する別のアデノウイルスベクタ
ーが当技術分野で公知であり、これらのベクターもまた本発明に用いるのに適切
である。これらの第二世代アデノウイルスベクターのいくつかは、免疫原性の低
下を示す（例えば、E1 + E2 欠失、Gorzigliaら，1996, J. Virol. 70: 4173-41
78; E1 + E4欠失、Yehら，1996, J. Virol. 70: 559-565)。欠失の拡大は、ベク
ターに複数の遺伝子を導入するための付加的なクローニングキャパシティを提供
するのに役立つ。例えば、25 kbの欠失が記述されており(Lieberら，1996, J. V
irol. 70: 8944-8960)、また35 kb以上の異種DNAの導入を可能とする、全ウイル
ス遺伝子を欠失させたクローニングベクターが報告されている(Fisher ら，1996
, Virology 217: 11-22)。このようなベクターを用いて、レトロウイルス二次ベ
クターを構築するための２または３個の転写ユニットをコードする本発明のアデ
ノウイルス一次ベクターを作製することができる。
【０２３４】 ここに記述する本発明の実施形態は、アデノウイルスおよび他のウイルスベク
ターに付随する主要な問題の１つ、すなわち、そのようなベクターからの遺伝子
発現は一過性であるという問題を解決している。一次標的細胞から生成されるレ
トロウイルス粒子は二次標的細胞に感染することができ、そして二次標的細胞に
おける遺伝子発現はレトロウイルスベクターゲノムが宿主細胞ゲノムに組み込ま
れているため、安定に維持される。二次標的細胞は重大な量のウイルスタンパク
質抗原を発現することはなく、したがってアデノウイルスベクターによって形質
導入された細胞よりも免疫原性が低い。
【０２３５】 二次ベクターとしてレトロウイルスベクターを使用することもまた有利である
。なぜなら、例えば急速に分裂する細胞を標的にすることを可能ならしめること
によって、それはある程度細胞の区別を可能とするからである。さらに、レトロ
ウイルスの組み込みは、増殖する標的細胞における安定な発現を含めて、標的組
織中における治療遺伝子の安定な発現を可能とする。
【０２３６】 好ましくは、一次ウイルスベクターは特定の１または複数の細胞型に優先的に
感染する。より好ましくは、一次ベクターは特定の細胞に向かうように標的設定
された、天然のウイルスと較べて変更された組織親和性をもつベクターである。
「標的設定されたベクター」という用語は、必ずしも「標的細胞」という用語と
結びついているわけではない。「標的細胞」とは、単にベクター（天然のもので
あれ標的設定されたものであれ）が感染または形質導入できる細胞をいう。
【０２３７】 本発明による好ましいアデノウイルス一次ベクターもまた、好ましくは、組織
親和性が野生型アデノウイルスの組織親和性から変更されている標的設定された
ベクターである。アデノウイルスベクターを改変して、例えば以下の文献に記載
されているような標的設定されたアデノウイルスベクターを作製することができ
る。すなわち、Krasnykhら，1996, J. Virol. 70: 6839-6846; Wickhamら，1996
, J. Virol. 70: 6831-6838; Stevensonら，1997, J. Virol. 71: 4782-4790; W
ickhamら，1995, Gene Therapy 2: 750-756; Douglasら，1997, Neuromuscul. D
isord. 7:284-298; Wickhamら，1996, Nature Biotechnology 14: 1570-1573で ある。
【０２３８】 本発明のベクター系の一次標的細胞は、造血細胞（単球、マクロファージ、リ
ンパ球、顆粒球、またはこれらの前駆細胞を含む）；内皮細胞；腫瘍細胞；間質
細胞；星状細胞または神経膠細胞；筋肉細胞；および上皮細胞を含むが、それら
だけに限定されない。
【０２３９】 したがって、二次ウイルスベクターを生成することができる本発明の一次標的
細胞は、上記の細胞型のうち任意のものであってよい。好ましい実施形態におい
ては、本発明の一次標的細胞は、レトロウイルスgag-pol遺伝子のための第１の 転写ユニットおよびパッケージング可能な欠陥性レトロウイルスゲノムを生成す
ることができる第２の転写ユニットを含む欠陥性アデノウイルスベクターに感染
した単球またはマクロファージである。この場合、少なくとも第２の転写ユニッ
トは好ましくは、身体内の病態部位、例えば虚血性部位または固形腫瘍の微小環
境、等において優先的に活性なプロモーター-エンハンサーの制御下にある。本 発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、第２の転写ユニットは、ゲ
ノムが二次標的細胞に挿入されると、ウイルスenv遺伝子の発現を減少させ、か つ治療遺伝子の効率的発現を可能とするのに役立つイントロンが生成されるよう
に構築される。
【０２４０】 二次ウイルスベクターもまた標的設定されたベクターであることができる。レ
トロウイルスベクターについては、これはエンベロープタンパク質を改変するこ
とによって達成できる。レトロウイルス二次ベクターのエンベロープタンパク質
は、非毒性エンベロープであるか、または一次標的細胞内で非毒性量産生される
エンベロープ、例えば、MMLV両種指向性エンベロープまたは改変された両種指向
性エンベロープ、等である必要がある。このような場合の安全性特徴は、好まし
くは、レトロウイルス構成要素間の領域または配列相同性の欠失である。
【０２４１】 二次標的細胞集団は、一次標的細胞集団と同一であってよい。例えば、本発明
の一次ベクターを腫瘍細胞へ送達することは、さらなるベクター粒子の複製およ
び生成をもたらし、これらの粒子はさらなる腫瘍細胞を形質導入することができ
る。または、二次標的細胞集団は一次標的細胞集団と異なっていてもよい。この
場合、一次標的細胞は治療を受けた個体の体内における内在性工場の役割を果た
して、二次標的細胞を感染させることができるさらなるベクター粒子を生成する
。例えば、一次標的細胞集団は一次ベクターによってin vivoまたはex vivoで形
質導入された造血細胞であってよい。次に、この一次標的細胞は身体内の部位、
例えば腫瘍などに送達されるか、またはそこへ遊走し、二次ベクター粒子を生成
する。このれらの粒子は、例えば、固形腫瘍内の腫瘍細胞を形質導入することが
できる。
【０２４２】 本発明は、治療用タンパク質の作用が必要とされる部位またはその近傍におい
て高力価の欠陥性レトロウイルスベクター粒子の局在化したin vivo生成を可能 とし、その結果、二次標的細胞の効率的形質導入を達成する。これは欠陥性アデ
ノウイルスベクターまたは欠陥性レトロウイルスベクターを単独で用いるよりも
一層効率的である。
【０２４３】 本発明はまた、分裂しない細胞およびゆっくりと分裂する細胞中におけるレト
ロウイルスベクター、例えばMMLVに基づくベクター等のin vivo生成を可能とす る。これまで、MMLVに基づくレトロウイルスベクターの生成は急速に分裂する細
胞、例えばin vitroで増殖する、組織培養に適合させた細胞、またはin vivoで 急速に分裂する腫瘍細胞、等においてのみ可能であった。レトロウイルスベクタ
ーを生成することができる細胞型の拡大は、固形腫瘍の細胞（その多くはゆっく
りと分裂する）に遺伝子を送達するうえで、また内皮細胞や種々の造血系統細胞
等の非分裂細胞を治療用タンパク質産物の内在性工場として使用するうえで、有
利である。
【０２４４】 本発明のベクター系による１以上の治療遺伝子の送達は、単独で用いることも
、または他の治療もしくは治療構成要素と組み合わせて用いることもできる。治
療することができる疾患は、癌、神経疾患、遺伝性疾患、心臓疾患、卒中、関節
炎、ウイルス感染および免疫系の疾患を含む。適切な治療遺伝子は、腫瘍抑制タ
ンパク質、酵素、プロドラッグ活性化酵素、免疫変調性分子、抗体、工学的に作
製された免疫グロブリン様分子、融合タンパク質、ホルモン、膜タンパク質、血
管作用性タンパク質またはペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗ウイルスタ
ンパク質、アンチセンスRNAおよびリボザイムをコードする遺伝子を含む。
【０２４５】 本発明の治療方法の好ましい実施形態においては、本発明のベクター系を用い
てプロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子が腫瘍に送達され、そして次に適
切なプロドラッグを用いて患者が治療される。プロドラッグの例は、リン酸エト
ポシド（アルカリ性フォスファターゼと共に使用、Senterら，1988, Proc. Natl
. Acad. Sci. 85: 4842-4846); 5-フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼと 共に、Mullenら，1994, Cancer Res 54: 1503-1506); ドキソルビシン-N-p-ヒド
ロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン-V-アミダーゼと共に、Kerrら，199
0, Cancer Immunol. Immunother. 31: 202-206); パラ-N-ビス(2-クロロエチル ）アミノベンゾイルグルタメート（カルボキシペプチダーゼG2と共に）；セファ
ロスポリンナイトロジェンマスタードカルバメート（βラクタマーゼと共に）；
SR4233 (P450レダクターゼと共に）；ガンシクロビル（HSV チミジンキナーゼと
共に、Borrelliら，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 7572-7576); マスター
ドプロドラッグ（ニトロレダクターゼと共に、Friedlosら，1997, J. Med. Chem
. 40: 1270-1275)およびシクロホスファミドまたはイホスファミド（シトクロム
P450と共に、Chenら，1996, Cancer Res. 56:1331-1340)を含む。
【０２４６】 さらに、治療遺伝子が二次標的細胞中で優先的に発現され、かつ一次標的細胞
中では少量しか発現されないか、または生物学的に重大な量では発現されないよ
うに治療遺伝子の生成を制御する方法が本発明により提供される。
【０２４７】 本発明においては、当技術分野のレベル内にある標準的な分子生物学的技法を
用いることができる。そのような技法は文献に十分記述されている。例えば、Sa
mbrookら(1989), Molecular Cloning; a laboratory manual; HamesおよびGlove
r (1985-1997) DNA Cloning: a practical approach, 第I-IV巻（第２版）を参 照されたい。免疫グロブリン遺伝子の作製方法は、McCaffertyら(1996) "Antibo
dy Engineering: A Practical Approach"に記述されている。
【０２４８】 要約すると、本発明は１つ以上のNOIを標的細胞に導入するのに適した新規な 送達系に関する。
【０２４９】 広い態様において、本発明は機能性スプライス・ドナー部位および機能性スプ
ライス・アクセプター部位を含むレトロウイルスベクターに関するものであり；
該機能性スプライス・ドナー部位および機能性スプライス・アクセプター部位は
第１の興味のあるヌクレオチド配列（NOI）の両側に位置し；該機能性スプライ ス・ドナー部位は該機能性スプライス・アクセプター部位の上流にあり；該レト
ロウイルスベクターはレトロウイルスプロベクターから誘導され；該レトロウイ
ルスプロベクターは該機能性スプライス・ドナー部位をもたらすことのできる第
１のヌクレオチド配列（NS）および該機能性スプライス・アクセプター部位をも
たらすことのできる第２のNSを含み；第１のNSは第２のNSの下流にあり；該レト
ロウイルスプロベクターの逆転写の結果該レトロウイルスベクターが形成される
ようになっている。
【０２５０】 さらに広い態様において、本発明はin vivo遺伝子送達のためのハイブリッド ウイルスベクター系を提供する。この系は、二次ウイルスベクターをコードする
１個以上の一次ウイルスベクターを含んでなり、該一次ベクターは一次標的細胞
に感染してそこで二次ウイルスベクターを発現することができ、該二次ベクター
は二次標的細胞の形質導入を行うことができる。
【０２５１】 好ましくは、一次ベクターはアデノウイルスベクターから得られる、またはそ
れに基づくベクターであり、および／または二次ウイルスはレトロウイルスベク
ター、好ましくはレンチウイルスベクターから得られる、またはそれに基づくベ
クターである。
【０２５２】 （発明を実施するための最良の形態） 以下、添付の図面に言及しながら実施例により本発明をさらに説明する。
【０２５３】 図１は、レトロウイルスのプロウイルスゲノムの構造を示す。これに関して、
マウスオンコレトロウイルス等の最も単純なレトロウイルスは３つのオープンリ
ーディングフレーム、すなわちgag、polおよびenvを有する。gagの翻訳中におこ
るフレームシフトはpolの翻訳を導く。envの発現および翻訳は、図に示すスプラ
イス供与体(SD)とスプライス受容体(SA)の間のスプライシングによって達成され
る。パッケージングシグナルはPsi と表示され、これは全長転写産物にのみ含ま
れている。スプライシング現象の間にこのシグナルが除去される、envを発現す るサブゲノム転写産物には含まれない。
【０２５４】 図２は、スモールＴスプライス供与体(small T splice donor)のpLTRへの付加
を図式的に示す。ここでは、スモールＴスプライス供与配列は、最終構築物中で
逆転写が起こると、U3-スプライス供与体-Ｒというカセットがプロウイルスベク
ターの5'末端に「受け継がれ」、そして発現されたRNA転写産物がその5'末端近 傍にスプライス供与配列を含むように、LTRベクターの転写開始点の下流である がＲ配列の上流に挿入される。
【０２５５】 図３は、pL-SA-Nの概略図を示す。共通スプライス受容体(T/C)nNC/TAG-G (Mou
nt, 1982, Nucleic Acids Res. 10: 459-472)およびブランチ部位(branch point
)の両方に下線を付し、太字で示す。矢印はイントロン／エキソン接合部を示す 。ここでは、共通スプライス受容配列がpLXSN のStu1/BamH1部位に挿入される。
このような配置により、この受容体は（最終RNA転写産物中で）任意の上流スプ ライス供与体と相互作用する。
【０２５６】 図４は、スプライス供与体を欠失させたpL-SA-Nの構築の概略図を示す。gTか らgCへの変化は、pL-SA-Nベクターを鋳型とし、後述する２つのオリゴヌクレオ チドを用いてPCR反応を実施することにより作製する。次に、得られたPCR産物を
pL-SA-NのSpe1-Asc1 部位にクローン化し、その結果、野生型スプライス供与体g
TをgCに置換する。Spe1およびAsc1両部位を太字で示し、Spe1オリゴヌクレオチ ド中の突然変異を太字の大文字で示す。
【０２５７】 図５は、MLV pICUTの配列を示す。
【０２５８】 図６は、EIAV LTRプラスミドCMV/R 接合部へのスプライス供与体の挿入を示す
概略図である。後に概略を示す２つのオリゴヌクレオチドを用いてPCRを実施し 、PCR産物をCMVLTRのSac1-BamH1部位にクローン化し、相当する断片を除去する 。SacIオリゴヌクレオチド中で、矢印は転写の開始を示し、新しいインサートは
大文字で示し、スプライス供与配列には下線を付してある。Ｒの開始をイタリッ
ク体で示す。
【０２５９】 図７は、スプライス受容体のpEGASUS-1への挿入を示す概略図である。ここで は、後述する２本鎖オリゴヌクレオチドをXho1-Bpu1 102で消化したpEGASUS-1に
挿入し、プラスミド pEGASUS+SA を作製する。共通スプライス受容体(T/C)nNC/T
AG-G (Mount, 1982, 同じ箇所）およびブランチ部位の両方に下線を付し、太字 で示す。矢印はイントロン／エキソン接合部を示す。
【０２６０】 図８は、EIAVベクターからの野生型スプライス供与体の除去を示す概略図であ
る。後述するオリゴヌクレオチドおよび鋳型としてpEGASUS+SAを用いたオーバー
ラップPCRによってスプライス供与配列を除去する。最初にオリゴ1+2 およびオ リゴ3+4 をそれぞれ用いて別々にPCR反応を実施する。次に増殖副産物を溶出し 、混合して第３のPCR反応に用いる。この第３反応を10サイクル実施した後、オ リゴ２および４を加える。次に、得られた産物をpEGASUS+SAのSac1-Sal1 部位に
クローン化し、プラスミドpEGASUS+SA(noSD)を作製する。スプライス供与体(SD)
の位置を図に示す。野生型スプライス供与体をGTからGCに変える点突然変異を、
オリゴ１および相補体であるオリゴ３の両方に太字で示す。
【０２６１】 図９は、pCMVLTR+SDとpEGASUS+SA(noSD)を組み合わせてpEICUT-1を作製する概
略を示す図である。ここでは、pEGASUS+SA(noSD)のMlu1断片をpCMV-LTRのユニー
クなMlu1部位にする。
【０２６２】 図10は、pEICUT-LacZ の構築を示す概略図である。これは、後に概略を述べる
ように、pEGASUS-1 由来のXho1-Bpu1 102 LacZ断片をpEICUT-1のXhoI-Bpu1 102 部位に挿入することによって作製される。
【０２６３】 図11は、pEICUT-LacZ 配列を示す。
【０２６４】 図12は、トランスフェクションされた細胞および形質導入細胞の両方における
ベクター配置の概略図を示す。ここでは、出発ベクターpICUTはスプライス受容 体（この例ではIgSA由来の共通スプライス受容体）の上流にスプライス供与体を
含んでおらず、そのため得られるRNA転写産物はスプライシングされない。した がって、転写産物の全てはパッケージングシグナルを含む全長転写産物である（
Ａ）。しかし、形質導入を行うと、スプライス供与体（この例ではスモールＴス
プライス供与体）は生成される全てのRNA転写産物がスプライス受容体（すなわ ちイントロン）の上流にスプライス供与体を含むようにプロウイルスベクターの
5'末端に「受け継がれ」、そしてその結果最大のスプライシングが達成される（
Ｂ）。
【０２６５】 図13は、パッケージング細胞または形質導入細胞への遺伝子発現の限定を示す
概略図である。この例における遺伝子発現の限定は、ハイグロマイシンORFをMLV
pEIBUTのネオマイシンORFの上流に配置することによって達成される（ａ）。こ
のクローニング戦略によって、得られるベクターはトランスフェクションされた
細胞中ではハイグロマイシンのみを発現するRNA転写産物を発現するようになる 。なぜなら、リボソーム5'キャップ依存性翻訳は上流ORFのみを効率的に読むか らである。しかし、形質導入を行うと、ハイグロマイシンは機能性イントロン内
に含まれることになり、したがって成熟転写産物から除去され（ｂ）、その結果
ネオマイシンORFが 5' キャップ依存性に翻訳される。
【０２６６】 図14は、ハイグロマイシンの発現をプロデューサー細胞に、そして2B6（p450 イソ型）の発現を形質導入細胞に限定するMLV pICUT Neo-p450ベクターの構築を
示す概略図である。この構築の出発ベクターは、hygroおよびneo両遺伝子を含む
図13に示すpICUT ベクターである。neo遺伝子は完全なp450 2B6 cDNAに以下のよ
うに置換される。すなわち、ヒト肝臓RNA (Clontech)を鋳型とし、下記のプライ
マーを用いてRT-PCRを実施して完全な2B6 cDNAを得る：
【０２６７】
【配列表】
【０２６８】 これは最適化されたコザック配列をもつ、ユニークなBclIおよびNgoM1 部位に両
側を囲まれた完全な2B6 cDNAをもたらす。次に、このcDNAをpICUT-Hyg-NeoのBcl
1-NgoMI部位にクローン化し、その結果Neoをp450で置換する（（Ａ）参照）。ト
ランスフェクションされた細胞（Ｂ）および形質導入細胞（Ｃ）中のプロウイル
スDNA構築物も示す。
【０２６９】 図15は、突然変異env遺伝子(m4070A)とpol遺伝子3'末端由来の野生型MMLV配列
との配列比較である。
【０２７０】 図16は、変更された4070Aの完全な配列である。
【０２７１】 図17は、遺伝子発現が限定されたレトロウイルス発現ベクターを示す。ここで
は、第１のNOI（4070AエンベロープORF)は最初のベクターによって発現され、第
２のNOI（この例ではp450）はベクターの複製後にのみ発現される。複製後、407
0A遺伝子は機能性イントロン内に位置し、したがってRNAスプライシングの間に 除去される。
【０２７２】 図18は、p450遺伝子の5'末端（スプライス供与体の上流）が、複製後にp450遺
伝子の3'末端の上流（SAの上流）に見いだされ、したがって複製後にのみ機能性
p450遺伝子が（スプライシングされたmRNAから）発現される、レトロウイルス発
現ベクターを示す。
【０２７３】 （実施例） 〔実施例１〕 分断イントロンMLVベクターの構築 (i)スモールＴスプライス供与体の付加 この構築物の出発プラスミドはpLXSN (Millerら，1989，同じ箇所)である。第
１に、この構築物をNhe1で消化し、背骨を再連結してLTR (U3-R-U5) プラスミド
を作製する。次に、スプライス供与配列を含むオリゴヌクレオチドをこのプラス
ミドのKpn1-Bbe1 部位の間に挿入する。このオリゴヌクレオチドには、該スプラ
イス供与体の下流に、Kpn1までのMLV R 配列も含まれている。得られるプラスミ
ドを3'LTR-SDと称する（図２参照）。
【０２７４】 (ii)スプライス受容体の付加 この構築物に用いるスプライス受容配列〔ブランチ部位、すなわち、該スプラ
イス受容体の20から40塩基上流に位置し、イントロンラリアット形成(Aebiら，1
987, Trends in Genetics 3: 102-107)に関与する１個のＡ残基を含む〕は、免 疫グロブリン重鎖可変領域mRNA (Bothwellら，1981, Cell 24: 625-637) である
が共通／最適化受容部位を有するものから誘導される。そのような配列シグナル
はpCI (Promega)にも存在する。この受容配列をまずpLXSN のBamH1-Stu1部位に ２本鎖オリゴヌクレオチドとして挿入し、ベクターpL-SA-N を作製する（注：SV
40プロモーターはクローニング中にpLXSN から失われる）。クローニング戦略の
概略については図３を参照されたい。
【０２７５】 (iii) pL-SA-Nからのもとのスプライス供与体の除去 pL-SA-Nのgag配列内に含まれていたスプライス供与体の除去は、PCRに基づく 部位特異的突然変異誘発法によって達成される。２つのオリゴヌクレオチドを用
いて、pL-SA-NのユニークなAsc1およびSpe1部位にまたがる領域をPCR増幅する。
Spe1にかかる(Spe1-spanning)オリゴヌクレオチドには、スプライシング陰性pBA
BEベクター(Morgensternら，1990, 同じ箇所）にも見いだされるagGTaag からag
GCaag への変化も組み込まれている。クローニング戦略の概略については図４を
参照されたい。
【０２７６】 (iv) pL(noSD)-SA-Nと3'LTR-SDを組み合わせる pL(noSD)SA-Nプラスミドは、正常なMLV由来3'LTR を含んでいる。pL(noSD)SA-
NからNhe1インサートを取り出し、これをNhe1で消化した3'LTR-SDベクターに挿 入することによって、上記3'LTR を3'LTR-SD配列と置換する。このようにして得
られるプラスミドをpICUT (Intron Created Upon Transduction,形質導入の結果
形成されるイントロン）と称し、この新世代レトロウイルスベクターの全ての特
徴を含んでいる（配列データについては図５参照）。
【０２７７】 〔実施例２〕 分断イントロンレンチウイルスベクターの構築 最初のEIAVレンチウイルス発現ベクターの構築（英国特許出願GB9727135.7 も
参照されたい） 分断機能レンチウイルスベクター構築の出発点は、pEGASUS-1 と称するベクタ
ー（英国特許出願GB9727135.7 参照）である。このベクターは感染性プロウイル
スEIAVクローンpSPEIAV19（受託番号：U01866; Payneら，1994） から誘導され る。その構築は以下の通りである。すなわち、第１に、PCR増幅したEIAV LTRをp
Bluescript II KS+ (Stratagene) 中にクローン化する。次に、pSEIAV19のMluI/
MluI (216/8124)断片を挿入して、pBluescript II KS+中に野生型プロウイルス クローン(pONY2) を作製する（図１）。次に、HindIII/HindIII 断片を除去する
ことによってenv領域を欠失させ、pONY2-H を作製する。さらに、pol遺伝子内の
BglII/NcoI断片(1901/4949)を欠失させ、その場所にHCMV IE エンハンサー／プ ロモーターによって制御されるβガラクトシダーゼ遺伝子を挿入する。これをpO
NY2.10nlsLacZ と称する。EIAV配列を759塩基対に減少させ、また一次転写産物 をCMVプロモーターから分離するため、第１に、EIAVポリプリントラクト(PPT)お
よび3'LTR を含む配列を下記のプライマー：
【配列表】
【０２７８】 および
【０２７９】
【０２８０】 を用いて、pONY2.10LacZからPCR増幅した。次にPCR産物を、pBlueScript II KS+ 中でU5がNot1に隣接するような方向で、pBS II KS+のSpe1部位にクローン化した
。
【０２８１】 次に、リポーター遺伝子カセットのために、pONY2.10nlsLacZ 由来のCMVプロ モーター/LacZをPst1消化によって除去し、そしてLacZ遺伝子が3'LTR の近隣に くるような方向でpBS.3'LTR のPst1部位にクローン化する。このベクターをpBS
CMVLacZ.3'LTR と称する。
【０２８２】 EIAVベクターの5'領域は、発現ベクターpCIEneo中に構築される。該発現ベク ターは、以前に規定した完全なCMVプロモーターの5'末端に由来する約400塩基対
の包含によって改変された、pCIneo (Promega)の誘導体である。この400塩基対 の断片は、以下のプライマー：
【配列表】
および
【配列表】 および
【０２８３】 を鋳型としてpHIT60 (Soneokaら，1995, Nucleic Acids Res. 23: 628-633) を 用いてPCR増幅によって得られる。PCR産物をBglIIおよびSpeIで消化し、pCIE-Ne
oのBglII/SpeI部位にクローン化する。
【０２８４】 Ｒ領域からgagコード領域のヌクレオチド150までのEIAVゲノム断片（ヌクレオ
チド268から675）を、以下のプライマー：CMV5‘EIAV2
【配列表】
【０２８５】 （下線を付した配列はEIAV R領域にアニールする）および
【配列表】
【０２８６】 を用いてpSEIAVから増幅する。
【０２８７】 得られるPCR産物の両側をXba1部位およびSac1部位で囲む。次に、これを切り 出してpCIE-NeoのXba1-SacI部位にクローン化する。その結果得られるプラスミ ド(pCIEneo5'EIAVと称する)は、CMVプロモーターの転写開始部位にEIAV R領域の
開始点を含む。次に、pBS.CMVLacZ.3LTRからApa1-Not1 断片を取り出し、これを
Sal1-Not1 で消化したpCIEneo5'EIAV にクローン化することによって、CMVLacZ/
3LTRカセットをpCIEneo5'EIAV プラスミドに挿入する（ベクターおよびインサー
トをそれぞれNot1で消化する前に、Sal1部位およびApa1部位をT4で「みがいて(p
olish)」平滑末端を作製する）。得られるプラスミドをpEGASUS-1 と称する。
【０２８８】 遺伝子デリバリーベクターとして用いるためには、pEGASUS-1はパッケージン グ細胞によって途中で提供されるgag/polおよびenvの両方の発現を必要とする。
gag/pol遺伝子の供給源として、EIAV gag-pol発現プラスミド(pONY3)が作製され
る。これは、gag-pol 遺伝子がhCMV-MIEプロモーター／エンハンサーから発現さ
れ、かつLTR 配列を全く含まないように、pONY2-HのMluI/MluI 断片を哺乳動物 発現プラスミドpCI-neo (Promega) に挿入することによって作製される。env遺 伝子の供給源としては、pRV583 VSV-G発現プラスミドが通常の方法で用いられる
。これらの３つのベクターは、MLVに基づくベクターについて記述されているよ うに（Soneokaら，1995, Nucl. Acids Res. 23:628-633)、３個のプラスミドに よる同時トランスフェクションに使用され、その結果得られるウイルスはD17 繊
維芽細胞上で通常ミリリットルあたり104から105 lacZ形成単位という力価を有 する。
【０２８９】 pICUTのEIAVレンチウイルス版ベクターpEICUTの構築 pEICUTを構築するため、まずpEGASUS-1 からXmaI-SexAI断片を除去し、T4ポリ
メラーゼを用いて両端を平滑末端とし、再連結して、pEGASUS-1のCMV-R-U5部分 のみを含むプラスミドを作製する。このプラスミドはその背骨にSV40-Neoカセッ
トを保持している。このプラスミドをCMVLTRと称する。CMVとＲの境界にスプラ イス供与体を挿入するため、図６に示す２つのオリゴヌクレオチドを用いて、図
６の説明に概略を述べたようにPCRを実施する。得られるプラスミドをpCMVLTR+S
Dと称する。MLV pICUTに用いたのと同一の免疫グロブリンに基づく共通スプライ
ス受容体（前述）をEIAV版に用いる。図７に示すオリゴヌクレオチドを用いて、
この受容体をpEGASUS-1 のXhoI-BpuI 102部位に挿入し、プラスミドpEGASUS+SA を作製する。図８に記述したオリゴヌクレオチドおよび方法を用いて、また鋳型
としてpEGASUS+SAを用いてオーバーラップPCRを実施することによって、EIAVの 野生型スプライス供与体を除去し、プラスミドpEGASUS+SA(noSD)を作製する。次
に、pEICUT-1を作製するため、pEGASUS+SA(noSD)のMlu1-Mlu1 断片をpCMVLTR+SD
のユニークなMlu1部位に挿入し、pEICUT-1を作製する（図９参照）。次に、Xho1
-Bpu1 102消化および挿入によってlacZをpEGASUS-1 からpEICUT-1に導入し、pEI
CUT-Zを作製する（図10参照；配列データについては図11参照）。
【０２９０】 MLV pICUTおよびEIAV pICUTの両ベクターともスプライス供与体の上流に強力 なスプライス受容体を含んでおり、それゆえ機能性イントロンは含まない（イン
トロンはスプライス受容体の5'末端に位置するスプライス供与体を必要とする）
。この理由により、ベクターがプロデューサー細胞にトランスフェクションされ
ると、生成される転写産物はスプライシングされない。したがってパッケージン
グシグナルは失われず、その結果、最大限のパッケージングが達成可能である（
図12参照）。
【０２９１】 しかし、レトロウイルスがそれによって複製するユニークな方法のため、形質
導入後、組み込まれたpICUTベクターから生成される転写産物は、上記のトラン スフェクションされた細胞の転写産物とは異なっている。これは複製の間に3'U3
プロモーター（Ｒの5'開始点まで）がコピーされて、形質導入細胞において5'プ
ロモーターとして使用されるためである。この理由により、組み込まれたpICUT から生成される転写産物は、いまや強力なスプライス受容体の5'末端に強力なス
プライス供与体を含む。これらは両方ともneo ORFの上流に位置している。その ため、そのような転写産物は5'UTR（非翻訳領域）内に機能性イントロンを含み 、したがって最大限にスプライシングされ翻訳される。
【０２９２】 上記のようなベクターの別の有利な点は、形質導入の結果としてのみイントロ
ンが形成されるので、遺伝子発現をパッケージされた細胞または形質導入細胞に
限定することができることである。これがいかにして達成されるかの１例を図13
に示す。この戦略は、第２遺伝子（この例ではハイグロマイシン）をスプライス
受容体の上流にクローニングすることを必要とする。これは、Selcta Vector Hy
gro (Ingenius; Oxfordshire, UK) からSalI断片上のハイグロマイシンcDNAを取
り出し、これをpICUT のXhoI部位（スプライス受容体に位置する）に挿入するこ
とによって達成される。このベクターはトランスフェクションされた細胞中でハ
イブロマイシンを、形質導入細胞中でネオマイシンを選択的に発現する。この理
由は、どのmRNA転写産物においても、内部リボソーム結合部位(IRES)の助けがな
い場合は第１の遺伝子のみがリボソームによって翻訳されるからである。トラン
スフェクションされた細胞においては、この遺伝子はハイグロマイシンである。
しかし、形質導入細胞ではハイグロマイシンのオープンリーディングフレーム(O
RF)が機能性イントロン内に含まれるため、この遺伝子は成熟mRNA転写産物から 除去され、その結果neo ORFの翻訳を可能とする。
【０２９３】 このような細胞特異的遺伝子発現を有するベクターは、種々の理由により臨床
用途に用いうる。例えば、耐性マーカーの発現をそれが必要とされるプロデュー
サー細胞に限定し、それらマーカーが免疫原性となりうる形質導入細胞において
は発現させないことができる。別な例としては、リシンおよび優勢な陰性シグナ
ルタンパク質等の毒性遺伝子の発現を、場合により細胞増殖を停止させたり細胞
を殺したりするのにそれらを必要とするかもしれない形質導入細胞に限定し、そ
してそのような特徴が高力価ウイルスの産生を妨げるであろうプロデューサー細
胞では発現させないことが可能であろう。図14は、プロデューサー細胞ではNeo のみが発現され、形質導入細胞ではプロドラッグp450 2B6イソ型が発現されるNe
o-p450 MLV pICUT構築物を示す。
【０２９４】 形質導入の結果イントロンを形成することの別な利点は、ベクター機能に必要
な任意の必須エレメントを形質導入の結果形成される機能性イントロンの内部に
位置させ、形質導入細胞の転写産物から除去することが可能なことである。例え
ば、MLVおよびレンチウイルスのpICUTベクターの両方について、ウイルス転写産
物は、形質導入の結果形成されて形質導入細胞の転写産物から除去されるイント
ロン内に機能性Psiパッケージングシグナルを含んでいた（MLV内のPsiの位置に ついてはBenderら，1987参照; EIAV内のPsiの位置については英国特許出願GB 97
27135.7参照）。
【０２９５】 そのような配置に由来する利点は以下のものを含む。 (i)転写産物から増大した翻訳が得られる。なぜなら、Psi二次構造物（もし存在
するならば）の存在下ではリボソームは「休み休み進む(stutter)」かもしれな いからである(Krallら, 1996, 同じ箇所およびそこに含まれる参照文献) 。
【０２９６】 (ii)パッケージングシグナルの不在下では、内在性レトロウイルスによる転写産
物のパッケージングが阻止される。
【０２９７】 (iii) gag 遺伝子などのウイルスの必須エレメント（および他の可能性のあるAT
G翻訳開始部位）が形質導入細胞で発現される転写産物から除去されている場合 は、望ましくない未成熟な翻訳開始が阻止される。これは、EIAVおよびMLV pICU
Tベクターの両方がそうであるように、パッケージングシグナルがgag遺伝子内に
伸びている場合は特に有益である。
【０２９８】 (iv)形質導入の結果形成されるイントロン内にプロモーター、エンハンサーおよ
びサプレッサーを配置し、その結果、そのような実在物をイントロン内に含む、
CMVから生成される転写産物のような他の転写産物の配置を模倣することができ る(Chapmanら，1991, 同じ箇所）。
【０２９９】 要約すると、本発明が記述する新規なpICUTベクター系は下記の操作を容易に する: (I) プロデューサー細胞における最大限のパッケージングおよび転写産物翻訳の
減少 (II) 形質導入細胞における最大限のスプライシングおよびそれによるイントロ ンの除去と翻訳の増大 (III) 遺伝子および／またはウイルス必須エレメントの発現のプロデューサー細
胞または形質導入細胞への限定
【０３００】 〔実施例３〕 pol遺伝子と最小限の相同性しかもたないMMLV両種指向性env 遺伝子およびgag-pol転写カセットの構築 モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)においては、envコード配列の最初の約6
0 bpはpol遺伝子の3'末端の配列とオーバーラップしている。これら２つの遺伝 子間の相同領域は、両遺伝子を発現する細胞においてそれらの間で組換えが起こ
る可能性を阻止するため、除去された。
【０３０１】 上記envコード配列の最初の約60 bpのDNA配列を、コードされているタンパク 質のアミノ酸配列は保持したまま、以下のように変更した。すなわち、env遺伝 子の5'末端（図15参照）のコドン使用法を変更するため、合成オリゴヌクレオチ
ドを作製し、envの残りの部分に以下のように挿入した。
【０３０２】 4070A遺伝子の5'末端の再構築のための出発プラスミドは、pHIT456 (Soneoka ら，1995, 同じ箇所)の4070A遺伝子を含むXba1-Xba1 断片を前もってクローン化
し、pCI-4070Aを形成しておいたpCIプラスミド(Promega)であった。 pCI-4070Aを鋳型とし、プライマーＡおよびＢ（図15）を用いてPCR反応を実施
し、600塩基対の産物を生成した。次に、この産物をpCI-4070AのNhe1およびXho1
部位の間にクローン化した。得られた構築物のNhe1/Xho1 領域を配列決定した。
得られた遺伝子のアミノ酸配列は元の4070Aと同一であるが、pol遺伝子との相同
領域は除去されている。
【０３０３】 改変env遺伝子m4070Aの完全な配列を図16に示す。この配列を標準的技法によ り発現ベクターpCI (Promega)に挿入する。CMV gag-pol転写ユニットはpHIT60 (
Soneokaら，1995, 同じ箇所）から得る。
【０３０４】 〔実施例４〕 レトロウイルスパッケージングシグナルからのgag配列の除去 LTRおよび最小限の機能性パッケージングシグナルを含むDNA断片をレトロウイ
ルスベクターMFG (Bandaraら，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10764-10768
)から、またはMMLVプロウイルスDNAから以下のオリゴヌクレオチドプライマーを
用いたPCR反応によって得る：
【配列表】
【０３０５】 このPCR断片はMMLVヌクレオチドの+1から+523までを含み、したがって+621から 始まるgagコード配列は含んでいない（番号はShinnickら，1981, Nature 293: 5
43-548 に記載のMMLVのヌクレオチド配列に基づく）。
【０３０６】 上記PCR断片を用いて、HindIIIおよびXho1制限酵素を用いた消化および標準的
技法を用いたサブクローニングによりレトロウイルスゲノムベクターを構築する
ことができる。そのようなベクターはgagコード配列と相同性をもたない。
【０３０７】 〔実施例５〕 欠陥性レトロウイルスゲノムの構築 欠陥性レトロウイルスゲノムを生成することができる転写ユニットを図17に示
す。このユニットは以下の要素を含む。すなわち、PGK遺伝子のHRE（低酸素応答
エレメント）を３コピー含む、低酸素によって調節されるプロモーター-エンハ ンサーおよびpGL3 (Promega)から72 bp反復エンハンサーが削除されたSV40プロ モーター；Ｒ、U5およびパッケージングシグナルを含むMMLV配列；m4070A（実施
例３）のコード配列；スプライス受容体；治療用タンパク質のコード配列を挿入
するためのクローニング部位；MMLV由来のポリピリミジントラクト；HREを含む プロモーター-エンハンサーの第２コピー；スプライス供与部位；Ｒ、U5の第２ コピーである。
【０３０８】 ベクターの逆転写および二次標的細胞への組み込みの結果、スプライス供与体
はenv遺伝子の上流に導入され、スプライシングによる該遺伝子のmRNAからの除 去を引き起し、それによって治療遺伝子の二次標的細胞のみにおける効率的な発
現を可能とする（図17参照）。
【０３０９】 〔実施例６〕 シトクロムP450の条件発現ベクターの構築 図18は、形質導入の後でのみ正しいスプライシングが達成されてP450の発現が
可能となるように、シトクロムP450遺伝子の配列を1/2ずつに分けてコードする レトロウイルス発現ベクターcDNAの構造を示す。したがって、このベクターは形
質導入細胞にのみ遺伝子発現を限定する。
【０３１０】 １）このベクターを構築するための出発プラスミドはpLNSX (MillerおよびRosma
n, 1989, Bio Techniques 7: 980-990)である。pLNSX のパッケージングシグナ ル内に含まれる天然のスプライス供与体(...agGTaag...) （位置781/782)を、AL
TERED SITES II突然変異誘発キット(Promega)および下記の配列を有する合成オ リゴヌクレオチドを用いてPCR突然変異誘発法によって突然変異させる：
【配列表】
【０３１１】 ２）pCI発現ベクター(Promega)のCMVプロモーターを、下記の２つのオリゴヌク レオチドを用いたPCRによって単離する：
【０３１２】 プライマー1：
【配列表】
【０３１３】 プライマー2：
【配列表】
【０３１４】 これは5'Nhe1部位（プライマー１）ならびに3'Not1およびXba1部位（プライマ
ー２）を有するCMVプロモーターを含む断片をもたらす。この断片をNhe1およびX
ba1で切断し、あらかじめNhe1-Nhe1断片を除去しておいたpLNSX にクローン化し
た。
【０３１５】 ３）シトクロムP450 cDNAコード配列の5'末端を以下のプライマーを用いてRT-PC
Rによってヒト肝臓RNA (Clontech)から単離する：
【０３１６】 プライマー3：
【０３１７】 プライマー4：
【配列表】
【０３１８】 これはATGから残基693までのP450遺伝子5'末端を増幅する（番号は翻訳開始部位
からのものである；Yamanoら, 1989, Biochem 28:7340-7348）。PCR断片の5'末 端（プライマー３に由来する）には、Not1部位および最適化「コザック」翻訳開
始シグナルも含まれている。PCR断片の3'末端（プライマー４に由来する）には 、別のNot1部位、およびP450の残基704（相補残基をプライマー４中に大文字で 示す）に対して上流に位置するGTスプライス供与体対を有する共通スプライス供
与配列（pCI にも見いだされ、もともとはヒトβグロビン遺伝子に由来する）が
含まれている。この断片をNot1で消化し、そして上記工程２で作製した、Not1で
消化したプラスミド中にクローン化する。
【０３１９】 ４）次に、工程２のクローニングの際に除去したNhe1-Nhe1 断片を工程３のプラ
スミドに再導入する。これによって、図17に示すレトロウイルスベクターである
がP450の3'末端を欠くベクターが作製される。
【０３２０】 ５）P450コード配列の3'末端を下記のプライマーを用いたRT-PCRによってヒト肝
臓RNA (Clontech)から単離する：
【０３２１】 プライマー5：
【配列表】
【０３２２】 プライマー6：
【配列表】
【０３２３】 これは残基705（プライマー５中、大文字で示す）から翻訳停止コドンを越えて 延びるPCR増幅されたP450の3'末端をもたらす。このPCR産物の5'末端内に、プラ
イマー５によって生成されて、Bcl1制限部位、共通スプライス受容体およびブラ
ンチ部位（pCIにも見いだされ、もともとは免疫グロブリン遺伝子に由来する） が残基705の上流に存在する。停止コドンの下流に位置するこの産物の3'末端に 、プライマー６によって生成されてCla1部位が存在する。次に、このPCR産物をB
cl1およびCla1で消化し、そしてBcl1-Cla1 断片を除去した、工程３で作製した ベクターに挿入し、図18に示すレトロウイルスベクターを作製する。
【０３２４】 以下の実施例は、in vivoまたはin vitroにおけるレンチウイルスの一過性生 成のために使用できるアデノレンチウイルス系の構築を説明する。
【０３２５】第１世代組換えアデノウイルス 第１世代アデノウイルスベクターは該ウイルスのE1およびE3領域の欠失からな
り、外来DNAの通常は左側逆方向末端反復配列(ITR)に隣接するウイルス左腕への
挿入を可能とする。このウイルスのパッケージングシグナル(194-358ヌクレオチ
ド）はE1aエンハンサーとオーバーラップし、そのため殆どのE1欠失ベクター中 に存在する。この配列はウイルスゲノムの右端へ移転させることができる(Heari
ngおよびShenk, 1983, Cell 33:59-74)。したがって、E1欠失ベクターにおいて3
.2 kbを欠失させることができる(358-3525ヌクレオチド)。
【０３２６】 アデノウイルスはそのゲノムの105%の長さのものをパッケージングすることが
でき、このためさらに2.1 kbを加えることが可能となる。したがって、E1/E3欠 失ウイルスベクターにおいては、クローニングキャパシテイは7-8 kbとなる（2.
1 kb + 1.9 kb (E3の除去) + 3.2 kb (E1の除去))。組換えアデノウイルスは必 須のE1初期遺伝子を欠くため、非E1補完性細胞系では複製できない。293細胞系 がGrahamら(1977, J. Gen. Virol. 36: 59-74)によって開発され、これはITR、 パッケージングシグナル、E1a、E1bおよびpIXを含む、Ad5ゲノムの左端由来の約
4 kbを含む。これらの細胞はE1aおよびE1b遺伝子産物を安定に発現するが、pIX
配列がE1b内にあるにもかかわらず、後期タンパク質IXを発現しない。非補完性 細胞中では、E1欠失ウイルスは細胞を形質導入し、そして核に運ばれるが、そこ
ではE1欠失ゲノムからの発現は全くない。
【０３２７】第１世代アデノウイルス生成系 Microbix Biosystems - nbl Gene Sciences 図19はMicrobix系を用いて組換えアデノウイルスを作製するのに用いられる一
般戦略を示す。
【０３２８】 この一般戦略は、外来DNAをE1シャトルベクターにクローン化することを必要 とし、該ベクター中で402-3328 bpのE1領域は外来DNAカセットに置換される。次
に、この組換えプラスミドをpJM17 プラスミドと共に293細胞中に同時トランス フェクションする。pJM17 はE3領域の欠失、およびE1領域の3.7単位に原核生物p
BRXベクター（アンピシリン耐性および細菌ori 配列を含む）の挿入を含む。し たがって、この40 kbプラスミドはアデノウイルスのヌクレオキャプシドにパッ ケージするには大きすぎるが、細菌中で増殖させることができる。293細胞中で の細胞内組換えは、amprおよびori配列の外来DNAインサートとの置換をもたらす
。
【０３２９】 〔実施例７〕 EIAV構成要素を含むアデノウイルスの作製のための導入プラス ミドの構築 レンチウイルスベクターを作製するには、４つのアデノウイルスを作製する必
要がある。すなわち、ゲノム、gagpol遺伝子、envelope遺伝子（狂犬病ウイルス
Ｇ）およびRev遺伝子である。レンチウイルス構成要素は異種プロモーターから 発現され、それらは（gagpol、Revおよび狂犬病ウイルスenvelopeの高発現にと って）必要な場合はイントロン、およびポリアデニル化シグナルを含む。これら
４つのウイルスをE1a マイナス細胞に形質導入すると、アデノウイルス構成要素
は発現されないが、異種プロモーターはレンチウイルス構成要素を発現させる。
EIAVアデノウイルス系の構築について１つの例を以下（実施例１）に概説する（
出願番号：9727135 .7)。このEIAVは、非必須EIAVコードタンパク質（S2、Tatま
たはエンベロープ）のうち任意のものを欠く最小限の系に基づいている。EIAVを
偽タイプ化するのに用いるエンベロープは、狂犬病ウイルスエンベロープ（Ｇタ
ンパク質）である。これはEIAVを良好に偽タイプ化することが示された（出願番
号：9811152.9)。
【０３３０】導入プラスミド 以下にEIAV構成要素を含む導入プラスミドの構築を説明する。この導入プラス
ミドはpE1sp1Aである（図20）。
【０３３１】 組換え導入プラスミドを用いて、293細胞中における相同組換えによって組換 えアデノウイルスを作製することが可能である。
【０３３２】 以下のプラスミドを図式的に表したものを添付する。
【０３３３】 Ａ）pE1RevE - Rev構築物 ApaLIおよびClaIを用いてプラスミドpCI-Revを切断する。EIAV Revをコードす
る2.3 kbのバンドをクレノウポリメラーゼで平滑末端とし、pE1sp1AのEcoRV 部 位に挿入してプラスミドpE1RevE を得る（図21）。
【０３３４】 Ｂ）pE1HORSE3.1 - gagpol構築物 pHORSE3.1 をSnaBI およびNotIで切断した。EIAV gagpolをコードする6.1 kb のバンドを、SnaBI およびNotIで切断したpE1RevE に挿入した(7.5 kbのバンド を精製した)。これによってプラスミドpE1HORSE3.1 を得る（図22）。
【０３３５】 Ｃ）pE1PEGASUS - ゲノム構築物 PEGASUS4 をBglII およびNotIで切断した。EIAVベクターゲノムを含む6.8 kb のバンドを、BglII およびNotIで切断したpE1RevE に挿入した(6.7 kbのバンド を精製した)。これによってプラスミドpE1PEGASUSを得る（図23）。
【０３３６】 Ｄ）pCI-Rab - 狂犬病ウイルス構築物 pE1Rabを作製するため、プラスミドpSA91RbGをNsiIおよびAhdIで切断すること
によって、狂犬病ウイルスのオープンリーディングフレームをpCI-Neo（図24） に挿入した。T4 DNAポリメラーゼを用いて1.25 kb のバンドを平滑末端化し、Sm
aIで切断したpCI-Neoに挿入した。これによってプラスミドpCI-Rab（図25）を得
た。
【０３３７】 Ｆ）pE1Rab - 狂犬病ウイルス構築物 pCI-RabをSnaBI およびNotIで切断した。狂犬病ウイルスエンベロープをコー ドする1.9 kbのバンドをSnaBI およびNotIで切断したpE1RevE に挿入した(7.5 k
b のバンドを精製した）。これによってプラスミドpE1Rab（図26）を得た。
【０３３８】 （発明の概略） 本発明は１以上のNOIを標的細胞に導入するのに適した新規なデリバリー系に 関する。
【０３３９】 １つの好ましい態様において、本発明は機能性スプライス供与部位および機能
性スプライス受容部位を含むレトロウイルスベクターであって；該機能性スプラ
イス供与部位および機能性スプライス受容部位は第１の興味のあるヌクレオチド
配列（NOI）の両側に位置し；該機能性スプライス供与部位は該機能性スプライ ス受容部位の上流にあり；該レトロウイルスベクターはレトロウイルスプロベク
ターから誘導され；該レトロウイルスプロベクターは該機能性スプライス供与部
位をもたらすことのできる第１のヌクレオチド配列（NS）および該機能性スプラ
イス受容部位をもたらすことのできる第２のNSを含み；第１のNSは第２のNSの下
流にあり；該レトロウイルスプロベクターの逆転写の結果該レトロウイルスベク
ターが形成されるようになっている該ベクターを包含する。
【０３４０】 別の表現をするならば、この態様は、スプライシングを非機能性とするために
SDとSAの順序を入れ換えたプロベクターから生成された、機能性SDおよびSAによ
って両側を囲まれた１以上のNOIを含む新規なデリバリー系を包含する。
【０３４１】 本発明のこの態様は「分断イントロン」態様と呼ぶことができる。本発明のこ
の態様を示す概略図を図27cに掲げる。対照的に、図27aおよび27bは公知のレト ロウイルスベクターのスプライシング配置を示す。
【０３４２】 本発明の別の広い態様は、１以上のレンチウイルスベクター構成要素をパッケ
ージすることができる１以上のアデノウイルスベクター構成要素を含んでなる新
規なデリバリー系を包含し、ここで該レンチウイルスベクターは場合により分断
イントロン配置を含む。
【０３４３】 本発明のこの態様は一般的な意味でハイブリッドウイルスベクター系と呼ぶこ
とができる。この特定の場合においては、アデノウイルス構成要素とレンチウイ
ルス構成要素の組み合わせは、二部分からなる(dual)ハイブリッドウイルスベク
ター系と呼ぶことができる。
【０３４４】 本発明のこの態様を示す概略図を図28に掲げる。
【０３４５】 本発明のこれらの、およびその他の広い態様を本明細書に論じる。
【０３４６】 上記明細書に述べた全ての刊行物は参照によりここに組み入れる。本発明の範
囲および精神から逸脱することなく、記述された本発明の方法および系の種々の
改変および変法が可能であることが当業者には明らかであろう。特定の好ましい
実施形態に関連させて本発明を説明してきたが、請求されている発明はそのよう
な特定の実施形態に不当に限定されないことが理解されるべきである。実際、分
子生物学および関連分野の当業者には自明である記述された本発明の実施態様の
種々の改変は、以下の請求の範囲内にあることが意図される。
【０３４７】
【配列表】
配列番号１ 配列番号２ 配列番号３ 図１６参照
【配列表】
【配列表】
【配列表】
【配列表】
【配列表】
【配列表】
【配列表】
【配列表】
【配列表】
【配列表】
【配列表】
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【配列表】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 レトロウイルスのプロウイルスゲノムの構造を示す図である。
【図２】 スモールＴスプライス供与体のpLTRへの付加を示す図である。
【図３】 pL-SA-Nを図式的に示す。
【図４】 スプライス供与体を欠失させたpL-SA-Nを図式的に示す。
【図５】 MLV pICUTの配列を示す図である。
【図６】 EIAV LTRプラスミドCMV/R 接合部へのスプライス供与体の挿入を示す図である
。
【図７】 pEGASUS-1へのスプライス受容体の挿入を示す図である。
【図８】 EIAVベクターからの野生型スプライス供与体の除去を示す図である。
【図９】 pEICUT-1を作製するためのpCMVLTR+SDとpEGASUS+SA(noSD)との組合せを示す図
である。
【図10】 pEICUT-LacZ の構築を示す図である。
【図11】 pEICUT-LacZ 配列を示す図である。
【図12】 トランスフェクションされた細胞および形質導入細胞の両方におけるベクター
配置を示す図である。
【図13】 パッケージング細胞または形質導入細胞への遺伝子発現の限定を示す図である
。
【図14】 ハイグロマイシンの発現をプロデューサー細胞に、そして2B6（p450イソ型） の発現を形質導入細胞に限定するMLV pICUT Neo-p450ベクターの構築を示す図で
ある。
【図15】 突然変異env遺伝子(m4070A)とpol遺伝子3'末端由来の野生型MMLV配列との配列
比較を示す。
【図16】 改変されたenv遺伝子m4070Aの完全な配列を示す。
【図17】 遺伝子発現が限定された構築物を示す。4070Aエンベロープは第１細胞に、p45
0は第２細胞に限定されている。
【図18】 NOI（この例ではp450) の発現を形質導入細胞に限定するためのイントロンの 使用を示す図である。
【図19】 導入ベクターpE1sp1A を図式的に示す。
【図20】 pE1sp1A 構築物を図式的に示す。
【図21】 pE1RevE 構築物を図式的に示す。
【図22】 pE1HORSE3.1-gagpol構築物を図式的に示す。
【図23】 pE1PEGASUS4-ゲノム構築物を図式的に示す。
【図24】 pCI-Neo 構築物を図式的に示す。
【図25】 pCI-Rab 構築物を図式的に示す。
【図26】 pE1Rab構築物を図式的に示す。
【図27a】 レトロウイルスベクターにおける天然のスプライシング配置を図式的に示す。
【図27b】 公知のレトロウイルスベクターにおけるスプライシング配置を図式的に示す。
【図27c】 本発明によるスプライシング配置を図式的に示す。
【図28】 本発明による二部分からなるハイブリッドウイルスベクター系を図式的に示す
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 35/76 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 キングスマン、スーザン イギリス国 オーエックス13 ５ピーピー オクソン、アップルトン、オークスミ ア、キーパーズ ハウス (72)発明者 ウッデン、マーク イギリス国 オーエックス１ ４アールエ ー オックスフォード、アービンドン ロ ード 158、フラット ５ (72)発明者 キングスマン、アラン イギリス国 オーエックス13 ５ピーピー オクソン、アップルトン、オークスミ ア、キーパーズ ハウス (72)発明者 ミトロファノス、キリアコス イギリス国 オーエックス４ １エスゼッ ト オックスフォード、ウォーウィック ロード 85 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 DA02 EA02 FA01 HA17 4B065 AA90X AA95X AA97Y AB01 BA02 CA23 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA022 ZA162 ZA362 ZA402 ZA452 ZA532 ZA542 ZA592 ZA672 ZA812 ZA892 ZA962 ZA972 ZB112 ZB132 ZB152 ZB262 ZB352 ZC542 ZC552 4C087 AA01 AA02 BC83 NA14 ZA02 ZA16 ZA36 ZA40 ZA45 ZA53 ZA54 ZA59 ZA67 ZA81 ZA89 ZA96 ZA97 ZB07 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB35 ZC54 ZC55

Claims (42)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 機能的スプライス・ドナー部位及び機能的スプライス・ア
    クセプター部位を含むレトロウイルスベクターであって、機能的スプライス・ド
    ナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位が、目的の第1のヌクレオチ ド配列(NOI)に隣接しており、機能的スプライス・ドナー部位が、機能的スプラ イス・アクセプター部位の上流にあり、該レトロウイルスベクターがレトロウイ
    ルスプロベクターに由来するものであり、レトロウイルスプロベクターが機能的
    スプライス・ドナー部位を生成することができる第1のヌクレオチド配列(NS)と 、機能的スプライス・アクセプター部位を生成することができる第2のNSとを含 み、第1のNSが第2のNSの下流にあって、前記レトロウイルスベクターが前記レト
    ロウイルスプロベクターの逆転写の結果として形成されるレトロウイルスベクタ
    ー。
  2. 【請求項２】 レトロウイルスプロベクターが第2のヌクレオチド配列の 上流にある第3のNSを含み、第3のNSが非機能的スプライス・ドナー部位を生成す
    ることができるものである請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
  3. 【請求項３】 レトロウイルスベクターがさらに第2のNOIを含み、第2のN
    OIが機能的スプライス・アクセプター部位の下流にあるものである請求項１また
    は２に記載のレトロウイルスベクター。
  4. 【請求項４】 レトロウイルスプロベクターが第2のNOIを含み、第2のNOI
    が第2のヌクレオチド配列の下流にあるものである請求項３に記載のレトロウイ ルスベクター。
  5. 【請求項５】 第2のNOIまたはその発現産物が治療剤または診断剤である
    かまたはそれらを含むものである請求項３または４に記載のレトロウイルスベク
    ター。
  6. 【請求項６】 第1のNOIまたはその発現産物が、1または複数の選択性を 与える剤(例えばマーカーエレメント)、ウイルスの必須エレメントもしくはその
    一部、またはそれらの組み合わせであるかまたはそれらを含むものである請求項
    １〜５のいずれかに記載のレトロウイルスベクター。
  7. 【請求項７】 第1のNSがレトロウイルスプロベクターの3'末端またはそ の近傍にあり、好ましくは、この3'末端がU3領域及びR領域を含み、かつ好まし くは、前記第1のNSがU3領域とR領域との間に位置するものである請求項１〜６の
    いずれかに記載のレトロウイルスベクター。
  8. 【請求項８】 レトロウイルスプロベクターのU3領域及び／または第1のN
    Sが第3のNOIであるNSを含み、前記NOIが1または複数の転写調節エレメント、コ ード配列またはその一部であるものである請求項７に記載のレトロウイルスベク
    ター。
  9. 【請求項９】 第1のNSがウイルスから得ることができるものである請求 項１〜８のいずれかに記載のレトロウイルスベクター。
  10. 【請求項１０】 第1のNSがイントロンまたはその一部である請求項９に 記載のレトロウイルスベクター。
  11. 【請求項１１】 前記イントロンが、SV40ウイルスの小形のtイントロン から得ることができるものである請求項１０に記載のレトロウイルスベクター。
  12. 【請求項１２】 レトロウイルスプロベクターがレトロウイルスパッケー
    ジングシグナルを含み、第2のNSがレトロウイルスパッケージングシグナルの下 流に位置し、これによりスプライシングが一次標的部位で防止され得る請求項１
    〜１１のいずれかに記載のレトロウイルスベクター。
  13. 【請求項１３】 第2のNSが第1のNOIの下流に位置し、これにより第1のNO
    Iが一次標的部位で発現され得る請求項１〜１２のいずれかに記載のレトロウイ ルスベクター。
  14. 【請求項１４】 第2のNSが複数のクローニング部位の上流に位置し、こ れにより1または複数の追加のNOIが挿入され得る請求項１〜１３のいずれかに記
    載のレトロウイルスベクター。
  15. 【請求項１５】 第2のNSが免疫学的分子またはその一部をコードするヌ クレオチド配列である請求項１〜１４のいずれかに記載のレトロウイルスベクタ
    ー。
  16. 【請求項１６】 免疫学的分子が免疫グロブリンである請求項１５に記載
    のレトロウイルスベクター。
  17. 【請求項１７】 第2のNSが免疫グロブリンの重鎖の可変領域をコードす るヌクレオチド配列である請求項１６に記載のレトロウイルスベクター。
  18. 【請求項１８】 機能的イントロンをさらに含む請求項１〜１７のいずれ
    かに記載のレトロウイルスベクター。
  19. 【請求項１９】 前記機能的イントロンが所望の標的部位においてNOIの 少なくとも1つの発現を抑制できるように配置されている請求項１８に記載のレ トロウイルスベクター。
  20. 【請求項２０】 前記標的部位が細胞である請求項１９に記載のレトロウ
    イルスベクター。
  21. 【請求項２１】 前記ベクターまたはプロベクターがマウスオンコレトロ
    ウイルスまたはレンチウイルスから誘導され得るものである請求項１〜２０のい
    ずれかに記載のレトロウイルスベクター。
  22. 【請求項２２】 前記ベクターがMMLV、MSV、MMTV、HIV-1またはEIAVから
    誘導され得るものである請求項２１に記載のレトロウイルスベクター。
  23. 【請求項２３】 レトロウイルスベクターが、組み込まれたプロウイルス
    である請求項１〜２２のいずれかに記載のレトロウイルスベクター。
  24. 【請求項２４】 請求項１〜２３のいずれかに記載のレトロウイルスベク
    ターから得ることができるレトロウイルス粒子。
  25. 【請求項２５】 請求項１〜２３のいずれかに記載のレトロウイルスベク
    ターまたは請求項２４に記載のレトロウイルス粒子でトランスフェクトまたは形
    質導入された細胞。
  26. 【請求項２６】 医薬で使用するための請求項１〜２３のいずれかに記載
    のレトロウイルスベクターまたは請求項２４に記載のレトロウイルス粒子または
    請求項２５に記載の細胞。
  27. 【請求項２７】 1または複数のNOIをそれを必要とする標的部位にデリバ
    リーするための医薬組成物を製造するための請求項１〜２３のいずれかに記載の
    レトロウイルスベクターまたは請求項２４に記載のレトロウイルス粒子または請
    求項２５に記載の細胞の使用。
  28. 【請求項２８】 請求項１〜２３のいずれかに記載のレトロウイルスベク
    ターもしくは請求項２４に記載のレトロウイルス粒子により、または請求項２５
    に記載の細胞の使用により細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含
    む方法。
  29. 【請求項２９】 請求項１〜２３のいずれかに記載のレトロウイルスベク
    ターまたは請求項２４に記載のレトロウイルス粒子または請求項２５に記載の細
    胞のためのデリバリー系であって、NOIまたは複数のNOIを第1の標的細胞にデリ バリーするための１または複数の非レトロウイルス発現ベクター、アデノウイル
    スもしくはプラスミドまたはそれらの組み合わせと、NOIまたは複数のNOIを第2 の標的細胞にデリバリーするためのレトロウイルスベクターとを含むデリバリー
    系。
  30. 【請求項３０】 請求項１〜２９のいずれかに記載のレトロウイルスプロ
    ベクター。
  31. 【請求項３１】 所望の標的細胞内で1または複数のNOIの発現を抑制する
    ための機能的イントロンの使用。
  32. 【請求項３２】 第1のNSをレトロウイルスプロベクターの3'末端からレ トロウイルスベクターの5'末端にデリバリーするための逆転写酵素の使用。
  33. 【請求項３３】 in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッドウイル スベクター系であって、二次ウイルスベクターをコードする1または複数の一次 ウイルスベクターを含み、一次ベクターまたはベクター群が第1の標的細胞に感 染し、そのなかで二次ウイルスベクターを発現することができ、二次ベクターが
    二次標的細胞の形質導入を行うことができる前記ハイブリッドウイルスベクター
    系。
  34. 【請求項３４】 一次ベクターがアデノウイルスベクターから得ることが
    できるもの、あるいはそれをベースにしたものであり、及び／または二次ウイル
    スベクターがレトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターから
    得ることができるもの、あるいはそれをベースにしたものである請求項３３に記
    載のハイブリッドウイルスベクター系。
  35. 【請求項３５】 レンチウイルスベクターがスプリット‐イントロン構造
    を有する請求項３３または３４に記載のハイブリッドウイルスベクター系の使用
    。
  36. 【請求項３６】 前記レンチウイルスベクターが、スプリット‐イントロ
    ン構造を含むか、またはそれをデリバリーすることができるハイブリッドウイル
    スベクター系。
  37. 【請求項３７】 レンチウイルスベクター系であって、レンチウイルスベ
    クターが、スプリット‐イントロン構造を含むか、またはそれをデリバリーする
    ことができる前記レンチウイルスベクター系。
  38. 【請求項３８】 アデノウイルスベクター系であって、アデノウイルスベ
    クターが、スプリット‐イントロン構造を含むか、またはそれをデリバリーする
    ことができる前記アデノウイルスベクター系。
  39. 【請求項３９】 pElsp1A、pCI-Neo、pE1RevE、pE1HORSE3.1、pE1PEGASUS
    4、pCI-Rab、pE1Rabとして提示されるもののなかの1つまたは複数をベースとす るか、またはそれから得られるベクターまたはプラスミド。
  40. 【請求項４０】 in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッドウイル スベクター系であって、二次ウイルスベクターをコードする一次ウイルスベクタ
    ーを含み、一次ベクターは第1の標的細胞に感染し、そのなかで二次ウイルスベ クターを発現することができ、二次ベクターは二次標的細胞の形質導入を行うこ
    とができ、一次ベクターはアデノウイルスベクターから得ることができるもの、
    あるいはそれをベースにしたものであり、二次ウイルスベクターはレトロウイル
    スベクター、好ましくはレンチウイルスベクターから得ることができるもの、あ
    るいはそれをベースにしたものである前記ハイブリッドウイルスベクター系。
  41. 【請求項４１】 in vivo遺伝子デリバリーのためのハイブリッドウイル スベクター系であって、二次ウイルスベクターをコードする一次ウイルスベクタ
    ーを含み、一次ベクターは第1の標的細胞に感染し、そのなかで二次ウイルスベ クターを発現することができ、二次ベクターは二次標的細胞の形質導入を行うこ
    とができ、一次ベクターはアデノウイルスベクターから得ることができるもの、
    あるいはそれをベースにしたものであり、二次ウイルスベクターはレトロウイル
    スベクター、好ましくはレンチウイルスベクターから得ることができるもの、あ
    るいはそれをベースにしたものであり、前記ベクター系は機能的スプライス・ド
    ナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位を含み、機能的スプライス・
    ドナー部位及び機能的スプライス・アクセプター部位は目的の第1のヌクレオチ ド配列(NOI)に隣接しており、機能的スプライス・ドナー部位は機能的スプライ ス・アクセプター部位の上流にあり、レトロウイルスベクターはレトロウイルス
    プロベクターに由来するものであり、レトロウイルスプロベクターは機能的スプ
    ライス・ドナー部位を生成することができる第1のヌクレオチド配列(NS)と、機 能的スプライス・アクセプター部位を生成することができる第2のNSとを含み、 第1のNSは第2のNSの下流にあって、前記レトロウイルスベクターは前記レトロウ
    イルスプロベクターの逆転写の結果として形成されるものである前記ハイブリッ
    ドウイルスベクター系。
  42. 【請求項４２】 本明細書に実質的に記載される、標的細胞においてNOI を差別的に発現し得るレトロウイルスベクター。
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